KR20230080039A - 3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 이의 제조 방법 - Google Patents

3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 소정의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정 에 관한 것이다.

Description

3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 이의 제조 방법 {CRYSTALS OF 3-HYDROXYPROPIONATE AND PREPARATION METHOD OF THE SAME}
본 발명은 3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3HP)은 아크릴산(acrylic acid), 아크릴산메틸(methyl acrylate), 아크릴아마이드(acrylamide) 등의 다양한 화학 물질로 전환 가능한 플랫폼 화합물이다. 2004년 미국 Department of Energy(DOE)로부터 Top 12 value-added bio-chemical로 선정된 이후 학계와 산업계에서 활발히 연구되고 있다.
3-하이드록시프로피온산의 생산은 크게 화학적 방법과 생물학적 방법의 두 가지 방법으로 이루어지나, 화학적 방법의 경우 초기 물질이 고가인 점, 생산 과정 중 독성 물질이 생성되는 점 등에 의해 비친환경적이라는 지적이 있어, 친환경적인 바이오 공정이 각광받고 있다.
미생물 발효에 의한 유기산의 제조시, 미생물을 발효하는 과정에서 3-하이드록시프로피온산 등의 유기산 이외에 다른 부산물도 함께 생성되기 때문에, 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 과정이 필요하다.
이에 따라, 생물학적 방법을 통해서도 고순도 및 고수율의 3-하이드록시프로피온산을 제공할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은, 불순물을 매우 낮은 함량을 포함할 뿐만 아니라, 정제가 용이하고 열안정성 및 형태 안정성 등이 우수한 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은, 정제가 용이하고 열안정성 및 형태 안정성 등이 우수한 고순도의 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기 제공되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정으로부터 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 공정을 제공하기 위한 것이다.
본 명세서에서는, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계; 및 상기 농축액과 비용매를 접촉시켜서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법에서 얻어진 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산염의 결정, 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 대해서 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 명세서에서 기술하는 제조 방법을 구성하는 단계들은 순차적 또는 연속적임을 명시하거나 다른 특별한 급이 있는 경우가 아니면, 하나의 제조 방법을 구성하는 하나의 단계와 다른 단계가 명세서 상에 기술된 순서로 제한되어 해석되지 않는다. 따라서 당업자가 용이하게 이해될 수 있는 범위 내에서 제조 방법의 구성 단계의 순서를 변화시킬 수 있으며, 이 경우 그에 부수하는 당업자에게 자명한 변화는 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
발명의 일 구현예에 따르면, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 제공된다.
본 발명자들은 소정의 조건에서 형성된 3-하이드록시프로피온산의 농축액을 비용매를 접촉시켜서 형성되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 X-선 회절 스펙트럼(XRD)에서 상술한 특정의 피크를 갖는다는 점을 확인하였으며, 이러한 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 불순물을 매우 낮은 함량을 포함하고 비정형 물질 등과 비교하여 정제가 용이할 뿐만 아니라, 결정 상태에서 형태 안정성 및 가열 안정성 등도 우수하여, 높은 순도를 갖는 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 대량 생산 가능하게 할 수 있다는 점을 실험을 통해서 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 알칼리 금속염 존재 하에 형성된 하이드록시프로피온산의 농축액에 비용매를 접촉시키는 경우 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염이 생성되며, 생성된 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 농도가 증가하면서 미세 결정을 이루게 되어 고체-액체 상분리가 일어나게 된다. 이후 결정화가 진행됨에 따라 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 고체 결정(3-하이드록시프로피온산염의 결정)으로 성장하여, 글리세롤, 1,3-프로판디올 등과 같은 액상의 불순물과 분리되면서 생성된 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 불순물을 매우 낮은 함량으로 포함하게 된다. 이때, 상기 비용매는 생성된 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 결정화를 촉진시키는 역할을 하여, 고체-액체 분리능이 증가되며 보다 높은 순도를 갖는 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 생성할 수 있게 한다.
이러한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정 상태는 X-선 회절(XRD) 그래프에서 피크 등을 통해 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0, 또는 11.3 내지 12.7, 또는 11.8 내지 12.50 의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크가 나타날 수 있다.
이러한 피크는 수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 또는 황산 마그네슘(Mg(SO4))에 대한 X선 회절(XRD) 분석 결과와는 상이한 결과를 나타내는 것이며, X선 회절(XRD) 분석 결과 2θ값이 상술한 범위에서 특정 피크가 나타나는 경우 상기 구현예의 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 형성되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염(예를 들어, 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염 또는 마그네슘염)의 경우, 기존의 무기 칼슘, 마그네슘 염 등의 결정상과는 다른 형태를 이루는데, 이는 육안이나 SEM등의 형상적인 특성으로 분석이 어렵다. 그러나, 결정을 형성하는 금속(예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘)과 3-하이드록시프로피온산의 결합 구조에 따라 X선 회절(XRD) 분석 값이 상이하므로, 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 X-선 회절 스펙트럼(XRD)을 측정하여 나타나는 각각의 고유 피크들의 분석을 통해 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 확인할 수 있다.
또한, 후술하는 바와 같이 상기 각각의 피크들의 위치별 2θ값을 통해 3-하이드록시프로피온산염의 결정에서 금속-3HP의 분자 크기(길이)를 확인할 수 있으며, 각 분자사이의 분자간 거리도 확인할 수 있다.
이때, 상술한 제1피크와 후술하는 제2피크 내지 제4피크 외에 생성되는 피크는 금속원소와 인접원소 간의 거리, 금속-금속간의 거리로 무기염 형태의 피크와 중첩되거나 인접하여, 유기물과의 결합으로 이루어져 발생하는 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 피크와는 상이하다.
상기 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 나타나는 제1피크는 금속과 3-하이드록시프로피온산 두 분자의 결합으로 형성되는 염 분자의 길이(크기)를 나타내는 것으로, 하기 수학식 1의 Bragg의 법칙을 통해 금속과 두개의 3-하이드록시프로피온산으로 이루어진 염 분자의 길이(크기)를 알 수 있다.
