KR20230080038A - 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 분리 정제하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것이다.
Description
본 발명은 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 분리 정제하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 관한 것이다.
유기산은 식품, 화장품, 의약품, 고분자 산업에서 다양한 용도를 갖는 상업적으로 중요한 화학 물질이다. 그 중에서 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 3HP)은 아크릴산(acrylic acid), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol), 아크릴아미드(acrylamide), 말론산(malonic acid) 및 바이오폴리머 등의 제조를 위한 원료로 활용이 가능한 물질이다.
3-하이드록시프로피온산의 생산은 크게 화학적 방법과 생물학적 방법의 두 가지 방법으로 이루어지나, 화학적 방법의 경우 초기 물질이 고가인 점, 생산 과정 중 독성 물질이 생성되는 점 등에 의해 비친환경적이라는 지적이 있어, 친환경적인 바이오 공정이 각광받고 있다.
미생물 발효에 의한 유기산의 제조시, 미생물을 발효하는 과정에서 3-하이드록시프로피온산 등의 유기산 이외에 다른 부산물도 함께 생성되기 때문에, 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 과정이 필요하다. 미생물 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 방법으로는 전기 투석법, 역삼투막법, 유기산을 함유하는 용액-유기용매 반응 추출법 등이 사용되고 있으며, 특히, 수산화나트륨(NaOH)를 이용한 역추출법이 수율이 높아 널리 이용되고 있다. 그러나, 이들 방법의 경우 생성물이 유기산염 형태이므로 이를 유기산으로 전환하기 위한 공정이 추가적으로 필요하며 순도가 낮은 단점이 있다.
3-하이드록시프로피온산은 발효 공정을 통해 생산되는 다른 유기산들과는 달리, 높은 친수성을 나타내고, 물에 대한 용해도 및 반응성이 높다. 이에 따라 침전 또는 추출과 같은 종래 유기산 분리 정제 공정을 적용하기 어렵다.
반응 추출법은, 유기산과 반응성이 좋은 아민 또는 알코올과 같은 활성 희석액(active diluent)을 이용하여, 유기산을 추출하는 방법으로, 유기산의 선택적 추출이 가능하고, 추출 효율이 비교적 높다. 이에 따라, 3HP의 분리 정제 시에도 상기 반응 추출법을 적용하는 것이 시도되고 있다. 일례로, 상기 아민으로서 트리옥틸아민(trioctylamine; TOA)을 사용하는 방법이 제안되었으나, 3HP의 추출 효율이 낮고, 또 다량의 유기 용매가 필요하다는 문제점이 있다. 또, 아민으로서 트리데실아민(tridecylamine)을 사용하는 경우에는, TOA 보다 3HP의 추출 효율은 높지만, 추출 시 유기상과 수상이 분리되지 않는 에멀젼(emulsion) 현상이 발생하는 문제점이 있다.
따라서, 미생물 발효액 등 3-하이드록시프로피온산 포함 원료액으로부터 고순도 및 고수율의 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 새로운 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 분리 정제하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정을 제공하기 위한 것이다.
본 명세서에서는 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 상기 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공될 수 있다.
본 발명자들은, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함하는 경우, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 효과적으로 분리하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산할 수 있으며, 3-하이드록시프로피온산의 회수율이 우수하고 정제 속도가 빠르다는 것을 실험을 통하여 확인하고, 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 3-하이드록시프로피온산은 발효 공정을 통해 생산되는 다른 유기산들과는 달리 높은 친수성을 나타내고 물에 대한 용해도 및 반응성이 높아, 침전 또는 추출과 같은 종래 유기산 분리 정제 공정을 적용하기 어렵다.
특히, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 발효액 내의 불순물을 제거하기 위해 추출, 결정화, 크로마토그래프 등을 이용하는 경우 양이온, 음이온 및 특정의 불순물(Glycerol, Acetate 및 1,3-Propanediol 등)을 제거하기 어렵고, 추가적이며 반복적인 공정의 증가와 농축, 건조, 다량의 유기 용매의 사용으로 비용 증가 및 환경적인 문제가 있다.
상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액으로부터 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하기 위해 종래의 반응 추출 방식이 아닌 연속적인 이온 교환 방식을 이용하여, 폐수 발생량, 수지 사용량 및 물 사용량을 절약할 수 있으며, 유기 용매를 사용하지 않아 친환경적으로 3-하이드록시프로피온산을 회수할 수 있다.
상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액은 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 동시에 또는 순차적으로 접촉될 수 있으며, 3-하이드록시프로피온산의 정제 효율을 높이기 위해 약염기성 음이온교환수지 컬럼에 우선 접촉한 이후 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉하는 것이 보다 바람직하다.
