TWI728324B

TWI728324B - 免疫活性化劑的製造方法、免疫活性化用飲食品的製造方法及醫藥品

Info

Publication number: TWI728324B
Application number: TW108108261A
Authority: TW
Inventors: 団克昭; 鳥居佳人
Original assignee: 鳥居佳人; 鳥居智子
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-05-21
Also published as: TW202033208A

Abstract

本發明包括：乾燥步驟，於0℃以上且40℃以下對平臥菊三七進行乾燥；以及裁斷或粉碎步驟，對於藉由所述乾燥步驟而經乾燥的平臥菊三七而言保持為0℃以上且40℃以下並且加以裁斷或粉碎。

Description

免疫活性化劑的製造方法、免疫活性化用飲食品的製造方法及醫藥品

本發明是有關於一種免疫活性化劑的製造方法及免疫活性化用飲食品的製造方法。

免疫是一種用以守護自身免受細菌或病毒等抗原侵入體內而引起的不良影響的防禦系統。生物體的免疫被大體分為自然免疫與獲得性免疫這兩種。

自然免疫於抗原侵入體內後立即起作用，並將抗原的資訊傳遞至獲得性免疫。此處，巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞等參與自然免疫，並進行藉由抗原的消化或分解而實現的排除、細胞介質的產生等。

另外，獲得性免疫藉由利用巨噬細胞等與自然免疫有關的免疫細胞而傳遞資訊的T細胞來進行。此處，關於參與獲得性免疫的T細胞，未成熟的輔助性T細胞藉由細胞介質等受到分化誘導刺激而變化為Th1細胞或Th2細胞。Th1細胞參與細胞性免疫，增強感染防禦與抗腫瘤免疫等生物體防禦能力。另外，Th2細胞參與體液性免疫。

另外，對增強感染防禦與抗腫瘤免疫等生物體防禦能力，並以感染病或癌的治療或預防為目的的免疫活性化劑進行各種研究（例如，參照專利文獻1及專利文獻2）。

於專利文獻1中，對五層龍屬植物或其萃取物進行研究，於專利文獻2中對源自茶的兒茶素（catechin）類的代謝物進行研究。另外，認為於專利文獻2中亦如記載為「關於兒茶素代謝物對NK細胞（自然殺傷細胞）活性的作用而未知」般，存在大量關於源自天然物的成分而未知的作用。 [現有技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2010-235544號公報 [專利文獻2]日本專利特開2016-160238號公報

[發明所欲解決之課題] 本發明的目的在於提供一種源自天然物的新的免疫活性化劑的製造方法及免疫活性化用飲食品的製造方法。 [解決課題之手段]

本發明者等人進行了努力研究，結果發現，藉由使用三七草（菊科三七草（Gynura）屬），可達成所述目的，從而完成了本發明。

即，根據本發明，可提供（1）一種免疫活性化劑的製造方法，其包括：乾燥步驟，於0℃以上且40℃以下對平臥菊三七（Gynura procumbens）進行乾燥；以及裁斷或粉碎步驟，對於藉由所述乾燥步驟而經乾燥的平臥菊三七而言保持為0℃以上且40℃以下並且加以裁斷或粉碎，（2）如（1）所述的免疫活性化劑的製造方法，其中使用平臥菊三七的葉或莖的至少一者來作為所述平臥菊三七，（3）如（1）或（2）所述的免疫活性化劑的製造方法，其進而包括添加維生素類、橄欖或其萃取物及魚腥草或其萃取物中的至少一種的步驟，（4）一種免疫活性化用飲食品的製造方法，其包括使利用如（1）至（3）中任一項所述的免疫活性化劑的製造方法而獲得的免疫活性化劑調配至食品或飲料中的步驟。 [發明的效果]

根據本發明，可提供一種源自天然物的新的免疫活性化劑的製造方法及免疫活性化用飲食品的製造方法。

以下，對本發明的免疫活性化劑的製造方法及免疫活性化用飲食品的製造方法進行說明。本發明的免疫活性化劑的製造方法包括：乾燥步驟，於0℃以上且40℃以下對三七草進行乾燥；以及裁斷或粉碎步驟，對於藉由所述乾燥步驟而經乾燥的三七草而言保持為0℃以上且40℃以下並且加以裁斷或粉碎。

