CN112074297A - 结合pd-1的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种特异性结合人PD‑1的分离的单克隆抗体。本发明还提供了编码抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于表达抗体的方法。本发明还提供了免疫缀合物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和包含该抗体的药物组合物，以及使用本发明的抗PD‑1抗体的治疗方法。

Description

结合PD-1的抗体及其用途
技术领域
本发明总体上涉及分离的单克隆抗体，特别是小鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体，其以高亲和力和功能性特异性结合人PD-1。本发明还提供了编码抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于表达抗体的方法。本发明进一步提供了免疫缀合物(immunoconjugate)、双特异性分子、溶瘤病毒和包含该抗体的药物组合物，以及使用本发明的抗PD-1抗体的诊断和治疗方法。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1或CD279，是T细胞调节剂CD28家族的成员，并在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata et al.,(1996)Int Immunol 8:765-72；Okazaki et al.,(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett et al.,(2003)JImmunol 170:711-8)。它包含膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和膜远端基于酪氨酸的开关基序(ITSM)(Thomas,M.L.(1995)J Exp Med 181:1953-6；Vivier,E and Daeron,M(1997)Immunol Today 18:286-91)。已经鉴定出PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2，两者都是与PD-1结合但不与其他CD28家族成员结合的B7同源物。
几条证据表明PD-1及其配体负调节免疫反应。例如，发现PD-1在多种人类癌症中丰富(Dong et al.,(2002)Nat.Med.8:787-9)。此外，据报道PD-1和PD-L1之间的相互作用引起肿瘤浸润淋巴细胞和T细胞受体介导的增殖的减少，以及癌细胞的免疫逃避(Dong etal.,(2003)J.Mol.Med.81:281-7；Blank et al.,(2005)Cancer Immunol.Immunother.54:307-314；Konishi et al.,(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。研究还表明，通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制作用，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是加和的(Iwai et al.,(2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 99:12293-7；Brown et al.,(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
PD-1缺陷的动物可能发展出各种自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病和具有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(Nishimura et al.,(1999)Immunity 11:141-51；Nishimuraet al.,(2001)Science 291:319-22)。另外，已经发现PD-1在自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病和类风湿性关节炎中起作用(Salama etal.,(2003)J Exp Med 198:71-78；Prokunina and Alarcon-Riquelme(2004)Hum MolGenet 13:R143；Nielsen et al.,(2004)Lupus 13:510)。在小鼠B细胞肿瘤细胞系中，PD-1的ITSM被证明对于阻断BCR介导的Ca2+通量和下游效应子分子的酪氨酸磷酸化是必不可少的(Okazaki et al.,(2001)PNAS 98:13866-71)。
已经开发了许多靶向PD-1的癌症免疫治疗剂用于疾病治疗。一种此类抗PD-1抗体是Nivolumab(由Bristol Myers Squibb以商品名
Figure BDA0002698451610000021
出售)，其在总共296名患者的临床试验中在非小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌中产生了全部或部分反应(Topalian SLet al.,(2012)The New England Journal of Medicine.366(26):2443–54)。它于2014年在日本获得批准，并于2014年被美国FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤。靶向PD-1的另一种抗PD-1抗体Pembrolizumab(KEYTRUDATM,MK-3475,Merck)也已于2014年获得美国FDA的批准，用于治疗转移性黑色素瘤。在美国，它已用于肺癌、淋巴瘤和间皮瘤的临床试验中。
尽管已经开发和批准了抗PD-1抗体，但仍需要具有对PD-1增强的结合亲和力和其他所需药物特性的其他单克隆抗体。
发明内容
本发明提供了分离的单克隆抗体，例如小鼠、人、嵌合或人源化的单克隆抗体，其与PD-1结合(例如人PD-1和猴PD-1)并且具有增加的与PD-1的亲和力，并且与现有的抗PD-1抗体(例如Nivolumab)相比，具有相当(若非更好)的抗肿瘤效果。
本发明的抗体可用于多种应用，包括检测PD-1蛋白以及治疗和预防PD-1相关疾病，例如癌症、自身免疫性心肌病、自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病和类风湿关节炎。
相应地，在一方面，本发明涉及与PD-1结合的分离的单克隆抗体(例如小鼠、嵌合或人源化抗体)或其抗原结合部分，其具有重链可变区，该重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中所述CDR1区、CDR2区和CDR3区包含分别与(1)SEQ ID NO：1、2和3；(2)SEQ IDNO：4、5和6；(3)SEQ ID NO：7、8和9；(4)SEQ ID NO：10、11和12；(5)SEQ ID NO：13、14和15；(6)SEQ ID NO：16、17和18；(7)SEQ ID NO：19、20和21；(8)SEQ ID NO：22、23和24；(9)SEQID NO：25、26和27；(10)SEQ ID NO：28、29和30；或(11)SEQ ID NO：31、32和33具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1。
在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含具有与SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至PD-1。SEQ ID NO：67和69-79可以分别由SEQ ID NO：102-113的核酸序列编码。
在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中所述CDR1区、CDR2区和CDR3区域包含分别与(1)SEQ ID NO：34、35和36；(2)SEQ ID NO：37、38和39；(3)SEQ ID NO：40、41和42；(4)SEQID NO：43、44和45；(5)SEQ ID NO：46、47和48；(6)SEQ ID NO：49、50和51；(7)SEQ ID NO：52、53和54；(8)SEQ ID NO：55、56和57；(9)SEQ ID NO：58、59和60；(10)SEQ ID NO：61、62和63；或(11)SEQ ID NO：64、65和66具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1。
在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至PD-1。SEQ ID NO：80和86-96可以分别由SEQ ID NO：114-125的核酸序列编码。
在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，每个重链可变区和轻链可变区都包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3包含分别与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO：1、2、3、34、35和36；(2)SEQ ID NO：4、5、6、37、38和39；(3)SEQ ID NO：7、8、9、40、41和42；(4)SEQ ID NO：10、11、12、43、44和45；(5)SEQ ID NO：13、14、15、46、47和48；(6)SEQ ID NO：16、17、18、49、50和51；(7)SEQ ID NO：19、20、21、52、53和54；(8)SEQ ID NO：22、23、24、55、56和57；(9)SEQ IDNO：25、26、27、58、59和60；(10)SEQ ID NO：28、29、30、61、62和63；或(11)SEQ ID NO：31、32、32、64、65和66，其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1。
在一个实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区包含分别与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO：67和80；(2)SEQ IDNO：68和81；(3)SEQ ID NO：69和81；(4)SEQ ID NO：68和82；(5)SEQ ID NO：68和83；(6)SEQID NO：68和84；(7)SEQ ID NO：68和85；(8)SEQ ID NO：68和86；(9)SEQ ID NO：69和86；(10)SEQ ID NO：70和87；(11)SEQ ID NO：71和88；(12)SEQ ID NO：72和89；(13)SEQ ID NO：73和90；(14)SEQ ID NO：74和91；(15)SEQ ID NO：75和92；(16)SEQ ID NO：76和93；(17)SEQ IDNO：77和94；(18)SEQ ID NO：78和95；或(19)SEQ ID NO：79和96，其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1。
在一个实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链恒定区包含与SEQ ID No：97、99或129具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且轻链恒定区包含与SEQ ID No：98或130具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，重链可变区和轻链可变区包含上述氨基酸序列，其中抗体或其抗原结合片段与PD-1结合。SEQ ID NO：97和99的这些氨基酸序列可以分别由SEQ ID NO：126和128的核酸序列编码。SEQ ID NO：98可以由SEQ ID NO：127编码。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条重链和两条轻链或由两条重链和两条轻链组成，其中每个重链包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，并且每个轻链包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中抗体与PD-1结合。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型。在其他实施方案中，本发明的抗体可以是单链抗体或抗体片段，例如Fab或Fab'2片段。
本发明的抗体或其抗原结合部分比现有技术的抗PD-1抗体(例如Nivolumab)具有更高的对人PD-1的结合亲和力，其以6.36×10-9M或更少的KD结合人PD-1，并抑制PD-L1与PD-1的结合。与现有抗PD-1抗体(例如Nivolumab)相比，本发明的抗体或其抗原结合部分也提供相当的抗肿瘤效果(若非更好)。
本发明还提供了免疫缀合物，其包含与治疗剂(例如细胞毒素)连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了双特异性分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与具有不同于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分(例如第二抗体)连接。另一方面，可以将本发明的抗体或其抗原结合部分制成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。
本发明还提供了组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或免疫缀合物、双特异性分子、溶瘤病毒、或CAR，以及药学上可接受的载体。
本发明还包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。还提供了一种使用包含表达载体的宿主细胞制备抗PD-1抗体的方法，其包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，和(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。
在另一方面，本发明提供了在对象中调节免疫应答的方法，其包括向对象施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而调节对象中的免疫应答。优选地，本发明的抗体增强、刺激或增加对象的免疫应答。在一些实施方案中，所述方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、CAR-T细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或能够在对象中表达它们的核酸分子。
在另一方面，本发明提供了在对象中抑制肿瘤生长的方法，包括向对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌和鼻咽癌。在一些实施方案中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、CAR-T细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或者能够在对象表达它们的核酸分子。
在另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗感染性疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、CAR-T细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或者能够在对象表达它们的核酸分子。
更进一步地，本发明提供了一种在对象中增强对抗原的免疫应答的方法，其包括向对象施用：(i)抗原；(ii)抗体或其抗原结合部分，从而增强对象对抗原的免疫应答。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或来自病原体的抗原。
本发明的抗体可以与至少一种其他试剂组合使用，该试剂例如是免疫刺激抗体(例如抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)、细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)、或共刺激抗体(例如抗CD137和/或抗GITR抗体)。
通过下面的详细描述和实施例，本公开的其他特征和优点将变得显而易见，其不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
附图说明
图1显示了人源化抗PD-1抗体huClEl-V10的熔解曲线。
图2显示了人源化抗PD-1抗体huClE1-V10的尺寸排阻色谱的结果。
详细描述
为了确保可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了其他定义。
术语“PD-1”是指程序性细胞死亡蛋白1。术语“PD-1”包括变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人PD-1蛋白具有特异性的抗体可以与来自除人以外的物种(例如猴)的PD-1蛋白交叉反应。在其他实施方案中，对人PD-1蛋白特异的抗体可以对人PD-1蛋白完全特异，并且不与其他物种或其他类型表现出交叉反应性；或可能与某些其他物种但并非所有其他物种的PD-1发生交叉反应。
术语“人PD-1”是指具有来自人的氨基酸序列的PD-1蛋白，例如具有Genbank登录号NP_005009.2的人PD-1的氨基酸序列。术语“猴或恒河猴PD-1”和“小鼠PD-1”分别指猴和小鼠PD-1序列，例如具有分别具有Genbank登录号NP_001107830和CAA48113的氨基酸序列的那些。
术语“免疫应答/免疫反应”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对人体的侵入病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌细胞、或者正常人类细胞或组织(在自身免疫或病理性炎症的情况下)的选择性损害、破坏或从中消除。
“抗原特异性T细胞应答”是指由T细胞产生的应答，该应答是由于用T细胞特异的抗原刺激T细胞而引起的。T细胞对抗原特异性刺激的应答的非限制性实例包括增殖和细胞因子产生(例如IL-2产生)。
