KR20230076551A - 비타민 b 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물 - Google Patents

비타민 b 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 강화 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 함유하는 면역 기능 개선용 조성물은 세포독성이 없으면서도 면역 기능 개선 효과가 탁월하여 식품 조성물 및 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물{METHOD FOR PREPARING RICE BRAN AND SHIITAKE MUSHROOM MIXED EXTRACT POWDER FOR INCREASING VITAMIN B AND COMPOSITION FOR ENHANCING IMMUNE SYSTEM COMPRISING THE MIXED EXTRACT POWDER AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 강화 조성물에 관한 것이다.
고령화 사회 진입과 Self-Care 의식 증대로 건강기능식품 제품에 대한 관심이 증가함으로써 제품의 안전성에도 관심이 증가하고 있는 실정이다. 천연제품 제품수요가 증가함으로써 천연원료에 대한 관심 및 시장이 지속적으로 증가하고 있으나 천연원료(건조효모 등) 자체를 100% 수입에 의존하고 있다. 최근 비타민C 등의 수입산 원료의 가격을 비교분석해보면, 1년 동안 3~4배 정도로 가격이 폭등하는 등 최근 경제적, 사회적, 환경적 요인 등으로 인해 수입산 원료의 가격 변동과 공급이 불안정하기 때문인 것으로 분석된다.
지속되는 코로나19 상황 속에서 소비자들은 건강과 면역력에 대한 관심이 증가하고 있으며, 실제 비타민 B 콤플렉스 등 면역 관련 건강기능식품들은 큰 매출성장을 이루고 있다. 따라서 본 발명자는 국내산 농산물을 활용한 미강 및 표고버섯 혼합분말의 면역증강효과를 확인하기 위해 비임상 효력시험을 통한 기능성 자료를 확보하고자 하였다.
대한민국 등록특허 제10-1409834호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법 및 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 강화 조성물을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
본 발명의 일 실시 예에서, 미강 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계 및 표고버섯 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법을 제공한다.
상기 미강 추출물 및 표고버섯 추출물은 진탕 추출법 또는 초음파 추출법에 의하여 추출된 것을 특징으로 한다.
상기 진탕 추출법은 미강 또는 표고버섯에 유기 용매를 가한 후 진탕하여 수행되는 것을 특징으로 하고, 상기 유기 용매는 소듐 1-헥산설포네이트(sodium 1-hexanesulfonate)인 것이 바람직하다.
상기 진탕 온도는 40 ~ 80℃인 것을 특징으로 한다.
상기 진탕 단계 이후에, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법은 효소 처리된 미강 추출물 및 표고버섯 추출물을 건조하여 분말화하는 단계 및 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계는 미강 추출물 분말 60 ~ 75 wt%, 표고버섯 추출물 분말 25 ~ 40 wt%의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
상기 건조는 -70 ~ 20℃의 온도에서 24 ~ 48시간 동안 동결건조기에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
상기 혼합 추출분말은 10 ~ 1mg/ml의 농도로 처리되는 것을 특징으로 한다.
상기 혼합 추출분말은 세포 내 IL-2 또는 IFN-γ의 양을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
상기 혼합 추출분말은 개체의 혈청내 IFN-γ의 양을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 함유하는 면역 기능 개선용 조성물은 세포독성이 없으면서도 면역 기능 개선 효과가 탁월하여 식품 조성물 및 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 시험관 내에서 마우스 비장세포의 생존력에 대한 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 마우스 비장세포에서 사이토카인 생성에 대한 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 Balb/c 마우스 혈청에서 사이토카인 수준에 대한 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말의 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 "상에" 또는 "전에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "~ (하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명의 일 실시 예에서, 미강 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계 및 표고버섯 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법을 제공한다.
일반적으로 비타민 추출 시 이용되는 방법으로는 비타민을 유리시키기 위한 산 가열 가수분해와 염기 가수분해를 사용하지만, 이러한 방법은 pH에 따라 많은 양의 비타민이 파괴될 수 있다.
또한, 전분이 많이 함유된 식품은 추출 온도에 따라 호화가 일어나 젤을 형성하고, 이로 인해 수용성 비타민의 추출과 정제가 어려워진다.