三七草屬於菊科三七草屬。作為三七草屬，可列舉：紫背天葵（Gynura bicolor）、木耳菜（Gynura cusimbua）、白子菜（Gynura divaricata）、蘭嶼木耳菜（Gynura eliptica）、白鳳菜（Gynura formosana）、菊三七（Gynura japonica）（Gynura segetum）、尼泊爾菊三七（Gynura nepalensis）、平臥菊三七（Gynura procumbens）、狗頭七（Gynura pseudochina）等，可較佳地使用平臥菊三七。作為平臥菊三七，亦可使用葉、莖、根等任一種，較佳為使用葉或莖，更佳為使用葉。

三七草較佳為使用於採取後進行乾燥並加以裁斷或粉碎而成者。乾燥較佳為於0℃以上且40℃以下、較佳為0℃以上且36℃以下、更佳為0℃以上且34℃以下的溫度條件下進行。另外，較佳為進行低溫除濕乾燥。

認為若於高於所述溫度的溫度下進行乾燥，則三七草中所含的成分中發揮本發明的效果的成分會發生改質或分解，從而無法獲得本發明的效果。另外，於在裁斷或粉碎之前或之後加以冷凍保存的情況下，亦無法獲得本發明的效果。

另外，進行低溫除濕乾燥時的濕度較佳為以相對濕度計為10%以下。另外，低溫除濕乾燥較佳為進行數小時〜50小時，更佳為進行10小時〜30小時。

另外，對三七草進行裁斷或粉碎時的方法可利用公知的裁斷或粉碎方法來進行，較佳為對於三七草的葉而言保持為所述乾燥條件下的溫度範圍並且進行裁斷或粉碎。為了進行此種方法，較佳為使用冷卻式粉碎機，例如可使用一面冷卻一面進行粉碎的珠磨機或均質機、水冷式石臼等。再者，就將三七草的保存狀態保持為良好的觀點而言，將三七草放入至榨汁機等中以包含水分的狀態保存時欠佳。較佳為如本發明般以使三七草乾燥的狀態加以保存。以所述方式進行處理的三七草可用作免疫活性化劑。

亦可向以所述方式進行處理的三七草中添加橄欖或其萃取物、魚腥草或其萃取物。另外，亦可向本發明的包含三七草或其萃取物的免疫活性化劑中添加維生素、胺基酸、蛋白質、礦物質成分、脂肪酸、肽等追加成分。作為追加成分，較佳為添加維生素，作為維生素，可列舉：維生素A、維生素B、維生素C、維生素E或該些維生素類的衍生物等。

以所述方式進行處理的三七草、與橄欖或其萃取物、魚腥草或其萃取物及追加成分的合計量的重量比率較佳為50：50〜100：0，更佳為70：30〜100：0，進而佳為80：20〜100：0。

利用本發明的免疫活性化劑的製造方法而獲得的免疫活性化劑可調配至食品或飲料等中。作為食品，可列舉：麵包類、麵類、點心類、加工肉製品、魚貝加工品、冷凍食品、果凍類、冰淇淋類、乳製品、各種調料等。另外，除一般食品以外，亦可調配至特定保健用食品、準藥品（quasi drug）、健康食品、補充劑（supplement）中。作為飲料，可列舉：清涼飲料水、乳飲料、酒類、茶、紅茶飲料、咖啡、果汁飲料、碳酸飲料、礦泉水類、水果飲料、蔬菜飲料等。

另外，可將調配有利用本發明的免疫活性化劑的製造方法而獲得的免疫活性化劑的食品或飲料設為與片劑、膠囊劑、糖漿等口服給藥製劑相同的形態。

另外，於製造調配有利用本發明的免疫活性化劑的製造方法而獲得的免疫活性化劑的食品或飲料時，於不妨礙本發明的效果的範圍內，視需要亦可添加甜味料、著色料、保存料、增黏劑、穩定劑、凝膠化劑、抗氧化劑、發色劑、漂白劑、乳化劑、膨脹劑、酸味料、光澤劑、香料等添加劑；溶劑；油。該些添加劑可單獨使用一種，亦可將兩種以上組合而使用。

調配至所述食品或飲料中的免疫活性化劑的比例可根據使用目的而適宜調整，調配至所述食品或飲料中的免疫活性化劑的比例較佳為0.0001重量%〜80重量%，更佳為0.003重量%〜50重量%，進而佳為0.005重量%〜30重量%。