本文所用的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。完整抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，其称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，该区称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如PD-1蛋白)的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，这是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，这是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward etal.,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，重链可变区包含一个可变域和两个恒定域。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的接头连接起来，从而使它们成为一条蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.,(1988)Science242:423-426；以及Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”之内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如本文所用，“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-1蛋白的分离的抗体基本上不含有特异性结合除PD-1蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人PD-1蛋白的分离的抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的PD-1蛋白)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“小鼠抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来自小鼠种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的小鼠抗体可以包括不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“小鼠抗体”并不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列已被嫁接到小鼠框架序列上的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合来自非人类来源的遗传物质和来自人类的遗传物质而制备的抗体。或更一般地，嵌合抗体是具有来自某些物种的遗传物质和来自另一物种的遗传物质的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人类天然产生的抗体变体的相似性。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
如本文所用，“与人PD-1特异性结合”的抗体旨在指与人PD-1蛋白(以及可能来自一种或多种非人物种的PD-1蛋白)结合但基本上不结合非PD-1蛋白的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人PD-1蛋白，即KD为5.0x10-8 M或更小、更优选1.0x 10-8M或更小、更优选7.0x 10-9M或更小。
如本文所用，术语“基本上不结合”至蛋白质或细胞，是指不与蛋白质或细胞结合或不以高亲和力结合，即与蛋白质或细胞结合的KD为1.0x 10-6M或以上、更优选1.0x 10-5M或以上、更优选1.0x 10-4M或以上、进一步优选1.0x 10-3M或以上、进一步优选1.0x 10-2M或以上。
术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的KD为1.0x 10-6M或更小、更优选5.0x 10-8M或更小、甚至更优选1.0x 10-8M或更小、甚至更优选7.0x 10-9M或更小、甚至更优选1.0x 10-9M或更小。但是，“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可能有所不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为10-6M或更小、更优选10-7M或更小、甚至更优选10-8M或更小。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”是指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”是指离解常数，其由Kd与Ka之比(即，Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域众所周知的方法确定。确定抗体KD的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如BiacoreTM系统。
术语“EC50”，也称为半数最大有效浓度，是指在指定的暴露时间后在基线和最大值之间诱导一半响应的抗体的浓度。
术语“IC50”，也称为半数最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体，其抑制特定生物学或生化功能50％的抗体浓度。
术语“对象/受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但是哺乳动物是优选的，例如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以预防或改善与疾病或病症(例如癌症)有关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本发明抗体的量。治疗有效量应理解为与所治疗的病症有关，其中本领域技术人员可以容易地识别出实际有效量。
在以下各节中进一步详细描述本发明的各个方面。
具有增加的与人PD-1的结合亲和力和更好的抗肿瘤作用的抗-PD-1抗体
本发明的抗体或其抗原结合部分与人PD-1特异性结合并且与先前描述的抗PD-1抗体相比(特别是与Nivolumab相比)具有改善的结合亲和力以及相当(若非更好)的抗肿瘤作用。
本发明的抗体或其抗原结合部分优选以7.0x 10-9M或更小的KD、更优选以5.0x10-10M或更小的KD结合人PD-1蛋白。本发明的抗体还以约1.0x 10-7M至1.0x 10-10M的KD结合食蟹猴PD-1。
其他功能特性包括阻断PD-1/PD-L 1相互作用的能力。在一个实施方案中，本发明的抗体可以以与Nivolumab相似的浓度抑制PD-1与PD-L1的结合。
其他功能特性包括抗体刺激免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的能力。例如，可以通过评估抗体刺激抗原特异性T细胞反应中白介素2(IL-2)产生的能力来进行测试。在某些实施方案中，抗体结合人PD-1并刺激抗原特异性T细胞应答。在其他实施方案中，抗体结合人PD-1，但不刺激抗原特异性T细胞应答。评估抗体刺激免疫反应能力的其他方法包括测试其抑制肿瘤生长的能力(例如在体内肿瘤移植模型中)或刺激自身免疫反应的能力，例如在自身免疫模型中促进自身免疫疾病发展的能力，例如在NOD小鼠模型中促进糖尿病发展的能力。
本发明的优选抗体是人单克隆抗体。另外或可替代地，抗体可以是例如嵌合或人源化单克隆抗体。
单克隆抗PD-1抗体
本发明的优选抗体是如下文和以下“实施例”部分所述的结构和化学特征的单克隆抗体。抗PD-1抗体的VH氨基酸序列在SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79中列出。抗PD-1抗体的VL氨基酸序列在SEQ ID NO：80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96中示出。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列ID号总结在下表1中，一些克隆共享相同的VH或VL。所有克隆的重链恒定区可以是IgG1重链恒定区，例如具有如SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的人IgG1重链恒定区，或具有在例如129中列出的氨基酸序列的小鼠IgG1重链恒定区，并且所有克隆的轻链恒定区可以是κ恒定区，例如具有在例如SEQ ID NO：98中列出的氨基酸序列的人κ恒定区，或者具有如SEQ ID NO.：130中列出的氨基酸序列的小鼠κ恒定区。抗体Fab可以包含重链/轻链可变区、重链CH1区(例如SEQ IDNO：99中列出的一个)和轻链恒定区。
表1.重链/轻链可变区的氨基酸序列ID号
Figure BDA0002698451610000111
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR分别由IMGT编号方案和Rabat编号系统定义。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列由其他系统(例如Chothia和CCG系统/方法)确定。
可以将与人PD-1结合的其他抗PD-1抗体的VH和VL序列(或CDR序列)与本发明的抗PD-1抗体的VH和VL序列(或CDR序列)“混合并匹配”。优选地，当VH和VL链(或这种链中的CDR)混合并匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列被结构相似的VH序列取代。同样，优选将来自特定VH/VL对的VL序列替换为结构相似的VL序列。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)重链可变区，其包含以上表1中列出的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，其包含以上表1中列出的氨基酸序列，或另一种抗PD-1抗体的VL，其中该抗体特异性结合人PD-1。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)以上表1中列出的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区；以及
(b)以上表1中列出的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区，或另一种抗PD-1抗体的CDR，其中该抗体特异性结合人PD-1。
在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包括抗PD-1抗体的重链可变CDR2区与结合人PD-1的其他抗体的CDR结合，例如来自不同抗PD-1抗体的重链可变区的CDR1和/或CDR3和/或来自轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3。
另外，在本领域中众所周知，CDR3结构域独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独确定抗体对同源抗原的结合特异性，并且可以预测基于共同的CDR3序列产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见例如Klimka el al.,,British J.of Cancer 83(2):252-260(2000)；Beiboer el al.,,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader et al.,,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas et al.,,J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas et al.，，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:2529-2533(1995)；Ditzel et al.,,J.Immunol.157:739-749(1996)；Berezov et al.,,BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.,,J.Biochem(Tokyo)117:452-7(1995)；Bourgeois et al.,,J.Virol 72:807-10(1998)；Levi et al.，，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374-8(1993)；Polymenis and Stoller,J.Immunol.152:5218-5329(1994)以及Xu and Davis,Immunity 13:37-45(2000)。还参见美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献的每一个的全文以引用方式并入本文。
因此，在另一个实施方案中，本发明的抗体包含抗PD-1抗体的重链可变区的CDR2和抗PD-l抗体的重链和/或轻链可变区的至少CDR3、或另一种抗PD-1抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够与人PD-1特异性结合。这些抗体优选地(a)与PD-1竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与本发明的抗PD-1抗体相似的结合亲和力。在又一个实施方案中，所述抗体可以进一步包含抗PD-1抗体的轻链可变区的CDR2、或另一种抗PD-1抗体的轻链可变区的CDR2，其中所述抗体能够与人PD-1特异性结合的抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包括抗PD-1抗体的重和/或轻链可变区的CDR1、或另一抗PD-l抗体的重和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体能够与人PD-1特异性结合。
保守性修饰
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，所述序列与本发明的抗PD-1抗体的序列的不同点在于具有一个或多个保守性修饰。本领域中应理解，可以进行某些保守性序列修饰而不移除抗原结合。参见例如Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10.341-6以及Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
因此，在一个实施方案中，该抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含上表1所列的序列，和/或其保守性修饰；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含上表1所列的序列，和/或其保守性修饰；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含以上表1所列的序列，及其保守性修饰；和/或
(d)轻链可变区CDR1和/或CDR2和/或CDR3序列包含以上表1所列的序列；和/或其保守性修饰；并且
(e)抗体特异性结合人PD-1。
本发明的抗体具有上述一种或多种以下功能特性，例如与人PD-1的高亲和力结合、以及诱导针对表达PD-1的细胞的ADCC或CDC的能力。
在各种实施方案中，抗体可以是例如小鼠、人、人源化或嵌合抗体。
如本文所用，术语“保守性序列修饰”旨在指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用此处介绍的功能分析方法测试改变的抗体的保留功能(即上述功能)。
经工程化和修饰的抗体
可以使用具有本发明的抗PD-1抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料来工程改造经修饰的抗体来制备本发明的抗体。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个残基来工程化抗体。另外或可替代地，可以通过修饰恒定区域内的残基来工程化抗体，例如以改变抗体的效应子功能。
在某些实施方案中，CDR移植可以用于工程化抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，各个抗体之间的CDR中的氨基酸序列比CDR外部的序列差异更大。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建包括嫁接到具有不同特征的不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在的抗体的CDR序列的表达载体，以表达模仿特定天然存在的抗体特性的重组抗体(参见例如Riechmann et al.,(1998)Nature 332:323-327；Jones et al.,(1986)Nature 321:522-525；Queen et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.还参见U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，其包含如上所述的包含本发明的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或轻链可变区，其包含如上所述的包含本发明的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。虽然这些抗体包含本发明的单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但是它们可以包含不同的框架序列。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开参考文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下地方找到：“VBase”人类种系序列数据库(可在Internet上找到，网址为www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及如上文引用的Kabat et al.,(1991)；Tomlinson et al.,(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox et al.,(1994)Eur.J.Immunol.24:827-836；其每一个的内容通过引用明确地并入本文。作为另一个例子，可以在Genbank数据库中找到人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可从随附的Genbank登录号中获得：1-69(NG--0010109,NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)以及3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一个例子，在HCol2HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可从随附的Genbank登录号中获得：1-69(NG--0010109,NT--024637&BC070333),5-51(NG--0010109&NT--024637),4-34(NG--0010109&NT--024637),3-30.3(CAJ556644)&3-23(AJ406678)。
使用本领域技术人员众所周知的称为Gapped BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.,(1997)，同上)，将抗体蛋白质序列与已编译的蛋白质序列数据库进行比较。
用于本发明的抗体的优选框架序列是与本发明的抗体使用的框架序列在结构上相似的那些。可以将VH CDR1、CDR2和CDR3序列嫁接到具有与该框架序列来源的种系免疫球蛋白基因相同的序列的框架区，或者可以将CDR序列嫁接到与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区。例如，已经发现在某些情况下，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
可变区修饰的另一种类型是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基突变，从而改善目标抗体的一个或多个结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以如本领域已知的在体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能特性的影响。优选地，引入保守性修饰(如本领域中已知的)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选是取代。而且，通常CDR区中不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VLCDR2区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3区，其包含本发明的序列，或具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括其中已经对VH和/或VL内的框架残基进行修饰例如以改善抗体的特性的那些抗体。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“突变回”为相应的种系序列。更具体地，经历了体细胞突变的抗体可以包含与该抗体所衍生的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区域内或甚至一个或多个CDR区域内的一个或多个残基发生突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“脱免疫”，并且在美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。
