KR20230088833A - T-세포 수용체 식별을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 항원-반응성 T-세포 수용체(TCR)를 식별하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 대상체(예를 들어, 암 환자)로부터 유래된 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주는 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 TCR을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.

Description

T-세포 수용체 식별을 위한 조성물 및 방법
상호 참조
본 출원은 2020년 10월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/104,624호 및 2020년 12월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/128,274호의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
T-세포 수용체(TCR)는 항원-주요 조직적합성 복합체의 인식을 담당하여 염증 반응의 개시를 야기한다. 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포를 포함한 많은 T 세포 하위집합(subset)이 존재한다. 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포라고도 알려져 있음)는 비정상적인 세포, 예를 들어 바이러스-감염 세포 또는 종양 세포를 사멸한다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포라고도 알려져 있음)는 다른 면역 세포의 활성화 및 성숙을 돕는다. 세포독성 및 헬퍼 T 세포는 각각의 반응을 촉발하는 특정 표적 항원을 인식한 후 그들의 기능을 수행한다. T 세포의 항원 특이성은 T 세포 표면에서 발현되는 TCR에 의해 정의될 수 있다. T 세포 수용체는 2개의 폴리펩타이드 사슬, 가장 일반적으로 알파 및 베타 사슬로 구성된 이종이량체 단백질이지만, 소수의 T 세포는 감마 및 델타 사슬을 발현할 수 있다. TCR의 특정 아미노산 서열 및 결과적으로 생성되는 3차원 구조는 TCR 항원 특이성 및 친화도를 정의한다. 임의의 개별 T 세포에 대한 TCR 사슬의 아미노산 및 암호 DNA 서열은 가능한 TCR 서열이 엄청나게 많기 때문에 유기체의 전체 TCR 레퍼토리 중에서 거의 항상 고유하거나 풍부도가 매우 낮다. 이러한 큰 서열 다양성은 많은 세포 메커니즘을 통해 T 세포 발달 동안 달성되며 매우 다양한 잠재적 항원에 반응하는 면역계 능력의 중요한 측면일 수 있다.
TCR 레퍼토리를 분석하는 것은 면역 시스템 특징 및 질환, 특히 항원 촉발인자가 알려져 있지 않은 질환의 병인 및 진행을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
요약
항원-반응성 T-세포 수용체(TCR) 또는 T 세포를 스크리닝하거나 평가하기에 효율적인 방식을 개발할 필요성은 본원에서 인식된다. 조성물 및 방법은 대상체의 원발성 종양 샘플이 충분한 품질 및/또는 양으로 확실하게 수득될 수 없는 경우를 포함한 다양한 상황에서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 비침습적일 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 일부 측면에서 항원-반응성 TCR 또는 항원-반응성 T 세포 식별을 위해 암 세포주를 사용한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법을 제공하며, 이는 (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유도된 MHC 분자인 단계; (b) 암 세포주를 제1 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 복수의 TCR-발현 세포 또는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 것인, 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 접촉한 후, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별함으로써, 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (c)에서 식별하는 단계는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축시키거나 선택하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 암 세포주에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a)에서 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원을 발현하는 비-암 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 외인성 MHC 분자는 동일한 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (b)에서 비-암 세포를 제2 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 비-암세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, 추가 내인성 항원은 암 세포주에 의해 발현된 내인성 항원과 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 비-암 세포는 (i) 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 발현하지 않거나, (ii) 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 더 낮은 수준으로 발현하거나, (iii) 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 발현하지만, 암 세포주에 의해 발현된 내인성 항원을 제시하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 샘플로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 제1 복수 또는 제2 복수의 TCR-발현 세포는 상이한 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (c)에서 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 식별은 마커에 기초하여 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것은 마커에 기초한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되지만 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서는 발현되지 않는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 세포의 TCR 및 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원에 의해 활성화되지 않는 제2 복수의 TCR-발현 세포 내의 세포에 있는 것을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-암 세포는 줄기 세포 또는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 실시양태에서, 비-암 세포는 분화된 iPSC이다. 일부 실시양태에서, 비-암 세포는 자가면역 조절자(AIRE)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포주 또는 비-암 세포의 내인성 MHC 분자는 불활성화된다(예를 들어, 녹다운 또는 녹아웃). 일부 실시양태에서, 암 세포주 또는 비-암 세포는 내인성 MHC 분자에 대해 결손(null)이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주 또는 비-암 세포는 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손이다. 일부 실시양태에서, 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 유전자는 CIITA이다.
일부 실시양태에서, 암 세포주 또는 비-암 세포의 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)이다. 일부 실시양태에서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 대상체로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 제1 복수의 TCR-발현 세포는 1차 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 T 세포는 종양-침윤 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 1차 T 세포는 말초 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 말초 T 세포는 종양-경험이 있는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 말초 T 세포는 PD-1+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 1차 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 1차 T 세포는 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 제1 복수의 TCR-발현 세포는 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 외인성 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 외인성 TCR은 동일한 대상체로부터 단리된 1차 T 세포로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 이전에 대상체로부터 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 및 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하여 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포 또는 종양 샘플과 닮은 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 암 세포주를 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 세포주와 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경의 상관 계수는 약 0.1 이상이다.
일부 실시양태에서, 방법은 (c)에서 하위집합의 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR의 서열을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR의 서열을 식별하는 단계는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR의 서열을 식별하는 단계는 암 세포주와 접촉하기 전에 제1 복수의 TCR-발현 세포의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하위집합에서 항원-반응성 세포에 의해 발현되는 TCR의 빈도는 제1 복수에서 항원-반응성 세포에 의해 발현되는 TCR의 빈도보다 높다.
일부 실시양태에서, 방법은 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR은 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암 세포주인 세포는 적어도 약 50, 100, 1,000개 이상의 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (b) 이전에 암 세포주를 사멸시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 사멸은 화학적 화합물로 암 세포주를 처리하거나 방사선조사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 화합물은 세포독성 화합물이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 화합물은 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 다카바진, 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨이린, 아자티오프라임, 프로카르바진, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 다우노마이신, 또는 이들의 임의의 조합이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법을 제공하며, 이는 (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 발현하는 암 세포주를 제공하는 단계로서, 외인성 MHC 분자가 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자인 단계; (b) 암 세포주를 동일한 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현하는 복수의 조작된 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 조작된 세포의 하위집합은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 항원에 의해 활성화되는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 접촉한 후, 복수의 조작된 세포의 하위집합을 식별하여, 항원-반응성 세포를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 암 세포주에 대해 내인성이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 외인성 항원을 발현하지 않거나 외인성 항원을 제시하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 동일한 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포를 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR은 복수의 조작된 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주의 내인성 MHC 분자는 불활성화된다(예를 들어, 녹다운 또는 녹아웃). 일부 실시양태에서, 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 유전자는 CIITA이다.
일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)이다. 일부 실시양태에서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 TCR은 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR은 동일한 대상체로부터 단리된 1차 세포에서 유래된다. 일부 실시양태에서, 1차 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 종양-침윤 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 말초 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 말초 T 세포는 종양-경험이 있는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 말초 T 세포는 PD-1+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, (c)에서 식별하는 단계는 복수의 조작된 세포의 하위집합을 농축하거나 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, (c)에서 식별하는 단계는 마커에 기초하여 복수의 조작된 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택하는 것은 마커에 기초하여 FACS 또는 MACS를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 리포터 단백질이다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 형광 단백질이다.
일부 실시양태에서, 마커는 세포 표면 단백질, 세포내 단백질 또는 분비 단백질이다. 일부 실시양태에서, 마커는 세포내 단백질 또는 분비 단백질이고, 여기서 방법은 선택하기 전에 복수의 조작된 세포를 고정 및/또는 투과화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 조작된 세포를 골지 차단제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 분비 단백질은 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질은 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 방법은 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR을 식별하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR을 식별하는 것은 복수의 조작된 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 이전에 대상체로부터 원발성 암 세포를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포를 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 암 세포주를 식별하기 위해 원발성 암 세포 및 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항원-반응성 세포 또는 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하기 위한 조성물을 제공하며, 이는 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주이고, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자인 세포; 및 대상체로부터 유래된 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는 T 세포를 포함하고, 여기서 암 세포주의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 교대(alternation)는 대상체로부터의 암 세포와 닮는다.
일부 실시양태에서, 암 세포주와 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경의 상관 계수는 약 0.1 이상이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 외인성 항원을 포함하거나 제시하지 않는다. 일부 실시양태에서, 암 세포주의 내인성 MHC 분자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 내인성 MHC 분자에 대해 결손이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손이다. 일부 실시양태에서, 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 유전자는 CIITA이다. 일부 실시양태에서, 암 세포주의 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)이다. 일부 실시양태에서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 복수의 T 세포이며, 각각 대상체로부터 유래된 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 복수의 T 세포는 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가하는 방법을 제공하며, 이는 (a) 복수의 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 복수의 세포는 암 세포주로부터 유래되고, 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하고, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인, 단계; (b) 복수의 세포를 동일한 대상체로부터 유래된 복수의 TCR을 발현하는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 TCR 또는 이의 분획은 복수의 세포 또는 이의 분획의 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는, 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 접촉시킨 후, (i) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획, (ii) 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획, 및/또는 (iii) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 분비되는 사이토카인을 정량하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포의 내인성 MHC 분자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포는 내인성 MHC 분자에 대해 결손이다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포는 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손이다. 일부 실시양태에서, 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포의 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)이다. 일부 실시양태에서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 대상체로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포는 1차 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포는 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 외인성 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, (i) 또는 (ii)의 분획을 정량화하는 것은 유세포 분석 기반 방법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유세포 분석 기반 방법은 FACS 또는 MACS이다. 일부 실시양태에서, (i)의 분획을 정량화하는 것은 분획으로부터 방출된 젖산 탈수소효소의 양을 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 동일한 암 유형으로부터 유래된 MHC-조작된 암 세포주의 패널을 포함하는 조성물을 제공하며, 이는 하기를 포함한다: 동일한 제1 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제1 하위 패널; 및 동일한 제2 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제2 하위 패널을 포함하고; 여기서 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현한다.
일부 실시양태에서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 동일한 외인성 및/또는 내인성 MHC 분자를 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하고, 각각의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 제1 부모 암 세포주 및 제2 부모 암 세포주는 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 내인성 MHC 분자는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 복수의 T 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널에서 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 각각의 암 세포주는 복수의 T 세포와 혼합된다. 일부 실시양태에서, 복수의 T 세포는 적어도 2개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 천연적으로 쌍을 이룬 TCR은 동일한 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, MHC-조작된 암 세포주의 패널은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 두경부암, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 연조직 육종 또는 위암으로부터 유래된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에 의해 발현된 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 항원-제시 세포(APC)를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인 단계; (b) APC를 대상체로부터 유래된 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 TCR-발현 세포 또는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 APC의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하고, 여기서 복수의 TCR-발현 세포 또는 외인성 항원을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 (i) APC로부터 분비된 표지 또는 내인성 항원을 인식 시, APC와 연관된 표지-전달 효소에 의해 전달되는 표지에 부착하거나, 또는 (ii) 내인성 항원을 인식 시 활성화 마커를 발현하는, 단계; 및 (c) 표지 또는 활성화 마커에 기초하여 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하여 항원-반응성 세포를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 식별하는 단계는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, APC는 적어도 약 100개의 내인성 항원을 발현한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 TCR-발현 세포에서 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획 또는 하위집합 중 TCR-발현 세포의 수에 기초하여 대상체에게 암 약물을 투여할지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 수를 정량화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단계 (b)에서 접촉하기 전에 복수의 TCR-발현 세포의 수를 정량화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 TCR-발현 세포에서 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하위집합 중 TCR-발현 세포의 분획 또는 수에 기초하여 암 약물을 대상체에게 투여할지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분획에 기초하여 암 약물을 사용한 치료에 적합한 것으로 결정된 대상체에게 암 약물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분획에 기초하여 암 약물을 사용한 치료에 부적합한 것으로 결정된 대상체에게 암 약물을 투여하지 않는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에 대한 암 약물의 용량을 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에 대한 암 약물의 용량을 감소시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 약물은 면역 세포 조절자이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 조절자는 사이토카인 또는 면역 관문 저해제이다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 TCR 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현을 위한 수혜자 세포로 전달하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 수혜자 세포는 전달 전에 TCR 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 수혜자 세포의 내인성 TCR은 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 수혜자 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 자가 T 세포 또는 동종 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 방법은 수혜자 세포 또는 이의 유도체를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 적어도 2개의 상이한 TCR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 상이한 TCR의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 상이한 TCR을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현을 위해 복수의 수혜자 세포로 전달하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 수혜자 세포를 APC 또는 추가 APC와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 수혜자 세포로부터 수혜자 세포를 농축시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 수혜자 세포는 APC 또는 추가 APC를 인식한다. 일부 실시양태에서, 표지는 검출가능한 모이어티를 포함하며, 검출가능한 모이어티는 유세포 분석에 의해 검출가능하다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 비오틴, 형광 염료, 펩타이드, 디곡시제닌 또는 접합 핸들이다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 아지드, 알킨, DBCO, 테트라진 또는 TCO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지는 표지-전달 효소에 의해 인식되는 기질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지는 APC에 의해 분비되는 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 표지-전달 효소는 트랜스펩티다제 또는 글리코실트랜스퍼라제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스펩티다제는 소르타아제이다. 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라제이다. 일부 실시양태에서, 표지-전달 효소는 APC에 의해 발현되거나 외부에서 공급되어 APC에 부착된다. 일부 실시양태에서, 표지-전달 효소는 막관통 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표지-전달 효소는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 APC에 부착된다. 일부 실시양태에서, APC는 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, APC는 암 세포주이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 암 세포주는 대상체의 암과 동일한 암 유형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 종양-침윤 T 세포 또는 말초 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 LAG3, CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3 또는 이들의 임의의 조합을 발현한다. 일부 실시양태에서, 복수의 TCR-발현 세포는 표지-수용 모이어티를 포함하고, 표지-수용 모이어티는 표지를 수용한다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 한, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 내용을 대체 및/또는 우선한다.
본 발명의 새로운 특징은 특히 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 기재한 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면(또한, 본원에서 "도(Figure)", "도(Fig.)" 및 "도(FIGURE)")을 참고로 하여 수득될 것이다.
도 1은 개인화된 T 세포 요법에서 본원에 기술된 MHC-개인화된 세포주를 사용하는 예를 도시한다.
도 2a-2f는 복수의 외인성 MHC 대립유전자가 세포주에서 공동-발현될 수 있고 충분한 발현 수준 및 세포내 발현된 항원을 제시하기에 충분한 능력을 달성할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 도 2a는 하나의 외인성 HLA 및 HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 직렬(tandem) 미니유전자(TMG)의 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 2b는 3개의 외인성 HLA 및 HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 TMG의 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 2c는 6개의 외인성 HLA 및 HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 TMG의 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 2d는 하나의 외인성 HLA 및 무관한 에피토프를 암호화하는 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 2e는 3개의 외인성 HLA 및 무관한 에피토프를 암호화하는 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 2f는 6개의 외인성 HLA 및 무관한 에피토프를 암호화하는 mRNA를 포함하는 K562 세포와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다.
도 3a-3f는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 MHC-결손 세포에서 농축되게 발현되고 세포 표면으로 수송될 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 도 3a는 외인성 HLA 없이 K562 세포에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다. 도 3b는 외인성 MHC 대립유전자 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA를 포함하는 K562 세포에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다. 도 3c는 외인성 HLA 없이 B2M 녹아웃된 K562 세포(K562-B2MKO)에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다. 도 3d는 외인성 HLA-A*02:01을 발현하는 K562-B2MKO 세포에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다. 도 3e는 B2M-HLA-A*02:01 융합체를 발현하는 K562-B2MKO 세포에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다. 도 3f는 B2M-HLA-C*08:02 융합체를 발현하는 K562-B2MKO 세포에서 MHC-I-알파의 표면 발현을 검출하는 데이터를 보여준다.
도 4a-4k는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 MHC-결손 세포에서 세포내 발현된 항원을 효율적으로 제시할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. T 세포는 3개의 상이한 MHC-조작된 세포주와 공동배양된 후 FACS로 분석했다. 도 4a는 외인성 항원의 부재 하에 K562/A*02:01 세포와 함께 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4b는 외인성 항원의 부재 하에 K562-B2MKO/A*02:01 세포와 함께 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4c는 외인성 항원의 부재 하에 K562-B2MKO/B2M-A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4d는 항원의 존재 하에 K562/A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4e는 항원의 존재 하에 K562-B2MKO/A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4f는 항원의 존재 하에 K562-B2MKO/B2M-A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4g는 TMG로부터 항원을 발현하는 K562/A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4h는 TMG로부터의 항원을 발현하는 K562-B2MKO/A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4i는 TMG로부터 항원을 발현하는 K562-B2MKO/B2M-A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4j는 공동배양 없이 T 세포에 대한 데이터를 보여준다. 도 4k는 K562-B2MKO/Ag-B2M-A*02:01 세포와 공동배양된 후 T 세포에 대한 데이터를 보여준다.
도 5a-5f는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 암 세포에서 내인성 항원을 효율적으로 제시할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 도 5a는 임의의 외인성 MHC를 발현함이 없이 PANC1 세포주와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 5b는 외인성 C*08:02를 발현하는 PANC1 세포주와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 5c는 외인성 B2M-C*08:02 융합체를 발현하는 PANC1 세포주와 공동배양된 후 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 5d는 임의의 외인성 MHC를 발현함이 없이 AsPC1 세포주와 공동배양된 후 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 5e는 외인성 C*08:02를 발현하는 AsPC1 세포주와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다. 도 5f는 외인성 B2M-C*08:02 융합체를 발현하는 AsPC1 세포주와 공동배양된 후의 T 세포의 데이터를 보여준다.
도 6a는 MALME3M 암 세포주에서 외인성 HLA 대립유전자의 표면 발현의 동역학을 보여주는 실험 데이터를 도시한다.
도 6b는 HMBC 암 세포주에서 외인성 HLA 대립유전자의 표면 발현의 동역학을 보여주는 실험 데이터를 도시한다.
도 7은 합성 라이브러리 및 암 세포주를 사용한 TCR 식별의 예시적인 워크플로우를 도시한다.
도 8은 HLA-A02:01 양성(HLA-A02:01+) 암 세포주에서 HLA-A02:01의 검출을 도시한다.
도 9는 HLA-A02:01 음성 또는 양성 암 세포주와 공동배양된 조작된 T 세포의 4가지 상이한 공동배양물로부터의 유세포분석 플롯을 도시한 것으로, 여기서 전시된 세포는 "사전" 및 "사후" CD137에 의해 염색된 살아있는 합성 TCR-T 세포이다.
도 10a는 다른 미지의 TCR과 함께 모델 TCR이 HMCB-TMG와의 양성 대조군 공동배양물에서는 농축되었지만, HLA-A02:01 음성 세포주 SKMEL에서는 농축되지 않았음을 보여주는 FACS 데이터의 볼케이노 플롯을 도시한다.
도 10b는 다른 미지의 TCR과 함께 모델 TCR이 HMCB-TMG와의 양성 대조군 공동배양물에서는 농축되었지만 HLA-A02:01 음성 세포주 SKMEL에서는 농축되지 않았음을 보여주는 MACS 데이터의 볼케이노 플롯을 도시한다.
도 11a는 세포에서 식별된 TCR의 발현을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. CD3의 가장 높은 회수율은 전기천공(EP) 후 48시간 후에 관찰되었으며, 이는 TCR 발현을 나타낸다.
도 11b는 식별된 TCR을 발현하는 이중 녹아웃 세포(내인성 TRAC 및 TRBC가 녹아웃됨)가 HLA-A02:01 양성 또는 음성 암 세포주와 공동배양되었고 활성화된 세포 집단의 백분율이 CD137 상향조절에 의해 결정되었음을 도시한다.
도 12는 APC와 함께 공동배양된 식별된 TCR을 사용한 사멸 검정의 결과를 보여주는 실험 데이터를 도시한 것이며, 여기서 APC는 알려진 항원(MUT) 또는 다른 항원(WT)을 함유하는 직렬 미니유전자(TMG)를 발현하는 HLA-A02:01 양성이다.
도 13a는 환자의 제한 HLA를 발현하는 부모 세포주에 대한 반응으로 초기 활성화 마커 CD137만의 상향조절을 보여주는 실험 데이터를 도시한다.
도 13b는 젖산 탈수소효소(LDH) 검정에 의해 모니터링된 세포 용해의 실험 데이터를 도시한다.
도 13c는 공동배양 검정의 실험 데이터를 도시하며, 여기서 아폽토시스는 Caspase-Glo® 3/7 검정에 의해 모니터링되었다.
도 13d는 활성화된 T 세포로부터의 사이토카인 방출이 측정된 공동배양 검정의 실험 데이터를 도시한 것이다.
도 14는 배수 농축(선택전 빈도와 비교하여) 및 P 값의 함수로서 개별 TCR 서열에 대한 볼케이노 플롯을 도시한다.
본 개시내용에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 또한, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 제한하려는 의도가 없다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 분야의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 기술되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"은 추정되어야 한다.
용어 "농축시키는", "단리하는", "분리하는", "분류하는", "정제하는", "선택하는" 또는 이들의 등가어는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 샘플로부터 주어진 특성을 갖는 하위샘플을 수득하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 농축시키는은 특정 세포 표현형을 갖는, 예를 들어, 해당 세포 표현형을 특징으로 하는 특정 세포 마커를 발현하거나 또는 특정 세포 마커 유전자를 발현하지 않는, 원하는 세포 계통 또는 원하는 세포를 적어도 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 함유하는 세포 집단 또는 세포 샘플을 수득하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암 세포주"는 암 또는 종양 세포로부터 유래된 불멸화된 세포주를 지칭한다. 암 세포주는 실험실 조건에서 시간이 지남에 따라 지속적으로 분열하고 성장하는 불멸 세포를 포함할 수 있다. 불멸화된 세포주는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50회 또는 그 이상의 세대 동안 배양될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 될 수 있는 포유동물과 같은 유기체를 지칭한다. 대상체는 개체, 숙주 또는 환자(예: 암 환자)일 수 있다. 대상체의 예로는 말, 소, 낙타, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 래트, 마우스(예: 인간화된 마우스), 게르빌루스쥐, 비인간 영장류(예: 마카크원숭이), 인간 등, 비포유류, 예를 들어 비포유류 척추동물, 예를 들어 새(예를 들어, 닭 또는 오리), 어류(예를 들어, 상어) 또는 개구리, 및 비포유류 무척추동물, 뿐만 아니라, 이의 트랜스제닉 종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에 대상체는 단일 유기체(예: 인간)일 수 있다. 대상체는 종양이 있는 인간일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 연구할 공통 면역 인자 및/또는 질환을 갖는 소규모 코호트 및/또는 질환이 없는 개체 코호트(예를 들어, 음성/정상 대조군)를 포함하는 개체 그룹일 수 있다. 샘플이 수득되는 대상체는 병태(예: 질환, 장애, 알레르기, 감염, 암 또는 자가면역 장애 등)를 가질 수 있으며 병태가 없는 음성 대조군 대상체에 대해 비교될 수 있다.
분자 또는 세포의 정황에서 사용되는 용어 "유래된"은 대상체 또는 샘플로부터 수득되거나 비롯되는 분자 또는 세포를 지칭한다. 대상체 또는 샘플로부터 유래된 분자는 대상체 또는 샘플로부터 단리된 분자일 수 있다. 대상체 또는 샘플로부터 유래된 분자는 대상체 또는 샘플에 함유된(예: 발현된) 또는 대상체 또는 샘플로부터 수득된 기준 분자의 카피(copy) 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 대상체 또는 샘플로부터 유래된 폴리펩타이드 분자 또는 폴리뉴클레오타이드 분자는 대상체 또는 샘플에서 발현된 기준 분자의 카피(예를 들어, 증폭된 카피, 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 카피)일 수 있다. 폴리펩타이드 분자 또는 폴리뉴클레오타이드 분자는 대상체 또는 샘플로부터의 기준 분자와 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 대상체 또는 샘플로부터 유래된 세포는 대상체 또는 샘플로부터 단리된 세포일 수 있다. 대상체 또는 샘플로부터 유래된 세포는 대상체 또는 샘플에 함유되거나 대상체 또는 샘플로부터 수득되는 기준 세포의 카피 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 개체 또는 샘플로부터 유래되는 세포는 확장 또는 분열 동안 대상체 또는 샘플로부터의 기준 세포의 자손 세포일 수 있다. 대상체 또는 샘플로부터 유래된 세포는 대상체 또는 샘플로부터의 기준 세포와 상이한 유전자 프로파일(예: 게놈 또는 전사체 프로파일) 또는 표현형 프로파일을 가질 수 있도록 조작되거나 처리되었을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성"은 이들 자신의 천연 공급원이 아닌 세포 또는 유기체에 존재하는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 암 세포주는 HLA-A*02:01 및/또는 HLA*11:01을 발현할 수 있지만 HLA*A24:02는 발현하지 않는다. HLA*A24:02를 암호화하는 핵산 서열이 암 세포주에 도입되는 경우, HLA*A24:02 또는 이를 암호화하는 핵산 서열은 암 세포주에 외인성이라고 할 수 있다. 반면에 "내인성"이라는 용어는 세포 또는 유기체에 고유한 물질을 지칭한다. 이 예에서 HLA-A*02:01 및/또는 HLA*11:01은 암 세포주에 대해 내인성이라고 지칭할 수 있다.
"외인성으로 발현되는" 또는 "외인성으로 발현된"이라는 용어는 숙주 세포에 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 숙주 세포로부터 유래되거나 비롯되지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열)로부터의 폴리펩타이드의 발현을 지칭한다. 외인성 단백질은 숙주 세포로부터 유래되거나 비롯되지 않는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되는 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동족 쌍"은 개별 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래되는 2개의 핵산 분자 또는 2개의 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질의 원래 또는 천연 쌍을 지칭한다. 동족 쌍은 개별 세포 내의 천연적으로 쌍을 이룬 사슬일 수 있다. 예를 들어, T-세포 수용체(TCR)의 동족 쌍은 개별 세포 내에서 또는 개별 세포로부터 유래된 천연적으로 쌍을 이룬 TCR 알파 및 베타 사슬일 수 있다. 또 다른 예에서, T-세포 수용체(TCR)의 동족 쌍은 개별 세포 내에서 또는 개별 세포로부터 유래된 천연적으로 쌍을 이룬 TCR 감마 및 델타 사슬일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종양-경험이 있는"은 종양 세포 또는 이의 유도체, 종양 세포의 자손 또는 종양 항원과 접촉하거나 이에 노출되는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 종양-경험이 있는 T 세포는 종양 세포 또는 종양 항원에 노출되었을 수 있다. 일부 경우에, 종양-경험이 있는 T 세포는 PD-1high 세포일 수 있다.
개요
종양-연관 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)은 원발성 종양뿐만 아니라, 동일하거나 심지어 상이한 기관/조직 기원의 암 세포주에서도 발현될 수 있다. 예를 들어, 주어진 폐 환자의 종양에서 발현되는 일부 TAA는 많은 다른 것들 중에서 NCI-H1734, HCC2935, NCI-H3255, HCC4006 및 RERFLCAD1과 같은 일부 폐암 세포주에서도 발현될 수 있다. 항원-반응성 T 세포는 원발성 종양 샘플을 사용하여 스크리닝할 수 있지만, 대부분의 경우 원발성 종양 샘플은 충분한 품질 및/또는 양으로 믿을만하게 수득될 수 없다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 항원-반응성(예를 들어, 종양-반응성) T 세포 수용체(TCR)를 식별하기 위해 암 세포주를 사용하고, 이는 항원-반응성 T 세포를 스크리닝하기 위해 원발성 종양 샘플을 사용하는 것으로 한계를 극복한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법은 종양 샘플이 환자로부터 수득될 필요가 없으므로 비침습적일 수 있다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법은 암과 같은 질환을 앓는 대상체를 위한 개별화된 면역요법을 공식화하기 위해 사용될 수 있다.
그러나, 암 세포주는 환자보다 상이한 세트의 MHC 분자를 발현할 수 있다. 일부 경우에, 환자의 자가 수지상 세포(DC, 예컨대, 단핵구 유래 DC 또는 MoDC, MDDC)는 자가 DC가 환자의 MHC 분자를 발현하므로, 암 세포주로 공급될 수 있다. 암 세포주로 공급된 자가 DC는 자가 암 세포로 공급된 자가 DC의 대안으로서 사용될 수 있다. 암 세포주 또는 자가 암 세포는 맨 먼저 사멸되거나 용해될 수 있다(예를 들어, 방사선조사, 동결-해동 주기 및/또는 미토마이신 C 및 차아염소산과 같은 화학물질에 의해). 그러나 충분한 양의 자가 DC는 이용 가능하지 않을 수 있으며, 암 세포주에서 발현되는 TAA/TSA는 특정 조건에서 자가 DC에 의해 충분히 제시되지 않을 수 있다. 일부 다른 경우에, 암 세포주는 암 세포주에서 환자의 MHC(들)를 외인성으로 발현시킴으로써 조작(또는 개인화 또는 MHC-개인화)될 수 있다. 선택적으로, 암 세포주의 내인성 MHC(들)의 발현은 동종반응성으로 인한 T 세포 또는 TCR 활성화의 기회를 감소시키기 위해 없어질 수 있다.
도 1은 개인화된 T 세포 요법에서 본원에 기술된 MHC-개인화된 세포주를 사용하는 예를 보여준다. 하나 이상의 정보는 대상체(101)(예: 치료가 필요한 암 환자)로부터 수득할 수 있다. 종양 샘플(102)은 대상체(101)로부터 수득할 수 있다. T 세포(103)는 또한 대상체(101)로부터도 수득할 수 있다. 대상체(101)에 의해 운반되는 HLA 대립유전자(104)도 결정될 수 있다. 종양 샘플(102)과 유사한 유전자 발현 프로파일을 가질 수 있는 암 세포주(105)가 선택되거나 식별될 수 있다. 암 세포주(105)의 내인성 MHC 분자(106)는 암 세포주(107)의 MHC-결손 버전을 만들기 위해 불활성화될 수 있다. MHC-결손 암 세포주(107)는 외인성 MHC 분자(109)를 발현하도록 조작되어 MHC-조작된 암 세포주(108)를 생성할 수 있다. 이러한 외인성 MHC 분자를 암호화하는 유전자는 HLA 대립유전자(104)에 기초하여 선택할 수 있고, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 암 세포주(107)로 전달할 수 있다. TCR-발현 세포(111)는 TCR 식별을 위해 MHC-조작된 암 세포주(108)와 혼합(예를 들어, (110)에서 공동배양)될 수 있다. TCR-발현 세포(111)에서 TCR은 대상체(101)의 T 세포(103)에 있는 TCR과 중첩되거나 그로부터 유래될 수 있다.
대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하기 위해 본원에 제공된 예시적인 방법은 (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자인 단계; (b) 암 세포주를 제1 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 복수의 TCR-발현 세포 또는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 접촉한 후, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축시켜 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 관련 조성물도 본원에 제공된다.