[수학식 1]
n*λ = 2d*sinθ
상기 수학식 1에서 n은 1, λ은 Cu 고유상수로 1.54Å, d는 결합면과의 거리 또는 분자(간)의 거리(길이)를 의미한다.
이때, 상기 수학식 1에 의해 제1피크에서 계산된 d 값은 약 7.0 내지 7.5로, 3-하이드록시프로피온산의 한 분자 길이는 약 4.3Å이므로, 이를 통해 두 분자의 3-하이드록시프로피온산과 금속(예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘)의 결합 구조로 인해 금속을 중심으로 화학적으로 안정한 에너지 준위로 3-HP가 배치되어 굽은 형태로 분자구조를 이루는 것을 유추할 수 있다.
또한, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 30°의 범위에서 1개 이상, 또는 3개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 9개 이상의 피크가 나타날 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 19.0 내지 21.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제2피크를 포함할 수 있고, 또는 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 22.0 내지 23.80의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제3피크를 포함할 수 있고, 또는 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 24.0 내지 25.00의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제4피크를 포함할 수 있다.
이때, 상기 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 19.0 내지 21.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 나타나는 제2피크를 통해 3-하이드록시프로피온산 한 분자의 길이를 유추할 수 있다.
구체적으로, 상기 수학식 1에 의해 제2피크에서 계산된 d 값이 제1피크에서 계산된 d 값의 절반 정도로 나타나는 것을 통해, 금속과 두개의 3-하이드록시프로피온산으로 이루어진 염 분자의 길이(크기)의 절반인 3-하이드록시프로피온산 한 분자의 길이를 유추할 수 있다.
또한, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 22.0 내지 23.80의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제3피크 및 24.0 내지 25.00의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제4피크를 통해, 금속과 두개의 3-하이드록시프로피온산으로 이루어진 염 분자들 사이의 거리, 즉 염 분자간의 거리를 유추할 수 있다.
한편, 상기 입사각(θ)이란 X선이 특정 결정면에 조사될 때, 결정면과 X선이 이루는 각도를 의미하며, 상기 피크란, x-y 평면에서의 가로축(x축)이 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이고, x-y 평면에서의 세로축(y축)이 회절 강도인 그래프 상에서, 가로축(x축)인 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이 양의 방향으로 증가함에 따라, 세로축(y축)인 회절 강도에 대한 가로축(x축)인 X선의 입사각의 2배(2θ)값의 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 양의 값에서 음의 값으로 변하는, 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 0인 지점을 의미한다.
한편, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 나타나는 제1피크에서의 반치전폭으로 계산되는 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기(gran domain size)는 30 nm 이상, 40 nm 이상, 50 nm 이상일 수 있고, 100 nm 이하, 90 nm 이하, 80 nm 이하일 수 있다.
상기 반치전폭(full width at half maximum, FWHM)은 1이상의 피크를 가진 분포곡선에 있어서 피크 높이의 세로 좌표값의 2분의 1인 점을 통과하는 가로 좌표에 평행한 직선을 그었을 때 곡선과 두점에서 교차하는 경우, 이 두 점 사이의 거리를 말하는데, X선 회절(XRD) 분석시 얻은 결과로부터 얻어진 피크의 반치전폭(full width at half maximum, FWHM)은 결정크기(Crystallite size)과 관련된다.
이때, 일반적으로 결정크기를 계산할 때 Peak 모양이 좌우 대칭되는 종 모양으로 가정하고 계산되는데, 실제 Peak 모양은 좌우 대칭되지 않고 스트레인(strain) 등의 영향으로 peak broadening이 나타날 수 있고, 상기 반치 전폭(full width at half maximum, FWHM)은 이러한 peak broadening을 무시하고 Lorenzian 방식으로 계산한 것일 수 있다.
상술한 바와 같이, 알칼리 금속염 존재 하에 형성된 하이드록시프로피온산의 농축액에 비용매를 접촉시키는 경우 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염이 생성되며, 생성된 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 농도가 증가하면서 미세 결정을 이루게 되고, 이후 결정화가 진행됨에 고체 결정(3-하이드록시프로피온산염의 결정)으로 성장한다.
즉, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염이 미세 결정을 이루고, 비용매의 비율, 건조 조건 등에 의해 상기 미세 결정이 성장하여 광학적으로 측정 가능할 정도의 마이크로 사이즈로 성장하며, 결정화가 진행되어 3-하이드록시프로피온산염의 결정으로 생성된다.
이때, 상기 제1피크에서 반치전폭으로 계산되는 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기(gran domain size)는 조건에 따라 커질 수도 작아질 수도 있으나, 30 내지 100 nm인 것이 불순물의 제거가 용이하고 작업성이 우수하다.
상기 미세 결정 크기가 지나치게 클 경우 쉽게 마이크로 사이즈의 결정이 생성되지만, 불순물의 제거가 어렵고, 지나치게 작을 경우 불순물 제거는 좋지만 미세결정이 성장하여 회수될 수 있는 결정화 시간이 길어질 수 있다.
상기 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 나타나는 제1피크에서의 미세 결정 크기를 통해 알칼리금속과 두 분자의 3HP의 결합으로 생성되는 유기산염 결정의 미세 결정의 크기[시작핵(seed)의 크기]를 알 수 있으며, 이를 통해 유기산과 알칼리금속의 결합으로 생성되는 유기산염 결정을 판단할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기는, 하기 수학식 2의 Scherer equation을 이용하여 계산될 수 있다.
[수학식 2]
τ = (K* λ) / βcosθ
상기 수학식 2에서, K는 형상계수로 0.9이며, λ은 Cu 고유상수로 1.54Å, β는 피크의 반치전폭(FWHM, radian), τ는 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기(nm)를 의미한다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함할 수 있으며, 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태일 수 있다. 즉, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태의 3-하이드록시프로피온산염을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염 또는 마그네슘염일 수 있다.
하기 구조식 1 및 구조식 2에서 Cation은 Na+, Mg2+ 또는 Ca2+ 일 수 있으며, 보다 구체적으로 Mg2+ 또는 Ca2+ 일 수 있다.
하기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산을 의미하며, n은 양이온과 결합하는 3HP 수로 1 이상의 정수일 수 있고 보다 구체적으로 2일 수 있다.