另外，或作为在框架或CDR区域内进行的修饰的替代，可以对本发明的抗体进行工程改造以包括在Fc区域内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接至该抗体)，或者对其进行修饰以改变其糖基化，再次改变该抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法描述于美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目，以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，抗体的Fc铰链区被突变以减少抗体的生物学半衰期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得相对于天然Fc-铰链域SpA结合，抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方法进一步详细描述于美国专利号6,165,745。
在另一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
另外地或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如在宿主细胞中以改变的糖基化机制表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述，并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(l,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系是通过使用两个替代载体进行的CHO/DG44细胞中FUT8基因的靶向破坏而创建的(参见美国专利公开号20040110704和amane-Ohnuki etal.,(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195描述了具有功能性被破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，从而使得在这种细胞系中表达的抗体通过减少或消除α-1,6键相关的酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了具有低酶活性以将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰氨基葡糖或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公布WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系Led 3细胞，其将岩藻糖与Asn(297)连接的碳水化合物连接的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化作用(另见Shields et al.,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。如PCT公布WO 06/089231中所述，还可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。或者，可以在植物细胞(例如浮萍)中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。在2006年8月11日提交的对应于Alston&Bird LLP律师档案号040989/314911的美国专利申请中公开了用于在植物系统中产生抗体的方法。PCT公开WO 99/54342描述了工程改造细胞系以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如(l,4)-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，从而导致抗体的ADCC活性增加(另请参见Umana et al.,(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。替代地，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切割掉。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino et al.,(1975)Biochem.14:5516-23)。
本公开内容预期的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团附着于抗体或抗体片段的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。参见例如EPO 154 316和EP0 401 384。
抗体的物理性质
本发明的抗体可以通过其各种物理性质来表征，以检测和/或区分其不同类别。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。由于改变的抗原结合，这种糖基化位点可以导致抗体的免疫原性增加或抗体的pK改变(Marshall etal(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316:452-7；Mimura et al.,(2000)Mol Immunol37:697-706)。糖基化已知发生在包含N-X-S/T序列的基序上。在一些情况下，优选具有不包含可变区糖基化的抗PD-1抗体。这可以通过选择在可变区中不包含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区中的残基突变来实现。
在优选的实施方案中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺作用可能发生在N-G或D-G序列上，并导致产生异天冬氨酸残基，该残基将连接引入多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。
每种抗体将具有独特的等电点(pI)，其通常落在6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。有人推测pI值超出正常范围的抗体可能在体内条件下具有某些解折叠和不稳定性。因此，优选具有包含落在正常范围内的pI值的抗PD-1抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电荷的表面残基来实现。
编码本发明抗体的核酸分子
在另一方面，本发明提供了编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯化的形式存在。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上纯化地呈现”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从基因文库回收编码此类抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子包括编码PD-1单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的核酸分子。一旦获得了编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段被连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选是IgG1、IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段可操作地连接，使得VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird et al.,(1988)Science 242:423-426；Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty etal.,,(1990)Nature 348:552-554)。
本发明的单克隆抗体的生产
可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495的众所周知的体细胞杂交(杂交瘤)技术来产生本发明的单克隆抗体(mAb)。产生单克隆抗体的其他实施方案包括B淋巴细胞的病毒或致癌转化和噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也是本领域众所周知的。参见例如美国专利号4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，其内容通过引用整体结合进本文。
产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生
还可以使用例如如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。在一个实施方案中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一种或多种表达载体中，从而使基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节抗体基因的转录和翻译的功能。
术语“调节序列”旨在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。替代地，可以使用非病毒调节序列，例如泛素蛋白启动子或b-球蛋白启动子。更进一步，调节元件由来自不同来源的序列组成，例如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人类T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列(Takebe et al.,(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。选择表达载体和表达控制序列以使其与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入相同或分开的表达载体中。在优选的实施方案中，可变区用于创建任何抗体同种型的全长抗体基因，其中将它们插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段可操作地连接到载体内的CH区段，而VL区段可操作地连接到载体内的CL区段。另外地或替代地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽在读框中连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常，可选择标记基因在已引入载体的宿主细胞上赋予对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是最优选的是在真核细胞(最优选在哺乳动物宿主细胞)中表达抗体，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中，与例如在R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述的DHFR可选择标记一起使用)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别是对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是在WO 87/04462、WO 89/01036和EP338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选地允许抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中的时间段来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
免疫缀合物
本发明的抗体可以与治疗剂缀合以形成免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗-有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选通过可裂解的接头(例如肽基、二硫键或腙接头)缀合。更优选地，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。可以如以下文件所述地制备ADC：美国专利号7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公布WO 02/096910；WO 07/038,658；WO07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295；通过引用将其公开内容并入本文。
双特异性分子
在另一方面，本公开内容的特征在于双特异性分子，其包含与至少一个其他功能性分子(例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体))连接的本发明的一种或多种抗体，以产生与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用，“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在一个实施方案中，除了抗Fc结合特异性和抗PD-1结合特异性之外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以针对抗增强因子(EF)，例如，与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，抗增强因子可以结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、PD-1或ICAM-1)或其他免疫细胞，从而导致针对靶细胞的免疫应答增加。
双特异性分子可以具有许多不同的形式和大小。在尺寸谱的一端，双特异性分子保留了传统的抗体形式，不同的是，它不是具有两个相同特异性的结合臂，而是具有两个各自具有不同特异性的结合臂。在另一个极端是由两个通过肽链连接的单链抗体片段(scFv)组成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中等大小的双特异性分子包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因工程、体细胞杂交或化学方法制备。参见例如，上文引用的Kufer et al,；Cao and Suresh,Bioconjugate Chemistry,9(6),635-644(1998)；以及van Spriel et al,,ImmunologyToday,21(8),391-397(2000)，以及其中引用的参考文献。
编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒
溶瘤病毒优选感染并杀死癌细胞。本发明的抗体可以与溶瘤病毒联合使用。替代地，可以将编码本发明抗体的溶瘤病毒引入人体。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本发明的抗体的药物组合物。当组合物包含一种以上抗体时，可以分散地给予抗体。该组合物可以任选地包含一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物，例如抗肿瘤药物。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等张剂、及其组合。合适的赋形剂的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有所教导，其公开内容通过引用并入本文。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据给药途径，可以将活性成分包被在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。替代地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
药物组合物可以是无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制成适合高药物浓度的微乳剂、脂质体或其他有序结构。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的对象和特定的给药方式而变化，并且通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之一百中，该量为活性成分的约0.01％至约百分之九十九、优选为约0.1％至约70％、最优选为约1％至约30％，与药学上可接受的载体的组合。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物特别有利，以易于给药和剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的活性成分，该活性成分经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。替代地，抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。
对于抗体的施用，剂量可以为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三到六个月一次给药。本发明的抗PD-1抗体的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药方案之一给予抗体：(i)六个剂量每四周一次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml(在一些方法中约25-300μg/ml)的血浆抗体浓度。
本发明的抗PD-1抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性降低、疾病无症状时期的频率和持续时间增加、或预防由于疾病困扰造成的障碍或残疾。例如，对于治疗携带肿瘤的对象，“治疗有效剂量”优选相对于未治疗的对象来说抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、并且更优选至少约80％。治疗有效量的治疗性抗体可以减小肿瘤的大小、或改善对象的症状，对象通常是人类或可以是另一种哺乳动物。
药物组合物可以是控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、酸酐、聚乙二醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以通过例如以下的医疗装置施用治疗组合物：(1)无针皮下注射装置(例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)经皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；通过引用将其公开内容并入本文。
在某些实施方案中，可以配制本发明的单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗性抗体穿过血脑屏障，可以将它们配制成脂质体，其可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawaet al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman et al.,(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoeet al.,(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier et al.,(1994)J Biol.Chem.269:9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体(组合物、双特异性抗体、免疫缀合物和其他形式，包括溶瘤病毒)具有多种体外和体内效用，包括例如通过阻断PD-1来增强免疫应答。可以在体外或离体将抗体施用至培养物中的细胞，或例如在体内施用于人类对象，以在各种情况下增强免疫力。因此，在一方面，本发明提供了一种在对象中修饰免疫应答的方法，该方法包括向对象施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而修饰对象中的免疫应答。优选地，应答被增强、刺激或上调。