따라서, 효소 가수분해를 이용하면 Aspergillus oryzae 유래의 α-amylase로 탄수화물의 α-1,4 결합을 끊어주며, 인산화된 형태로 존재하는 비타민 B1의 탈인산화를 유도하고 고단백질 식품에서 일부 protease와 유사한 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명자는 미강 추출물 및 표고버섯 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 경우에 비타민 B군 함량이 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 다카디아스타제(Takadiastase)는 50 ~ 1000 U/ml의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 다카디아스타제(Takadiastase)를 첨가하기 이전에 추출액의 pH를 4.0~4.5가 되도록 하는 것이 바람직하다. 상기 다카디아스타제(Takadiastase)를 첨가하고 35 ~ 45℃의 온도에서 1 ~ 5시간 보관한다.
상기 미강 추출물 및 표고버섯 추출물은 진탕 추출법 또는 초음파 추출법에 의하여 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진탕 추출법은 미강 또는 표고버섯에 유기 용매를 가한 후 진탕하여 수행되는 것을 특징으로 하고, 상기 유기 용매는 소듐 1-헥산설포네이트(sodium 1-hexanesulfonate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진탕 온도는 40 ~ 80℃인 것을 특징으로 한다. 본 발명자의 실험에 의하면, 40℃의 진탕 온도에서 비타민 B군의 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
상기 진탕 단계 이후에, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다. 상기 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액을 첨가한 이후에는 원심분리 후 상층액을 여과할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법은 효소 처리된 미강 추출물 및 표고버섯 추출물을 건조하여 분말화하는 단계 및 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 건조 단계는 동결건조기, 진공건조기, 스프레이 드라이 건조기(S/D) 중 어느 하나에 의하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 동결 건조기를 사용한다. 따라서 상기 건조는 -70 ~ 20℃의 온도에서 24 ~ 48시간 동안 동결건조기에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 건조 단계 이후에는 건조물을 분쇄하는 단계가 수행될 수 있다. 상기 분쇄 단계는 당해 기술 분야에서 사용되는 분쇄 방법을 사용한다.
상기 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계는 미강 추출물 분말 60 ~ 75 wt%, 표고버섯 추출물 분말 25 ~ 40 wt%의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다. 본 발명자의 실험에 의하면 미강:표고버섯=75:25 비율로 혼합하는 경우 비타민 B군의 함량이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
상기 혼합 추출분말은 10 ~ 1mg/ml의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하고, 상기 혼합 추출분말은 세포 내 IL-2 또는 IFN-γ의 양을 증가시키고, 개체의 혈청내 IFN-γ의 양을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
상기 개체는 포유동물인 것이 바람직하다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
실시예 1. 미강과 표고버섯을 이용한 비타민 B의 추출
1. 표준 추출공정을 통한 왕겨 및 표고버섯 추출물 제조
1) 원료세척 및 건조 공정 설정
식물 시료의 경우, 세척에 의한 추출물의 손실 및 주요 성분의 함량변화가 있을 수 있어 세척 시 식물 조직의 손상을 최소화 하는 공정을 설정하였다.
동결건조, 열풍건조에 따라 표고버섯의 추출물 및 유효성분의 함량은 변화가 심하므로, 원료 표준화 규격화를 위해서는 건조 방법도 공정 중 하나로 설정하였다.
원료의 최적 추출공정을 연구한 후, 정선과 세척, 절단, 건조 공정을 표준화 하였다(표 1).
천연스토리 원료 제조 공정 규격
세부공정 주요 내용 기준 및 규격 판정
원료 정선 오염원의 제거 부패물이 없어야 함 가/부
원료 세척 세척방법 설정
예) 와류 세척기, 브러쉬 세척기		 이물이 없어야 함 가/부
건조 세부 건조 조건을 설정 열풍건조 가/부
세절 세절기를 이용한 분쇄 - 가/부
추출 최적 조건 설정, 추출시간, 용매조건 10배수, 70℃, 8시간 열수 추출 가/부
표준 공정 규격에 따른 추출물의 비타민 B 함량
구분 B1 (mg/g) B2 (mg/g) 나이아신 (mgNE/g)
표고 - 0.0093 mg/g 1.71 mgNE/g
왕겨 0.02 mg/g - -
상기 표준 공정 규격에 따른 비타민 B 함량을 참고하면, 표고버섯의 경우 비타민 B2 및 나이아신이 추출되었으나, 왕겨의 경우 비타민 B1만 추출되고 비타민 B2 및 나이아신은 추출되지 않았다.
