KR20230093290A - 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 위해 데이터를 수집하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 진단하기 위한 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하기 위한 인비트로 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 검사 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 진단 방법, 진단 키트, 식도암의 치료 방법 - Google Patents
식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 위해 데이터를 수집하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 진단하기 위한 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하기 위한 인비트로 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 검사 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 진단 방법, 진단 키트, 식도암의 치료 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식도암의 내시경 치료 적응증의 정진율이 높으며, 내시경 치료 적응증의 여부를 간편하면서도 객관적으로 판단할 수 있는 범용적인 기술을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따른 방법에서는, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교한다; 본 발명의 일 양태에 따른 진단 키트는 샘플 중의 CXCL2의 발현량 및 샘플 중의 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 측정하는 시약을 구비한다; 본 발명의 일 양태에 따른 식도암의 치료 방법에서는, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법을 사용하여, 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단한다.
본 발명의 일 양태에 따른 방법에서는, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교한다; 본 발명의 일 양태에 따른 진단 키트는 샘플 중의 CXCL2의 발현량 및 샘플 중의 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 측정하는 시약을 구비한다; 본 발명의 일 양태에 따른 식도암의 치료 방법에서는, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법을 사용하여, 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단한다.
Description
본 발명은 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 위해 데이터를 수집하는 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증을 진단하기 위한 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하기 위한 인비트로 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 검사 방법, 식도암의 내시경 치료 적응증의 진단 방법, 진단 키트, 식도암의 치료 방법에 관한 것이다.
본원은 2020년 11월 17일에 출원한 일본 특허출원 2020-190857호에 근거한 우선권을 주장하며 해당 일본 출원의 전체 내용을 참고로 원용한다.
식도암은 침윤 깊이의 차이에 따라 표재성 식도암과 진행성 식도암으로 분류할 수 있다. 표재성 식도암에서 암세포가 점막 내에만 국한되어 있으면 내시경 치료를 치료 방법으로 선택할 수 있다. 한편, 암세포가 점막을 넘어 점막근판에서 점막하층까지 침윤한 경우 또는 암세포가 맥관에 침윤한 경우, 표재성 식도암에는 외과 수술, 화학방사선 요법이 선택된다.
이들 치료 방법은 내시경 치료와 비교하여 침습성이 높으며, 외과 수술은 수술 후의 합병증 발생률도 높다. 이 때문에 암세포의 침윤 깊이를 정확하게 진단하여 내시경 치료 적응증을 적절하게 결정할 필요가 있다. 일단 내시경 치료를 한 후에 추가로 외과 절제를 실시하는 것을 방지하기 위해, 또한 내시경 치료로 근치될 가능성이 있음에도 불구하고 외과적인 절제 등이 선택되는 것을 방지하기 위한 것이다.
식도암의 침윤 깊이의 판단 방법에는 MRI 검사, CT 검사, 내시경 관찰 등의 영상 진단이 있다. 그러나 식도암의 벽 내 침윤도의 차이를 정확하게 진단하는 것은 MRI 검사, CT 검사 등의 영상 기술로는 어렵다. 이 때문에 내시경 관찰에 의한 형태학 진단이 표재성 식도암의 침윤 깊이 진단의 표준적 진단법으로 시행되고 있다(비특허문헌 1).
식도암에 대한 ESD/EMR 가이드라인(일본 소화기 내시경 학회 잡지 Vol. 62(2), Feb. 2020, 221-271)
식도암에서는 암세포가 식도의 맥관 및 점막하층에 침윤하면 림프절 전이의 가능성이 커지기 때문에 마이크로 레벨로 식도벽 내 암세포의 침윤 깊이를 확인하여 내시경 치료 적응증을 판단할 것이 요구된다.
