KR20230080037A - 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것이다.

Description

3-하이드록시프로피온산의 회수 공정{PROCESS OF RECOVERING 3-HYDROXYPROPIONIC}
본 발명은 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것이다.
유기산은 식품, 화장품, 의약품, 고분자 산업에서 다양한 용도를 갖는 상업적으로 중요한 화학 물질이다. 그 중에서 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 3HP)은 아크릴산(acrylic acid), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol), 아크릴아미드(acrylamide), 말론산(malonic acid) 및 바이오폴리머 등의 제조를 위한 원료로 활용이 가능한 물질이다.
3-하이드록시프로피온산의 생산은 크게 화학적 방법과 생물학적 방법의 두 가지 방법으로 이루어지나, 화학적 방법의 경우 초기 물질이 고가인 점, 생산 과정 중 독성 물질이 생성되는 점 등에 의해 비친환경적이라는 지적이 있어, 친환경적인 바이오 공정이 각광받고 있다.
미생물 발효에 의한 유기산의 제조시, 미생물을 발효하는 과정에서 3-하이드록시프로피온산 등의 유기산 이외에 다른 부산물도 함께 생성되기 때문에, 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 과정이 필요하다. 미생물 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 방법으로는 전기 투석법, 역삼투막법, 유기산을 함유하는 용액-유기용매 반응 추출법 등이 사용되고 있으며, 특히, 수산화나트륨(NaOH)를 이용한 역추출법이 수율이 높아 널리 이용되고 있다. 그러나, 이들 방법의 경우 생성물이 유기산염 형태이므로 이를 유기산으로 전환하기 위한 공정이 추가적으로 필요하며 순도가 낮은 단점이 있다.
3-하이드록시프로피온산은 발효 공정을 통해 생산되는 다른 유기산들과는 달리, 높은 친수성을 나타내고, 물에 대한 용해도 및 반응성이 높다. 이에 따라 침전 또는 추출과 같은 종래 유기산 분리 정제 공정을 적용하기 어렵다.
반응 추출법은, 유기산과 반응성이 좋은 아민 또는 알코올과 같은 활성 희석액(active diluent)을 이용하여, 유기산을 추출하는 방법으로, 유기산의 선택적 추출이 가능하고, 추출 효율이 비교적 높다. 이에 따라, 3HP의 분리 정제 시에도 상기 반응 추출법을 적용하는 것이 시도되고 있다. 일례로, 상기 아민으로서 트리옥틸아민(trioctylamine; TOA)을 사용하는 방법이 제안되었으나, 3HP의 추출 효율이 낮고, 또 다량의 유기 용매가 필요하다는 문제점이 있다. 또, 아민으로서 트리데실아민(tridecylamine)을 사용하는 경우에는, TOA 보다 3HP의 추출 효율은 높지만, 추출 시 유기상과 수상이 분리되지 않는 에멀젼(emulsion) 현상이 발생하는 문제점이 있다.
따라서, 미생물 발효액 등 3-하이드록시프로피온산 포함 원료액으로부터 고순도 및 고수율의 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 새로운 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정을 제공하기 위한 것이다.
본 명세서에서는, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계; 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 형성하는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 상기 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계; 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 형성하는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공될 수 있다.
본 발명자들은, 알칼리 금속염이 존재하는 상태에서 3-하이드록시프로피온산을 농축하여 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하고, 분리된 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 포함하는 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 경우, 고순도 및 고수율로 3-하이드록시프로피온산을 회수할 수 있다는 점을 실험을 통하여 확인하고, 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 3-하이드록시프로피온산은 발효 공정을 통해 생산되는 다른 유기산들과는 달리 높은 친수성을 나타내고 물에 대한 용해도 및 반응성이 높아, 침전 또는 추출과 같은 종래 유기산 분리 정제 공정을 적용하기 어렵다.
특히, 중성 발효로 생성되는 3-하이드록시프로피온산의 경우 3-하이드록시프로피온산염 형태로 생성되는데, 3-하이드록시프로피온산염을 포함하는 생성물에서 불순물(Glycerol, Acetate 및 1,3-Propanediol 등)을 제거하기 어렵고, 추가적이며 반복적인 공정의 증가와 농축, 건조, 다량의 유기 용매의 사용으로 비용 증가 및 환경적인 문제가 있다.
그러나, 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계를 통해, 종래 산 처리 후 이온교환수지 처리를 통한 정제 및 용매 추출 방식에 비해 유기 용매를 사용하지 않아 친환경적이고 경제적이면서도, 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 회수할 수 있다.
상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계를 포함한다.
이때, 상기 양이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서 3-하이드록시프로피온산염 내의 양이온(Cation)을 수소 양이온(H+)으로 치환시키는 역할을 한다.
