KR20230110841A - Pd-1에 결합하는 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 분리된 단일 클론 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체를 발현하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역 접합체, 이중 특이적 분자, 키메라 항원 수용체, 종양 용해성 바이러스 및 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 본 발명의 항PD-1 항체를 사용하는 치료 방법을 제공한다.

Description

PD-1에 결합하는 항체 및 그 용도{ANTIBODIES BINDING PD-1 AND USES THEREOF}
본 발명은 대체적으로 분리된 단일 클론 항체에 관한 것으로, 특히 높은 친화도 및 기능성을 가지며 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 마우스, 키메라 또는 인간화된 단일 클론 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체를 암호화하기 위한 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체를 발현하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역 접합체(immunoconjugate), 이중 특이적 분자, 종양 용해성 바이러스 및 해당 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 본 발명의 항PD-1항체를 사용한 진단 및 치료 방법을 제공한다.
PD-1 또는 CD279라고도 하는 세포 예정사 단백질-1은 T세포 조절기인 CD28 계열의 구성원이며, 활성화된 B세포, T세포, 골수세포에서 발현(Agata et al.,(1996)　Int Immunol　8:765-72; Okazaki et al.,(2002)　Curr. Opin. Immunol.　14: 391779-82; Bennett et al.,(2003)　J Immunol　170:711-8) 된다. PD-1은 막 근위 타이로신 기반 면역 수용체 억제화 모티프(ITIM) 및 막 원위 티로신 기반 스위치 모티프(ITSM)(Thomas, M. L.(1995)　J Exp Med　181:1953-6; Vivier, E and Daeron, M(1997)　Immunol Today　18:286-91)를 포함한다. PD-1의 두 리간드인 PD-L1 및 PD-L2가 현재 이미 확인되었으며, 양자는 모두 PD-1에 결합하지만 다른 CD28계열의 구성원에 결합하지 않는 B7상동체이다.
PD-1 및 그 리간드가 면역 반응을 부정적으로 조절한다는 몇가지 증거가 제시되었다. 예를 들어, 다양한 인간 암에서 PD-1이 대량으로 존재하는 것으로 밝혀졌다(Dong et al.,(2002)　Nat. Med.　8:787-9). 또한, PD-1과 PD-L1의 상호 작용은 종양 침윤 림프 세포 및 T세포 수용체 매개 증식을 감소시키고, 암세포의 면역 이탈을 유발하는 것으로 보고되었다(Dong et al.,(2003)　J. Mol. Med.　81:281-7; Blank et al.,(2005)　Cancer Immunol. Immunother.　54:307-314; Konishi et al.,(2004)　Clin. Cancer Res.　10:5094-100). 연구에 따르면, PD-1과 PD-L1의 국소적 상호 작용을 억제함으로써 면역 억제 효과가 역전될 수 있으며, PD-1과 PD-L2의 상호 작용도 차단되면, 이 효과는 가산적이라는 사실이 밝혀졌다(Iwai et al.,(2002)　Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA　99:12293-7; Brown et al.,(2003)　J. Immunol.　170:1257-66).
PD-1가 결핍한 동물은 자가 면역 심근 병증 및 관절염 및 신염을 동반한 루푸스 유사 증후군을 포함한 다양한 자가 면역 표현형으로 발전될 수 있다(Nishimura et al.,(1999)　Immunity　11:141-51; Nishimura et al.,(2001)　Science　291:319-22). 또한, PD-1은 자가 면역 뇌척수염, 전신성 홍 반성 루푸스, 이식편대숙주병(GVHD), 제1형 당뇨병 및 류마티스 관절염에 대해 작용을 하는 것으로 밝혀졌다(Salama et al.,(2003)　J Exp Med　198:71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme(2004)　Hum Mol Genet　13:R143; Nielsen et al.,(2004)　Lupus　13:510). 마우스 B-세포 종양 세포주에서, PD-1의 ITSM은 BCR 매개Ca2+플럭스 및 다운 스트림 이펙터 분자의 티로신 인산화를 차단하는데 필수적인 것으로 나타났다(Okazaki et al.,(2001)　PNAS　98:13866-71).
PD-1을 표적으로 하는 많은 암 면역 치료제가 개발되어 질병의 치료에 사용되고 있다. 그러한 항PD-1항체 중의 하나는 Nivolumab(Bristol Myers Squibb에서 OPDIVO®라는 상품명으로 판매)인데, 총 296명의 환자를 대상으로 한 임상 시험에서 비소 세포 폐암, 흑색종 및 신세포암에서 전체 또는 일부 반응(Topalian SL et al.,(2012)　The New England Journal of Medicine.　366(26): 2443-54)을 보였다. 2014년에 일본에서 승인을 받았고, 2014년에 전이성 흑색종의 치료제로서 미국FDA의 승인을 받았다. PD-1을 표적으로 하는 다른 한가지 항PD-1항체Pembrolizumab(KEYTRUDATM, MK-3475, Merck)도 이미2014년에 전이성 흑색종의 치료제로서 미국FDA의 승인을 받았다. 미국에서 폐암, 림프종 및 중피종의 임상 시험에 사용되고 있다.
항PD-1항체가 개발되고 승인되었지만, PD-1에 대해 향상된 결합 친화도와 다른 필요한 약물 특성을 갖는 단일 클론 항체가 여전히 필요하다.
본 발명은 PD-1에 결합(예를 들어, 인간PD-1 및 원숭이PD-1)하고 PD-1에 대해 증가된 친화도를 가지며 기존의 항PD-1항체(예를 들어, Nivolumab)에 비해 더 좋지는 않지만 유사한 항 종양 효과를 갖는 예컨대 마우스, 인간, 키메라 또는 인간화 단일 클론 항체와 같은 분리된 단일 클론 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 PD-1단백질의 검출과 예컨대 암, 자가 면역 심근 병증, 자가 면역 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 이식편대숙주병(GVHD), 제1형 당뇨병 및 류마티스 관절염과 같은 PD-1관련 질병의 치료와 예방에 다양하게 적용된다.
또한, 본 발명은 PD-1에 결합하는 분리된 단일 클론 항체(예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화 항체) 또는 그 항원 결합 부분에 관한 것으로서, CDR1영역, CDR2영역 및 CDR3영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지며, 상기 CDR1영역, CDR2영역 및 CDR3영역은(1)SEQ ID NO: 1, 2 및 3; (2)SEQ ID NO: 4, 5 및 6; (3)SEQ ID NO: 7, 8 및 9; (4)SEQ ID NO: 10, 11 및 12; (5)SEQ ID NO: 13, 14 및 15; (6)SEQ ID NO: 16, 17 및 18; (7)SEQ ID NO: 19, 20 및 21; (8)SEQ ID NO: 22, 23 및 24; (9)SEQ ID NO: 25, 26 및 27; (10)SEQ ID NO: 28, 29 및 30; 또는(11)SEQ ID NO: 31, 32 및 33과 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다.
또한, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 또는 79와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다. SEQ ID NO: 67 및 69-79는 각각 SEQ ID NO: 102-113의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 CDR1영역, CDR2영역 및 CDR3영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하여 구성되며, 상기 CDR1영역, CDR2영역 및 CDR3영역은(1)SEQ ID NO: 34, 35 및 36; (2)SEQ ID NO: 37, 38 및 39; (3)SEQ ID NO: 40, 41 및 42; (4)SEQ ID NO: 43, 44 및 45; (5)SEQ ID NO: 46, 47 및 48; (6)SEQ ID NO: 49, 50 및 51; (7)SEQ ID NO: 52, 53 및 54; (8)SEQ ID NO: 55, 56 및 57; (9)SEQ ID NO: 58, 59 및 60; (10)SEQ ID NO: 61, 62 및 63; 또는(11)SEQ ID NO: 64, 65 및 66과 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다.
또한, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 96과 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하여 구성되며, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다. SEQ ID NO: 80 및 86-96는 각각 SEQ ID NO: 114-125의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 모두 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 각 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 CDR1영역, CDR2영역 및 CDR3영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역CDR1, CDR2 및 CDR3과 경쇄 가변 영역CDR1, CDR2 및 CDR3는 다음의 서열(1)SEQ ID NO: 1, 2, 3, 34, 35 및 36; (2)SEQ ID NO: 4, 5, 6, 37, 38 및 39; (3)SEQ ID NO: 7, 8, 9, 40, 41 및 42; (4)SEQ ID NO: 10, 11, 12, 43, 44 및 45; (5)SEQ ID NO: 13, 14, 15, 46, 47 및 48; (6)SEQ ID NO: 16, 17, 18, 49, 50 및 51; (7)SEQ ID NO: 19, 20, 21, 52, 53 및 54; (8)SEQ ID NO: 22, 23, 24, 55, 56 및 57; (9)SEQ ID NO: 25, 26, 27, 58, 59 및 60; (10)SEQ ID NO: 28, 29, 30, 61, 62 및 63; 또는(11)SEQ ID NO: 31, 32, 32, 64, 65 및 66과 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 다음의 서열(1)SEQ ID NO: 67 및 80; (2)SEQ ID NO: 68 및 81; (3)SEQ ID NO: 69 및 81; (4)SEQ ID NO: 68 및 82; (5)SEQ ID NO: 68 및 83; (6)SEQ ID NO: 68 및 84; (7)SEQ ID NO: 68 및 85; (8)SEQ ID NO: 68 및 86; (9)SEQ ID NO: 69 및 86; (10)SEQ ID NO: 70 및 87; (11)SEQ ID NO: 71 및 88; (12)SEQ ID NO: 72 및 89; (13)SEQ ID NO: 73 및 90; (14)SEQ ID NO: 74 및 91; (15)SEQ ID NO: 75 및 92; (16)SEQ ID NO: 76 및 93; (17)SEQ ID NO: 77 및 94; (18)SEQ ID NO: 78 및 95; 또는(19)SEQ ID NO: 79 및 96; 과 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고, 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 SEQ ID No: 97, 99 또는 129와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 SEQ ID No: 98 또는 130와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 상기 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 PD-1에 결합한다. SEQ ID NO: 97 및 99의 이러한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 126 및 128의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. SEQ ID NO: 98은 SEQ ID NO: 127에 의해 암호화될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되며, 각 중쇄는 상기 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR서열을 포함하고, 각 경쇄는 상기 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 CDR서열을 포함하며, 상기 항체는 PD-1에 결합한다. 본 발명의 항체는 예컨대 IgG1, IgG2 또는 IgG4이소형과 같은 전장 항체일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 예컨대 Fab 또는 Fab'2단편과 같은 단일 사슬 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 기존 기술의 항PD-1항체(예를 들어, Nivolumab)보다 인간PD-1에 대한 결합 친화도가 높고, 6.36×10-9M 또는 더욱 낮은 KD로 인간PD-1에 결합하며, PD-L1와 PD-1의 결합을 억제한다. 기존의 항PD-1항체(예를 들어, Nivolumab)와 비교하면, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분도 더 좋지는 않지만 유사한 항 종양 효과를 제공한다.
본 발명은 또한 치료제(예를 들어, 세포 독소)와 연결되는 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 포함하는 면역 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체 또는 그 항원 결합 부분과 상이한 결합 특이성을 갖는 제 2 기능성 모이어티(예를 들어, 제 2 항체)에 연결된 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 포함하는 이중 특이적 분자를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부분으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 종양 용해성 바이러스에 의해 암호화되거나 또는 종양 용해성 바이러스와 결합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분 또는 면역 접합체, 이중 특이적 분자, 종양 용해성 바이러스 또는 CAR, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산 분자 및 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 또한, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 항PD-1항체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,(i) 숙주 세포에서 항체를 발현하는 단계, 및,(ii) 숙주 세포 또는 그 세포 배양물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 대상체에 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 투여함으로써 대상체의 면역 반응을 조절하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 대상체에서 면역 반응을 향상, 자극 또는 증가시킨다. 일 실시 형태에서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 이중 특이적 분자, 면역 접합체, CAR-T세포, 항체 암호화 또는 항체 보유 종양 용해성 바이러스를 투여하거나 또는 대안적으로, 이것들을 대상체에서 발현할 수 있는 핵산 분자를 투여하는 단계;를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 대상체에 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함한다. 종양은 고형 종양 또는 비 고형 종양일 수 있고, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 결장 선암, 췌장암, 결장암, 위장 암, 전립선 암, 방광암, 신장 암, 난소 암, 자궁 경부암, 유방암, 폐암, 신세포암 및 비인두암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시 형태에서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 이중 특이적 분자, 면역 접합체, CAR-T세포 또는 암호화 항체 또는 항체 보유 종양 용해성 바이러스를 투여하거나 또는 대상체에서 이것들을 발현할 수 있는 핵산 분자를 투여하는 단계;를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 대상체에 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 이중 특이적 분자, 면역 접합체, CAR-T세포 또는 암호화 항체 또는 항체 보유 종양 용해성 바이러스를 투여하거나 또는 대상체에서 이것들을 발현할 수 있는 핵산 분자를 투여하는 단계;를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 대상체에(i)항원; (ii)항체 또는 그 항원 결합 부분;을 투여함으로써 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 항원은 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터 유래된 항원일 수 있다.
본 발명의 항체는 적어도 한가지 다른 시약과 조합하여 사용될 수 있으며, 상기 시약은 예컨대 면역 자극 항체(예를 들어, 항PD-L1항체 및/또는 항CTLA-4항체), 사이토카인(예를 들어, IL-2 및/또는 IL-21) 또는 공동 자극 항체(예를 들어, 항CD137 및/또는 항GITR항체)일 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, Genbank항목, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 인용을 통해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
도 1은 인간화 항PD-1항체 huClEl-V10의 융해곡선이다.