그러나, 내시경 관찰로 식도의 암세포의 침윤 깊이를 마이크로 레벨로 판단하기 위해서는 식도벽의 미세한 변화를 검사자가 포착해야 한다. 따라서, 내시경 관찰에 의한 형태학적 진단에서는 내시경 치료 적응증의 판단에 고심하는 경우가 많다. 실제 임상에서 내시경 치료 적응증의 정진율은 60~70% 전후이다. 또한, 내시경 관찰에 의한 형태학적 진단은 경험학에 기초한 아날로그 진단이기 때문에, 종래의 방법은 객관성에 개선의 여지가 있으며, 또한 범용적이지 않다.
본 발명은 식도암의 내시경 치료 적응증의 정진율이 높으며, 내시경 치료 적응증의 여부를 간편하면서도 객관적으로 판단할 수 있는 범용적인 기술을 제공한다.
본 발명의 제1 양태는 하기 [1] 내지 [5]의 양태를 갖는다.
[1] 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법으로, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법.
[2] 상기 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA 모두의 발현량을 측정하는 [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 샘플이 혈청, 혈청 엑소좀 및 종양 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 식도암이 식도의 맥관 또는 점막하층에 침윤하였는지 아닌지의 판단을 보조하는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단에 사용하는 진단 키트로, 샘플 중의 CXCL2의 발현량 및 샘플 중의 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 측정하는 시약 키트를 구비하는 진단 키트.
본 발명의 제2 양태는 상기 [1] 내지 [5]에 기재된 양태에 추가로 하기 ≪1≫ 내지 ≪7≫에 기재된 양태를 더 갖는다.
≪1≫ 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하는 방법으로, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법.
≪2≫ 상기 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA 모두의 발현량을 측정하는 ≪1≫에 기재된 방법.
≪3≫ 상기 샘플이 혈청, 혈청 엑소좀 및 종양 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 ≪1≫ 또는 ≪2≫에 기재된 방법.
≪4≫ 식도암이 식도의 맥관 또는 점막하층에 침윤하였는지 아닌지를 판단하는 ≪1≫ 내지 ≪3≫ 중 어느 하나에 기재된 방법.
≪5≫ 식도암을 치료하는 방법으로, ≪1≫ 내지 ≪4≫ 중 어느 하나의 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고, 식도암이 식도의 맥관에 침윤하지 않았다고 예측한 경우, 내시경 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법.
≪6≫ 식도암을 치료하는 방법으로, ≪1≫ 내지 ≪4≫ 중 어느 하나의 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고, 식도암이 점막하층에 침윤하지 않았다고 예측한 경우, 내시경 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법.
≪7≫ 식도암을 치료하는 방법으로, ≪1≫ 내지 ≪4≫ 중 어느 하나의 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고, 식도암이 식도의 맥관에 침윤하였거나 또는 식도암이 점막하층에 침윤하였다고 예측한 경우, 외과적 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법.
본 발명에 따르면, 식도암의 내시경 치료 적응증의 정진율이 높으며, 내시경 치료 적응증의 여부를 간편하면서도 객관적으로 판단할 수 있는 범용적인 기술이 제공된다.
도 1은 식도암의 침윤 깊이와 내시경 치료, 외과 수술의 적응증의 관계를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 실험 예의 분석 개요를 설명하기 위한 흐름도이다.
도 3은 혈청 중의 CXCL2, VEGFA의 측정 결과로 작성한 ROC 곡선이다.
도 4는 도 3의 ROC 곡선에서 CXCL2를 단독으로 사용한 경우의 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 도 3의 ROC 곡선에서 CXCL2 및 VEGFA를 병용한 경우의 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 식도암의 종양 조직에서 CXCL2의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 식도암의 종양 조직에서 VEGFA의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실험 예의 분석 개요를 설명하기 위한 흐름도이다.
도 3은 혈청 중의 CXCL2, VEGFA의 측정 결과로 작성한 ROC 곡선이다.