후술하는 바와 같이, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태일 수 있는데, 이러한 3-하이드록시프로피온산염 결정을 포함하는 수용액을 양이온교환수지가 충전되어 있는 구간을 통과시키는 경우, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 3-하이드록시프로피오네이트(3-Hydroxypropionate; 3HP-)와 알칼리 금속염의 양이온(Cation)으로 해리되면서, 알칼리 금속염의 양이온(Cation)이 양이온교환수지에 흡착되고, 양이온교환수지의 수소 양이온(H+)이 3-하이드록시프로피오네이트(3-Hydroxypropionate; 3HP-)와 결합하여 3-하이드록시프로피온산이 H-3HP 형태로 회수될 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
(상기 Cation는 알칼리 금속염의 양이온이고,
상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산이고,
상기 n은 양이온과 결합하는 3HP 수로, 1 이상의 정수이고,
상기 m은 수화물에서의 물 분자 수로, 1 이상의 정수이다.)
한편, 상기 양이온교환수지는 강산성 및 약산성 양이온교환수지 모두 사용 가능하며, 약산성 양이온교환수지를 사용할 경우 양이온이 약산성 양이온교환수지에 흡착되지 못하고 수용액상에 잔류하게 될 우려가 있으므로, 유기산염의 이온의 해리 효율을 고려하여 약산성 양이온수지 보다 강산성 양이온교환수지가 보다 효과적이다.
한편, 상기 양이온교환수지는 모체에 이온교환이 가능한 작용기를 포함하는 고분자일 수 있는데, 이때 모체에 도입되는 이온교환이 가능한 작용기는 -COOH, -SOOH, -POOH 등 수소 양이온(H+) 교환이 가능한 산 형태일 수 있다.
또한, 상기 양이온교환수지의 모체는 폴리스티렌, 아크릴계 폴리머 등을 사용할 수 있으며, homopolymer, co-polymer, block-polymer, random copolymer 등의 다양한 모체가 사용 가능하다.
상기 양이온교환수지의 입자는 구형 또는 비정형 형상일 수 있으며, 상기 양이온교환수지 입경분포범위(Particle Size)는 0.3 mm 내지 1.2 mm 일 수 있다.
상기 양이온교환수지의 교환 효율은 양이온교환수지의 안정성 및 양이온교환수지 내의 이온 탈착 정도를 고려하여 1.2 eq 내지 2.0 eq, 또는 1.6 eq 내지 1.9 eq 일 수 있다.
또한, 상기 양이온교환수지는 단독 또는 2종 이상의 종류를 혼합하여 사용할 수 있으며, 사용하는 수지 종류에 따라 교환 효율에 차이가 있으므로, 입자의 크기, 형상, 교환기 등을 고려하여 수지를 선택할 수 있다.
한편, 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피는 2 BV 이상일 수 있다.
상기 수지부피(BED VOLUME; BV)는 컬럼안의 충진제가 차지하는 부피를 뜻한다.
상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피 함량이 지나치게 낮으면, 이온 교환 시 교환 효율이 감소하고, 수지부피의 함량이 지나치게 높으면 이온 교환 시간이 증가하여 비경제적일 수 있다.
따라서, 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피를 2 BV 이상, 또는 5 BV 이상, 또는 10 BV 이상, 또는 12 BV 이상이면서, 100 BV 이하로 하는 것이 효과적이다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 상기 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 7.2 이하, 또는 5 이하, 또는 2.4 이하로 투입할 수 있고, 또는 1 이상으로 투입할 수 있다.
상기 통액속도(space velocity; SV, [m³h-1])는 컬럼내 시간당 통액량을 수지의 체적으로 나눈 수치이다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 투입하는 속도에 따라 3-하이드록시프로피온산의 회수 수율 및 회수 시간에 영향이 있을 수 있는데, 상기 통액속도(SV)가 7.2 를 초과하는 경우 이온 교환 효율이 감소될 문제가 있을 수 있으며, 1 미만인 경우 이온 교환 시간이 증가하여 경제적으로 비효율성이 증가하는 문제가 있을 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액은 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 100 g/L 이상 포함할 수 있다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 이후, 상기 농축액에서 분리된 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 제조하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 상기 농축액으로부터 여과 플라스크 및 진공 펌프 등을 이용하여 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리할 수 있고, 분리된 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 증류수에 용해하여 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 제조할 수 있다.
이때, 증류수의 함량을 조절하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 함량을 조절할 수 있다.
상기 양이온교환수지 컬럼에 투입되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산염의 결정 함량에 따라, 양이온교환수지에 흡착되는 3-하이드록시프로피온산염 내의 양이온(Cation)의 선택성에 차이가 발생하므로, 수용액 내 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 100 g/L 이상, 또는 200 g/L 이상, 또는 300 g/L 이상으로, 또는 1000 g/L 이하, 또는 900 g/L 이하, 또는 800 g/L 이하로 하는 것이 바람직하다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액 내 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 100 g/L 미만인 경우 이온 교환 시간이 증가하여 비효율적일 수 있으며, 1000 g/L를 초과하는 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 증류수에 용해되지 않거나 석출될 가능성이 있다.