조성물 및 방법은 또한 TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가하는 방법은 (a) 복수의 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 복수의 세포는 암 세포주로부터 유래되고 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하며, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인 것인, 단계; (b) 복수의 세포를 동일한 대상체로부터 유래되는 복수의 TCR을 발현하는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 TCR 또는 이의 분획은 복수의 세포 또는 이의 분획의 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 것인 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 접촉시킨 후, (i) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획, (ii) 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획, 및/또는 (iii) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 분비된 사이토카인을 정량하는 단계를 포함할 수 있다.
T 세포 수용체(TCR)
TCR은 다양한 암 또는 감염 유기체와 연관된 항원(예를 들어, T 세포 에피토프)을 인식하는 T 세포의 능력을 부여하기 위해 사용될 수 있다. TCR은 알파(α) 사슬과 베타(β) 사슬 또는 감마(γ) 사슬과 델타(δ) 사슬 둘 모두로 구성될 수 있다. 이러한 사슬을 구성하는 단백질은 TCR의 엄청난 다양성을 생성하기 위해 고유한 메커니즘을 사용하는 DNA에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 다중-서브유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합할 수 있고 항원 제시 세포(APC) 표면에서 MHC 클래스 I 및 II 단백질에 의해 제시된 펩타이드에 결합할 수 있다. APC 상의 항원성 펩타이드에 대한 TCR의 결합은 T-세포 활성화의 중심 이벤트일 수 있고, 이는 T 세포와 APC 사이의 접촉점의 면역학적 시냅스에서 일어난다.
TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 조건에서 T 세포 에피토프를 인식할 수 있다. MHC 클래스 I 단백질은 고등 척추동물의 모든 유핵 세포에서 발현될 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 12-kDa 경쇄 베타-2-마이크로글로불린(또는 β-2-마이크로글로불린 또는 B2M)과 비공유-회합된 46-kDa 중쇄로 구성된 이종이량체이다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA) 복합체라고도 한다. 인간에서, 예를 들어, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 및 HLA-Cw8과 같은 여러 MHC 대립유전자가 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 대립유전자는 HLA-A2 대립유전자이며, 이는 일부 집단에서 집단의 대략 50%에서 발현된다. 일부 실시양태에서, HLA-A2 대립유전자는 HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 또는 *0207 유전자 산물일 수 있다. 일부 경우에, 상이한 집단 간에 아형의 빈도에는 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, HLA-A2 양성 백인 집단의 95% 초과는 HLA-A*0201인 반면, 중국인 집단에서는 빈도가 대략 23% HLA-A*0201, 45% HLA-A*0207, 8% HLA-A*0206 및 23% HLA-A*0203인 것으로 보고되었다.
일부 실시양태에서, TCR은 MHC 클래스 II 분자의 정황에서 T 세포 에피토프를 인식할 수 있다. MHC 클래스 II 단백질은 APC의 하위집합에서 발현될 수 있다. 인간에서, MHC 클래스 II 대립유전자는, 예를 들어 DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8 및 DPI와 같은 여러 가지가 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1*0101, HLA-DRB*0301, HLA-DRB*0701, HLA-DRB*0401 또는 HLA-DQB1*0201 유전자 산물이다.
TCR 사슬은 가변 도메인(또는 가변 영역) 및 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함할 수 있다. 전체 길이의 불변 도메인/영역은 세포외 부분(본원에서 "세포외 불변 도메인"이라고 함), 힌지 영역, 막관통 영역 및 세포질 꼬리를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 불변 도메인은 전체 길이의 불변 도메인 또는 그의 일부, 예를 들어 세포외 불변 도메인일 수 있다. TCRα 및 δ 사슬의 가변 도메인은 복수의 가변(V) 및 연결(J) 유전자에 의해 암호화되는 반면, TCRβ 및 γ 사슬은 다양성(D) 유전자에 의해 추가로 암호화된다. VDJ 재조합 동안 각 유전자 분절의 1개의 랜덤 대립유전자는 다른 것과 재조합되어 기능적 가변 도메인을 형성한다. 가변 도메인과 불변 유전자 분절의 재조합은 기능적인 TCR 사슬 전사체를 초래할 수 있다. 추가로, 유전자 분절 사이의 접합(junction) 부위에서는 랜덤 뉴클레오타이드가 첨가 및/또는 결실될 수 있다. 이 과정은 강한 조합성(어떤 유전자 영역이 재조합할 것인지에 따라 달라짐) 및 접합부 다양성(어떤 얼마나 많은 뉴클레오타이드가 첨가/결실될 것인지에 따라 달라짐)을 야기할 수 있고, 그 결과 큰 고도 가변성 TCR 레퍼토리를 초래하고, 이는 수많은 항원의 식별을 보장할 수 있다. 추가 다양성은 기능적 TCR을 형성하기 위한 α 및 β 또는 γ 및 δ 사슬의 쌍형성("어셈블리"라고도 함)에 의해 달성될 수 있다. 재조합, 랜덤 삽입, 결실 및 치환을 통해 T 세포 수용체를 암호화하는 작은 유전자 세트는 1015 내지 1020개의 TCR 클론형을 생성할 가능성이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "클론형"은 동일한 면역수용체를 운반하는 면역 세포 집단을 지칭한다. 예를 들어, 클론형은 동일한 TCR을 운반하는 T 세포 집단 또는 동일한 BCR(또는 항체)을 운반하는 B 세포 집단을 지칭한다. 면역수용체 다양성의 정황에서 "다양성"은 집단내 면역수용체(예: TCR, BCR 및 항체) 클론형의 수를 지칭한다. 클론형의 더 높은 다양성은 동족 쌍(예: 천연 쌍) 조합의 더 높은 다양성을 나타낼 수 있다.
각 TCR 사슬은 그 구조에 상보성 결정 영역(CDR1-3)이라고 하는 3개의 초가변 루프를 함유할 수 있다. CDR1 및 2는 V 유전자에 의해 암호화되며 TCR과 MHC 복합체의 상호작용에 기능적일 수 있다. 하지만, CDR3는 V와 J 또는 D와 J 유전자 사이의 접합 영역에 의해 암호화되므로 매우 가변적일 수 있다. CDR3은 펩타이드 항원과 직접 접촉하는 TCR의 영역일 수 있다. CDR3는 T 세포 클론형을 결정하기 위한 관심 영역으로 사용될 수 있다. 개체 또는 샘플의 T 세포에 의한 모든 TCR의 합은 TCR 레퍼토리 또는 TCR 프로파일이라고 한다. TCR 레퍼토리는 질환의 발병 및 진행에 따라 변할 수 있다. 따라서, 암, 자가면역, 염증 및 감염 질환과 같은 상이한 질환 조건에서 면역 레퍼토리 상태를 결정하는 것은 질환 진단 및 예후에 유용할 수 있다.
TCR은 전체 길이의 TCR 뿐만 아니라 이의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편(MHC-펩타이드 결합 단편이라고도 함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 온전한 또는 전체 길이의 TCR이다. 일부 실시양태에서, TCR은 전체 길이의 TCR보다 작지만 MHC 분자에 결합된 특정 항원 펩타이드, 예를 들어 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전체 길이 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, 전체 TCR이 결합하는 에피토프(예: MHC-펩타이드 복합체)에 여전히 결합할 수 있다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 일반적으로 각 사슬이 3개의 상보성 결정 영역을 함유하는 곳과 같이 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한다. 항원 결합 도메인이거나 항원 결합 도메인에 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질이 포함된다.
TCR 식별 방법
본 개시내용은 관심 항원에 반응성인 항원-반응성 세포 또는 TCR(예를 들어, 대상체 유래 TCR)을 식별함으로써 치료적으로 적절한 항원-반응성 세포 또는 TCR의 발견을 가능하게 하는 조성물 및 방법을 제공한다. 식별된 항원-반응성 세포 또는 TCR은 종양 반응성이거나 종양 항원을 인식할 수 있다. 본 개시내용은 또한 TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가 또는 분석하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 암 세포주 또는 TCR-발현 세포는 대상체-특이적 MHC 분자 또는 TCR을 포함(예를 들어, 발현)하여 개인화된 세포-기반 면역치료법의 공식화를 가능하게 한다.
본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 대상체(예, 인간 환자)에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 방법은 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는 MHC 분자이다. 다음으로, 암 세포주는 제1 복수의 TCR-발현 세포와 접촉(예를 들어, 공동배양)될 수 있다. 일부 경우에, 암 세포주는 제1 복수의 TCR-발현 세포를 포함하는 혼합물과 접촉될 수 있다. 암 세포주와 접촉시, 제1 복수의 TCR-발현 세포 또는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화될 수 있다. 접촉에 이어, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 식별될 수 있다. 예를 들어, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 제1 복수의 TCR-발현 세포로부터 농축되거나 선택될 수 있다. 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR은 농축되거나 선택된 하위집합으로부터 식별될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 식별하는 것은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화될 수 있는 하위집합을 농축하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 식별하는 것은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하지 못하는 것으로부터 하위집합을 선택하거나 하위집합을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 농축하는 것은 APC(인공 APC 포함)와 함께 하위집합을 공동배양함으로써 하위집합을 확장하거나 FACS 또는 MACS와 같은 유세포 분석-기반 방법에 의해 하위집합을 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 선택하는 것은 유세포 분석-기반 방법에 의해 하위집합을 분리하는 것을 포함할 수 있다.
외인성 MHC 분자는 암 세포주에 대해 외인성일 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래될 수 있다. 대상체가 발현하는 MHC 대립유전자 또는 대립유전자들에 대한 정보를 수득하는 데에는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 말초 혈액 샘플을 수득하여 게놈 DNA를 추출할 수 있다. MHC 유전자좌는 증폭되고 시퀀싱될 수 있다. 시퀀싱에서 수득된 서열은 다양한 데이터베이스의 기준 MHC 서열과 비교할 수 있다. 대안적으로, 대상체에 의해 발현된 MHC 대립유전자 또는 대립유전자들은 폴리머라제 연쇄 반응 또는 항체-기반 방법에 의해 결정될 수 있다.
선택적으로, 방법은 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원을 발현하는 비-암 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 동일한 대상체로부터 유래될 수 있다. 비-암 세포는 대상체에서 식별된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 MHC 분자를 외인성으로 발현할 수 있다. 비-암 세포는 자가-반응성(예: 자가-항원 또는 자기항원을 인식하는 세포)인 항원-반응성 세포를 선택하기 위한 음성 대조군으로 사용될 수 있으며 환자를 치료하기 위한 면역치료제를 제형화하는 데 사용될 수 없다. 다음으로, 비-암 세포는 제2 복수의 TCR-발현 세포와 접촉될 수 있다. 제2 복수의 TCR-발현 세포 또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원에 의해 활성화될 수 있다. 추가 내인성 항원은 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원과 동일하거나 상이할 수 있다. 비-암 세포는 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 발현하지 않을 수 있다. 비-암 세포는 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 더 낮은 수준으로 발현할 수 있다. 비-암 세포는 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 발현할 수 있지만, 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 제시하지는 않을 수 있다.
선택적으로, 일부 경우에, 음성 선택은 본원에 기술된 MHC-결손 암 세포주와 같은 내인성 MHC 분자를 발현하지 않는 암 세포주를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 MHC-결손 암 세포주는 암 세포주의 표면에 있는 비-MHC 제한 항원을 인식하는 TCR-발현 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 선택된 이들 TCR-발현 세포는 종양 항원이기도 한 암 세포주의 내인성 항원을 인식하지 못할 수 있다.
음성 선택은 선택적일 수 있다. 음성 선택이 수행되는 경우, 제1 복수 및 제2 복수는 동일한 샘플로부터의 분취량일 수 있다. 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 샘플로부터 유래될 수 있다. 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 TCR을 발현할 수 있다. 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 TCR(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000개 이상의 상이한 TCR의 집단)의 동일한 집단을 포함할 수 있다. 제1 복수 또는 제2 복수의 TCR-발현 세포는 상이한 TCR을 발현할 수 있다. TCR은 대상체로부터 유래될 수 있으며, 이러한 TCR은 대상체-특이적 TCR일 수 있다. 방법은 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별(예를 들어, 농축 또는 선택)하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 식별하는 것은 마커에 기초하여 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것은 마커에 기초한 FACS 또는 MACS를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 선택은 가용성, 형광 표지된, 또는 표면-결합된 펩타이드 MHC 복합체(pMHC), pMHC 사량체 또는 pMHC 올리고머에 대한 결합에 기초할 수 있다. 선택은 세포가 MHC-결합 항원과 접촉한 후 TCR-발현 세포에서의 마커 발현에 기초할 수 있다. 마커는 세포 표면 마커일 수 있다. 세포 표면 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3, 뿐만 아니라 다른 T 세포 활성화 마커, 또는 이들의 조합일 수 있다. 선택은 칼슘 유입에 기초할 수 있다. 마커는 세포내 단백질 또는 분비 단백질일 수 있다. 세포내 단백질은 전사 인자일 수도 있고 인산화된 단백질일 수도 있다. 분비 단백질은 사이토카인 또는 케모카인(예: IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린 또는 이들의 조합)일 수 있다. 분비 단백질을 마커로 사용하는 경우, 단백질 트래피킹 저해제가 세포에 첨가될 수 있다. 단백질 트래피킹의 저해제는 골지 차단제일 수 있다. 골지 차단제는 브레펠딘(Brefeldin) A, 모넨신(Monensin) 등일 수 있다. 분비 단백질은 IL-2, IL-10, IL-15, TNF-알파 또는 INF-감마일 수 있다. 선택은 또한 리포터 유전자 발현 또는 리포터 단백질을 기반으로 할 수 있다. 리포터 단백질은 형광 단백질(예: GFP 및 mCherry)일 수 있다. 리포터 유전자 발현은 TCR 신호전달에 의해 조절되는 전사 인자의 제어 하에 있을 수 있다. 이러한 전사 인자의 예로는 AP-1, NFAT, NF-카파-B, Runx1, Runx3 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
방법은 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되지만 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서는 발현되지 않는 TCR을 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에 있는 세포의 TCR, 및 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가 내인성 항원에 의해 활성화되지 않는 제2 복수의 TCR-발현 세포 중의 세포에 있는 것을 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되지만 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서는 발현되지 않는 TCR을 식별하기 위해 다양한 시퀀싱 방법이 사용될 수 있다.
비-암 세포는 줄기 세포, 정상 세포 또는 1차 건강한 세포일 수 있다. 비-암 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있다. 비-암 세포는 건강한 대상체로부터 또는 환자의 비-암 샘플로부터 수득될 수 있다. 비-암 세포는 불멸화될 수 있다. 예를 들어, 비-암 세포는 SV40을 과발현함으로써 불멸화된 1차 세포일 수 있다. 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. 비-암 세포는 분화된 iPSC일 수 있다. 비-암 세포는 자가면역 조절자(AIRE)를 발현할 수 있다.
암 세포주 또는 비-암 세포의 내인성 MHC 분자(예를 들어, 유전자 또는 단백질 산물)는 불활성화(예를 들어, 하향 조절, 녹다운 또는 녹아웃)될 수 있다. 불활성화되는 내인성 MHC 분자는 세포 표면에서 발현되지 않을 수 있다. MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자는 불활성화될 수 있다. MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 유전자는 불활성화될 수 있다. MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 단백질 산물은, 예를 들어, 분해 또는 저해에 의해 불활성화될 수 있다. MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 유전자의 단백질 산물은 불활성화될 수 있다. 내인성 MHC 분자는 불활성화되는 경우, 암 세포주에서의 정상 발현 수준보다 최대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1% 또는 그 미만의 발현 수준을 가질 수 있다. 내인성 MHC 분자는 다양한 방법을 사용하여 발현을 검출할 수 없을 정도로 완전히 불활성화될 수 있다. 불활성화된 내인성 MHC 분자를 갖는 암 세포주는 MHC-결손 암 세포주일 수 있다. 비-암 세포는 MHC-결손 비-암 세포일 수 있다. 암 세포주 또는 비-암 세포는 내인성 MHC 분자에 대해 결손일 수 있다. 암 세포주 또는 비-암 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 내인성 MHC 분자에 대해 결손일 수 있다. 일부 경우에, 암 세포주 또는 비-암 세포는 모든 내인성 MHC 분자(모든 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자 포함)에 대해 결손일 수 있다. 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자를 불활성화하거나, MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 유전자를 불활성화하기 위해 다양한 유전자 편집 방법이 사용될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화된다. 일부 경우에는 MHC 분자를 암호화하는 하나 이상의 유전자가 불활성화될 수 있다. 예를 들어, B2M을 암호화하는 유전자와 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자 둘 모두가 불활성화될 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화될 수 있다. 일부 경우에, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화될 수 있다. 일부 경우에, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화될 수 있다. 예를 들어, CIITA 유전자가 불활성화될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 II 분자를 암호화하는 유전자와 MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자 둘 모두가 불활성화될 수 있다.
암 세포주 또는 비-암 세포의 외인성 MHC 분자는 대상체(예를 들어, TCR이 수득되는 대상체와 동일한 대상체)에서 유래되는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)일 수 있다. MHC-I 알파와 B2M은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 (G4S)n일 수 있으며, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함할 수 있다.
복수의 TCR-발현 세포는 동일한 대상체로부터 단리될 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포는 1차 T 세포를 포함할 수 있다. 1차 T 세포는 종양-침윤 T 세포일 수 있다. 1차 T 세포는 말초 T 세포일 수 있다. 말초 T 세포는 암 세포 또는 암 세포의 자손과 접촉했을 수 있거나, 종양 항원에 노출되었을 수 있는 종양-경험이 있는 T 세포일 수 있다. 종양-경험이 있는 T 세포는 PD-1+ T 세포일 수 있다. 종양-경험이 있는 T 세포는 높은 PD-1 발현을 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 표면에서 PD-1 발현을 측정할 때, 적어도 약 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상으로 상위의 PD-1 발현 수준을 갖는 세포가 높은 PD-1 발현을 갖는 T 세포로서 간주될 수 있다. 말초 T 세포는 PD-1+ T 세포일 수 있다. 1차 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 1차 T 세포는 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
복수의 TCR-발현 세포는 조작된 세포를 포함할 수 있다. 조작된 세포는 본원에 기술된 다양한 유형의 세포일 수 있다. 조작된 세포는 외인성 TCR을 발현할 수 있다. 외인성 TCR은 동일한 대상체로부터 단리된 1차 T 세포로부터 유래될 수 있다. 외인성 TCR은 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR일 수 있다.
방법은 암 세포주를 제공하기 전에 대상체로부터 원발성 암 세포 또는 종양/암 샘플을 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 원발성 암 세포는 본원에 기술된 다양한 조직 샘플, 예를 들어 말초 혈액 샘플 또는 종양 조직 샘플로부터 수득될 수 있다. 방법은 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 및 일부 후보 암 세포주의 전사체(예를 들어, 유전자 발현 프로파일) 또는 게놈 분석을 수행하여, 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 닮은 전사체 프로파일(예를 들어, 유전자 발현 프로파일) 또는 게놈 변경(예를 들어, 돌연변이)을 갖는 암 세포주를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 원발성 암 세포 및 암 세포주는 동일한 조직 기원일 수 있다. 암 세포주의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경은 원발성 암 세포 또는 종양 샘플과 실질적으로 유사할 수 있다. 전사체학(또는 유전자 발현 프로파일링)은 특정 시간에 세포 집단에서 mRNA(전사체)의 발현 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다. 두 샘플 간의 유전자 발현 프로파일은 다양한 방법으로 비교할 수 있다. 예를 들어, 각 샘플의 유전자 발현 프로파일은 RNA-Seq 또는 발현 마이크로어레이에 의해 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA-Seq이 사용된다. 일부 경우에, 환자의 암 샘플과 세포주 사이 또는 상이한 세포주 중에서 사용되는 RNA-Seq 플랫폼은 상이할 수 있다. 이러한 경우 ComBat과 같은 도구를 사용하여 이러한 시퀀싱 플랫폼 차이 또는 배취(batch) 영향을 교정할 수 있다. 전사체 수는 유전자 수준으로 집계될 수 있고, 백만개당 전사체(transcript per million: TPM) 값은 표준 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 상이한 샘플의 데이터는 정규화 및 로그 변환된 상위 사분위수일 수 있다.
유전자의 하위집합은 환자의 암 샘플과 세포주 사이의 스피어만(Spearman) 상관관계를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 하위집합은 유전자가 종양 샘플의 순도와 상관관계가 있는지 여부에 기초하여 또는 동일한 암 유형 중 다른 종양 샘플 또는 다른 세포주에 있는 이 유전자의 가변성에 기초하여 선택할 수 있다. The Cancer Genome Atlas(TCGA)와 같은 공개 데이터베이스는 이러한 목적 및 기타 목적에 유용한 자원일 수 있다. 예를 들어, 모든 TCGA 샘플에 대한 종양 순도 추정치는 TCGA PanCan 사이트의 ABSOLUTE46 방법을 사용하거나 ESTIMATE47을 사용하여 수득할 수 있다. 주어진 암 유형에 대해 종양 순도와 높은 상관관계가 있는 유전자는 제거될 수 있고, 유전자 발현 데이터는 선형 회귀를 사용하여 종양 순도에 대해 조정될 수 있다. 그 후, 원발성 종양 샘플에 걸쳐 사분위수 범위(IQR)로 순위가 매겨진 5000개의 가장 가변적인 유전자가 선택될 수 있다.
환자 종양 샘플의 유전자 발현 프로파일은 환자 종양의 유전자 발현 프로파일과 동일한 암 유형의 TCGA 데이터의 유전자 발현 프로파일을 상기 기술된 방법을 사용하여 비교함으로써 순도-조정될 수 있다. 이 조정 후 환자의 종양 샘플과 세포주 사이의 스피어만 상관관계는 5000개의 선택된 유전자의 정규화되고 로그 변환된 TPM 값을 사용하여 계산할 수 있다. 스피어만 상관 계수는 환자의 종양과 세포주 사이의 유사성을 설명하는 데 사용될 수 있다. 유사성은 상관 계수가 약 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 이상인 경우 충분한 것으로 간주될 수 있다.
방법은 복수의 TCR-발현 세포의 농축된 하위집합의 TCR을 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR(또는 TCR의 서열)을 식별하는 것을 포함한다. 일부 경우에, TCR을 식별하는 것은 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 하위집합의 각각의 고유 TCR의 빈도는 시퀀싱 데이터에서 결정될 수 있으며, 이는 선택후 빈도(post-selection frequency)로서 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 암 세포주와 접촉하기 전에 복수의 TCR-발현 세포의 TCR 레퍼토리는 시퀀싱으로 처리된다. 각각의 고유 TCR의 빈도는 시퀀싱 데이터에서 결정될 수 있으며, 이는 선택전 빈도(pre-selection frequency)로서 지칭될 수 있다. 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR은 선택후 빈도와 선택전 빈도를 비교함으로써 결정될 수 있다.
다양한 시퀀싱 방법이 본원에서 사용될 수 있다. 다양한 시퀀싱 방법으로는 생거(Sanger) 시퀀싱, 고처리량 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, RNA-Seq, 차세대 시퀀싱(NGS), 디지털 유전자 발현, 클론성 단일 마이크로어레이(Clonal Single MicroArray), 샷건 시퀀싱, 막심-길버트(Maxim-Gilbert) 시퀀싱 또는 대규모 병렬 시퀀싱을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. TCR-발현 세포는 inDrop 또는 DropSeq와 같은 단일 세포 RNA-Seq 방법의 투입물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱은 단일 세포 바코드화(예를 들어, TCR-발현 세포를 개별 구획으로 분할하고, 단일 세포로부터 방출된 핵산을 바코드화하고, 핵산을 시퀀싱하고, 동일한 바코드에 기초하여 단일 세포로부터의 TCR 사슬을 쌍형성시킴)를 사용할 수 있다. 시퀀싱은 세포 내에서 쌍을 이룬 TCR 사슬을 암호화하는 서열이 단일 연속 폴리뉴클레오타이드 사슬에 융합되거나 연결되었다면, 바코드 사용을 포함하지 않을 수 있다.
선택적으로, TCR 또는 본원에서 식별된 TCR을 암호화하는 서열은 TCR을 발현하기 위해 숙주 세포(또는 수혜자 세포)에 도입될 수 있다. 숙주 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
방법은 (i) 항원-반응성 세포 또는 (ii) 항원-반응성 세포의 TCR을 포함하는 세포(예를 들어, 숙주 세포) 또는 (iii) 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 치료적 유효량의 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 포함하는 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 약제 또는 약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항원-반응성 세포의 TCR은 항원-반응성 세포에서 쌍을 이룬 TCR의 서열을 결정하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 쌍을 이룬 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 그 다음 다른 숙주 세포로 전달될 수 있으며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 약제 또는 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용에 기술된 다양한 전달 방법 또는 벡터는 쌍을 이룬 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 또 다른 숙주 세포로 전달하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 대상체에서 유래되는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000개 이상의 상이한 동족 쌍(예를 들어, 천연적으로 쌍을 이룬 TCR)을 포함하는 복수의 TCR을 발현할 수 있다. 복수의 TCR은 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 추가로 포함할 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포는 조작된 세포일 수 있다. 조작된 세포는 복수의 TCR을 외인성으로 발현할 수 있다.
항원-반응성 세포를 식별하는데 사용되는 암 세포주는 적어도 약 50, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000개 이상의 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 복수의 TCR-발현 세포의 농축된 하위집합은 이를 필요로 하는 대상체 내로 직접 투여될 수 있다. 일부 경우에, 농축된 하위집합은 암 세포주가 제거되지 않을 수 있고, 이로써 대상체에게 투여 시 문제를 일으킬 수 있다. 방법은 암 세포주를 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키기 전에 암 세포주를 사멸시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 사멸은 암 세포주를 화학적 화합물로 처리하거나 방사선조사하는 것을 포함할 수 있다. 화학적 화합물은 세포독성 화합물일 수 있다. 세포독성 화합물의 예로는 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 다카바진, 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨이린, 아자티오프라임, 프로카바진, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 다우노마이신, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에 의해 발현된 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 인식하는 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 식별하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 발현하는 암 세포주를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자일 수 있다. 다음으로, 암 세포주는 동일한 대상체로부터 유래되는 적어도 약 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000개 이상의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현하는 복수의 조작된 세포와 접촉될 수 있다. 복수의 조작된 세포 또는 복수의 조작된 세포의 하위집합은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 항원에 의해 활성화될 수 있다. 접촉 후, 복수의 조작된 세포 또는 복수의 조작된 세포의 하위집합은 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 식별하기 위해 농축될 수 있다.
항원은 암 세포주에 대해 내인성일 수 있다. 암 세포주는 외인성 항원을 발현하지 않을 수 있거나 외인성 항원을 제시하지 않을 수 있다. 항원은 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)일 수 있다.
암 세포주는 동일한 대상체에서 유래되지 않을 수 있다. 암 세포주는 또 다른 대상체, 예를 들어 건강한 공여자로부터 유래될 수 있다. 암 세포주는 본원에 기술된 임의의 유형의 암 세포주일 수 있다. 암 세포주는 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포와 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 가질 수 있다.
복수의 조작된 세포는 대상체로부터 단리된 1차 세포(예를 들어, 1차 T 세포)로부터 유래된 복수의 TCR을 포함할 수 있다. 1차 세포는 T 세포일 수 있다. T 세포는 종양-침윤 T 세포일 수 있다. T 세포는 말초 T 세포일 수 있다. 말초 T 세포는 종양-경험이 있는 T 세포일 수 있다. 말초 T 세포는 PD-1+ T 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. T 세포는 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 기술된 복수의 조작된 세포는 복수의 TCR을 외인성으로 발현할 수 있다. 예를 들어, 복수의 TCR을 암호화하는 서열은 복수의 TCR을 발현하기 위해 조작된 세포 내로 도입될 수 있다.
복수의 조작된 세포 또는 복수의 조작된 세포의 하위집합은 마커에 기초하여 농축(예를 들어, 선택 또는 분류)될 수 있다. 예를 들어, FACS 또는 MACS는 마커에 기초하여 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 마커는 리포터 단백질일 수 있다. 리포터 단백질은 형광 단백질일 수 있다. 마커는 세포 표면 단백질, 세포내 단백질 또는 분비 단백질일 수 있다. 마커는 세포내 단백질 또는 분비 단백질일 수 있고, 방법은 선택하기 전에 복수의 조작된 세포를 고정 및/또는 투과화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 복수의 조작된 세포를 골지 차단제와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 분비 단백질은 사이토카인일 수 있다. 사이토카인은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린 또는 이들의 조합일 수 있다. 세포 표면 단백질은 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3, 또는 이들의 조합일 수 있다.
항원-반응성 세포에 의해 발현되는 TCR은 식별될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱을 사용하여 복수의 조작된 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 분석하고 항원-반응성 세포의 TCR을 식별할 수 있다. 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 포함하는 세포는 대상체 내로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 방법은 암 세포주를 제공하기 전에 대상체로부터 원발성 암 세포를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 원발성 암 세포 및 일부 후보 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하여 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포를 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 암 세포주를 식별할 수 있다.
본 개시내용은 또한 TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가 또는 분석하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 방법은 암 세포주로부터 유래된 복수의 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 복수의 세포는 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암 환자)로부터 유래된 MHC 분자일 수 있다. 다음으로, 복수의 세포는 동일한 대상체(예를 들어, MHC 분자가 유래되는 대상체)로부터 유래된 복수의 TCR을 발현하는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉될 수 있다. 접촉 시, 복수의 TCR 또는 이의 분획은 복수의 세포 또는 이의 분획의 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식(예를 들어, 상호작용 또는 결합)할 수 있다. 접촉 후, 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획이 정량화될 수 있다. 예를 들어, 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획은 유세포 분석 기반 방법(예: FACS 또는 MACS) 또는 광유체 기술(예: Berkeley Lights에서 상업적으로 입수 가능)에 의해 정량화될 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획은 용해된 세포 또는 사세포일 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획은 마커에 기초하여 정량화될 수 있다. 일부 경우에, 분획은 용해된 세포 또는 사세포를 표지화하는데 사용될 수 있는 마커에 기초하여 FACS 또는 MACS로 결정할 수 있다. 마커는 아폽토시스(예: 카스파제 3)와 관련될 수 있거나 용해된 세포 또는 사세포를 염색하기 위한 염료일 수 있다. 일부 경우에, 젖산 탈수소효소(LDH) 검정은 샘플 중 용해된 세포 또는 사세포의 양을 계산하는데 사용될 수 있는, 용해된 세포 또는 사세포로부터 방출된 LDH의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획(예를 들어, 활성화된 분획)은, 예를 들어, 유세포 분석 기반 방법 또는 광유체 기술에 의해 정량화될 수 있다. 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획은 마커에 기초하여 정량화될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획은 마커에 기초하여 FACS 또는 MACS에 의해 결정될 수 있다. 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, CD107a, TNF-알파, 또는 FoxP3일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 광유체 기술은 미세유체 장치를 사용하여 샘플 내의 세포를 개별 구획으로 분배하는 단계, 및 관심 있는 특성을 갖는 세포의 하위집합과 연관된 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 신호는 관심 있는 특성을 갖는 세포를 함유하는 구획 내에서만 생성될 수 있다. 예를 들어, 신호는 복수의 TCR-발현 세포에 의해 인식되는 세포의 분획을 결정할 때 용해된 세포 또는 사세포와 연관될 수 있거나, 또는 활성화된 T 세포의 분획을 결정할 때에는 T 세포로부터 분비된 사이토카인과 연관될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 분비되는 사이토카인의 양 또는 수준이 또한 정량화될 수 있다(예를 들어, 사이토카인 방출 검정). 사이토카인의 예로는 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 복수의 세포는 외인성 MHC 분자를 발현하는 APC일 수 있다. APC는 전문 또는 비전문 APC일 수 있다. APC는 본원에 기술된 암 세포주일 수 있거나, 또는 대상체로부터 단리될 수 있다. APC는 자가 APC일 수 있다. TCR-발현 세포는 본원에 기술된 TCR-발현 세포 중 어느 하나일 수 있다.