하기 구조식 2에서 m은 수화물에서 Cation(3HP)n과 결합하는 물 분자의 수로, 1 이상의 정수일 수 있고 보다 구체적으로 2일 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 1 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 8 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상이거나, 200 ㎛ 이하, 180 ㎛ 이하, 또는 160 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10은 2 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 4 ㎛ 이상 78 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D90은 10 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 210 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 205 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 입자 크기 분포 D50, D10, D90은 입자의 입경 분포 곡선에 있어서, 각각 체적 누적량의 50%, 10%, 90%에 해당하는 입경을 의미하는 것으로, 상기 D50, D10, D90은 예를 들어, 레이저 회절법(laser diffraction method)을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 레이저 회절법은 일반적으로 서브미크론(submicron) 영역에서부터 수 mm 정도의 입경의 측정이 가능하며, 고 재현성 및 고 분해성의 결과를 얻을 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 0.70 이상 3.00 이하, 0.75 이상 2.90 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D50, D10, D90가 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경, 개수 평균 입경 및 체적 평균 입경이 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
한편, 상술한 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 회절각도(2θ±0.2°)에서의 피크로 정의되는 결정 특징을 갖는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 불순물을 매우 낮은 함량을 포함하는데, 보다 구체적으로 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에는 글리세롤, 1,3-프로판디올, 및 아세테이트를 포함한 잔류 성분 함량이 100 ppmw 이하이거나 50 ppmw 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는, 회수된 전체 결정의 질량 대비 상기 구조식 1 및/또는 구조식 2의 구조식을 갖는 화합물의 질량의 백분율(%)로 계산될 수 있다. 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상 일 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 칼 피셔 방법(Karl Fischer method)으로 결정 내에 포함된 수분 함량을 측정할 수 있으며, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량은 200 ppm 이상 5000 ppm 이하, 250 ppm 이상 4800 ppm 이하, 300 ppm 이상 4600 ppm 이하, 350 ppm 이상 4400 ppm 이하일 수 있다.
이때, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 수분은 결정 수분(예를 들어 Ca(3HP)2·2H2O)이 아닌 결정 사이에 포함된 부착 수분을 의미한다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량이 지나치게 많으면 결정 고체가 아닌 슬러리 형태로 회수되거나, 수분 내에 불순물이 함유되어 순도 향상 저하에 문제가 될 수 있다.
한편, 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하는 등의 공정을 통해 3-하이드록시프로피온산을 제조함에 따라, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 방사성 탄소 동위원소(14C)를 포함할 수 있다.
방사성 탄소 동위원소(14C)는 지구 대기 중에 탄소 원자 1012개 당 거의 1개이며, 반감기는 약 5700년이고, 탄소 스톡 (stock)은 우주선 (cosmic ray)과 일반 질소 (14N)가 참여하는 핵 반응으로 인해 대기 상층에 풍부할 수 있다. 한편, 화석 연료에는 방사성 탄소 동위원소 오래전에 붕괴되어 14C 비율이 실질적으로 0일 수 있다. 3-하이드록시프로피온산 원료로 바이오 유래 원료를 사용하거나, 이와 함께 화석 연료를 병용할 경우, ASTM D6866-21 규격으로 3-하이드록시프로피온산 내에 포함된 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC; percent modern carbon)과 바이오 탄소의 함량을 측정할 수 있다.
측정 방법은 예를 들어, 측정 대상 화합물에 포함되는 탄소 원자를 그라파이트 또는 이산화탄소 가스 형태로 만들고 질량 분석기로 측정하거나, 액체 섬광 분광법에 따라 측정할 수 있다. 이때, 상기 질량 분석기 등과 함께 14C 이온을 12C 이온으로부터 분리하기 위한 가속기를 함께 사용해 2개의 동위 원소를 분리하여 함량 및 함량비를 질량 분석기로 측정할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소의 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상, 50 pMC 이상, 90 pMC 이상, 100 pMC 이상일 수 있고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량%일 수 있다.
상기 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미하고, 1950년대 핵 실험 프로그램의 효력이 지속되고 있고 소멸되지 않아, 100% 보다 클 수 있다.
또한, 상기 바이오 탄소의 함량은 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 전체 탄소 함량에 대한 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 이 값이 클수록 친환경성 화합물에 해당할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC) 및 바이오 탄소 함량이 지나치게 적으면, 친환경성이 감소하며, 바이오 유래 물질이라 볼 수 없을 수 있다.
한편, 발명의 다른 구현예에 따르면, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계; 및 상기 농축액과 비용매를 접촉시켜서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법이 제공될 수 있다.
본 발명자들은, 알칼리 금속염이 존재 하에 형성된 하이드록시프로피온산의 농축액을 비용매를 접촉시키면 과농축에 의해 빠른 속도로 생성되는 결정에 비해 결정 생성 속도를 제어하여 순수한 하이드록시프로피온산염의 결정을 형성된 후 결정 사이즈를 키울 수 있게 된다는 점을 확인 하였다.
이러한 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 경우, 결정 내부에 매우 낮은 함량의 불순물을 포함하며 고른 결정생성으로 인하여 여과성이 우수하여, 정제가 용이할 뿐만 아니라, 결정 상태에서 형태 안정성 및 가열 안정성 등도 우수하여, 높은 순도를 갖는 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 대량 생산 가능하게 할 수 있다는 점을 실험을 통해서 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 알칼리 금속염 존재 하에 형성된 하이드록시프로피온산의 농축액에 비용매를 접촉시키는 경우 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염이 생성되며, 생성된 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 농도가 증가하면서 미세 결정을 이루게 되어 고체-액체 상분리가 일어나게 된다. 이후 결정화가 진행됨에 따라 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 고체 결정(3-하이드록시프로피온산염의 결정)으로 성장하여, 글리세롤, 1,3-프로판디올 등과 같은 액상의 불순물과 분리되면서 생성된 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 불순물을 매우 낮은 함량으로 포함하게 된다. 이때, 상기 비용매는 생성된 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 결정화를 촉진시키는 역할을 하여, 고체-액체 분리능이 증가되며 보다 높은 순도를 갖는 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 생성할 수 있게 한다.