另外，利用本發明的製造方法而獲得的免疫活性化劑於醫藥品領域中用於以感染病或癌的治療或預防為目的的用途。本發明的免疫活性化劑可單獨使用，或者亦可與一般而言製劑方面所容許的添加劑一同混合而進行製劑化。另外，作為給藥形態，可列舉：使用片劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、散佈劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑、萃取劑等口服劑的給藥形態或者使用注射劑、溶液劑、栓劑、軟膏劑、貼劑、泥敷劑、洗劑等非口服劑的給藥形態等，並無特別限制，可根據治療目的等而適宜選擇。

另外，於片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑、散佈劑的情況下，可含有賦形劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑等添加劑。作為賦形劑，可列舉：澱粉、羧甲基纖維素、白糖、糊精、玉米澱粉等。

作為結合劑，可列舉：結晶纖維素、結晶纖維素·羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基纖維素、低取代度羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素乙酸酯琥珀酸酯、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、羥乙基纖維素、小麥澱粉、大米澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、糊精、α化澱粉、部分α化澱粉、羥丙基澱粉、聚三葡萄糖、聚乙烯基吡咯啶酮、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物E、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物RS、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物、聚乙烯基縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基醇、阿拉伯膠、阿拉伯膠粉末、瓊脂、明膠、白色蟲膠、黃蓍膠、精製白糖、聚乙二醇。

作為崩壞劑，可列舉：結晶纖維素、甲基纖維素、低取代度羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、交聯羧甲基纖維素鈉、小麥澱粉、大米澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、部分α化澱粉、羥丙基澱粉、羧甲澱粉鈉、黃蓍膠。

作為潤滑劑，可列舉：小麥澱粉、大米澱粉、玉米澱粉、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、含水二氧化矽、輕質矽酸酐、合成矽酸鋁、乾燥氫氧化鋁凝膠、滑石、正矽鋁酸鎂、磷酸氫鈣、無水磷酸氫鈣、蔗糖脂肪酸酯、蠟類、氫化植物油、聚乙二醇。

另外，於溶液劑、糖漿劑、懸浮劑、乳劑、酏劑的情況下，除水或植物油等一般所使用的惰性的稀釋劑以外，亦可含有著色劑、矯味劑、著香劑等作為添加劑。

另外，於注射劑的情況下，可含有懸浮液、乳濁液、用時溶解劑等添加劑。另外，於軟膏劑、栓劑的情況下，可含有脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蠟、蠟、樹脂、塑膠、基劑、二醇類、高級醇、水、乳化劑、懸浮化劑等作為添加劑。另外，於泥敷劑的情況下，可含有甘油、水、水溶性高分子、吸水性高分子等作為添加物。另外，於洗劑的情況下，可含有溶劑、乳化劑、懸浮化劑等作為添加劑。 [實施例]

以下，列舉實施例來對本發明進行說明，但本發明並不限定於此。再者，本實施例中的份及%只要無特別記載，則為重量基準。

於本實施例中，對三七草進行（1）免疫誘導反應的研究、（2）自然免疫反應及獲得性免疫反應的研究、（3）針對癌細胞的細胞障礙活性的研究。（1）免疫誘導反應的研究（樣本的製備）作為用於免疫誘導反應的研究的三七草葉的樣本，製備下述四種。

樣本A.使經採取的三七草（平臥菊三七）葉於20℃〜30℃、相對濕度10%以下的條件下進行低溫除濕乾燥。於20℃〜30℃下將低溫除濕乾燥後的三七草葉粉碎，並加入至超純水中而獲得樣本。

樣本B.於室溫（25℃左右）下將經採取的三七草（平臥菊三七）葉放入至低速榨汁機中，使用所獲得的液體及纖維質兩者而製成樣本。

樣本C.於室溫（25℃左右）下將經採取的三七草（平臥菊三七）葉加入至低速榨汁機中，於所獲得的液體及纖維質中僅使用液體而製成樣本。樣本D.將樣本B凍結，之後解凍而製成樣本。另外，關於枇杷葉、維氏熊竹葉、八丈草葉、魚腥草葉，將葉直接用作樣本。