예를 들어, 하기 구조식 1 및 구조식 2에서 Cation이 Mg2+ 인 경우, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산염의 결정(Mg(3HP)2)을 100 g/L 내지 260 g/L으로, Cation이 Ca2+ 인 경우, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산염의 결정(Ca(3HP)2)을 100 g/L 내지 450 g/L으로 조절하는 경우 3-하이드록시프로피온산의 회수율을 극대화할 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계를 통해, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서 3-하이드록시프로피온산염 내의 양이온(Cation)이 수소 양이온(H+)으로 치환되며, 이후 상기 양이온교환수지 컬럼에 추가 수용액을 투입하여 잔류 3-하이드록시프로피온산을 수용액 형태로 수득할 수 있다.
상술한 바와 같이 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 투입하면, 3-하이드록시프로피온산염 내의 양이온(Cation)이 양이온교환수지에 부착되고, 양이온교환수지의 수소 양이온(H+)이 3-하이드록시프로피오네이트(3HP-)와 결합하여 3-하이드록시프로피온산이 H-3HP 형태로 수용액으로 회수된다.
이때, 투입되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 회수율을 증가시키기 위해 추가로 물을 투입하여 양이온교환수지 컬럼에 잔류하는 3-하이드록시프로피온산을 수득할 수 있다.
구체적으로, 상기 양이온교환수지 컬럼 내부의 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계에서 물을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4 이하, 1 이상으로 투입할 수 있다.
상기 통액속도(SV)가 2.4 를 초과하는 경우 양이온이 충분히 교환되지 못하여 이후 이온교환 수용액에 양이온이 포함될 수 있으며, 1 미만인 경우 회수 시간이 지나치게 길어져 비효율적 일 수 있다.
상기 양이온교환수지 컬럼 내부의 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계는 수득하고자 하는 pH에 따라 3-하이드록시프로피온산의 회수율에 영향이 있을 수 있으며, pH 2.5 이하 바람직하게는 pH 3 이하로 수득하는 경우 회수율을 극대화할 수 있다.
한편, 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후, 상기 양이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 수세하는 단계는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 양이온교환수지 컬럼을 통해 3-하이드록시프로피온산 수용액으로 모두 수득 후, 양이온교환수지 컬럼을 세척하는 단계로, 물을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 10 이하, 7.2 이하로 투입할 수 있다.
한편, 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후, 상기 양이온교환수지 컬럼에 산을 통과시켜 양이온교환수지를 재생하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계를 통해, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서 3-하이드록시프로피온산염 내의 양이온(Cation)이 수소 양이온(H+)으로 치환되며, 알칼리 금속염의 양이온(Cation)은 양이온교환수지에 흡착되게 되는데, 이후 알칼리 금속염의 양이온(Cation)이 결합된 양이온교환수지 컬럼에 산을 통과시키면 알칼리 금속염의 양이온(Cation)이 다시 탈착되고, 양이온교환수지에 수소 양이온(H+)이 결합되어 양이온교환수지를 재생시킬 수 있다.
상기 산은 양이온교환수지에서 수소 양이온(H+)을 제공할 수 있는 것으로 그 종류에 제한이 없으며, 예를 들면 염산(HCl), 황산(H2SO4), 질산(HNO3), 브로민화 수소산(HBr) 등을 이용할 수 있다.
또한, 상기 양이온교환수지 컬럼에 산을 통과시킨 후, 산이 통과된 양이온교환수지 컬럼을 물로 수세하여 잔여 산 및 음이온 등 기타 잔여물을 제거할 수 있다.
상기 재생된 양이온교환수지는 재사용될 수 있으며, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 재생된 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;를 반복할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계 이후, 수득된 3-하이드록시프로피온산 수용액을 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 수용액을 농축하는 방법은 액상 성분을 증발시키기 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 회전증발농축, 증발 농축, 진공 농축, 감압 농축 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들면, 수득된 3-하이드록시프로피온산 수용액에서 물을 제거하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 농도를 10wt% 이상, 또는 30 wt% 이상, 또는 70 wt% 이상으로 농축할 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 의한 3-하이드록시프로피온산 회수율은 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 예컨대, 40 내지 99.9%, 50 내지 99.9%, 60 내지 99.9%, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 40 내지 99%, 50 내지 99%, 60 내지 99%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 90 내지 99%, 40 내지 97%, 50 내지 97%, 60 내지 97%, 70 내지 97%, 80 내지 97%, 90 내지 97%, 40 내지 95%, 50 내지 95%, 60 내지 95%, 70 내지 95%, 80 내지 95%, 또는 90 내지 95%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 회수율은 중량 기준으로 산정된 것일 수 있다.
한편, 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액은 100 g/L 이상, 200 g/L 이상, 300 g/L 이상, 350 g/L 이상, 400 g/L 이상, 450 g/L 이상, 500 g/L 이상의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있고, 900 g/L 이하, 850 g/L 이하, 800 g/L 이하의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있다. 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 생성 여부는 알칼리 금속염의 존재와 상기 농축액에서의 상기 3-하이드록시프로피온산의 농도 등에 따라 영향을 받는 것으로 보인다.