항원-반응성 세포의 표지화
항원-반응성 세포(예를 들어, 항원-반응성 TCR-발현 세포)는 본원에 기술된 바와 같은 마커에 기초하여 선택되거나 농축될 수 있다. 항원-반응성 세포는 TCR 신호전달 경로를 촉발함으로 인해 본원에 기술된 암 세포주와 같은 APC와 상호작용 후에 세포 표면 마커 또는 리포터 유전자를 상향조절할 수 있다. 세포 표면 마커 또는 리포터 유전자를 상향조절하는 T 세포는 정량화(예: 형광 현미경 또는 유세포 분석에 의해)하거나 농축(예: FACS 또는 MACS)할 수 있다.
세포 마커 또는 리포터 유전자 외에, 항원-반응성 세포를 표지하기 위해 다른 방법이 사용될 수 있으며, 이는 이후 FACS 또는 MACS와 같은 본원에 기술된 방법에 의해 선택될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 암 세포주와 같은 항원-제시 세포(APC)는 APC와 상호작용하는 TCR-발현 세포를 표지하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, APC는 APC와 물리적으로 상호작용하는 TCR-발현 세포로 표지의 전달을 촉매할 수 있는 표지-전달 효소와 연관(예를 들어, 발현 또는 부착)되도록 조작될 수 있다. 표지는 검출 가능한 표지일 수 있다. 표지는 표지-전달 효소의 기질을 포함할 수 있다. 표지는 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 표지-전달 효소에 의해 인식될 수 있는 기질에 부착될 수 있다. 일부 경우에, TCR-발현 세포는 표지-전달 효소의 촉매작용하에 표지에 부착될 수 있는 표지-수용 모이어티와 연관(예를 들어, 발현 또는 부착)될 수 있다. TCR-발현 세포는 표지-수용 모이어티를 내인성 또는 외인성으로 발현할 수 있다. TCR-발현 세포는 예를 들어 화학적 연결을 통해 화학적으로 표지-수용 모이어티에 부착될 수 있다.
이러한 표지-전달 효소의 비제한적 예는 트랜스펩티다제일 수 있다. 트랜스펩티다제는 소르타제 A(SrtA), 소르타제 B, 아르케오소르타제 A, 엑소소르타제 A, 롬보소르타제 또는 PorU와 같은 소르타제일 수 있다. 일부 경우에는 트랜스펩티다제는 SrtA이며, 이는 스트렙토코커스 아우레우스와 같은 많은 박테리아의 게놈에서 찾을 수 있다. SrtA는 기질로서 펩타이드(예를 들어, LPXTG 펜타-펩타이드)를 사용할 수 있고, 이 기질을 TCR-발현 세포 상에 존재하는 N-말단 트리글리신 모이어티로 전달할 수 있다. SrtA는 SrtA의 활성을 조절할 수 있는 P94S, D124G, D160N, D165A, Y187L, E189R, K190E, K196T, F200L 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
N-말단 트리글리신 모이어티는 TCR-발현 세포의 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, N-말단 트리글리신 모이어티를 포함하는 화학적으로 합성된 펩타이드는 TCR-발현 세포에 화학적으로 접합될 수 있다. 이러한 화학적 접합을 위한 예시적인 방법은 구리-무함유 클릭 화학으로 알려진 것 중 테트라진 기에 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 기를 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, TCO 기는 티올 말레이미드 반응을 통해 펩타이드에 접합될 수 있고, 테트라진 기는 NHS 에스테르 기를 사용하여 TCR-발현 세포 표면에 접합될 수 있다. 그런 다음 TCO-변형된 펩타이드는 세포 배양 배지에 부착되고 테트라진-변형된 세포 표면과 반응할 수 있다. 반응하지 않은 TCO-변형된 펩타이드는 세척될 수 있다. 본원에 사용된 클릭 화학은 구리-무함유(free) 클릭 화학으로 제한되지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 아지드-알킨 고리첨가(예를 들어, 구리-촉매화된 아지드-알킨 고리첨가 및 루테늄-촉매화된 아지드-알킨 고리첨가), 알킨-니트론 고리첨가, 알켄 및 테트라진 역-수요 디엘스-앨더(inverse-demand Diels-Alder), 또는 알켄 및 테트라졸 광클릭 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 클릭 화학 또는 다른 화학적 접합이 사용될 수 있다.
표지는 기질, 예를 들어, 기질 펩타이드를 포함할 수 있다. LPXTG 펜타-펩타이드와 같은 기질은 비오틴, 형광 염료, 디곡시제닌, 펩타이드 태그(예: HIS-태그 또는 FLAG-태그) 또는 접합 핸들과 같은 검출 가능한 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 유세포 분석에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광 염료는 직접 검출될 수 있다. 또 다른 예에서, 기질은 접합 핸들에 의해 변형될 수 있고, 여기에 또 다른 검출 가능한 모이어티가 클릭 화학 반응과 같은 다양한 반응을 통해 부착될 수 있고, 간접적으로 검출될 수 있다. 기질이 효소에 의해 표지-수용 모이어티로 전달되기 전에 검출 가능한 모이어티는 기질에 부착될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 모이어티는 기질이 TCR-발현 세포의 표지-수용 모이어티로 전달된 후에 부착될 수 있다.
표지-전달 효소는 APC의 표면에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 표지-전달 효소는 신호 펩타이드(예: N-말단 신호 펩타이드)에 융합될 수 있으며, 일부 경우에, 표지-전달 효소는 막관통 도메인(예: C-말단 막관통 도메인)에 추가로 융합될 수 있다. 일부 경우에, SrtA는 APC의 표면에서 발현될 수 있다. 예를 들어, SrtA는 신호 펩타이드에 SrtA를 융합시킴으로써 발현될 수 있다. 신호 펩타이드는 B2M(MSRSVALAVLALLSLSGLEA)의 신호 펩타이드와 같은 N-말단 신호 펩타이드일 수 있다. SrtA는 막관통 도메인에 추가로 융합될 수 있다. 막관통 도메인은 클래스 I MHC 분자의 알파 사슬(VGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMW)의 막관통 도메인과 같은 C-말단 막관통 도메인일 수 있다. 다른 단백질로부터의 다양한 신호 펩타이드 또는 막관통 도메인 서열이 사용될 수 있다. 이러한 서열은 UniProt 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 대안적으로, SrtA는 알려진 상호작용 파트너를 가진 막 단백질 또는 막-고정 단백질인 스캐폴드 단백질에 융합될 수도 있다. 스캐폴드 단백질의 예로는 단일 사슬 항체, HER2, CD40, CD40L 및 많은 다른 세포 표면 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 융합 단백질은 APC 내부에서 세포내적으로 발현될 수 있고, 자연스럽게 세포 표면으로 수송된다. SrtA가 스캐폴드 단백질과 융합될 때, TCR-발현 세포는 스캐폴드 단백질의 상호작용 파트너와 연관(예를 들어, 발현, 발현하도록 조작 또는 표지화)될 수 있다. 스캐폴드 단백질과 상호작용 파트너는 이들의 상호작용만으로는 APC와 TCR-발현 세포 사이의 상호작용을 유도할 수 없도록 하기 위해 변형(예를 들어, 돌연변이 도입)될 수 있다. 비제한적인 예로서, 스캐폴드 단백질은 CD40L일 수 있고, 이의 상호작용 파트너는 CD40일 수 있으며; K142E 및 R202E 돌연변이는 CD40L에 도입되어 CD40에 대한 그의 친화도를 감소시킬 수 있다. 상호작용 파트너는 또한 LPXTG 기질을 수용하기 위한 N-말단 트리글리신 모이어티 및 이에 부착된 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다.
표지-전달 효소의 또 다른 비제한적 예는 글리코실트랜스퍼라제일 수 있다. 글리코실트랜스퍼라제는 뉴클레오타이드 당 기질(예: UDP-글루코스, UDP-갈락토스, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, UDP-자일로스, UDP-글루쿠론산, GDP-만노스, GDP-푸코스 및 CMP-시알산)로부터의 당류 모이어티를 친핵성 글리코실 수용체 분자로 전달할 수 있다. 친핵성 글리코실 수용체 분자는 산소계, 탄소계, 질소계 또는 황계일 수 있다.
예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제는 H. 파일로리 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제(FucT)일 수 있다. FucT는 FucT의 천연 기질인 GDP-푸코스의 푸코스 모이어티를 T 세포를 비롯한 많은 유형의 포유동물 세포 표면에서 발견할 수 있는 N-아세틸락토사민(LacNAc) 또는 α-2,3-시알릴 LacNAc로 전달할 수 있다. FucT는 또한 이의 기질 상의 특정 변형을 용인할 수 있다. 예를 들어, 비오틴, 형광단 또는 접합 핸들과 같은 검출 가능한 모이어티는 푸코스 상의 C-5 위치를 통해 GDP-푸코스의 푸코스 모이어티에 연결될 수 있다. 따라서, FucT는 APC의 표면에 부착될 수 있고, 예를 들어, GDP-푸코스-비오틴의 푸코스-비오틴 모이어티를 APC와 상호작용하는 TCR-발현 세포의 표면으로 전달할 수 있다. 이 예에서 비오틴은 또한 많은 다른 검출 가능한 모이어티에 의해 대체될 수 있다.
FucT는 다양한 방법을 사용하여 APC의 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, FucT는 이의 N-말단 신호 펩타이드 및 C-말단 막관통 도메인에서 신호전달 펩타이드와 융합될 수 있고, SrtA에 대해 상기에 기술된 바와 같이 APC 내부에서 세포내적으로 발현될 수 있다. 대안적으로, FucT는 APC 외측에서 생성되어 APC 표면에 생화학적으로 부착될 수 있다. 본원에 기술된 클릭 화학을 비롯한 다양한 화학이 사용될 수 있다. 예를 들어, FucT는 TCO-FucT를 형성하기 위해 TCO-NHS를 사용하여 TCO에 의해 변형될 수 있다. APC는 테트라진-NHS를 사용하여 테트라진에 의해 변형될 수 있다. 그런 다음 TCO-FucT는 테트라진-변형된 APC와 접촉하여 FucT를 APC에 부착시킬 수 있다. 대안적으로, GDP-푸코스-테트라진은 TCO-FucT를 GDP-푸코스-FucT로 추가로 전환시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서 GDP-푸코스 모이어티와 FucT는 테트라진-TCO 클릭 화학의 반응 생성물을 통해 연결된다. GDP-푸코스-FucT는 APC와 인큐베이션될 수 있고, 여기서 FucT 모이어티는 이 자체(또는 또 다른 GDP-푸코스-FucT 분자)를 APC 상의 LacNAc 또는 시알릴 LacNAc에 부착시키는 반응을 촉매할 수 있다. 이러한 생화학적 방법은 SrtA를 APC 표면에 부착시키는 데에도 사용될 수 있다.
일부 경우에, APC를 인식하는 TCR-발현 세포는 APC와 TCR-발현 세포를 공동배양함으로써 표지될 수 있고, 그 후에 상호작용시켜 APC와 TCR-발현 세포에 의해 형성된 복합체가 포착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 복합체는 0.1% 내지 0.5% 파라포름알데히드와 같은 낮은 농도의 고정제를 사용하여 안정화될 수 있다. 복합체는 크기에 따라 상호작용하지 않은 APC와 TCR-발현 세포로부터 분리될 수 있으며, 이는 유세포 분석 및 FACS에서 광산란으로 명시될 수 있다. 복합체의 단리를 용이하게 하기 위해, APC 및 TCR-발현 세포는 또한 상이한 형광 염료로 염색될 수 있다. 예를 들어, APC는 녹색 염료로 염색될 수 있고 TCR-발현 세포는 적색 염료로 염색될 수 있다. FACS 동안 녹색 염료와 적색 염료 둘 모두를 소유하는 입자(APC 및 TCR-발현 세포에 의해 형성된 복합체인 것으로 추정됨)는 단 1가지 색의 염료를 소유하는 입자로부터 분리될 수 있다. 이 방법을 사용하면 APC 자체는 APC가 제시한 항원을 인식할 수 있는 TCR-발현 세포에 부착된 표지로 간주될 수 있다.
고정제를 사용하거나 사용함이 없이, APC 및 TCR-발현 세포에 의해 형성된 복합체는 에멀젼 중 유중수 액적과 같은 개별 구획에 캡슐화될 수 있다. 이러한 유중수 에멀젼을 제조하는 일반적인 방법은 미세유동학, 볼텍싱 또는 진탕을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 에멀젼 생성 전에 수성 상 중 APC 및 TCR-발현 세포의 밀도는 APC 및 TCR-발현 세포가 에멀젼 생성 시에 상호작용하지 않는다면, 이들이 동일한 액적 내에 분할될 가능성이 없을 정도로 충분히 낮게 제어될 수 있다. APC는 유화 후, APC로부터 TCR-발현 세포가 해리될 지라도 동일 액적에서 TCR-발현 세포에 부착할 수 있는 표지를 생성할 수 있다. 예를 들어, APC는 TCR-발현 세포에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 단백질을 분비할 수 있다. 예를 들어, TCR-발현 세포는 T 세포의 세포 표면 단백질(예: CD45, CD2) 뿐만 아니라 사이토카인(예: TNF-알파)을 인식하는 이중특이성 항체에 의해 먼저 표지될 수 있다. APC는 이중특이성 항체에 의해 인식되는 사이토카인을 분비하도록 조작될 수 있다. 에멀젼 생성 전에 사이토카인의 생성을 감소시키기 위해, 이 사이토카인의 발현 카세트는 유도성 프로모터(예: TetOn 프로모터)의 제어 하에 있을 수 있으며, 유도제(예: 테트라사이클린, 독시사이클린)는 유화 직전의 배지에 첨가될 수 있다. 에멀젼은 탈유화될 수 있고 TCR-발현 세포에 결합된 사이토카인은 APC를 인식할 수 있는 TCR 세포를 정량화하거나 농축시키는 표지로서 작용할 수 있다.
일부 경우에, 본원에는 대상체에 의해 발현된 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법이 제공된다. 대상체는 암과 같은 병태를 가질 수 있다. 방법은 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 항원-제시 세포(APC)를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자일 수 있다. 다음으로, APC는 대상체로부터 유래된 복수의 TCR-발현 세포와 접촉될 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포 또는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 APC의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식할 수 있다. 내인성 항원을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포 또는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 APC로부터 분비된 표지 또는 내인성 항원을 인식 시에 APC와 연관된 표지-전달 효소에 의해 전달된 표지에 부착될 수 있거나, 또는 내인성 항원을 인식 시에 활성화 마커를 발현할 수 있다. 다음으로, 표지 또는 활성화 마커에 기초하여 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 식별될 수 있고, 이로써 항원-반응성 세포가 식별될 수 있다. 식별은 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축시키는 것을 포함할 수 있다. APC는 적어도 약 10, 50, 100, 200, 300개 이상의 내인성 항원을 발현할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 동반 진단에 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 대상체에게 암 약물을 투여할지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 결정은 복수의 TCR-발현 세포에서 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획 또는 항원을 인식하는 하위집합에서 TCR-발현 세포의 수에 기초할 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 수는, 예를 들어, 유세포 분석에 의해 정량화될 수 있다. T 세포 활성화를 나타내는 본원에 개시된 다양한 마커(예를 들어, 세포 표면 마커 또는 분비 사이토카인)가 사용될 수 있다. APC와 접촉하기 전에 복수의 TCR-발현 세포의 수는 정량화될 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포에서 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획은 정량화에 기초하여 결정될 수 있다. 대상체에게 암 약물을 투여할지 여부는 하위집합 중 TCR-발현 세포의 분획 또는 수에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 경우에, 암 약물은 분획에 기초하여 암 약물로 치료하기에 적합하다고 결정된 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 다른 경우에, 암 약물은 분획에 기초하여 암 약물로 치료하기에 부적합하다고 결정된 대상체에게 투여되지 않을 수 있다. 상기 방법은 또한 암 약물의 용량을 증가시킬 것인지 감소시킬 것인지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에는 대상체에 대한 암 약물의 용량은 증가될 수 있다. 일부 경우에는 대상체에 대한 암 약물의 용량은 감소될 수 있다.
암 약물은 면역 세포 조절자일 수 있다. 면역 세포 조절자는 사이토카인 또는 면역 관문 저해제일 수 있다.
본원에 기술된 방법은 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 서열을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다음으로, TCR 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현을 위해 수혜자 세포로 전달(예를 들어, 도입, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염)될 수 있다. 수혜자 세포는 TCR 발현을 위한 숙주 세포일 수 있다. 수혜자 세포는 "TCR-발현 세포" 섹션에 개시된 임의의 유형의 세포일 수 있다. 예를 들어, 수혜자 세포는 T 세포일 수 있다. T 세포는 자가 T 세포 또는 동종 T 세포일 수 있다. 수혜자 세포는 전달 전에 TCR 서열을 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 수혜자 세포의 내인성 TCR은 불활성화될 수 있다(예: 녹아웃 또는 녹다운). 수혜자 세포 또는 이의 파생물(예를 들어, 수혜자 세포의 카피 또는 자손)은, 예를 들어, 치료로서 대상체에게 전달될 수 있다.
일부 경우에, 항원을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 적어도 2개의 상이한 TCR을 발현할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 TCR의 서열이 결정될 수 있다. 다음으로, 적어도 2개의 상이한 TCR을 포함하는 복수의 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현을 위해 복수의 수혜자 세포 내로 전달될 수 있다. TCR을 발현하는 수혜자 세포는 추가로 선택될 수 있다. 예를 들어, 복수의 수혜자 세포는 APC 또는 추가 APC와 접촉될 수 있다. 다음으로, 복수의 수혜자 세포로부터의 수혜자 세포는 농축될 수 있고(예를 들어, FACS 또는 MACS에 의해), 여기서 수혜자 세포는 APC 또는 추가 APC를 인식한다.
본원에 기술된 표지는 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 유세포 분석에 의해 검출 가능할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 비오틴, 형광 염료, 펩타이드, 디곡시제닌 또는 접합 핸들일 수 있다. 접합 핸들은, 예를 들어, 아지드, 알킨, DBCO, 테트라진 또는 TCO를 포함할 수 있다. 표지는 표지-전달 효소에 의해 인식되는 기질을 포함할 수 있다. 표지는 APC에 의해 분비되는 사이토카인이다. 표지-전달 효소는 트랜스펩티다제(예: 소르타제) 또는 글리코실트랜스퍼라제(예: 푸코실트랜스퍼라제)일 수 있다. 표지-전달 효소는 APC에 의해 발현되거나 외부에서 공급되어 APC에 부착될 수 있다. 표지-전달 효소는 막관통 단백질일 수 있다. 표지-전달 효소는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 APC에 부착될 수 있다. APC는 대상체에서 유래될 수 있다. APC는 본원에 기술된 암 세포주일 수 있다. 암 세포주는 대상체의 암과 동일한 암 유형에서 유래될 수 있다.
복수의 TCR-발현 세포는 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포는 종양-침윤 T 세포 또는 말초 T 세포일 수 있다. T 세포는 LAG3, CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR 또는 FoxP3, 또는 이들의 임의의 조합을 발현할 수 있다. 복수의 TCR-발현 세포는 표지를 수용하기 위한 표지-수용 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 본원에 기술된 암 세포주에 제한되지 않는 다양한 APC에 의한 TCR 식별에 사용될 수 있음을 이해해야 한다. APC는 전문 또는 비전문 APC일 수 있다. APC는 건강한 대상체 또는 병태가 있는 대상체와 같은 대상체로부터 단리된 1차 세포일 수 있다. APC는 대상체-특이적 MHC를 발현하도록 조작될 수 있다. APC는 암세포와 유사한 항원을 운반할 수 있는 암-모방(cancer-mimicking) APC 또는 cmAPC일 수 있다. APC는 세포주일 수 있다. APC는 불멸화되지 않을 수 있다.
TCR-발현 세포
다양한 측면에서, 복수의 TCR-발현 세포는 복수의 TCR-발현 세포로부터 항원-반응성 세포를 식별하기 위한 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. TCR-발현 세포는 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 발현하는 대상체 또는 조작된 세포로부터 수득되는 1차 T 세포일 수 있다. 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR은 대상체 또는 대상체의 종양에 특이적일 수 있다.
TCR-발현 세포는 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+/CD8+ T 세포일 수 있다. T 세포와 같은 TCR-발현 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다(예를 들어, 1차 T 세포). TCR-발현 세포는 본원에 기술된 임의의 샘플로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 말초 혈액 샘플일 수 있다. 말초 혈액 세포는 특정 세포 유형(예: 단핵 세포, 적혈구, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 면역 세포, T 세포, NK 세포 등)에 대해 농축될 수 있다. 말초 혈액 세포는 또한 특정 세포 유형(예: 단핵 세포, 적혈구, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 면역 세포, T 세포, NK 세포 등)이 선택적으로 고갈될 수 있다.
T 세포는 고형 조직을 포함하는 조직 샘플로부터 수득될 수 있으며, 비제한적 예로는 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절(예를 들어, 편도선), 갑상선, 흉선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도 및 위로부터의 조직을 포함한다. 추가적인 비제한적인 공급원으로는 골수, 제대혈, 감염 부위의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함한다. T 세포는 건강한 공여자, 암 진단을 받은 환자 또는 감염 진단을 받은 환자로부터 유래되거나 수득될 수 있다. T 세포는 여러 표현형 특성을 제시하는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.
T 세포는 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다. 본 개시내용의 특정 측면에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 다양한 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득될 수 있다. 성분채집 산물은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유할 수 있다. 성분채집에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 놓기 위해 세척될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척될 수 있다. 세척 용액에는 칼슘이나 마그네슘 또는 기타 2가 양이온이 결여될 수 있다. 칼슘 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 세척 단계는 반자동 "플로우-스루" 원심분리기(예: Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하는 것과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는, 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수와 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
TCR-발현 세포는 샘플로부터 단리되고 다양한 방법에 의해 특정 특성에 의해 선택되는 T 세포일 수 있다. T 세포는, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 세정에 의해, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구 또는 조직으로부터 단리될 수 있다. 조직으로부터 T 세포를 단리할 때(예: 종양 조직에서 종양-침윤 T 세포를 단리할 때), 제조된 조직은 적혈구를 용해시키거나 단핵구를 고갈시키기 전에 세포를 해리시키기 위해 잘게 썰거나 단편화해야 한다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간 동안 DYNABEADS™ M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28(예: 3x28)-접합 비드와 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 한 측면에서, 시간 기간은 약 30분이다. 추가 측면에서, 시간 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위이며 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가 측면에서, 시간 기간은 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간 이상이다. 또 다른 측면에서, 시간 기간은 10 내지 24시간이다. 한 측면에서, 인큐베이션 시간 기간은 약 24시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 적은 임의의 상황에서 T 세포를 단리하는데, 예컨대, 종양 조직 또는 면역타협 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 항-CD3/항-CD28 비드에 결합하도록 하는 시간을 단순히 단축 또는 연장함으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 동안 또는 배양 개시에 대해, 또는 과정 동안 기타 시점에서 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단을 배양 개시 동안 또는 배양 개시 시에 대하여, 또는 기타 원하는 시점에서 선택될 수 있다. 일부 경우에는 여러 선택 라운드가 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 선택 절차가 수행될 수 있고 "선택되지 않은" 세포(항-CD3/항-CD28 비드에 결합할 수 없는 세포)는 활성화 및 확장 과정에서 사용될 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가 선택 라운드를 거칠 수도 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 방법은 음성적으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지향성인 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택일 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 이는 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 전형적으로 발현하는 조절 T 세포를 농축하거나 양성적으로 선택하는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 특정 측면에서, T 조절 세포는 항-C25 접합 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
T 세포 집단은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 분자, 예를 들어, 다른 사이토카인 및 전사 인자, 예컨대, T-bet, Eomes, Tcf1(인간의 TCF7) 중 하나 이상을 발현하는 것이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은, 예를 들어, PCT 공개 번호: WO 2013/126712에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)은 변동될 수 있다. 특정 측면에서, 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피는 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 감소될 수 있다(예: 세포 농도 증가). 예를 들어, 한 측면에서, 20억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 다른 측면에서, 10억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1억개 초과 세포/mL가 사용된다. 추가 측면에서, 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5천만개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 일부 측면에서, 적어도 약 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5천만, 또는 1억개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 일부 측면에서, 적어도 약 1억 2500만 또는 1억 5000만 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(예를 들어, 백혈구, 종양 조직 등)로부터 또는 CD28-음성 T 세포와 같이 관심 있는 세포 표면 마커를 약하게 발현할 수 있는 세포의 보다 효율적인 포착을 허용할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료 가치를 가질 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면, 더 약한 CD28 발현을 가질 수 있는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용할 수 있다.
일부 경우에는 더 낮은 농도의 세포가 사용될 수 있다. T 세포의 혼합물을 현저하게 희석함으로써 입자와 세포 사이의 표면 상호작용을 최소화할 수 있다. 이것은 입자에 결합될 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현할 수 있고 희석된 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포착될 수 있다. 일부 측면에서, 사용되는 세포의 농도는 적어도 약 5×105/mL, 5×106/mL 이상이다. 다른 측면에서, 사용되는 농도는 약 1×105/mL 내지 1×106/mL, 및 이들 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 다른 측면에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전기에서 인큐베이션될 수 있다.
T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 산물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 이러한 정황에서 많은 동결 용액 및 매개변수가 유용할 수 있지만, 사용될 수 있는 1가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반한다. 그런 다음 세포는 -80℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장될 수 있다. 세포는 -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 동결에 의해 동결될 수 있다. 특정 측면에서, 동결보존된 세포는 해동 및 세척되고, 사용 전에 실온에서 1시간 동안 방치된다.
또한, 본 개시내용의 정황에서 세포(예를 들어, TCR-발현 세포)가 요구될 수 있는 시점 이전의 시간 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집 산물의 수집이 고려된다. 일부 경우에, 혈액 샘플 또는 성분채집술이 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 질환의 발병 위험이 있지만 아직 질환이 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해지고, 관심 세포는 이후 사용을 위해 단리 및 동결된다. 특정 측면에서, T 세포는 확장되고, 동결되고, 향후에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기술된 특정 질환의 진단 직후이지만, 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 측면에서, 세포는 작용제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 기타 면역탈격제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 방사선 조사에 의해 치료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 수의 적절한 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리된다.
본 개시내용의 추가 측면에서, T 세포는 대상체에게 기능적 T 세포만을 남기는 치료 직후에 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물 치료 후, 환자가 이 치료로부터 정상적으로 회복될 수 있는 기간 동안의 치료 직후에, 수득되는 T 세포의 품질은 생체외에서 확장하는 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 개시내용의 정황에서는 이 회복 단계 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 기타 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 추가로, 특정 측면에서, 동원(예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법을 사용하여, 특히 치료법 후 정의된 시간 창 동안, 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 유리한 대상체의 조건을 생성할 수 있다. 예시적인 세포 유형으로는 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 기타 세포를 포함한다.
대상체로부터 수득되는 1차 T 세포 외에, TCR-발현 세포는 세포주 T 세포와 같은 세포주 세포일 수 있다. 세포주 T 세포의 예로는, Jurkat, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17 및 HUT 78/H9를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
TCR-발현 세포는 시험관내 배양물로부터 수득되는 T 세포일 수 있다. T 세포는 조직 또는 세포와 접촉함으로써 시험관내에서 활성화되거나 확장될 수 있다. "활성화 및 확장" 섹션을 참조한다. 예를 들어, 환자의 말초 혈액에서 단리된 T 세포는 종양 세포, 종양 조직, 종양구, 종양 용해물-펄스화된 APC 또는 종양 mRNA-적재된 APC와 같은 종양 항원을 제시하는 세포와 공동배양될 수 있다. 종양 항원을 제시하는 세포는 정의된 항원, 정의된 항원 세트 또는 정의되지 않은 항원 세트(예컨대, 종양 용해물 또는 총 종양 mRNA)를 발현하도록 조작되거나 그에 의해 펄스화된 APC일 수 있다. 예를 들어, 정의된 항원을 제시하는 경우, APC는 공지된 서열을 갖는 하나 이상의 짧은 에피토프(예를 들어, 길이가 7 내지 13개 아미노산)를 암호화하는 하나 이상의 미니유전자를 발현할 수 있다. APC는 또한 2개 이상의 에피토프를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터로부터 2개 이상의 미니유전자를 발현할 수 있다. 정의되지 않은 항원을 제시하는 경우, APC는 종양 용해물 또는 전체 종양 mRNA에 의해 펄스화될 수 있다. 종양 항원을 제시하는 세포는 공동배양 전에 방사선조사될 수 있다. 공동배양은 공동 자극 신호 또는 사이토카인을 제공할 수 있는 시약(예: 항-CD28 항체)을 포함하는 배지에서 이루어질 수 있다. 이러한 공동배양은 종양 항원-반응성 T 세포를 자극(예: 활성화) 및/또는 확장할 수 있다. 이들 세포는 본원에 기술된 세포 표면 마커(예를 들어, CD25, CD69, CD137)를 사용하여 선택되거나 농축될 수 있다. 이 방법을 사용하면 환자의 말초 혈액으로부터 종양 항원-반응성 T 세포가 사전-농축될 수 있다. 이러한 사전-농축된 T 세포는 본원에 기술된 방법에서 TCR-발현 세포로서 사용될 수 있다. 사전-농축된 T 세포(예: CD137+)는 공동배양 동안 마커(예: CD137) 발현을 획득한 T 세포를 함유할 수 있으며, 채혈 시 이미 마커를 발현한 T 세포를 함유할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 후자의 집단은 종양 반응성일 수 있다. 이 방법은 기술된 종양-침윤 림프구(TIL)를 단리하는 것보다 쉬운 대안을 제공할 수 있다.