도 2는 인간화 항PD-1항체 huClE1-V10의 크기 배제 크로마토그래피 결과이다.
본 발명의 내용을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어에 대해 정의한다. 또한, 상세한 설명에서 추가적으로 정의될 것이다.
용어 “PD-1”은 세포 예정사 단백질-1을 가리킨다. 용어 “PD-1”은 변이체, 이소형, 상동체, 이종상 동체 및 파라로그를 포함한다. 예를 들어, 인간 PD-1 단백질에 특이적인 항체는 특정 경우에 원숭이와 같은 인간 이외의 종의 PD-1 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 인간 PD-1 단백질에 특이적인 항체는 인간 PD-1 단백질에 대해 완전히 특이적일 수 있고 다른 종 또는 다른 유형에 대한 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있으며; 또는 다른 모든 종은 아니지만 특정 다른 종의 PD-1과 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 PD-1"은 Genbank 수탁 번호 NP_005009.2를 갖는 인간 PD-1의 아미노산 서열과 같은 인간 유래 아미노산 서열을 갖는 PD-1 단백질을 가리킨다. 용어 "원숭이 또는 레서스　원숭이 PD-1" 및 "마우스 PD-1"은 예컨대 각각 Genbank수탁 번호가 NP_001107830 및 CAA48113인 아미노산 서열과 같은 원숭이 및 마우스 PD-1 서열을 가리킨다.
용어 "면역 반응"은 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간(항체, 사이토카인 및 보체 포함)에 의해 생성된 가용성 거대 분자의 작용을 의미하며, 침입한 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포 또는 자가 면역 또는 병리적 염증의 경우의 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 손상, 파괴 또는 제거한다.
"항원 특이적 T세포 반응"은 T세포 특이적 항원으로 T세포를 자극함으로써 발생하는 T세포에 의한 반응을 가리킨다. 항원 특이적 자극 시 T세포에 의한 반응의 비 제한적인 예는 증식 및 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2 생산)을 포함한다. 항원 특이적 자극에 대한 T세포 반응의 비 제한적인 예는 증식 및 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2 생산)을 포함한다.
본 발명에서 용어 “항체”는 온전한 항체 및 그 임의의 항원 결합 단편(즉, “항원 결합 부분”) 또는 그 단일 사슬을 포함한다. 온전한 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 두개의 중쇄(H) 및 두개의 경쇄(L)를 포함하여 구성된 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3등 세개의 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임 워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역 글로불린과 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개할 수 있으며, 상기 숙주 조직 또는 인자는 면역시스템의 각종 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체의 항원 결합 부분"(또는 "항체 부분"이라 약칭)은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, PD-1 단백질)을 가리킨다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는(i)VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2 개의 Fab단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH도메인으로 구성된 Fv단편,(v) VH도메인으로 구성된 dAb단편(Ward et al.,(1989) Nature 341:544-546); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및,(viii) 단일 가변 도메인 및 2 개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 나노바디;를 포함한다. 또한, Fv단편의 두 도메인인VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 상기 합성 링커는 그것들이 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 하는데, 여기서VL 및 VH영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(ScFv)라고 하며, 예를 들어, Bird et al.,(1988) Science 242:423-426; 및 ,Huston et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883를 참조할 수 있음)를 형성한다. 이러한 단일 사슬 항체 또한 항체의 "항원 결합 부분"에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 이들 단편의 유용성은 온전한 항체와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
본 발명에서 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 포함되지 않은 항체를 가리킨다(예를 들어, PD-1단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 실질적으로 PD-1 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 포함되지 않음). 그러나, 인간 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 PD-1 단백질과 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 포함되지 않을 수 있다.
본 발명에서 용어 “단일 클론 항체” 또는 “단일 클론 항체 조성물”은 단일 분자로 구성된 항체 분자 제제를 가리킨다. 단일 클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 용어 "마우스 항체"는 프레임 워크 및 CDR 영역 모두가 마우스 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 가리킨다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 마우스 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 마우스 항체는 마우스 생식 계열 면역 글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험 관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 용어 "마우스 항체"는 다른 포유 동물 종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 마우스 프레임 워크 서열에 이식된 항체를 포함하지 않는다.
용어 "키메라 항체"는 비 인간 공급원의 유전 물질과 인간의 유전 물질을 결합하여 만든 항체를 가리킨다. 또는, 보다 일반적으로, 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질과 다른 종의 유전 물질을 갖는 항체이다.
본 발명에서 용어 "인간화 항체"는 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키기 위해 단백질 서열이 변형된 비 인간 종으로부터 유래된 항체를 가리킨다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 가리킨다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 발명에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 서로 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 "인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 "항체는 인간 PD-1 단백질(및 가능하게는 하나 이상의 비 인간 종으로부터 유래된 PD-1 단백질에 결합하는 항체)에 결합하지만, 비 PD-1 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 가리킨다. 바람직하게는, 항체는 "고친화도", 즉5.0 x10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1.0x10-8 M이하, 더 바람직하게는7.0x10-9 M이하의 KD로 인간 PD-1 단백질에 결합한다.
본 발명에서 용어 "실질적으로 단백질 또는 세포에 결합하지 않는다"는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 높은 친화도로 결합하지 않는 것을 가리키는데, 즉, 단백질 또는 세포에 결합하는KD가 1.0x10-6 M이상, 더 바람직하게는 1.0x10-5 M이상, 더 바람직하게는 1.0x10-4 M이상, 더 바람직하게는 1.0x10-3 M이상, 훨씬 더 바람직하게는 1.0x10-2 M이다.
용어 IgG 항체에 대한 "고친화도"는 항체가 표적 항원에 대한 KD가 1.0x10-6이하, 보다 바람직하게는 5.0x10-8 M이하, 더욱 바람직하게는 1.0x10-8 M이하, 더욱 더 바람직하게는 7.0x10-9 M이하, 더욱 바람직하게는 1.0x10-9 M이하인 경우를 가리킨다. 그러나, "고친화도"결합은 다른 항체 이소형에 대해 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도"결합은 KD가10-6 M이하, 더욱 바람직하게는 10-7M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-8M 이하인 항체를 가리킨다.
본 발명에서 용어 “Kassoc” 또는 “Ka”는 특정 항체 항원 상호 작용의 결합 속도를 가리키는 반면, 용어 “Kdis” 또는 “Kd”는 특정 항체 항원 상호 작용의 해리 속도를 가리킨다. 본 발명에서 용어 “KD”는 해리 상수를 가리키며, Kd와 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표시된다. 항체에 대한 KD값은 업계에 주지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이며, 바람직하게는 BiacoreTM시스템과 같은 바이오 센서 시스템을 사용하는 것이다.
용어 "EC50"은 최대 유효 농도의 절반을 의미하며, 특정 노출 시간 이후 기준선과 최대값 사이의 중간에 반응을 유도하는 항체의 농도를 가리킨다.
용어 “IC50”는 최대 억제 농도의 절반을 의미하며, 항체의 부재에 비해 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 50%억제하는 항체의 농도를 가리킨다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비 인간 동물을 포함한다. 용어 "비 인간 동물"은 포유류 및 비 포유류 동물을 포함하는 모든 척추 동물, 비 인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직하게는, 비 인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말과 같은 포유류이다.
용어 "치료적 유효량"은 질병 또는 병증(예를 들어, 암)와 관련된 증상을 예방 또는 개선하거나 질병 또는 병증의 중증도를 감소시키기에 충분한 본 발명의 항체의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 치료되는 병증과 관련이 있는 것으로 이해되며, 실제 유효량은 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 다음 서브 섹션에서 더 자세히 설명될 것이다.
인간 PD-1에 대한 결합 친화도가 증가하고 더 나은 항 종양 효과를 갖는 항PD-1 항체
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 인간 PD-1에 특이적으로 결합하며, 상기에 설명된 항PD-1 항체, 특히 Nivolumab에 비해 개선된 결합 친화도 뿐만 아니라, 더 우수하지는 않지만 유사한 항 종양 효과를 갖는다.
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 바람직하게는 7.0x10-9 M이하의 KD, 보다 바람직하게는 5.0x10-10 M이하의 KD로 인간 PD-1 단백질에 결합한다. 본 발명의 항체는 또한 약 1.0x10-7 M 내지 1.0x10-10 M의 KD로 사이노몰구스 원숭이PD-1에 결합한다.
추가 기능 속성에는PD-1/PD-L 1 상호 작용을 차단하는 기능이 포함된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 Nivolumab과 유사한 농도에서 PD-1와 PD-L1의 결합을 억제할 수 있다.
다른 기능적 특성에는 항원 특이적 T세포 반응과 같은 면역 반응을 자극하는 항체의 능력이 포함된다. 해당 능력은 예를 들어 항원 특이적 T세포 반응에서 인터루킨2(IL-2)의 생성을 자극하는 항체의 능력을 평가함으로써 테스트할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체는 인간 PD-1에 결합하고 항원 특이적 T세포 반응을 자극한다. 다른 실시 형태에서, 항체는 인간 PD-1에 결합하지만, 항원 특이적 T세포 반응을 자극하지 않는다. 면역 반응을 자극하는 항체의 능력을 평가하기 위한 다른 방법에는 생체 내 종양 이식 모델에서와 같이 종양의 성장을 억제하는 능력을 평가하거나, 또는 자가 면역 모델에서의 자가 면역 질환의 발달을 촉진하는 능력 또는 NOD 마우스 모델에서 당뇨병의 발달을 촉진하는 능력과 같은 자가 면역 반응을 자극하는 능력을 평가하는 방법이 포함된다.
본 발명의 바람직한 항체는 인간 단일 클론 항체이다. 또한, 대안적으로, 항체는 예를 들어 키메라 또는 인간화 단일 클론 항체일 수 있다.
단일 클론 항PD-1 항체
본 발명의 바람직한 항체는 하기 및 하기 실시예에 기재된 바와 같이 구조적 및 화학적으로 특징화된 단일 클론 항체이다. 항PD-1항체의 VH아미노산 서열은 SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 또는 79에 제시되어 있다. 항PD-1항체의 VL아미노산 서열은 SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 96에 제시되어 있다. 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 ID 번호는 아래 표 1에 요약되어 있으며, 일부 클론은 동일한 VH 또는 VL을 공유한다. 모든 클론의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 SEQ ID NO:97 또는 129에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역일 수 있고, 모든 클론의 경쇄 불변 영역은 예를 들어 SEQ ID NO:98 또는 130에 제시된 아미노산 서열을 갖는 kappa 불변 영역일 수 있다. 항체 Fab는 중쇄/경쇄 가변 영역, 중쇄 CH1영역(예를 들어, SEQ ID NO:99에 제시된 영역) 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
표1. 중쇄/경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 ID번호
표 1의 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 각각 IMGT 넘버링 체계 및 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 그러나, 업계에 잘 알려진 바와 같이, CDR 영역은 또한 중쇄/경쇄 가변 영역 서열에 기초하여 Chothia 및 CCG 시스템/방법과 같은 다른 시스템에 의해 결정될 수 있다.
인간 PD-1에 결합하는 다른 항PD-1 항체의VH 및 VL서열(또는 CDR 서열)을 본 발명의 항PD-1항체의 VH 및 VL서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL사슬(또는 그러한 사슬 내의 CDR)이 혼합되고 일치될 때, 특정 VH/VL쌍으로부터의 VH서열은 구조적으로 유사한 VH서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게는 특정 VH/VL쌍으로부터의 VL서열은 구조적으로 유사한 VL서열로 대체된다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은,
(a) 상기 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및,
(b) 상기 표 1에 나열된 아미노산 서열 또는 다른 항PD-1 항체의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역 - 상기 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합함 - ; 을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분은,
(a) 상기 표 1에 나열된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및,
(b) 상기 표 1에 나열된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3영역 또는 다른 항PD-1항체의 CDR영역 - 상기 항체는 인간PD-1에 특이적으로 결합함 - ; 을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 항체 또는 그 항원 결합 부분은 항PD-1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2 영역 및 인간 PD-1에 결합하는 다른 항체의 CDR을 포함하는데, 예를 들어 중쇄 가변 영역의 CDR1 및/또는 CDR3, 및/또는 상이한 항PD-1 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함한다.
또한, CDR3도메인이 CDR1 및/또는 CDR2도메인과 독립적이고 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 독립적으로 결정할 수 있으며, 공통 CDR3 서열을 기반으로 생성된 동일한 결합 특이성을 갖는 다양한 항체를 예측 가능하다는 것은 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Klimka el al.,, British J. of Cancer 83(2):252-260(2000); Beiboer el al.,, J. Mol. Biol. 296:833-849(2000); Rader et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915(1998); Barbas et al.,, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162(1994); Barbas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2529-2533(1995); Ditzel et al.,, J. Immunol. 157:739-749(1996); Berezov et al.,, BIAjournal 8: Scientific Review 8(2001); Igarashi et al.,, J. Biochem(Tokyo) 117:452-7(1995); Bourgeois et al.,, J. Virol 72:807-10(1998); Levi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8(1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329(1994)鹿섟Xu and Davis, Immunity 13:37-45(2000)를 참조할 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,951,646호; 제6,914,128호; 제6,090,382호; 제6,818,216호; 제6,156,313호; 제6,827,925호; 제5,833,943호; 제5,762,905호 및 제5,760,185호를 참조할 수 있다. 상기 각각의 참고 문헌은 그 전체가 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
따라서, 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 항PD-1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2 및 항PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 CDR3, 또는 다른 항PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3을 포함하며, 상기 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체는 바람직하게는(a) PD-1과의 결합을 위해 경쟁하고; (b) 기능적 특성을 유지하며; (c) 동일한 에피토프에 결합하며; 및/또는,(d) 본 발명의 항PD-1 항체와 유사한 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 항체는 항PD-1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2 또는 다른 항PD-1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 항PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, 또는 다른 항PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다.