또한, 상기 농축액 상에서 3-하이드록시프로피온산의 결정의 농도가 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 수 용해도(Water Solubility) 보다 높은 경우, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정이 보다 용이하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Ca(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 450 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 450 g/L 초과하는 경우 Ca(3HP)2 결정이 생성이 촉진될 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Mg(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 250 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 250 g/L 초과하는 경우 Mg(3HP)2 결정의 생성이 촉진 수 있다.
상기 알칼리 금속염을 포함하면서도, 상술한 농도를 만족하는 농축액으로부터 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성할 수 있으며, 상기 알칼리 금속염은 3-하이드록시프로피온산염의 결정 형성하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있으며, 예를 들어 상기 알칼리 금속염은 Na+, Mg2+ 및 Ca2+로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함할 수 있으나, Mg2+ 또는 Ca2+의 양이온, 또는 이의 염을 사용하는 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 보다 효과적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 알칼리 금속염은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 공정에서 첨가되어 잔류하거나, 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상, 또는 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 공정 중에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염의 농도는 3-하이드록시프로피온산 농도의 10% 내지 100%, 또는 30% 내지 90% 일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 900 g/L, 50 내지 800 g/L, 100 내지 700 g/L 또는 200 내지 600 g/L의 농도로 상기 농축액에서 존재할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태일 수 있다. 즉, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태의 3-하이드록시프로피온산염을 포함할 수 있다.
하기 구조식 1 및 구조식 2에서 Cation은 양이온을, 상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산을, n은 양이온과 결합하는 3HP 수로 1 이상의 정수를 의미하고, 하기 구조식 2에서 m은 수화물에서 Cation(3HP)n과 결합하는 물 분자의 수로, 1이상의 정수이다. 상기 양이온은, 예를 들어, Na+, Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있으나, Mg2+ 또는 Ca2+인 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 보다 효과적으로 형성될 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계는 상기 농축액을 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 교반하는 단계는 섭씨 0 내지 70도, 섭씨 0 내지 60도, 섭씨 0 내지 50도, 섭씨 0 내지 40도, 섭씨 0 내지 35도, 섭씨 0 내지 30도, 섭씨 10 내지 70도, 섭씨 10 내지 60도, 섭씨 10 내지 50도, 섭씨 10 내지 40도, 섭씨 10 내지 35도, 섭씨 10 내지 30도, 섭씨 15 내지 70도, 섭씨 15 내지 60도, 섭씨 15 내지 50도, 섭씨 15 내지 40도, 섭씨 15 내지 35도, 섭씨 15 내지 30도, 섭씨 20 내지 70도, 섭씨 20 내지 60도, 섭씨 20 내지 50도, 섭씨 20 내지 40도, 섭씨 20 내지 35도, 또는 섭씨 20 내지 30 도 (예, 상온)의 온도 및/또는 100 내지 2000rpm, 100 내지 1500rpm, 100 내지 1000rpm, 100 내지 500rpm, 100 내지 400rpm, 또는 200 내지 400rpm (예, 약 300rpm) 조건 하에서 수행될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이상 85 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 75 ㎛일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10은 5 ㎛ 이상 40 ㎛ 이하, 8 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하일 수 있고, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D90은 50 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이상 190 ㎛ 이하, 65 ㎛ 이상 180 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이상 175 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 입자 크기 분포 D50, D10, D90은 입자의 입경 분포 곡선에 있어서, 각각 체적 누적량의 50%, 10%, 90%에 해당하는 입경을 의미하는 것으로, 상기 D50, D10, D90은 예를 들어, 레이저 회절법(laser diffraction method)을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 레이저 회절법은 일반적으로 서브미크론(submicron) 영역에서부터 수 mm 정도의 입경의 측정이 가능하며, 고 재현성 및 고 분해성의 결과를 얻을 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D50, D10, D90가 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 1.00 이상 3.00 이하, 1.20 이상 2.80 이하, 1.40 이상 2.60 이하, 1.60 이상 2.40 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 95 ㎛ 이하, 40 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하일 수 있고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 25 ㎛ 이하, 5 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하일 수 있고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 60 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 55 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경, 개수 평균 입경 및 체적 평균 입경이 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio) 및 평균 종횡비는 각각 0.50 이상 3.00 이하, 0.70 이상 2.80 이하, 1.00 이상 2.50 이하일 수 있다. 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 종횡비가 지나치게 크면 결정을 이송시 흐름성과 막힘의 문제가 발생할 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 칼 피셔 방법(Karl Fischer method)으로 결정 내에 포함된 수분 함량을 측정할 수 있으며, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량은 200 ppm 이상 5000 ppm 이하, 250 ppm 이상 4800 ppm 이하, 300 ppm 이상 4600 ppm 이하, 350 ppm 이상 4400 ppm 이하일 수 있다.