TCR-발현 세포는 종양-침윤 림프구(TIL), 예를 들어 종양-침윤 T 세포일 수 있다. TIL은 암에 걸린 기관에서 분리될 수 있다. 뇌, 심장, 폐, 눈, 위, 췌장, 신장, 간, 장, 자궁, 방광, 피부, 머리카락, 손발톱, 귀, 땀샘, 코, 입, 입술, 비장, 잇몸, 치아, 혀, 침샘, 편도선, 인두, 식도, 대장, 소장, 직장, 항문, 갑상선, 흉선, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 신장낭, 골격 근육, 평활근, 혈관, 혈액, 척수, 기관, 요관, 요도, 시상하부, 뇌하수체, 유문, 부신, 난소, 난관, 자궁, 질, 유선, 고환, 정낭, 음경, 림프, 림프절 또는 림프관일 수 있는 암이 있는 기관으로부터 하나 이상의 세포가 분리될 수 있다. 하나 이상의 TIL은 뇌, 심장, 간, 피부, 장, 폐, 신장, 눈, 소장 또는 췌장에서 유래할 수 있다. TIL은 췌장, 신장, 눈, 간, 소장, 폐 또는 심장에서 유래할 수 있다. 하나 이상의 세포는 췌장 섬 세포, 예를 들어, 췌장 β 세포일 수 있다. 일부 경우에, TIL은 위장관 암에서 유래할 수 있다. TIL 배양물은 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 종양은 비-암성 조직 또는 괴사 영역으로부터 절제될 수 있다. 그 다음, 종양은 약 2-3mm 길이로 단편화될 수 있다. 일부 경우에, 종양은 크기가 약 0.5mm 내지 약 5mm 크기, 약 1mm 내지 약 2mm, 약 2mm 내지 약 3mm, 약 3mm 내지 약 4mm, 또는 약 4mm 내지 약 5mm로 단편화될 수 있다. 그 다음, 종양 단편은 배지 및 사이토카인과 같은 세포 자극제를 활용하여 시험관내에서 배양될 수 있다. 일부 경우에는 IL-2를 활용하여 종양 단편으로부터 TIL을 확장시킬 수 있다. IL-2의 농도는 약 6000 IU/mL일 수 있다. IL-2의 농도는 또한 약 2000 IU/mL, 3000 IU/mL, 4000 IU/mL, 5000 IU/mL, 6000 IU/mL, 7000 IU/mL, 8000 IU/mL, 9000 IU/mL, 또는 최대 약 10000 IU/mL일 수 있다. TIL이 확장되면 종양 반응성을 결정하기 위해 시험관내 검정으로 처리될 수 있다. 예를 들어, TIL은 FAC에서 CD3, CD4, CD8 및 CD58 발현에 대해 평가될 수 있다. TIL은 또한 공동 배양, 세포독성, ELISA 또는 ELISPOT 검정으로 처리될 수 있다. 일부 경우에, TIL 배양물은 동결보존되거나 급속 확장을 겪을 수 있다. TIL과 같은 세포는 태아, 신생아, 청년 및 성인을 포함하나 이에 제한되지 않는 발달 단계의 공여자로부터 단리될 수 있다.
TCR-발현 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 과립구, 호산구, 적혈구, 혈소판, 줄기 세포, iPSC, 중간엽 줄기 세포, 또는 이들로부터 조작된 것일 수 있다. 또한, TCR-발현 세포는 세포주 세포일 수 있다. 세포주는 종양형성 또는 인위적으로 불멸화된 세포주일 수 있다. 세포주의 예로는 CHO-K1 세포, HEK293 세포, Caco2 세포, U2-OS 세포, NIH 3T3 세포, NSO 세포, SP2 세포, CHO-S 세포, DG44 세포, K-562 세포, U-937 세포, MRC5 세포, IMR90 세포, Jurkat 세포, HepG2 세포, HeLa 세포, HT-1080 세포, HCT-116 세포, Hu-h7 세포, Huvec 세포 및 Molt 4 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. TCR-발현 세포는 자가 T 세포 또는 동종 T 세포일 수 있다.
TCR-발현 세포는 조작된 세포일 수 있다. 조작된 세포는 조작된 T 세포일 수 있다. 조작된 세포는 외인성 분자(예: TCR)를 발현할 수 있다. 조작된 세포는 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 조작된 세포는 병태(예를 들어, 암)을 갖는 대상체로부터 수득된 1차 T 세포에 의해 발현되는 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 조작된 세포는 병태를 갖는 대상체의 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 발현하도록 유전자 변형된 1차 세포(예를 들어, 건강한 공여자를 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득되는 1차 T 세포)일 수 있다. 예를 들어, 1차 T 세포는 건강한 공여자로부터 수득될 수 있고, 암 환자의 TCR을 발현하도록 조작될 수 있다. 1차 T 세포는 건강한 공여자의 혈액 샘플에서 단리될 수 있다. 1차 T 세포는 말초 T 세포일 수 있다. 1차 T 세포는 다양한 공급원으로부터 또는 본원에 기술된 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 조작된 세포는 B 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 과립구, 호산구, 적혈구, 혈소판, 줄기 세포, iPSC 및 중간엽 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 대상체로부터 수득되는 다른 유형의 세포일 수 있다. 조작된 세포는 본원에 기술된 세포주 세포일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 세포인 TCR-발현 세포의 라이브러리는 TCR 식별을 위해 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 라이브러리는 합성 라이브러리일 수 있으며, 합성 라이브러리 내의 조작된 세포의 각 세포는 TCR을 외인성으로 발현한다. 조작된 세포에 의해 발현되는 TCR은 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR일 수 있다. 일부 경우에, T 세포와 같은 TCR-발현 세포는 내인성 TCR을 포함할 수 있고, 내인성 TCR은 불활성화(예를 들어, 녹아웃 또는 녹다운)될 수 있다.
대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열은 발현을 위해 세포로 전달될 수 있다. 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 원형 핵산 분자로서 세포 내로 전달되어 조작된 세포를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 전기천공에 의해 세포 내로 전달(예를 들어, 전기천공, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환)될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 양이온성 중합체와 같은 담체에 의해 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 대상체-유래 또는 대상체-특이적 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터는 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 대상체- 유래 또는 대상체-특이적 TCR이 세포에서 발현될 수 있다. TCR은 플라스미드, 트랜스포존(예: Sleeping Beauty, Piggy Bac) 및 바이러스 벡터(예: 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터)와 같은 벡터(또는 발현 벡터)로부터 발현될 수 있다. 벡터의 추가적인 예는 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드 및 발현 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터의 비제한적인 예로는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 및 이들의 변이체를 포함한다. 추가로, 벡터는 추가적인 발현 제어 서열(예를 들어, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택가능한 마커 서열(예를 들어, 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 세포에 도입된 경우, 핵산 분자이며, 이로써 형질전환된 세포(예: 조작된 세포)를 생성한다. 벡터는 복제 기점과 같이 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 기타 유전자 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 TCR의 발현을 가능하게 하는 서열에 작동가능하게 연결된 본 개시내용에 따른 쌍을 이룬 TCR-암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터 포함), 복제 적격, 복제 결핍 및 실질이 없는(gutless) 형태를 비롯한 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV -40) 벡터, 소 유두종 벡터, 엡스타인-바 벡터, 헤르페스 벡터, 백시니아 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 벡터, 하비 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유선 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터 및 비-바이러스성 플라스미드일 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 자가-복제성 (m)RNA, 자가-복제 (m)RNA, 자가-증폭성 (m)RNA, 또는 RNA 레플리콘이라고도 하는 자가-증폭성 RNA 레플리콘이다. 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 자신을 복제할 수 있는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 세포 내부에서 스스로 복제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 RNA 폴리머라제 및 관심 분자를 암호화한다. RNA 중합효소는 RNA-의존적 RNA 중합효소(RDRP 또는 RdRp)일 수 있다. 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 또한 프로테아제 또는 RNA 캡핑 효소를 암호화할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘 벡터는 동부 말 뇌염 바이러스(EEE), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 에버글레이즈 바이러스, 무캄보 바이러스, 픽수나 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스(WEE), 신드비스 바이러스, 남아프리카 아르보바이러스 86번, 셈리키 포레스트 바이러스, 미들버그 바이러스, 치쿤군야 바이러스, 오녕-녕 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바마 포레스트 바이러스, 게타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 우나 바이러스, 아우라 바이러스, 와타로아 바이러스, 바반키 바이러스, 키질라가흐 바이러스, 하이랜즈 J 바이러스, 포트 모르간 바이러스, 엔두무 바이러스, 버기 크릭 바이러스 및 국제 바이러스 분류 위원회(ICTV)에서 알파바이러스로서 분류된 기타 다른 바이러스를 포함할 수 있는 알파바이러스로 알려진 바이러스의 토가비리대 과의 것이거나 그로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 VEE TC-83 백신 균주와 같이 알파바이러스의 약독화된 형태로부터의 부분이거나 이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘 벡터는 세포에 대한 세포변성 또는 아폽토시스 효과 없이 관심 분자의 발현을 가능하게 하는 바이러스의 약독화 형태이다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘 벡터는 숙주 세포, 표적 세포, 또는 유기체에서 특정 기능(예를 들어, 장기적인 또는 증가된 TCR 발현)에 대해 시험관내, 생체내, 생체외, 또는 인실리카(in silica)에서 조작되거나 선택되었다. 예를 들어, 자가-증폭성 RNA 레플리콘의 상이한 변이체를 수용하는 숙주 세포 집단은 상이한 시점에서 하나 이상의 관심 분자(자가-증폭성 RNA 레플리콘 또는 숙주 게놈에서 암호화됨)의 발현 수준에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택되거나 조작된 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 숙주 세포, 표적 세포, 또는 유기체에서 더 오래 지속하거나 또는 더 높은 수준으로 발현하는 RNA 레플리콘의 단백질 발현을 초래하는 숙주 세포 또는 유기체로부터의 I형 인터페론 반응, 선천적 항바이러스 반응, 또는 적응 면역 반응을 감소시키기 위해 변형되었다. 일부 실시양태에서, 이러한 최적화된 자가-증폭성 RNA 레플리콘 서열은 원하는 표현형 형질(예를 들어, 관심 분자의 더 높거나 더 지속적인 발현, 또는 야생형 균주 또는 백신 균주에 비해 벡터에 대한 감소된 선천적 항바이러스 면역 반응)을 갖는 개별 세포 또는 세포 집단으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 원하는 또는 선택된 자가-증폭성 RNA 레플리콘 서열을 보유하는 세포는 자가-증폭성 RNA 레플리콘을 포함하는 치료제로 치료된 후, 유익한 반응 특성을 갖는 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물)(예를 들어, 엘리트 응답자 또는 완전 관해 대상체)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘 벡터는 추가 작용제를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 작용제는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-10, GM-CSF, TNF 알파, 그랜자임 B 또는 이들의 조합과 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 작용제는 TCR의 발현에 직접적으로 영향을 미치거나 숙주 세포 표현형을 조절함으로써(예를 들어, 아폽토시스 또는 확장을 유도함으로써), TCR의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가-증폭성 RNA 레플리콘은 하나 이상의 하위게놈성 폴리뉴클레오타이드(들)를 생성하기 위해, 하나 이상의 하위게놈 서열(들)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하위-게놈 폴리뉴클레오타이드는 세포 해독 기구에 의한 해독을 위한 기능성 mRNA 분자로서 작용한다. 하위게놈 폴리뉴클레오타이드는 중합효소가 하위게놈 서열로부터 하위게놈 폴리뉴클레오타이드를 생성하도록 유도하는 자가-증폭성 RNA 레플리콘에서 정해진 서열 요소(예를 들어, 하위게놈 프로모터 또는 SGP)의 기능을 통해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, SGP는 RNA-의존성 RNA 중합효소(RDRP 또는 RdRp)에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 다중 SGP 서열은 단일 자가-증폭성 RNA 레플리콘 상에 존재하고 TCR, TCR의 구성요소 또는 추가 작용제를 암호화하는 하위게놈 서열의 상류에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, SGP 서열의 뉴클레오타이드 길이 또는 조성은 하위게놈 폴리뉴클레오타이드의 발현 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일하지 않은 SGP 서열은 상응하는 하위게놈 폴리뉴클레오타이드의 비율이, SGP 서열이 동일한 경우와 상이하도록 자가-증폭성 RNA 레플리콘 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 동일하지 않은 SGP 서열은 TCR의 증가된 발현, 표적 세포 또는 숙주에 대한 세포독성 효과 없이 표적 세포의 증가된 또는 더 빠른 확장을 유도하거나, RNA 레플리콘에 대해 선천적 또는 적응 면역 반응을 약화시키는 서로에 대한 상대적인 비율로 생성되도록 TCR 및 추가 작용제(예를 들어, 사이토카인)의 생성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 하위게놈 서열 및 SGP 서열의 서로에 상대적인 위치 및 게놈 서열 자체는 서로에 상대적인 하위게놈 폴리뉴클레오타이드의 비율을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SGP 및 TCR을 암호화하는 하위게놈 서열은 TCR의 발현이 추가 작용제에 비해 실질적으로 증가되도록 SGP 및 추가 작용제를 암호화하는 하위게놈 영역의 하류에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 레플리콘 또는 SGP는 사이토카인이 T 세포의 확장을 촉진하거나 TCR의 치료 효과를 증대시키지만 사이토카인 방출 증후군, 사이토카인 폭풍, 또는 신경학적 독성과 같은 심한 부작용을 일으키지 않도록 사이토카인의 최적량을 발현하도록 선택되거나 조작되었다.
본원에 기술된 다양한 벡터는 숙주 세포 내로 본 개시내용에 개시된 다른 관심 유전자(예를 들어, MHC 분자를 암호화하는 핵산)를 전달하거나 도입하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬을 암호화하는 쌍을 이룬 TCR-암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, TCRγ 사슬 및 TCRδ 사슬을 암호화하는 쌍을 이룬 TCR-암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자가-증폭성 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 유사형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노막대, 리포좀, 미셀, 미세기포, 세포-투과성 펩타이드 또는 지방구로 제형화될 수 있다.
2개의 TCR 사슬의 발현은 2개의 프로모터 또는 1개의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일부 경우에, 2개의 프로모터가 사용된다. 일부 경우에, 2개의 프로모터는 2개의 사슬에 대한 각각의 단백질-암호 서열과 함께, 머리-머리, 머리-꼬리 또는 꼬리-꼬리 배향으로 배열될 수 있다. 일부 경우에, 하나의 프로모터가 사용된다. 2개의 단백질-암호 서열은 1개의 프로모터가 2개의 사슬을 발현하는 데 사용될 수 있도록, 선택적으로 프레임에 맞게, 연결될 수 있다. 그리고 그러한 경우에, 2개의 단백질-암호 서열은 머리-꼬리 배향으로 배열될 수 있고 리보솜 결합 부위(예를 들어, 내부 리보솜 결합 부위 또는 IRES), 프로테아제 절단 부위 또는 자가-프로세싱 절단 부위(예컨대, 2A 펩타이드를 암호화하는 서열)와 연결되어 이중시스트론 발현을 용이하게 할 수 있다. 일부 경우에, 2개의 사슬은 펩타이드 링커에 의해 연결되어, 2개의 사슬이 단일-사슬 폴리펩타이드로서 발현될 수 있도록 할 수 있다. 각각 발현된 사슬은 재배열된 V(D)J 유전자를 포함하는 완전 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 각각 발현된 사슬은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 완전 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 각각 발현된 사슬은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함하는 완전 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 각각 발현된 사슬은 불변 도메인 서열을 추가로 함유할 수 있다.
발현 벡터를 생성하기 위해, TCR과 같은 관심 유전자를 암호화하는 서열에 추가 서열이 첨가될 수 있다. 이러한 추가 서열은 벡터 백본(예를 들어, 표적 세포 또는 E.콜라이와 같은 임시 숙주에서 벡터의 복제를 위한 요소), 프로모터, IRES, 자가-절단 펩타이드를 암호화하는 서열, 종결인자, 보조 유전자(예컨대, 페이로드), 뿐만 아니라 쌍을 이룬 TCR-암호화 폴리뉴클레오타이드의 부분 서열(예컨대, 불변 도메인을 암호화하는 서열의 일부)을 포함할 수 있다.
프로테아제 절단 부위는 엔테로키나아제 절단 부위: (Asp)4Lys; Xa 인자 절단 부위: Ile-Glu-Gly-Arg; 트롬빈 절단 부위, 예를 들어 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser; 레닌 절단 부위, 예를 들어 His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His; 콜라게나아제 절단 부위, 예를 들어 X-Gly-Pro(여기서, X는 임의의 아미노산임); 트립신 절단 부위, 예를 들어, Arg-Lys; 피코나바이러스로부터의 프로테아제 2A 절단 부위, A형 간염 바이러스 3C 절단 부위, 인간 라이노바이러스 2A 프로테아제 절단 부위, 피코나바이러스 3 프로테아제 절단 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바이러스 2A 또는 3C 프로테아제 절단 부위와 같은 바이러스 프로테아제 절단 부위; 및 카스파제 프로테아제 절단 부위, 예를 들어 활성화된 카스파제-3에 의해 인식되고 절단되는 DEVD로서, 여기서 절단은 두 번째 아스파르트산 잔기 이후에 발생하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 프로테아제 절단 부위를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 여기서 프로테아제 절단 부위는 세포 프로테아제 절단 부위 또는 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질 절단 부위는 푸린; IPNV의 VP4; 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제; 라이노바이러스의 3C 프로테아제; PC5/6 프로테아제; PACE 프로테아제, LPC/PC7 프로테아제; 엔테로키나아제; Xa 인자 프로테아제; 트롬빈; 제네나아제 I; MMP 프로테아제; 순무모자이크 포티바이러스의 핵 내포 단백질 a(N1a); 뎅기열 4형 플라비바이러스의 NS2B/NS3, 황열병 바이러스의 NS3 프로테아제; 콜리플라워 모자이크 바이러스의 ORF V; KEX2 프로테아제; CB2; 또는 2A에 의해 인식되는 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 절단 부위는 바이러스의 내부적으로 절단 가능한 신호 펩타이드 절단 부위이다. 일부 실시양태에서, 바이러스의 내부적으로 절단 가능한 신호 펩타이드 절단 부위는 C형 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스, 한타바이러스, 플라비바이러스 또는 풍진 바이러스로부터의 부위를 포함한다.
본 개시내용의 벡터에 포함되기에 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜과 체결할 수 있는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRES 요소는 적어도 약 250개의 염기쌍, 적어도 약 350개의 염기쌍, 또는 적어도 약 500개의 염기쌍이다. 본 개시내용의 IRES 요소는 바이러스, 포유동물 및 초파리를 포함하나 이에 제한되지 않는 유기체의 DNA로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, IRES 요소가 유래되는 바이러스 DNA로는 피코나바이러스 상보성 DNA(cDNA), 뇌심근염 바이러스(EMCV) cDNA 및 폴리오바이러스 cDNA를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. IRES 요소가 유래되는 포유동물 DNA의 예로는 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP)을 암호화하는 DNA 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 암호화하는 DNA를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. IRES 요소가 유래되는 초파리 DNA의 예로는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 유래의 안텐나페디아(Antennapedia) 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리오바이러스 IRES 요소의 추가 예로는, 예를 들어, 폴리오바이러스 IRES, 뇌심근염 바이러스 IRES 또는 A형 간염 바이러스 IRES를 포함한다. 플라비바이러스 IRES 요소의 예로는 C형 간염 바이러스 IRES, GB B형 바이러스 IRES, 또는 소 바이러스성 설사 바이러스 IRES 또는 고전적 돼지 열병 바이러스 IRES를 포함하나 이에 제한되지 않는 페스티바이러스 IRES를 포함한다.
자가-프로세싱 절단 부위의 예로는 인테인 서열; 변형된 인테인; 고슴도치 서열; 기타 돼지과 서열; 2A 서열, 예를 들어 구제역 바이러스(FMDV)로부터 유래된 2A 서열; 및 각각에 대한 변형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 유전자 발현(예를 들어, TCR 발현)을 위한 벡터는 임의의 수의 프로모터를 포함할 수 있으며, 여기서 프로모터는 구성적, 조절가능 또는 유도가능, 세포 유형 특이적, 조직-특이적 또는 종 특이적이다. 추가 예로는 테트라사이클린-반응성 프로모터를 포함한다. 벡터는 TCR이 발현되어야 하는 숙주 세포에 적응된 레플리콘일 수 있고, 예를 들어 에세리치아 콜라이와 같은 박테리아 세포에서도 기능적인 레플리콘을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있으며, 여기서 유도는 예를 들어 특정 세포 유형 또는 특정 수준의 성숙과 연관이 있다. 대안적으로, 다수의 바이러스 프로모터가 적합할 수 있다. 프로모터의 예는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 신장 인자 1A(EF-1A) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 및 프렌드(Friend) 비장 병소-형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 연관되거나 연관되지 않을 수 있으며, 여기서 인핸서는 특정 프로모터와 자연스럽게 연관되거나, 또는 다른 프로모터와 연관될 수 있다.
포유동물 세포에서 사용되는 프로모터는 구성적(헤르페스 바이러스 TK 프로모터; SV40 초기 프로모터; 라우스 육종 바이러스 프로모터; 사이토메갈로바이러스 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터)이거나 조절(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)될 수 있다. 벡터는 특정 포유류 세포를 감염시키는 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스, 백시니아 및 아데노바이러스 및 이들의 파생물을 기반으로 할 수 있다. 프로모터는 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스 후기 및 백시니아 7.5K 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 에놀라제는 구성적 효모 프로모터의 예이고, 알코올 탈수소효소는 조절된 프로모터의 예이다. 특정 프로모터, 전사 종결 서열 및 기타 선택적 서열, 예컨대, 조직 특이적 서열을 암호화하는 서열의 선택은 발현이 수행되는 세포의 유형에 의해 결정될 수 있다.
TCR-발현 벡터로부터 발현된 TCR은 자연 형태일 수 있거나 조작된 형태일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 형태는 단일 사슬 TCR 단편이다. 일부 경우에, 조작된 형태는 TCR-CAR이다. 기존의 방법은 또한 이러한 조작된 형태의 TCR을 발현하는 TCR-발현 벡터를 생성하기 위해, 쌍을 이룬 TCR-암호화 폴리뉴클레오타이드에 기능성 서열(예를 들어, 링커, CD28 TM 도메인)을 도입시키는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, TCR 복합체의 하나 이상의 추가 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 전달되어 조작된 세포를 생성할 수 있다. 하나 이상의 추가 서브유닛은 CD3 입실론, CD3 베타, CD3 감마, CD3 제타 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
활성화 및 확장
TCR-발현 세포는 T 세포일 수 있다. T 세포는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하기 위해 T 세포 표면의 공동자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 작용제와의 접촉에 의해 확장되거나 자극될 수 있다. 활성화 및/또는 확장은 TCR-발현 세포를 항원 제시 세포(예를 들어, 본원에 기술된 암 세포주)와 접촉시키기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 이오노포어 A23187, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 분열촉진 렉틴과 같은 화학물질은 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예: 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 시험관내에서 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 부속 분자의 공동자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉할 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 작용제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 추가 실시양태에서, T 세포와 같은 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드와 세포는 후속적으로 분리된 다음, 세포가 배양된다. 대안적인 실시양태에서, 배양 전에 작용제-코팅된 비드와 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존력에 필수적인 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 1640 또는 X-vivo 5, (Lonza))를 포함할 수 있다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있고, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 추가되고, 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된다. 표적 세포는, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)와 같은 성장을 지원하는 데 필수적인 조건 하에서 유지될 수 있다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 다른 특성을 나타낼 수 있다. T 세포는 조직 또는 세포와의 공동배양에 의해 활성화되거나 확장될 수 있다. T 세포를 활성화하는 데 사용되는 세포는 APC 또는 인공 APC(aAPC)일 수 있다.
일부 경우에, T 세포의 자극은 항원 및 방사선조사된 조직적합성 APC, 예컨대 피더 PBMC에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 PHA 및 동종 피더 세포와 같은 비특이적 미토겐을 사용하여 성장될 수 있다. 피더 PBMC는 40Gy로 방사선조사될 수 있다. 피더 PBMC는 약 10Gy 내지 약 15Gy, 약 15Gy 내지 약 20Gy, 약 20Gy 내지 약 25Gy, 약 25Gy 내지 약 30Gy, 약 30Gy 내지 약 35Gy, 약 35Gy 내지 약 40Gy, 약 40Gy 내지 약 45Gy, 약 45Gy 내지 약 50Gy로 방사선조사될 수 있다. 일부 경우에, 방사선조사된 피더 세포의 대조용 플라스크만은 항-CD3 및 IL-2에 의해 자극될 수 있다.
항원
본원에 기술된 암 세포주는 항원을 포함할(예를 들어, 발현할 또는 나타낼) 수 있다. 항원은 표적 항원일 수 있다. 항원은 종양 항원일 수 있다. 항원은 암 세포주에 대한 내인성 항원일 수 있다. 항원은 암세포가 발현하는 항원과 동일하거나 상이할 수 있다. 암 세포주는 적어도 약 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 내인성 항원을 포함(예를 들어, 발현)할 수 있다. 암 세포주는 내인성 항원을 나타낼 수 있다. 일부 경우에 암 세포주는 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 외인성 MHC는 치료가 필요한 대상체로부터 유래될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 항원-제시 세포(APC)는 항원을 포함할 수 있다. 항원은 APC에 대한 내인성 항원일 수 있다. APC는 적어도 약 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 내인성 항원을 포함(예를 들어, 발현)할 수 있다. APC는 자가 APC일 수 있다.
본원에 기술된 암 세포주의 항원 또는 내인성 항원은 종양-특이적 항원, 종양-연관 항원, 종양 상의 배아 항원, 종양-특이적 막 항원, 종양-연관 막 항원, 성장 인자 수용체, 성장 인자 리간드 또는 암과 연관된 임의의 다른 유형의 항원을 포함할 수 있다. 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA)일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "TSA"는 종양 세포에 고유하고 체내의 다른 세포에서 발생하지 않는 항원을 지칭한다. 종양 항원은 종양-연관 항원(TAA)일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "TAA"는 종양 세포에 고유하지 않고 정상 세포에서도 발현되는 항원을 지칭한다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있도록 하는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 종양 세포에서 훨씬 높은 수준으로 발현될 수 있다. TAA는 환자의 종양 세포를 시퀀싱하고 종양에서만 발견되는 돌연변이된 단백질을 식별하여 결정할 수 있다. 이러한 항원은 "신항원"이라고 한다. 종양 항원은 상피암 항원, 전립선 특이적 암 항원(PSA) 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 방광암 항원, 폐암 항원, 결장암 항원, 난소암 항원, 뇌암 항원, 위암 항원, 신장 세포 암종 항원, 췌장암 항원, 간암 항원, 식도암 항원, 두경부암 항원, 결장직장암 항원, 림프종항원, B세포 림프종암 항원, 백혈병 항원, 골수종 항원, 급성 림프모구성 백혈병 항원, 만성 골수성 백혈병 항원, 또는 급성 골수성 백혈병 항원일 수 있다. 항원의 예로는 1GH-IGK, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 9D7, 아사이클로필린 C-연관 단백질, 알파-태아단백질(AFP), α-악티닌-4, A3, A33 항체에 특이적인 항원, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, BCR-ABL, 베타-카테닌, 베타-HCG, BrE3-항원, BCA225, BING-4, BRCA1/2, BTAA, CA125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA195, CA242, CA-50, 칼슘 활성화된 염화물 채널 2, CAGE, CAM43, CAMEL, CAP-1, 탄산 탈수효소 IX, c-Met, CA19-9, CA72-4, CAM 17.1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD68, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK4, CDK4m, CDKN2A, CML6/6, CO-029, CTLA4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, 사이클린 B, HIF-1a, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAMS), CEACAM6, c-Met, DAM, E2A-PRL, EGFR, EGFRvIII, EGP-1(TROP-2), EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, EphA3, 섬유아세포 성장 인자(FGF), FGF-5, 피브로넥틴, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, Ga733VEpCAM, GAGE, gp100, GRO-β, H4-RET, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) 및 이의 서브유닛, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자(HIF-1), HSP70-2M, HST-2, HTgp-175, Ia, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-λ, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, 미성숙 라미닌 수용체, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), KC4-항원, KSA, KS-1-항원, KS1-4, LAGE-1a, Le-Y, LDR/FUT, M344, MA-50, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MART-1, MART-2, TRAG-3, MC1R, mCRP, MCP-1, 메조텔린, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MG7-Ag, MOV18, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUCSac, MUC13, MUC16, MUM-1/2, MUM-3, MYL-RAR, NB/70K, Nm23H1, NuMA, NCA66, NCA95, NCA90, NY-ESO-1, P 폴리펩타이드, p15, p16, p53, p185erbB2, p180erbB3, PAM4 항원, 췌장암 뮤신, PD1 수용체 (PD-1), PD-1 수용체 리간드 1(PD-L1), PD-1 수용체 리간드 2(PD-L2), PI5, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, Pme117 전립선산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RCAS1, RS5, RAGE, RANTES, Ras, T101, SAGE, SAP-1, 5100, SSX-2, 서바이빈, 서바이빈-2B, SDDCAG16, TA-90＼Mac2 결합 단백질, TAAL6, TAC, TAG-72, TGF-βRII, Ig TCR, TLP, 텔로머라제, 테나신, TRAIL 수용체, TRP-1, TRP-2, TSP-180, TNF-α, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히(Thomson-Friedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, 티로시나제, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, XAGE, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관신생 마커, bc1-2, bc1-6, 및 K-ras, 종양유전자 마커 및 종양유전자 산물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에 암 세포주에 의해 제시된 내인성 항원은 충분히 연구되어 있지 않을 수 있거나, 알려져 있지 않을 수 있다. 내인성 항원의 정체 또는 서열은, 예를 들어, 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다.
암 세포주
본원에 기술된 암 세포주는 포유동물 암 세포주(예를 들어, 인간 암 세포주)일 수 있다. 암 세포주는 종양이 있는 인간 대상체로부터 수득된 샘플로부터 유래될 수 있다. 샘플은 본원에 기술된 다양한 샘플일 수 있다. 샘플은 액체 샘플 또는 고형 조직 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절(예: 편도선), 갑상선, 흉선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도 또는 위로부터의 조직일 수 있다. 추가적인 비제한적 공급원으로는 골수, 제대혈, 감염 부위의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 다양한 실시양태에서 TCR 식별에 사용되는 항원 제시 세포(APC)는 암 세포주일 수 있다.