상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 내의 해리된 음이온(citric acid, SO4 2-, Br-, Cl- 등)을 제거하는 역할을 하고, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산을 음이온 형태로 선택적으로 흡착시키는 역할을 한다.
구체적으로, 상기 약염기성 음이온교환수지는 금속염의 해리능이 낮아 발효액에서 이온형태로 해리된 불순물 이온을 먼저 흡착하여, 강염기성 음이온교환 수지의 해리 및 3-하이드록시프로피온산 음이온의 흡착 능력을 높여줄 수 있다.
다만, 약염기성 음이온교환 수지 또한 3-하이드록시프로피온산의 해리 및 흡착 능력이 있으므로 약염기성과 강염기성 음이온교환 수지를 혼합하는 경우는 이를 유의하여 설계할 필요가 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 내의 해리된 음이온은 약염기성 음이온 교환수지 컬럼을 통과하며 수지에 흡착되고, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염은 분해되지 않고 통과하게 되어 발효액 내의 해리된 음이온 제거할 수 있다.
또한, 발효액 내의 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염은 강염기성 음이온 교환수지 컬럼을 통과하며 3-하이드록시프로피오네이트(3-Hydroxypropionate; 3HP-)와 금속 염의 양이온으로 해리되면서 금속 염의 양이온은 통과하고 3-하이드록시프로피온산이 음이온 형태로 수지에 선택적으로 흡착될 수 있다.
한편, 상기 약염기성 음이온교환수지는 교환기가 약염기성의 2차 아민(secondary amine) 또는 3차 아민(tertiary amine)으로 이온형이 OH- 또는 Cl-의 형태일 수 있으며, 상기 약염기성 음이온교환수지의 유효 pH 범위(Operating pH Range)는 0 내지 9일 수 있다.
예를 들어, 약염기성 음이온 교환수지로 Lanxess사 Lewatit MP68 등이 사용될 수 있다.
상기 약염기성 음이온교환수지의 선택은 교환 효율에 따라 입자의 크기, 형상, 교환기 및 이온형이 변경될 수 있다.
상기 약염기성 음이온교환수지에서의 염기도는 pH 3.0 내지 7.0 일 수 있으며, 상기 약염기성 음이온교환수지의 pH가 3.0 미만인 경우, 3-하이드록시프로피온산염이 해리되어 3-하이드록시프로피온산으로 나오는 문제가 있을 수 있다. 또한, pH가 7.0을 초과하는 경우 약염기성 음이온교환수지의 교환기와의 반응으로 알칼리염이 과량으로 생성되는 문제가 있을 수 있다.
한편, 상기 강염기성 음이온교환수지는 강염기성의 4차 암모늄을 교환기로 사용하며, 예를 들어 교환기로 트리메틸암모늄(Trimethylammonium), 디메틸에탄올암모늄(Dimethylethanolammonium) 등을 가질 수 있고, 상기 강염기성 음이온교환수지의 유효 pH 범위(Operating pH Range)는 1 내지 14일 수 있다.
예를 들어, 강염기성 음이온 교환수지로 삼양사 HMA30 Cl 등이 사용될 수 있다.
또한 이온형으로는 OH- 또는 Cl-의 형태일 수 있으며, 수지의 선택은 교환 효율에 따라 입자의 크기, 형상, 교환기 및 이온형이 변경될 수 있다.
상기 강염기성 음이온교환수지에서의 염기도는 3-하이드록시프로피온산의 음이온이 흡착되기 전에는 pH 3.0 내지 10.0 일 수 있으며, 흡착시에는 pH 3.0 내지 8.0 일 수 있다. pH가 3.0 미만인 경우, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염이 3-하이드록시프로피오네이트(3-Hydroxypropionate; 3HP-)로 해리되지 않아 3-하이드록시프로피온산의 회수 수율이 저하될 수 있다.
한편, 후술하는 바와 같이 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계;를 더 포함하는 경우, 상기 강염기성 음이온교환수지의 수세 시 염기도는 pH가 5.0 내지 10.0 일 수 있으며, 상기 염기도를 가지는 경우, 중성의 불순물과 알칼리금속염의 배출 효율이 증가할 수 있다.
또한, 후술하는 바와 같이 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계에서는 첨가되는 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액에 따라 염기도가 달라질 수 있으며, 예를 들어 수산화나트륨 수용액의 경우는 pH 7.0 내지 12.0일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산의 음이온이 흡착되기 전의 강염기성 음이온교환수지에서의 염기도를 기준으로, 약염기성 음이온교환수지(pH 3.0 내지 7.0)와 강염기성 음이온교환수지(pH 3.0 내지 10.0)의 염기도(pH)의 차이는 2.0 이상, 2.5 이상, 3.0 이상일 수 있고, 5.0 이하, 4.5 이하, 4.0 이하 일 수 있다. 즉, 상기 강염기성 음이온교환수지는 약염기성 음이온교환수지보다 pH 2.0 이상 높은 수지를 사용할 수 있다.