이때, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 수분은 결정 수분(예를 들어 Ca(3HP)2·2H2O)이 아닌 결정 사이에 포함된 부착 수분을 의미한다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량이 지나치게 많으면 결정 고체가 아닌 슬러리 형태로 회수되거나, 수분 내에 불순물이 함유되어 순도 향상 저하에 문제가 될 수 있다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서는 후술하는 바와 같이 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하는 등의 공정을 통해 3-하이드록시프로피온산을 제조함에 따라, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 방사성 탄소 동위원소(14C)를 포함할 수 있다.
방사성 탄소 동위원소(14C)는 지구 대기 중에 탄소 원자 1012개 당 거의 1개이며, 반감기는 약 5700년이고, 탄소 스톡 (stock)은 우주선 (cosmic ray)과 일반 질소 (14N)가 참여하는 핵 반응으로 인해 대기 상층에 풍부할 수 있다. 한편, 화석 연료에는 방사성 탄소 동위원소 오래전에 붕괴되어 14C 비율이 실질적으로 0일 수 있다. 3-하이드록시프로피온산 원료로 바이오 유래 원료를 사용하거나, 이와 함께 화석 연료를 병용할 경우, ASTM D6866-21 규격으로 3-하이드록시프로피온산 내에 포함된 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC; percent modern carbon)과 바이오 탄소의 함량을 측정할 수 있다.
측정 방법은 예를 들어, 측정 대상 화합물에 포함되는 탄소 원자를 그라파이트 또는 이산화탄소 가스 형태로 만들고 질량 분석기로 측정하거나, 액체 섬광 분광법에 따라 측정할 수 있다. 이때, 상기 질량 분석기 등과 함께 14C 이온을 12C 이온으로부터 분리하기 위한 가속기를 함께 사용해 2개의 동위 원소를 분리하여 함량 및 함량비를 질량 분석기로 측정할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소의 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상, 50 pMC 이상, 90 pMC 이상, 100 pMC 이상일 수 있고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량%일 수 있다.
상기 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미하고, 1950년대 핵 실험 프로그램의 효력이 지속되고 있고 소멸되지 않아, 100% 보다 클 수 있다.
또한, 상기 바이오 탄소의 함량은 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 전체 탄소 함량에 대한 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 이 값이 클수록 친환경성 화합물에 해당할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC) 및 바이오 탄소 함량이 지나치게 적으면, 친환경성이 감소하며, 바이오 유래 물질이라 볼 수 없을 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정 상태는 X-선 회절 (XRD) 그래프에서 피크 등을 통해 확인할 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다.
예를 들어, 상기 농축액에 수산화 마그네슘(Mg(OH)2)이 포함되어 있어, 형성되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Mg(3HP)2인 경우, Mg(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 3-하이드록시프로피온산과 마그네슘 결합에 의한 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다. 이러한 피크는 수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 또는 황산 마그네슘(Mg(SO4))에 대한 X선 회절(XRD) 분석 결과와는 상이한 결과를 나타내는 것이며, X선 회절(XRD) 분석 결과 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 특정 피크가 나타나는 경우 Mg(3HP)2의 결정이 형성되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, Mg(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 피크가 나타날 수 있으며, 예를 들어, 2θ값이 8.2 내지 9.3°, 9.5 내지 11.0°, 11.2 내지 12.7°, 12.9 내지 13.3°, 13.5 내지 14.8°인 범위에서 각각 피크가 나타날 수 있다.
또한, 상기 농축액에 수산화 칼슘(Ca(OH)2)이 포함되어, 형성되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Ca(3HP)2인 경우, Ca(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 3-하이드록시프로피온산과 칼슘 결합에 의한 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다. 이러한 피크는 수산화 칼슘(Ca(OH)2) 또는 황산 칼슘(Ca(SO4))에 대한 X선 회절(XRD) 분석 결과와는 상이한 결과를 나타내는 것이며, X선 회절(XRD) 분석 결과 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 특정 피크가 나타나는 경우 Ca(3HP)2의 결정이 형성되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, Ca(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 3개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 9개 이상의 피크가 나타날 수 있으며, 예를 들어, 2θ값이 10.0 내지 11.0°, 11.1 내지 11.6°, 11.6 내지 12.5°, 12.7 내지 13.6°, 13.8 내지 16.0°, 17.0 내지 18.0°, 19.0 내지 19.8°, 20.2 내지 21.2°, 21.5 내지 22.0°인 범위에서 각각 피크가 나타날 수 있다.