상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액은 100 g/L 이상, 150 g/L 이상, 200 g/L 이상, 250 g/L 이상, 300 g/L 이상, 350 g/L 이상, 400 g/L 이상, 450 g/L 이상, 500 g/L 이상의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있고, 1000 g/L 이하, 950 g/L 이하, 900 g/L 이하, 850 g/L 이하, 800 g/L 이하의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 생성 여부는 알칼리 금속염의 존재와 상기 농축액에서의 상기 3-하이드록시프로피온산의 농도 등에 따라 영향을 받는 것으로 보인다.
또한, 상기 농축액 상에서 3-하이드록시프로피온산의 결정의 농도가 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 수 용해도(Water Solubility) 보다 높은 경우, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정이 보다 용이하게 생성될 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Ca(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 450 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 450 g/L 초과하는 경우 Ca(3HP)2 결정이 생성이 촉진될 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Mg(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 250 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 250 g/L 초과하는 경우 Mg(3HP)2 결정의 생성이 촉진 수 있다.
상기 알칼리 금속염을 포함하면서도, 상술한 농도를 만족하는 농축액으로부터 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성할 수 있으며, 상기 알칼리 금속염은 3-하이드록시프로피온산염의 결정 형성하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있으며, 예를 들어 상기 알칼리 금속염은 Mg2+ 및 Ca2+로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 알칼리 금속염은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 공정에서 첨가되어 잔류하거나, 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 공정 중에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염의 농도는 3-하이드록시프로피온산 농도의 10% 내지 100%, 또는 30% 내지 90% 일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 900 g/L, 50 내지 800 g/L, 100 내지 700 g/L 또는 200 내지 600 g/L의 농도로 상기 농축액에서 존재할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액이 비용매를 접촉하는 과정에서 소정의 결정 특징을 갖는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 형성될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고, X선 회절(XRD) 분석 시, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0, 또는 11.3 내지 12.7, 또는 11.8 내지 12.50 의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크가 나타날 수 있다.
또한, 3-하이드록시프로피온산염의 결정 에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 30°의 범위에서 1개 이상, 또는 3개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 9개 이상의 피크가 나타날 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 19.0 내지 21.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제2피크를 포함할 수 있고, 또는 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 22.0 내지 23.80의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제3피크를 포함할 수 있고, 또는 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 24.0 내지 25.00의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제4피크를 포함할 수 있다.
상기 각각의 피크들의 위치별 2θ값을 통해 3-하이드록시프로피온산염의 결정에서 금속-3HP의 분자 크기(길이)를 확인할 수 있으며, 각 분자사이의 분자간 거리도 확인할 수 있다.
구체적으로, 제1피크를 통해 금속과 두개의 3-하이드록시프로피온산으로 이루어진 염 분자의 길이(크기)를 알 수 있고, 제2피크를 통해 3-하이드록시프로피온산 한 분자의 길이를, 제3피크 및 제4피크를 통해 금속과 두개의 3-하이드록시프로피온산으로 이루어진 염 분자들 사이의 거리를 알 수 있다.
각 피크에서의 상세한 내용은 상술한 바와 같다.
한편, X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 나타나는 제1피크에서의 반치전폭으로 계산되는 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기(gran domain size)는 30 nm 이상, 40 nm 이상, 50 nm 이상일 수 있고, 100 nm 이하, 90 nm 이하, 80 nm 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 1 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 8 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상이거나, 200 ㎛ 이하, 180 ㎛ 이하, 또는 160 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10은 2 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 4 ㎛ 이상 78 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D90은 10 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 210 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 205 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 0.70 이상 3.00 이하, 0.75 이상 2.90 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 형성 과정에서, 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액과 비용매 간의 부피비는 3-하이드록시프로피온산의 농도나 농축액 및 비용매의 부피를 고려하여 결정할 수 있으며, 예를 들어 상기 농축액과 상기 비용매는 1:0.5 내지 1:20, 또는 1:0.5 내지 1:10, 또는 1:0.8 내지 1:8, 또는 1:1 내지 1:5의 부피 비율로 사용될 수 있다.
상기 농축액에 비해 비용매의 부피가 지나치게 적으면, 결정이 생성되는 농도가 높아 결정의 생성속도가 빨라지게 되어 순수한 결정입자가 천천히 생성되지 못하고 불규칙적인 결정 입자가 빠르게 형성될 수 있고, 고체-액체의 분리능이 낮아 액상의 불순물과 정제해야 할 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염이 분리하기 어려울 수 있다.
또한, 상기 농축액에 비해 비용매의 부피가 지나치게 많으면, 비용매에 대한 용해도에 의해 경우에 따라 생성된 결정이 녹아 풀릴 수 있으며, 결정 생성 후 결정 여과과정에서 시간이 증가하며, 폐액량 증가로 이어져 경제적이지 않을 수 있다.
상기 비용매는 알코올계 비용매, 케톤계 비용매, 니트릴계 비용매 또는 이들의 2종 이상의 혼합물을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 알코올계 비용매 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 케톤계 비용매는 아세톤, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 디에틸케톤, 아세토페논, 메틸이소부틸케톤, 메틸이소아밀케톤, 이소포론 및 디-(이소부틸)케톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 알코올계 비용매는 메탄올, 에탄올, 알릴 알코올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1- 부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올, 벤질알콜, 시클로헥산올, 디아세톤알코올, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르, 2-메톡시에탄올 및 1-데칸올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 니트릴계 비용매는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 부티로니트릴, 발레로니트릴, 카프릴로니트릴, 헵탄니트릴, 싸이클로펜탄 카보니트릴, 싸이클로헥산 카보니트릴, 2-플루오로벤조니트릴, 4-플루오로벤조니트릴, 다이플루오로벤조니트릴, 트리플루오로벤조니트릴, 페닐아세토니트릴, 2-플루오로페닐아세토니트릴, 4-플루오로페닐아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계는 상기 농축액을 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 교반하는 단계는 섭씨 0 내지 70도, 섭씨 0 내지 60도, 섭씨 0 내지 50도, 섭씨 0 내지 40도, 섭씨 0 내지 35도, 섭씨 0 내지 30도, 섭씨 10 내지 70도, 섭씨 10 내지 60도, 섭씨 10 내지 50도, 섭씨 10 내지 40도, 섭씨 10 내지 35도, 섭씨 10 내지 30도, 섭씨 15 내지 70도, 섭씨 15 내지 60도, 섭씨 15 내지 50도, 섭씨 15 내지 40도, 섭씨 15 내지 35도, 섭씨 15 내지 30도, 섭씨 20 내지 70도, 섭씨 20 내지 60도, 섭씨 20 내지 50도, 섭씨 20 내지 40도, 섭씨 20 내지 35도, 또는 섭씨 20 내지 30 도 (예, 상온)의 온도 및/또는 100 내지 2000rpm, 100 내지 1500rpm, 100 내지 1000rpm, 100 내지 500rpm, 100 내지 400rpm, 또는 200 내지 400rpm (예, 약 300rpm) 조건 하에서 수행될 수 있다.