암 세포주는 암 환자와 같은 대상체로부터 유래된 하나 이상의 MHC 분자를 외인성으로 발현하도록 조작되거나 개인화될 수 있다. 이러한 MHC 분자는 대상체-유래 또는 대상체-특이적 MHC 분자로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 대상체(예를 들어, TCR이 수득된 것과 동일한 대상체)로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 외인성으로 발현할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 암 세포주는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 MHC 분자(예를 들어, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 이들의 조합)를 외인성으로 발현할 수 있다. 암 세포주는 대상체로부터 유래되거나 대상체에서 식별된 모든 MHC 분자 또는 이의 하위집합을 외인성으로 발현할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파 및 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)일 수 있다. 선택적으로, 동종반응성으로 인한 T 세포 또는 TCR 활성화의 기회를 감소시키기 위해 세포주의 내인성 MHC의 발현은 감소시키거나 없앨 수 있다. 내인성 클래스 I 및/또는 클래스 II MHC 발현 수준이 감소되거나 없어진 암 세포주는 MHC-결손(또는 HLA-결손) 암 세포주라고 불릴 수 있다. 암 세포주(MHC-결손 여부에 관계없이)가 하나 이상의 외인성 MHC 유전자(예: B2M-MHC-I-알파 융합체)를 발현하는 경우, MHC-조작된 암 세포주라고 불릴 수 있다. MHC-조작된 암 세포주가 대상체(예를 들어, 환자 또는 암과 같은 병태를 가진 대상체)로부터 유래된 하나 이상의 MHC 유전자를 발현한다면, 이는 MHC-개인화된 암 세포주라고 불릴 수 있다. MHC-개인화된 암 세포주는 대상체로부터 유래된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 MHC 유전자를 발현할 수 있다. 외인성 MHC 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열은 예를 들어 암 세포주로 전달될 수 있다. 본 개시내용에 기술된 다양한 전달 방법 또는 다양한 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, TCR-발현 벡터를 작제하기 위해 사용되는 전달 방법 또는 벡터는 MHC 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 트랜스포존(예: Sleeping Beauty, Piggy Bac), 또는 바이러스 벡터(예: 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터)일 수 있다. 외인성 MHC 분자는 암 세포주에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있다. 일부 경우에, 외인성 MHC 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 전기천공에 의해 암 세포주로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 양이온성 중합체와 같은 담체에 의해 암 세포주로 전달될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예를 들어, 외인성 MHC 분자를 암호화하는 mRNA 서열과 같은 RNA는 전기천공에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 외인성 MHC 분자는 플라스미드, 트랜스포존(예를 들어, Sleeping Beauty, Piggy Bac) 및 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터)와 같은 벡터로부터 발현될 수 있다. 벡터의 추가적인 예로는 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드 및 발현 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터의 비제한적인 예로는 pUC, pBR322, pET, pBluescript 및 이들의 변이체를 포함한다. 추가로, 벡터는 추가적인 발현 제어 서열(예를 들어, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택가능한 마커 서열(예를 들어, 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에는, 대상체로부터 유래된 2개 이상의 MHC 유전자를 암호화하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 서열의 혼합물이 암 세포주로 전달(예를 들어, 전기천공, 형질감염 또는 형질도입)될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 자가-증폭성 RNA 레플리콘이다.
암 세포주는 내인성 항원을 발현할 수 있다. 내인성 항원은 본원에 기술된 종양 항원, 예를 들어, 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원일 수 있다. 암 세포주는 외인성 항원을 발현하지 않거나, 외인성 항원을 제시하지 않을 수 있다. 내인성 항원은 암 세포주의 내인성 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 내인성 항원은 암 세포주의 게놈으로부터 전사되는 내인성 mRNA로부터의 단백질 산물일 수 있다.
본원에 기술된 암 세포주는 다양한 조직으로부터 유래될 수 있다. 암 세포주는 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 두경부암, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 연조직 육종 및 위암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 암 또는 종양 유형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 부신피질 암종(ACC), 방광 요로상피 암종(BLCA), 유방 침습성 암종(BRCA), 자궁경부 편평 세포 암종 및 내경부 선암종(CESC), 담관암종(CHOL), 결장 선암종(COAD), 직장 선암종(READ), 결장직장 선암종(COADREAD), 림프성 신생물 미만성 거대 B세포 림프종(DLBC), 식도 암종(ESCA), 다형성 교모세포종(GBM), 뇌 저등급 신경교종(LGG), 두경부 편평 세포 암종(HNSC), 신장 투명 신세포 암종(KIRC), 신장 유두 신세포 암종(KIRP), 급성 골수성 백혈병(LAML), 만성 골수성 백혈병(LCML), 간 간세포 암종(LIHC), 폐 선암종(LUAD), 폐 편평 세포 암종(LUSC), 중피종(MESO), 난소 장액성 낭선암종(OV), 췌장 선암종(PAAD), 갈색 세포종 및 부신경절종(PCPG), 전립선 선암종(PRAD), 육종(SARC), 피부 피부 흑색종(SKCM), 위 선암종(STAD), 고환 생식 세포 종양(TGCT), 흉선종(THYM), 갑상선 암종(THCA), 자궁 암육종(UCS), 자궁체 자궁내막 암종(UCEC) 또는 포도막 흑색종(UVM)으로부터 유래될 수 있다.
암 세포주는 다양한 유형의 세포주일 수 있다. 암 세포주는 대상체가 가지고 있는 암에 따라 선택될 수 있다. 선택된 암 세포주는 이후 본원에 기술된 바와 같이 항원-반응성 T 세포 또는 TCR을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 암 세포주는 BLCA로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 RT4, CAL29, RT112, SW780 또는 KMBA2일 수 있다. 암 세포주는 BRCA로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 BT483, HCC1500, ZR7530, HCC38 또는 HCC1143일 수 있다. 암 세포주는 CHOL에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 SNU1079, SNU478, SNU869, SNU245 또는 HUCCT1일 수 있다. 암 세포주는 COADREAD에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 SW837, CL34, HCC56, HT55 또는 LS411N일 수 있다. 암 세포주는 DLBC에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 CI1, RI1, DOHH2, WSUDLCL2 또는 SUDHL6일 수 있다. 암 세포주는 ESCA로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 OE21, TE11, TE9, OE19 또는 OE33일 수 있다. 암 세포주는 GBM으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 SNU201, SNU626, CAS1, SNU489 또는 YKG1일 수 있다. 암 세포주는 HNSC로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 SCC15, BICR16, SNU1214, SCC25 또는 BICR31일 수 있다. 암 세포주는 KIRC에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 KMRC20, KMRC3, VMRCRCZ, CAL54 또는 RCC10RGB일 수 있다. 암 세포주는 LAML에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 KASUMI6, KG1, GDM1, OCIAML5 또는 ME1일 수 있다. 암 세포주는 LGG로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 H4, NMCG1, TM31, SW1088 또는 HS683일 수 있다. 암 세포주는 LIHC에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 HEPG2, JHH5, HUH7, HUH1 또는 HEP3B217일 수 있다. 암 세포주는 LUAD에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 NCIH3255, HCC2935, NCIH1734, RERFLCAD1 또는 HCC4006일 수 있다. 암 세포주는 LUSC에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 SW900, NCIH2170, HCC95, LUDLU1 또는 KNS62일 수 있다. 암 세포주는 MESO로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 ISTMES2, JL1, ISTMES1, NCIH2452 또는 MPP89일 수 있다. 암 세포주는 OV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 CAOV4, KURAMOCHI, COV362, OVSAHO 또는 JHOS4일 수 있다. 암 세포주는 PAAD에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 PATU8988S, CAPAN1, TCCPAN2, PANC0504 또는 PANC0327일 수 있다. 암 세포주는 PRAD에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 VCAP, MDAPCA2B, LNCAPCLONEFGC, DU145, 또는 22RV1일 수 있다. 암 세포주는 SKCM으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 HS939T, MALME3M, UACC257, HS944T 또는 RPMI7951일 수 있다. 암 세포주는 STAD로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 HUG1N, SNU620, SNU16, SNU601 또는 GSU일 수 있다. 암 세포주는 THCA에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 ML1, BCPAP, FTC133, 8305C 또는 8505C일 수 있다. 암 세포주는 UCEC에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 암 세포주는 MFE280, KLE, RL952, JHUEM3 또는 EFE184일 수 있다.
본원에 기술된 암 세포주의 추가 예로는 253J, 253JBV, 5637, 639V, 647V, BC3C, BFTC905, CAL29, HS172T, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, KMBC2, KU1919, RT112, RT4, SCABER, SW1710, SW780, T24, TCCSUP, UBLC1, UMUC1, UMUC3, VMCUB1 또는 기타 BLCA에서 유래된 암 세포주 유형; AU565, BT20, BT474, BT483, BT549, CAL120, CAL148, CAL51, CAL851, CAMA1, DU4475, EFM19, EFM192A, HCC1143, HCC1187, HCC1395, HCC1419, HCC1428, HCC1500, HCC1569, HCC1599, HCC1806, HCC1937, HCC1954, HCC202, HCC2157, HCC2218, HCC38, HCC70, HDQP1, HMC18, HS281T, HS343T, HS578T, HS606T, HS739T, HS742T, JIMT1, KPL1, MCF7, MDAMB134VI, MDAMB157, MDAMB175VII, MDAMB231, MDAMB361, MDAMB415, MDAMB436, MDAMB453, MDAMB468, SKBR3, T47D, UACC812, UACC893, ZR751, ZR7530 또는 기타 BRCA 유래의 암 세포주 유형; HUCCT1, SNU1079, SNU1196, SNU245, SNU308, SNU478, SNU869 또는 기타 CHOL 유래의 암 세포주 유형; C2BBE1, CCK81, CL11, CL14, CL34, CL40, COLO201, COLO320, COLO678, CW2, GP2D, HCC56, HCT116, HCT15, HS255T, HS675T, HS698T, HT115, HT29, HT55, KM12, LOVO, LS1034, LS123, LS180, LS411N, LS513, MDST8, NCIH508, NCIH716, NCIH747, OUMS23, RCM1, RKO, SKCO1, SNU1033, SNU1040, SNU1197, SNU175, SNU407, SNU503, SNU61, SNU81, SNUC1, SNUC2A, SNUC4, SNUC5, SW1116, SW1417, SW1463, SW403, SW48, SW480, SW620, SW837, SW948, T84 또는 기타 COADREAD 유래의 암 세포주 유형; A3KAW, A4FUK, CI1, DB, DOHH2, HT, KARPAS422, MC116, NUDHL1, NUDUL1, OCILY19, PFEIFFER, RI1, RL, SUDHL10, SUDHL4, SUDHL5, SUDHL6, SUDHL8, TOLEDO, U937, WSUDLCL2 또는 기타 DLBC 유래의 암 세포주 유형; COLO680N, ECGI10, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE270, KYSE30, KYSE410, KYSE450, KYSE510, KYSE520, KYSE70, OE19, OE21, OE33, TE1, TE10, TE11, TE14, TE15, TE4, TE5, TE6, TE8, TE9, 또는 기타 ESCA 유래의 암 세포주 유형; 42MGBA, 8MGBA, A172, AM38, CAS1, CCFSTTG1, DBTRG05MG, DKMG, GAMG, GB1, GMS10, GOS3, KALS1, KG1C, KNS42, KNS60, KNS81, KS1, LN18, LN229, M059K, SF126, SF295, SNU1105, SNU201, SNU466, SNU489, SNU626, T98G, U118MG, U251MG, U87MG, YH13, YKG1 또는 기타 GBM 유래의 암 세포주 유형; A253, BHY, BICR16, BICR18, BICR22, BICR31, BICR56, BICR6, CAL27, CAL33, FADU, HS840T, HSC2, HSC3, HSC4, PECAPJ15, PECAPJ49, SCC15, SCC25, SCC4, SCC9, SNU1041, SNU1066, SNU1076, SNU1214, SNU899, YD10B, YD15, YD38, YD8 또는 기타 HNSC 유래의 암 세포주 유형; 769P, 786O, A498, A704, ACHN, CAKI1, CAKI2, CAL54, KMRC1, KMRC2, KMRC20, KMRC3, OSRC2, RCC10RGB, SNU1272, SNU349, VMRCRCZ 또는 기타 KIRC 유래의 암 세포주 유형; AML193, EOL1, F36P, GDM1, HEL, HEL9217, HL60, KASUMI1, KASUMI6, KG1, M07E, ME1, MOLM13, MOLM16, MONOMAC1, MONOMAC6, MV411, NB4, NOMO1, OCIAML2, OCIAML3, OCIAML5, OCIM1, P31FUJ, PL21, SIGM5, SKM1, TF1, THP1 또는 기타 LAML 유래의 암 세포주 유형; GI1, H4, HS683, NMCG1, SNU738, SW1088, SW1783, TM31 또는 기타 LGG 유래의 암 세포주 유형; HEP3B217, HEPG2, HLF, HUH1, HUH6, HUH7, JHH1, JHH2, JHH4, JHH5, JHH6, JHH7, LI7, NCIH684, PLCPRF5, SKHEP1, SNU182, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449, SNU475, SNU761, SNU878, SNU886 또는 기타 LIHC 유래의 암 세포주 유형; A549, ABC1, CAL12T, CALU3, CORL105, DV90, HCC1171, HCC1833, HCC2108, HCC2279, HCC2935, HCC4006, HCC44, HCC78, HCC827, HS229T, HS618T, LU65, LXF289, MORCPR, NCIH1299, NCIH1355, NCIH1395, NCIH1435, NCIH1437, NCIH1563, NCIH1568, NCIH1573, NCIH1623, NCIH1648, NCIH1650, NCIH1651, NCIH1666, NCIH1693, NCIH1703, NCIH1734, NCIH1755, NCIH1781, NCIH1792, NCIH1793, NCIH1838, NCIH1944, NCIH1975, NCIH2009, NCIH2023, NCIH2030, NCIH2073, NCIH2085, NCIH2087, NCIH2106, NCIH2110, NCIH2122, NCIH2126, NCIH2172, NCIH2228, NCIH2291, NCIH23, NCIH2342, NCIH2347, NCIH2405, NCIH2444, NCIH322, NCIH3255, NCIH358, NCIH441, NCIH522, NCIH650, NCIH838, NCIH854, PC14, RERFLCAD1, RERFLCAD2, RERFLCKJ, RERFLCMS, SKLU1 또는 기타 LUAD 유래의 암 세포주 유형; CALU1, EBC1, EPLC272H, HARA, HCC15, HCC1588, HCC95, HLFA, KNS62, LC1F, LK2, LOUNH91, LUDLU1, NCIH1385, NCIH1869, NCIH2170, NCIH226, NCIH520, RERFLCAI, RERFLCSQ1, SKMES1, SQ1, SW1573, SW900 또는 기타 LUSC 유래의 암 세포주 유형; ACCMESO1, DM3, ISTMES1, ISTMES2, JL1, MPP89, MSTO211H, NCIH2052, NCIH2452, NCIH28, RS5 또는 기타 MESO 유래의 암 세포주 유형; 59M, A2780, CAOV3, CAOV4, COV318, COV362, COV644, EFO21, EFO27, ES2, FUOV1, HEYA8, IGROV1, JHOC5, JHOM1, JHOM2B, JHOS2, JHOS4, KURAMOCHI, MCAS, OAW28, OAW42, OC314, ONCODG1, OV56, OV7, OV90, OVCAR4, OVCAR8, OVISE, OVK18, OVMANA, OVSAHO, OVTOKO, RMGI, RMUGS, SKOV3, SNU119, SNU8, SNU840, TOV112D, TOV21G, TYKNU 또는 기타 OV 유래의 암 세포주 유형; ASPC1, BXPC3, CAPAN1, CAPAN2, CFPAC1, DANG, HPAC, HPAFII, HS766T, HUPT3, HUPT4, KP2, KP3, KP4, L33, MIAPACA2, PANC0203, PANC0213, PANC0327, PANC0403, PANC0504, PANC0813, PANC1, PANC1005, PATU8902, PATU8988S, PATU8988T, PK1, PK45H, PK59, PSN1, QGP1, SNU213, SNU324, SNU410, SU8686, SUIT2, SW1990, T3M4, TCCPAN2, YAPC 또는 기타 PAAD 유래의 암 세포주 유형; 22RV1, DU145, LNCAPCLONEFGC, MDAPCA2B, NCIH660, PC3, VCAP 또는 기타 PRAD 유래의 암 세포주 유형; A101D, A2058, A375, C32, CJM, COLO679, COLO741, COLO783, COLO792, COLO800, COLO829, G361, HMCB, HS294T, HS600T, HS695T, HS834T, HS839T, HS852T, HS895T, HS934T, HS936T, HS939T, HS940T, HS944T, HT144, IGR1, IGR37, IPC298, K029AX, LOXIMVI, MALME3M, MDAMB435S, MELHO, MELJUSO, MEWO, RPMI7951, SH4, SKMEL1, SKMEL24, SKMEL28, SKMEL3, SKMEL30, SKMEL31, SKMEL5, UACC257, UACC62, WM115, WM1799, WM2664, WM793, WM88, WM983B 또는 기타 SKCM 유래의 암 세포주 유형; 2313287, AGS, ECC10, ECC12, FU97, GCIY, GSS, GSU, HGC27, HS746T, HUG1N, HUTU80, IM95, KATOIII, KE39, KE97, LMSU, MKN1, MKN45, MKN7, MKN74, NCCSTCK140, NCIN87, NUGC2, NUGC3, NUGC4, OCUM1, RERFGC1B, SH10TC, SNU1, SNU16, SNU216, SNU5, SNU520, SNU601, SNU620, SNU668, SNU719, TGBC11TKB 또는 기타 STAD 유래의 암 세포주 유형; 8305C, 8505C, BCPAP, BHT101, CAL62, FTC133, FTC238, ML1, SW579, TT, TT2609C02 또는 기타 THCA 유래의 암 세포주 유형; AN3CA, COLO684, EFE184, EN, ESS1, HEC108, HEC151, HEC1A, HEC1B, HEC251, HEC265, HEC50B, HEC59, HEC6, JHUEM1, JHUEM2, JHUEM3, JHUEM7, KLE, MFE280, MFE296, MFE319, RL952, SNGM, SNU1077, SNU685, TEN 또는 기타 UCEC 유래의 암 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기술된 암 세포주는 2종 이상의 암 세포주 유형의 혼합물일 수 있다. 본원에 기술된 암 세포주는 동일한 암 또는 종양 유형으로부터 유래된 2종 이상의 암 세포주 유형의 혼합물일 수 있다. 본원에 기술된 암 세포주는 상이한 암 또는 종양 유형으로부터 유래된 2종 이상의 암 세포주 유형의 혼합물일 수 있다. 본원에 기술된 암 세포주는 동일한 조직으로부터 유래된 2종 이상의 암 세포주 유형의 혼합물일 수 있다. 본원에 기술된 암 세포주는 상이한 조직으로부터 유래된 2종 이상의 암 세포주 유형의 혼합물일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 암 세포주는 대상체가 가진 암 또는 암들에 따라 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해 선택될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자일 수 있다. 선택적으로, 조성물은 대상체로부터 유래된 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는 T 세포를 추가로 포함할 수 있다. 암 세포주의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 교대는 대상체의 암 세포와 닮을 수 있다(예를 들어, 실질적으로 유사). 예를 들어, 암 세포주와 1차 암 세포 또는 종양 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경의 상관 계수는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상일 수 있다.
암 세포주는 외인성 항원을 포함하거나 제시하지 않을 수 있다. 일부 경우에는 암 세포주의 내인성 MHC 분자는 불활성화될 수 있다(예: 하향 조절, 녹아웃 또는 녹다운). 유전자 또는 유전자의 단백질 산물을 불활성화하기 위해 단백질을 암호화하는 유전자는 녹아웃 또는 녹다운할 수 있다. 암 세포주는 내인성 MHC 분자에 대해 결손일 수 있다. 암 세포주는 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손일 수 있다. 내인성 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화될 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화될 수 있다. 일부 경우에는 MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화될 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자는 불활성화될 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화될 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자는 불활성화될 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자는 불활성화될 수 있다. 유전자는 클래스 II 주요 조직적합성 복합 트랜스활성화인자(CIITA)일 수 있다. 암 세포주의 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 B2M 및 MHC-I 알파 둘 모두를 포함할 수 있다. 외인성 MHC 분자는 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)일 수 있다. MHC-I 알파와 B2M은 링커로 연결될 수 있다. 링커는 (G4S)n일 수 있으며, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 임의의 정수일 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함할 수 있다. T 세포는 복수의 T 세포를 포함할 수 있으며, 각각은 대상체로부터 유래된 다른 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현한다. 복수의 T 세포는 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 다른 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 동일한 암 유형으로부터 유래된 MHC-조작된 암 세포주의 패널을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, MHC-조작된 암 세포주의 패널은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 두경부암, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 연조직 육종 또는 위암에서 유래될 수 있다. 패널은 동일한 제1 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제1 하위패널을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 암 세포주인 제1 세포가 조작되어(예를 들어, MHC 분자를 외인성으로 발현시킴으로써) 제2 세포를 형성한다면, 제1 세포는 부모 세포주로 불릴 수 있다. 부모 세포주는 대상체-특이적 HLA(들)로 조작되지 않은 원래 세포주일 수 있다. 패널은 동일한 제2 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제2 하위 패널을 포함할 수 있다. 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현할 수 있다. 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 동일한 외인성 및/또는 내인성 MHC 분자를 발현하지 않을 수 있다. 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 MHC-조작된 암 세포주를 포함할 수 있고, 각각의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현한다. 예를 들어, 이들의 2개 각각은 동일한 외인성 및/또는 내인성 MHC 분자를 발현하지 않을 수 있다.
제1 부모 암 세포주 및 제2 부모 암 세포주는 상이할 수 있다. 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 내인성 MHC 분자는 불활성화될 수 있다. 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현될 수 있거나 대상체로부터 유래될 수 있다. 패널은 3개 이상의 하위 패널을 포함할 수 있다. 각 하위 패널에는 동일한 부모 암 세포주로부터 유래된 3개 이상의 MHC-조작된 암 세포주가 있을 수 있으며, 각각 상이한 외인성 MHC 분자를 발현한다.
비제한적 예로서, MHC-조작된 암 세포주의 패널은 결장직장에서 유래될 수 있다. 제1 하위 패널은 부모 암 세포주 SW837에서 유래된 MHC-조작된 암 세포주를 포함할 수 있다. 제2 하위 패널은 부모 암 세포주 HT55에서 유래된 MHC-조작된 암 세포주를 포함할 수 있다. 결장암 환자는 다음과 같은 클래스 I MHC 유전자를 가질 수 있다: HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-B*39:05, HLA-B*51:01, HLA-C*07:02 및 HLA-C*15:02. 제1 하위 패널에서, 하나의 세포는 HLA-A*02:01을 발현하도록 조작될 수 있고, 또 다른 세포는 HLA-A*02:01을 제외한 상기 임의의 클래스 I MHC 유전자(예: HLA-B*39:05)를 발현하도록 조작될 수 있다. 제2 하위 패널에서, 하나의 세포는 HLA-C*07:02를 발현하도록 조작될 수 있고, 또 다른 세포는 HLA-C*07:02를 제외한 상기 임의의 클래스 I MHC 유전자(예: HLA-A*24:02)를 발현하도록 조작될 수 있다.
조성물은 복수의 T 세포를 추가로 포함할 수 있다. 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널에서 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 각각의 암 세포주는 복수의 T 세포와 혼합(예를 들어, 공동배양)될 수 있다. 복수의 T 세포는 적어도 2개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함할 수 있다. 천연적으로 쌍을 이룬 TCR은 동일한 대상체로부터 유래될 수 있다.
유전자 전달
유전자 또는 유전자 물질(예를 들어, 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자)을 세포 내로 전달(또는 도입) 및 발현하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 본원에 기술된 관심 단백질은 외인성 MHC 분자 또는 TCR 사슬일 수 있다. 발현 벡터의 정황에서, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 APC, 암 세포주 또는 T 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 관심 있는 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 생물학적 방법으로는 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포 내로 유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 화학적 방법은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함할 수 있다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 콜로이드 시스템의 예는 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 다른 방법은 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크론 이하 크기의 전달 시스템을 사용한 핵산의 전달을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
비-바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우, 전달 비히클의 예는 리포좀이다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키기 위해 지질 제형의 사용이 고려될 수 있다(시험관내, 생체외 또는 생체내). 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되며, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 모두와 연관된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착될 수 있고, 리포솜 내에 포획, 지질과 복합체화, 지질 함유 용액에 분산, 지질과 혼합, 지질과 조합, 지질에 현탁액으로서 함유, 미셀에 의해 함유되거나 또는 복합체화, 또는 다른 방식으로 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이중층 구조에, 미셀로서 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재되어, 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성하는 것도 가능하다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데하이드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물 클래스, 뿐만 아니라 세포질에서 자연스럽게 발생하는 지방 액적을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma, 미주리주 세인트루이스로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕시 플레인뷰)로부터 수득할 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring에서 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 용매로서 사용될 수 있다. "리포좀"은 밀봉된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반명이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질이 있는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수성 용액에 현탁될 때 자발적으로 형성될 수 있다. 지질 성분은 밀폐된 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 겪을 수 있으며 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포착할 수 있다. 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 추정하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 본원에서 고려되는 것으로, 리포펙타민-핵산 복합체를 포함할 수 있다.
유전자 편집
본원에 개시된 암 세포주(또는 일부 경우에, 비-암 세포)는 하나 이상의 내인성 MHC 분자를 불활성화하도록 조작될 수 있다. 내인성 MHC 분자 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 유전자는 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체(CRISPR®, 예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호 참조), 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) 뉴클레아제(TALEN, 예를 들어 미국 특허 제9,393,257호 참조), 메가뉴클레아제(12 내지 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열을 포함하는 큰 인식 부위를 갖는 엔도데옥시리보뉴클레아제), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN, 예를 들어, 문헌[Urnov 등, Nat. Rev. Genetics (2010) v11, 636-646] 참조), 또는 megaTAL 뉴클레아제(TAL 반복체에 대한 메가뉴클레아제의 융합 단백질) 방법과 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 불활성화될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 관심 유전자는 RNA 간섭(RNAi)과 같은 기술을 사용하여 녹다운될 수 있다.
이러한 유전자 편집 기술은 사용자-정의된 DNA 서열을 결합시키고 이중 가닥 DNA 파손(DSB)을 매개하는데 있어서 공통 작용 방식을 공유할 수 있다. 그런 다음 DSB는 비-상동성 말단 접합(NHEJ), 또는 공여자 DNA가 존재할 때에는, 공여자 DNA 단편으로부터 상동성 서열을 도입시키는 이벤트인 상동성 재조합(HR)에 의해 복구될 수 있다. 또한, 니카제 뉴클레아제(nickase nuclease)는 단일 가닥 DNA 파손(single-stranded DNA break, SSB)을 생성한다. DSB는 공여자 DNA로부터 상동성 서열을 도입시키는 이벤트인, 단일 가닥 DNA 통합(ssDI) 또는 단일 가닥 주형 복구(ssTR)에 의해 복구될 수 있다.
게놈 DNA의 유전자 변형은 관심 유전자좌에서 DNA 서열을 인식하도록 조작된 부위-특이적, 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행할 수 있다. 조작된 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 게놈에서 미리 결정된 부위를 인식하고 절단하도록 조작될 수 있다. ZFN은 FokI 제한 효소의 뉴클레아제 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 징크 핑거 도메인은 미리 결정된 DNA 서열(예: 길이가 18 염기쌍인 서열)에 결합하는 단백질을 생산하기 위해 합리적 또는 실험적 방법을 통해 재설계될 수 있다. 이러한 조작된 단백질 도메인을 Fokl 뉴클레아제에 융합시키면 게놈-수준 특이성으로 DNA 파손을 표적으로 하는 것이 가능하다. ZFN은 광범위한 진핵 유기체에서 유전자 추가, 제거 및 치환을 표적으로 하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 게놈 DNA의 특정 부위를 절단하기 위해 생성될 수 있다. ZFN과 마찬가지로 TALEN은 Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된 조작된 부위-특이적 DNA 결합 도메인을 포함한다. 그러나, 이러한 경우에 DNA 결합 도메인은 각각 단일 DNA 염기쌍을 특이적으로 인식하는 TAL-이펙터 도메인의 직렬 어레이를 포함한다. 컴팩트 TALEN은 이량체화의 필요성을 피하는 대안적인 엔도뉴클레아제 아키텍처를 갖고 있다. 컴팩트 TALEN은 I-TevI 귀소 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인에 융합된, 조작된 부위-특이적 TAL-이펙터 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. Fokl과 달리, I-TevI는 이중-가닥 DNA 파손을 생성하기 위해 이량체화되지 않을 수 있고, 따라서 Compact TALEN은 단량체로 기능할 수 있다.
CRISPR/Cas9 시스템에 기초한 조작된 엔도뉴클레아제가 또한 사용될 수 있다. CRISPR 유전자-편집 기술은 짧은 가이드 RNA 또는 이본쇄 crRNA/TracrRNA에 의해 DNA 표적화 특이성 및 절단 활성이 프로그래밍될 수 있는 엔도뉴클레아제 단백질을 포함할 수 있다. CRISPR 엔도뉴클레아제는 2가지 성분을 포함한다: (1) 카스파제 이펙터 뉴클레아제, 전형적으로 미생물 Cas9; 및 (2) 짧은 "가이드 RNA" 또는 뉴클레아제를 게놈의 관심 위치로 유도하는 18 내지 20개의 뉴클레오타이드 표적화 서열을 포함하는 RNA 이본쇄. 동일한 세포에서 각각 상이한 표적화 서열을 갖는 다중 가이드 RNA를 발현시킴으로써, 게놈의 다중 부위에 대해 DNA 파손을 동시에 표적화하는 것이 가능하다(다중 게놈 편집).
각각 다중 CRISPR 유형을 함유하는 CRISPR 시스템의 2가지 클래스가 있다. Class I은 고세균에서 일반적으로 발견되는 I형 및 III형 CRISPR 시스템을 함유한다. 그리고, 클래스 II는 II형, IV형, V형 및 VI형 CRISPR 시스템을 함유한다. 가장 널리 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 II형 CRISPR-Cas9 시스템이지만, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 편집을 위해 용도변경되었다. 지난 몇 년 동안 10개가 넘는 서로 다른 CRISPR/Cas 단백질이 리모델링되었다. 예를 들어, 애시드-아미노코커스 종(Acid-aminococcus sp)(AsCpf1) 또는 라크노스피라시에(Lachnospiraceae) 박테리아(LbCpf1)의 Cas12a(Cpf1) 단백질이 사용될 수 있다.
귀소 엔도뉴클레아제는 식물 및 진균의 게놈에서 일반적으로 발견되는 15-40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하는 자연 발생의 뉴클레아제 그룹이다. 이들은 그룹 1 자가-스플라이싱 인트론 및 인테인과 같은 기생충 DNA 요소와 연관이 있을 수 있다. 이들은 세포 DNA-복구 기구를 모집하는 염색체에 이중-가닥 파손을 생성함으로써 숙주 게놈의 특정 위치에서 상동성 재조합 또는 유전자 삽입을 자연스럽게 촉진할 수 있다. 특정 아미노산 서브스테이션(substation)은 귀소 뉴클레아제의 DNA 절단 특이성을 재프로그래밍할 수 있다. 메가뉴클레아제(MN)는 박테리아 귀소 엔도뉴클레아제에서 유래되고 고유한 표적 부위에 대해 조작된, 선천적 뉴클레아제 활성을 가진 단량체 단백질이다. 일부 경우에, 메가뉴클레아제는 조작된 I-CreI 귀소 엔도뉴클레아제이다. 다른 경우에, 메가뉴클레아제는 조작된 I-SceI 귀소 엔도뉴클레아제이다.
상기에 언급된 유전자 편집 기술 외에도, 메가뉴클레아제, ZFN 및 TALEN의 융합체를 포함하는 키메라 단백질은 ZFN 및 TALEN의 결합 친화도 및 메가뉴클레아제의 절단 특이성을 이용하는 신규한 단량체 효소를 생성하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, megaTAL은 메가뉴클레아제의 높은 절단 효율과 TALEN의 맞춤제작이 쉬운 DNA 결합 도메인의 조합인 단일 키메라 단백질이다.