한편, 상기 입사각(θ)이란 X선이 특정 결정면에 조사될 때, 결정면과 X선이 이루는 각도를 의미하며, 상기 피크란, x-y 평면에서의 가로축(x축)이 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이고, x-y 평면에서의 세로축(y축)이 회절 강도인 그래프 상에서, 가로축(x축)인 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이 양의 방향으로 증가함에 따라, 세로축(y축)인 회절 강도에 대한 가로축(x축)인 X선의 입사각의 2배(2θ)값의 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 양의 값에서 음의 값으로 변하는, 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 0인 지점을 의미한다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 1.50 Å 이상 13.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 2.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Mg(3HP)2인 경우, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 나타나는 피크의 상기 결정 내 원자들 간의 간격(d값)은, 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 13.00 Å 이하, 4.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 5.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Ca(3HP)2인 경우, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 나타나는 피크의 상기 결정 내 원자들 간의 간격(d값)은, 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 13.00 Å 이하, 3.00 Å 이상 10.00 Å 이하, 3.40 Å 이상 9.00 Å 이하, 4.00 Å 이상 8.50 Å 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하이고, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하이고, 결정화 온도가 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하일 수 있다.
상기 유리 전이 온도, 융점, 결정화 온도는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정될 수 있으며, 측정시 승온 속도는 1 내지 20 ℃/분일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하, -50 ℃ 이상 -35 ℃ 이하, -45 ℃ 이상 -40 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 융점은 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하, 31 ℃ 이상 160 ℃ 이하, 32 ℃ 이상 150 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정화 온도는 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하, 27 ℃ 이상 160 ℃ 이하, 30 ℃ 이상 150 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정화 안정구간은 -40 ℃ 내지 150 ℃일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는, 회수된 전체 결정의 질량 대비 상기 구조식 1 및/또는 구조식 2의 구조식을 갖는 화합물의 질량의 백분율(%)로 계산될 수 있다. 예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 또는 90 내지 99%, 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 이전에, 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 및 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 2종의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성효소(GdrAB)를 암호화하는 유전자(gdrAB)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 비타민 B12를 생합성할 수 있는 균주일 수 있다.
상기 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)는 dhaB(GenBank accession no. U30903.1) 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)에서 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 dhaB1, dhaB2 및/또는 dhaB3를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 글리세롤을 3-하이드록시프로판알(3-hydroxypropanal, 3-HPA)과 물(H2O)로 분해하는 효소 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)를 암호화하는 유전자(aldH)는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 E. coli K12 MG1655 세포주에서 유래한 aldH(GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) 유전자, 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia)에서 유래한 puuC 유전자, 및/또는 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 KGSADH 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알데하이드 탈수소효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 3-하이드록시프로판알로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하기 위한 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 발효액 생산을 위한 배지는 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있다. 일 예에서 상기 배지는 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 일 예에서 상기 배지는 폐글리세롤(crude glycerol) 및/또는 전처리된 폐글리세롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 생산용 배지는 비타민 B12를 추가로 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액에 포함된 3-하이드록시프로피온산의 농도는 1 내지 200 g/L, 10 내지 150 g/L, 30 내지 130 g/L 또는 40 내지 100 g/L일 수 있다.
또한, 상기 발효는 중성 발효일 수 있으며, 예를 들어 발효시 pH가 6 내지 8, 6.5 내지 8, 6 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.5 범위에서 유지되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 범위는 필요에 따라 적절히 조절될 수 있다. 상기 중성 발효를 위해 상기 알칼리 금속염이 투입될 수 있다. 상기 알칼리 금속염은 Mg2+, Ca2 또는 이의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2 또는 Mg(OH)2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액으로부터 세포를 제거(분리)하는 단계; 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계; 및/또는 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포의 제거(분리)는 세포(균주) 제거 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 세포의 분리는 원심분리를 수행하여 이루어질 수 있다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계는, 발효액의 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 활성탄을 상기 발효액과 혼합한 후 활성탄을 제거함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계는 고형 불순물의 제거, 단백질 및/또는 소수성 functional group이 있는 물질의 제거, 및/또는 탈색(decoloration) 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 필터 여과, 및/또는 활성탄 여과 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 발효액의 농축은 발효액 (예컨대, 발효액의 액상 성분)을 증발하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 농축은 발효액의 액상 성분을 증발시키기 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 회전증발농축, 증발 농축, 진공 농축, 감압 농축 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 농축 후의 발효액 내 3-하이드록시프로피온산 농도는, 농축 전과 비교하여, 2 내지 50배, 2 내지 40배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 10배, 5 내지 50배, 5 내지 40배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 또는 5 내지 10배 증가된 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 3-하이드록시프로피온산염의 결정화를 통해 발효 부산물 및/또는 첨가물을 손쉽게 분리할 수 있어 순도 높은 3-하이드록시프로피온산염의 회수가 가능하고, 회수된 공정에 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 공정 등으로 고순도 및 고수율로 3-하이드록시프로피온산을 회수할 수 있고, 유기 용매를 사용하지 않아 친환경적이고 경제적인 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1 및 2에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1 및 2에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 3-하이드록시프로피온산 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구현예를 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 구현예를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주의 제조
글리세롤을 기질로 사용하여 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3HP)을 생산하는 것으로 알려져 있는 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합벡터를 대장균(E.coli) W3110 균주에 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다.