도 4는 도 3의 ROC 곡선에서 CXCL2를 단독으로 사용한 경우의 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 도 3의 ROC 곡선에서 CXCL2 및 VEGFA를 병용한 경우의 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 식도암의 종양 조직에서 CXCL2의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 식도암의 종양 조직에서 VEGFA의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
본 명세서에서 하기 용어의 의미는 본 단락에 기재한 바와 같다.
「식도암」이란 식도(인두에서 위에 이르기까지의 소화관 부위)에 발생하는 악성 종양을 말한다. 식도암은 병리학적으로 편평상피암, 선암, 점표피암 등으로 분류되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
「프라이머」란 DNA 및 RNA 중 어느 하나 또는 모두와 상보 결합을 형성하는 뉴클레오타이드를 의미한다.
「변이체」란 다형성, 돌연변이 등에 기인한 천연 변이체; 1 또는 2 이상의 염기, 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체를 의미한다.
「유도체」란 형광단, 방사성 동위원소 등에 의한 라벨화 유도체; 유기 관능기를 갖는 수식 뉴클레오타이드; 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자로의 치환 등을 받은 뉴클레오타이드 등을 의미한다. 다만, 유도체는 이들 예시에 한정되지 않는다.
「피검체」란 사람, 침팬지 등의 영장류; 마우스, 래트와 같은 설치류 등의 포유류; 개, 고양이 등의 애완동물; 소, 말, 양, 염소 등의 가축을 의미한다.
「피검자」는 피검체로서의 사람을 의미한다.
「검사」, 「평가」 및 「시험」의 각 용어로 특정되는 행위는, 의료 행위가 특허의 대상에서 제외되는 국가에서는 의사에 의한 의료 행위(예를 들면, 사람의 병을 진단하는 행위, 사람의 병을 치료하는 행위 등)를 포함하지 않는다.
「감도」는 (진양성의 수) / ((진양성의 수) + (위음성의 수))의 값을 의미한다.
「특이도」는 (진음성의 수) / ((진음성의 수) + (위양성의 수))를 의미한다.
수치 범위를 나타내는 「~」는 그 전후에 기재된 수치를 하한값 및 상한값으로 포함하는 것을 의미한다.
<식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법>
본 발명의 방법은 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 식도암은 점막상피에서 외막으로 향하는 침윤 깊이에 따라 표재성 식도암과 진행성 식도암으로 분류된다. 진행성 식도암에서는 근치 절제가 가능하다면 외과 수술이 표준 치료법이다. 한편, 암의 침윤이 점막하층에 국한된 표재성 식도암(T1a 또는 T1b) 중 점막내암(T1a)은 내시경 치료로 근치할 수 있으며, 내시경 치료 적응증이다.
특히, 최근에는 점막근판에 침윤한 암(T1a MM) 중에서도, 미소한 맥관에 암세포가 침투하지 않은 암에 대해서도 내시경적 절제가 선택되는 추세이다. 예를 들어, 도 1의 도면 부호 1은 암세포가 침윤하지 않는 맥관을 나타낸다. 맥관에 암세포가 침윤하지 않았다면 내시경 치료를 선택할 수 있다. 한편, 도 1의 도면 부호 2는 암세포가 침윤한 맥관을 나타내며, 도면 부호 3은 식도의 맥관에 침윤한 암세포를 나타낸다. 맥관에 암세포가 침윤한 경우, 외과 수술이 권장된다.
본 발명의 방법은, 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 농도를 측정함으로써 표재성 식도암의 침윤 깊이를 예측하여 내시경 치료 적응증으로 할 것인지 외과 수술 적응증으로 할 것인지의 판단 및 진단을 보조한다.
특히, 본 발명에서는 식도암이 식도의 맥관 또는 점막하층에 침윤하였는지 아닌지를 예측할 수 있어서 내시경 치료 적응증의 여부에 관한 판단을 보조할 수 있다.
본 발명의 방법은, 피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교한다.