优选的对象包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)来治疗的疾病的人类患者。在一个特定的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现抗原特异性增强免疫力，可以将抗PD-1抗体与感兴趣的抗原一起给药，或者该抗原可能已经存在于待治疗的对象中(例如，患有肿瘤或患有病毒的对象)。当针对PD-1的抗体与另一种药剂一起施用时，它们可以按顺序或同时施用。
鉴于本发明的抗PD-1抗体抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2分子结合并刺激抗原特异性T细胞应答的能力，本发明还提供了使用抗体来刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答的体外和体内方法。例如，本发明提供了一种刺激抗原特异性T细胞应答的方法，该方法包括使所述T细胞与本发明的抗体接触，从而刺激抗原特异性T细胞应答。抗原特异性T细胞应答的任何合适的指示剂可以用于测量抗原特异性T细胞应答。
此类合适的指示剂的非限制性实例包括在抗体存在下增加的T细胞增殖和/或在抗体存在下增加细胞因子的产生。在一个优选的实施方案中，刺激了抗原特异性T细胞产生白介素2。
本发明还提供了在对象中刺激免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的方法，其包括向对象施用本发明的抗体，从而刺激对象的免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)。在一个优选的实施方案中，所述对象是携带肿瘤的对象，并且刺激了针对所述肿瘤的免疫应答。在另一个优选的实施方案中，所述对象是携带病毒的对象，并且刺激了针对所述病毒的免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明提供了在对象中抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括向对象施用本发明的抗体，从而在对象中抑制肿瘤的生长。在又一个实施方案中，本发明提供了用于在对象中治疗病毒感染的方法，其包括向对象施用本发明的抗体，从而在对象中治疗病毒感染。
下面进一步详细讨论本发明的这些和其他方法。
癌症
用抗体阻断PD-1可以增强对患者癌细胞的免疫应答。在一方面，本发明涉及使用抗PD-1抗体在体内治疗对象，从而抑制癌性肿瘤的生长。抗-PD-1抗体可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。替代地，抗PD-1抗体可以与在癌症治疗中使用的其他免疫原性试剂(例如溶瘤病毒)或其他抗体结合使用，如下所述。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种在对象中抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括向对象施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。优选地，该抗体是小鼠、嵌合或人源化的抗PD-1抗体。
使用本发明的抗体可以抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括：黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)，肾癌(例如透明细胞癌)，前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)，乳腺癌，结肠癌，以及肺癌(例如非小细胞肺癌)，无论是原发性还是转移性。另外，本发明包括难治性或复发性恶性肿瘤，使用本发明的抗体可以抑制其生长。
可以使用本发明的方法治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏(Kaposi's)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)、以及上述癌症的组合。本发明也可用于治疗转移性癌症，特别是表达PD-1的转移性癌症(Iwai et al.(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
任选地，可以将针对PD-1的抗体与免疫原性试剂组合，该试剂例如是癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)以及用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He et al(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
当与疫苗接种方案组合时，PD-1阻断可能更有效。已经设计了许多针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational BookSpring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；还请参见Restifo,N.and Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61,pp.3023-3043in DeVita et al.(eds.),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,Fifth Edition)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。当肿瘤细胞被转导来表达GM-CSF时，这些细胞疫苗已被证明是最有效的。已经显示出GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的有效的抗原呈递激活剂(Dranoffet al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:3539-43)。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究导致了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,SA(1999)Immunity 10:281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和从中产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以证明是宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-1阻断作用可以与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用，以产生针对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，因此可以耐受。肿瘤抗原可以包括蛋白质端粒酶，该蛋白是染色体端粒合成所必需的，并且在超过85％的人类癌症中以及仅在有限的体细胞组织中表达(Kim et al.(1994)Science 266:2011-2013)。可以通过各种方式保护这些体细胞组织免受免疫攻击。肿瘤抗原还可以是癌细胞中表达的“新抗原(neo-antigen)”，这是因为体细胞突变会改变蛋白质序列或在两个不相关序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间形成体融合蛋白，或者是B细胞肿瘤的独特型。
其他肿瘤疫苗可以包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白质，例如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏(Kaposi's)疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-1阻断剂结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热激蛋白(HSP)。这些热激蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白片段，并且这些HSP在递送到抗原呈递细胞上以引起肿瘤免疫的效率很高(Suot&Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamuraet al.(1997)Science278:117-120)。
树突细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，可用于引发抗原特异性反应。可以离体产生DC并装载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle et al.(1998)NatureMedicine 4:328-332)。DC也可以通过遗传手段转导以表达这些肿瘤抗原。为了免疫的目的，DC也已经直接融合到肿瘤细胞上(Kugler et al.(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可以与PD-1阻断有效结合，以激活更有效的抗肿瘤反应。
PD-1阻断剂也可以与标准的癌症治疗组合。PD-1阻断剂可与化学治疗方案有效结合。在这些情况下，有可能减少所施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr et al.(1998)CancerResearch 58:5301-5304)。这样的组合的一个例子是抗PD-1抗体与达卡巴嗪(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。这样的组合的另一个例子是抗PD-1抗体与白介素2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。PD-1阻断剂和化学疗法并用的科学依据是，细胞死亡是大多数化学治疗化合物的细胞毒作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平升高。可能通过细胞死亡与PD-1阻断剂协同作用的其他组合疗法是放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一个在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与PD-1阻断剂组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可能将肿瘤抗原喂入宿主抗原呈递途径。
PD-1阻断抗体还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可用于靶向两个单独的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性反应。这些反应的T细胞臂将通过使用PD-1阻断而增强。替代地，可通过使用与肿瘤抗原结合的双特异性抗体和树突状细胞特异性细胞表面标志物将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多机制都可以通过灭活肿瘤表达的具有免疫抑制作用的蛋白质来克服。这些包括TGF-β(Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)和Fas配体(Hahne et al.(1996)Science 274:1363-1365)。这些实体中的每一个的抗体可以与抗PD-1组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并促进宿主的肿瘤免疫应答。
激活宿主免疫应答的其他抗体可以与抗PD-1组合使用。这些包括树突状细胞表面上的激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效替代T细胞辅助活性(Ridge etal.(1998)Nature 393:474-478)，并且可以与PD-1抗体结合使用(Ito et al.(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。针对T细胞共刺激分子的活化抗体，例如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg et al.(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero et al.(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997))和ICOS(Hutloff et al.(1999)Nature 397:262-266)，也可以提供提高水平的T细胞活化。
还存在几种实验性治疗方案，其涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增，以及将这些细胞过继转移至受体中，以刺激抗原特异性T细胞抵抗肿瘤(Greenberg&Riddell(1999)Science 285:546-51)。这些方法也可以用于激活对诸如CMV之类的感染因子的T细胞应答。在抗PD-1抗体存在下的离体激活可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
感染性疾病
本发明的其他方法用于治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一方面提供了一种在对象中治疗感染性疾病的方法，该方法包括向所述对象施用抗PD-1抗体或其抗原结合部分，从而治疗所述对象的所述感染性疾病。优选地，抗体是嵌合或人源化抗体。
类似于其如上所述的对肿瘤的应用，抗体介导的PD-1阻断剂可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可能特别有用的病原体的例子包括目前尚无有效疫苗的病原体、或常规疫苗不够完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(A、B和C)、流行性感冒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。PD-1阻断对于由诸如HIV的试剂在感染过程中呈现改变的抗原的既定感染特别有用。这些新的表位在抗人PD-1施用时被认为是外来的，因此引起了强烈的T细胞应答，该应答没有被通过PD-1的负信号所减弱。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括：HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔(Epstein Barr)病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒(flaviviruses)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇(coxsackie)病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣(molluscum)病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括：衣原体、立克次氏(rickettsial)菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉菌、沙门氏菌、杆菌(bacilli)、霍乱、破伤风、肉毒杆菌中毒、炭疽、瘟疫、钩端螺旋体病和莱姆斯(Lymes)病细菌。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括：念珠菌(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌、曲霉菌(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉菌属(毛霉菌(mucor)、犁头霉菌(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括：溶组织性变形虫(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi,)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，PD-1阻断剂可以与其他形式的免疫疗法(例如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体治疗)结合使用，其提供了增强的肿瘤抗原呈递(参见例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)。
自身免疫反应
抗PD-1抗体可以激发和放大自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导的抗肿瘤应答揭示了许多抗肿瘤应答都涉及抗自身反应性(van Elsas et al.(2001)J.Exp.Med.194:481-489；Overwijk,et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz,(2000)同上；Rosenberg&White(1996)J.Immunother Emphasis TumorImmunol 19(1):81-4)。因此，可以考虑将抗PD-1阻断剂与各种自身蛋白结合使用，从而设计疫苗接种方案以有效地产生针对这些自身蛋白的免疫应答以用于疾病治疗。
其他自身蛋白也可以用作靶标，例如用于治疗过敏和哮喘的IgE、以及用于类风湿关节炎的TNFα。最后，可以通过使用抗PD-1抗体来诱导对各种激素的抗体应答。对生殖激素的中和抗体反应可用于避孕。中和抗体对特定肿瘤生长所需的激素和其他可溶性因子的反应也可以视为可能的疫苗接种目标。
如上所述的使用抗PD-1抗体的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫反应，以治疗具有其他自身抗原(例如细胞因子，例如TNFα和IgE)的不适当积累的患者。
组合疗法