상기 약염기성 음이온교환수지와 상기 강염기성 음이온교환수지의 염기도(pH)의 차이가 상기 소정의 범위를 가짐으로써 3-하이드록시프로피온산의 정제 효율이 증가할 수 있다.
또한, 약염기성 음이온교환수지 및 강염기성 음이온교환수지 각각의 수지에 의해 유기산염의 해리 정도에 따라 pH의 변화가 있으며, 이에 따라 통액속도와 통액부피에 따라 달라질 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서, 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 0.1 내지 1.0, 또는 0.1 내지 0.5, 또는 0.1 내지 0.3일 수 있다.
상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피가 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1.0을 초과하는 경우, 강염기성 음이온교환수지의 성능을 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 약염기성 음이온교환수지를 통과한 액 내에 존재하는 이온교환반응에서 생성되는 금속염(CaCㅣ2, MgCl2, Ca(OH)2, Mg(OH)2 등)으로 인해 강염기성 음이온교환수지에서의 교환능력이 저하될 수 있다.
또한, 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피가 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 0.1 미만인 경우, 발효액 내의 해리된 음이온이 충분히 제거되지 못하는 문제가 있을 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계는, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 10 내지 100 h-1, 또는 10 내지 80 h-1, 또는 30 내지 50 h-1로 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 통액 속도(space velocity; SV)는 컬럼내 시간당 통액량을 흡착수지의 체적으로 나눈 수치이다.
상기 통액 속도(SV)가 100 h-1를 초과하는 경우 흡착 수지의 음이온 형태의 불순물의 흡착율이 떨어지는 문제가 있을 수 있으며, 10 h-1 미만인 경우 흡착 시간이 지나치게 길어져 비효율적일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피는 약염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV, 또는 1 내지 5 BV, 또는 1 내지 3 BV일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피가 약염기성 음이온교환수지 대비 10 BV를 초과하는 경우 발효액의 농도가 낮아져서 효율성이 떨어지며, 1 BV 미만인 경우 충분히 해리되어 있는 이온 불순물들이 남게 되어 이후 강염기성 음이온교환수지의 교환 용량을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있다.
상기 통액 부피(bed volume; BV)은 충진된 수지 부피에서 시간당 흘러간 액상의 부피를 뜻한다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계는, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 30 h-1, 또는 1 내지 20 h-1, 또는 1 내지 10 h-1로 투입하는 단계를 포함할 수 있으며, 처리양이나 교환수지 컬럼의 용량에 따라 상기 통액 속도는 달라질 수 있다.
상기 통액 속도(SV)는 pH 값이나 전기전도도의 변화로 최적의 운행 조건을 결정할 수 있으며, 통액 속도(SV)가 30 h-1를 초과하는 경우 3-하이드록시프로피온산이 음이온으로 해리되고 흡착하는 충분하는 시간에 도달하지 않아서 수율의 문제가 있을 수 있으며, 1 h-1 미만인 경우 흡착 시간 및 전체 이온교환 공정 처리시간이 지나치게 길어져 비효율적이다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피는 강염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV, 또는 1 내지 5 BV, 또는 1 내지 3 BV일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피가 강염기성 음이온교환수지 대비 10 BV를 초과하는 경우 사용되는 수지의 양이 많아져 비용 및 처리 시간이 증가되고, 1 BV 미만인 경우 흡착되어 처리되는 양이 적어 효율적이지 못하다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 내의 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도는 5 wt% 이상, 또는 10 wt% 이상, 또는 20 wt% 이상이면서, 50 wt% 이하, 또는 40 wt% 이하, 또는 30 wt% 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도가 5 wt% 미만인 경우 이온교환 공정에서 희석이 되어 정제한 3-하이드록시프로피온산의 농도가 낮아져 많은 양의 물을 농축해야 하는 문제가 있을 수 있으며, 50 wt%를 초과하는 경우 점도 증가로 인한 막힘 현상이나 완전한 해리/흡착/탈착이 되기 위해 통액 속도를 낮추게 되어 효율성의 문제가 발생할 수 있다.
한편, 상기 이온교환의 공정은 실온에서 처리를 하지만 계절적인 온도차로 인해 통액 속도를 맞추기 위해 가열을 하여 진행할 수도 있다.
한편, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 단계에서 3-하이드록시프로피온산 염이 3-하이드록시프로피오네이트와 금속 염의 양이온으로 해리하면서 생기는 양이온 불순물, 중성 불순물 등을 수세를 통해 제거할 수 있다.