보수적 변형
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 보존적 변형에 의해 본 발명의 항PD-1 항체의 서열과 상이한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 당업자는 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 예를 들어, Brummell et al.,(1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al.,(1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al.,(1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al.,(1992 ) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and O'Connell(1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al.,(1998) Int. Immunol. 10.341-6 및 Beers et al.,(2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43를 참조할 수 있다.
따라서, 일 실시 형태에서, 상기 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서,
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 상기 표 1에 나열된 서열 및/또는 그 보존적 변형을 포함하며; 및/또는,
(b) 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 상기 표 1에 나열된 서열 및/또는 그 보존적 변형을 포함하며; 및/또는,
(c) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 상기 표 1에 나열된 서열 및 그 보존적 변형을 포함하며; 및/또는,
(d) 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 상기 표 1에 나열된 서열, 및/또는 그 보존적 변형을 포함하며;
(e) 상기 항체는 인간PD-1에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 인간 PD-1에 대한 고친화도 결합 및 PD-1 발현 세포에 대해 ADCC 또는 CDC를 유도하는 능력과 같은 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는다.
다양한 실시 형태에서, 항체는 예를 들어 마우스, 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 현저하게 영향을 미치거나 항체의 결합 특성을 변경하지 않는 아미노산 변형을 가리킨다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 추가 및 결실이 포함된다. 변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 업계에 공지된 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트 산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 본 명세서에 설명된 기능 분석 방법을 사용하여 변경된 항체의 유지된 기능(즉, 상기에 설명된 기능)에 대해 테스트할 수 있다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본 발명의 항PD-1 항체의 하나 이상의 VH/VL서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 하나 이상의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내(예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임 워크 영역 내) 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 또한, 대안적으로, 예컨대 항체의 작동 기능을 변경하는 것과 같이, 항체는 불변 영역 내 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
일부 실시 형태에서, CDR 이식을 사용하여 항체의 가변 영역을 조작할 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호 작용한다. 따라서, CDR 내부의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체간에 차이가 더 크다. CDR 서열이 대부분의 항체의 항원 상호 작용을 담당하기 때문에, 다른 항체의 프레임 워크 서열에 이식된 특정 자연 발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체(예를 들어, Riechmann et al.,(1998) Nature 332:323-327; Jones et al.,(1986) Nature 321:522-525; Queen et al.,(1989) Proc. Natl. Acad를 참조할 수 있다. 또한, U.S.A. 86: 10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호를 참조할 수 있음)를 발현할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시 형태는 분리된 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분에 관한 것으로, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 상기한 바와 같은 본 발명의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상기한 바와 같은 본 발명의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 이들 항체는 본 발명의 단일 클론 항체의VH 및 VL CDR서열을 포함하지만, 상이한 프레임 워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프레임 워크 서열은 생식 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식 계열 DNA 서열은 "VBase"인간 생식 계열 서열 데이터베이스(사이트 주소: www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), 및 위에서 인용된 Kabat et al.,(1991); Tomlinson et al.,(1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; 및, Cox et al.,(1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836에서 찾을 수 있고, 각각의 내용은 인용을 통해 본 명세서에 포함된다. 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식 계열 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 다음 중쇄 생식 계열 서열은 수반된 Genbank 수탁 번호:1-69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3-33(NG--0010109 & NT--024637) 및 3-7(NG--0010109 & NT--024637)로부터 얻을 수 있다. 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 다음 중쇄 생식 계열 서열은 수반된 Genbank 수탁 번호:1-69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5-51(NG--0010109 & NT--024637), 4-34(NG--0010109 & NT--024637), 3-30.3(CAJ556644) & 3-23(AJ406678)로부터 얻을 수 있다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 잘 알려진 Gapped BLAST(Altschul et al.,(1997), supra)라는 서열 유사성 검색 방법 중 하나를 사용하여 컴파일된 단백질 서열 데이터베이스와 비교된다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 바람직한 프레임 워크 서열은 본 발명의 항체에 의해 사용되는 프레임 워크 서열과 구조적으로 유사한 것 들이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 프레임 워크 서열이 유래하는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에서 발견된 것과 동일한 서열을 갖는 프레임 워크 영역에 이식할 수 있거나, CDR 서열을 생식 계열 서열에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임 워크 영역에 이식할 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키기 위해 프레임 워크 영역 내 잔기를 돌연변이시키는 것이 유익하다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화도)을 개선한다. 돌연변이를 도입하기 위해, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR 매개 돌연변이 유발을 수행할 수 있고, 업계에 공지된 시험관 내 또는 생체 내 분석을 통해 항체 결합 또는 원하는 다른 기능적 특성을 평가할 수 있다. 바람직하게는, 업계에 공지된 바와 같이, 보존적 변형을 도입한다. 돌연변이는 아미노산 치환, 추가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 일반적으로 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항PD-1단일 클론 항체 또는 그 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역은, (a) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1영역; (b) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는VH CDR2영역; (c) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3영역; (d) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는VL CDR1영역; (e) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2영역; 및, (f) 본 발명의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3영역;을 포함한다.
본 발명의 조작된 항체는 예컨대 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임 워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 항체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 프레임 워크 변형을 수행하여 항체의 면역 원성을 감소시킨다. 예를 들어, 한가지 방법으로는 하나 이상의 프레임 워크 잔기를 상응하는 생식 계열 서열로 "역 돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 상기 항체가 유래된 생식 계열 서열과 다른 프레임 워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임 워크 서열을 항체가 유래된 생식 계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임 워크 변형은 프레임 워크 영역 내 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역 원성을 감소시키는 것이다. 상기 방법은 "탈 면역화"라고도 하며, 미국 특허 공개 제20030153043호에 더 자세히 설명되어 있다.
또한, 프레임 워크 또는 CDR영역 내에서 이루어진 변형에 대한 대안으로서, 본 발명의 항체는 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있으며, 일반적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존성 세포 독성을 변경시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위해 그의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다.
일 실시 형태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 상기 방법은 미국 특허 제5,677,425 호에 자세히 설명되어 있다. CH1의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
또 다른 실시 형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 포도상구균 단백질A(SpA) 결합을 손상 시키도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3도메인 인터페이스 영역으로 도입된다. 상기 방법은 미국 특허 제6,165,745호에 자세히 설명되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 상기 항체에 글리코실화가 없음). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임 워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 글리코실화의 제거는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호를 참조할 수 있다.
또한, 대안적으로, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저 푸코실화된 항체 또는 증가된 양분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같이 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 메커니즘를 사용하여 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 메커니즘을 갖는 세포는 업계에 알려져 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709에는 푸코실 트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(α(1,6)-푸코실 트랜스퍼라제)이 없기 때문에 Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체는 탄수화물에 푸코스가 부족하다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/-세포주는 두개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적을 파괴하는 것에 의해 생성된다(미국 특허 공개 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki et al.,(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 설명하며, 상기 유전자는 세포주에서 발현된 항체가 α-1,6 결합 관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타내도록 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화한다. EP 1,176,195는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸 글루코사민 또는 예를 들어 뮤린 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)과 같이 효소 활성이 낮거나 효소 활성이 없는 세포주에 푸코스를 첨가하는 것에 대해 설명하였다. PCT 공개 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)에 연결된 탄수화물에 부착하는 능력을 저하시키고 상기 숙주 세포에서 발현된 항체의 저 푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주 Lec13 세포를 설명하고 있다(Shields et al.,(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). PCT 공개 WO 06/089231에 기술 된 바와 같이, 변형된 글리코실화 특징을 갖는 항체는 닭 계란에서도 생산될 수 있다. 또는, 변형된 글리코실화 특징을 갖는 항체는 Lemna와 같은 식물 세포에서 생산될 수 있다. 2006 년 8 월 11 일에 출원된 Alston & Bird LLP 변호사 문서 번호 040989/314911에 해당하는 미국 특허 출원에 식물 시스템에서 항체를 생성하는 방법이 개시되었다. PCT 공개 WO 99/54342는 당 단백질 변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, β아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주에 대해 설명하였는데, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 양분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다(Umana et al.,(1999) Nat. Biotech. 17:176-180 참조). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제α-L-푸코시다제는 항체에서 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino et al.,(1975) Biochem. 14:5516-23).
본 발명에서 기대하는 본 발명의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는 예를 들어 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 일반적으로 하나 이상의 PEG그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착된 조건에서 항체 또는 항체의 단편이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응하게 한다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 발명에서 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10)알콕시-또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하는 임의의 형태의 PEG를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 페길화될 항체는 비 글리코실화 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 업계에 공지되어 있으며 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EPO 154 316 및 EP 0 401 384를 참조할 수 있다.
항체의 물리적 특성
본 발명의 항체는 검출 및/또는 다른 부류와 구별하기 위해, 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 글리코 실화 부위는 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 면역 원성을 증가시키거나 항체의 pK를 변경시킬 수 있다(Marshall et al(1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison(2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al(1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro(2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al(1985) Nature 316:452-7; Mimura et al.,(2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 일부 예에서, 가변 영역 글리코 실화를 포함하지 않는 항PD-1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역에 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택하거나 글리코실화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 항체는 아스파라긴 이성질체 부위를 포함하지 않는다. 아스파라긴의 탈 아미드화는 N-G 또는 D-G서열에서 발생할 수 있으며, 폴리펩티드 사슬에 연결을 도입하고 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 초래할 수 있다(이소아스파르트산 효과).
각 항체는 일반적으로 6에서 9.5 사이의 pH범위에 속하는 고유한 등전점(pI)을 갖는다. IgG1 항체에 대한 pI는 일반적으로 pH 범위 7-9.5에 속하고 IgG4 항체에 대한 pI는 일반적으로 pH 범위 6-8에 속한다. 정상 범위를 벗어난 pI를 가진 항체는 생체 내 조건에서 약간의 풀림 및 불안정성을 가질 수 있다는 추측이 있다. 따라서, 정상 범위에 속하는 pI 값을 포함하는 항PD-1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위의 pI를 갖는 항체를 선택하거나 하전된 표면 잔류물을 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 CDR을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물에 존재하거나 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "분리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA 일 수 있고, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현된 항체의 경우(예를 들어, 아래에 추가로 설명되는 바와 같이 인간 면역 글로불린 유전자를 보유하는 트랜스 제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마), 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역 글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 기술 사용)에서 얻은 항체의 경우 이러한 항체를 암호화하는 핵산을 유전자 라이브러리에서 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 PD-1 단일 클론 항체의 VH 및 VL서열 또는 CDR을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. VH 및 VL 단편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 DNA 단편을 추가로 조작할 수 있는데, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환할 수 있다. 이러한 조작에서VL 또는 VH를 암호화하는 DNA 단편을 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결한다. 본 발명에서 용어 "작동적으로 연결"은 2 개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임 내에 남아 있도록 2 개의 DNA 단편을 연결하는 것을 의미한다.
VH를 암호화하는 DNA와 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자를 작동적으로 연결함으로써, VH영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 전환할 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH를 암호화하는 DNA를 중쇄 CH1불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결할 수 있다.
VL를 암호화하는 DNA를 경쇄 불변 영역CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써, VL영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 경쇄 유전자( 및 Fab 경쇄 유전자)로 전환할 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH 및 VL를 암호화하는 DNA 단편과 유연한 링커를 암호화(예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호화)하는 다른 단편을 작동적으로 연결함으로써, VH 및 VL서열이 연속적인 단일 사슬 단백질로 발현되게 하며, 상기 VL 및 VH는 유연한 링커에 의해 결합 된다(예를 들어, Bird et al.,(1988) Science 242:423-426; Huston et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348:552-554).
본 발명의 단일 클론 항체의 제조
본 발명의 단일 클론 항체(mAbs)는 Kohler and Milstein(1975) Nature 256:495의 잘 알려진 체세포 혼성화(하이브리도마) 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 단일 클론 항체의 제조를 위한 다른 실시 형태에는 B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질 전환 및 파지 디스플레이 기술이 포함된다. 키메라 또는 인간화 항체도 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, U.S. Pat. 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370를 참조할 수 있으며, 이러한 내용은 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 단일 클론 항체를 제조하는 형질 감염 종의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어 업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질 감염 방법의 조합(예를 들어, Morrison, S.(1985) Science 229:1202)을 사용하여 숙주 세포 형질 감염 종에서 제조될 수 있다. 일 실시 형태에서, 표준 분자 생물학 기술에 의해 수득된 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터에 삽입함으로써, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되도록 한다. 본 발명에서 용어 "작동적으로 연결"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 기능을 제공하도록 항체 유전자를 벡터에 연결하는 것을 의미한다.