在另一方面，本发明提供了组合疗法的方法，其中将本发明的抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)与一种或多种有效刺激免疫的其他抗体共同施用，从而进一步增强、刺激或上调对象的免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供了一种在对象中刺激免疫应答的方法，该方法包括向对象施用抗PD-1抗体和一种或多种另外的免疫刺激抗体(例如抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)，从而在对象中刺激免疫反应，例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒反应。在另一个实施方案中，向对象施用抗PD-1抗体和抗LAG-3抗体。在另一个实施方案中，向对象施用抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。在又一个实施方案中，向对象施用抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，至少一种另外的免疫刺激抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体)是人抗体。替代地，至少一种另外的免疫刺激抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(例如，由小鼠抗LAG-3、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体制备)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增生性疾病(例如癌症)的方法，其包括向对象施用PD-1抗体和CTLA-4抗体。在另外的实施方案中，以亚治疗剂量施用抗PD-1抗体，以亚治疗剂量施用抗CTLA-4抗体，或以亚治疗剂量施用两者。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病有关的不良事件的方法，该方法包括向对象施用抗PD-1抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，对象是人类。在其他实施方案中，抗CTLA-4抗体是人序列单克隆抗体10D1(在PCT公开WO01/14424中描述)，并且抗PD-1抗体是小鼠序列单克隆抗体，例如本文所述的抗PD-1抗体C1H5。本发明的方法所涵盖的其他抗CTLA-4抗体包括例如在以下文献中公开的：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho et al.(2004)J.Clin.Oncology22(145):Abstract No.2505(antibody CP-675206)；以及Mokyr et al.(1998)CancerRes.58:5301-5304。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体以5x10-8M或更小的KD结合人CTLA-4，以1x 10-8M或更小的KD结合人CTLA-4，以5x 10-9M或更小的KD结合人CTLA-4，或以1x 10-8M至1x 10-10M或更小的KD结合人CTLA-4。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增生性疾病(例如癌症)的方法，其包括向对象施用抗PD-1抗体和抗LAG-3抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增生性疾病(例如癌症)的方法，其包括向对象施用抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
抗体对PD-1和一种或多种第二靶抗原(例如CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-L1)的阻断可以增强对患者癌细胞的免疫应答。使用本公开的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。用本公开的联合疗法治疗的癌症的代表性实例包括以上在抗PD-1抗体的单一疗法的讨论中具体列出的癌症。
在某些实施方案中，本文讨论的治疗性抗体的组合可以作为单一组合物在药学上可接受的载体中同时施用，或者作为分开的组合物而每种抗体在药学上可接受的载体中同时施用。在另一个实施方案中，可以按顺序施用治疗性抗体的组合。
此外，如果按顺序施用多于一种剂量的联合疗法，则在每个施用时间点顺序施用的顺序可以颠倒或保持相同的顺序，顺序施用可以与同时施用组合，或它们的任何组合。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多机制都可以通过灭活由肿瘤表达并且具有免疫抑制作用的蛋白质来克服。这些包括TGF-β(Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)和Fas配体(Hahne et al.(1996)Science 274:1363-1365)。在另一个例子中，这些实体中的每一个的抗体可以进一步与抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体组合结合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并促进宿主的肿瘤免疫应答。
可用于激活宿主免疫应答的其他抗体可进一步与抗-PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体组合结合使用。这些包括树突状细胞表面上的激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体(Ridge等人，同上)可以与抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1组合结合使用(Ito等人，同上)。针对T细胞共刺激分子的其他活化抗体(Weinberg等人，同上；Melero等人，同上；Hutloff等人，同上)也可以提供提高水平的T细胞活化。
如上所述，目前将骨髓移植用于治疗多种造血源性肿瘤。组合的PD-1和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-L1阻断剂可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的效力。
几种实验治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增，以及将这些细胞过继转移至针对肿瘤的抗原特异性T细胞的受体中(Greenberg&Riddell，同上)。这些方法也可以用于激活对诸如CMV之类的感染因子的T细胞应答。可以预期在存在抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体的情况下进行离体激活会增加过继转移T细胞的频率和活性。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病(例如癌症)有关的不良事件的方法，该方法包括向对象施用抗PD-1抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体。例如，本发明的方法提供了一种通过向患者施用不可吸收的类固醇来减少免疫刺激性治疗性抗体诱导的结肠炎或腹泻的发生率的方法。因为将会接受免疫刺激性治疗性抗体的任何患者都有发展为由这种抗体引起的结肠炎或腹泻的风险，所以整个患者群体都适合根据本发明的方法进行治疗。尽管已使用类固醇治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD恶化，但尚未将类固醇用于在未诊断为IBD的患者中预防IBD(降低IBD的发生率)。与类固醇(甚至是不可吸收的类固醇)相关的显著副作用阻碍了预防性使用。
在进一步的实施方案中，PD-1与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-L1阻断剂的组合(即，免疫刺激性治疗性抗体抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3抗体和/或抗PD-L1抗体)可以进一步与使用任何不可吸收的类固醇组合使用。如本文所用，“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其表现出广泛的首过代谢，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，不可吸收的类固醇是布地奈德(budesonide)。布地奈德是一种局部作用的糖皮质激素，口服后主要通过肝脏广泛代谢。ENTOCORT ECTM(Astra-Zeneca)是布地奈德的pH和时间依赖性口服制剂，旨在优化向回肠和整个结肠的药物递送。ENTOCORT ECTM已在美国获准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病。ENTOCORT ECTM用于治疗克罗恩氏病的常规口服剂量为6至9毫克/天。ENTOCORT ECTM在肠内释放然后被吸收并保留在肠粘膜中。一旦它通过肠道粘膜靶组织，ENTOCORT ECTM就会被肝脏中的细胞色素P450系统广泛代谢为糖皮质激素活性可忽略不计的代谢产物。因此，生物利用度低(约10％)。与其他糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度导致改善的治疗率，首过代谢程度较差。与全身作用的皮质类固醇相比，布地奈德产生的不良反应更少，包括下丘脑-垂体抑制作用更少。但是，长期服用ENTOCORT ECTM会导致全身性糖皮质激素作用，例如皮质醇过多和肾上腺抑制。参见PDR 58th ed.2004；608-610。
在另外的实施方案中，PD-1与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-L1阻断剂的组合(即，免疫刺激性治疗性抗体抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗-LAG-3和/或抗PD-L1抗体)与不可吸收的类固醇结合可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸酯包括5-ASA试剂，例如：柳氮磺吡啶(AZULFIDINETM,Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉秦(olsalazine)(DIPENTUMTM,Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(COLAZALTM,Salix Pharmaceuticals,Inc.)；以及美沙拉嗪(mesalamine)(ASACOLTM,Procter&Gamble Pharmaceuticals；PENTASATM,Shire US；CANASATM,Axcan Scandipharm,Inc.；ROWASATM,Solvay)。
根据本发明的方法，将水杨酸酯与抗PD-1和抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体和非可吸收的类固醇组合施用可以包括水杨酸酯和不可吸收的类固醇的任何重叠或按顺序施用，以减少由免疫刺激抗体诱导的结肠炎的发生。因此，例如，用于减少根据本发明的免疫刺激抗体诱导的结肠炎发生率的方法包括同时或依次施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇(例如，在不可吸收的类固醇后6小时施用水杨酸盐)、或其任何组合。此外，根据本发明，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径(例如均口服给药)或通过不同的途径(例如，水杨酸盐通过口服给药而不可吸收的类固醇直肠给药)给药，其可能不同于用于施用抗PD-1与抗CTLA-4和/或抗LAG-3和/或抗PD-L1抗体的组合的途径。
通过以下实施例进一步说明本公开，其不应解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1使用杂种瘤技术生成小鼠抗PD-1单克隆抗体
免疫接种
根据E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998中所述的方法免疫小鼠。将在C末端具有人IgG1 Fc标记的重组人PD-1蛋白(Aero biosystems,#PD-l-H5257,含有细胞外结构域,AA Leu 25-Gln 167)用作免疫原。将人PD-1-his蛋白(Sino biological,#10377-H08H)用于确定抗血清滴度和筛选分泌抗原特异性抗体的杂交瘤。
具体地，对每只动物注射在完全弗洛伊德佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.,USA)中的25μg人PD1 Fc蛋白，然后通过注射在不完全弗洛伊德佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.,USA)中的25μg人PD1 Fc蛋白质来加强免疫2-3次(取决于抗血清滴度)。通过使用重组人PD 1-his蛋白的基于ELISA的筛选来测量抗血清滴度。简而言之，将稀释的血清(60μl)加入到每个孔中，并在37℃下孵育40分钟。然后将板洗涤4次，使用HRP-山羊抗小鼠-IgG(Jackson Immunoresearch,Cat#115-036-071)进行检测，并在450nm处观察结合OD。在杂交瘤融合之前，通过腹膜内注射给予具有良好效价的动物最终的加强免疫。
杂交瘤融合与筛选
在融合之前，培养鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Agl4,ATCC#CRL-l58l)的细胞以达到对数期。无菌制备来自免疫小鼠的脾细胞，并按照Kohler G,and Milstein C,"Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity,"Nature,256:495-497(1975)中所述的方法与骨髓瘤细胞融合。随后将融合的“杂交细胞”分配到DMEM/20％FCS/HAT培养基中的96孔板中。融合后7至10天在显微镜下观察存活的杂交瘤集落。两周后，使用重组人PD 1-his蛋白对每个孔的上清液进行基于ELISA的筛选。简而言之，在4℃下用60μl人PD1-his(Sino biological,#10377-H08H，在PBS中2.0μl/ml)包被ELISA板过夜。将板用PBST洗涤4次，并用200μl封闭缓冲液(PBST中的5％非脂肪乳)封闭。将稀释的杂交瘤上清液(60μl)加到每个孔中，并在37℃下孵育40分钟。然后将板洗涤4次，使用HRP-山羊抗小鼠-IgG(Jackson Immuno research,Cat#l 15-036-071)进行检测，并在450nm处观察结合OD。然后选择分泌与人PD1-his结合的抗体的阳性杂交瘤，并将其转移至24孔板。对产生具有高特异性结合和PD1/PDL1阻断活性的抗体的杂交瘤克隆进行亚克隆，并通过蛋白A亲和层析纯化由亚克隆产生的抗体。简而言之，使用PBS缓冲液以5至10倍柱体积洗涤蛋白A琼脂糖柱(来自bestchrom(Shanghai)Biosciences,Cat#AA0273)。使细胞上清液通过柱，然后使用PBS缓冲液洗涤柱直至蛋白质的吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱，并立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)收集到1.5ml管中。合并含有IgG的级分，并在PBS中于4℃透析过夜。
实施例2使用BIACORE表面等离子体共振技术的小鼠抗PD-1单克隆抗体的亲和力 测定
通过Biacore T200系统(GE healthcare,Pittsburgh,PA,USA)，表征实施例1中产生的纯化的抗PD-1小鼠单克隆抗体(mAb)(即克隆C1E1、D1F2、C1F5、D1A1、D1F1、C1E2、C1A1、C1F4、D2C2、2G2和C1C5，后来都确定是IgG1/κ同种型)的亲和力和结合动力学。
简单而言，使用由Biacore提供的标准胺偶联试剂盒(GE healthcare,Pittsburgh,PA,USA)通过伯胺将山羊抗小鼠IgG(GE healthcare,Cat#BRl 00839,HumanAntibody Capture Kit)共价连接至CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。然后将纯化的抗PD-1抗体和浓度为66.7nM的Nivolumab
Figure BDA0002698451610000382
以10μL/min的流速流到芯片上。然后，将HBS EP缓冲液(由Biacore提供)中的重组人PD-1-His(Sino biological,#10377-H08H)或食蟹猴PD-1-his蛋白(Aerobiosystems,#PD-l-C5223)以30μL/min的流速流到芯片上。跟踪抗原-抗体结合动力学2分钟，并跟踪解离动力学10分钟。使用BIA评估软件，将结合和解离曲线拟合至1:1Langmuir结合模型。
确定ka、kd和KD值并显示在下表2中。
表2.与人或食蟹猴PD-1结合的小鼠抗PD-1单克隆抗体的Biacore动力学
Figure BDA0002698451610000381
Figure BDA0002698451610000391
本发明的抗体以比Nivolumab更低的KD特异性结合人PD-1，表明对人PD-1的亲和力更高。
实施例3小鼠抗PD-1单克隆抗体的结合活性
用在PBS中的2μg/ml山羊抗小鼠IgG Fcγ片段(Jackson Immuno Research,#115-006-071,100μg/孔)包被96孔微板，并在4℃下孵育过夜。将板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween-20,PBST)洗涤4次，然后用200μl/孔的封闭缓冲液(PBST中5％w/v非脂肪乳)在37℃下封闭2小时。再次洗涤板，并与100μg/孔的实施例1的纯化的抗PD-1抗体和Nivolumab(0.004-66.7nM，在PBST中的2.5％非脂肪乳中5倍连续稀释)在37℃温育40分钟，然后再洗4次。将含有捕获的抗PD-1抗体的平板与生物素标记的人PD-1Fc蛋白(SEQ ID NO：100，PBST中2.5％非脂肪乳中的60nM，100μg/孔)于37℃孵育40分钟。洗涤4次，并与抗生蛋白链菌素缀合的HRP(在PBST中1:10000稀释，Jackson Immuno Research,#016-030-084，100μg/孔)一起在37℃温育40分钟。最后一次洗涤后，将板与100μg/孔ELISA底物TMB(Innoreagents)孵育。用50μg/孔的1M H2SO4在25℃下在15分钟内终止反应，并在450nm读取吸光度。使用Graphpad Prism软件分析数据，并报告EC50值。
结果总结在下表3中。
表3.抗PD-1抗体与人PD-1的结合活性
Figure BDA0002698451610000392
Figure BDA0002698451610000401
结果表明，本发明的抗体与人PD-1特异性结合，其中几个克隆具有比Nivolumab更低的EC50值。
实施例4使用ELISA的功能性阻断测定和报告测定
4.1配体阻断ELISA
使用竞争性ELISA测定法测量本发明的抗PD-1抗体阻断PD-1-PD-L1相互作用的能力。简而言之，将人PD-L1-Fc蛋白(SEQ ID NO：101)以2μg/mL PBS包被在96孔微板上，并在4℃下孵育过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween-20,PBST)洗涤，并用PBST中5％非脂肪乳在37℃下封闭2小时。然后使用洗涤缓冲液再次洗涤板。
制备在生物素标记的人PD-1-Fc(SEQ ID NO：100，PBST中2.5％非脂肪乳中的10nM)中的本发明的抗PD-1抗体或Nivolumab的稀释液(从100nM开始，四倍连续稀释)，并在室温下孵育40分钟，然后将抗体/PD-1-Fc-生物素混合物(100μl/孔)加入到PD-L1包被的板中。在37℃下孵育40分钟后，使用洗涤缓冲液将板洗涤4次。然后加入100μl/孔的抗生蛋白链菌素缀合的HRP，并在37℃下孵育40分钟，以检测结合至PD-L1的生物素标记的人PD-1。再次使用洗涤缓冲液洗涤板。最后，加入TMB，并使用1M H2SO4终止反应，并在450nm处读取吸光度。使用Graphpad Prism软件分析数据，并报告IC50值。
4.2基准阻断ELISA
使用竞争性ELISA测定法测量本发明的抗PD-1抗体阻断基准(Nivolumab)-人PD-1结合的能力。简而言之，将Nivolumab以2μl/mL的PBS溶液包被在96孔微板上，并在4℃下孵育过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液洗涤，并用PBST中的5％非脂肪乳在37℃封闭2小时。封闭时，将生物素标记的人PD-1Fc(SEQ ID NO：100，在PBST中的2.5％非脂肪乳中的10nM)与测试的每种抗体(137pM-100nM，3倍连续稀释)混合并在25℃下孵育40分钟。洗涤后，将PD-1/抗体混合物(100μl/孔)添加到用Nivolumab包被的板上，并在37℃下孵育40分钟。再次用洗涤缓冲液洗涤板，然后加入100μl/孔的SA-HRP，并在37℃下孵育40分钟，以检测与
Figure BDA0002698451610000411
结合的生物素标记的人PD-1。最后使用洗涤缓冲液洗涤板。加入TMB，并用1M H2SO4终止反应，并在450nm读取吸光度。使用Graphpad Prism软件分析数据，并报告IC50值。
4.3基于细胞的功能测定