이때, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계;는 물을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 50 h-1, 또는 1 내지 30 h-1, 또는 1 내지 10 h-1 로 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계에서, 물의 통액 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV, 또는 1 내지 5 BV, 또는 1 내지 3 BV 일 수 있다.
상기 통액 속도(SV) 및 통액 부피(BV)는 전기전도도의 측정으로 불순물 이온이 제거되는 것을 확인하여 결정할 수 있다.
상기 통액 속도(SV)가 50 h-1를 초과하는 경우 교환의 효율성 문제가 있을 수 있으며, 1 h-1 미만인 경우 시간이 지나치게 길어져 비효율적일 수 있다.
또한, 상기 물의 통액 부피가 10 BV를 초과하는 경우 폐수 발생량이 증가하여 비효율적일 수 있으며, 1 BV 미만인 경우 양이온 불순물이 충분히 제거되지 않을 수 있다.
한편, 수세 효율을 높이기 위해 역방향이나 순방향으로 작업을 하거나 용기를 회전 또는 진동하여 양이온 불순물을 보다 효과적으로 제거할 수 있다.
또는, 수세 효율을 높이기 위해 반응 온도를 증가하여 수세 속도를 빠르게 할 수도 있다. 이때, 상기 반응 온도를 증가시키는 방법으로는 수세용 물의 온도를 증가시키거나(25℃ 내지 60℃), 또는 컬럼 외부에 스팀이나 열매를 이용하여 용기의 전체 온도를 증가시키거나, 또는 유도가열, 온수 파이프 등을 이용하여 국부적인 부분의 온도를 증가시키는 방법을 이용할 수 있다.
상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계;를 포함한다.
상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 예를 들면, NaOH, KOH, LiOH, CsOH, NaCl, KCl, LiCl, CsCl 일 수 있고, 무수물 및 함수물을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계에서 강염기성 음이온교환수지에 흡착된 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염의 금속 이온(M+ 또는 M2+)과 결합하여 3-하이드록시프로피온산 금속염(M-3HP 또는 M(3HP)2)의 형태로 탈착될 수 있다.
이때, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계는, 상기 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 30 h-1, 또는 1 내지 20 h-1, 또는 1 내지 10 h-1로 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계에서, 상기 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액의 통액 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1 내지 10 BV, 또는 1 내지 5 BV, 또는 1 내지 3 BV일 수 있다.
상기 통액 속도(SV) 및 통액 부피(BV)는 용기의 구간별 pH 값이나 전기전도도의 변화로 결정할 수 있다.
상기 통액 속도(SV)가 30 h-1를 초과하는 경우, 3-하이드록시프로피온산 음이온이 3-하이드록시프로피온산 알칼리(토)금속염의 형태로 완전한 전환이 어려워 3-하이드록시프로피온산 금속염의 탈착율이 떨어질 수 있으며, 1 h-1 미만인 경우 탈착 시간이 지나치게 길어져 비효율적일 수 있다.
또한, 상기 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액의 부피가 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 10 BV을 초과하는 경우 3-하이드록시프로피온산 알칼리(토)금속염으로의 완전한 전환이 가능하나, 회수되는 용액에서의 알칼리(토)금속염의 비중이 증가하여 다음단계인 양이온교환수지 공정에서의 양이온교환수지의 교환 용량을 소비하는 문제를 야기하고, 폐수 발생량이 증가할 수 있다. 또한, 1 BV 미만인 경우 3-하이드록시프로피온산 금속염의 전환 효율이 떨어질 수 있다.
한편, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계의 3-하이드록시프로피온산 금속염의 탈착 효율을 높이기 위해 각 구간별 온도변화를 통해 탈착 속도를 조절할 수 있으며, 상기 탈착 반응이 완료되면 수세를 통해 다음 단계를 준비할 수 있다.
상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함한다.
상기 단계에서 3-하이드록시프로피온산 금속염이 양이온교환수지 컬럼을 통과하면서 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염의 금속 이온(M+ 또는 M2+)이 수지에 흡착되고, 이온교환을 통해 3-하이드록시프로피온산이 H-3HP 형태로 회수될 수 있다.
이때, 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계는, 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 상기 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 50 h-1, 또는 5 내지 30 h-1, 또는 10 내지 20 h-1 로 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액의 통액 부피는 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 2 내지 10 BV, 또는 2 내지 7 BV, 또는 2 내지 5 BV일 수 있다.
상기 통액 속도(SV) 및 통액 부피(BV)는 pH 값 및 전기전도도의 변화를 모니터링하면서 운전을 조절할 수 있다.