용어 "조절 서열"은 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990))에 설명되어 있다. 포유 동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유 동물 숙주 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소가 포함되는데, 예를 들어, 거대 세포 바이러스(CMV), 유인원 바이러스40(SV40), 아데노 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마와 같은 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 β글로빈 프로모터와 같은 비 바이러스 조절 서열이 사용될 수 있다. 또한, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터의 서열과 인간 T세포 백혈병 바이러스1 형의 긴 말단 반복 서열(Takebe et al.,(1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)을 포함하는 SRα 프로모터 시스템과 같은 다양한 소스의 서열로 구성된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 가변 영역을 원하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화한 발현 벡터에 삽입하여 VH세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트에 작동적으로 연결되고 VL 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동적으로 연결되게 함으로써, 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성한다. 또한, 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내로 연결되도록 벡터로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역 글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비 면역 글로불린 단백질로부터 유래된 신호 펩티드) 일 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 및 선별 가능한 마커 유전자에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점)과 같은 다른 서열을 운반할 수 있다. 선별 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호 및 제5,179,017 호 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 DHFR 숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자(G418 선별 용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질 감염한다. 용어 "형질 감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하기 위한 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어 전기 천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질 감염 등을 포함한다. 이론적으로는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것이 가능하지만, 가장 바람직하게는 진핵 세포, 특히 포유 동물 숙주 세포에서 항체를 발현하는데, 왜냐하면, 이러한 진핵 세포, 특히 포유 동물 세포가 원핵 세포보다 접힌 면역 활성 항체의 조립과 분비에 더욱 적절하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유 동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO세포)(Urlaub and Chasin,(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 설명된 dhfr-CHO 세포 포함, 예를 들어 R. J. Kaufman and P. A. Sharp(1982) J. Mol. Biol. 159:601-621에 설명된 DHFR 선택 마커와 함께 사용), NSO골수종 세포, COS세포 및 SP2세포를 포함한다. 특히 NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유 동물 숙주 세포에 도입할 때, 항체가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 항체를 제조하거나, 보다 바람직하게는 항체를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지에 분비하여 항체를 제조한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지에서 회수할 수 있다.
면역 접합체
본 발명의 항체는 항체-약물 접합체(ADC)와 같은 면역 접합체를 형성하기 위해 치료제에 접합될 수 있다. 적합한 치료제는 세포 독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 인터칼레이터, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 수출 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열충격 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항유사분열제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 펩티딜, 디설파이드 또는 히드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 예를 들어 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다. ADC는 다음과 같은 미국 특허의 설명에 의해 제조될 수 있다. 즉, 미국 특허 제7,087,600호; 제6,989,452호; 및, 제7,129,261호; PCT공개WO 02/096910; WO 07/038,658; WO 07/051,081; WO 07/059,404; WO 08/083,312; 및, WO 08/103,693; 미국 특허 공개 제20060024317호; 제20060004081호; 및, 제20060247295호. 그 개시 내용은 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
이중 특이적 분자
다른 측면에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 연결된 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 이중 특이적 분자를 특징으로 하여 2개 이상의 서로 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중 특이적 분자를 생성한다. 따라서, 본 발명에 사용된 "이중 특이적 분자"는 3 개 이상의 특이적 분자를 포함한다.
일 실시 형태에서, 이중 특이적 분자는 항Fc 결합 특이성 및 항PD-1 결합 특이성 이외에 제3 특이성을 갖는다. 제3 특이성은 항 증강 인자(EF), 예를 들어 세포 독성 활성과 관련된 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자에 대한 것 일 수 있다. 예를 들어, 항 증강 인자는 세포 독성 T세포(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, PD-1 또는 ICAM-1을 통해) 또는 기타 면역 세포에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
이중 특이적 분자는 다양한 형식과 크기로 존재할 수 있다. 크기 스펙트럼의 한쪽 끝에서, 이중 특이적 분자는 동일한 특이성을 갖는 두 개의 결합 팔을 갖는 대신 각각 다른 특이성을 갖는 두개의 결합 팔을 갖는 것을 제외하고는 전통적인 항체 형식을 유지한다. 다른 극단에는 펩타이드 사슬로 연결된 두개의 단일 사슬 항체 단편(scFv), 소위 Bs(scFv) 2 구조로 구성된 이중 특이적 분자가 있다. 중간 크기의 이중 특이적 분자에는 펩티딜 링커에 의해 연결된 두개의 서로 다른 F(ab) 단편이 포함된다. 이들 및 기타 형식의 이중 특이적 분자는 유전 공학, 체세포 혼성화 또는 화학적 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기에 인용된 Kufer et al; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9(6), 635-644(1998); 및 van Spriel et al., Immunology Today, 21(8), 391-397(2000) 및 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다.
항체 암호화 또는 항체 보유 종양 용해성 바이러스
종양 용해성 바이러스는 암세포를 우선적으로 감염시키고 죽인다. 본 발명의 항체는 종양 용해성 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체를 암호화하는 종양 용해성 바이러스를 인체에 도입할 수 있다.
약학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 항체는 조성물이 하나 이상의 항체를 포함할 때 개별적으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로 하나 이상의 다른 약학적 활성 성분, 예를 들어 다른 항체 또는 약물, 예를 들어 항 종양 약물을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 수량의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장제 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 Gennaro, ed., Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed.(Lippincott Williams & Wilkins 2003)를 참조할 수 있으며, 그 개시 내용은 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라 활성 성분을 물질에 코팅하여 산 및 불활성화를 초래할 수 있는 기타 자연 조건으로부터 보호할 수 있다. 본 발명에서 용어 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 이에 제한되지는 않지만 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 캡슐 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 경기 관, 피하, 피하, 관절 내, 피막 하, 지주막 하, 척추 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강 내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 그들은 또한 마이크로 에멀젼, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬 된 구조로 제형화 될 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라지며, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분 범위이며, 약제학적으로 허용되는 담체와의 조합이다.
최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 투여량을 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할된 용량을 시간이 지남에 따라 투여될 수도 있으며, 또는 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해, 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에서 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함한다. 대안적으로, 항체는 서방성 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다.
항체 투여에 관해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg 범위 일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 체중 범위에 속할 수 있다. 예시적인 치료 요법은 주 1 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 4 주에 1 회, 한 달에 1 회, 3 개월에 1 회 또는 3-6 개월에 1 회 투여할 수 있다. 본 발명의 항PD-1 항체의 바람직한 투여 요법은 정맥 내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하며, 항체는 다음 투여 일정 중 하나에 따라 투여한다. 즉: (i) 매 4 주 6 회 투여, 그 후 매 3 주 1회 투여; (ii) 매 3 주 1회; (iii) 3 mg/kg 체중 1 회, 그 후 매 3 주마다 1 mg/kg 체중. 일부 방법에서, 용량이 약 1-1000㎍/ml(일부 방법에서 약 25-300㎍/ml)의 혈장 항체 농도에 도달하도록 조정한다.
본 발명의 항PD-1 항체의 "치료학적 유효 투여량"은 바람직하게는 질병 증상의 중증도 감소, 질병 무증상 기간의 빈도 및 기간 증가, 또는 질병의 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 예를 들어, 종양 보유 대상체의 치료를 위해, "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 치료되지 않은 대상체에 비해 종양 성장을 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%를 억제한다. 치료적 유효량의 치료용 항체는 일반적으로 인간 또는 다른 포유 동물일 수 있는 대상체의 종양 크기를 감소시키거나 그렇지 않으면 증상을 개선할 수 있다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로 캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 에틸렌비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토 에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체 적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조할 수 있다.
치료 조성물은 다음의 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 즉:(1) 바늘 없는 피하 주사 장치(예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 및 제4,596,556)호); (2) 미세 주입 펌프(미국 특허 제4,487,603호); (3) 경피 장치(미국 특허 제4,486,194호); (4) 주입 장치(미국 특허 제4,447,233호 및 제4,447,224호); 및,(5) 삼투 장치(미국 특허 제4,439,196호 및 제4,475,196호). 그 개시 내용은 인용을 통해 본 발명에 포함된다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 단일 클론 항체는 생체 내에서 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료용 항체가 혈액 뇌 장벽을 통과하도록 보장하기 위해, 이들을 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키기 위해 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있는 리포좀으로 제형화할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,416,016호; 및, 제5,399,331호; V. V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al.,(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al.,(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al.,(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al.,(1995 ) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al.,(1994) J Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen(1994) FEBS Lett. 346: 123; 및, Killion and Fidler(1994) Immunomethods 4:273를 참조할 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체(조성물, 이중 특이적 항체, 면역 접합체 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 다른 형태)는 예를 들어 PD-1의 차단에 의한 면역 반응의 향상을 포함하는 수많은 시험 관내 및 생체 내 유용성을 갖는다. 항체는 다양한 상황에서 면역을 향상시키기 위해 배양된 세포, 시험 관내 또는 생체 외 또는 인간 대상체, 예를 들어 생체 내에 투여될 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부분을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 반응은 강화, 자극 또는 상향 조절된다.
바람직한 대상체는 면역 반응의 향상이 필요한 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 면역 반응(예를 들어, T세포 매개 면역 반응)을 증가시킴으로써 치료할 수 있는 장애를 가진 인간 환자를 치료하기에 특히 적합하다. 특정 실시 형태에서, 상기 방법은 생체 내 암 치료에 특히 적합하다. 항원 특이적 면역 강화를 달성하기 위해, 항PD-1 항체는 원하는 항원과 함께 투여될 수 있거나 해당 항원이 치료 될 대상체(예를 들어, 종양 보유 또는 바이러스 보유 대상체)에 이미 존재할 수 있다. PD-1에 대한 항체가 다른 약제와 함께 투여될 때, 이들은 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항PD-1 항체가 PD-1 및 PD-L1 및/또는 PD-L2 분자의 결합을 억제하고 항원 특이적 T세포 반응을 자극할 수 있는 사실을 고려하여, 본 발명은 또한 항체를 사용하여 항원 특이적 T세포의 반응을 자극, 향상 또는 상향 조절하기 위한 시험관 내 및 생체 내 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항원 특이적 T세포 반응을 자극하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 T세포를 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 항원 특이적 T세포의 반응을 자극하는 단계를 포함한다. 항원 특이적 T세포 반응의 적절한 지표를 사용하여 항원 특이적 T세포 반응을 측정할 수 있다.
이러한 적합한 지표의 비 제한적인 예는 항체의 존재하에 증가된 T세포 증식 및/또는 항체의 존재하에 증가된 사이토카인의 생성을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 항원 특이적 T세포를 자극하여 인터루킨2를 생성한다.
본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응(예를 들어, 항원 특이적 T세포 반응)을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 본 발명의 항체를 투여함으로써 대상체의 면역 반응(예를 들어, 항원 특이적 T세포 반응)을 자극하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 대상체는 종양 보유 대상체이고, 상기 종양에 대한 면역 반응을 자극한다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 대상체는 바이러스 보유 대상체이고, 바이러스에 대한 면역 반응을 자극한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체를 대상체에 투여하여 대상체에서 종양 성장을 억제하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체를 대상체에 투여함으로써 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 방법 및 다른 방법은 아래에서 더 상세히 설명한다.
암
항체에 의한 PD-1의 차단은 환자의 암세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일 측면에서, 본 발명은 암성 종양의 성장이 억제되도록 항PD-1 항체를 사용하여 생체 내에서 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 항PD-1 항체는 암성 종양의 성장을 억제하기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 항PD-1 항체는 암 치료에 사용되는 다른 면역 원성 제제, 예컨대 종양 용해성 바이러스 또는 기타 항체와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 유효량의 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 마우스, 키메라 또는 인간화 항PD-1 항체이다.
본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 바람직한 암은 일반적으로 면역 요법에 반응하는 암을 포함한다. 치료를 위한 바람직한 암의 비 제한적인 예는 원발성 또는 전이성을 물론하고, 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장 암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선 암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암), 유방암, 결장암 및 폐암(예를 들어, 비소 세포 폐암)을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 불응성 또는 재발성 악성 종양을 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 뇌 또는 경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위 암, 위암, 고환암, 난관암, 자궁내막 암, 자궁 경부암, 질암, 외음부 암, 호지킨병, 비호 지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비 계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우요관암, 중추신경계 림프종(CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척수 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평세포암, T세포 림프종, 환경 적 석면에 의해 유도된 암 및 상기 암의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-1을 발현하는 전이성 암(Iwai et al.(2005) Int. Immunol. 17: 133-144)의 치료에 유용하다.
선택적으로, PD-1에 대한 항체는 암 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 형질 감염된 세포(He et al(2004) J. Immunol. 173:4919-28)와 같은 면역 원성 작용제와 조합될 수 있다. 사용될 수 있는 종양 백신의 비 제한적인 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예를 들어 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질 감염된 종양 세포를 포함한다.
PD-1 차단은 백신 접종 프로토콜과 조합될 때 더 효과적일 가능성이 있다. 종양 예방 접종을 위한 다양한 실험 전략이 디자인되었다(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; 및, Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al.(eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition 참조). 이러한 전략 중 하나는 자가 또는 동종 종양 세포를 사용하여 백신을 제조한다. 이러한 세포 백신은 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 형질 도입될 때 가장 효과적인 것으로 나타났다. GM-CSF는 종양 백신 접종을 위한 항원 제시의 강력한 활성제 인 것으로 나타났다(Dranoff et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43).
다양한 종양에서의 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원의 정의(Rosenberg, SA(1999) Immunity 10: 281-7)를 이끌어 냈다. 많은 경우에, 이러한 종양 특이적 항원은 예를 들어 멜라닌 세포 항원 gp100, MAGE 항원 및 Trp-2과 같은 종양과 종양이 발생한 세포에서 발현되는 분화 항원이다. 더 중요한 것은, 이러한 항원의 대부분이 숙주에서 발견되는 종양 특이적 T세포의 표적임을 증명할 수 있다는 것이다. PD-1 차단은 이들 단백질에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 함께 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 일반적으로 면역계에서 자가 항원으로 간주되므로 내성이 있다. 종양 항원에는 염색체의 텔로미어 합성에 필요하고 인간 암의 85% 이상과 제한된 수의 체세포에서만 발현되는 단백질 텔로머라제가 포함될 수 있다(Kim et al.(1994) Science 266: 2011-2013). 이러한 체세포 조직은 다양한 방법으로 면역 공격으로부터 보호될 수 있다. 종양 항원은 또한 단백질 서열을 변경하거나 두개의 관련되지 않은 서열(즉, 필라델피아 염색체의 bcr-abl)간에 융합 단백질을 생성하는 체세포 돌연변이 또는 B세포 종양의 이디오타입으로 인해 "신생 항원"이 될 수 있다.