유전자 편집 기술을 수행하기 위해, 뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas9 시스템의 경우에는 gRNA가 관심 세포로 전달될 수 있다. 전달 방법으로는 물리적, 화학적 및 바이러스적 방법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 물리적 전달 방법은 전기천공법, 미세주입 또는 탄도 입자의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 방법으로부터 선택될 수 있다. 다른 한편, 화학적 전달 방법은 인산 칼슘, 지질 또는 단백질과 같은 분자를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 전달 방법은 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스를 사용할 수 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 또한 항원-반응성 세포, 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR, 또는 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR을 발현하는 세포를 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로즈 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 산화방지제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다.
또한, 본원에는 항원-반응성 세포, 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR, 또는 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR을 발현하는 세포를 포함하는, 약제로서 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 이 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다. 조성물은 암 또는 자가면역 질환과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료(또는 예방)될 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 병태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 수 있으나, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 내독소, 마이코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 오염물이 실질적으로 없을 수 있고, 예를 들어, 검출 불가능한 수준이다. 일부 경우에, 박테리아는 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에세리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
투여
본원에는 암과 같은 병태를 갖는 대상체에게 약제학적 조성물 또는 치료 요법을 투여하는 방법이 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 항원-반응성 세포, TCR, 또는 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR을 발현하는 세포를 포함하는 세포 조성물일 수 있다. 약제학적 조성물은 항원-반응성 세포, TCR, 또는 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR을 발현하는 세포인 약물을 포함하는 용액일 수 있다. 일부 경우에, 세포 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 세포 조성물은 용액에 재현탁되고 주입으로 투여될 수 있다. 면역자극제, 면역억제제, 항생제, 항진균제, 구토억제제, 화학요법제, 방사선요법 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 치료 요법이 또한 본원에 제공될 수 있다. 상기 중 임의의 것을 포함하는 치료 요법은 동결건조되고 수성 용액(예를 들어, 식염수)에서 재구성될 수 있다. 일부 경우에, 치료(예를 들어, 세포 치료)는 피하 주사, 근육내 주사, 피내 주사, 경피 투여, 정맥내("i.v.") 투여, 비강내 투여, 림프내 주사 및 경구 투여로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다. 일부 경우에, 림프관내 마이크로카테터에 의해 면역수용체-프로그래밍된 수혜자 세포를 포함하는 세포 조성물이 대상체에게 주입된다.
피하 경로의 경우, 바늘은 피부 바로 아래의 지방 조직으로 삽입될 수 있다. 약물이 주사된 후, 작은 혈관(모세혈관)으로 이동하여 혈류에 의해 운반될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 림프관을 통해 혈류에 도달할 수 있다. 더 많은 양의 약제학적 조성물이 필요한 경우에는 근육내 경로가 사용될 수 있다. 근육은 피부와 지방 조직 아래에 있기 때문에 더 긴 바늘이 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 상완, 허벅지 또는 엉덩이의 근육에 주사될 수 있다. 정맥내 경로의 경우, 바늘을 정맥 내로 직접 삽입할 수 있다. 약제학적 조성물은 세포를 함유하는 용액일 수 있고 단일 용량으로 또는 연속 주입에 의해 제공될 수 있다. 주입을 위해 용액은 중력에 의해(압축 가능한 플라스틱 백으로부터), 보다 일반적으로 주입 펌프에 의해 얇고 유연한 튜브를 통해, 일반적으로 팔뚝에 있는 정맥에 삽입된 튜브(카테터)로 이동할 수 있다. 일부 경우에, 세포 또는 치료 요법은 주입액으로서 투여된다. 주입은 일정 기간 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, 주입은 약 5분 내지 약 5시간의 기간에 걸친 세포 또는 치료 요법의 투여일 수 있다. 주입은 약 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5 시간 또는 최대 약 5시간의 기간에 걸쳐 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 정맥내 투여는 신속하고 잘 제어된 방식으로 신체 전체에 정확한 용량을 전달하기 위해 사용된다. 또한, 피하 또는 근육내 주사로 제공한다면, 통증을 유발하고 조직을 손상시키는 자극성 용액에도 사용될 수 있다. 특히, 개인이 비만인 경우, 바늘이나 카테터를 정맥에 삽입하는 것이 어려울 수 있기 때문에 정맥내 주사는 피하 주사 또는 근육내 주사보다 투여하기가 더 어려울 수 있다. 정맥내로 제공할 때, 약물은 즉시 혈류로 전달될 수 있으며 임의의 다른 경로로 제공할 때보다 빠르게 효과를 나타내는 경향이 있다. 결과적으로, 보건의료인은 약물이 작용하거나 바람직하지 않은 부작용을 일으키는 징후에 대해 정맥내 주사를 맞는 사람을 면밀히 모니터링할 수 있다. 또한, 이 경로로 제공된 약물의 효과는 더 짧은 시간 동안 지속되는 경향이 있을 수 있다. 따라서, 일부 약물은 그 효과를 일정하게 유지하기 위해 지속적인 주입에 의해 제공될 수 있다. 척추강내 경로의 경우, 바늘은 하부 척추의 두 척추 사이와 척수 주변 공간으로 삽입될 수 있다. 그런 다음 약물은 척추관으로 주사될 수 있다. 소량의 국소 마취제를 사용하여 주사 부위를 마비시킬 수 있다. 이 경로는, 예를 들어, 이러한 구조의 감염을 치료하기 위해, 뇌, 척수 또는 이를 덮고 있는 조직층(수막)에 신속하거나 국소적인 영향을 미치기 위해 약물이 필요할 때 사용될 수 있다.
일부 경우에, 세포 요법을 포함하는 약제학적 조성물은 임의의 경로에 의해 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있고, 이러한 투여는 단일 및 다중 투여량 둘 모두로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사 용액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 약제학적으로 허용되는 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비독성 유기 용매 등을 포함한다. 또한, 이러한 경구용 약제학적 제형은 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되는 유형의 다양한 작용제에 의해 적절하게 감미 및/또는 향미될 수 있다.
일부 경우에, 치료 요법은 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 담체 및 부형제의 예로는 덱스트로스, 염화나트륨, 수크로스, 락토스, 셀룰로오스, 자일리톨, 소르비톨, 말리톨, 젤라틴, PEG, PVP 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 덱스트로스 또는 염화나트륨과 같은 부형제는 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 또는 최대 약 15%의 백분율일 수 있다. 일부 경우에, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 식별된 TCR을 외인성으로 발현하는 세포와 같은 조작된 세포를 포함하는 하나 이상의 세포(기관 및/또는 조직 포함)를 대상체에게 이식하는 것을 포함할 수 있다. 세포내 게놈 이식에 의해 제조된 세포는 암 치료에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 암 세포주의 MHC-개인화
내인성 클래스 I MHC를 없애기 위해, B2M의 발현은 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 대안적으로, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C와 같은 클래스 I MHC(MHC-I 알파) 유전자의 알파 사슬의 발현은 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 앞서 언급한 유전자를 녹아웃하기 위해 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 또는 이들의 변형체와 같은 유전자 편집 도구가 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas9 및 가이드 RNA(gRNA) 표적화 서열 5'-ACTCACGCTGGATAGCCTCC-3', 5'-GAGTAGCGCGAGCACAGCTA-3', 5'-CAGTAAGTCAACTTCAATGT-3'를 사용하여 B2M을 녹아웃할 수 있다.
또 다른 예로서, HLA-A 유전자의 측면에 있는 Cas9 및 gRNA 표적화 서열 5'-GCCGCCTCCCACTTGCGCT-3' 및 5'-CACATGCAGCCCACGAGCCG-3'를 사용하여 HLA-A의 결실을 일으킬 수 있다. HLA-B의 상류 서열과 HLA-C의 하류 서열을 표적으로 하는 Cas9 및 gRNA를 사용하면 서로 인접한 HLA-B 및 HLA-C의 결실을 유발할 수 있다. HLA-B의 상류 서열을 표적으로 하는 gRNA는 5'-ATCCCTAAATATGGTGTCCC-3' 또는 5'-TCCCTAAATATGGTGTCCCT-3' 서열을 표적으로 할 수 있다. HLA-C의 하류 서열을 표적으로 하는 gRNA는 5'-GTGATCCGGGTATGGGCAGT-3' 또는 5'-TGATCCGGGTATGGGCAGTG-3' 서열을 표적으로 할 수 있다. 종합하면, 이들 조작은 MHC-I-알파 유전자의 녹아웃을 유발할 수 있다.
MHC-I의 녹아웃 또는 녹다운이 수행된 후, 세포는 항-MHC-I 항체로 염색될 수 있고, MHC-I이 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되는 세포가 단리될 수 있다. 그 후, 선택적으로 단일 세포로부터 시작하는 단클론 세포주가 확립될 수 있다.
MHC-I 알파 유전자가 녹아웃되거나 녹다운되면 외인성 MHC-I 알파 유전자는 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 mRNA와 같은 임의의 벡터에 의해 도입될 수 있다. 외인성 MHC-I 알파의 해독 산물은 내인성 B2M과 복합체를 형성할 수 있다.
B2M이 녹아웃되거나 녹다운된 경우, MHC-I 알파는 환자에게 도입될 수 있다. 일부 경우에, B2M과 MHC-I 알파의 융합 단백질(여기서, B2M-MHC-I-알파 융합체로 불림)이 환자에게 도입될 수 있으며, 여기서 MHC-I 알파는 환자로부터 유래된 것이다. 적절한 폴딩을 촉진하기 위해 B2M과 MHC-I 알파 사이에는 링커가 도입될 수 있다. 다음 서열은 MHC-I-알파가 HLA-A*02:01인 B2M-MHC-I-알파 융합체의 일 예이다:
Figure pct00001
환자-유래 클래스 II MHC(MHC-II)는 또한 암 세포주에서 외인성으로 발현될 수 있다. 환자 유래 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타는 모두 플라스미드, 바이러스 벡터 및 mRNA와 같은 다양한 벡터를 사용하여 암 세포주에서 외인성으로 발현될 수 있다. 상기 개념과 유사하게, 내인성 MHC-II 발현은 감소되거나 없어질 수 있다. MHC-II는 수지상 세포 및 대식세포와 같은 전문 APC에 의해 발현될 수 있지만, 특히 암세포가 INF-감마와 접촉할 때 암세포에 의해 발현될 수도 있음을 유의한다. 내인성 MHC-II 발현을 없애기 위해 모든 MHC-II 유전자가 녹아웃될 수 있거나, 또는 MHC-II의 마스터 조절자인 CIITA 및 이의 관련 유전자가 녹아웃될 수 있다. CIITA는 5'-TCCATCTGGTCATAGAAG-3' 서열을 표적으로 하는 Cas9 및 gRNA에 의해 녹아웃될 수 있다. 불변 사슬 및 HLA-DM과 같은 다른 MHC-II 유전자도 암 세포주에서 외인성으로 발현될 수 있다.
내인성 클래스 I 및/또는 클래스 II MHC 발현 수준이 감소된 암 세포주는 MHC-결손(또는 HLA-결손) 암 세포주로 불릴 수 있다. 암 세포주(MHC-결손 여부에 관계없이)가 하나 이상의 외인성 MHC 유전자(B2M-MHC-I-알파 융합체 포함)를 발현한다면, 이는 MHC-조작된 암 세포주로 불릴 수 있다. MHC-조작된 암 세포주가 환자가 가진 하나 이상의 MHC 유전자를 발현한다면, MHC-개인화된 암 세포주로 불릴 수 있다.
실시예 2: 비-암세포의 MHC-개인화
MHC-결손 암 세포주를 생산하는 실시예 1에 기술된 방법은 또한 유도 만능 줄기 세포(iPSC)와 같은 MHC-결손 줄기 세포를 생산하는 데에도 사용될 수 있다. 하나 이상의 MHC 유전자(B2M-MHC-I-알파 융합 유전자 포함)는 플라스미드(게놈 통합을 통해), 렌티바이러스 벡터 또는 CRISPR 녹인을 통해 iPSC에 안정적으로 도입되어 MHC-조작된 iPSC를 생산할 수 있다. 이러한 MHC-결손 및 MHC-조작된 iPSC는 비-암세포로 간주될 수 있는 세포 유형(예: 폐, 간, 신경, 췌장, 심장, 면역, 조혈 줄기 세포 등)의 광범위한 어레이로 인위적으로 분화될 수 있다. 이러한 iPSC-유래 비-암 세포는 전술한 방법을 사용하여 외인성 MHC 유전자에 의해 추가로 조작될 수 있다. iPSC에서 외인성 MHC를 안정적으로 발현하는 것이 유리할 수 있지만, iPSC 유래 세포에서 외인성 MHC를 일시적으로 발현하는 것은 실행 가능한 옵션임을 유의한다. 일시적인 발현은 플라스미드, mRNA 및 AAV 벡터에 의해 달성될 수 있다. 불멸화된 1차 인간 세포(예: SV40의 과발현을 통해)는 또한 비-암세포로 기능할 수 있으며, iPSC 및 암 세포주와 동일한 방식으로 MHC-조작될 수 있다. MHC-조작된 비-암세포가 환자의 MHC 유전자를 하나 이상 발현한다면, 이는 MHC 개인화된 비-암세포로 불릴 수 있다.
실시예 3: MHC-개인화된 암 세포를 사용한 환자-유래 종양-반응성 TCR의 발견
비제한적 예로서, 결장암 환자는 다음 클래스 I MHC 유전자: HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-B*39:05, HLA-B*51:01, HLA-C*07:02, HLA-C*15:02 및 다음 클래스 II MHC 유전자: HLA-DPA1*02:02, HLA-DPB1*02:02, HLA-DPB1*19:01, HLA-DQA1*03:03, HLA-DQA1*01:03, HLA-DQB1*04:01, HLA-DQB1*06:01, HLA-DRA*01:01, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1*08:03, HLA-DRB4*01:03을 가질 수 있다.
이 환자를 치료하기 위해 결장직장암 세포주: SW837, LS411N, HT55, CL34, SNU61이 사용될 수 있다. 각 세포주에 대해 MHC-결손 세포주를 생산하기 위해 B2M 및 CIITA를 녹아웃할 수 있다. 그런 다음 각각의 B2M-MHC-I-알파 융합 유전자 및 MHC-II 유전자를 암호화하는 mRNA는 표준 시험관내 전사(IVT), 캡핑 및 A-테일링에 의해 제조될 수 있다. 동일한 농도의 6개의 B2M-MHC-I-알파 융합 유전자(HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-B*39:05, HLA-B*51:01, HLA-C*07:02, HLA-C*15:02)의 mRNA를 혼합하여, 각각의 MHC-결손 세포주에 전기천공하여 "MHC-I-개인화된 암 세포주"를 생산할 수 있다. 동일한 농도의 11개의 MHC-II 유전자(HLA-DPA1*02:02, HLA-DPB1*02:02, HLA-DPB1*19:01, HLA-DQA1*03:03, HLA-DQA1*01:03, HLA-DQB1*04:01, HLA-DQB1*06:01, HLA-DRA*01:01, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1*08:03, HLA-DRB4*01:03)의 mRNA는 혼합하여 각각의 MHC-결손 세포주에 전기천공하여 "MHC-II-개인화된 암 세포주"를 생산할 수 있다. MHC-I 개인화된 암 세포주와 MHC-II 개인화된 암 세포주를 총칭하여 MHC-개인화된 세포주라고 할 수 있다.
종양-침윤 T 세포 또는 PD-1-높은 말초 T 세포는 표준 방법 또는 실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 이들 세포는 각 T 세포에 대한 쌍을 이룬 TCR 서열을 수득하기 위해 단일-세포 TCR-seq와 같은 시퀀싱으로 처리될 수 있다. 총 1,000~10,000개의 쌍을 이룬 TCR 서열이 수득될 수 있다. 이들 TCR 유전자의 전부 또는 하위집합은 국제 출원 제PCT/US2020/026558호에 기술된 방법을 사용하여 풀(pool)에서 합성될 수 있다. TCR 유전자는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체외에서 건강한 공여자로부터 말초 T 세포에 도입되어, "다클론성 합성 T 세포"라고 부르는 T 세포 집단을 초래할 수 있다. 외인성(예를 들어, 합성된) TCR은 다클론 합성 T 세포에서 외인성 및 내인성 TCR 사이의 쌍형성 오류(mispairing)를 방지하기 위해 뮤린 불변 도메인을 가질 수 있다.
외인성 TCR 유전자 풀을 특성화하기 위해, 다클론 합성 T 세포의 분취량을 수득할 수 있고 외인성 TCR은 벡터 상의 외인성 TCR의 측면 시퀀싱을 표적으로 하는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 수 있다. 그리고 증폭 산물은 NextGen Sequencing(NGS)으로 분석할 수 있으며 풀의 각 외인성 TCR의 빈도를 기록할 수 있다. 이 샘플에서 이러한 외인성 TCR의 빈도는 선택전 빈도라고 할 수 있다.
다클론 합성 T 세포는 각각의 MHC-I-개인화된 또는 MHC-II-개인화된 암 세포주와 공동배양될 수 있으며, 그 동안 그의 외인성 TCR이 MHC-개인화된 암 세포주를 인식하는 합성 T 세포가 활성화될 수 있다. 활성화된 T 세포는 CD137, CD69 및 OX40과 같은 활성화 마커를 발현할 수 있다. 활성화 마커-양성 세포는 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 또는 자기 활성화 세포 분류법(MACS)을 사용하여 분류할 수 있다. 분류된 세포에서 외인성 TCR 유전자는 벡터에서 외인성 TCR의 측면 시퀀싱을 표적으로 하는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. 증폭 생성물은 NGS에 의해 분석될 수 있고 풀 내의 각각의 외인성 TCR의 빈도가 기록될 수 있다. 이 샘플 내 외인성 TCR의 이들 빈도는 선택후 빈도라고 할 수 있다.
외인성 TCR의 선택후 빈도가 2개 이상의 MHC-I-개인화된 또는 MHC-개인화된 암 세포주에 의해 3 이상의 계수만큼 선택전 빈도보다 높다면, 이 TCR은 종양-반응성 TCR로 간주될 수 있다. 선택적으로, MHC-개인화된 암 세포주가 기관 또는 조직 기원이 MHC-개인화된 암 세포와 동일하거나 유사한 MHC-결손 암 세포주 또는 MHC-개인화된 비-암 세포로 대체된 대조군 실험이 수행될 수 있다. 이 경우, 비-암 세포는 MHC-개인화된 iPSC-유래 결장 세포 또는 상피세포일 수 있다. TCR이 MHC-개인화된 비-암세포와의 공동배양물에서 농축을 나타내는 경우, 이 TCR은 자가-반응성으로 간주될 수 있으며 환자에 대한 TCR-T 요법에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 간주될 수 있다. TCR이 종양 반응성이고 자가 반응성이 아닌 경우, 표준 TCR-T 제조 공정을 적용하여 암 치료를 위해 환자에게 투여될 수 있는 TCR-T 세포를 제조할 수 있다.
실시예 4: 환자-유래 종양-반응성 T 세포의 자극 및 농축
MHC-개인화된 암 세포주는 또한 천연의 환자-유래 T 세포(예를 들어, 유전자 조작이 없는 T 세포)를 자극하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤, 말초 종양-경험이 있는 T 세포는 실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 단리, 농축 및 선택적으로 확장될 수 있다. 이들 T 세포는 MHC-개인화된 암 세포주와 공동배양될 수 있다. 공동-자극 경로는 공동배양 과정 동안 유도될 수 있다. 예를 들어, B7 분자(CD80 및 CD86)는 MHC-개인화된 암 세포주에서 외인성으로 발현될 수 있다. 대안적으로, 항-CD28 항체는 배양 배지 또는 세포 배양 용기의 표면에 존재할 수 있다. 이전에 논의된 바와 같이, 이러한 공동배양에서, MHC-개인화된 암 세포는 (1) 공동배양에서 살아 있거나 사멸된 암 세포주가 공급된 자가 DC, (2) 살아 있거나 사멸된 자가 종양 세포가 공급된 자가 DC, 또는 (3) 자가 종양 세포로 대체될 수 있다.
공동배양 5일 내지 30일 후, T 세포는 수집되고, 정제되고, 품질 관리(QC) 검정으로 처리되고, 환자에게 투여(예를 들어, 주입)될 수 있다. 종양-반응성 T 세포의 분획을 추가로 증가시키기 위해, 짧은 공동배양(예를 들어, 12시간 내지 3일) 후, 상향조절된 수준의 활성화 마커(예를 들어, CD69, CD25, CD137, OX40)를 갖는 T 세포를 FACS 또는 MACS를 사용하여 단리할 수 있다. 이러한 단리된 세포는 환자에게 투여하기 전에 추가로 확장될 수 있다(예: 급속 확장 프로토콜 또는 REP 사용).
실시예 5: 종양-침윤 T 세포, 말초 종양-경험이 있는 T 세포의 수득 및 종양-펄스화된 DC의 제조
종양 세포 및 TIL 수득하기: 암 환자가 종양 절제술을 받는 경우, 새로 절제된 종양의 일부(이상적으로는 부피가 1 cm3보다 큰 것)를 액체 질소에서 동결보존할 수 있다. 선택적으로, 종양 물질의 또 다른 부분은 작은 조각 및 단세포 또는 거의 단세포 현탁액으로 기계적 및/또는 효소적으로 해리될 수 있다. 단세포 또는 거의 단세포 현탁액은 동결보존될 수 있다. 동결보존은 DMSO와 같은 동결 보호제의 존재하에 수행될 수 있다. 신선하거나 동결보존된 종양 물질은 불활성화 또는 용해되어, 수지상 세포에 의한 포식을 촉진하고 최종 주입 산물이 살아있는 암세포를 함유하지 않도록 보장할 수 있다. 불활성화는 방사선조사, 화학적 처리, 고온 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 종양-침윤 T 세포는 Miltenyi Biotec와 같은 상업적 공급원에서 입수할 수 있는 CD3 양성 선택 키트, CD4+CD8 양성 선택 키트 또는 음성 선택 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 수득할 수 있다.
말초 혈액으로부터 MDDC 및 T 세포 수득하기: 채혈 또는 백혈구 성분채집술 산물로부터, T 세포 및 단핵구는 자기 비드-기반 음성 또는 양성 선택에 의해 농축되거나 단리될 수 있다. 예를 들어, CliniMACS Prodigy 기기(Miltenyi Biotec)에서 CliniMACS CD14 시약을 사용하면 단핵구는 >95%의 순도, >80%의 회수율, >95%의 세포 생존율로 일상적으로 농축될 수 있다. 농축된 단핵구는 GM-CSF(~1000 U/ml) 및 IL-4(~500 U/mL)가 보충된 AIM-V와 같은 무혈청 배지에서 7일 동안 GMP 표준 절차를 사용하여 MACS GMP 세포 배양 백(Miltenyi Biotec)에서 배양될 수 있다. 사이토카인은 4일째에 보충될 수 있다. 이 절차를 사용하여 생성된 DC(단핵구 유래 DC, MoDC 또는 MDDC라고 불림)는 그 다음 자가 종양 용해물에 노출될 수 있다. 종양 용해물은 1차 해동 단계 동안 100℃에서 5분간의 가열 단계와 함께 3 내지 10회의 동결/해동 및 10 Gy 조사와 같은 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 용해물에 이한 DC 적재는 2 시간 동안 50-200 μg/ml의 단백질로 수행할 수 있다. 미적재 및 용해물-적재된 DC는 그 다음 임상-등급 종양 괴사 인자-α(TNFα; ~50 ng/ml), IFNα(1,000 IU/ml) 및 폴리 I:C(20 mg/ml)에 의해 24시간 동안 성숙될 수 있다. 미적재 및 용해물-적재된 DC는 그 다음 분취물당 107 내지 108로 분취될 수 있고, 냉동-동결 용기를 사용하여 10%(부피/부피) 디메틸설폭사이드(DMSO)가 포함된 자가 혈청에서 냉동보존될 수 있다. 냉동보존된 MDDC는 사용하기 전에 표준 절차를 사용하여 해동될 수 있다. 현재 단핵구가 고갈된 단핵구 농축 단계의 통과액은 대량의 T 세포를 농축하기 위한 원료 물질일 수 있다. CliniMACS CD4 GMP MicroBeads, CliniMACS CD8 GMP MicroBeads 또는 이 둘의 혼합물은 CliniMACS Prodigy 시스템을 사용하여 각각 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 pan-T 세포를 농축하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 조절 T 세포는 CliniMACS CD25 시약을 사용하여 고갈될 수 있다.
종양-경험이 있는 T 세포 농축하기: T 세포의 말초 PD-1-높은(또는 PD-1hi) 하위 집단은 종양-경험이 있는 T 세포와 함께 농축될 수 있기 때문에 관심 대상이다. 말초 PD-1-높은 T 세포는 FACS 또는 MACS를 사용하여 단리될 수 있다. MACS는 T 세포 또는 이들의 확장 산물이 인간에서 사용될 경우, 이러한 T 세포의 오염 위험을 최소화하기 위해 폐쇄형 GMP-준수 시스템에 쉽게 적용될 수 있다는 장점이 있다. PD-1-높은 세포(모두 PD-1 양성 세포보다)의 MACS 선택은 다음 최적화 전략을 사용하여 비오티닐화된 항-PD-1 항체 및 CliniMACS Anti-Biotin GMP MicroBeads를 사용하여 수행할 수 있다.
먼저, T 세포 및 비오티닐화된 항-PD-1 항체의 최적 농도를 혼합하고 최적의 기간 동안 인큐베이션할 수 있으며(아래 참조), 그 후 T 세포를 CliniMACS PBS/EDTA로 세척하고 원심분리로 펠릿화할 수 있다. 세포 펠릿은 CliniMACS Anti-Biotin Reagent(예: 5 × 106 T 세포당 1 ml CliniMACS 완충액 중 37.5 μl 항-비오틴 MicroBeads)을 사용하여 재현탁하고, 암실에서 2-8℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, CliniMACS PBS/EDTA 완충액으로 세척할 수 있다. 이러한 방식으로 수득한 T 세포는 PD-1-비드-농축된 T 세포라고 할 수 있다.
비오티닐화된 항-PD-1 항체의 최적 농도 및 이 항체와의 최적 인큐베이션 시간을 결정하기 위해 일련의 파일럿 실험을 수행하여 PD-1-높은 T 세포가 충분히 농축되도록 한다. 먼저, T 세포의 분취량을 (1) 비오틴-표지된 항-PD-1 항체 또는 (2) 비오틴-표지된 아이소타입 대조군으로 염색할 수 있다. 세척 후, 이들 두 샘플 각각을 형광-표지된 스트렙타비딘(예: 피코에리트린-스트렙타비딘)으로 추가 염색할 수 있고, 세척하고, 유세포 분석법으로 분석할 수 있다. "PD-1 형광 역치"는 비오틴-표지된 아이소타입 대조군으로 염색된 T 세포의 99%가 이 PD-1 형광 역치 미만의 형광 신호를 갖도록 결정될 수 있다. PD-1 형광 역치를 초과하는 비오틴-표지된 항-PD-1 항체로 염색된 T 세포의 중앙 형광 강도(MFI)는 "MFIPD-1-Pos"로서 기록될 수 있다. PD-1-비드-농축된 T 세포는 형광-표지된 스트렙타비딘으로 염색되고, 세척되고, 유세포 분석법으로 분석될 수 있다. PD-1-비드-농축된 T 세포의 중앙 형광 강도는 "MFIPD-1-비드-농축된"으로 기록될 수 있다. 비오티닐화된 항-PD-1 항체의 농도 및 인큐베이션 시간은 MFIPD-1-비드-농축된 것이 MFIPD-1-Pos보다 적어도 5배 더 크도록 최적화될 수 있다. 비오티닐화된 항-PD-1 항체의 농도는 범위를 식별한 뒤 이 범위 내에서 직선적으로 식별하기 위해 먼저 대수적으로(예를 들어, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 또는 100 μg/mL) 변동될 수 있다. 인큐베이션 시간은 30분으로 설정될 수 있으나, 필요에 따라 5분 내지 2시간 사이에서 5분 내지 10분 간격으로 최적화될 수 있다.
PD-1-농축된 T 세포 중에서 PD-1의 높은 발현 수준을 보장하기 위한 선택적인 방법은 비오틴-표지된 항-PD-1 항체를 비오틴-/형광-이중-표지된 항-PD-1 항체로 대체하는 것일 수 있다. 위에서 설명한 비드-기반 PD-1 농축 후, T 세포는 항 PD-1 항체에 표지된 형광을 기준으로 추가로 FACS 분류될 수 있으며, 여기서 미리 결정된 역치보다 높은 PD-1-연관된 형광 신호를 나타내는 T 세포만이 분류된다. 미리 결정된 역치는 아이소타입 대조군이 또한 비오틴-/형광-이중-표지되고, 형광-표지된 스트렙타비딘을 사용한 염색이 생략될 수 있는 것을 제외한 전술한 방법에 의해 결정되는, MFIPD-1-Pos의 4배일 수 있다.
비오틴-표지된 항-PD-1 항체 또는 비오틴-/형광-이중-표지된 항-PD-1 항체를 제조하기 위해, 치료용 또는 인간 생체내 임상 시험용으로 승인된 항-PD-1 항체, 예컨대, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 신틸리맙, 티스렐리주맙, CS1003, 캄렐리주맙이 사용될 수 있다. 비오틴 및 형광 표지는 NHS 에스테르를 통한 것과 같은 표준 커플링 화학을 사용하여 항-PD-1 항체에 접합될 수 있다. 예를 들어, NHS-(PEG)12-비오틴 또는 NHS-(PEG)12-비오틴과 NHS-(PEG)12-플루오레세인의 1:1(몰비) 혼합물은 아민이 없는 완충액에서 10~30분 동안 항-PD-1 항체와 혼합될 수 있다. 커플링 반응은 아민-함유 완충액에 의해 켄칭될 수 있다.
실시예 6: 세포주에서 복수의 외인성 MHC 대립유전자의 발현
MHC 유전자는 세포에서 고도로 발현될 수 있다. MHC 단백질의 높은 발현 수준은 낮은 수준으로 발현된 항원을 제시하는 데 도움이 될 수 있다. 외인성으로 발현된 MHC 유전자는 암 세포주에서 복수의 외인성 MHC 대립유전자가 발현된다면 충분히 높은 발현 수준에 도달하지 못할 수 있다. 이를 테스트하기 위해, HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA 1μg을 (a) HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 직렬 미니유전자(TMG)의 mRNA(도 2a), 또는 (b) 무관한 에피토프를 암호화하는 mRNA(도 2d)와 함께 K562 세포에 전기천공했고, 이러한 조작된 K562 세포를 A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 인식할 수 있는 TCR로 조작된 T 세포(항-NY-ESO-1 TCR-T 세포라고 지칭됨)와 공동배양했다. 데이터는 후자(도 2d)가 아닌 전자(도 2a)에 의해 조작된 K562 세포가 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포를 강력하게 자극할 수 있음을 보여준다. 또한, 2개의 다른 클래스 I MHC 대립유전자(HLA-A*24:02, HLA-B*38:02)를 암호화하는 2개의 다른 mRNA를 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA에 첨가했다. MHC 대립유전자를 암호화하는 mRNA의 총량은 1μg으로 유지되었으므로, 3개의 MHC-암호화 mRNA 각각의 양은 0.33μg이었다. 놀랍게도, 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포의 자극 수준은 본질적으로 영향을 받지 않았지만(도 2b, 도 2a에 비해), 무관한 항원을 발현하는 K562에 의한 배경 자극은 다소 감소되었다(도 2e). 다음으로, 3개의 추가 클래스 I MHC 대립유전자(HLA-B*46:01, HLA-C*01:02, HLA-C*07:02)를 암호화하는 3개의 추가 mRNA를 첨가하여, 총 외인성 클래스 I MHC 대립유전자 6개를 만들었다. MHC 대립유전자를 암호화하는 mRNA의 총량은 1μg으로 유지되었으므로 각 MHC 대립유전자를 암호화하는 mRNA의 양은 단지 0.167μg이었다. 놀랍게도, 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포의 자극 수준은 크게 영향을 받지 않았다(도 2c). 배경 자극도 이전 그룹과 유사했다(도 2f). 이 예에서 각 개인은 6개의 클래스 I MHC 대립유전자를 가지고 있기 때문에, 여기에 제시된 결과는 6개의 모든 대립유전자를 암호화하는 mRNA가 세포주에 도입될 수 있고 여전히 충분한 발현 수준 및 충분한 항원 제시 능력에 도달할 수 있음을 시사한다.