상기 통액 속도(SV)가 50 h-1를 초과하는 경우 3-하이드록시프로피온산의 회수율이 떨어지는 문제가 있을 수 있으며, 1 h-1 미만인 경우 회수 시간이 지나치게 길어져 비효율적일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액의 부피가 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 10 BV을 초과하는 경우 회수되는 용액의 양이 늘어나 농축 등의 작업시간이 길어져서 효율적이지 않으며, 2 BV 미만인 경우 3-하이드록시프로피온산의 회수율이 떨어질 수 있다.
한편, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계; 이후, 상기 수득된 3-하이드록시프로피온산을 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산을 농축하는 방법은 액상 성분을 증발시키기 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 회전증발농축, 증발 농축, 진공 농축, 감압 농축 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;의 각 단계는 연속식 이온 교환 방식으로 진행될 수 있으며, 각 단계는 순차적으로 또는 동시에 진행될 수 있다.
상기 각 단계가 연속식 이온 교환 방식(moving bed)으로 진행됨에 따라, 고정상(fixed bed) 이온 교환 방식과 대비하여 수지나 폐수, 물 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 공정처리시간도 줄일 수 있어 경제적이고 효율적으로 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 생산할 수 있다.
한편, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이전에, 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 생산하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 2종의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성효소(GdrAB)를 암호화하는 유전자(gdrAB)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 비타민 B12를 생합성할 수 있는 균주일 수 있다.
상기 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)는 dhaB(GenBank accession no. U30903.1) 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)에서 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 dhaB1, dhaB2 및/또는 dhaB3를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 글리세롤을 3-하이드록시프로판알(3-hydroxypropanal, 3-HPA)과 물(H2O)로 분해하는 효소 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)를 암호화하는 유전자(aldH)는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 E. coli K12 MG1655 세포주에서 유래한 aldH(GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) 유전자, 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia)에서 유래한 puuC 유전자, 및/또는 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 KGSADH 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알데하이드 탈수소효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 3-하이드록시프로판알로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하기 위한 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 발효액 생산을 위한 배지는 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있다. 일 예에서 상기 배지는 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 일 예에서 상기 배지는 폐글리세롤(crude glycerol) 및/또는 전처리된 폐글리세롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 생산용 배지는 비타민 B12를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효는 중성 발효일 수 있으며, 예를 들어 발효시 pH가 6 내지 8, 6.5 내지 8, 6 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.5 범위에서 유지되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 범위는 필요에 따라 적절히 조절될 수 있다. 상기 중성 발효를 위해 상기 알칼리 금속염이 투입될 수 있다. 상기 알칼리 금속염은 Na+, Mg2+ 및 Ca2+ 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 NaOH일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효를 통해 3-하이드록시프로피온산(3HP)을 포함하는 균주 발효액이 생산될 수 있으며, 알칼리 금속염의 투입으로, 상기 발효 결과물에 3-하이드록시프로피온산의 금속염(Na(3HP), Mg(3HP)2, Ca(3HP)2 등)이 포함될 수도 있다.
한편, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액으로부터 세포를 제거(분리)하는 단계; 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계; 및/또는 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포의 제거(분리)는 세포(균주) 제거 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 세포의 분리는 원심분리를 수행하여 이루어질 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계는, 발효액의 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 활성탄을 상기 발효액과 혼합한 후 활성탄을 제거함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계는 고형 불순물의 제거, 단백질 및/또는 소수성 functional group이 있는 물질의 제거, 및/또는 탈색(decoloration) 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 필터 여과, 및/또는 활성탄 여과 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
한편, 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;에 관한 내용은 상기 일 구현예에 관하여 상술한 내용을 포함한다.
상기 다른 일 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계;를 포함한다.
상기 산은 예를 들면, 염산, 질산, 인산, 황산, 붕산, 브로민화수소산 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계에서 강염기성 음이온교환수지에 흡착된 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 산 수용액의 수소 양이온(H+)과 결합하여 3-하이드록시프로피온산이 H-3HP 형태로 회수될 수 있다.
이때, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계는 상기 산 수용액을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 30 h-1, 또는 1 내지 20 h-1, 또는 1 내지 10 h-1로 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계에서, 상기 산 수용액의 통액 부피는 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1 내지 10 BV, 또는 1 내지 5 BV, 또는 3 내지 5 BV일 수 있다.
상기 통액 속도(SV)가 30 h-1를 초과하는 경우, 충분히 탈착이 이루어지지 않아 수율이 낮아질 수 있으며, 1 h-1 미만인 경우 전체 3HP를 탈착하는 시간이 길어져서 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
또한, 상기 산 수용액 수용액의 부피가 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 10 BV을 초과하는 경우, 회수되는 3-하이드록시프로피온산의 농도가 낮아져서 다음단계 및 농축의 처리시간이 길어지는 문제가 있을 수 있으며, 1 BV 미만인 경우 충분히 탈착이 이루어지지 않을 수 있다.