（免疫誘導反應的研究）將樣本A〜樣本D、枇杷葉、維氏熊竹葉、八丈草葉及魚腥草葉的樣本分別稀釋為1/10000，並添加至鼠脾臟細胞中，利用定量聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法來研究此時的細胞介質-mRNA量的變動。

更具體而言，於使用（i）無免疫誘導反應劑、（ii）作為免疫誘導反應劑的刀豆球蛋白A（ConA）2 μg/mL、（iii）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）1 μg/mL的情況下，對6種細胞介質-mRNA的變動進行研究。另外，於不加入所述樣本而進行的情況下（以下，稱為「僅藥物刺激」），亦對該些（i）〜（iii）進行研究。

另外，作為細胞介質，對IL1a、IFN、TNF、IL4、IL12、IL2這六種進行研究。將結果示於圖1〜圖3中。再者，以細胞內穩定顯現的mRNA（GAPDH）為基準而將與其相對的顯現量的差表示為Delta Ct值（PCR循環數的差）。將結果示於圖1〜圖3中。

根據圖1〜圖3，認為根據IL1a、IFN、IL4中的上昇程度，於三七草葉的樣本（樣本A〜樣本D）中，低溫除濕乾燥後進行粉碎的樣本A可高效地萃取或可保持引起免疫反應的有效成分。另外，根據IL1a、IFN、IL4中的上昇程度，暗示維氏熊竹葉及魚腥草葉的樣本的作用強。

（2）自然免疫反應及獲得性免疫反應的研究（樣本的製備）用於自然免疫反應及獲得性免疫反應的研究的三七草葉的樣本是使用用於所述免疫誘導反應的研究的樣本A（以下，於該項中稱為「三七草葉的樣本」）。

另外，亦將魚腥草葉、橄欖葉用作樣本。另外，關於岩藻多糖，亦以成為與三七草葉的樣本的濃度同等的濃度的方式製備樣本。

（自然免疫反應的研究）自鼠分離出巨噬細胞，將各樣本分別稀釋為1/100、1/1000、1/10000及1/100000並添加後，添加一定量的螢光珠並培養8小時。然後，利用螢光顯微鏡觀察培養後的巨噬細胞，將取入的螢光珠量設為螢光量並加以數值化。

作為樣本，使用三七草葉、魚腥草葉、橄欖葉及岩藻多糖的樣本、以及所述四種的混合樣本。另外，亦對未使用該些樣本的對照組進行研究。

另外，作為數值化，使用螢光顯微鏡來獲取表示螢光珠的取入的狀態的圖像，於圖像中基於一定的螢光亮度以上的總面積而進行數值化處理。將結果示於圖4中。於圖4中，關於各樣本，將按照添加量（稀釋倍率）而進行數值化所得的取入螢光量示於直方圖中。

（獲得性免疫反應的研究）分離鼠脾臟淋巴球（CD4+T細胞），將各樣本分別稀釋為1/100、1/1000及1/10000並添加後，培養1週。若T細胞產生IFN-γ，則表示分化為Th1細胞，若T細胞產生IL-4，則表示分化為Th2細胞。

因而，於培養後，將產生IFN-γ的淋巴球設為Th1，將產生IL-4的淋巴球設為Th2，使用螢光標識抗體測定各自的存在。根據測定結果對各樣本求出按照稀釋倍率的Th1/Th2的比率。將結果示於圖5。再者，關於圖5的混合樣本的稀釋倍率10000倍的資料，Th1/Th2為94.5，但就圖5的易視性的觀點而言，省略表示。

根據圖4及圖5而明確，三七草葉的樣本較自然免疫反應而言更強地作用於獲得性免疫反應。由此，若確認到活化殺傷T細胞、自然殺傷細胞等、或者針對腫瘤細胞的細胞殺傷效果等，則認為確認到抗腫瘤效果。

（3）針對癌細胞的細胞障礙活性的研究（樣本的製備）用於針對癌細胞的細胞障礙活性的研究的三七草葉的樣本是使用所述免疫誘導反應的研究中的樣本A（以下，於該項中稱為「三七草葉的樣本」）。

（針對癌細胞的直接的細胞殺傷效果的研究）研究培養癌細胞並殺滅直接添加各個樣本時的細胞的細胞殺傷效果。作為癌細胞而對三種進行研究，使用固形癌、血液系癌、表皮癌的代表性鼠癌細胞系（CT-26；大腸癌、EL-4；淋巴瘤、B16 mel；黑色素瘤）。再者，作為樣本，使用三七草葉、魚腥草葉、橄欖葉及岩藻多糖的樣本、以及所述四種的混合樣本。將結果示於圖6中。