다른 종양 백신에는 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스(HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스(KHSV)와 같은 인간 암과 관련된 바이러스의 단백질이 포함될 수 있다. PD-1차단제와 함께 사용할 수 있는 또 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체에서 분리된 정제된 열충격 단백질(HSP)이다. 이러한 열충격 단백질은 종양 세포의 단백질 단편을 포함하며, 이러한 HSP는 종양 면역을 유도하기 위해 항원 제시 세포에 전달하는데 매우 효율적이다(Suot & Srivastava(1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al.(1997) Science 278: 117-120).
수지상 세포(DC)는 항원 특이적 반응을 프라이밍하는데 효과적인 항원 제시 세포이다. DC는 생체 외에서 생산될 수 있으며 다양한 단백질 및 펩티드 항원 뿐만 아니라 종양 세포 추출물을 로딩할 수 있다(1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC는 또한 이러한 종양 항원을 발현하기 위해 유전적 수단에 의해 형질 도입될 수 있다. DC는 또한 면역화 목적으로 종양 세포에 직접 융합된다(Kugler et al.(2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신 접종 방법으로서, DC 면역화는 PD-1 차단제와 효과적으로 결합되어 보다 효과적인 항 종양 반응을 활성화 할 수 있다.
PD-1 차단제는 또한 표준 암 치료와 조합될 수 있다. PD-1 차단제는 화학 요법과 효과적으로 결합될 수 있다. 이러한 경우, 투여되는 화학 요법 시약의 용량을 줄이는 것이 가능할 수 있다(Mokyr et al.(1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 흑색종 치료를 위한 데카르 바진과 항PD-1 항체의 조합이다. 이러한 조합의 또 다른 예는 흑색종 치료를 위한 항PD-1항체와 인터루킨2(IL-2)의 조합이다. PD-1 차단제와 화학 요법을 병용하는 과학적 근거는 대부분의 화학 요법 화합물의 세포 독성 작용의 결과는 세포 사멸이며, 항원 제시 경로에서 종양 항원 수준을 증가시켜야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통해 PD-1 차단과 시너지를 유발할 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술 및 호르몬 박탈이다. 이러한 각 프로토콜은 숙주에서 종양 항원의 소스를 생성한다. 혈관 신생 억제제도 PD-1 차단과 결합될 수 있다. 혈관 신생의 억제는 종양 세포의 사멸로 이어지며, 이는 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로로 보낼 수 있다.
PD-1 차단 항체는 또한 Fcα 또는 Fcγ수용체 발현 이펙터 세포를 종양 세포에 표적화하는 이중 특이적 항체와 조합하여 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,922,845호 및 제5,837,243호 참조). 이중 특이적 항체를 사용하여 두개의 개별 항원을 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, 항Fc 수용체/항 종양 항원(예를 들어, Her-2/neu) 이중 특이적 항체는 이미 대식세포를 종양 부위에 표적화하기 위해 사용되었다. 이러한 표적화는 종양 특정 반응을 보다 효과적으로 활성화할 수 있다. 이러한 반응의 T세포 암은 PD-1 차단의 사용에 따라 증가될 것이다. 대안적으로, 항원은 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중 특이적 항체의 사용에 의해 DC에 직접 전달될 수 있다.
종양은 다양한 메커니즘을 통해 숙주 면역 감시를 회피한다. 이러한 메커니즘의 대부분은 종양에 의해 발현되고 면역 억제성인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 여기에는 특히 TGF-β(Kehrl et al.(1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10(Howard & O'Garra(1992) Immunology Today 13: 198-200) 및 Fas리간드(Hahne et al.(1996) Science 274: 1363-1365)가 포함된다. 이들 각각에 대한 항체는 항PD-1과 조합하여 면역 억제제의 효과를 상쇄하고 숙주에 의한 종양 면역 반응을 추진하기 위해 사용될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화하는 다른 항체는 항PD-1과 함께 사용될 수 있다. 여기에는 DC 기능과 항원 제시를 활성화하는 수지상 세포 표면의 분자가 포함된다. 항CD40 항체는 T세포 도우미 활성(Ridge et al.(1998) Nature 393:474-478)을 효과적으로 대체할 수 있으며, PD-1 항체와 함께 사용할 수 있다(Ito et al.(2000) Immunobiology 201(5) 527-40). T세포 공동 자극 분자에 대한 항체, 예를 들어 CTLA-4(예를 들어, 미국 특허 제5,811,097호), OX-40(Weinberg et al.(2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB(Melero et al.(1997) Nature Medicine 3: 682-685(1997)) 및 ICOS(Hutloff et al.(1999) Nature 397: 262-266)를 활성화하면 T세포 활성화 수준을 향상시킬 수 있다.
또한 종양에 대한 항원 특이적 T세포를 자극하기 위해 생체 외 활성화 및 항원 특이적 T세포의 확장 및 수용자에게 이들 세포의 입양 전달을 포함하는 여러 실험적 치료 프로토콜이 있다(Greenberg & Riddell(1999) Science 285: 546-51). 이러한 방법은 CMV와 같은 감염원에 대한 T세포 반응을 활성화하기 위해 사용할 수 있다. 항PD-1 항체의 존재 하에서 생체 외 활성화는 입양 전달된 T세포의 빈도와 활성을 증가시킬 수 있다.
감염성 질환
본 발명의 다른 방법은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 감염성 질환이 치료되도록 대상체에 항PD-1 항체 또는 그 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 키메라 또는 인간화 항체이다.
상기한 바와 같이 종양에 대한 적용과 유사하게, 항체 매개 PD-1 차단은 병원체, 독소 및 자가 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 백신과 함께 단독으로 또는 보조제로서 사용될 수 있다. 이러한 치료 방법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예로는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체 또는 기존 백신이 완전히 효과적이지 않은 병원체가 포함된다. 여기에는 HIV, 간염(A, B 및 C), 인플루엔자, 헤르페스, 지아르디아, 말라리아, 레슈마니아, 황색포도상구균, 녹농균이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. PD-1차단제는 감염 과정에서 변경된 항원을 제시하는 HIV와 같은 제제에 의한 확립된 감염에 특히 유용하다. 이러한 새로운 에피토프는 항 인간 PD-1 투여 시 이물질로 인식되어 PD-1을 통한 음성 신호에 의해 감쇠되지 않는 강력한 T세포 반응을 유발한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인바 바이러스), 아데노 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비 바이러스, 에코바이러스, 라이노 바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보 바이러스, 백시 니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연체 동물 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보 바이러스 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 일부 예는 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코 박테리아, 포도상 구균, 연쇄상 구균, 폐렴 구균, 수막 구균 및 임균, 클레 브시 엘라, 프로테우스, 세라 티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라 균, 디프테리아, 살모넬라 균, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 전염병, 렙토스피라증 및 라임병 박테리아를 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, tropicalis, etc.), 크립토코커스 네오포르만스, 아스페르길루스(fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales(mucor, absidia, rhizopus), 스포로트릭스 센키, 블라스토미세스 더마티티디스, 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스, 콕시디오이데스 이미티스 및 히스토플라스마 캡슐라툼을 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타메바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이, 네글레리아 파울러리, 아칸타메바 종, 지아르디아람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움 종(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라즈 모디움 비벡스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 크루즈 트리파노소마(Trypanosoma cruzi), 도노반리슈 만편모충(Leishmania donovani), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 또쥐모양선충(Nippostrongylus brasiliensis)을 포함한다.
상기 모든 방법에서, PD-1 차단제는 사이토카인 치료(예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2) 또는 이중 특이적 항체 요법과 같은 다른 형태의 면역 요법과 조합될 수 있으며, 종양 항원의 향상된 제시를 제공한다(예를 들어, Holliger(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak(1994) Structure 2: 1121-1123참조).
자가 면역 반응
항PD-1 항체는 자가 면역 반응을 유발하고 증폭할 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩티드 백신을 사용한 항 종양 반응의 유도는 많은 항 종양 반응이 항 자기 반응을 포함한다는 것을 보여준다(van Elsas et al.(2001) J. Exp. Med. 194:481-489;Overwijk, et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987;Hurwitz,(2000) 상기와 동일함; Rosenberg & White(1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1): 81-4). 따라서, 질병 치료를 위해 이러한 자기 단백질에 대한 면역 반응을 효율적으로 생성하기 위한 백신 프로토콜을 디자인하여 다양한 자기 단백질과 함께 항PD-1 차단제를 사용하는 것을 고려할 수 있다.
알레르기 및 천식 치료를 위한 IgE 및 류마티스 관절염을 위한 TNFα와 같은 다른 자가 단백질도 표적으로 사용될 수 있다. 마지막으로 항PD-1 항체를 사용하여 다양한 호르몬에 대한 항체 반응을 유도할 수 있다. 생식 호르몬에 대한 항체 중화 반응은 피임에 사용될 수 있다. 특정 종양의 성장에 필요한 호르몬 및 기타 용해성 인자에 대한 항체 반응을 중화시키는 것도 가능한 예방 접종 표적으로 간주될 수 있다.
상기한 바와 같은 항PD-1 항체의 사용에 관한 유사한 방법은 치료적 자가 면역 반응의 유도 및 다른 자가 항원(예를 들어, 사이토카인, TNFα 및 IgE)의 부적절한 축적을 갖는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
조합 요법
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항PD-1 항체(또는 그 항원 결합 부분)을 면역 자극에 효과적인 하나 이상의 다른 항체와 공동으로 투여함으로써 대상체의 면역 반응을 더욱 강화, 자극 또는 상향 조절하는 조합 요법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 항PD-1 항체 및 하나 이상의 다른 면역 자극 항체(예를 들어, 항LAG-3항체, 항PD-L1항체 및/또는 항CTLA-4항체)를 투여함으로써 예를 들어 종양 성장을 억제하거나 항 바이러스 반응을 자극하는 등 대상체에서 면역 반응을 자극한다. 다른 실시 형태에서, 대상체에 항PD-1 항체 및 항LAG-3 항체가 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체에 항PD-1 항체 및 항PD-L1 항체가 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체에 항PD-1 항체 및 항CTLA-4 항체가 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 다른 면역 자극 항체(예를 들어, 항PD-1, 항PD-L1 및/또는 항CTLA-4 항체)는 인간 항체이다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 면역 자극 항체는 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다(예를 들어, 마우스 항LAG-3, 항PD-L1 및/또는 항CTLA-4 항체로부터 제조됨).
다른 실시 형태에서, 본 발명은 PD-1 항체 및 CTLA-4 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 과다증식성 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 치료 용량 이하의 용량으로 항PD-1 항체를 투여하거나, 또는 치료 용량 이하의 용량으로 항CTLA-4 항체를 투여하거나 또는 치료 용량 이하의 용량으로 상기 양자를 투여한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 면역 자극제를 사용한 과다증식성 질환의 치료와 관련된 부작용을 수정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 항PD-1 항체 및 항CTLA-4 항체의 치료 용량 이하의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 다른 실시 형태에서, 항CTLA-4항체는 인간 서열 단일 클론 항체 10D1(PCT공개WO 01/14424에 기재 됨)이고, 항PD-1 항체는 항PD-1 항체C1H5와 같은 마우스 서열 단일 클론 항체이다. 본 발명의 방법에 포함되는 다른 항CTLA-4항체는 예를 들어 WO 98/42752;WO 00/37504; 미국 특허 제6,207,156호; Hurwitz et al.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al.(2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505(antibody CP-675206); 및, Mokyr et al.(1998) Cancer Res. 58:5301-5304에 개시된 항체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 항CTLA-4 항체는 5x10-8 M이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하고, 1x10-8 M이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하고, 5x10-9 M 이하인 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 1x10-8 M 내지 1x10-10 M이하인 KD로 인간 CTLA-4에 결합한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 과다증식성 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항PD-1 항체 및 항LAG-3 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 과다증식성 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항PD-1 항체 및 항PD-L1 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
항체에 의한 PD-1 및 하나 이상의 제2 표적 항원, 예컨대 CTLA-4 및/또는 LAG-3 및/또는 PD-L1의 차단은 환자의 암 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 암은 일반적으로 면역 요법에 반응하는 암을 포함한다. 본 발명의 조합 요법으로 치료할 수 있는 암의 대표적인 예는 상기 항PD-1 항체를 사용한 단일 요법의 설명에서 구체적으로 나열된 암을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명에서 설명된 치료용 항체의 조합은 약학적으로 허용되는 담체에서 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있거나, 또는 약학적으로 허용되는 담체 내의 각 항체와 함께 개별 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 순차적으로 치료용 항체의 조합을 투여할 수 있다.
또한, 조합 요법의 1회 이상의 용량이 순차적으로 투여되는 경우, 순차적 투여의 순서는 각 투여 시점에서 동일한 순서로 반전되거나 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여와 조합될 수 있거나, 임의로 조합될 수 있다.
종양은 매우 다양한 메커니즘에 의해 숙주 면역 감시를 회피한다. 이러한 메카니즘의 대부분은 종양에 의해 발현되고 면역 억제성인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 여기에는 특히 TGF-β(Kehrl et al.(1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10(Howard & O'Garra(1992) Immunology Today 13: 198-200) 및 Fas리간드(Hahne et al.(1996) Science 274: 1363-1365)가 포함된다. 또 다른 예에서, 이들 각각에 대한 항체는 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체 조합과 추가적으로 조합되어 면역 억제의 작용을 중화하고 숙주에 의한 항 종양 면역 반응에 도움이 된다.