샘플로는 예를 들면, 피검체의 체액, 피검체에서 채취한 종양 조직(생검 조직)을 들 수 있다. 체액으로는 예를 들면, 혈액, 혈청, 유즙, 소변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 양수, 누액, 땀, 비루, 대변액(便汁) 등의 체액; 및 이들 체액에 포함된 엑소좀을 들 수 있다. 다만, 체액이 이들 예시에 한정되는 것은 아니다. 상기 각 체액에서 불필요한 성분을 제거하는 등의 전처리를 행한 처리액; 상기 각 체액에 포함된 세포를 배양하여 얻어진 배양액일 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 사용할 수 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
발명의 효과를 쉽게 확인할 수 있기 때문에 이들 중에서도 혈청, 혈청 엑소좀이 바람직하다.
CXCL2는 사이토카인인 CXC 케모카인의 일종이다. CXCL2는 「Chemokine (C-X-C motif) ligand 2」의 약어이다. 또한, CXCL2는 Gro-β, GRO2, MIP-2α로 지칭될 수도 있다.
VEGFA는 혈관내피세포 증식인자의 일종이다. VEGFA는 「Vascular Endothelial Growth Factor-A」의 약어이다. 또한, VEGFA는 혈관내피 증식인자 A로 지칭될 수도 있고, 단순히 VEGF로 지칭될 수도 있다.
감도가 더욱 높아지기 때문에 본 발명의 방법에서는 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA 모두의 발현량을 측정하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법에서는 CXCL2, VEGFA의 각각의 변이체, 유도체의 발현량을 측정해도 된다.
CXCL2, VEGFA의 발현량은 CXCL2, VEGFA를 코딩하는 DNA의 발현량일 수도 있고, CXCL2, VEGFA를 코딩하는 RNA의 발현량일 수도 있으며, CXCL2, VEGFA의 단백질 발현량일 수도 있다.
예를 들면, 샘플 중의 CXCL2, VEGFA의 단백질 농도를 그 발현량으로 측정하는 경우, 샘플에 대해 ELISA, Multiplex 등의 다양한 단백질 측정 방법을 사용할 수 있다. 단백질 농도의 측정 방법은 ELISA, Multiplex에 한정되지 않으며, 그 외의 다양한 단백질 측정 방법을 사용할 수 있다.
단백질의 발현량을 측정할 때는, 샘플 중에서 발현량이 항상 안정적인 단백질을 표준화 인자로 하여 발현량을 규격화할 수 있다.
DNA의 발현량, RNA의 발현량의 측정 방법은 DNA, RNA의 농도를 측정할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. DNA 농도의 측정 방법으로는 PCR을 들 수 있지만, 그 외의 다양한 측정 방법을 사용할 수 있다. 또한, RNA 농도의 측정 방법으로는 역전사 PCR, qPCR을 들 수 있지만, 그 외의 다양한 RNA 측정 방법을 사용할 수 있다. DNA의 발현량 및 RNA의 발현량을 PCR의 사이클 수의 컷오프 값에 기초하여 산출할 수 있다.
DNA의 발현량, RNA의 발현량을 측정할 때는, CXCL2, VEGFA를 코딩하는 DNA 및 RNA 이외의 다른 DNA, RNA로, 샘플 중에서 발현량이 항상 안정적인 다른 DNA, RNA를 표준화 인자로 하여 발현량을 규격화할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 방법에서는 측정한 CXCL2, VEGFA의 발현량을 기준치와 비교한다. CXCL2의 발현량 및 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 값을 기준치와 비교함으로써, 마이크로 레벨에서 식도벽 내의 암세포의 침윤 깊이를 우수한 정진율로 예측할 수 있다. 이에 따라, 내시경 치료 적응증을 적절하게 판단할 가능성이 종래 기술보다 높아진다.