상기 농축액과 비용매를 접촉시켜서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계는 0℃ 이상, 15℃ 이상, 30 ℃ 이상, 35 ℃ 이상, 40 ℃ 이상, 45 ℃ 이상, 50 ℃ 이상, 55 ℃ 이상일 수 있고, 100℃ 이하, 90 ℃ 이하, 80 ℃ 이하, 75 ℃ 이하, 70 ℃ 이하, 65 ℃ 이하, 또는 0℃ 내지 100℃의 온도에서 수행될 수 있다.
이때, 상기 농축액에 상술한 온도의 비용매를 투입하거나, 농축액과 비용매를 혼합한 상태에서 가온 또는 냉각을 통해 상기 온도 범위로 조절할 수 있다.
한편, 상기 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계는, 탄소원의 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계; 및 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 2종의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성효소(GdrAB)를 암호화하는 유전자(gdrAB)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 비타민 B12를 생합성할 수 있는 균주일 수 있다.
상기 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)는 dhaB(GenBank accession no. U30903.1) 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)에서 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 dhaB1, dhaB2 및/또는 dhaB3를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 글리세롤을 3-하이드록시프로판알(3-hydroxypropanal, 3-HPA)과 물(H2O)로 분해하는 효소 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)를 암호화하는 유전자(aldH)는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 E. coli K12 MG1655 세포주에서 유래한 aldH(GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) 유전자, 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia)에서 유래한 puuC 유전자, 및/또는 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 KGSADH 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알데하이드 탈수소효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 3-하이드록시프로판알로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하기 위한 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 발효액 생산을 위한 배지는 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있다. 일 예에서 상기 배지는 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 일 예에서 상기 배지는 폐글리세롤(crude glycerol) 및/또는 전처리된 폐글리세롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 생산용 배지는 비타민 B12를 추가로 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액에 포함된 3-하이드록시프로피온산의 농도는 1 내지 200 g/L, 10 내지 150 g/L, 30 내지 130 g/L 또는 40 내지 100 g/L일 수 있다.
또한, 상기 발효는 중성 발효일 수 있으며, 예를 들어 발효시 pH가 6 내지 8, 6.5 내지 8, 6 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.5 범위에서 유지되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 범위는 필요에 따라 적절히 조절될 수 있다. 상기 중성 발효를 위해 상기 알칼리 금속염이 투입될 수 있다. 상기 알칼리 금속염은 Mg2+, Ca2 또는 이의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2 또는 Mg(OH)2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액으로부터 세포를 제거(분리)하는 단계; 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계; 및/또는 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포의 제거(분리)는 세포(균주) 제거 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 세포의 분리는 원심분리를 수행하여 이루어질 수 있다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계는, 발효액의 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 활성탄을 상기 발효액과 혼합한 후 활성탄을 제거함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계는 고형 불순물의 제거, 단백질 및/또는 소수성 functional group이 있는 물질의 제거, 및/또는 탈색(decoloration) 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 필터 여과, 및/또는 활성탄 여과 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법은 상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 발효액의 농축은 발효액 (예컨대, 발효액의 액상 성분)을 증발하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 농축은 발효액의 액상 성분을 증발시키기 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 회전증발농축, 증발 농축, 진공 농축, 감압 농축 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 농축 후의 발효액 내 3-하이드록시프로피온산 농도는, 농축 전과 비교하여, 2 내지 50배, 2 내지 40배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 10배, 5 내지 50배, 5 내지 40배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 또는 5 내지 10배 증가된 것일 수 있다.
한편, 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법에서 얻어진 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 제조 방법에서 얻어진 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하는 방법은 결정을 분리하기 위한 목적 범위에서 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 회수는 건조(예를 들어 가열 건조 등), 및/또는 여과 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 분리된 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 3-하이드록시프로피온산으로 전환(정제)하는 방법은 3-하이드록시프로피온산 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 하기 나열된 방법 중 하나 이상의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, i) 양이온 교환수지를 통해 양이온을 제거하여 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(protonation)하는 방법;
ii) 액체 양이온 교환(Liquid Cation Exchange)을 이용해 양이온 (예를 들어, Mg, Ca 등)을 유기용매로 추출하여 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(Protonation)하는 방법; 및
iii) 산 (예를 들어, 황산 등)으로 적정하여 염(예를 들어, CaSO4(s) 또는 MgSO4(s))을 제조함으로써 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(Protonation)하는 방법이 있을 수 있다.
구체적으로, 상기 3-하이드록시프로피온산을 회수 하는 과정에서는 양이온 교환 수지 컬럼을 이용할 수도 있다.
구체적으로, 상기 형성된 3-하이드록시프로피온산이 포함된 용액을 양이온 교환 수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 및 상기 양이온 교환 수지 컬럼을 접촉한 용액에서 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 양이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산이 포함된 용액에 존재하는 3-하이드록시프로피온산염을 3-하이드록시프로피온산으로 전환하는 역할을 하며, 이에 따라 보다 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 높은 효율로 분리 및 회수할 수 있다.
한편, 상기 양이온교환수지는 모체에 이온교환이 가능한 작용기를 포함하는 고분자일 수 있는데, 이때 모체에 도입되는 이온교환이 가능한 작용기는 -COOH, -SOOH, -POOH 등 수소 양이온(H+) 교환이 가능한 산 형태일 수 있다.