2. 추출 조건에 따른 왕겨 및 표고버섯의 고형분 함량
1) 왕겨 및 표고버섯 추출을 위한 온도 및 시간 조건 설정
왕겨 및 표고버섯 추출을 위한 온도조건에 따른 열수 추출 조건
원료투입량
(kg)		 가수량
(L)		 추출 시간
(hour)		 온도
(℃)		 고형분 (brix)
왕겨 표고버섯
10 100 8 60 3.2 4.8
10 100 8 70 3.4 4.9
10 200 8 60 3.0 4.7
10 200 8 70 3.1 4.7
왕겨 및 표고버섯 추출을 위한 추출시간에 따른 추출 조건
원료투입량
(kg)		 가수량
(L)		 추출 시간
(hour)		 온도
(℃)		 고형분 (brix)
왕겨 표고버섯
10 100 6 70 3.3 4.5
10 100 7 70 3.4 4.6
10 100 8 70 3.4 4.9
10 100 10 70 3.3 4.8
왕겨 및 표고버섯 추출에 사용할 온도 표준화를 위한 설정 실험결과 고형분 함량이 가수량 10배수, 70℃에서 8시간 추출한 추출액에서 왕겨와 표고버섯의 고형분 함량이 가장 높게 나와 추출시간과 온도는 8시간 70℃가 가장 적절한 것으로 판단하였다.
2) 왕겨 및 표고버섯 추출을 위한 용매량 조건 설정
왕겨 및 표고버섯 추출을 위한 용매량에 따른 추출 조건
원료투입량
(kg)		 가수량
(L)		 가열 온도
(℃)		 추출 시간
(hour)		 고형분 (brix)
왕겨 표고버섯
10 100 70 8 3.5 5.1
10 150 70 8 3.3 5.0
10 200 70 8 3.1 4.7
왕겨 및 표고버섯 추출에 사용할 최적 용매 사용량 표준화를 위한 실험결과 10배수로 추출했을 때 가장 좋은 결과를 보였다.
3. 유효성분 증대를 위한 농축 및 함량 측정
1) 감압 농축을 통한 농축
감압 농축기를 사용하여 농축한 왕겨 및 표고버섯 농축액의 수율 및 농도
구 분 시료번호 시료량 (L) 온도 (℃) 농축 시간
(hour)		 수율 (L) 고형분
(brix)
왕겨 추출물 1 60 60 10 15.2 16.3
2 60 60 8 15.8 15.9
3 60 60 6 16.3 15.2
표고버섯 추출물 1 60 60 10 15.5 26.8
2 60 60 8 16.0 25.8
3 60 60 6 16.4 24.7
유효성분 증대를 위해 200L 감압 농축기를 사용하여 농축한 결과 용량 15~16L, 왕겨 추출물 고형분 농도 약 16brix, 표고버섯 추출물 고형분 농도 약 25brix의 결과가 나타났다.
2) 왕겨 및 표고버섯의 비타민 B군 함량 측정
한국분석기술연구원에 의뢰하여 비타민 B1, 비타민 B2, 나이아신의 함량을 측정하였다.
비타민 B군 함량
구 분 시료번호 B1 (mg/g) B2 (mg/g) 나이아신 (mgNE/g)
왕겨 추출물 1 0.12 mg/g 0.15 mg/g -
2 0.12 mg/g 0.14 mg/g -
3 0.06 mg/g 0.06 mg/g -
표고버섯 추출물 1 - 0.16 mg/g 0.15 mgNE/g
2 - 0.13 mg/g 0.089 mgNE/g
3 - 0.12 mg/g 0.1 mgNE/g
함량 분석 결과, 각 추출물들의 농축 조건에 따른 비타민 B의 함량이 예상보다 낮아, 단순한 추출 농축 방법 이외에 문헌검색 등을 통한 수용성 비타민 추출방법 변경하기로 하였다.