通过使用基于细胞的报告子分析来评估抗体阻断细胞膜PD-1/PD-L1相互作用的活性。该测定法包括两种基因工程化细胞系组成：稳定地表达人PD-1和由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的萤光素酶报告子的PD-1效应细胞系(Genscript,GS-J2/PD-1)，以及稳定地表达人PD-L1和工程化细胞表面蛋白-抗原肽/主要组织相容性复合物(MHC)的PD-L1细胞系(Genscript,GS-C2/PD-L1,APC细胞)。当这两种细胞系共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制了PD-1效应细胞的T细胞受体(TCR)介导的萤光素酶表达(通过NFAT途径)。
基于细胞的功能测定如下进行。简而言之，将处于对数期阶段的PD-L1细胞以5×105/ml的密度接种到384孔细胞培养板中。第二天，制备在测定缓冲液(RPMI 1640+1％FBS)中的本发明的抗PD-1抗体或Nivolumab的稀释液(从333.3nM开始，5倍连续稀释)。同时，丢弃384孔板中的PD-L1细胞的培养基，然后将抗PD-1抗体(20μl/孔)和PD-1效应细胞(密度为6.25×105/m，20μl/孔)的稀释液加入至384孔细胞培养板。在37℃下共培养6小时后，将板从培养箱中取出，并根据生产商的说明使用One-Glo荧光素酶测定系统(Promega,#E6l20)读取每个孔的发光度。使用Graphpad Prism软件分析剂量-反应曲线，并报告EC50值。
这三种测定的结果总结在下表4中。
表4.抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力
Figure BDA0002698451610000421
可以看出，本发明的抗体能够阻断人PD-1/人PD-L1的相互作用，其中一些克隆的EC50或IC50值低于Nivolumab。
数据还显示，本发明的抗体能够阻断人PD-1/Nivolumab的相互作用，其中来自克隆2G2的抗体具有部分阻断，表明它们结合与Nivolumab相同或相似的表位。
实施例5嵌合抗体的产生和表征
将抗PD1小鼠mAh C1E1的重链和轻链的可变域分别框内克隆至人IgG1重链和人κ轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO：67和80所示的氨基酸序列，而人IgG1重链和人κ轻链恒定区的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：97和98中列出。遵循前述实施例中的方案，在结合捕获ELISA、竞争ELISA和基于细胞的功能性报告子测定中证实了所得嵌合抗体的活性。数据显示，嵌合的C1E1抗体具有与基准
Figure BDA0002698451610000423
相当的活性，如下表5所示。
表5.嵌合抗体的结合和功能活性
Figure BDA0002698451610000422
实施例6抗PD-1小鼠单克隆抗体C1E1的人源化
选择小鼠抗PD1抗体C11E1用于人源化和进一步研究。小鼠抗体的人源化是使用成熟的CDR移植方法进行的，如下所述。
为了选择用于小鼠抗体C1E1人源化的受体框架，针对人免疫球蛋白基因数据库对小鼠C11E1的轻链和重链可变区序列进行了blast处理。选择与小鼠C1E1具有最高同源性的人种系IGVH和IGVK作为用于人源化的受体框架。将小鼠抗体重/轻链可变区CDR插入所选择的框架，并且进一步突变框架中的残基以获得更多候选的重链/轻链可变区。
将含有编码人源化C1E1 E1重链/轻链可变区以及人IgG1重链和人κ轻链恒定区的核苷酸序列的载体以60％比40％的轻链与重链构建体比率瞬时转染到50ml 293F悬浮细胞培养物中，1.2mg/ml PEI。在摇瓶中放置六天后，收集细胞上清液，离心分离成沉淀细胞，并在IgG分离之前通过0.22μm的过滤器过滤。通过蛋白A亲和色谱法纯化抗体。简而言之，使用PBS缓冲液以5至10倍柱体积洗涤蛋白A琼脂糖柱(来自bestchrom(Shanghai)Biosciences,Cat#AA0273)。使细胞上清液通过柱，然后使用PBS缓冲液洗涤柱直到蛋白质的吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱，并立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)收集到1.5ml管中。合并含有IgG的级分，并在PBS中于4℃透析过夜。
总共获得了10种人源化抗体，其中进一步表征了8种，即huClE1-V1至huClE1-V7和huClE1-V10。上面表1中总结了8种抗体的重链/轻链可变区氨基酸序列，人IgG1重链和人κ轻链恒定区序列分别列于SEQ ID NO：97和98。
如实施例2中所述，通过BIACORE技术评估了huClE1-V1至huClE1-V7与人PD1的结合亲和力，亲和力KD值总结在下表6中。如实施例3中所述，通过捕获结合ELISA评估抗体huClE1-V10与人PD1的结合活性，其利用山羊抗人IgG Fab捕获抗体(JacksonImmunoResearch,Cat#109-005-097)来捕获IgG，结合的EC50值总结在表7中。所有8种人源化抗体具有与嵌合抗体C11 E1相当的亲和力。
表6.人源化C1E1 mAb的亲和力
Figure BDA0002698451610000441
表7.人源化C1E1 mAb的结合活性
Figure BDA0002698451610000442
然后，按照实施例2至4的方案，通过Biacore和通过结合捕获ELISA测试人源化抗体huClE1-V10对人和食蟹猴PD1的亲和力，并通过竞争ELISA和通过基于细胞的报告子测定测试功能活性。如表8所示，huClE1-V10显示出与嵌合C1E1抗体相当的体外活性。
表8.人源化C1E1 mAh的结合和功能活性
Figure BDA0002698451610000443
Figure BDA0002698451610000451
实施例7人源化C1E1抗体的理化性质
通过使用如下所述的蛋白质热位移测定、cIEF技术、SEC技术和冻融法来检查抗PD1人源化抗体huClE1-V10的理化性质。
蛋白质热位移测定法测定Tm
使用GloMeltTM热位移蛋白稳定性试剂盒(Biotium,Cat#33022-T,lot#:181214)测量抗PD1人源化抗体huClE1-V10的热稳定性。简要地，使GloMeltTM染料解冻并达到室温。将含有染料的小瓶涡旋并离心。通过将5μL 200x染料添加到95μL PBS中来制备10x染料。在总20μL反应体积中加入2μL 10x染料和10μL抗体。建立了具有表9中详细参数的熔解曲线程序。将试管短暂旋转，然后放入实时PCR热循环仪(Roche，LightCycler 480II)中。使用Microsoft Excel2010软件分析结果。
表9.熔解曲线程序的参数
Profile步骤 温度 变温速度 保持时间
初始保持 25℃ NA 30s
熔解曲线 25-99℃ 0.1℃/s NA
cIEF技术确定pI
使用毛细管等电聚焦(cIEF)来确定抗PD1人源化抗体huClE1-V10的pI和电荷异质性。简而言之，将35μL 0.1％MC、4μL pH3-10 Pharmlyte、2μL0.5mol/L Arg、1μL Mark-7.05和1μL Mark-9.99添加到装有PBS中的20μg抗体的试管中，然后添加ddH2O直至100μL。电泳程序包括两个阶段：在1500V下初始分离1分钟，然后在3000V下进行6分钟。暴露5分钟进行检测后，使用MauriceTMCompassTM软件(Proteinsimple Inc.,USA)分析数据。
SEC技术确定聚集度
通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Agilent Technologies，1260Infinity II)评估单体的百分比。抗体携带在水性流动相中，并通过填充在柱中的多孔固定相树脂。柱中的保留时间是蛋白质的流体动力学尺寸和填充树脂床中孔尺寸的函数。较小的分子可以渗透到树脂的较小孔中，并且与较大的分子相比保留时间更长。从柱上洗脱后，通过紫外线吸收检测蛋白质。流动相为磷酸盐缓冲盐溶液，在280nm处监测吸光度。流速为0.8mL/分钟。进样量为40μL 1mg/mL样品。柱温为室温。自动进样器温度为2-8℃。总运行时间为25分钟。
冻融法确定稳定性
在1xPBS制剂(含有137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4.12H2O、2mmol/L KH2PO4)中的1mg/ml抗体溶液被冷冻在-80℃至少24小时，然后在室温下解冻30-60分钟。每个样品重复5次冷冻和融化循环。在某些冻融循环后，例如第二、第三和第四次后，在重新冷冻之前，取出一部分溶液用于SEC分析。
通过GloMeltTM热位移蛋白稳定性试剂盒评估了导致变性的不稳定性。如图1所示，抗PD1人源化抗体huC1E1-V10显示出通常在78℃下的高解链温度(Tm)，并且在69.5℃下也显示出次要峰。huClE1-V10的cIEF分析表明，主要同种型的百分比为约81.5％，酸性物种的百分比为约11.0％，碱性物种的百分比为约7.5％。使用MauriceTMCompassTM软件计算pI，huClE1-V10抗体的pI值为8.36。huClE1-V10人源化抗体的pI显著高于7，因此预期在中性pH值下具有显著的正电荷。huClE1-V10的SEC测试表明，单体百分比为100.0％(见图2)。通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估冷冻和解冻的稳定性。抗体huClE1-V10没有显示出随着时间的推移聚集水平的明显增加，并且在重复冷冻和融化5次之后没有观察到沉淀或混浊。
实施例8小鼠C11E1抗体的体内抗肿瘤功效
在NCG小鼠中评估了小鼠C1E1抗体的体内抗肿瘤活性。简而言之，在第1天，在右腋下对NCG小鼠皮下注射与5x105个肿瘤激活的PBMC混合的4x106个人黑素瘤A375细胞。每周三周使用电子卡尺测量肿瘤体积，并计算为(长度x宽度2)/2。选择二十四只荷瘤小鼠，并在第14天随机分为四组。分别以3mg/kg的剂量在第14、21和28天对动物腹膜内给予媒介物(5％葡萄糖溶液)、小鼠C1E1、小鼠C1E1 Fab和Nivolumab。小鼠抗体C1E1含有小鼠重链可变区和人IgG1恒定区以及小鼠轻链可变区和人Ck1恒定区，其分别具有SEQ ID NO：67、97、80和98所示的序列，而小鼠C1E1 Fab包含小鼠重链可变域和人IgG1 CH1恒定域以及轻链可变域和人Ck1恒定域，其分别具有SEQ ID NO：67、99、80和98所示的序列。
在第35天对小鼠实施安乐死，并收集肿瘤并称重。计算肿瘤生长抑制率(％TGI＝(1-每个治疗组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积)×100％)。
所有治疗均被荷瘤动物良好耐受。如表10所示，在人黑素瘤A375异种移植模型上，3mg/kg的小鼠C1E1治疗和3mg/kg的小鼠C1E1 Fab治疗均具有比3mg/kg的Nivolumab显著更好的功效。
表10.小鼠C1E1抗体在人黑素瘤细胞A375中的抗肿瘤功效
Figure BDA0002698451610000471
a通过学生t检验与媒介物对照组进行比较，*P<0.05。
实施例9插入有小鼠C1E1编码序列的疱疹病毒T3011的体内抗肿瘤功效
在B16F10-hPD-L1黑素瘤异种移植模型上评估了插入有小鼠C1E1抗体编码序列的疱疹病毒T3011的抗肿瘤功效。
除了将C1E1 Fab片段序列插入UL3-UL4之间的基因组区域之外，通过去除反向重复区并由人IL-12基因替代(参见例如PCT/CN2016/080025)，疱疹病毒T3011是基因修饰的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。C1E1 Fab序列包含小鼠重链可变域和人IgG1 CH1恒定域以及小鼠轻链可变域和人Ckappal恒定域，其分别具有SEQ ID NO：67、99、80和98所示的序列。
简而言之，在右前侧对雌性B-hPD-1人源化小鼠皮下注射1x105Bl6FlO-hPD-Ll黑素瘤细胞。当肿瘤体积达到约90mm3时，将小鼠随机分为5组，每组8只。这些小鼠瘤内分别施用媒介物(5％葡萄糖溶液)、T3011(5×106PFU/小鼠)、T3011(1×107PFU/小鼠)、T3011(3×107PFU/小鼠)和NV1020(3×107PFU/小鼠，由MediGene(以前的NeuroVir)开发的用于潜在的癌症治疗的基于重组溶瘤HSV的病毒，请参见例如在患有广泛预处理的难治性结直肠癌转移至肝脏的患者中的溶瘤单纯疱疹病毒NV1020的I/II期研究。Hum Gene Ther.2010Sep；2l(9):1119-28)。每周两次测量肿瘤体积。
给药后十二天，对小鼠实施安乐死并收集肿瘤，称重并拍照。计算相对肿瘤体积(RTV＝TVn/TV0，其中TVn指第n天的肿瘤体积，TV0指第0天的肿瘤体积)、肿瘤生长抑制率(TGI％＝1-每个治疗组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积×100％)和肿瘤重量抑制率(IRTW＝(1-每个治疗组的平均肿瘤重量/对照组的平均肿瘤重量)×100％)。
如下表11所示，插入有小鼠C1E1抗体编码序列的T3011以剂量依赖性方式提供了明显的抗肿瘤活性。在3x l07 PFU/小鼠剂量水平下，T3011给药显示出比NV1020给药更好的抗肿瘤功效。
表11.插入有小鼠ClEl编码序列的疱疹病毒T3011对B16F10-hPD-Ll黑素瘤异种移植模型的抗肿瘤功效
Figure BDA0002698451610000481
a通过学生t检验与媒介物对照组进行比较，*P<0.05并且**P<0.01。
实施例12人源化C1E1抗体的体内抗肿瘤功效
在MC38异种移植模型上评估了人源化的C1E1抗体对肿瘤生长的作用。简而言之，在右后侧对雌性B-hPD-1小鼠皮下注射5xl05个细胞。当肿瘤体积达到约100-150mm3时，将小鼠随机分为7组，每组8只小鼠。每周两次持续三周，分别以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的剂量向动物腹膜内施用媒介物(PBS)、huClE1-V10和
Figure BDA0002698451610000482
人源化抗体huC11-V10包含重链可变区和恒定区以及轻链可变区和恒定区，其分别具有SEQ ID NO：69、97、86和98所示的序列。在研究期间测量肿瘤体积。
治疗开始后的二十三天，对小鼠实施安乐死并收集肿瘤，称重并照相。计算肿瘤体积生长抑制率(TGITV)并显示在表12中。
如下表12所示，荷瘤动物很好地耐受了所有治疗。HuClEl-V10处理在MC38异种移植模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，与
Figure BDA0002698451610000483
相当。
表12.huClEl-V10在MC38异种移植模型中的抗肿瘤功效
Figure BDA0002698451610000491
a通过学生t检验与媒介物对照组进行比较，*P<0.05并且**P<0.01。
尽管以上已经结合一个或多个实施例描述了本发明，但是应该理解，本发明不限于那些实施例，并且该描述旨在覆盖所有可能的替代、修改和等同形式，如可以包括在所附权利要求书的精神和范围之内。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。
本申请中的序列总结如下。
Figure BDA0002698451610000492
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Figure BDA0002698451610000511
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Figure BDA0002698451610000551
Figure BDA0002698451610000561
Figure BDA0002698451610000571
Figure BDA0002698451610000581
序列表
<110> 深圳市亦诺微医药科技有限公司
<120> 结合PD-1的抗体及其用途
<130> 55532 00004
<150> US62/657927
<151> 2018-04-15
<160> 130
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> C1E1、huC1E1-V1 - huC1E1-V7和huC1E1-V10的VH-CDR3
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Ala Ser Pro Tyr Ala Asn Tyr Val Trp Tyr Leu Asp Val
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VH-CDR1
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VH-CDR2
<400> 14
Ile Ser Gly Gly Gly Val Asn Thr
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VH-CDR3
<400> 15
Ala Arg His Gly Asn Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VH-CDR1
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VH-CDR2
<400> 17
Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr
1 5
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VH-CDR3
<400> 18
Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VH-CDR1
<400> 19
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VH-CDR2
<400> 20
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VH-CDR3
<400> 21
Ala Arg Thr Gly Gly Phe Ile Thr Thr Gly Tyr Trp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VH-CDR1
<400> 22
Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr Ala
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VH-CDR2
<400> 23
Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asp Val
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VH-CDR3
<400> 24
Ser Arg Leu Gly Ile Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VH-CDR1
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Thr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VH-CDR2
<400> 26
Ile Ser Gly Gly Gly Val Asp Thr
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VH-CDR3
<400> 27
Ala Arg His Gly Asn Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VH-CDR1
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Gly
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VH-CDR2
<400> 29
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Phe Thr
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VH-CDR3
<400> 30