숙주 면역 반응성을 활성화하기 위한 다른 항체는 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체와 추가적으로 조합하여 사용될 수 있다. 여기에는 DC기능과 항원 제시를 활성화하는 수지상 세포 표면의 분자가 포함된다. 항CD40 항체(Ridge et al., supra)는 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 조합과 함께 사용할 수 있다(Ito et al. al., supra). T세포 공동 자극 분자에 대한 다른 활성화 항체(Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra)는 또한 높은 수준의 T세포 활성화를 제공할 수 있다.
상기한 바와 같이, 골수 이식은 현재 조혈 기원의 다양한 종양을 치료하기 위해 사용되고 있다. 조합된 PD-1 및 CTLA-4 및/또는 LAG-3 및/또는 PD-L1 차단제는 기증자 이식의 종양 특이적 T세포의 효과를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실험적 치료 프로토콜은 생체 외 활성화 및 항원 특이적 T세포의 확장 및 종양에 대한 항원 특이적 T세포의 수용자에게 이들 세포의 입양 전달에 관한 것이다(Greenberg & Riddell, supra). 이러한 방법은 CMV와 같은 감염원에 대한 T세포 반응을 활성화하는데도 사용될 수 있다. 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체의 존재하에서 생체 외 활성화는 입양 전달된 T세포의 빈도와 활성을 증가시키는 것으로 예상할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 면역 자극제를 사용한 과다증식성 질환(예를 들어, 암)의 치료와 관련된 부작용을 수정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 항PD-1 항체 및 치료 용량 이하 용량의 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1항체를 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 비 흡수성 스테로이드를 환자에게 투여함으로써 면역 자극 치료용 항체 유도성 대장염 또는 설사의 발생을 감소시키는 방법을 제공한다. 면역 자극 치료 항체가 사용될 환자는 이러한 항체에 의해 유도된 대장염 또는 설사를 일으킬 위험이 있기 때문에, 전체 환자 그룹이 모두 본 발명의 방법에 따른 치료에 적합하다. 스테로이드는 염증성 장 질환(IBD)을 치료하고 IBD의 악화를 예방하기 위해 투여되지만, IBD로 진단되지 않은 환자에서 IBD를 예방(IBD발생 감소)하는데 사용되지 않는다. 스테로이드(심지어 비 흡수성 스테로이드)와 관련된 중요한 부작용은 예방적 사용을 방해한다.
추가적인 실시 형태에서, PD-1과 CTLA-4 및/또는 LAG-3 및/또는 PD-L1 차단의 조합(즉, 면역 자극 치료 항체 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG -3 항체 및/또는 항PD-L1 항체)는 임의의 비 흡수성 스테로이드를 사용한 조합과 추가적으로 조합될 수 있다. 본 발명에서 "비 흡수성 스테로이드"는 간에서 대사 후에 스테로이드의 생체 이용률이 낮게, 즉 약 20% 미만이 되도록 광범위한 1차 통과 대사를 나타내는 글루코 코르티코이드이다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 비 흡수성 스테로이드는 부데소니드(budesonide)이다. 부데소니드는 국소적으로 작용하는 글루코 코르티코 스테로이드로서, 경구 투여 후 주로 간에서 광범위하게 대사된다. ENTOCORT ECTM(Astra-Zeneca)는 회장 및 결장 전체에 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소나이드의 pH 및 시간 의존적 경구 제형이다. ENTOCORT ECTM는 회장 및/또는 상행 결장과 관련된 경증에서 중증 크론병 치료제로서 미국에서 승인되었다. 크론병 치료를 위한 ENTOCORT ECTM의 일반적인 경구 투여량은 6 ~ 9mg/일이다. ENTOCORT ECTM는 장에서 방출되어 장 점막에 흡수 및 유지된다. ENTOCORT ECTM는 장 점막 표적 조직을 통과하면 간에서 사이토크롬 P450 시스템에 의해 글루코코르티코이드 활성이 미미한 대사 산물로 광범위하게 대사된다. 따라서, 생체 이용률이 낮다(약 10%). 부데소나이드의 생체 이용률이 낮으며, 1차 통과 대사를 가진 다른 글루코 코르티코이드에 비해 치료율을 향상시킬 수 있다. 부데소나이드는 전신적으로 작용하는 코르티코 스테로이드보다 시상 하부 뇌하수체 억제가 적으며, 부작용이 적다. 그러나 ENTOCORT ECTM을 장기적으로 사용하면 고피질 및 부신 억제와 같은 전신 글루코 코르티코이드 효과를 초래할 수 있다. PDR 58th　ed. 2004; 608-610를 참조할 수 있다.
다른 실시 형태에서, PD-1과 CTLA-4 및/또는 LAG-3 및/또는 PD-L1 차단의 조합(즉, 면역 자극 치료 항체 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항 LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체)는 비 흡수성 스테로이드와 함께 살리실레이트와 추가적으로 조합될 수 있다. 살리실레이트는 5-ASA시약, 예를 들어, 설파살라진(AZULFIDINETM, Pharmacia & UpJohn); 오살라진(olsalazine)(DIPENTUMTM, Pharmacia & UpJohn); 발살라지드(balsalazide)(COLAZALTM, Salix Pharmaceuticals, Inc.); 및, 메살라민(mesalamine)(ASACOLTM, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASATM, Shire US; CANASATM, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASATM, Solvay)을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 살리실레이트를 항PD-1 및 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체 및 비 흡수성 스테로이드와 조합하여 투여하는 경우는 면역 자극 항체에 의해 유도된 대장염의 발생을 감소시키기 위한 목적으로 살리실레이트 및 비 흡수성 스테로이드의 임의의 중복 또는 순차적 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명에 따른 면역 자극 항체에 의해 유도된 대장염의 발생을 감소시키기 위한 방법은 살리실레이트와 비 흡수성 물질을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나 또는 그 임의의 조합을 포함한다(예를 들어, 살리실레이트는 비 흡수성 스테로이드 투여 후 6 시간 후에 투여 됨). 또한, 본 발명에 따르면, 살리실레이트와 비 흡수성 스테로이드는 동일한 경로(예를 들어, 모두 경구 투여) 또는 다른 경로(예를 들어, 살리실레이트는 경구 투여되고 비 흡수성 스테로이드는 직장에 투여)를 통해 투여할 수 있으며, 항PD-1과 항CTLA-4 및/또는 항LAG-3 및/또는 항PD-L1 항체의 조합을 투여하기 위한 경로와 다를 수 있다.
하기 실시예를 통해 본 발명에 대해 추가적으로 설명하며, 이는 본 발명을 추가적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서의 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고 문헌, Genbank 서열, 특허 및 개시된 특허 출원의 내용은 모두 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예1 하이브리도마 기술을 이용한 마우스항PD-1단일 클론 항체
면역접종
E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998에 설명된 방법에 따라 마우스를 면역화한다. C말단에 인간 IgG1 Fc 태그가 있는 재조합 인간 PD-1 단백질(Acro biossystems, # PD-1-H5257, 세포 외 도메인 포함, AA Leu25-Gln 167)을 면역원으로 사용한다. 인간 PD-1-His 단백질(Sino biological, #10377-H08H)은 항혈청 역가를 결정하고 항원 특이적 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하기 위해 사용된다.
구체적으로, 각 동물에 완전 프로이트 보조제(Sigma, St. Louis, Mo., USA) 중의 25μg의 인간 PD1 Fc 단백질을 주입한 다음, 항혈청 역가에 따라 불완전 프로이트 보조제( Sigma, St. Louis, Mo., USA) 중의 25μg의 인간 PD1 Fc 단백질을 주입하여 면역화를 2-3 배 강화한다. 항혈청 역가는 재조합 인간 PD1-his 단백질을 사용하여 ELISA 기반 스크리닝에 의해 측정된다. 간단히 말하면, 희석된 혈청(60μl)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 40분 동안 배양한다. 이어서 플레이트를 4회 세척하고 HRP-염소 항 마우스-IgG(Jackson Immuno research, Cat# 115-036-071)를 사용하여 검출하며, 450nm에서 결합 OD를 관찰한다. 역가가 좋은 동물은 하이브리도마 융합 전에 복강 내 주사를 통해 마지막으로 한번 더 면역화를 강화한다.
하이브리도마 융합 및 스크리닝
마우스 골수종 세포주(SP2/0-Agl4, ATCC#CRL-l58l)를 융합하기 전에 대수 성장기까지 배양한다. 면역화된 마우스의 비장 세포를 멸균 제조하고 Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497(1975)에 설명된 방법에 따라 골수종 세포와 융합한다. 융합된 "하이브리드 세포"를 DMEM/20% FCS/HAT배지의 96웰 플레이트에 분배한다. 융합 7 ~ 10 일 후, 현미경으로 하이브리도마 세포 콜로니의 생존을 관찰한다. 2주 후, 재조합 인간 PD1-his 단백질을 사용하여 각 웰의 상청액을 ELISA로 스크리닝한다. 간단히 말하면, ELISA 플레이트는 4℃에서 60 μl의 인간 PD1-his(Sino biological, #10377-H08H, PBS중 2.0 μl/ml)로 밤새 코팅한다. 플레이트를 PBST로 4 회 세척하고 200μl의 블록킹 버퍼(PBST 중 5% 무 지방 우유)로 차단한다. 희석된 하이브리도마 상청액(60μl)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 40분 동안 배양한다. 이어서 플레이트를 4회 세척하고 HRP-염소 항 마우스-IgG(Jackson Immuno research, Cat#l 15-036-071)를 사용하여 검출하며, 450nm에서 결합OD를 관찰한다. 그런 다음, 인간 PD1-his에 결합하는 양성 하이브리도마 분비 항체를 선택하고 24 웰 플레이트로 옮긴다. 높은 특이적 결합 및 PD1/PDL1 차단 활성을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 서브 클로닝하고, 서브 클론에 의해 생성된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토 그래피로 정제한다. 간단히 말하면, PBS 완충용액을 사용하여 5 내지 10 컬럼 부피로 단백질 A 세 파로스 컬럼(출처 bestchrom(Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273)을 세척한다. 세포 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 PBS완충용액을 사용하여 컬럼을 세척한다. 컬럼을 용출 완충액(0.1M 글리신-HCl, pH 2.7)으로 용출하고 즉시 중화 완충액(1M Tris-HCl, pH 9.0)을 사용하여 1.5ml 튜브에 수집한다. IgG를 포함하는 성분을 혼합하고, PBS에서 4 °C에서 밤새 투석한다.
실시예2 BIACORE 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용한 마우스 항PD-1 단일 클론 항체의 친화도 측정
Biacore T200시스템(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 의해 실시예1에서 생성된 정제된 항PD-1마우스 단일 클론 항체(mAb)(즉, 클론C1E1, D1F2, C1F5, D1A1, D1F1, C1E2, C1A1, C1F4, D2C2, 2G2 및 C1C5, 나중에 모두IgG1/κ이소형으로 결정됨)의 친화도 및 결합 동역학에 대해 특성화한다.
간단히 말하면, Biacore에서 제공하는 표준 아민커플링키트(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 1 차 아민을 통해 염소 항 마우스 IgG(GE healthcare, Cat#BRl 00839, Human Antibody Capture Kit)를 CM5칩(카복시 메틸 덱스 트란 코팅된 칩)에 공유 연결한다. 바이오 센서 표면의 미 반응 부분은 에탄올 아민으로 차단한다. 이어서 정제된 항PD-1 항체와 66.7 nM 농도의 니볼루맙(OPDIVO®을 10 μL/min의 유속으로 칩에 흘린다. 그런 다음 HBS EP 완충용액(Biacore에서 제공)에 있는 재조합 인간 PD-1-his(Sino biological, #10377-H08H) 또는 사이노몰구스 원숭이PD-1-his 단백질(Acro biosystems, # PD-1-C5223)을 30 μL/min의 유속에서 칩에 흘린다. 항원-항체 결합 동역학을 2분 동안 추적하고 해리 동역학을 10분 동안 추적한다. 결합 및 해리 곡선은 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 적합시킨다.
ka, kd 및 KD값을 결정하고 아래 표 2에 나타낸다.
표2. 인간 또는 사이노몰구스 원숭이PD-1에 결합하는 마우스 항PD-1단일 클론 항체의 Biacore동역학
본 발명의 항체는 니볼루맙(Nivolumab)보다 낮은 KD로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하며, 이는 인간 PD-1에 대한 더 높은 친화도를 나타낸다.
실시예3 마우스 항PD-1 단일 클론 항체의 결합 활성
96 웰 마이크로 플레이트를 PBS중의 2μg/ml 염소 항 마우스 IgG Fcγ 단편(Jackson Immuno Research, # 115-006-071, 100μg/well)으로 코팅하고 4°C에서 밤새 배양한다. 플레이트를 세척 완충용액(PBS + 0.05 % Tween-20, PBST)으로 4 회 세척한 다음, 37℃에서 2 시간 동안 200μl/웰 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방우유)으로 차단한다. 플레이트를 다시 세척하고 실시예 1의 100 μl/웰의 정제된 항PD-1 항체 및 Nivolumab(0.004-66.7 nM, PBST 중의 2.5% 무지방우유에 5 배 연속 희석)와 함께 37℃에서 40분 동안 배양하고 다시 4회 세척한다. 포획된 항PD-1 항체를 포함하는 플레이트를 비오틴 표지된 인간 PD-1 Fc 단백질(SEQ ID NO:100, PBST 중의 2.5% 무지방우유 중의 60 nM, 100 μl/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 배양한다. 4회 세척하고, 스트렙 타비딘 접합HRP(PBST중에서 1:10000희석, Jackson Immuno Research, #016-030-084, 100 μg/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 배양한다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 μl/웰 ELISA 기질 TMB(Innoreagents)와 함께 배양한다. 50μl/well의 1M H2SO4를 사용하여 25°C에서 15분내로 반응을 종료시키고, 450nm에서 흡광도를 읽는다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 EC50값을 보고한다.