또한, 왕겨의 원료사용을 위한 소재 조사 중 벼의 과피인 왕겨는 식품으로서 사용에 제한 내용이 있으며 기존에 쌀겨보다 미강에 함유되어 있는 비타민 양이 더 많다고 알려져 있어, 쌀눈과 쌀겨를 포함한 미강을 이용하기로 하였다.
이는 식품 원료로서 많이 알려져 있는 미강을 이용한 경우가, 왕겨를 이용한 경우보다 소비자들에게 원료에 대한 친근감 및 안전성을 제고할 수 있으므로 타당성이 있다고 판단된다.
4. 효소처리에 따른 미강 및 표고버섯의 비타민 B 함량
1) 효소 수용액 제조
전분과 당질 가수분해 활성이 높은 효소제제인 Takadiastase (sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 구입하여 효소 용액 제조하였다.
다카디아스타아제(Takadiastase) 5,000 U를 취하여 3차 증류수 10 mL를 가한 후 30초간 진탕하여 여과하였다.
2) 진탕 추출
균질화된 시료 약 1 g에 5 mM sodium 1-hexanesulfonate(Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan)의 추출용매 48 mL를 가한 후 shaking water bath(HB-205 SW, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)를 이용하여 40℃, 60℃, 80℃에서 100 rpm으로 30~40분간 진탕하였다. 진탕 후 2.5 M sodium acetate 용액과 추출용매를 각각 1 mL씩 첨가해 50 mL로 맞추었다. 이 추출액을 15,000 rpm 으로 10분간 원심분리하고 상층액을 0.45 μm PVDF syringe filter(Whatman Inc., Maidstone, UK)로 여과하였다.
3) 초음파 추출
균질화된 시료 약 1 g에 추출용매 48 mL를 첨가하고 40℃, 60℃, 80℃에서 초음파 추출기(SD-350H, Sungdong Ultrasonic Co., Seoul, Korea)로 30~40분간 추출하였다. 2.5 M sodium acetate 용액과 추출용매를 각각 1 mL씩 첨가해 50 mL로 정용하였다. 추출액을 15,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm syringe filter로 여과하였다.
4) 효소 처리
시료 1 g에 추출용매를 48 mL 가해 진탕 또는 초음파 추출을 실시한 후 이 추출액에 2.5 M sodium acetate 1 mL를 넣어 pH를 4.0~4.5로 정량하였다. 효소 처리를 위해 진탕/초음파 추출액에 takadiastase 수용액 1 mL를 첨가하여 40℃ 항온수조에서 3시간 처리하고, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상층액을 0.45 μm syringe filter로 여과하였다.
5) 효소 처리한 미강 및 표고버섯 추출물의 비타민 B군 함량 측정
미강 및 표고버섯의 효소 수용액 처리 및 온도에 따른 진탕/초음파 추출을 하고 비타민 B 군에 대한 함량 분석을 진행하였다.
비타민 B군 함량
구 분 추출 방법 온도 (℃) B1 (mg/g) B2 (mg/g) 나이아신 (mgNE/g)
미강 진탕 40 0.58 0.21 6.12
60 0.61 0.23 5.79
80 0.57 0.23 5.60
초음파 40 0.78 0.10 5.56
60 0.74 0.08 5.64
80 0.69 0.11 5.74
표고버섯 진탕 40 0.81 0.07 5.86
60 0.77 0.11 5.71
80 0.84 0.10 5.77
초음파 40 0.65 0.17 4.12
60 0.69 0.24 5.20
80 0.71 0.22 4.85
온도와 추출 방법에 따른 비타민 B 군의 함량 분석 결과, 두 추출 방법 간의 유의적인 차이는 없었으나 효소처리를 하지 않고 단순 열수추출 및 농축을 진행했던 결과보다 약 5~6배 증가한 차이를 관찰할 수 있었다.
5. 감압 농축을 통한 농축
효소처리를 진행한 미강 및 표고버섯의 유효성분 증대를 위해 실험실용 감압 농축기로 농축 진행하였다.