Thr Arg Arg Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Ser Trp Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VH-CDR1
<400> 31
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VH-CDR2
<400> 32
Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Pro
1 5
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VH-CDR3
<400> 33
Val Arg Gln Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Asp Ala Met Asp
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1、huC1E1-V1 - huC1E1-V7和huC1E1-V10的VL-CDR1
<400> 34
Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser Gly Ile Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1、huC1E1-V1 - huC1E1-V7和huC1E1-V10的VL-CDR2
<400> 35
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1、huC1E1-V1 - huC1E1-V7和huC1E1-V10的VL-CDR3
<400> 36
His Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VL-CDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VL-CDR2
<400> 38
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VL-CDR3
<400> 39
Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VL-CDR1
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VL-CDR2
<400> 41
Gly Ser Gln Ser Met Ser
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VL-CDR3
<400> 42
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VL-CDR1
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VL-CDR3
<400> 44
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VL-CDR3
<400> 45
Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VL-CDR1
<400> 46
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VL-CDR2
<400> 47
Thr Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VL-CDR3
<400> 48
Gln Gln Ser Tyr Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VL-CDR1
<400> 49
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VL-CDR2
<400> 50
Tyr Ala Phe His Arg Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VL-CDR3
<400> 51
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VL-CDR1
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ile
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VL-CDR2
<400> 53
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VL-CDR3
<400> 54
Gln Gln His Lys Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VL-CDR1
<400> 55
Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VL-CDR2
<400> 56
Leu Ala Ser Asn Arg His Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VL-CDR3
<400> 57
Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VL-CDR1
<400> 58
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VL-CDR2
<400> 59
Ile Ala Ser Asn His Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VL-CDR3
<400> 60
Gln Gln Ser Tyr Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VL-CDR1
<400> 61
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Arg Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VL-CDR2
<400> 62
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VL-CDR3
<400> 63
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VL-CDR1
<400> 64
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly His Ile Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VL-CDR2
<400> 65
Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VL-CDR3
<400> 66
Phe Gln Gly Ser His Gly Thr
1 5
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1的VH
<400> 67
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V1、huC1E1-V3 - huC1E1-V7的VH
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V2和huC1E1-V10的VH
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VH
<400> 70
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Asn Tyr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VH
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Gly Gly Gly Ser Ser Ser Phe Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VH
<400> 72
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Ala Asn Tyr Val Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VH
<400> 73
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VH
<400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VH
<400> 75
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Gly Gly Phe Ile Thr Thr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VH
<400> 76
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asp Val Ser Phe Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Leu Gly Ile Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 77
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VH
<400> 77
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Val Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Tyr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VH
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Ser Trp Asp Tyr Ser Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VH
<400> 79
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gln Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1的VL
<400> 80
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 81
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V1和huC1E1-V2的VL
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V3的VL
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V4的VL
<400> 83
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V5的VL
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V6的VL
<400> 85
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V7和huC1E1-V10的VL
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VL
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VL
<400> 88
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Val Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VL
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VL
<400> 90
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VL
<400> 91
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Phe His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VL
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln His Lys Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VL
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VL
<400> 94
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ile Ala Ser Asn His Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VL
<400> 95
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Arg Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 96
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VL
<400> 96
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly His Ile Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 97
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG1重链恒定区
<400> 97
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类κ轻链恒定区
<400> 98
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 99
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG1重链CH1区
<400> 99
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 100
<211> 371
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Glu
130 135 140
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu
370
<210> 101
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 102
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1的VH
<400> 102
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggg ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacgttcagt agttatctta tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtga cacctacttt 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgtcaagaa caacctgtac 240
ctgcaaatga gcagtcttag gtctgaggac acggccttgt attactgtgt aagatttggg 300
ggcgctggtt actactggta tttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 103
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V2和huC1E1-V10的VH
<400> 103
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatctta tgtcctgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctagagtg ggtggcaact atatcaggtg gtggaggtga cacatacttc 180
ccagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagattcggt 300
ggtgctggtt actactggta ctttgacgtc tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 104
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VH
<400> 104
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtaa catctactat 180
ccagacagtg tggagggtcg attcaccgtc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcatatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtgt ccttaactac 300
gcctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 105
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VH
<400> 105
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attactggtg gtggtagtag ttccttctat 180
ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240
ttgcaaatga ccagtctgag gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagcccctac 300
ttatcctact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 106
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VH
<400> 106
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa catctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attattgtgc aagcccgtat 300
gctaactacg tatggtacct cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 107
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VH
<400> 107
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agcaatacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attagtggtg gtggtgttaa cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccctgt attactgtgc aagacatggt 300