한편, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계;에서 첨가되는 산 수용액에 따라 상기 강염기성 음이온교환수지에서의 염기도가 달라질 수 있으며, 예를 들어 염산 수용액의 경우는 pH 0 내지 2.5일 수 있다.
한편, 상기 다른 일 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 산 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 수용액을 얻는 단계 이후, 상기 3-하이드록시프로피온산 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계를 포함하며, 상기 단계에서 3-하이드록시프로피온산 수용액이 양이온교환수지 컬럼을 통과하면서 Ca2+, Na+, K+ 등의 잔류 양이온 불순물이 제거되고, 3-하이드록시프로피온산은 이온교환 반응 없이 양이온교환수지 컬름을 통과하여 회수될 수 있다.
이때, 상기 3-하이드록시프로피온산 수용액을 상기 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 50 h-1, 또는 1 내지 30 h-1, 또는 1 내지 20 h-1로 통과시킬 수 있으며, 상기 3-하이드록시프로피온산 수용액의 통액 부피는 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1 내지 50 BV, 또는 5 내지 20 BV, 또는 5 내지 10 BV일 수 있다.
상기 통액 속도(SV) 및 통액 부피(BV)는 pH 값 및 전기전도도의 변화를 모니터링하면서 운전을 조절할 수 있다.
한편, 상기 다른 일 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후, 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계에 관한 내용은 상기 일 구현예에 관하여 상술한 내용을 포함한다.
한편, 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 약염기성 음이온교환수지 컬럼; 강염기성 음이온교환수지 컬럼; 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 재생부; 및 상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액으로부터 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 양이온교환수지 컬럼;을 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 장치가 제공될 수 있다.
상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 해리된 음이온을 흡착시키고, 3-하이드록시프로피온산 염을 통과시켜 발효액 내의 해리된 음이온(citric acid, SO4 2-, Br-, Cl- 등)을 제거하는 역할을 한다.
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼은 3-하이드록시프로피온산 염에서 해리된 3-하이드록시프로피오네이트 음이온 만을 선택적으로 흡착시킬 수 있다.
상기 재생부에서는 3-하이드록시프로피오네이트 음이온과 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염의 금속 이온(M+ 또는 M2+)이 결합한 3-하이드록시프로피온산 금속염(M-3HP 또는 M(3HP)2) 수용액을 얻을 수 있다.
상기 양이온교환수지 컬럼은 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염의 금속 이온(M+ 또는 M2+)을 흡착시키고, 이온교환을 통해 3-하이드록시프로피온산이 H-3HP 형태로 회수하는 역할을 한다.
한편, 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼, 강염기성 음이온교환수지 컬럼, 재생부 및 양이온교환수지 컬럼은 각각 2개 이상이 복수로 이루어질 수 있으며, 각각은 동수이거나 다를 수 있다.
또한, 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼, 강염기성 음이온교환수지 컬럼, 재생부 및 양이온교환수지 컬럼을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 장치에서 3-하이드록시프로피온산의 회수는 연속적으로 진행될 수 있으며, 각 단계를 반응 용기가 이동하거나 in/out 밸브가 이동하여 진행, 또는 반응 용기 자체가 자전하거나 공전하여 진행할 수도 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산의 회수 장치는 미반응 발효액, 수용액 또는 물 등을 회수하는 증류부 및 이를 재사용하기 위한 농축부를 더 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액, 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액, 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액 또는 물을 각각 약염기성 음이온교환수지 컬럼, 강염기성 음이온교환수지 컬럼 또는 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 반응을 진행하는데, 이때 미반응된 발효액, 수용액 또는 물을 증류부를 통해 회수 및 농축부를 통해 농축하여 재사용 할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산의 회수 장치는 pH 측정부 및 전기전도도 측정부 또는 굴절률 측정부를 더 포함할 수 있다.
상기 전기전도도 측정부 또는 굴절률 측정부는 각 컬럼내의 이온의 흡착 또는 탈착을 통해 각 성분의 이동을 확인하는 역할을 한다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 회수 장치는 온도조절부, 회전부, 진동발생부 또는 재사용장비 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액에서 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 분리 정제하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구현예를 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 구현예를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주의 제조
글리세롤을 기질로 사용하여 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3HP)을 생산하는 것으로 알려져 있는 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합벡터를 대장균(E.coli) W3110 균주에 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다.
보다 구체적으로, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 BtuR 유전자를 클로닝하여 얻어진 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터를 W3110 균주(KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다. 본 준비예 1의 3-하이드록시프로피온산 생산 균주 제작 과정 및 사용된 벡터, 프라이머, 및 효소들은 대한민국 공개특허 제10-2020-0051375호의 실시예 1을 참조하여 수행하였다.