감압 농축기를 사용하여 농축한 미강 및 표고버섯 농축액의 수율 및 농도
구 분 시료번호 시료량 (L) 온도 (℃) 농축 시간
(hour)		 수율 (mL) 고형분
(brix)
미강 1 1 60 8 248 18.8
2 1 60 6 271 18.1
3 1 60 4 312 18.0
표고버섯 1 1 60 8 255 19.5
2 1 60 6 267 19.2
3 1 60 4 293 18.7
진탕 및 초음파 추출 방법 간 유의적인 차이가 없으나 진탕 추출 방법에서 미강과 표고버섯 모두 미세하게 함량이 더 높았음을 발견하고, 40
Figure pat00001
에서 진탕 추출을 진행한 시료들로 농축 진행하였다.
2) 미강 및 표고버섯 농축액의 비타민 B군 함량 측정
비타민 B군 함량
구 분 시료번호 B1 (mg/g) B2 (mg/g) 나이아신 (mgNE/g)
미강 1 3.14 1.70 25.68
2 2.96 1.61 24.51
3 2.77 1.65 24.77
표고버섯 1 2.91 1.84 23.44
2 2.87 1.79 23.21
3 2.54 1.72 23.40
농축 시간에 따른 비타민 B 군의 함량 변화는 농축 시간이 길수록 고형분 및 유효성분의 함량이 조금씩 높음을 확인하였으며, 평균적으로 농축 전 보다 4~5배 정도로 비타민 B군의 함량이 증가함을 확인하였다.
6. 미강 및 표고버섯 추출농축액의 분말 제조
미강 추출물 및 표고버섯 추출물의 분말화를 위하여 동결건조기를 사용하여 온도 -40℃에서 36 ~ 48시간 동안 건조하고, 건조물을 분쇄하여 분말화 하였다. 상기 방법에 의하여 수득한 미강 추출물 분말과 표고버섯 추출물 분말을 혼합하여 비타민 B군의 함량을 분석하였다.
배합비율 (wt%) 비타민 B군 함량
No. 미강 표고버섯 B1 (mg/g) B2 (mg/g) 나이아신 (mgNE/g) 합계
1 60 40 2.97 1.94 23.18 28.09
2 65 35 3.04 1.76 24.45 29.25
3 70 30 3.15 1.84 23.97 28.96
4 75 25 3.26 1.77 25.46 30.49
배합 비율별 비타민 B군의 함량을 분석한 결과, 배합비율 별 비타민 B군의 유의적 증가 혹은 감소의 차이를 보이지 않아, 비타민 B1, B2, 나이아신의 합이 가장 큰 배합 비율인 미강:표고버섯=75:25 비율을 최종 선택하였다.
실시예 2. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말의 면역 활성검증
<실험 방법>
1. 시료의 준비
실시예 1에서 제조된 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 75:25 비율로 혼합하고, DW(distilled water)에 10, 30, 100 ug/ml의 농도로 희석 후 사용하였다.
2. 비장세포 분리 및 배양
Balb/c mouse로부터 비장을 무균적으로 적출하며, RPMI 1640 용액으로 세척한 다음 분쇄하여 세포를 유리하였다. 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시킨 후 4℃, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 cell pellet을 ACK buffer 에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 유출된 비장세포는 10% fetal bovine serum와 1% penicillin-streptomycin을 함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1×106 cell/㎖이 되도록 현탁하여 48 well plate에 각각 500 ㎕을 분주하였으며, 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 농도별로 처리하였다.
lipopolysaccharide(LPS)를 양성대조군으로 시료를 구분하여 세포에 처리하였다. 위와 같이 처리된 세포군들은 37℃, 5% CO2 incubator에서 3~48시간 하였고, 배양액의 상층액은 -20℃에 보관하여 사이토카인 생성량 및 세포독성 측정을 위해 사용하였다.
3. MTT Assay를 이용한 세포독성 측정
비장세포주를 96-well microtiter plate에 세포농도 5×106 cells/㎖로 조절하여 100 ㎕씩 well에 넣고 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 농도별로 처리 한 다음 24시간 배양하였다. 배양액을 교환한 후 MTT labeling reagent에 electron coupling reagent를 첨가하여 준비한 MTT labeling mixture를 각 well당 10 ㎕씩(최종농도 0.5㎎/㎖) 4시간 처리한 후 550 nm 파장에서 흡광도를 이용하여 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 분말의 세포독성을 측정하였다.