보다 구체적으로, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 BtuR 유전자를 클로닝하여 얻어진 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터를 W3110 균주(KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다. 본 준비예 1의 3-하이드록시프로피온산 생산 균주 제작 과정 및 사용된 벡터, 프라이머, 및 효소들은 대한민국 공개특허 제10-2020-0051375호의 실시예 1을 참조하여 수행하였다.
준비예 2: Ca(3HP) 2 결정 제조
준비예 1에서 준비된 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주를 비정제 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 5L 발효기에서 35℃에서 발효 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하였다. 3-하이드록시프로피온산 생성으로 인한 pH 저하를 방지하기 위해 알칼리 금속염인 수산화 칼슘(Ca(OH)2)을 투입하여 발효 수행 동안의 pH를 중성으로 유지하였다.
발효배양 후 원심분리(4000 rpm, 10 분, 4 ℃)하여 세포를 제거하고, 활성탄을 이용해 1차 발효액 정제 (1차 정제)를 진행하였다. 구체적으로 원심 분리하여 균체가 제거된 발효액에 활성탄을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심 분리하여 활성탄을 분리하였다. 이후 활성탄이 분리된 발효액을 0.7 um의 여과지를 통해 진공 펌프(vaccum pump)로 여과하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 정제하였다.
상기 1차 정제를 마친 발효액의 3-하이드록시프로피온산 농도는 50 내지 100 g/L 수준이며, 상기 발효액은 Rotary evaporator(50 ℃, 50 mbar)를 이용하여 농축 농도 600 g/L로 농축하여 농축액을 제조하고, 상온에서 교반(300 rpm)하여 Ca(3HP)2 결정을 생성하였다. 이때, 상기 농축액에서 상기 알칼리 금속염의 농도는 493.3 g/L (Ca(OH)2 기준) 이었다. 상기 생성된 결정을 에탄올(EtOH)을 이용해 3번 세척(washing)하고, 50 ℃의 오븐에서 건조하여 최종적으로 결정을 회수하였다.
준비예 3: Mg(3HP) 2 결정 제조
상기 준비예 2에서 수산화 칼슘(Ca(OH)2) 대신 수산화 마그네슘(Mg(OH)2)을 투입하여 발효를 수행하였다.
발효배양 후 원심분리(4000 rpm, 10 분, 4 ℃)하여 세포를 제거하고, 활성탄을 이용해 1차 발효액 정제 (1차 정제)를 진행하였다. 구체적으로 원심 분리하여 균체가 제거된 발효액에 활성탄을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심 분리하여 활성탄을 분리하였다. 이후 활성탄이 분리된 발효액을 0.7 um의 여과지를 통해 진공 펌프(vaccum pump)로 여과하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 정제하였다.
상기 1차 정제를 마친 발효액의 3-하이드록시프로피온산 농도는 50 내지 100 g/L 수준이며, 상기 발효액은 Rotary evaporator(50 ℃, 50 mbar)를 이용하여 농축 농도 800 g/L로 농축하여 농축액을 제조하고, 상온에서 교반(300 rpm)하여 Mg(3HP)2 결정을 생성하였다. 이때, 상기 농축액에서 상기 알칼리 금속염의 농도는 493.3 g/L (Mg(OH)2 기준) 이었다. 상기 생성된 결정을 에탄올(EtOH)을 이용해 3번 세척(washing)하고, 50 ℃의 오븐에서 건조하여 최종적으로 결정을 회수하였다.
실시예 1
제조예 2에서 수득한 Ca(3HP)2 결정을 증류수에 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 및 3-하이드록시프로피온산염의 농도가 265 g/L 가 되도록 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 준비하였다.
내산성 처리된 이온교환용 수지타워에 양이온교환수지를 12 BV로 충진 후 물로 수세하여 양아온교환수지 컬럼을 준비하였다.
이때, 양이온 교환수지로 SAMYANG CORPORATION의 TRILITE®CMP28LH를 사용하였다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4 로 투입하고, 이후 증류수를 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 2.4로 투입하여, pH 2.5 이하의 3-하이드록시프로피온산 수용액을 수득하였다.
이후, 수득한 3-하이드록시프로피온산 수용액에서 물을 제거하여 수용액 내의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 70 wt%가 되도록 농축하였다.
실시예 2
Ca(3HP)2 결정 대신 제조예 3에서 수득한 Mg(3HP)2 결정을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정을 수행하였다.
[실험예]
1. 양이온 함량 측정
실시예 1 및 2에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량과 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량을 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)을 이용하여 측정하였다.
HPLC는 Aminex HPX-87H ion exclusion column (7.8 * 300 mm, 9㎛)을 사용하여 0.5 mM sulfuric acid (H2SO4)를 flow rate 0.4 mL/min 속도로 흘려주었고, column의 온도는 35℃, Detector 온도는 35℃, injection volume은 5μL, UV Detector 는 210 nm로 하였다.