또한, 상기 양이온교환수지의 모체는 폴리스티렌, 아크릴계 폴리머 등을 사용할 수 있으며, homopolymer, co-polymer, block-polymer, random copolymer 등의 다양한 모체가 사용 가능하다.
상기 양이온교환수지의 입자는 구형 또는 비정형 형상일 수 있으며, 상기 양이온교환수지 입경분포범위(Particle Size)는 0.3 mm 내지 1.2 mm 일 수 있다.
상기 양이온교환수지의 교환 효율은 양이온교환수지의 안정성 및 양이온교환수지 내의 이온 탈착 정도를 고려하여 1.2 eq 내지 2.0 eq, 또는 1.6 eq 내지 1.9 eq 일 수 있다.
또한, 상기 양이온교환수지는 단독 또는 2종 이상의 종류를 혼합하여 사용할 수 있으며, 사용하는 수지 종류에 따라 교환 효율에 차이가 있으므로, 입자의 크기, 형상, 교환기 등을 고려하여 수지를 선택할 수 있다.
한편, 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피는 10 BV 이상, 또는 11 BV 이상, 또는 12 BV 이상 일 수 있다. 상기 수지부피(BED VOLUME; BV)는 컬럼안의 충진제가 차지하는 부피를 뜻한다. 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피 함량이 지나치게 낮으면, 이온 교환 시 교환 효율이 감소하고, 수지부피의 함량이 지나치게 높으면 이온 교환 시간이 증가하여 비경제적일 수 있다.
본 발명에 따르면, 불순물을 매우 낮은 함량을 포함할 뿐만 아니라, 정제가 용이하고 열안정성 및 형태 안정성 등이 우수한 3-하이드록시프로피온산염의 결정과, 정제가 용이하고 열안정성 및 형태 안정성 등이 우수한 고순도의 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 제조하는 방법과, 상기 제공되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정으로부터 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 공정이 제공될 수 있다.
상기 제공되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 3-하이드록시프로피온산염을 고순도로 포함하고, 특정 입경 내지 형상을 가짐으로 인해 발효 부산물 및/또는 첨가물 등의 불순물로부터의 여과가 용이하고, 또한 3-하이드록시프로피온산의 회수 (분리, 정제) 공정은 3-하이드록시프로피온산염의 결정화를 통해 발효 부산물 및/또는 첨가물을 손쉽게 분리할 수 있어 순도 높은 3-하이드록시프로피온산염의 회수가 가능하고, 유기 용매 없이 공정 수행이 가능하여 3-하이드록시프로피온산 분리 정제 공정을 단순화할 수 있어 3-하이드록시프로피온산의 정제 비용을 절감할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 2은 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 3은 실시예 3의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 4은 실시예 4의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 5은 실시예 5의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 6은 실시예 6의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 7은 실시예 7의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 아니한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 온도는 모두 섭씨 온도로 기재되었다.
준비예 1. 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주의 제조
글리세롤을 기질로 사용하여 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3HP)을 생산하는 것으로 알려져 있는 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균(E.coli) W3110 균주에 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다.
보다 구체적으로, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 BtuR 유전자를 클로닝하여 얻어진 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터를 W3110 균주(KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다. 본 준비예 1의 3-하이드록시프로피온산 생산 균주 제작 과정 및 사용된 벡터, 프라이머, 및 효소들은 대한민국 공개특허 제10-2020-0051375호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)의 실시예 1을 참조하여 수행하였다.
실시예 1: Mg(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Mg(3HP)2 결정 제조
준비예 1에서 준비된 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주를 비정제 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 5 L 발효기에서 섭씨 35 도에서 발효 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하였다. 3-하이드록시프로피온산 생성으로 인한 pH 저하를 방지하기 위해 알칼리 금속염인 수산화 마그네슘(Mg(OH)2)을 투입하여 발효 수행 동안의 pH를 중성으로 유지하였다.
발효배양 후 원심분리(4000 rpm, 10 분, 섭씨 4 도)하여 세포를 제거하고, 활성탄을 이용해 1차 발효액 정제 (1차 정제)를 진행하였다. 구체적으로 원심 분리하여 균체가 제거된 발효액에 활성탄을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심 분리하여 활성탄을 분리하였다. 이후 활성탄이 분리된 발효액을 0.7 um의 여과지를 통해 진공 펌프(vaccum pump)로 여과하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 정제하였다.
상기 1차 정제를 마친 발효액의 3-하이드록시프로피온산 농도는 약 100 g/L 수준이며, 상기 발효액은 Rotary evaporator(섭씨 50 도, 50 mbar)를 이용하여 농축 농도 600 g/L로 농축하여 2L의 농축액을 제조하고, 상기 농축액의 2배 부피의 에탄올을 첨가하고 상온에서 교반(80 rpm)하여 Mg(3HP)2 결정을 생성하였다. 이때, 상기 농축액에서 상기 알칼리 금속염의 농도는 493.3 g/L (Mg(OH)2 기준) 이었다.
상기 생성된 결정을 에탄올(EtOH)을 이용해 3번 세척(washing)하고, 섭씨 50도의 오븐에서 건조하여 최종적으로 결정을 회수하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
양이온교환수지[SAMYANG CORPORATION의 TRILITE®CMP28LH]를 12 BV로 충진 후 물로 수세하여 양아온교환수지 컬럼을 준비하였다.
상기 3-하이드록시프로피온산의 마그네슘염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4 [m³h-1]로 투입하고, 이후 증류수를 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 7.2 [m³h-1]이하로 투입하여, pH 2.5 이하의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 수득하였다.
이후, 수득한 3-하이드록시프로피온산 수용액에서 물을 제거하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 30 wt%가 되도록 농축하였다.