4. 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) 측정
비장세포를 분리하여 배양액에 축척된 사이토카인의 농도를 효소결합면역흡 착검사(Enzymelinked immumosorbent assay, ELISA)법을 이용하여 측정하였다. (ELISA kit, R&D system, USA). 사이토카인의 항체가 코팅 되어 있는 well plate에 상층액 시료 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층용액을 제거하고 PBS와 Tween20(Sigma)을 섞어 만든 washing buffer로 3회 이상 세척하였다. detection antibody 용액을 넣어 항체와 반응시킨 후, Avidin과 결합된 Horseradish Peroxidase(HRP) 효소를 넣어 상온에서 15분 반응시켰다. 이후, HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 확인하였다. 시료에 cytokine이 존재하면 색상의 변화가 나타나므로, 이 변화를 통해 cytokine의 생성 유무를 알 수 있다. Stop solution(H2SO4)을 넣어 HRP 효소와 TMB 기질의 반응을 종결시킨 후, microplate reader (Thermo)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의한 Balb/c mouse 혈청으로부터 사이토카인 분비량 측정
(1) 실험동물 및 사육환경
미강 및 표고버섯 혼합 추출분말의 면역증강 효과 측정을 위한 실험동물로서 생후 7주령 된 수컷 Balb/c 마우스를 샘타코(Samtaco, Korea)부터 구입하여 동물 사육실에 서 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도:50±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 적응시킨 후 사용하였다.
(2) 시험군의 구성
Group (mice) 시험물질 Dose
(ml/kg B.W.)		 투여
방법		 No. of animal
Normal control
(NC)		 Saline 0 경구 1001~1008
양성대조군 Concanavalin A
(Con A, 2 mg/kg b.w.)		 2 경구 2001~2008
M-50 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 Low 50mg/kg 경구 3001~3008
M-200 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 High 200mg/kg 경구 4001~4008
(3) 시험물질 투여 경로 및 방법
1주일간의 순화기간 후, 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 (50, 200 mg/kg)을 1일 1회 총 3일 동안 반복 투여하였다. 양성대조군인 concanavalin A (Con A)의 경우, 2 mg/kg, b.w. 농도로 본 실험 당일 꼬리 정맥 투여하였다. 각 시험군에 투여로 인해 유발되는 스트레스를 동일하게 하기 위하여, control군에 Sample 투여군들과 같은 양의 생리 식염수를 경구 투여하였다. 실험 마지막 날 경구 투여 및 Con A 꼬리 정맥 주사하고 1시간 후 쥐를 희생하여 혈청 및 장기 적출하여 무게를 측정하였다.
(4) 장기 무게 측정
실험 마지막 날 샘플투여 및 Con A 꼬리 정맥 주사하고 1시간 후 쥐를 희생한 후 몸무게 및 각 장기의 무게를 측정하였다. 장기무게측정은 아래와 같다.
Figure pat00002
(5) Balb/c mouse 혈청으로부터 사이토카인 측정
추출물 및 Con A를 투여한 후 1시간 뒤에 쥐를 희생하여 혈액을 채취한 뒤 15분간 방치시켜 응고시킨 후 각각의 혈액을 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층의 혈청을 획득하고, ELISA kit (R&D system, USA)를 이용하여 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ 농도를 각각 측정하였다. 제조사의 protocol에 따라 capture antibody pre-coated 96well micro plate에 wash buffer로 3회 세척한 후 50㎕의 assay buffer를 분주하고 각 cytokine 표준액 및 혈청을 50㎕씩 첨가하여 200 rpm의 agitator에서 2시간 동안 실온 반응시켰다. Wash buffer를 이용해 3회 세척 후 detection antibody를 100㎕ 분주하고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 avidin-HRP를 100㎕ 분주하여 다시 실온에서 30분 간 반응시켰다. Wash buffer로 4회 세척한 후 TMB substrate solution이 포함된 기질액 100㎕를 분주하여 실온에서 15분 동안 차광하여 방치하고 stop solution 100㎕를 처리하여 반응을 정지시키고 ELISA micro reader로 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 cytokine의 농도는 표준액을 사용하여 얻은 표준곡선에 따라 계산하였다.