도 1은 실시예 1 및 2에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1 및 2에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 양이온(Ca2+, Mg2+) 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
이온교환 전 양이온 함량 (mg/L) 이온교환 후 양이온 함량 (mg/L)
실시예 1 Ca2+: 61175.8274 Ca2+: 1.8710
실시예 2 Mg2+: 454.6297 Mg2+: 0.0463
2. 3-하이드록시프로피온산 농도 측정
실시예 1에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 3-하이드록시프로피온산의 ?t량을 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)을 이용하여 측정하였다.
도 3은 실시예 1에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에서의 3-하이드록시프로피온산 함량의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
3. 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 회수율 측정
실시예 1에서 3-하이드록시프로피온산의 회수율을 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
구체적으로, 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액에 포함된 3-하이드록시프로피온산의 함량(X)과, 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액에 포함된 3-하이드록시프로피온산의 함량(Y)을 HPLC를 통해 분석한 후, 하기 식 1에 대입하여 3-하이드록시프로피온산 회수율을 계산하였다.
[식 1]
3-하이드록시프로피온산 회수율 (%) = Y/X * 100
이온교환 후 수용액 내의 3HP 농도 (g/L) 회수율(%)
실시예 1 38.2760 99
상기 표 1 및 2에 따르면, 본원 실시예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 의하는 경우, 3-하이드록시프로피온산 수용액 내의 양이온 함량이 감소하고, 높은 수치로 3-하이드록시프로피온산이 회수되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 의하는 경우, 3-하이드록시프로피온산염에서 양이온을 효과적으로 분리하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인할 수 있다.
4. 3-하이드록시프로피온산 수용액의 1 H-NMR 측정
실시예 1에서 회수 공정 수행 이후 3-하이드록시프로피온산 수용액 내의 3HP의 ?t량을 72wt%로 농축하였다.
상기 3HP 72wt% 함량 3-하이드록시프로피온산 수용액 100 mg를 샘플링하여 NMR solvent인 D2O 500 μL에 용해시키고, 수분이 제거된 10 mg의 DMF를 첨가한 용액을 NMR 튜브에 옮겨 담고 1H-NMR 측정용 샘플을 제조하였다.
상기 측정용 샘플을 사용하여 1H-NMR 스펙트럼(AVANCE III HD FT-NMR spectrometer(500 MHz for 1H), Bruker사 제조)을 측정하였다.
도 4는 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4를 통해 본원 실시예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 의하는 경우, 표준 물질인 DMF에 의하여 3HP의 정량 및 불순물의 정량이 가능하며, 고순도의 3HP를 수득한 것을 확인할 수 있었다.
5. 3-하이드록시프로피온산염 결정 내 바이오 탄소 함량 분석
ASTM D 6866-21(Method B)를 이용하여 준비예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Ca(3HP)2)과 준비예 3의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Mg(3HP)2)의 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 및 바이오 탄소 함량을 분석하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
상기 바이오 탄소 함량은 준비예 2 및 3의 3-하이드록시프로피온산염 결정에 각각 포함된 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 3-하이드록시프로피온산염 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미한다.
방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 바이오 탄소 함량 (%)
준비예2 101.52 100
준비예3 102.23 100
- pMC: percent Modern Carbon; 퍼센트 현대 탄소
상기 표 3을 참고하면, 상기 준비예 2 및 3의 3-하이드록시프로피온산염 결정에 포함된 pMC가 100 이상으로, 바이오 탄소의 함량 또한 100% 이상임을 알 수 있으며(바이오탄소함량 평균값의 정밀도는 ±3%(절대값)), 이를 통해 생산된 3-하이드록시프로피온산염 결정이 친환경적인 화합물임을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계;
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 형성하는 단계; 및
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;를 포함하는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양이온교환수지 컬럼의 수지부피는 2 BV 이상인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계는
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 상기 양이온교환수지 컬럼에 통액속도(SV) 7.2 이하로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액은 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 100 g/L 이상 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 포함된 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후,
    상기 양이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계; 또는 상기 양이온교환수지 컬럼에 산을 통과시키는 단계;를 추가로 더 수행하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 농축액은 상기 3-하이드록시프로피온산을 100 g/L 이상 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2로 표시되는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정:
    [구조식 1]
    Cation(3HP)n
    [구조식 2]
    Cation(3HP)n·mH2O
    상기 Cation는 알칼리 금속염의 양이온이고,
    상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산이고,
    상기 n은 양이온과 결합하는 3HP 수로, 1 이상의 정수이고,
    상기 m은 수화물에서의 물 분자 수로, 1 이상의 정수이다.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 이들의 혼합물인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하이고, (D90-D10)/D50이 1.00 이상 3.00 이하인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상이고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  11. 제1항에 있어서,
    3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계; 및
    상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액을 형성하는 단계;를 더 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  12. 제1항에 있어서,
    3-하이드록시프로피온산 회수율이 40% 이상인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
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