실시예 2: Mg(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Mg(3HP)2 결정 제조
상기 농축액의 1배 부피의 에탄올을 첨가하고 상온에서 교반(300rpm)하여 Mg(3HP)2 결정을 생성한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 Mg(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 마그네슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
실시예 3: Mg(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Mg(3HP)2 결정 제조
상기 발효액에 대하여 Rotary evaporator(섭씨 50 도, 50 mbar)를 이용하여 농축 농도 600 g/L로 농축하여 2000 L의 농축액을 제조하고, 상기 농축액의 2배 부피의 에탄올을 첨가하고 상온에서 교반(120 rpm)하여 Mg(3HP)2 결정을 생성한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 Mg(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 마그네슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
실시예 4: Ca(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Ca(3HP)2 결정 제조
수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 대신에 수산화칼슘(Ca(OH)2)을 사용한 점을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 Ca(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
실시예 5: Ca(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Ca(3HP)2 결정 제조
수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 대신에 수산화칼슘(Ca(OH)2)을 사용한 점을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 Ca(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
실시예 6: Ca(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Ca(3HP)2 결정 제조
수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 대신에 수산화칼슘(Ca(OH)2)을 사용한 점을 제외하고 실시예 3과 동일한 방법으로 Ca(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 3과 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
실시예 7: Ca(3HP) 2 결정 제조 및 3-하이드록시프로피온산의 회수
(1) Ca(3HP)2 결정 제조
상기 농축액의 2배 부피의 에탄올을 첨가한 점을 제외하고 실시예 6과 동일한 방법으로 Ca(3HP)2결정을 제조하였다.
(2) 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 얻어진 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염의 결정이 포함된 수용액을 사용한 점을 제외하고, 실시예 3과 동일한 방법으로 30 wt% 농도의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻었다.
비교예 1: 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효 과정을 수행 후, 상기 1차 정제를 마친 발효액에 대하여 황산(H2SO4)을 이용해 pH 2까지 발효액을 적정하였다. 적정 과정에서 생성된 침전을 제거하여 3-하이드록시프로피온산의 양성자 추가(protonation)를 진행하였다.
상기 침전을 제거한 발효액을 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 1차 정제 및 농축하고 결정 생성 가부를 확인하였다. 그러나, 농축 과정에서 600 g/L (3HP 기준) 농축한 경우에는 결정이 생성되지 않았으며, 1000 g/L (3HP 기준)까지 농축을 실시한 경우에도 결정의 생성이 확인되지 않았다.
양이온교환수지[SAMYANG CORPORATION의 TRILITE®CMP28LH]를 12 BV로 충진 후 물로 수세하여 양아온교환수지 컬럼을 준비하고, 상기 얻어진 농축액을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4 [m³h-1]로 투입하고, 이후 증류수를 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 7.2 [m³h-1]이하로 투입하여, pH 2.5 이하의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 수득하였다.
이후, 수득한 3-하이드록시프로피온산 수용액에서 물을 제거하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 30 wt%가 되도록 농축하였다.
비교예 2: 3-하이드록시프로피온산의 회수
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 발효 과정을 수행 후, 상기 1차 정제를 마친 발효액에 대하여 황산(H2SO4)을 이용해 pH 2까지 발효액을 적정하였다. 적정 과정에서 생성된 침전을 제거하여 3-하이드록시프로피온산의 양성자 추가(protonation)를 진행하였다.
상기 침전을 제거한 발효액을 상기 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 1차 정제 및 농축하고 결정 생성 가부를 확인하였다. 그러나, 농축 과정에서 600 g/L (3HP 기준) 농축한 경우에는 결정이 생성되지 않았으며, 1000 g/L (3HP 기준)까지 농축을 실시한 경우에도 결정의 생성이 확인되지 않았다.
양이온교환수지[SAMYANG CORPORATION의 TRILITE®CMP28LH]를 12 BV로 충진 후 물로 수세하여 양아온교환수지 컬럼을 준비하고, 상기 얻어진 농축액을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4 [m³h-1]로 투입하고, 이후 증류수를 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 7.2 [m³h-1]이하로 투입하여, pH 2.5 이하의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 수득하였다.
이후, 수득한 3-하이드록시프로피온산 수용액에서 물을 제거하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 30 wt%가 되도록 농축하였다.
<시험예>
1. 3-하이드록시프로피온산염 결정에 대한 X선 회절(XRD) 분석
실시예에서 제조된 결정에 대해 1.54 Å의 파장의 Cu-Kα선을 조사하여 반사 모드의 X-선 회절(XRD) 패턴을 측정하였다.
측정 장비는 Bruker AXS D4 Endeavor XRD 를 이용하였다. 사용 전압 및 전류는 각각 40 kV 및 40 mA이며, 사용한 옵틱스(optics) 및 검출기(detector)는 다음과 같다.
-Primary (incident beam) optics: motorized divergence slit, soller slit 2.3°
-Secondary (diffracted beam) optics: soller slit 2.3°
-LynxEye detector (1D detector)
도 1 내지 7은 실시예 1 내지 7 각각의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절 분석 결과 그래프이다.
2. 3-하이드록시프로피온산염 결정의 입도 분석
입도 분석기(Size and Shape Particle Analyzer; Microtrac TurboSync)를 사용하여 실시예 1 내지 7의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 D10, D50, D90, 부피 평균 입경, 개수 평균 입경 및 체적 평균 입경을 각각 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
3. 불순물 함량 측정
실시예 및 비교예에서 최종 회수된 용액 내에 포함된 불순물을 핵자기공명 분광분석(NMR) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정하였다.
(1) High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC를 이용하여 불순물(글리세롤, 아세테이트 및 1,3-프로판디올)과 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 비율을 측정하였다.
HPLC는 Aminex HPX-87H ion exclusion column (7.8 * 300 mm, 9 ㎛)을 사용하여 0.5 mM sulfuric acid (H2SO4)를 flow rate 0.4 mL/min 속도로 흘려주었고, column의 온도는 35 ℃, injection volume은 5 μL, UV Detector 는 210 nm로 하였다.
(2) 1H-NMR
1H-NMR을 이용하여 불순물(글리세롤, 아세테이트 및 1,3-프로판디올)과 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 함량비를 분석하였다.
정제 전 알칼리 금속 3-하이드록시프로피온산염 및 정제된 3-하이드록시프로피온산은 100 μL를 샘플링에 NMR solvent인 D2O 500 μL에 용해시키고, 수분이 제거된 11.5 μL의 미메틸포름아미드(DMF)를 첨가한 용액을 NMR 튜브에 옮겨 담고 1H-NMR 측정용 샘플을 제조하였다.