결과는 하기 표 3에 나타낸다.
표3. 항PD-1항체와 인간PD-1의 결합 활성
결과적으로, 본 발명의 항체가 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, 그 중의 몇몇 클론이 니볼루맙(Nivolumab)보다EC50값이 더 낮다.
실시예4 ELISA 및 보고 분석을 사용하여 기능 차단 테스트 수행
4.1리간드 차단 ELISA
경쟁 ELISA 분석을 사용하여 PD-1-PD-L1 상호 작용을 차단하는 본 발명의 항PD-1 항체의 능력을 측정한다. 간단히 말하면, 인간 PD-L1-Fc 단백질(SEQ ID NO:101)을 96-well 미크로 플레이트에 2㎍/mL PBS로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양한다. 다음날, 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% Tween-20, PBST)으로 세척하고 37℃에서 2 시간 동안 PBST에서 5% 무지방우유로 차단한다. 그 다음, 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 세척한다.
비오틴 표지된 인간 PD-1-Fc(SEQ ID NO: 100, PBST 중에서 2.5% 무 지방우유 중의 10nM)에서 본 발명 또는 니볼루맙의 항PD-1 항체의 희석액(100 nM 부터 4 배 연속 희석)을 제조하고, 실온에서 40분 동안 배양 한 다음 항체/PD-1-Fc-비오틴 혼합물(100μl/웰)을 PD-L1 코팅 플레이트에 첨가한다. 37℃에서 40 분 동안 배양 후 세척 완충용액을 사용하여 플레이트를 4회 세척한다. 그 다음, 100 μl/well스트렙 타비딘 접합HRP를 첨가하고 37℃에서 40 분 동안 배양하여 PD-L1에 결합된 비오틴 표지된 인간 PD-1을 검출한다. 다시 세척 완충용액을 사용하여 플레이트를 세척한다. 마지막으로 TMB를 첨가하고, 1M H2SO4를 사용하여 반응을 종료하며, 450 nm에서 흡광도를 읽는다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 IC50값을 보고한다.
4.2벤치 마크 차단 ELISA
경쟁 ELISA 분석을 사용하여 본 발명의 항PD-1 항체의 벤치 마크(Nivolumab)-인간 PD-1 결합을 차단하는 능력을 측정한다. 간단히 말하면, Nivolumab을 PBS에서 2 μg/mL로 96 웰 마이크로 플레이트에 코팅하여 4℃에서 밤새 배양한다. 다음날, 플레이트를 세척 완충용액으로 세척하고, PBST 중 5% 무지방우유로 37°C에서 2 시간 동안 차단한다. 차단하는 동안, 비오틴 표지된 인간 PD-1 Fc(SEQ ID NO: 100, PBST 중에서 2.5% 무지방우유 중의 10nM)을 테스트 할 각 항체(137 pM-100nM, 3 배 연속 희석)와 혼합하고, 25℃에서 40 분 동안 배양한다. 세척 후, PD-1/항체 혼합물(100 μl/웰)을 Nivolumab로 코팅된 플레이트에 첨가하고 37℃에서 40 분 동안 배양한다. 세척 완충액으로 플레이트를 다시 세척한 다음 100 μl/웰SA-HRP에 첨가하고, 37℃에서 40 분 동안 배양하여 Opdivo®에 결합된 비오틴 표지된 인간 PD-1을 검출한다. 마지막으로, 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 세척한다. TMB를 첨가하고 1M H2SO4를 사용하여 반응을 종료하여 450nm에서 흡광도를 읽는다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 IC50값을 보고한다.
4.3세포 기반 기능 분석
세포 기반 리포터 분석을 사용하여 세포막 PD-1/PD-L1 상호 작용을 차단하는 항체의 활성을 평가한다. 해당 분석은 유전적으로 조작된 2가지 세포주, 즉: 인간 PD-1 및 NFAT 반응 요소(NFAT-RE)에 의해 구동되는 루시퍼라제 리포터의 PD-1를 안정적으로 발현하는 이펙터 세포주(Genscript, GS-J2/PD-1), 및 인간 PD-L1 및 조작된 세포 표면 단백질-항원 펩티드/주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 안정적으로 발현하는 PD-L1세포주(Genscript, GS-C2/PD-L1, APC 세포)로 구성된다. 해당 두가지 세포주가 공동 배양될 때, PD-1/PD-L1 상호 작용은 PD-1 이펙터 세포의 T세포 수용체(TCR) 매개 루시퍼라제 발현을 억제한다(NFAT 경로를 통해).
세포 기반 기능 분석은 다음과 같이 수행된다. 간단히 말하면, 로그 단계의 PD-L1세포를 5×105/ml의 밀도로 384 웰 세포 배양 플레이트에 배양한다. 다음날, 분석 완충액(RPMI 1640 + 1％FBS) 중의 본 발명의 항PD-1항체 또는 Nivolumab의 희석용액(333.3 nM에서부터 5배 연속 희석)을 제조한다. 한편, 384웰 플레이트에 있는 PD-L1 세포의 배지를 폐기한 다음, 항PD-1 항체(20 μl/웰) 및 PD-1효과기 세포(밀도6.25×105/m, 20μl/웰)의 희석액을 384 웰 세포 배양 플레이트에 첨가한다. 37℃에서 6 시간 동안 공동 배양한 후, 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 제조업체의 지침에 따라 One-Glo Luciferase Assay 시스템(Promega, # E6120)을 사용하여 각 웰의 발광도를 읽는다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 용량-반응 곡선을 분석하여 EC50 값을 보고한다.
상기 세가지 분석의 결과는 아래 표 4에 나타낸다.
표4. PD-1/PD-L1 상호 작용을 차단하는 항PD-1 항체의 능력
결과적으로, 본 발명의 항체는 인간PD-1/인간PD-L1의 상호 작용을 차단하며, 그중의 몇몇 클론이 EC50 또는 IC50값이 Nivolumab보다 작다.
데이터 결과에 의하면, 본 발명의 항체가 인간 PD-1/Nivolumab 상호 작용을 차단하며, 그중의 클론 2G2로부터 유래된 항체는 부분적으로 차단하는데, 이는 이들이 Nivolumab과 동일하거나 유사한 에피토프에 결합함을 나타낸다.
실시예5 키메라 항체의 생성 및 특성화
항PD1 마우스 mAh C1E1의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 각각 인간 IgG1 중쇄 및 인간κ경쇄의 불변 영역에 프레임으로 클로닝한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 SEQ ID NO: 67 및 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 반면, 인간 IgG1 중쇄 및 인간 κ경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 97 및 98에 제시되어 있다. 생성된 키메라 항체의 활성은 전술한 실시예의 프로토콜에 따라 결합 포획 ELISA, 경쟁 ELISA 및 세포 기반 기능 리포터 분석에서 확인되었다. 데이터 결과에 따르면, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 키메라 C1E1 항체가 벤치 마크(OPDIVO®와 유사한 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
표5. 키메라 항체의 결합 및 기능적 활성
실시예6 항PD-1마우스 단일 클론 항체C1E1의 인간화
마우스 항PD1항체C11E1를 사용하여 인간화 및 추가 연구를 수행한다. 마우스 항체의 인간화는 아래에 기술된 바와 같은 성숙된 CDR이식 방법을 사용하여 수행한다.
마우스 항체 C1E1의 인간화를 위한 수용체 프레임 워크를 선택하기 위해, 인간 면역 글로불린 유전자 데이터베이스에 따라 마우스 C1E1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 블라스팅한다. 마우스 C1E1과 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식 계열 IGVH 및 IGVK를 인간화를 위한 수용체 프레임 워크로 선택한다. 마우스 항체 중쇄/경쇄 가변 영역 CDR을 선택된 프레임 워크에 삽입하고 프레임 워크 내의 잔기를 추가로 돌연변이시켜 더 많은 후보 중쇄/경쇄 가변 영역을 얻는다.
인간화 C1E1 중쇄/경쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 60% 대 40% 경쇄 및 중쇄 구조 비율에 따라 1.2 mg/ml PEI를 사용하여 일시적으로 50ml 293F 현탁 세포 배양물에 형질 감염시킨다. 진탕 플라스크에 6 일 동안 방치한 후 세포 상층액을 수집하고 원심 분리하여 펠릿 세포를 형성하며, IgG 분리 전에 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 항체는 단백질 A 친화도 크로마토 그래피로 정제한다. 간단히 말하면, PBS 완충액을 사용하여 5 ~ 10 컬럼 부피로 단백질 A 세파로스 컬럼(bestchrom(Shanghai) Biosciences, Cat # AA0273)을 세척한다. 세포 상청액을 컬럼에 통과시킨 후 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 PBS 완충용액을 사용하여 컬럼을 세척한다. 컬럼을 용출 완충액(0.1M 글리신-HCl, pH 2.7)으로 용출하고 즉시 중화 완충액(1M Tris-HCl, pH 9.0)이 있는 1.5ml 튜브에 수집한다. IgG를 포함하는 성분을 혼합하고, PBS에서 4 °C에서 밤새 투석한다.
총 10 가지 인간화 항체가 얻어졌고, 그 중 8 가지는 추가로 특성화 되었으며, 즉 huC1E1-V1에서 huC1E1-V7 및 huC1E1-V10까지이다. 상기 표 1에 8가지 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 나타내며, 인간 IgG1 중쇄 및 인간 카파 경쇄 불변 영역 서열은 서열 번호 97 및 98에 나열되어 있다.
실시예 2에 설명된 바와 같이, BIACORE 기술에 의해 huC1E1-V1 내지 huC1E1-V7가 인간 PD1에 대한 결합 친화도를 평가하고, 친화도 KD 값을 하기 표 6에 나타낸다. 염소 항 인간 IgG Fab 포획 항체(Jackson ImmunoResearch, Cat # 109-005-097)를 사용하여 IgG를 포획하는 실시예 3에 설명된 포획 결합 ELISA를 통해 항체 huC1E1-V10과 인간 PD1의 결합 활성을 평가하며, 결합된 EC50 값을 표 7에 나타낸다. 모든 8가지 인간화 항체는 키메라 항체 C1E1과 비슷한 친화도를 갖는다.
표6. 인간화C1E1 mAb의 친화도
표 7. 인간화C1E1 mAb의 결합 활성
이어서 실시예 2 내지 실시예 4의 프로토콜에 따라, Biacore 및 결합 포획 ELISA에 의해 인간화 항체 huClE1-V10의 인간 및 사이노몰구스 원숭이PD1에 대한 친화도를 분석하고, 경쟁 ELISA 및 세포 기반 리포터 분석에 의해 기능적 활성을 평가한다. 표 8에 나타낸 바와 같이, huClE1-V10은 키메라 C1E1 항체와 유사한 시험 관내 활성을 나타냈다.
표 8. 인간화C1E1 mAh의 결합 및 기능적 활성
실시예7 인간화C1E1항체의 물리 화학적 특성
다음에 기재된 단백질 열 이동 분석, cIEF 기술, SEC 기술 및 동결 해동 방법을 사용하여 항PD1 인간화 항체 huC1E1-V10의 물리 화학적 특성을 분석한다.
단백질 열 이동 분석에 의해 Tm을 분석
GloMelt ™열 이동 단백질 안정성 키트(Biotium, Cat # 33022-T, lot #:181214)를 사용하여 항PD1 인간화 항체 huC1E1-V10의 열 안정성을 측정한다. 간단히 말하면, GloMelt ™염료를 해동하고 실온에 도달하도록 한다. 염료가 포함된 바이알을 볼텍싱하고 원심 분리한다. 5 μL 200x 염료를 95 μL PBS에 첨가하여 10x 염료를 제조한다. 총 20 μL 반응 부피에 2 μL 10 x 염료 및 10 μg 항체를 첨가한다. 표 9의 세부 매개 변수를 갖는 용융 곡선 프로그램의 실행을 설정한다. 튜브를 빠르게 회전시키고 실시간 PCR 열 순환기(Roche, LightCycler 480 II)에 배치한다. Microsoft Excel 2010 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석한다.
표9. 융해 곡선 프로그램 매개 변수
pi를 결정하기 위한 CIEF 기술
모세관 등전 포커싱(cIEF)을 사용하여 항PD1 인간화 항체 huC1E1-V10의 pI 및 전하 이질성을 결정한다. 간단히 말하면, 35μL 0.1 % MC, 4μL pH3-10 Pharmlyte, 2μL 0.5mol/L Arg, 1μL Mark-7.05 및 1μL Mark-9.99를 PBS에 20 μg의 항체가 들어 있는 튜브에 첨가한 다음 ddH2O를 100μL까지 첨가한다. 전기 영동 프로그램은 두 단계로 구성된다. 즉: 1500V에서 1 분 동안 분리한 다음 3000V에서 6 분 동안 분리하며; 5 분 노출 후 검출하고, Maurice ™Compass ™ 소프트웨어(Proteinsimple Inc., USA)를 사용하여 데이터를 분석한다.
SEC기술에 의해 응집도 결정
크기 배제 크로마토 그래피(SEC)(Agilent Technologies, 1260 Infinity II)로 단량체의 백분율을 평가한다. 항체를 수성 이동상으로 운반하고 컬럼에 포장된 다공성 고정상 수지를 통과시킨다. 컬럼에서의 머무름 시간은 단백질의 유체 동역학 크기와 패킹된 수지 베드의 기공 크기의 함수이다. 작은 분자는 수지의 작은 구멍으로 침투될 수 있고, 큰 분자보다 머무름 시간이 더 길다. 컬럼에서 용출 후, UV 흡광도로 단백질을 검출한다. 이동상은 인산염 완충 식염수 용액이고, 흡광도는 280 nm에서 모니터링되었다. 유속은 0.8 mL/분이다. 주입 용량은 40μL 1mg/mL샘플 이다. 컬럼 온도는 실온이다. 자동 시료 주입기 온도는 2 - 8 °C이다. 총 실행 시간은 25 분이다.