도 2a-2f는 복수의 외인성 MHC 대립유전자가 세포주에서 공동-발현될 수 있고 충분한 발현 수준 및 세포내 발현된 항원을 제시하기에 충분한 능력을 달성할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포는 (1) (a) HLA-A*02:01-제한된 NY-ESO-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 직렬 미니유전자(TMG)의 mRNA, 또는 (b) 무관한 에피토프를 암호화하는 mRNA, 및 (2) (i) HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA, (ii) HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA, 및 2개의 다른 클래스 I MHC 대립유전자를 암호화하는 2개의 다른 mRNA, 또는 (iii) HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA 및 5개의 다른 클래스 I MHC 대립유전자를 암호화하는 5개의 다른 mRNA와 공동-전기천공된 K562 세포와 공동배양했다. HLA 대립유전자(들)를 암호화하는 mRNA의 총량은 1μg으로 일정하게 유지했다. 공동배양 1일 후, 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포를 항-CD137 항체로 염색하고 유세포 분석법으로 조사했다. CD8+ 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포만이 보인다. CD137+인 항-NY-ESO-1 TCR-T 세포의 백분율이 도면에 보고된다. SSC는 측면 산란을 나타낸다.
실시예 7: MHC-결손 세포주에서 기능적 외인성 MHC 대립유전자의 발현
HLA-E 및 HLA-G와 같은 비고전적 MHC 대립유전자는 NK 세포에 의한 인식 또는 사멸을 피하기 위해 MHC-결손 세포에 도입될 수 있다. 그러나, 고전적인 MHC 대립유전자가 MHC-결손 세포(특히 B2M 녹아웃에 의해 수득된 세포)에 도입될 수 있고 항원 제시에 적절하게 기능하는지 여부는 덜 명확할 수 있다. 이를 테스트하기 위해 K562 세포주를 모델 세포주로 사용하여 외인성 MHC 대립유전자가 발현 및 기능할 수 있는지를 연구했다. K562 세포는 일반적으로 낮은 수준의 MHC-I-알파 발현을 가질 수 있다. 이는 도 3a에서 확인되었다. 그러나, 외인성 MHC 대립유전자 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA가 전기천공에 의해 K562에 형질감염되었을 때, 세포 표면에서 클래스 I MHC의 풍부한 양이 검출되었다(도 3b). 데이터는 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA의 품질 및 기능을 확인시켜준다. 다음으로, K562-B2MKO를 생성하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 K562에서 B2M을 녹아웃시켰다. 도 3a의 데이터와 비교하여, 도 3c의 데이터는 B2M의 녹아웃의 성공을 보여준다. HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA가 K562-B2MKO에 전기천공되었을 때, 세포 표면 클래스 I MHC는 검출되지 않은 상태를 유지했다(도 3d). 그러나, B2M-HLA-A*02:01 융합체(도 3e) 또는 B2M-HLA-C*08:02 융합체(도 3f)(B2M-MHC-I-알파 융합체의 예로서)를 암호화하는 mRNA가 K562-B2MKO에 전기천공되었을 때에는 풍부한 세포 표면 클래스 I MHC가 다시 한 번 검출되었으며, 이는 외인성 B2M-MHC-I-알파 융합체가 MHC-결손 세포에서 발현되어 세포 표면으로 수송될 수 있음을 시사한다.
도 3a-3f는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 풍부하게 발현되어 MHC-결손 세포에서 세포 표면으로 수송될 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 부모 K562 세포 또는 K562-B2MKO 세포를 인간 pan 클래스 I MHC를 인식하는 항체로 염색했다(도 3a 및 도 3c). 이들 2가지 세포주는 또한 HLA-A*02:01, B2M-HLA-A*02:01 융합체 또는 B2M-HLA-C*08:02 융합체를 암호화하는 mRNA로 형질감염시키고 동일한 방식으로 염색했다(도 3b, 도 3d, 도 3e 및 도 3f). 양성으로 염색된 세포의 백분율이 도면에 보고된다. SSC는 측면 산란을 나타낸다.
HLA-A*02:01-제한된 WT-1 에피토프를 인식하는 TCR로 조작된 T 세포(항-WT-1 TCR-T 세포로 지칭됨)는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 세포내 발현된 항원을 제시할 수 있는지 여부를 테스트하는 센서로서 사용했다. 항-WT-1 TCR-T 세포 상의 세포 표면 CD137은 TCR-T 세포가 TCR 신호전달을 통해 표적 세포에 의해 자극된 후에 상향조절될 수 있다. 부모 K562 세포는 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA로 전기천공하여 K562/A*02:01을 형성시켰다. K562-B2MKO 세포는 HLA-A*02:01 또는 B2M-HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA로 전기천공하여 각각 K562-B2MKO/A*02:01 또는 K562-B2MKO/B2M-A*02:01을 형성시켰다. 음성 대조군으로서, 이들 3개의 MHC-조작된 세포주 중 어떠한 것도 공동배양하지 않은 항-WT-1 TCR-T 세포에 비해(도 4j), 항-WT-1 TCR-T 세포를 자극하지 않았다(도 4a, 도 4b 및 도 4c), 배양 배지에 WT-1 펩타이드가 첨가되었을 때, K562-B2MKO/A*02:01(도 4e)은 아니지만, K562/A*02:01(도 4d) 및 K562-B2MKO/B2M-A*02:01(도 4f)은 T 세포를 자극할 수 있으며, 이는 B2MKO 배경에서 B2M-MHC-I-알파 융합체의 중요성을 시사한다. 유사하게, WT-1 에피토프를 포함한 여러 에피토프를 암호화하는 직렬 미니유전자(TMG)의 mRNA를 HLA*02:01 또는 B2M-HLA*02:01을 암호화하는 mRNA와 공동형질감염시켰을 때, K562/A*02:01(도 4g) 및 K562-B2MKO/B2M-A*02:01(도 4i)은 K562-B2MKO/A*02:01(도 4h)와 달리 T 세포를 자극할 수 있으며, 이는 다시 B2M-MHC-I-알파 융합체의 중요성 및 세포내 발현된 항원을 제시하는 그의 능력을 입증한다. 놀랍게도, 이러한 활성화 수준은 인위적으로 높은 수준으로 항원을 제시하기 위해 사용된, 전기천공된 mRNA로부터 발현된 항원 펩타이드, B2M 및 MHC-I-알파를 포함하는 융합 단백질(Ag-B2M-A*02:01로 지칭됨, 도 4k 참조)에 의해 달성된 것과 유사하다(모든 외인성으로 발현된 HLA는 이의 항원에 물리적으로 연결되어 있기 때문임). 전반적으로, B2M-MHC-I-알파 융합체는 B2MKO 배경에서 놀랍도록 강력한 세포내 발현된 항원을 제시하는 능력을 입증했다.
도 4a-4k는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 MHC-결손 세포에서 세포내 발현된 항원을 효율적으로 제시할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. 다양한 버전의 K562 세포를 항-WT-1 TCR-T 세포와 공동배양했다. 1일 동안 공동배양 후, 항-WT-1 TCR-T 세포를 항-CD137 항체로 염색하고 유세포 분석으로 검사했다. 도 4a, 도 4d 및 도 4g에서, 부모 K562 세포는 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA로 전기천공했다. 도 4b, 도 4e 및 도 4h에서, K562-B2MKO 세포는 HLA-A*02:01을 암호화하는 mRNA로 전기천공했다. 도 4c, 도 4f 및 도 4i에서, K562-B2MKO 세포는 B2M-HLA-A*02:01 융합체를 암호화하는 mRNA로 전기천공했다. 도 4k에서, K562-B2MKO 세포는 항원-B2M-HLA-A*02:01 융합체를 암호화하는 mRNA로 전기천공했고, 여기서 항원은 항-WT-1 TCR-T 세포에 의해 인식되는 WT-1 에피토프이다. 도 4d, 도 4e 및 도 4f에서, WT-1 에피토프 펩타이드는 공동 배양 배지에 첨가했다. 도 4g, 도 4h 및 도 4i에서, WT-1 에피토프를 포함하는 여러 에피토프를 암호화하는 TMG의 mRNA는 MHC 대립유전자(또는 이의 유도체)를 암호화하는 mRNA와 함께 K562 세포(또는 이의 파생물)에 공동-전기천공했다. 도 4j는 공동배양하지 않은 항-WT-1 TCR-T 세포의 CD137 수준을 보여준다. SSC는 측면 산란을 나타낸다.
실시예 8: B2M-MHC-I-알파 융합체에 의한 내인성 항원의 제시
앞의 실시예는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 T 세포 인식을 위해 세포내 발현된 항원을 제시할 수 있음을 보여준다. B2M-MHC-I-알파 융합체가 T 세포 인식을 위해 내인성 항원(예: 세포주의 천연 또는 내인성 게놈에서 발현된 항원)을 제시할 수 있는지를 추가로 입증하기 위해, PANC1 및 AsPC1 세포주 및 C*08:02-제한된 KRADG12D 에피토프를 인식하는 알려진 TCR(NCI4095-2)을 사용했다. PANC1과 AsPC1 둘 모두는 KRASG12D 돌연변이를 운반하지만, HLA-C*08:02를 발현하지 않는다. NCI4095-2 TCR을 공여자의 말초 T 세포에 형질도입하여 항-KRASG12D TCR-T 세포를 형성시켰다. 도 5a-5F에 도시된 바와 같이, 항-KRASG12D TCR-T 세포가 PANC1 또는 AsPC1을 인식하지 못하지만, 외인성 HLA-C*08:02 또는 외인성 B2M-C*08:02 융합체가 mRNA 벡터를 통해 이들 세포주에서 발현되었을 때 두 세포주는 항-KRASG12D TCR-T 세포에 의해 인식될 수 있다.
도 5a-5f는 B2M-MHC-I-알파 융합체가 암 세포에서 내인성 항원을 효율적으로 제시할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 도시한다. PANC1 및 AsPC1 세포의 다양한 버전을 항-KRASG12D TCR-T 세포와 공동배양했다. PANC1 및 AsPC1 둘 모두가 KRASG12D 돌연변이를 운반하지만, 둘 다 HLA-C*08:02를 발현하지는 않는다. 항-KRASG12D TCR-T 세포는 C*08:02-제한된 KRASG12D 펩타이드를 인식한다. 1일 동안 공동배양 후, 항-KRASG12D TCR-T 세포는 항-CD137 항체로 염색했고 유세포 분석으로 검사했다. 도 5a에서, PANC1 세포는 외인성 MHC에 의해 조작되지 않았다. 도 5b에서, PANC1 세포는 외인성 HLA-C*08:02 알파 사슬을 발현하도록 조작되었다. 도 5c에서, PANC1 세포는 외인성 B2M-C*08:02 융합체를 발현하도록 조작되었다. 도 5d에서, AsPC1 세포는 외인성 MHC로 조작되지 않았다. 도 5e에서, AsPC1 세포는 외인성 HLA-C*08:02 알파 사슬을 발현하도록 조작되었다. 도 5f에서, AsPC1 세포는 외인성 B2M-C*08:02 융합체를 발현하도록 조작되었다. SSC는 측면 산란을 나타낸다.
실시예 9: 암 세포주에서 MHC-I의 발현 동역학
도 6a 및 도 6b는 암 세포주에서 MHC-I의 발현 동역학을 보여준다. 흑색종 세포주 Malme3M(도 6a) 및 HMCB(도 6b)는 B2M 유전자좌에서 편집되어 MHC-결손 세포를 생산했다. 다양한 B2M-MHC-I-알파 융합 대립유전자는 mRNA 일시적 형질감염에 의해 도입되었고 표면 발현은 pan MHC-I 항체에 의해 시간 경과에 따라 모니터링되었다. mRNA의 총량은 각각의 MHC-I에 대해 일정하게 유지되었고, 세포는 별도로 형질감염되었다. HLA-A 11:01, HLA-B 51:01, HLA-C 04:01 및 HLA-C 15:01의 표면 발현을 Malme3M에서 검정했고, HLA-A 11:01, HLA-B 51:01 및 HLA-C 04:01의 표면 발현은 도 6a 및 도 6b에서 각각 나타낸 시점마다 HMCB에서 검정했다.
실시예 10: 합성 라이브러리 및 암 세포주를 사용한 TCR 식별의 워크플로우 예
T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 MHC의 정황에서 제시된 항원에 고도로 특이적인 방식으로 결합할 수 있다. 합성 TCR 라이브러리(예를 들어, 약 1,000개의 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 함유하는 라이브러리)는 TCR-T 세포의 합성 라이브러리를 생성하기 위해 정상 공여자 T 세포에서 발현될 수 있으며, APC 또는 종양 세포를 특이적으로 인식하는 세포는 TCR-T 세포를 분류하여 농축될 수 있다.
정상 공여자 T 세포는 단리되고 CD3/CD28에 의해 활성화된 다음, 합성 TCR 라이브러리의 렌티바이러스 또는 아데노-연관 바이러스에 의해 조작될 수 있다. 이러한 T 세포가 완전히 확장되고 증식을 중단하면, 이후 사용을 위해 동결하거나 공동배양 검정에 직접 사용했다. 공동배양물은 TCR-T 세포 라이브러리와 혼합되고 4-24시간 동안 인큐베이션된, 단핵구 유래 수지상 세포, B 세포, 원발성 종양 물질 또는 암 세포주와 같은 APC를 포함한다. 인큐베이션 시간 후, 공동배양 세포는 그 다음 CD137, OX40, CD107a 등과 같은 활성화 마커에 대해 염색된다. 다음으로, 공동배양 세포의 일부는 "분류전" 샘플로 따로 보관한다; 이는 이후에 시퀀싱을 위해 처리하기 위해 세척 및 동결될 것이다. 공동배양물의 나머지는 그 다음 활성화 마커를 사용하여 비드-기반 농축 프로토콜 또는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)으로 분류한다. "분류된" 세포 샘플은 세척, 동결 및 그 다음 이후 처리될 것이다.
다음으로, 분류전 T 세포 및 분류된 T 세포는 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 시퀀싱된다. 게놈 DNA 또는 RNA는 단리되고 PCR에 사용되어 Illumina 시퀀서에서 NGS용 라이브러리를 생성한다. 맞춤형 프라이머는 특히 CDR3 영역의 NGS 판독물을 생성한다. 미가공 판독물 수는 합성 TCR 라이브러리에 정렬하여 수득한다. 표적-반응성 TCR(예를 들어, 종양 항원-반응성 TCR)은 볼케이노 플롯(도 7)에 도시된 바와 같이 분류 전과 분류 후의 빈도 및/또는 배수 변화를 비교함으로써 정의된다.
실시예 11: 합성 라이브러리 및 암 세포주를 이용한 TCR 식별
실시예 10에 개략된 워크플로우를 사용하여 합성 TCR-T 세포 라이브러리는 특정 HLA 제한에 대한 항원에 대해 스크리닝할 수 있다. 일 예로서, HLA-A02:01을 발현하거나 음성인 암 세포주를 사용하여 HLA-A02:01에 의해 제한되는 항원에만 반응성인 TCR을 식별했다(도 8). CD137은 반응성 또는 활성화에 대한 마커로 사용했다. 잔류 CD137 발현은 활성화 전에 TCR-T 세포에서 관찰했다. CD137의 선택 민감도를 증가시키기 위해, TCR-T 세포는 암 세포주와 공동배양을 설정하기 전에 CD137-PE로 염색했고, 공동배양 후 세포는 CD137의 동일한 클론으로 염색되었지만 PE/Cy7으로는 염색되지 않았다. 이 방법은 암 세포주에 의해 새롭게 활성화된 TCR-T 세포만을 분류하기 위해 사용되었고 임의의 잔여 CD137 발현으로부터 배경을 감소시켰다. 도 9는 전시된 세포가 "사전" 및 "사후" CD137에 의해 염색된 살아있는 합성 TCR-T 세포인 4개의 상이한 공동배양물로부터의 유세포분석 플롯을 보여준다. 분류 및 시퀀싱된 세포는 나타낸 암세포주에 의해 새로 활성화된 TCR-T 세포인 Q1의 집단이다. 양성 대조군으로서 HLA-A02:01 양성인 암 세포주 중 하나를, 라이브러리에 함유된 모델 TCR(예: PMEL17, DMF5, 1G4, NKI.CDK4.53, 및 DMF4)의 항원을 함유하는 직렬 미니 유전자(TMG)로 전기천공했다.
다음으로, 분류된 TCR-T 세포를 시퀀싱했고, 그 다음 "적중(hit)"을 입력값 및 유의성 컷오프로부터 빈도의 배수 변화 및 배수 변화의 유의성 역치의 조합으로서 정의했다. FACS 데이터의 볼케이노 플롯(도 10a)은 이 모델에서 다른 미지의 TCR과 함께 TCR이 HMCB-TMG와의 양성 대조군 공동배양물에서 농축되었지만(점선으로 된 박스 내의 데이터 점 참조), HLA-A02:01 음성 세포주 SKMEL에서는 농축되지 않았음을 보여준다. 또한, MACS를 사용한 비드-기반의 CD137 농축도 사용했다(도 10b). FACS에서와 유사한 결과가 관찰되었다. 이러한 결과는 합성 라이브러리에서 미지의 HLA-A02:01 특이적 TCR이 검출될 수 있음을 암시한다. 추가 검증을 위해 96개의 TCR을 선택했다. 96개의 TCR 중 64개의 TCR은 HLA-A02:01 양성 암 세포주에서만 농축되었고, HLA-A02:01 음성 암 세포주 SKMEL에서는 농축되지 않았다. 16개의 TCR은 테스트된 모든 암 세포주에서 농축되었고, 그 다음 어떠한 농축도 보이지 않은 20개의 TCR은 음성 대조군으로서 선택했다.
실시예 12: 실시예 11에서 식별된 TCR의 검증
관심 있는 특이적 TCR은 1,000개의 다른 TCR의 원래 풀로부터의 고유한 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 검증을 위해 위에서 식별된 96개의 TCR에 특이적인 96개의 프라이머를 사용했다. PCR 및 시험관내 전사(IVT)를 수행하여 개별 TCR의 mRNA의 96-웰 플레이트를 생성했다. 다음으로, TRAC 및 TRBC를 CRIPSR/Cas9으로 녹아웃(이중 녹아웃(DKO)이라고 함)함으로써 TCR을 발현하지 않도록 사전에 조작된 정상 공여자 T 세포를 사용하여 식별된 TCR을 발현시켰다. 이들 DKO 세포는 Lonza 96-셔틀 시스템을 사용하여 각 TCR의 mRNA로 전기천공했다. CD3의 가장 높은 회수율은 전기천공(EP) 48시간 후에 관찰되었으며, 이는 TCR 발현을 나타낸다(도 11a). 식별된 TCR을 발현하는 DKO 세포는 HLA-A02:01 양성 또는 음성 암 세포주와 공동배양했고 활성화된 세포 집단의 백분율은 CD137 상향조절에 의해 결정되었다(도 11b). TCR은 사멸 검정을 사용하여 추가로 검증했으며, 여기서 식별된 TCR을 발현하는 T 세포는 APC와 공동배양했다. APC는 알려진 항원(MUT) 또는 다른 항원(WT)을 함유하는 직렬 미니유전자(TMG)를 발현하는 HLA-A02:01 양성이다(도 12).
실시예 13: 암종 환자로부터 환자-특이적 HLA를 발현하는 암 세포주 및 합성 라이브러리를 사용한 TCR 식별
간세포 암종 환자의 고형 종양을 수술로 제거하고 단일 세포로 처리했다. T 세포는 표면 마커 CD3에 의해 양성 선택했고 선택된 분획은 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 처리되었다. 그런 다음 쌍을 이룬 TCR 정보를 사용하여 이 데이터세트에서 관찰된 모든 TCR을 합성하고, 쌍을 이룬 TCR 클론을 공여자 T 세포 내로 조작하여 조작된 T 세포를 생성했다. 환자의 것과 동일한 적응증의 암 세포주를 편집하여 위에 제시된 바와 같이 MHC-결손 세포를 생성하고 환자로부터 모두 6개의 클래스 I HLA 대립유전자(예: 대상체-특이적 HLA)로 형질감염시켰다. 환자로부터 쌍을 이룬 TCR을 함유하는 조작된 T 세포 및 동일한 환자로부터 6개의 클래스 I HLA 대립유전자를 제시하는 암 세포주를 그 다음 함께 배양하고, 새로운 CD137 발현에 기초하여 항원-반응성 T 세포를 활성화에 대해 분류했다. 분류된 세포는 시퀀싱하고 초기 빈도와 비교할 때 배수 농축에 대해 분석했다. 높은 배수 농축도를 보이는 것은 적중(hit)으로 표시했고, 개별적으로 추가 검증으로 처리했다. 이러한 TCR 중 몇몇은 환자 HLA 조작된 세포주에 반응성인 것으로 검증되었다. 추가 조사를 위해 대표 TCR을 선택했다. 먼저, HLA 제한을 결정하기 위해 개별 HLA를 세포주에 형질감염시켰다. 밀접하게 관련된 2개의 HLA는 TCR을 함유하는 T 세포를 활성화시키는 것으로 발견되었다. 2개의 HLA 중에서, TCR을 함유하는 T 세포의 더 강력한 활성화를 유도하는 하나를 제한성 HLA로 표시했다. 도 13a는 환자의 제한성 HLA를 발현하는 부모 세포주에 대한 반응에 의해서만 초기 활성화 마커 CD137의 상향조절을 보여준다. 도 13b는 젖산 탈수소효소(LDH) 검정에 의해 모니터링된 세포 용해 실험의 결과를 보여주며, 여기서 증가된 신호는 용해 및 LDH 효소의 증가된 수준과 직접적으로 관련이 있다. 조사된 TCR 발현 T 세포만이 환자의 제한성 HLA를 발현할 때의 표적 세포주를 용해했다. 도 13c는 아폽토시스가 Caspase-Glo® 3/7 검정에 의해 모니터링된 또 다른 공동-배양 검정을 보여준다. 부모 세포주의 아폽토시스는 환자의 제한성 HLA가 발현될 때에만 관찰되었다. 도 13d는 T 세포 활성화가 사이토카인 방출에 의해 모니터링된 또 다른 공동-배양 검정을 보여준다. 이 실험에서 방출된 IFN-γ의 농도가 결정되었다. 환자의 제한성 HLA가 발현될 때, T 세포로부터 다량의 IFN-γ 방출이 관찰되었다.
실시예 14: 흑색종 환자로부터 환자-특이적 HLA를 발현하는 암 세포주 및 합성 라이브러리를 사용한 TCR 식별
말기 흑색종 환자의 혈액을 관문 치료법 후에 수집했다. PD1을 발현하는 T 세포를 분류하고 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 처리했다. 그런 다음, 분류된 세포의 쌍을 이룬 TCR 정보를 사용하여 데이터세트에서 관찰된 TCR을 합성하고 쌍을 이룬 TCR 클론을 공여자 T 세포 내로 조작했다. 동일한 환자 적응증의 2개의 암 세포주를 편집하여 상기에 제시된 바와 같이 MHC-결손 세포를 생성하고 환자로부터의 모두 6개 클래스 I HLA 대립 유전자(양성 선택) 또는 6개의 무관련 HLA 대립 유전자(음성 선택)로 형질감염시켰다. 환자로부터의 쌍을 이룬 TCR을 함유하는 조작된 T 세포 및 클래스 I HLA 대립유전자를 제시하는 암 세포주를 함께 배양하고 음성 선택 또는 양성 선택에 반응성인 T 세포를 새로운 CD137 발현에 기초하여 분류했다. 분류된 세포를 시퀀싱하고 각 세포주에 대한 반응성에 대해 분석했다. 볼케이노 플롯(도 14)은 배수 농축(선택전 빈도와 비교하여) 및 P 값의 함수로서 개별 TCR 서열에 대한 어느 한 세포주의 최대값을 보여준다. 음성 선택에서 제시되지 않는 높은 통계적 농축을 보여주는 TCR 서열은 적중으로 표시하고(점선으로 된 박스 내의 데이터 점 참조), 개별적으로 추가 검증으로 처리했다. 이 분석은 환자의 암에 잠재적으로 반응성인 환자의 말초 혈액으로부터의 TCR 서열을 발견하기 위해 환자 HLA 조작된 세포주를 사용할 수 있는 능력을 보여준다.
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본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되어야 하는 것으로 의도된 것은 아니다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되도록 의도된 것은 아니다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고 관련 기술분야의 기술자에게 수많은 변형, 변화 및 치환이 일어날 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존적인 본원에 제시된 특정 묘사, 구성 또는 상대적인 비율에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 이러한 임의의 대안, 수정, 변형 또는 등가물도 포함할 것으로 고려된다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 및 그 등가물 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
실시양태 문단
본 개시내용은 다음을 제공한다:
[001] 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법으로서,
(a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자인, 단계;
(b) 암 세포주를 제1 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 복수의 TCR-발현 세포 또는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 것인, 단계; 및
(c) (b)에서 접촉한 후, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하여, 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
[002] 문단 [001]에 있어서, (c)에서 식별하는 단계가 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축하거나 선택하는 것을 포함하는, 방법.
[003] 문단 [001] 또는 [002]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 암 세포주에 대해 외인성인, 방법.
[004] 문단 [001]-[003] 중 어느 하나에 있어서, 방법이 (a)에서 동일한 대상체로부터 유래되는 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 추가적인 내인성 항원을 발현하는 비-암 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[005] 문단 [004]에 있어서, (b)에서 비-암 세포를 제2 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가적인 내인성 항원에 의해 활성화되는 것인, 방법.
[006] 문단 [004] 또는 [005]에 있어서, 추가적인 내인성 항원이 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원과 동일하거나 상이한 것인, 방법.
[007] 문단 [004]-[006] 중 어느 하나에 있어서, 비-암 세포가 (i) 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 발현하지 않거나, (ii) 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 더 낮은 수준으로 발현하거나, 또는 (iii) 암 세포주에 의해 발현된 내인성 항원을 발현하지만, 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 제시하지 않는 것인, 방법.
[008] 문단 [005]-[007] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포는 동일한 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
[009] 문단 [005]-[008] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수 및 제2 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 TCR을 발현하는, 방법.
[010] 문단 [005]-[009] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수 또는 제2 복수의 TCR-발현 세포가 상이한 TCR을 발현하는, 방법.
[011] 문단 [005]-[010] 중 어느 하나에 있어서, (c)에서 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[012] 문단 [001]-[011] 중 어느 하나에 있어서, 식별하는 것이 마커에 기초하여, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
[013] 문단 [012]에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것이 마커에 기초하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
[014] 문단 [013]에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[015] 문단 [013]에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되지만, 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서는 발현되지 않는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[016] 문단 [013]에 있어서, 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에 있는 세포의 TCR, 및 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가적인 내인성 항원에 의해 활성화되지 않는 제2 복수의 TCR-발현 세포의 세포 내에 있는 것을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[017] 문단 [004]-[016] 중 어느 하나에 있어서, 비-암 세포가 줄기 세포 또는 1차 세포인, 방법.
[018] 문단 [017]에 있어서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)인, 방법.
[019] 문단 [018]에 있어서, 비-암 세포는 분화된 iPSC인, 방법.
[020] 문단 [004]-[019] 중 어느 하나에 있어서, 비-암 세포가 자가면역 조절자(AIRE)를 발현하는 것인, 방법.
[021] 문단 [001]-[019] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주 또는 비-암 세포의 내인성 MHC 분자가 불활성화(예를 들어, 녹다운, 또는 녹아웃)되는, 방법.
[022] 문단 [001]-[021] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주 또는 비-암 세포가 내인성 MHC 분자에 대해 결손(null)인, 방법.
[023] 문단 [001]-[022] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주 또는 비-암 세포가 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 방법.
[024] 문단 [021]-[023] 중 어느 하나에 있어서, 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[025] 문단 [024]에 있어서, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[026] 문단 [024] 또는 [025]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화되는, 방법.
[027] 문단 [026]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[028] 문단 [024]-[027] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화되는, 방법.
[029] 문단 [028]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[030] 문단 [024]-[029] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[031] 문단 [024]-[030] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화되는, 방법.
[032] 문단 [031]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[033] 문단 [031]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[034] 문단 [033]에 있어서, 유전자가 CIITA인, 방법.
[035] 문단 [001]-[034] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주 또는 비-암 세포의 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래되는, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[036] 문단 [035]에 있어서, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[037] 문단 [035] 또는 [036]에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[038] 문단 [035]-[037] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래되는 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는, 방법.
[039] 문단 [035]-[038] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는, 방법.
[040] 문단 [039]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 방법.
[041] 문단 [040]에 있어서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결되는, 방법.
[042] 문단 [041]에 있어서, 링커가 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수인, 방법.
[043] 문단 [035]-[042] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는, 방법.
[044] 문단 [001]-[043] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 대상체로부터 단리되는, 방법.
[045] 문단 [001]-[044] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포가 1차 T 세포를 포함하는, 방법.
[046] 문단 [045]에 있어서, 1차 T 세포가 종양-침윤 T 세포인, 방법.
[047] 문단 [045]에 있어서, 1차 T 세포가 말초 T 세포인, 방법.
[048] 문단 [047]에 있어서, 말초 T 세포가 종양-경험이 있는 T 세포인, 방법.
[049] 문단 [047]에 있어서, 말초 T 세포가 PD-1+ T 세포인, 방법.
[050] 문단 [045]-[049] 중 어느 하나에 있어서, 1차 T 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
[051] 문단 [045]-[049] 중 어느 하나에 있어서, 1차 T 세포가 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
[052] 문단 [001]-[051] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포가 조작된 세포를 포함하는, 방법.
[053] 문단 [052]에 있어서, 조작된 세포가 외인성 TCR을 발현하는, 방법.
[054] 문단 [053]에 있어서, 외인성 TCR이 동일한 대상체로부터 단리된 1차 T 세포로부터 유래되는 것인, 방법.
[055] 문단 [001]-[054] 중 어느 하나에 있어서, (a) 이전에, 대상체로부터 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[056] 문단 [055]에 있어서, 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 닮은 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 암 세포주를 식별하기 위해, 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 및 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[057] 문단 [056]에 있어서, 암 세포주와 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경의 상관 계수가 약 0.1 이상인, 방법.