상기 측정용 샘플을 사용하여 1H-NMR 스펙트럼(AVANCE III HD FT-NMR spectrometer(500 MHz for 1H), Bruker사 제조)을 측정하였다.
XRD
Peak 2θ 값(°) 분자 간격 (Å) 반치전폭(Å) 미세 결정 크기 (nm)
실시예1 #1 12.45 7.10 0.0023 60.36
#2 20.93 4.24 0.0022 64.06
#3 23.48 3.78 0.0028 50.56
#4 24.66 3.61 0.0011 129.0
실시예2 #1 12.41 7.12 0.0024 58.09
#2 20.89 4.25 0.0027 52.20
#3 23.45 3.79 0.0029 48.81
#4 24.62 3.61 - -
실시예3 #1 12.43 7.11 0.0023 60.62
#2 19.73 4.49 0.0018 78.16
#3 23.56 3.77 0.0035 56.06
#4 24.22 3.67 0.0023 67.13
실시예4 #1 12 7.37 0.0027 51.62
#2 19.53 4.54 0.0026 54.09
#3 23.58 3.77 0.0029 48.82
#4 24.12 3.69 0.0045 31.50
실시예5 #1 11.97 7.38 0.0026 53.60
#2 19.49 4.55 0.0026 54.09
#3 23.56 3.77 0.0029 48.82
#4 24.24 3.67 0.0038 37.31
실시예6 #1 11.97 7.38 0.0018 77.42
#2 19.47 4.55 0.0018 78.12
#3 23.52 3.78 0.0021 67.42
#4 24.06 3.69 0.0022 64.41
실시예7 #1 11.97 7.38 0.0022 63.34
#2 19.47 4.55 0.0022 63.92
#3 23.52 3.78 0.0027 55.98
#4 24.06 3.69 0.0027 52.49
비교예1 - - - - -
비교예2 - - - - -
입경 분포 불순물 함량 (ppm)
D10 (㎛) D50 (㎛) D90 (㎛) (D90-D10)/D50 글리세롤 1,3-프로판디올 아세테이트
실시예1 4.1 10 22.6 1.85 검출한계 검출한계 검출한계
실시예2 5.8 11.1 19.9 1.27 검출한계 검출한계 검출한계
실시예3 16.1 56.3 175 2.82 검출한계 검출한계 검출한계
실시예4 44.5 85 146.5 1.2 검출한계 검출한계 검출한계
실시예5 24.2 70.2 158.6 1.91 검출한계 검출한계 검출한계
실시예6 75.6 158 201 0.79 검출한계 검출한계 검출한계
실시예7 74.1 140 196 0.87 검출한계 검출한계 검출한계
비교예1 3126 검출한계 200
비교예2 2425 검출한계 검출한계
표 1 및 2를 참고하면, 실시예 1 내지 7에서 얻어진 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.97 내지 12.45의 회절각도(2θ±0.2°)에서 하나의 피크를 나타내고, 제1피크의 반치전폭(Å)이 0.0018 내지 0.0027이라는 점 및 제1피크의에서의 미세 결정 크기(nm)가 51.62 내지 77.42 인 점이 확인되며, 또한 실시예의 입자 크기 분포 D50이 10 내지 158 ㎛이고, (D90-D10)/D50이 0.79 내지 2.82이라는 점이 확인되었다.
또한, 얻어진 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 19.47 내지 20.93의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제2피크와 23.45 내지 23.58의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제3피크와 24.06 내지 24.66의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제4피크를 나타낸다는 점이 확인되었다.
상기 제공되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 3-하이드록시프로피온산염을 고순도로 포함하고, 특정 입경 내지 형상을 가짐으로 인해 발효 부산물 및/또는 첨가물 등의 불순물로부터의 여과가 용이하고, 또한 3-하이드록시프로피온산의 회수 (분리, 정제) 공정은 3-하이드록시프로피온산염의 결정화를 통해 발효 부산물 및/또는 첨가물을 손쉽게 분리할 수 있어 순도 높은 3-하이드록시프로피온산염의 회수가 가능하고, 유기 용매 없이 공정 수행이 가능하여 3-하이드록시프로피온산 분리 정제 공정을 단순화할 수 있어 3-하이드록시프로피온산의 정제 비용을 절감할 수 있다.
4. 3-하이드록시프로피온산염 결정 내 바이오 탄소 함량 분석
ASTM D 6866-21(Method B)를 이용하여 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Mg(3HP)2) 및 실시예 4의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Ca(3HP)2)의 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 및 바이오 탄소 함량을 분석하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
상기 바이오 탄소 함량은 실시예 1 및 4의 3-하이드록시프로피온산염 결정에 각각 포함된 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 3-하이드록시프로피온산염 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미한다.
농축 농도 (g/L) 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 바이오 탄소 함량 (%)
실시예1 600 101.52 100
실시예4 600 102.23 100
- pMC: percent Modern Carbon; 퍼센트 현대 탄소표 3을 참고하면, 상기 실시예 1 및 4의 3HP염 결정 모두 pMC가 101 이상이고, 바이오 탄소의 함량 또한 100%임을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고,
    X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 11.0 내지 13.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제1피크를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  2. 제1항에 있어서,
    X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 19.0 내지 21.0의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제2피크를 포함하거나, 또는
    X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 22.0 내지 23.80의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제3피크를 포함하거나, 또는
    X-선 회절 스펙트럼(XRD)의 24.0 내지 25.00의 회절각도(2θ±0.2°)에서 제4피크를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1피크에서 반치전폭으로 계산되는 3-하이드록시프로피온산염의 미세 결정 크기(gran domain size)가 30 내지 100 nm 인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D50가 5 ㎛ 이상 180 ㎛ 이하인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 0.70 이상 3.00 이하인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정:
    상기 D50, D10, D90은 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입경 분포 곡선에 있어서 각각 체적 누적량의 50%, 10%, 90%에 해당하는 입경을 의미한다.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상이고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  7. 제1항에 있어서,
    글리세롤, 1,3-프로판디올, 및 아세테이트를 포함한 잔류 성분 함량이 100 ppmw 이하인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 순도가 70% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염 또는 마그네슘염인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
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