안정성을 결정하기 위한 동결-해동 방법
1xPBS 제형(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4.12H2O, 2 mmol/L KH2PO4포함) 중의 1mg/ml의 항체 용액을 -80°C에서 적어도 24시간 냉동하고, 그 다음에 실온에서 30-60 분 동안 해동한다. 각 샘플은 동결 및 해동을 5 회 반복한다. 예를 들어, 두번째, 세번째 및 네번째 이후, 다시 동결하기 전에 일부분 용액을 취해 SEC에 의한 분석에 사용한다.
GloMelt ™Thermal Shift Protein Stability Kit로 변성으로 이어지는 불안정성을 평가한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 항PD1 인간화 항체 huC1E1-V10은 일반적으로 78℃에서 높은 융점(Tm)을 나타내고, 69.5℃에서 작은 피크를 나타낸다. huC1E1-V10에 대한 cIEF 분석에 의하면, 주요한 이소형의 백분율은 약 81.5 %이고, 산성 종의 백분율은 약 11.0%이며, 알칼리 종의 백분율은 약 7.5%이다. Maurice™™를 사용하여 pIs를 계산하며, huC1E1-V10 항체의 pI 값은 8.36이다. huC1E1-V10 인간화 항체는 pI가 7보다 현저히 높으므로 중성 pH에서 상당한 양전하를 가질 것으로 예상된다. huC1E1-V10의 SEC 분석에 의하면, 단량체 비율은 100.0%이다(도 2 참조). 동결-해동 안정성은 입자 크기 배제 크로마토 그래피(SEC)로 평가한다. 항체 huC1E1-V10은 동결 및 해동을 5회 반복한 후에 응집 수준이 크게 증가되지 않았고 침전이나 흐림이 관찰되지 않았다.
실시예8 마우스C11E1항체의 생체 내 항 종양 효과
NCG 마우스에서 마우스 C1E1 항체의 생체 내 항 종양 활성을 평가한다. 간단히 말하면, 첫날(제1일)에 5x105개 종양으로 활성화한 PBMC와 혼합된 4x106 개 인간 흑색종 A375 세포를 NCG 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 피하 주사한다. 3주 동안, 매주 2회씩 전자 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하고, 다음과 같이 계산한다. 즉:(길이x폭2)/2. 제14 일째에 24 개의 종양이 있는 마우스를 선택하여 4 개의 그룹으로 무작위로 분류한다. 제14일, 제21일 및 제28일에 동물에게 비히클(5%포도당 용액), 마우스 C1E1 Fab 및 Nivolumab을 3mg/kg의 용량으로 복강 주사한다. 마우스 항체C1E1는 각각 SEQ ID NO: 67, 97, 80 및 98에 제시된 서열을 갖는 마우스 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1불변 영역 및 마우스 경쇄 가변 영역 및 인간Ck1불변 영역을 포함하며, 마우스C1E1 Fab는 각각 SEQ ID NO: 67, 99, 80 및 98에 제시된 서열을 갖는 마우스 중쇄 가변 도메인과 인간IgG1 CH1불변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 인간Ck1불변 도메인을 포함한다.
마우스를 제35일에 안락사시키고 종양을 수집하여 무게를 측정한다. 종양 성장 억제율(%TGI=(1-각 치료군의 평균 종양 부피/대조군의 평균 종양 부피)×100%)을 계산한다.
모든 치료 방법은 종양이 있는 동물에서 잘 견딜 수 있다. 표 10에 나타난 바와 같이, 인간 흑색종 A375 이종 이식 모델에서 마우스 C1E1 3mg/kg 및 마우스 C1E1 Fab 3mg/kg의 치료 효과는 3mg/kg 니볼 루맙보다 현저하게 우수하다.
표10. 인간 흑색종 세포 A375 이종 이식 모델에서 마우스 C1E1 항체의 항 종양 효과
a학생t의 테스트에 의해 매체 대조군과 비교하면, *P<0.05.
실시예9 마우스 C1E1-암호화 서열이 삽입된 헤르페스 바이러스 T3011의 생체 내 항 종양 효과
B16F10-HpD-L1 흑색종 이종 이식 모델에서 마우스 C1E1 항체 암호화 서열이 삽입된 헤르페스 바이러스 T3011의 항 종양 효과를 평가한다.
헤르페스 바이러스 T3011은 UL3-UL4 사이의 게놈 영역에 C1E1 Fab 단편 서열을 삽입하는 것 외에도 역 반복 영역을 제거하여 인간 IL-12 유전자로 대체하는 유전적으로 변형된 단순 헤르페스 바이러스 1 형(HSV-1)이다(예를 들어,PCT/CN2016 / 080025 참조). C1E1 Fab 서열은 각각 SEQ ID NO: 67, 99, 80 및 98에 제시된 서열을 갖는 마우스 중쇄 가변 도메인와 인간 IgG1 CH1 불변 도메인 및 마우스 경쇄 가변 도메인과 인간 Ckappa1 불변 도메인을 포함한다.
간단히 말하면, 암컷 B-hPD-1 인간화 마우스의 우측 전방에 1x105　Bl6FlO-hPD-Ll흑색종 세포를 피하 주사한다. 종양 부피가 약 90 mm3에 도달하면 마우스를 각 그룹에 8 마리씩 5 개 그룹으로 무작위로 분류한다. 이들 마우스의 종양 내에 비히클(5% 포도당 용액), T3011(5×106 PFU/마우스), T3011(1×107 PFU/마우스), T3011(3×107 PFU/마우스) 및 NV1020(3×107 PFU/마우스, 잠재적인 암 치료를 위해 MediGene(이전의 NeuroVir)에서 개발한 재조합 종양 용해성 HSV 기반 바이러스이며, 예를 들어 광범위하게 전처리된 불응성 대장 암에서 간으로 전이된 종양 용해성 단순 헤르페스 바이러스 NV1020의 I/II 상 연구 참조. Hum Gene Ther. 2010 Sep;2l(9): 1119-28)를 투여한다. 종양 부피는 매주 2회 측정한다.
약물 투여 12일 후, 마우스를 안락사시키고 종양을 수집하여 무게를 측정하고 사진을 찍는다. 상대 종양 부피(RTV=TVn/TV0, 여기서 TVn은 제n 일의 종양 부피를 나타내고, TV0는 제0 일의 종양 부피를 나타냄), 종양 성장 억제율(TGI %=1-각 치료 그룹의 평균 종양 부피/대조군의 평균 종양 부피)×100%) 및 종양 중량 억제율(IRTW=(1-각 치료군의 평균 종양 중량/대조군의 평균 종양 중량)×100%)을 계산한다.
다음의 표 11에 나타낸 바와 같이, 마우스 C1E1 항체 암호화 서열이 삽입된 T3011은 용량 의존적인 방식으로 명백한 항 종양 활성을 제공한다. T3011의 투여는 3x l07 PFU/마우스 용량 수준에서 NV1020 의 투여보다 더 우수한 항 종양 효과를 나타냈다.
표11. 마우스 C1E1 암호화 서열이 삽입된 헤르페스 바이러스 T3011이 B16F10-hPD-L1 흑색종 이종 이식 모델에 대한 항 종양 효과
a학생t의 테스트에 의해 매체 대조군과 비교하면, *P<0.05 및 **P<0.01이다.
실시예12 인간화 C1E1 항체의 생체 내 항 종양 효과
MC38 이종 이식 모델에서 인간화 C1E1 항체가 종양 성장에 대한 효과를 평가한다. 간단히 말하면, 오른쪽 뒷쪽에서 암컷 B-hPD-1 마우스에 5xl05세포를 피하 주사한다. 종양 부피가 약 100-150 mm3에 도달하면 마우스를 각 그룹에 8 마리씩 7 개 그룹으로 무작위로 분류한다. 동물에게 비히클(PBS), huC1E1-V10 및 OPDIVO®를 각각 1mg/kg, 3mg/kg 또는 10mg/kg의 용량으로 연속 3 주 동안 매주 2 회씩 복강 내 투여한다. 인간화 항체 huC11-V10는 각각 SEQ ID NO: 69, 97, 86 및 98에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 불변 영역 및 경쇄 가변 영역과 불변 영역을 포함한다. 연구 과정에 종양 부피를 측정한다.
치료 개시 23 일 후, 마우스를 안락사시키고 종양을 수집하여 무게를 측정하고 사진을 찍는다. 종양 부피 성장 억제율(TGITV)을 계산하고 표 12에 나타낸다.
하기 표 12에 나타낸 바와 같이, 모든 치료는 종양 보유 동물에 의해 잘 견뎌졌다. HuClEl-V10치료는 MC38 이종 이식 모델에서 용량 의존적 방식으로 항 종양 활성을 나타냈으며, OPDIVO®와 동등하다.
표12. MC38이종 이식 모델에서 huClEl-V10의 항 종양 효과
a학생t의 테스트에 의해 매체 대조군과 비교하면, *P<0.05 및 **P<0.01이다.
하나 이상의 실시예를 결부하여 본 발명에 대해 상기와 같이 설명하였지만, 본 발명은 이러한 실시예에 제한되지 않으며, 본 발명은 특허청구범위 내에서 실시한 모든 대체, 수정 및 등가물을 포함한다. 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 인용을 통해 본 발명에 포함된다.
본 발명의 서열은 다음과 같이 요약된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biosion Inc. <120> ANTIBODIES BINDING PD-1 AND USES THEREOF <130> 55532 00004 <150> US62/657927 <151> 2018-04-15 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 for C1E1, huC1E1-V1 - huC1E1-V7 and huC1E1-V10 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 for C1E1, huC1E1-V1 - huC1E1-V7 and huC1E1-V10 <400> 2 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 for C1E1, huC1E1-V1 - huC1E1-V7 and huC1E1-V10 <400> 3 Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 for D1F2 <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 for D1F2 <400> 5 Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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for 2G2 <400> 28 Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Gly 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 for 2G2 <400> 29 Ile Ser Ser Gly Ser Ser Phe Thr 1 5 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 for 2G2 <400> 30 Thr Arg Arg Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 for C1C5 <400> 31 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 for C1C5 <400> 32 Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Pro 1 5 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 for C1C5 <400> 33 Val Arg Gln Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Asp Ala Met Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 for C1E1, huC1E1-V1 - huC1E1-V7 and huC1E1-V10 <400> 34 Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser Gly Ile Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> VH for 2G2 <400> 112 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtacag cctctggatt cactttcagt tactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggaatg ggtcgcaacc attagtagtg gtagtagttt cacctactct 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctacaaatga acagtctgaa gtctgaggac acagccattt attactgtac aagacgagag 300 gggatctatg atgcttcctg ggattattct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 113 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for C1C5 <400> 113 cagatccagt tggtgcagtc aggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa taaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atagtggaga gccaacatat 180 tctgatgact tcaagggacg ctttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acgtctacat atttctgtgt aagacagggg 300 gactttgatt acgaggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for D1F2 <400> 116 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggccagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacagtcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcactgggtc tgggacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240 gaagatcttg ccacttactt ttgccaacag ggtagttcgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 117 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for C1F5 <400> 117 gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60 ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaagtat ggttcccagt ccatgtctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctcg ttatcaacag tgtggagact 240 gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggcctctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 118 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for D1A1 <400> 118 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa cctggaagaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag agtaatgcgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 119 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for D1F1 <400> 119 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggttgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattctggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagttatga ggttccttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 120 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for C1E2 <400> 120 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatttcatc gctacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 121 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for C1A1 <400> 121 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa tctggtatca gcagaaaaca 120 gatggaactc ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccagcag cataaaacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 122 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for C1F4 <400> 122 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcacc 60 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240 aaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 123 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for D2C2 <400> 123 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattctggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctata ttgcatccaa ccacggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagttatga ggttccttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 124 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for 2G2 <400> 124 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattata cgtagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgacga tctgggactt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 125 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for C1C5 <400> 125 gatgttttga tgacccaaag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gacacatcta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caagcgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgggacg 300 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 330 <210> 126 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 heavy chain constant region <400> 126 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 127 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human kappa light chain constant region <400> 127 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 128 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 heavy chain CH1 region <400> 128 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agtt 294 <210> 129 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region for mouse antibodies <400> 129 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 130 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region for mouse antibodies <400> 130 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (8)

  1. 항 PD-1 항체의 Fab를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 단순 헤르페스 바이러스 1형(HSV-1)로서,
    상기 항 PD-1 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 34, 35 및 36의 아미노산 서열을 포함하는,
    유전적으로 변형된 HSV-1.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 SEQ ID NO: 67 및 80의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 HSV-1.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항 PD-1 항체는
    SEQ ID NO: 97, 99 또는 129의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고/하거나,
    SEQ ID NO: 98 또는 130의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는,
    유전적으로 변형된 HSV-1.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항 PD-1 항체의 Fab는 각각 SEQ ID NO: 67, 99, 80 및 98의 서열을 갖는 마우스 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 불변 도메인, 마우스 경쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 포함하는,
    유전적으로 변형된 HSV-1.
  5. 제1항에 있어서,
    인간 IL-12 유전자를 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 HSV-1.
  6. 제1항에 있어서,
    역 반복 영역이 제거된, 유전적으로 변형된 HSV-1.
  7. 제6항에 있어서,
    역 반복 영역이 인간 IL-12 유전자로 대체된, 유전적으로 변형된 HSV-1.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 UL3와 UL4 사이에 삽입된, 유전적으로 변형된 HSV-1.
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