기준치로는, 이 값 이상이면 암세포가 식도의 점막근판을 넘어 점막하층에 침윤하였을 것으로 의심되는 기준치를 고려할 수 있다. 그 밖에도 기준치로는 이 값 이상이면 암세포가 식도의 맥관 내에 침윤하였을 것으로 의심되는 기준치를 고려할 수 있다.
기준치를 정할 때는 내시경 치료 적응증의 피검체에서의 CXCL2, VEGFA의 발현량을 참고로 할 수 있다. 통상적으로, 기준치는 내시경 치료 적응증의 피검체에서의 CXCL2, VEGFA의 발현량이다. 판별 시에 사용하는 기준치는 피검체의 연령, 성별, 채취 방법, 검체의 종류, 원하는 감도, 특이도, 정진율 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.
상세하게는 후술하는 실험 예에서 설명하겠지만, 샘플 중의 CXCL2, VEGFA의 발현량이 기준치보다 낮은 경우, 암세포가 식도의 점막하층 및 식도의 맥관 모두에 침윤하지 않았다고 예측할 수 있으며 내시경 치료를 선택하는 것이 바람직하다고 판단할 수 있다. 한편, 샘플 중의 CXCL2, VEGFA의 발현량이 기준치 이상인 경우, 암세포가 식도의 점막근판을 넘어 점막하층에 침윤하였거나 또는 암세포가 식도의 맥관에 침윤하였다고 예측할 수 있으며 내시경 치료 대신에 외과 수술, 화학 방사선 요법을 선택하는 것이 바람직하다고 판단할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법에서는, 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교한다. 후술하는 실시 예에 나타내는 바와 같이, CXCL2, VEGFA의 샘플 중의 농도로부터 식도암의 점막하층 및 맥관으로의 침윤 여부를 예측할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 방법에 따르면 피검체가 내시경 치료 적응증인지 또는 외과 수술 적응증인지를 우수한 정진율로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 형태학 진단과 같은 경험학에 근거한 아날로그 진단과는 달리 검사 수치에 근거한 디지털 방법으로, 객관성이 우수하며 범용적인 방법이다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하기 위해 데이터를 수집하는 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증을 진단하기 위한 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증의 검사 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하기 위한 인비트로 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증의 진단 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증의 판정 방법이라고도 할 수 있다.
이상에서 설명한 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법은, 식도암의 내시경 치료 적응증의 시험 방법이라고도 할 수 있다.
<진단 키트>
본 발명의 진단 키트는 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단에 사용하는 진단 키트이다. 본 발명의 진단 키트는 샘플 중의 CXCL2의 발현량 및 샘플의 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 측정하는 시약 키트를 구비한다.
CXCL2, VEGFA의 각각의 DNA 발현량을 측정하는 시약 키트로는 예를 들면 CXCL2, VEGFA의 각각의 DNA와 특이적인 프라이머를 적어도 구비하는 것을 들 수 있다. DNA 발현량을 측정하는 시약 키트는 DNA 추출 시약 및 PCR용 효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 추가로 구비할 수 있다. DNA 추출 시약은 샘플에서 DNA를 추출할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다.
CXCL2, VEGFA의 각각의 RNA 발현량을 측정하는 시약 키트로는 예를 들면 CXCL2, VEGFA의 각각의 mRNA와 특이적인 프라이머를 적어도 구비하는 것을 들 수 있다. CXCL2, VEGFA의 mRNA와 특이적인 프라이머로부터 역전사 반응을 실행하고 이후에 RT-PCR, qPCR 등을 실행하면 CXCL2, VEGFA의 RNA 발현량을 측정할 수 있다.
또한, RNA 발현량을 측정하는 시약 키트는 RNA 추출 시약 및 역전사 효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 추가로 구비할 수 있다. RNA 추출 시약은 샘플에서 RNA를 추출할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 역전사 효소는 통상의 RT-PCR, qPCR에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
CXCL2, VEGFA의 단백질 발현량을 측정하는 시약 키트는 샘플 중의 CXCL2, VEGFA의 농도를 측정할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블로팅 등의 다양한 분석 방법을 실행하기 위한 시약 키트를 들 수 있다.