준비예 2
준비예 1에서 준비된 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주를 비정제 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 5L 발효기에서 35℃에서 발효 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하였다. 3-하이드록시프로피온산 생성으로 인한 pH 저하를 방지하기 위해 알칼리 금속염인 수산화 칼슘(Ca(OH)2)을 투입하여 발효 수행 동안의 pH를 중성으로 유지하였다.
발효배양 후 원심분리(4000 rpm, 10 분, 4℃)하여 세포를 제거하고, 활성탄을 이용해 1차 발효액 정제 (1차 정제)를 진행하였다. 구체적으로 원심 분리하여 균체가 제거된 발효액에 활성탄을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심 분리하여 활성탄을 분리하였다. 이후 활성탄이 분리된 발효액을 0.7 um의 여과지를 통해 진공 펌프(vaccum pump)로 여과하여 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주로부터 유래한 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 수득하였다.
실시예 1
3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도가 10wt%인 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 1 L를 약염기성 음이온교환수지(Lanxess사 Lewatit MP68) 컬럼에 통액 속도(SV) 30 h-1으로, 통액 부피를 약염기성 음이온교환수지 대비 1 BV로 통과시켜 발효액 내의 해리된 음이온을 제거하였다.
이때, 약염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피는 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 0.2 로 하였다.
이후, 상기 해리된 음이온이 제거된 발효액을 강염기성 음이온교환수지(삼양사 HMA30 Cl) 컬럼에 통액 속도(SV) 10 h-1으로 통과시킨 후, 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1 BV의 물을 통과시켜, 3-하이드록시프로피오네이트 음이온을 흡착하였다.
상기 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 흡착된 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 물을 통액 속도(SV) 50 h-1으로 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 5 BV의 부피로 통과시켜 양이온 불순물을 제거하였다.
상기 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 흡착된 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 NaOH를 통액 속도(SV) 30 h-1으로 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지부 피 대비 5 BV으로 통과시켜 Na-3HP 수용액을 회수하였다.
상기 회수된 Na-3HP 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 50 h-1으로 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 3 BV로 통과시켜, 3-하이드록시프로피온산을 수득하였다.
상기 수득된 3-하이드록시프로피온산을 30 wt% 3-하이드록시프로피온산 농도로 농축하였다.
비교예 1
3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도가 10wt%인 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주로부터 유래한 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 1 L를 2 L의 반응기에 넣은 후 교반하였다.
이후, 60 ℃로 승온 후 95 % 황산 용액 3HP 당량 대비 1당량을 첨가하여 교반을 진행하고, CaSO4 결정이 반응기 전체에 생성이 되면 온도를 실온으로 냉각하였다.
생성된 CaSO4 침전물을 0.45 마이크로의 필터를 이용하여 여과하고 남은 여액을 30 wt% 3-하이드록시프로피온산 농도로 농축하였다.
상기 농축액을 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 5 h-1으로 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 10 BV로 통과시켜, 3-하이드록시프로피온산을 수득하였다.
상기 수득된 3-하이드록시프로피온산을 30 wt% 3-하이드록시프로피온산 농도로 농축하였다.
비교예 2
3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도가 10wt%인 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주로부터 유래한 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 1 L를 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 30 h-1으로, 통액 부피를 양이온교환수지 대비 5 BV로 통과시켰다.
이때, 양이온 교환수지 컬럼의 수지 부피는 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 0.7 로 하였다.
이후, 정제액을 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 10 h-1으로 통과시킨 후, 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 5 BV의 물을 통과시켜, 3-하이드록시프로피오네이트 음이온을 흡착하였다.
상기 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 흡착된 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 물을 통액 속도(SV) 30 h-1으로 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지부피 대비 5 BV의 부피로 통과시켜 양이온 불순물을 제거하였다.
상기 3-하이드록시프로피오네이트 음이온이 흡착된 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 NaOH를 통액 속도(SV) 30 h-1으로 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 5 BV의 부피로 통과시켜 Na-3HP 수용액을 회수하였다.
상기 회수된 Na-3HP 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 30 h-1으로 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 5 BV로 통과시켜, 3-하이드록시프로피온산을 수득하였다.
상기 수득된 3-하이드록시프로피온산을 30 wt% 3-하이드록시프로피온산 농도로 농축하였다.
[실험예]
1. 3-하이드록시프로피온산(3HP) 수용액 내의 불순물 함량 측정
상기 실시예 및 비교예에서 수득한 3-하이드록시프로피온산에 대하여, 3-하이드록시프로피온산(3HP) 수용액 내의 불순물의 함량을 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) 및 1H-NMR을 이용하여 측정하였다.
(1) High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC를 이용하여 불순물(Glycerol, Acetate 및 1,3-Propanediol)과 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 비율을 측정하였다.