aactacaatt actatggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 108
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VH
<400> 108
caggtccagt tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact aactactggc taggttgggt aaaacagagg 120
cctggacatg gacttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtggtta tactaactac 180
aatgagaact tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gtagcctgac atctgaggac tctgctgtct ttttctgtgc aagaggctac 300
ggtactaatt actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 109
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VH
<400> 109
caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagttc 180
tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaacc 300
ggggggttta ttactacggg ctactggtac ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 110
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VH
<400> 110
caggtccagc tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg gttctggcta caaattcact gattatgcta tgcactgggt gaggcagagt 120
catgcaaaga gtctagagtg gattggaatt attagtactt actctggtga cgttagtttc 180
aaccagaact tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240
atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgttc aagactgggg 300
attacggcgg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 111
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VH
<400> 111
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agcaatacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attagtggtg gtggtgttga cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccctgt attactgtgc aagacatggt 300
aactacaatt actatggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 112
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VH
<400> 112
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtacag cctctggatt cactttcagt tactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaaga ggctggaatg ggtcgcaacc attagtagtg gtagtagttt cacctactct 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctacaaatga acagtctgaa gtctgaggac acagccattt attactgtac aagacgagag 300
gggatctatg atgcttcctg ggattattct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 113
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VH
<400> 113
cagatccagt tggtgcagtc aggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa taaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atagtggaga gccaacatat 180
tctgatgact tcaagggacg ctttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acgtctacat atttctgtgt aagacagggg 300
gactttgatt acgaggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 114
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E1的VL
<400> 114
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcaa aagtgttgat gattctggca ttagttttat gcactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttcg tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcacc aaactaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 115
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huC1E1-V7和huC1E1-V10的VL
<400> 115
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtaa gtctgttgac gacagtggta tcagcttcat gcactggtat 120
caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg ctgcatccaa ccagggctct 180
ggcatcccag ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 240
agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcatc agactaagga ggtgccttgg 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggagatc aaa 333
<210> 116
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F2的VL
<400> 116
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggccagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacagtcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcactgggtc tgggacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240
gaagatcttg ccacttactt ttgccaacag ggtagttcgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 117
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F5的VL
<400> 117
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagtat ggttcccagt ccatgtctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctcg ttatcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 118
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1A1的VL
<400> 118
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa cctggaagaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag agtaatgcgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaaac tggaaatcaa a 321
<210> 119
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D1F1的VL
<400> 119
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggttgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattctggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagttatga ggttccttgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 120
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1E2的VL
<400> 120
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120
gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatttcatc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 121
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1A1的VL
<400> 121
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa tctggtatca gcagaaaaca 120
gatggaactc ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccagcag cataaaacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 122
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1F4的VL
<400> 122
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240
aaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 123
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2C2的VL
<400> 123
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattctggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctata ttgcatccaa ccacggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagttatga ggttccttgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 124
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2G2的VL
<400> 124
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattata cgtagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgacga tctgggactt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 125
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C1C5的VL
<400> 125
gatgttttga tgacccaaag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gacacatcta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caagcgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgggacg 300
ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 330
<210> 126
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG1重链恒定区
<400> 126
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 127
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类κ轻链恒定区
<400> 127
cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 128
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类IgG1重链CH1区
<400> 128
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agtt 294
<210> 129
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠抗体的重链恒定区
<400> 129
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠抗体的轻链恒定区
<400> 130
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (14)

1.一种与PD-1结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中所述CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下列出的氨基酸序列：
（1）分别包含SEQ ID NO：1、2和3；
（2）分别包含SEQ ID NO：4、5和6；
（3）分别包含SEQ ID NO：7、8和9；
（4）分别包含SEQ ID NO：10、11和12；
（5）分别包含SEQ ID NO：13、14和15；
（6）分别包含SEQ ID NO：16、17和18；
（7）分别包含SEQ ID NO：19、20和21；
（8）分别包含SEQ ID NO：22、23和24；
（9）分别包含SEQ ID NO：25、26和27；
（10）分别包含SEQ ID NO：28、29和30；或者
（11）分别包含SEQ ID NO：31、32和33；
其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中所述CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下氨基酸序列：
（1）分别包含SEQ ID NO：34、35和36；
（2）分别包含SEQ ID NO：37、38和39；
（3）分别包含SEQ ID NO：40、41和42；
（4）分别包含SEQ ID NO：43、44和45；
（5）分别包含SEQ ID NO：46、47和48；
（6）分别包含SEQ ID NO：49、50和51；
（7）分别包含SEQ ID NO：52、53和54；
（8）分别包含SEQ ID NO：55、56和57；
（9）分别包含SEQ ID NO：58、59和60；
（10）分别包含SEQ ID NO：61、62和63；或者
（11）分别包含SEQ ID NO：64、65和66。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链和轻链可变区包含与以下序列分别具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列：（1）SEQ ID NO：67和80；（2）SEQ ID NO：68和81；（3）SEQ ID NO：69和81；（4）SEQ ID NO：68和82；（5）SEQ ID NO：68和83；（6）SEQ ID NO：68和84；（7）SEQ ID NO：68和85；（8）SEQ ID NO：68和86；（9）SEQ ID NO：69和86；（10）SEQ ID NO：70和87；（11）SEQ ID NO：71和88；（12）SEQ ID NO：72和89；（13）SEQ ID NO：73和90；（14）SEQID NO：74和91；（15）SEQ ID NO：75和92；（16）SEQ ID NO：76和93；（17）SEQ ID NO：77和94；（18）SEQ ID NO：78和95；或（19）SEQ ID NO：79和96。
6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区具有与SEQ ID NO：97、99或129具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列，所述轻链恒定区具有与SEQ ID NO：98或130具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其（a）与人PD-1结合；（b）与猴PD-1结合；（c）抑制PD-L1与PD-1的结合；（d）增加T细胞增殖；（e）刺激免疫反应；和/或（f）刺激抗原特异性T细胞应答。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其是小鼠、人、嵌合或人源化抗体。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其进一步包含抗肿瘤剂。
12.一种用于抑制对象中的肿瘤生长的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求10所述的药物组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤或非实体瘤。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌和鼻咽癌。
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Applicant after: IMMUNO VIR Co.,Ltd.

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Applicant before: IMMUNO VIR Co.,Ltd.

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