엑소좀 중의 발현량을 측정하는 경우, 본 발명의 진단 키트는 샘플에서 엑소좀을 추출하기 위한 엑소좀 추출 키트, 엑소좀에서 RNA를 추출하기 위한 RNA 추출 키트 및 엑소좀에서 단백질을 추출하기 위한 단백질 추출 키트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 더 구비할 수 있다.
혈액을 피검체에서 채취하는 경우, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 채혈 키트는 주삿바늘, 채혈관 등을 추가로 구비할 수 있다.
(치료 방법)
식도암의 치료 방법, 치료 방침에 대해 설명한다. 사람을 진단하거나 또는 치료하는 행위가 특허의 대상이 아닌 국가에서는 본 발명의 방법은 치료 방법에 적용되지 않는다.
사람을 진단하거나 또는 치료하는 행위가 특허의 대상인 국가에서는 본 발명의 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 예측하고 식도암이 점막하층에 침윤하지 않았다고 예측한 경우, 내시경 치료를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 식도암이 식도의 맥관에 침윤하지 않았다고 예측한 경우에도 내시경 치료를 선택하는 것이 바람직하다. 한편, 식도암이 식도의 점막하층에 침윤하였다고 예측한 경우, 또는 식도암이 식도의 맥관에 침윤하였다고 예측한 경우, 외과적 치료를 선택하는 것이 바람직하다. 특히, 식도암이 식도의 맥관에 침윤하였다고 예측한 경우에는 식도암의 침윤 깊이와 관계 없이 외과적 치료를 선택하는 것이 바람직하다고 생각된다. 구체적인 치료 방법은 치료 행위가 이루어지는 국가에서 승인 또는 인가한 방법이라면 특별히 한정되지 않는다. 암의 근치 효과가 예상되는 치료라면 다양한 치료 기술을 적용할 수 있다.
실시 예
이하, 실험 예를 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실험 예에 한정되지 않는다.
<약어의 설명>
n：증례 수
AUC: Area Under the ROC Curve
95% CI: 95% 신뢰 구간
<단백질 발현량 분석>
(분석 개요)
내시경적 또는 외과적으로 절제하여 치료 전에 검체를 채취한 식도암 44례 중, 침윤 깊이가 T1인 표재성 식도암 25례를 분석 대상으로 하였다(도 2). 이 25례 중, 수술 후의 병리 조직 진단 결과에 근거하여 침윤 깊이가 T1a인 식도암 중에서도 림프절 전이 및 맥관 침습이 없는 것(맥관 침습 음성)을 「내시경 치료 적응증 병변」으로 하고, 림프절 전이 또는 맥관 침습이 있는 것(맥관 침습 양성) 또는 침윤 깊이가 T1b 이상인 식도암을 「수술 적응증 병변」으로 하였다. 「내시경 치료 적응증 병변」에서는 내시경 치료가 권장된다. 또한, 「수술 적응증 병변」에서는 외과 수술이 권장된다.
또한, 통상적인 혈청 단백질 분석에 추가로, 혈청에서 엑소좀을 추출하여 혈청 엑소좀 단백질의 분석도 했다(도 2). 혈청 단백질, 혈청 엑소좀 단백질의 분석을 하고 CXCL2, VEGFA, 그 외 9개의 혈관 신생 인자의 농도를 ELISA, Multiplex로 측정하였다. 여기에 결과를 도시하지 않았지만 다른 9개 인자란 구체적으로 FGF-basic, P1GF, Angiopoietin-1, PDGF-AA, Thrombospondin 2, Angiogenin, MEP1a, CXCL3, Endostatin이다.