各樣本均未對EL-4、B16 mel顯示出效果，但對CT-26而確認到若干效果。特別是橄欖葉及魚腥草葉的樣本的效果強。

（經由殺傷細胞、自然殺傷細胞的活性化的癌細胞障礙活性的研究）向自鼠脾臟中分離出的淋巴球中添加各種樣本，並培養1週。之後，將另外培養的三種癌細胞與分別培養的淋巴球一併繼續培養。此處，若誘導出殺傷活性，則淋巴球阻礙癌細胞。為了測定所述情況，使用細胞障礙活性測定試劑盒（寶生物（Takara）製造的LDH細胞毒檢測試劑盒（Cytoxicity Detection Kit））來測定。

再者，作為樣本，使用三七草葉、魚腥草葉、橄欖葉及岩藻多糖的樣本、以及所述四種的混合樣本。另外，於對照組中亦用作樣本。作為癌細胞，使用CT-26、EL-4及B16 mel。

另外，作為淋巴球，分別自與三種癌細胞相適應的種及不適應的種分離。藉由適應淋巴球而癌細胞受到阻礙、且於不適應淋巴球中癌細胞未受到阻礙時可認為是癌特異性殺傷活性的誘導。將結果作為相對於對照組的比例而示於圖7中。

如圖7所示，確認到適應淋巴球中的殺傷活性且未確認到不適應淋巴球中的殺傷活性者是三七草葉、魚腥草葉及橄欖葉（核）的樣本，其作用共通而相對於CT-26強，且於B16 mel中僅於三七草葉的樣本中確認到效果。另外，整體作用最強的是三七草葉的樣本。再者，結果為於四種混合樣本中，岩藻多糖阻礙其他樣本的效果。

無

圖1是表示免疫誘導反應的研究的結果的圖表。圖2是表示免疫誘導反應的研究的結果的圖表。圖3是表示免疫誘導反應的研究的結果的圖表。圖4是表示自然免疫反應的研究的結果的圖表。圖5是表示獲得性免疫反應的研究的結果的圖表。圖6是表示針對癌細胞的直接的細胞殺傷效果的研究的結果的圖表。圖7是表示經由殺傷細胞、自然殺傷細胞的活性化的癌細胞障礙活性的研究結果的圖表。

Claims

一種免疫活性化劑的製造方法，其包括：乾燥步驟，於0℃以上且40℃以下、且相對濕度為10%以下對平臥菊三七進行低溫除濕乾燥；以及裁斷或粉碎步驟，對經由所述乾燥步驟而經乾燥的平臥菊三七，於保持0℃以上且40℃以下的同時加以裁斷或粉碎。
如申請專利範圍第1項所述的免疫活性化劑的製造方法，其中不包含使用二氧化碳超臨界進行萃取的步驟。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的免疫活性化劑的製造方法，其中使用冷卻式粉碎機進行所述裁斷或粉碎步驟。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的免疫活性化劑的製造方法，其中所述乾燥步驟於20℃以上且30℃以下進行低溫除濕乾燥，且所述裁斷或粉碎步驟是對經由所述乾燥步驟而經乾燥的平臥菊三七，於保持20℃以上且30℃以下的同時加以裁斷或粉碎。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的免疫活性化劑的製造方法，其中所述裁斷或粉碎步驟是對經由所述乾燥步驟而經乾燥的平臥菊三七，於保持0℃以上且25℃以下的同時加以裁斷或粉碎。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的免疫活性化劑的製造方法，其中作為所述平臥菊三七，使用平臥菊三七的葉或莖的至少一者。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的免疫活性化劑的製造方法，其進而包括添加維生素類、橄欖或其萃取物、及魚腥草或其萃取物中的至少一種的添加步驟。
一種免疫活性化用飲食品的製造方法，其包括使免疫活性化劑調配至食品或飲料中的調配步驟，所述免疫活性化劑為利用如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的免疫活性化劑的製造方法而獲得。
一種醫藥品，其包括免疫活性化劑，所述免疫活性化劑為利用如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的免疫活性化劑的製造方法而獲得的。