<실험 결과>
1. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의한 비장세포 내 cell viability 변화
미강 및 표고버섯 혼합 추출분말이 마우스의 비장세포의 cell viability에 미치는 효과를 확인하기 위하여 비장세포에 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말(PM)을 24hr 처리 하여 MTT assay를 수행하였다. T세포와 B세포의 mitogen 인 Con A와 LPS를 처리하여 대조군으로 사용하였다. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 처리했을 때 cell viability가 농도 의존적으로 미세하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
(2) 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의한 비장세포 내 cytokine 농도 변화
미강 및 표고버섯 혼합 추출분말이 마우스의 면역반응 조절에 미치는 효과를 확인하기 위하여 mouse 비장세포에 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말과 Con A를 24hr 처리 하였다. 배양 배지로 유리된 사이토카인인 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 양을 ELISA assay를 활용하여 측정하였다. 실험결과, Con A에 의하여 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 처리에 의해서 IL-2의 생성량이 저농도에서부터 증가하였으며, IFN-γ의 생성량은 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의해서 30μg/ml 에서 증가함을 확인할 수 있었습니다. IL-4, 10의 생성량은 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 처리에 의해 유의적 변화가 없음을 확인할 수 있었다(도 2).
(3) 실험동물의 무게 측정 및 장기의 무게 변화
실험동물을 Con A, 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 저농도, 고농도 그룹으로 나누어 3일 동안 경구투여 하였다. 실험 종료 후 간, 신장, 비장의 장기 지수를 비교해 보았을 때, NC군을 기준으로 각 실험군에서 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 이 결과는 간, 신강, 흉선, 비장에 대해서 외형적 영향은 없는 것으로 나타났다(표 13).
NC Con A M-50 M-200
weight gain(g) 0.32±0.12 0.45±0.48 0.1±0.57 0.28±0.41
relative tissue weight(g/kg b.w)
liver 4.387±0.308 4.325±0.293 4.392±0.228 4.274±0.341
spleen 0.359±0.05 0.368±0.025 0.324±0.028 0.332±0.062
thymus 0.192±0.019 0.191±0.025 0.189±0.025 0.189±0.018
kidney 1.523±0.205 1.531±0.16 1.580±0.167 1.513±0.146
(4) 혈청 내 cytokine 농도 변화
미강 및 표고버섯 혼합 추출분말이 마우스의 면역반응 조절에 미치는 효과를 확인하기 위하여 경구투여하였던 마우스의 혈청에서 cytokine 중 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 농도 변화를 ELISA 방법으로 측정하였다. NC군과 비교했을 때 ConA 처리군에서 IL-2, 4, 10, IFN-γ의 production 모두 유의적인 변화를 보였다. 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 처리군에서 IFN-γ의 level의 증가를 확인할 수 있었다. IL-2, 4, 10의 level에는 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 처리군에서 유의적인 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 3A~D).
<결론>
면역반응은 다양한 면역 세포들이 상호작용을 하며 외부로부터 침입한 병원체 및 물질에 대해 방어작용을 하는 것이다. 면역기능 증강으로는 cytokine 생산 증가, 백신의 adjuvant 기능, 대식세포 활성 증가, 면역세포의 생육 증가, 면역세포의 세포 독성능 증가와 같이 여러 가지 면역 기능 증강 연구가 보고 되어 있다. 효과적인 면역반응을 수행하기 위해서는 면역 세포 간에 복합적인 상호작용이 필요하다. 세포와 세포 간에 커뮤니케이션을 매개하는 분자를 총칭하여 cytokine이라고 한다. 많은 cytokine이 interleukin(IL)이라고 불려지는 이유는 백혈구(leukocytes) 사이에서 작용하면서 면역반응에 관여하기 때문이다.