이들 다른 9개 인자와 비교하여, CXCL2, VEGFA의 각각의 농도는 「내시경 치료 적응증 병변」과 「수술 적응증 병변」에서 유의미한 차이가 인정되었다. CXCL2, VEGFA의 측정 결과를 표 1에 나타낸다.
| 내시경 치료 적응증 병변 | 수술 적응증 병변 | P값 | ||
| CXCL2 | 혈청(pg/ml) | 222.1±107.9 | 656.2±592.9 | 0.003 |
| 혈청exosome(pg/ml) | 77.1±36.9 | 737.6±1362.4 | 0.030 | |
| VEGFA | 혈청(pg/ml) | 67.1±44.8 | 141.6±92.0 | 0.014 |
| 혈청exosome(pg/ml) | 18.6±18.4 | 51.3±43.5 | 0.014 | |
(측정 결과와 ROC 곡선의 구축)
「내시경 치료 적응증 병변」과 비교하여 「수술 적응증 병변」에서 혈청 및 혈청 엑소좀 중의 CXCL2, VEGFA 농도의 유의미한 상승이 확인되었다(표 1). 한편, 다른 9개 인자에 관해서는 두 그룹 간의 유의미한 차이는 확인되지 않았다.
도 3에 혈청 중의 CXCL2, VEGFA의 측정 결과로 작성한 ROC 곡선을 나타낸다. 이 ROC 곡선을 이용한 분석에서 AUC는 혈청 중의 CXCL2의 경우 0.860이고, 혈청 중의 VEGFA의 경우 0.755로 양호한 결과였다(표 2).
| AUC | |
| CXCL2 | 0.860 |
| VEGFA | 0.755 |
(사용 예 1)
표재성 식도암의 치료 방침의 결정에 대해 사용 예를 2례 제시한다. 우선, 혈청 중의 CXCL2의 단백질 발현량을 단독으로 사용하였다. 구체적으로는, 도 3에 나타낸 ROC 곡선을 이용하여 CXCL2≥390pg/ml를 수술 적응증 병변의 컷오프 값으로 하였다. 이때, 모든 증례 중에서 4례가 수술 적응증으로 분류되고, 21례가 내시경 치료 적응증으로 분류되었다(도 4).
실제로는 모든 증례 25례 중에서 5례가 수술 적응증 병변이고, 20례가 내시경 치료 적응증 병변이기 때문에 수술 적응증을 「양성」, 내시경 치료 적응증을 「음성」으로 한 경우, 사용 예 1에서 감도는 60%이고, 특이도는 95%이며, 정진율은 88%였다(표 3).
| 혈청 중의 CXCL2 단독 | |||
| 양성 | 음성 | 합계 | |
| 수술 적응증 | 3 | 2 | 5 |
| 내시경 치료 적응증 | 1 | 19 | 20 |
| 합계 | 4 | 21 | 25 |
(사용 예 2)
다음으로, 혈청 중의 CXCL2의 단백질 발현량과 VEGFA의 단백질 발현량을 병용했다. 사용 예 2에서는 CXCL2≥390pg/ml를 「수술 적응증」(양성)으로 하고, 또한 CXCL2＜390pg/ml라도 VEGFA≥160pg/ml를 만족한 경우도 「수술 적응증」(양성)으로 했다. 한편, CXCL2<390pg/ml이면서 VEGFA<160pg/ml를 만족한 경우는 「내시경 치료 적응증」(음성)으로 했다(도 5). 사용 예 2에서 감도는 80%이고, 특이도는 90%이며, 정진율은 88%였다(표 4).
| 혈청 중의 CXCL2 + 혈청 중의 VEGFA의의 병용 | |||
| 양성 | 음성 | 합계 | |
| 수술 적응증 | 3+1 | 1 | 5 |
| 내시경 치료 적응증 | 1+1 | 18 | 20 |
| 합계 | 6 | 19 | 25 |
사용 예 1, 2 모두에서 기존의 내시경 진단과 같은 형태학 진단보다 높은 정진율을 나타냈다. 향후, 기존의 내시경 진단, 형태학 진단에 추가로 본 발명의 방법을 병용함으로써 정진율의 추가 향상이 기대된다.