[058] 문단 [001]-[057] 중 어느 하나에 있어서, (c)에서 하위집합의 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[059] 문단 [058]에 있어서, 항원-반응성 세포에 의해 발현되는 TCR의 서열을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[060] 문단 [059]에 있어서, TCR의 서열을 식별하는 단계가 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함하는, 방법.
[061] 문단 [001]-[060] 중 어느 하나에 있어서, 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[062] 문단 [001]-[061] 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현하는, 방법.
[063] 문단 [062]에 있어서, 복수의 TCR은 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하는, 방법.
[064] 문단 [001]-[063] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주인 세포가 적어도 약 50, 100, 1,000개 이상의 세포를 포함하는, 방법.
[065] 문단 [001]-[064] 중 어느 하나에 있어서, (b) 이전에, 암 세포주를 사멸시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[066] 문단 [065]에 있어서, 사멸은 암 세포주를 화학적 화합물로 처리하거나 방사선조사하는 것을 포함하는, 방법.
[067] 문단 [066]에 있어서, 화학적 화합물이 세포독성 화합물인, 방법.
[068] 문단 [067]에 있어서, 세포독성 화합물이 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 다카바진, 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프라임, 프로카바진, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 다우노마이신, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
[069] 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법으로서,
(a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 항원을 발현하는 암 세포주를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인, 단계;
(b) 암 세포주를 동일한 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현하는 복수의 조작된 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 조작된 세포의 하위집합은 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 항원에 의해 활성화되는 것인, 단계; 및
(c) (b)에서 접촉한 후, 복수의 조작된 세포의 하위집합을 식별함으로써 항원-반응성 세포를 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
[070] 문단 [069]에 있어서, 항원이 암 세포주에 대해 내인성인, 방법.
[071] 문단 [069] 또는 [070]에 있어서, 암 세포주가 외인성 항원을 발현하지 않거나 외인성 항원을 제시하지 않는 방법.
[072] 문단 [069]-[071] 중 어느 하나에 있어서, 항원이 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)인, 방법.
[073] 문단 [069]-[072] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주가 동일한 대상체로부터 유래되지 않는 방법.
[074] 문단 [069]-[073] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주가 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포를 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 방법.
[075] 문단 [069]-[074] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR이 복수의 조작된 세포에 대해 외인성인, 방법.
[076] 문단 [069]-[075] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주의 내인성 MHC 분자가 불활성화(예를 들어, 녹다운, 또는 녹아웃)되는, 방법.
[077] 문단 [076]에 있어서, 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[078] 문단 [077]에 있어서, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[079] 문단 [077] 또는 [078]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화되는, 방법.
[080] 문단 [079]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[081] 문단 [077]-[080] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화되는, 방법.
[082] 문단 [081]의 방법에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[083] 문단 [077]-[082] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[084] 문단 [077]-[083] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화되는, 방법.
[085] 문단 [084]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[086] 문단 [084]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[087] 문단 [086]에 있어서, 유전자가 CIITA인, 방법.
[088] 문단 [069]-[087] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[089] 문단 [088]에 있어서, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[090] 문단 [088] 또는 [089]에 있어서, MHC 클래스 II 분자는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
[091] 문단 [088]-[090] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는, 방법.
[092] 문단 [088]-[090] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는, 방법.
[093] 문단 [092]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 방법.
[094] 문단 [093]에 있어서, MHC-I 알파 및 B2M은 링커에 의해 연결된 것인, 방법.
[095] 문단 [094]에 있어서, 링커는 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수인, 방법.
[096] 문단 [088]-[095] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는, 방법.
[097] 문단 [069]-[096] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR이 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하는, 방법.
[098] 문단 [069]-[097] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR이 동일한 대상체로부터 단리된 1차 세포로부터 유래되는 것인, 방법.
[099] 문단 [098]에 있어서, 1차 세포가 T 세포인, 방법.
[100] 문단 [099]에 있어서, T 세포가 종양-침윤 T 세포인, 방법.
[101] 문단 [099]에 있어서, T 세포가 말초 T 세포인, 방법.
[102] 문단 [101]에 있어서, 말초 T 세포가 종양-경험이 있는 T 세포인, 방법.
[103] 문단 [101]에 있어서, 말초 T 세포가 PD-1+ T 세포인, 방법.
[104] 문단 [099]에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
[105] 문단 [099]에 있어서, T 세포가 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
[106] 문단 [069]-[105] 중 어느 하나에 있어서, (c)에서 식별하는 것이 복수의 조작된 세포의 하위집합을 농축하거나 선택하는 것을 포함하는, 방법.
[107] 문단 [069]-[106] 중 어느 하나에 있어서, (c)에서 식별하는 것이 마커에 기초하여 복수의 조작된 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
[108] 문단 [106]에 있어서, 선택하는 것이 마커에 기초하여 FACS 또는 MACS를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
[109] 문단 [106] 또는 [108]에 있어서, 마커가 리포터 단백질인, 방법.
[110] 문단 [109]에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인, 방법.
[111] 문단 [106] 또는 [108]에 있어서, 마커가 세포 표면 단백질, 세포내 단백질 또는 분비 단백질인, 방법.
[112] 문단 [111]에 있어서, 마커가 세포내 단백질 또는 분비 단백질이고, 방법이 선택하기 전에, 복수의 조작된 세포를 고정 및/또는 투과화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[113] 문단 [112]에 있어서, 복수의 조작된 세포를 골지 차단제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[114] 문단 [111]-[113] 중 어느 하나에 있어서, 분비 단백질이 사이토카인인, 방법.
[115] 문단 [114]에 있어서, 사이토카인이 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린, 또는 이들의 조합인, 방법.
[116] 문단 [111]-[115] 중 어느 하나에 있어서, 세포 표면 단백질이 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3 또는 이들의 조합인, 방법.
[117] 문단 [069]-[116] 중 어느 하나에 있어서, 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[118] 문단 [117]에 있어서, TCR을 식별하는 것이, 복수의 조작된 세포의 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함하는, 방법.
[119] 문단 [069]-[118] 중 어느 한 항에 있어서, 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[120] 문단 [069]-[119] 중 어느 하나에 있어서, (a) 이전에, 대상체로부터 원발성 암 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[121] 문단 [120]에 있어서, 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포를 닮은 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 암 세포주를 식별하기 위해, 원발성 암 세포 및 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[122] 문단 [001]-[121] 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
[123] 하기를 포함하는, 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하기 위한 조성물로서,
외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자임; 및
대상체로부터 유래된 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는 T 세포로서, 여기서 암 세포주의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 교대(genomic alternation)는 대상체로부터의 암 세포의 것과 닮은 것인, 조성물.
[124] 문단 [123]에 있어서, 암 세포주와 원발성 암 세포 또는 종양 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경의 상관 계수가 약 0.1 이상인, 조성물.
[125] 문단 [123] 또는 [124]에 있어서, 암 세포주가 외인성 항원을 포함하거나 제시하지 않는 조성물.
[126] 문단 [123]-[125] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주의 내인성 MHC 분자가 불활성화된, 조성물
[127] 문단 [123]-[126] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주가 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 조성물.
[128] 문단 [123]-[127] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주가 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 조성물.
[129] 문단 [126]-[128] 중 어느 하나에 있어서, 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
[130] 문단 [129]에 있어서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
[131] 문단 [129] 또는 [130]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화된 것인, 조성물.
[132] 문단 [131]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
[133] 문단 [129]-[132] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화된 것인, 조성물.
[134] 문단 [133]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
[135] 문단 [129]-[134] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
[136] 문단 [129]-[135] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화된 것인, 조성물.
[137] 문단 [136]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
[138] 문단 [136]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
[139] 문단 [138]에 있어서, 유전자가 CIITA인, 조성물.
[140] 문단 [123]-[139] 중 어느 하나에 있어서, 암 세포주의 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
[141] 문단 [140]에 있어서, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
[142] 문단 [140] 또는 [141]에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
[143] 문단 [140]-[142] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는, 조성물.
[144] 문단 [140]-[143] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는, 조성물.
[145] 문단 [144]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 조성물.
[146] 문단 [145]에 있어서, MHC-I 알파 및 B2M이 링커에 의해 연결된, 조성물.
[147] 문단 [146]에 있어서, 링커는 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수인, 조성물.
[148] 문단 [140]-[147] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는, 조성물.
[149] 문단 [123]-[148] 중 어느 하나에 있어서, T 세포가 복수의 T 세포이고, 각각이 대상체로부터 유래된 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는, 조성물.
[150] 문단 [149]에 있어서, 복수의 T 세포가 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함하는, 조성물.
[151] TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가하기 위한 방법으로서,
(a) 암 세포주로부터 유래되고, 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 또는 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인 단계;
(b) 복수의 세포를 동일한 대상체로부터 유래된 복수의 TCR을 발현하는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 TCR 또는 이의 분획은 복수의 세포 또는 이의 분획의 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 것인, 단계; 및
(c) (b)에서 접촉시킨 후, (i) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 복수의 세포의 분획, (ii) 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포의 분획, 및/또는 (iii) 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 분비되는 사이토카인의 양 또는 수준을 정량화하는 단계
를 포함하는, 방법.
[152] 문단 [151]에 있어서, 복수의 세포의 내인성 MHC 분자는 불활성화되는, 방법.
[153] 문단 [151] 또는 [152]에 있어서, 복수의 세포가 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 방법.
[154] 문단 [151]-[153] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 세포가 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 방법.
[155] 문단 [151]-[154] 중 어느 하나에 있어서, 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[156] 문단 [155]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화되는, 방법.
[157] 문단 [156]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[158] 문단 [155]-[157] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화되는, 방법.
[159] 문단 [158]에 있어서, MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[160] 문단 [155]-[159] 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화되는, 방법.
[161] 문단 [160]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[162] 문단 [160] 또는 [161]에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
[163] 문단 [151]-[162] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 세포의 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
[164] 문단 [163]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는, 방법.
[165] 문단 [163]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는, 방법.
[166] 문단 [165]에 있어서, 외인성 MHC 분자가 MHC-I 알파와 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 방법.
[167] 문단 [166]에 있어서, MHC-I 알파와 B2M이 링커에 의해 연결된 것인, 방법.
[168] 문단 [151]-[167] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는, 방법.
[169] 문단 [151]-[168] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 대상체로부터 단리되는, 방법.
[170] 문단 [151]-[169] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포가 1차 T 세포를 포함하는, 방법.
[171] 문단 [151]-[168] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포가 조작된 세포를 포함하는, 방법.
[172] 문단 [171]에 있어서, 조작된 세포가 외인성 TCR을 발현하는, 방법.
[173] 문단 [151]-[172] 중 어느 하나에 있어서, (i) 또는 (ii)의 분획을 정량하는 단계가 유세포 분석 기반 방법을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
[174] 문단 [173]에 있어서, 유세포 분석 기반 방법이 FACS 또는 MACS인, 방법.
[175] 문단 [151]-[172] 중 어느 하나에 있어서, (i)의 분획을 정량하는 단계가 분획으로부터 방출된 젖산 탈수소효소의 양을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
[176] 동일한 암 유형으로부터 유래된 MHC-조작된 암 세포주의 패널을 포함하는 조성물로서,
동일한 제1 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제1 하위 패널; 및
동일한 제2 부모 암 세포주로부터 유래된 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제2 하위 패널을 포함하고;
여기서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현하는 것인, 조성물.
[177] 문단 [176]에 있어서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주가 동일한 외인성 및/또는 내인성 MHC 분자를 발현하지 않는, 조성물.
[178] 문단 [176] 또는 [177]에 있어서, 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주가 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하고, 각각의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현하는 것인, 조성물.
[179] 문단 [176]-[178] 중 어느 하나에 있어서, 제1 부모 암 세포주와 제2 부모 암 세포주가 상이한 것인, 조성물.
[180] 문단 [176]-[179] 중 어느 하나에 있어서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널의 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 내인성 MHC 분자가 불활성화되는, 조성물.
[181] 문단 [176]-[180] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 MHC 분자가 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래되는, 조성물.
[182] 문단 [176]-[181] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 T 세포를 추가로 포함하는 조성물.
[183] 문단 [182]에 있어서, 제1 하위 패널 또는 제2 하위 패널에서 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주의 각각의 암 세포주가 복수의 T 세포와 혼합되는, 조성물.
[184] 문단 [182] 또는 [183]에 있어서, 복수의 T 세포가 적어도 2개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함하는, 조성물.
[185] 문단 [184]에 있어서, 천연적으로 쌍을 이룬 TCR이 동일한 대상체로부터 유래되는 것인, 조성물.
[186] 문단 [176]-[185] 중 어느 하나에 있어서, MHC-조작된 암 세포주의 패널이 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 두/경부암, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 연조직 육종 또는 위암으로부터 유래되는, 조성물.
[187] 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법으로서,
(a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 항원-제시 세포(APC)를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 MHC 분자는 대상체에 의해 발현되거나 대상체로부터 유래된 MHC 분자인 단계;
(b) APC를 대상체로부터 유래된 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 TCR-발현 세포 또는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 APC의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하고, 내인성 항원을 인식하는 복수의 TCR-발현 세포 또는 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 (i) 내인성 항원을 인식 시, APC로부터 분비된 표지 또는 APC와 연관된 표지-전달 효소에 의해 전달되는 표지에 부착되거나, (ii) 내인성 항원을 인식 시 활성화 마커를 발현하는 것인, 단계; 및
(c) 표지 또는 활성화 마커에 기초하여 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별함으로써 항원-반응성 세포를 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
[188] 문단 [187]에 있어서, 식별하는 단계가 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축시키는 것을 포함하는, 방법.
[189] 문단 [187] 또는 [188]에 있어서, APC가 적어도 약 100개의 내인성 항원을 발현하는, 방법.
[190] 문단 [187]에 있어서, 방법이 복수의 TCR-발현 세포 중 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획, 또는 하위집합 중 TCR-발현 세포의 수에 기초하여 대상체에게 암 약물을 투여할지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[191] 문단 [187]-[189] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 수를 정량화하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[192] 문단 [191]에 있어서, (b)에서 접촉하기 전에, 복수의 TCR-발현 세포의 수를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[193] 문단 [192]에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포에서 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 분획을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[194] 문단 163 또는 [193]에 있어서, 하위집합 중 TCR-발현 세포의 분획 또는 수에 기초하여 대상체에게 암 약물을 투여할지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
[195] 문단 [194]에 있어서, 분획에 기초하여 암 약물로 치료하기에 적합한 것으로 결정된 대상체에게 암 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[196] 문단 [194]에 있어서, 분획에 기초하여 암 약물로의 치료에 부적합한 것으로 결정된 대상체에게 암 약물을 투여하지 않는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[197] 문단 [194] 또는 [195]에 있어서, 대상체에 대한 암 약물의 용량을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[198] 문단 [194] 또는 [195]에 있어서, 대상체에 대한 암 약물의 용량을 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[199] 문단 [194]-[198] 중 어느 하나에 있어서, 암 약물이 면역 세포 조절자인, 방법.
[200] 문단 [199]에 있어서, 면역 세포 조절자가 사이토카인 또는 면역 관문 저해제인, 방법.
[201] 문단 [187]-[200] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합의 TCR 서열을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[202] 문단 [201]에 있어서, 발현을 위해 TCR 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 수혜자 세포로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[203] 문단 [202]에 있어서, 수혜자 세포는 전달 전에 TCR 서열을 포함하지 않는 방법.
[204] 문단 [203]에 있어서, 수혜자 세포의 내인성 TCR이 불활성화되는, 방법.
[205] 문단 [202]-[204] 중 어느 하나에 있어서, 수혜자 세포가 T 세포인, 방법.
[206] 문단 [205]에 있어서, T 세포가 자가 T 세포 또는 동종 T 세포인, 방법.
[207] 문단 [202]-[206] 중 어느 하나에 있어서, 수혜자 세포 또는 이의 파생물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
[208] 문단 [188]-[207] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 적어도 2개의 상이한 TCR을 발현하는, 방법.
[209] 문단 [208]에 있어서, 적어도 2개의 상이한 TCR의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[210] 문단 [209]에 있어서, 발현을 위해 복수의 수용체 세포 내로 적어도 2개의 상이한 TCR을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드 분자를 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[211] 문단 [210]에 있어서, 복수의 수혜자 세포를 APC 또는 추가적인 APC와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[212] 문단 [211]에 있어서, 복수의 수혜자 세포로부터 수혜자 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 수혜자 세포는 APC 또는 추가적인 APC를 인식하는 것인, 방법.
[213] 문단 [187]-[212] 중 어느 하나에 있어서, 표지가 검출 가능한 모이어티를 포함하고, 검출 가능한 모이어티가 유세포 분석에 의해 검출 가능한 것인, 방법.
[214] 문단 [213]에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 비오틴, 형광 염료, 펩타이드, 디곡시제닌, 또는 접합 핸들인, 방법.
[215] 문단 [214]에 있어서, 접합 핸들이 아지드, 알킨, DBCO, 테트라진, 또는 TCO를 포함하는, 방법.
[216] 문단 [187]-[215] 중 어느 하나에 있어서, 표지가 표지-전달 효소에 의해 인식되는 기질을 포함하는, 방법.
[217] 문단 [187]-[216] 중 어느 하나에 있어서, 표지가 APC에 의해 분비되는 사이토카인인, 방법.
[218] 문단 [187]-[217] 중 어느 하나에 있어서, 표지-전달 효소가 트랜스펩티다제 또는 글리코실트랜스퍼라제인, 방법.
[219] 문단 [218]에 있어서, 트랜스펩티다제가 소르타제인, 방법.
[220] 문단 [219]에 있어서, 글리코실트랜스퍼라제가 푸코실트랜스퍼라제인, 방법.
[221] 문단 [187]-[220] 중 어느 하나에 있어서, 표지-전달 효소가 APC에 의해 발현되거나 외부에서 공급되어 APC에 부착되는, 방법.
[222] 문단 [221]에 있어서, 표지-전달 효소가 막관통 단백질인, 방법.
[223] 문단 [221]에 있어서, 표지-전달 효소가 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 APC에 부착되는, 방법.
[224] 문단 [187]-[223] 중 어느 하나에 있어서, APC가 대상체로부터 유래되는 것인, 방법.
[225] 문단 [187]-[224] 중 어느 하나에 있어서, APC가 암 세포주인, 방법.
[226] 문단 [187]-[225] 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 암을 갖고 있는, 방법.
[227] 문단 [226]에 있어서, 암 세포주가 대상체의 암과 동일한 암 유형에서 유래되는, 방법.
[228] 문단 [187]-[225] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포가 T 세포를 포함하는, 방법.
[229] 문단 [228]에 있어서, T 세포가 종양-침윤 T 세포 또는 말초 T 세포인, 방법.
[230] 문단 [229]에 있어서, T 세포가 LAG3, CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3 또는 이들의 임의의 조합을 발현하는, 방법.
[231] 문단 [187]-[230] 중 어느 하나에 있어서, 복수의 TCR-발현 세포가 표지-수용 모이어티를 포함하고, 표지-수용 모이어티가 표지를 수용하는, 방법.
[232] 문단 [187]-[231] 중 어느 하나의 방법에 의해 식별되는 항원-반응성 세포 또는 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
SEQUENCE LISTING <110> ROOTPATH GENOMICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR T-CELL RECEPTOR IDENTIFICATION <130> 53563-709.601 <140> PCT/US2021/056208 <141> 2021-10-22 <150> 63/128,274 <151> 2020-12-21 <150> 63/104,624 <151> 2020-10-23 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> SITE <222> (1)..(50) <223> This sequence may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 2 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo 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Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr 130 135 140 Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly 145 150 155 160 Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser 165 170 175 Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu 180 185 190 Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His 195 200 205 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala 210 215 220 Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp 225 230 235 240 Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 245 250 255 Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met 260 265 270 Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu 275 280 285 Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg 290 295 300 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys 305 310 315 320 Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg 325 330 335 Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 340 345 350 Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 355 360 365 Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 370 375 380 Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 385 390 395 400 Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile 405 410 415 Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile 420 425 430 Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp 435 440 445 Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln 450 455 460 Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val 465 470 475 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tccatctggt catagaag 18 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Asp Ser Ser Leu Gln Ala Arg Leu Phe Pro Gly Leu Thr Ile Lys Ile 1 5 10 15 Gln Arg Ser Asn Gly Leu Ile His Ser 20 25

Claims (103)

  1. 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법으로서,
    (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 MHC 분자는 상기 대상체에 의해 발현되거나 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인 것인, 단계;
    (b) 상기 암 세포주를 제1 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포 또는 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합은 상기 암 세포주의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 내인성 항원에 의해 활성화되는 것인, 단계; 및
    (c) (b)에서 접촉시킨 후, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하여 상기 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 상기 항원-반응성 세포를 식별하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, (c)에서 식별하는 단계가 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 농축 또는 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 암 세포주에 대해 외인성인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법이 (a)에서 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 추가적인 내인성 항원을 발현하는 비-암 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 외인성 MHC 분자는 상기 동일한 대상체로부터 유래되는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, (b)에서 상기 비-암 세포를 제2 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 상기 비-암 세포의 외인성 MHC와 복합체를 이루는 추가적인 내인성 항원에 의해 활성화되는 것인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 추가적인 내인성 항원이 상기 암 세포주에 의해 발현되는 상기 내인성 항원과 동일하거나 상이한 것인, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-암 세포가 (i) 상기 암 세포주에 의해 발현되는 상기 내인성 항원을 발현하지 않거나, (ii) 상기 암 세포주에 의해 발현되는 상기 내인성 항원을 더 낮은 수준으로 발현하거나, 또는 (iii) 상기 암 세포주에 의해 발현되는 상기 내인성 항원을 발현하지만, 상기 암 세포주에 의해 발현되는 내인성 항원을 제시하지 않는 것인, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복수 및 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복수 및 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포가 동일한 TCR을 발현하는 것인, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복수 또는 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포가 상이한 TCR을 발현하는 것인, 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (c)에서 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식별하는 단계가 마커에 기초하여 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합 및/또는 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 선택하는 것이 상기 마커에 기초하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 발현되지만, 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서는 발현되지 않는 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 암 세포주의 상기 외인성 MHC와 복합체를 이루는 상기 내인성 항원에 의해 활성화되는 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합에서 세포의 TCR, 및 상기 비-암 세포의 상기 외인성 MHC와 복합체를 이루는 상기 추가적인 내인성 항원에 의해 활성화되지 않는 상기 제2 복수의 TCR-발현 세포 내의 세포에 있는 것을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-암 세포가 줄기 세포 또는 1차 세포인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포(iPSC)인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비-암 세포가 분화된 iPSC인, 방법.
  20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-암 세포가 자가면역 조절자(AIRE)를 발현하는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주 또는 상기 비-암 세포의 내인성 MHC 분자가 불활성화(예를 들어, 녹다운, 또는 녹아웃)되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주 또는 비-암 세포가 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주 또는 비-암 세포가 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 상기 알파 사슬 또는 상기 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 유전자가 CIITA인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주 또는 상기 비-암 세포의 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 MHC-I 알파와 상기 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 MHC-I 알파와 상기 B2M이 링커에 의해 연결되는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 링커가 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수인, 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 TCR-발현 세포가 상기 동일한 대상체로부터 단리되는 것인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 TCR-발현 세포가 1차 T 세포를 포함하는 것인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 1차 T 세포가 종양-침윤 T 세포인, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 1차 T 세포가 말초 T 세포인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 말초 T 세포가 종양-경험이 있는 T 세포인, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 말초 T 세포가 PD-1+ T 세포인, 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 T 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
  51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 T 세포가 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 TCR-발현 세포가 조작된 세포를 포함하는 것인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 조작된 세포가 외인성 TCR을 발현하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 외인성 TCR이 상기 동일한 대상체로부터 단리된 1차 T 세포로부터 유래되는 것인, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 이전에, 상기 대상체로부터 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 원발성 암 세포 또는 상기 종양 샘플 및 암 세포주의 전사체 또는 게놈 분석을 수행하여, 상기 대상체로부터 단리된 원발성 암 세포 또는 종양 샘플을 닮은 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 변경을 갖는 상기 암 세포주를 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 암 세포주와 상기 원발성 암 세포 또는 상기 종양 샘플 사이의 상기 유전자 발현 프로파일, 상기 전사체 프로파일 또는 상기 게놈 변경의 상관 계수가 약 0.1 이상인, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, (c)에서 상기 하위집합의 TCR을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항원-반응성 세포에 의해 발현된 TCR의 서열을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 TCR의 서열을 식별하는 단계가 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 상기 하위집합의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 TCR의 서열을 식별하는 단계가 상기 암 세포주와 접촉하기 전에 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 하위집합에서 상기 항원-반응성 세포에 의해 발현되는 TCR의 빈도가 상기 제1 복수 중 상기 항원-반응성 세포에 의해 발현되는 상기 TCR의 빈도보다 더 높은 것인, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-반응성 세포 또는 상기 항원-반응성 세포의 상기 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복수의 TCR-발현 세포가 상기 동일한 대상체로부터 유래된 적어도 10개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 복수의 TCR을 발현하는 것인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 복수의 TCR이 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하는 것인, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포주인 상기 세포가 적어도 약 50, 100, 1,000개 이상의 세포를 포함하는 것인, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 이전에, 상기 암 세포주를 사멸시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 사멸시키는 단계가 상기 암 세포주를 화학적 화합물로 처리하거나 방사선조사하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 세포독성 화합물인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 세포독성 화합물이 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 다카바진, 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프라임, 프로카르바진, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 다우노마이신, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항의 방법에 의해 식별된 항원-반응성 세포 또는 상기 항원-반응성 세포의 TCR을 암호화하는 서열을 포함하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  72. 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 암 세포주의 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하기 위한 조성물로서,
    외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 암 세포주인 세포로서, 상기 외인성 MHC 분자는 상기 대상체에 의해 발현되거나 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인, 세포; 및
    상기 대상체로부터 유래되는 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는 T 세포로서, 상기 암 세포주의 유전자 발현 프로파일, 전사체 프로파일 또는 게놈 교대(genomic alternation)가 상기 대상체로부터의 암 세포의 것과 닮은, T 세포
    를 포함하는, 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 암 세포주와 상기 원발성 암 세포 또는 상기 종양 샘플 사이의 상기 유전자 발현 프로파일, 상기 전사체 프로파일 또는 상기 게놈 변경의 상관 계수가 약 0.1 이상인, 조성물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 암 세포주가 외인성 항원을 포함하거나 제시하지 않는 것인, 조성물.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주의 내인성 MHC 분자가 불활성화된 것인, 조성물.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주가 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 조성물.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주가 모든 내인성 MHC 분자에 대해 결손인, 조성물.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 MHC 분자가 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬(MHC-I 알파)이 불활성화된 것인, 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 알파 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 베타-2-마이크로글로불린(B2M)이 불활성화된 것인, 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자의 B2M을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 알파 사슬 또는 베타 사슬이 불활성화된 것인, 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 상기 알파 사슬 또는 상기 베타 사슬을 암호화하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
  87. 제85항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자의 전사를 조절하는 유전자가 불활성화된 것인, 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 유전자가 CIITA인, 조성물.
  89. 제72항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포주의 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  90. 제89항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자가 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC-I 알파 및 내인성 B2M을 포함하는 것인, 조성물.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래되는 MHC-I 알파 및 B2M 둘 모두를 포함하는 것인, 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 MHC-I 알파와 상기 B2M의 융합 단백질(B2M-MHC-I-알파 융합체)인, 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 상기 MHC-I 알파와 상기 B2M이 링커에 의해 연결된 것인, 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 링커가 (G4S)n이고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 10의 정수인, 조성물.
  97. 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 MHC 분자가 상기 대상체로부터 유래된 MHC-II 알파 및 MHC-II 베타를 포함하는 것인, 조성물.
  98. 제72항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 복수의 T 세포이고, 각각이 상기 대상체로부터 유래된 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 발현하는 것인, 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 상기 복수의 T 세포가 상기 대상체로부터 유래되는 적어도 10개의 상이한 천연적으로 쌍을 이룬 TCR을 포함하는 것인, 조성물.
  100. TCR-발현 세포의 항암 활성을 평가하는 방법으로서,
    (a) 복수의 세포를 제공하는 단계로서, 상기 복수의 세포는 암 세포주로부터 유래되고 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하며, 상기 외인성 MHC 분자는 상기 대상체에 의해 발현되거나 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인, 단계;
    (b) 상기 복수의 세포를 상기 동일한 대상체로부터 유래된 복수의 TCR을 발현하는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 TCR 또는 이의 분획이 상기 복수의 세포의 외인성 MHC 분자 또는 이의 분획과 복합체를 이루는 상기 내인성 항원을 인식하는 것인 단계; 및
    (c) (b)에서 접촉시킨 후, (i) 상기 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 인식되는 상기 복수의 세포의 분획, (ii) 상기 복수의 세포 또는 이의 분획을 인식하는 상기 복수의 TCR-발현 세포의 분획, 및/또는 (iii) 상기 복수의 TCR-발현 세포 또는 이의 분획에 의해 분비되는 사이토카인의 양 또는 수준을 정량화하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  101. 동일한 암 유형으로부터 유래된 MHC-조작된 암 세포주의 패널을 포함하는 조성물로서,
    동일한 제1 부모 암 세포주로부터 유래되는 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제1 하위 패널; 및
    동일한 제2 부모 암 세포주로부터 유래되는 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주를 포함하는 제2 하위 패널
    을 포함하고;
    여기서, 상기 제1 하위 패널 또는 상기 제2 하위 패널의 상기 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주는 상이한 외인성 MHC 분자를 발현하는 것인, 조성물.
  102. 제101항에 있어서, 상기 제1 하위 패널 또는 상기 제2 하위 패널의 상기 적어도 2개의 MHC-조작된 암 세포주가 동일한 외인성 및/또는 내인성 MHC 분자를 발현하지 않는 것인, 조성물.
  103. 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 인식하는 항원-반응성 세포를 식별하는 방법으로서,
    (a) 외인성 MHC 분자와 복합체를 이루는 내인성 항원을 발현하는 항원 제시 세포(APC)를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 MHC 분자는 상기 대상체에 의해 발현되거나 상기 대상체로부터 유래되는 MHC 분자인, 단계;
    (b) 상기 APC를 상기 대상체로부터 유래되는 복수의 TCR-발현 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 TCR-발현 세포 또는 상기 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 상기 APC의 상기 외인성 MHC와 복합체를 이루는 상기 내인성 항원을 인식하고, 상기 내인성 항원을 인식하는 상기 복수의 TCR-발현 세포 또는 상기 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합이 (i) 상기 내인성 항원을 인식 시, 상기 APC로부터 분비된 표지 또는 상기 APC와 연관된 표지-전달 효소에 의해 전달되는 표지에 부착되거나, 또는 (ii) 상기 내인성 항원을 인식 시 활성화 마커를 발현하는 것인, 단계; 및
    (c) 상기 표지 또는 상기 활성화 마커에 기초하여 상기 복수의 TCR-발현 세포의 하위집합을 식별하여, 상기 항원-반응성 세포를 식별하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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