HPLC는 Aminex HPX-87H ion exclusion column (7.8 * 300 mm, 9㎛)을 사용하여 0.5 mM sulfuric acid (H2SO4)를 flow rate 0.4 mL/min 속도로 흘려주었고, column의 온도는 35℃, Detector 온도는 35℃, injection volume은 5μL, UV Detector 는 210 nm로 하였다.
도 1은 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.
(2)
1
H-NMR
1H-NMR을 이용하여 불순물(Glycerol, Acetate 및 1,3-Propanediol)과 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 함량비를 분석하였다.
정제 전 알칼리 금속 3-하이드록시프로피온산염 및 정제 후 3-하이드록시프로피온산을 100 μL를 샘플링에 NMR solvent인 D2O 500 μL에 용해시키고, 수분이 제거된 11.5 μL의 DMF를 첨가한 용액을 NMR 튜브에 옮겨 담고 1H-NMR 측정용 샘플을 제조하였다.
상기 측정용 샘플을 사용하여 1H-NMR 스펙트럼(AVANCE III HD FT-NMR spectrometer(500 MHz for 1H), Bruker사 제조)을 측정하였다.
도 2는 실시예 1에서 얻은 3-하이드록시프로피온산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
2. 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 회수율 측정
상기 실시예 및 비교예에서 수득한 반응 생성물에 대하여, 액체 크로마토그래피를 이용하여, 3-하이드록시프로피온산의 HPLC 면적% 분석을 통하여 3-하이드록시프로피온산의 회수율을 분석하였다.
[식 1]
3-하이드록시프로피온산 회수율(recovery rate, %) = 100 × (반응 후 3-하이드록시프로피온산 몰량)/(반응 전 3-하이드록시프로피온산 몰량)
3-하이드록시프로피온산 수용액 내의 불순물 함량(ppm) 및 3-하이드록시프로피온산의 회수율을 하기 표 1에 나타내었다.
| 3-하이드록시프로피온산 수용액 내의 불순물 함량(ppm) | 회수율(%) | |||
| Glycerol | Acetate | 1,3-Propanediol | ||
| 실시예 1 | 검출한계 | 검출한계 | 검출한계 | 92 |
| 비교예 1 | 2,425 | 검출한계 | 검출한계 | 80 |
| 비교예 2 | 검출한계 | 검출한계 | 검출한계 | 70 |
상기 표 1에 따르면, 본원 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에 의하는 경우, 산 처리 후 양이온교환수지 컬럼을 통과한 비교예 1에 비해 정제 후 불순물의 함량이 적으며, 비교예 1 및 2에 비해서 3-하이드록시프로피온산의 회수율이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 상기 구현예의 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정의 각 단계를 모두 포함하여 연속식 이온 교환 방식으로 진행되는 경우, 3-하이드록시프로피온산과 불순물을 효과적으로 분리하여 고순도의 3-하이드록시프로피온산을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인할 수 있다.
Claims (18)
- 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계;
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계; 및
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계;를 포함하는,
3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서,
상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 0.1 내지 1.0 인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 약염기성 음이온교환수지와 상기 강염기성 음이온교환수지의 염기도(pH)의 차이는 2.0 이상인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계는,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 상기 약염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 10 내지 100 h-1로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피는 상기 약염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV 인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계는,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 30 h-1로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계에서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액의 통액 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV 인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이후,
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계;를 더 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제8항에 있어서,
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계는,
물을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 50 h-1로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제8항에 있어서,
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼을 수세하는 단계에서,
물의 통액 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 대비 1 내지 10 BV 인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계는,
상기 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 30 h-1로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산 금속염으로의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액을 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 얻는 단계에서,
상기 알칼리금속염 수용액 또는 알칼리토금속염 수용액의 통액 부피는 상기 강염기성 음이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 1 내지 10 BV 인, 3-하이드록시프로피온산 금속염으로의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계는,
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 상기 양이온교환수지 컬럼에 통액 속도(SV) 1 내지 50 h-1 로 투입하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산 금속염으로의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계에서,
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액의 통액 부피는 상기 양이온교환수지 컬럼의 수지 부피 대비 2 내지 10 BV 인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 금속염 수용액을 양이온교환수지 컬럼에 통과시켜 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계; 이후,
상기 수득된 3-하이드록시프로피온산을 농축하는 단계;를 더 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 약염기성 음이온교환수지 컬럼 및 강염기성 음이온교환수지 컬럼에 접촉시키는 단계; 이전에,
3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액을 생산하는 단계;를 더 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 각 단계는 연속식 이온 교환 방식으로 순차적 또는 동시에 진행되는, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염을 포함한 균주 발효액 내의 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 금속염의 농도는 5 내지 50 wt%인, 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
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