또한, 사용 예 1 또는 사용 예 2에서는 CXCL2≥390pg/ml, VEGFA≥160pg/ml를 수술 적응증 병변의 컷오프 값으로 했지만, 이 컷오프 값, 즉, 기준치는 적절히 변경할 수 있다. 특히, 원하는 감도, 특이도, 정진율에 따라 각각 임의로 변경하여 설정할 수 있다.
<RNA 발현량 분석>
모든 증례 25예에서 채취한 생검 종양 조직에서 RNA를 추출하고, RT-PCR로 종양 조직 내의 CXCL2와 VEGFA의 발현을 분석하였다. RNA 발현량은 PCR의 사이클 수의 컷오프 값의 차이(내인성 인자와의 차이)에 기초하여 산출하였다. 그 결과, 종양 조직 중의 CXCL2 및 VEGFA의 RNA 발현은 내시경 치료 적응증 병변과 비교하여 수술 적응증 병변에서 유의미하게 높게 발현하였다(도 6, 7).
이 결과는, 조기 식도암 중에서도 암세포가 점막하층에 침윤하거나 맥관에 침윤하거나 또는 림프절 전이를 일으킬 수 있는 침윤능이 높은 표재성 식도암에서는 CXCL2 및 VEGFA 의 발현이 상승하고, 발현량이 향상된 CXCL2 및 VEGFA의 단백질이 혈액 중에 분비되어 있다는 것을 시사한다.
이상에서 설명한 바와 같이, CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하는 본 발명에서는, 표재성 식도암의 진행도, 특히, 암세포가 식도의 맥관에 침윤하였는지 또는 암세포가 식도의 점막하층에 침윤하였는지 아닌지를 예측할 수 있으며, 내시경 치료 적응증으로 할 것인지 외과 수술 적응증으로 할 것인지의 판단 및 진단을 보조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 식도암의 내시경 치료 적응증의 정진율이 높으며, 내시경 치료 적응증의 여부를 간편하면서도 객관적으로 판단할 수 있는 범용적인 기술을 제공할 수 있다.
1: 암세포가 침윤하지 않은 맥관
2: 암세포가 침윤한 맥관
3: 맥관에 침윤한 암세포
3: 맥관에 침윤한 암세포
Claims (14)
- 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하는 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하는 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증을 판단하기 위해 데이터를 수집하는 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증을 진단하기 위한 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증의 검사 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단을 보조하기 위한 인비트로 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증의 진단 방법으로,
피검체에서 채취한 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 기준치와 비교하는 방법. - 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 중의 CXCL2 및 VEGFA 모두의 발현량을 측정하는 방법. - 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈청, 혈청 엑소좀 및 종양 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 방법. - 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서,
식도암이 식도의 맥관 또는 점막하층에 침윤하였는지 아닌지의 판단을 보조하는 방법. - 식도암의 내시경 치료 적응증의 판단에 사용하는 진단 키트로,
샘플 중의 CXCL2의 발현량 및 샘플 중의 VEGFA의 발현량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 측정하는 시약 키트를 구비하는 진단 키트. - 식도암을 치료하는 방법으로,
제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고,
식도암이 식도의 맥관에 침윤하지 않았다고 예측한 경우, 내시경 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법. - 식도암을 치료하는 방법으로,
제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고,
식도암이 점막하층에 침윤하지 않았다고 예측한 경우, 내시경 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법. - 식도암을 치료하는 방법으로,
제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 피검체의 식도암의 침윤 깊이를 판단하고,
식도암이 식도의 맥관에 침윤하였거나 또는 식도암이 점막하층에 침윤하였다고 예측한 경우, 외과적 치료를 선택하는 식도암의 치료 방법.
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