IL-2는 T 세포 중에 Th1과 Th2 세포의 분화를 촉진하는 cytokine으로 이 세포들의 집단 유지에 중요한 역할을 한다. Th1과 Th2 세포는 각각 선천성 면역에 중요한 대식세포와 항체를 생산하는 B세포의 증식을 촉진한다. 따라서 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의한 IL-2의 level을 확인한 결과 세포에서의 IL-2의 양이 증가하였지만, 동물의 IL-2 혈중 농도에는 별다른 영향을 주지 않았다.
IL-10은 T세포와 대식세포에 직접적으로 작용하여 세포의 활성화를 억제하고 대식세포의 항원 제시 기능을 약하게 함으로써 면역 반응을 진정시키는 면역계에 대한 억제기능을 담당하는 억제성 사이토카인이다. IL-10은 항염증성 특징(anti-inflammatory properties)을 가지고 있어서 활성화된 대식세포에서 분비하는 TNF-α, IL-6, IL-1 등과 같이 염증성 사이토카인의 발현을 억제시키기도 한다. 본 실험에서 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말에 의한 IL-10의 level을 확인한 결과 세포와 동물의 IL-10 level에 큰 변화를 미치지 않았다.
인터페론은 호르몬 같은 사이토카인 신호 인자로써, 선천 면역의 일환으로 우리 몸을 보호하는 작용을 하게 된다. 인터페론은 항원제시세포(APC)에서 생산되어 분비되는 IFN type 1과 T 세포 및 NK 세포에서 분비되는 IFN type 2가 있다. 전자는 다양한 인터페론 촉진유전자를 발현하며, 후자는 대식세포의 분화를 돕는다. IFN type 1은 대표적으로 INF-α, IFN-
Figure pat00003
가 존재하고 있다. 이들은 APC인 대식세포, 수지상세포, B세포에서 발현되며 최종적으로 신호전달 경로를 통해서 IFN type 1과 cytokine(IL-12, IL-6, TNF 등)을 분비하게 된다. IFN type 2는 IFN-γ라고도 불리우며, NK 세포와 CD4+와 CD8+ T 세포에서 생산되어 대식세포의 활성화를 돕는 선천성 면역에 중요한 cytokine이다.
본 실험을 통해 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 처리한 그룹에서 IFN-γ의 경우, 세포에서 30μg/ml 농도에서 IFN-γ의 양이 증가하였고, 동물의 IFN-γ혈중 농도에도 저농도에서 유의적 증가 효과를 미쳤다.
IL-4는 naive T 세포에서 Th2 세포의 분화를 촉진하며, positive feedback 작용으로 Th2 세포 분화를 더욱 촉진하며, B 세포의 IgE 생산을 유도하는 cytokine이다. 본 실험의 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말을 처리한 그룹에서 IL-4의 경우 세포와 동물에서 유의적 효과를 확인할 수 없었다.

Claims (15)

  1. 미강 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계;및
    표고버섯 추출물에 다카디아스타제(Takadiastase) 효소를 처리하는 단계;를 포함하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미강 추출물 및 표고버섯 추출물은 진탕 추출법 또는 초음파 추출법에 의하여 추출된 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 진탕 추출법은 미강 또는 표고버섯에 유기 용매를 가한 후 진탕하여 수행되는 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기 용매는 소듐 1-헥산설포네이트(sodium 1-hexanesulfonate)인 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 진탕 온도는 40 ~ 80℃인 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 진탕 단계 이후에, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    효소 처리된 미강 추출물 및 표고버섯 추출물을 건조하여 분말화하는 단계;및
    미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미강 추출물 분말 및 표고버섯 추출물 분말을 혼합하는 단계는 미강 추출물 분말 60 ~ 75 wt%, 표고버섯 추출물 분말 25 ~ 40 wt%의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 건조는 -70 ~ 20℃의 온도에서 24 ~ 48시간 동안 동결건조기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 비타민 B 함량이 증대된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의하여 제조된 미강 및 표고버섯 혼합 추출분말.
  11. 제10항의 혼합 추출분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 혼합 추출분말은 10 ~ 1mg/ml의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 혼합 추출분말은 세포 내 IL-2 또는 IFN-γ의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 혼합 추출분말은 개체의 혈청내 IFN-γ의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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