KR20230075658A - 미니돼지 et-타입과 l-타입 판별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미니돼지 ET-타입과 L-타입을 판별하기 위한 SNP 마커에 관한 것으로, 미니돼지 (L-Type, ET-Type) 의 혈액 DNA를 활용하여 미니돼지 타입별 판별 마커를 찾기 위한 전장유전체 데이터를 생산하여 집단 유전체 분석을 수행하였고, ET-타입과 L-타입을 가장 잘 구분할 수 있는 마커 16개를 선발하였는 바, 이는 미니돼지 집단 내에서 ET-타입과 L-타입 구별을 가능하게 하는 유전자 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 바이오장기 이식 연구용으로 사육되는 미니돼지 혈액 DNA의 유전체분석을 통해 발굴한 유전자마커를 이용한 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법에 관한 것이다.
장기이식(Organ transplantation)은 어떤 조직 또는 장기의 파손된 기능을 대체할 목적으로 다른 사람의 장기를 이식하여 그 기능을 회복시키는 것을 말하며, 자신의 장기를 자기 자신에게 이식하는 자가 이식 (autotransplantation, 예를 들어, 자가조혈모세포 이식), 타인의 장기를 이식하는 동종 이식 (allogeneic transplantation), 종을 달리하는 동물로부터 이식하는 이종 이식 (xenogeneic transplantation)이 있다.
이종 이식은 종이 다른 동물의 기관이나 조직, 세포 등을 사람에게 이식하는 것으로, 대체 장기를 공급하는 동물로 원숭이, 돼지 등 여러 동물이 시도되고 있다. 원숭이 및 침팬지와 같은 영장류는 다른 종에 비하여 사람과 유전적, 생리학적으로 유사하지만 인수공통전염병의 위험이 높고 윤리적 이슈 등으로 인하여 이종 이식의 모델로 적합하지 않다. 이에, 생리학적, 유전학적으로 사람과 매우 유사한 돼지가 이종 이식에 가장 적합한 동물 후보로 대두되고 있다.
특히, 미니돼지 (mini-pig, 또는 micro pig)는 인간과 해부 생리학적으로 유사하며, 특히 장기의 크기 및 형태, 대사구조가 비슷하여 바이오분야 실험 모델에 적합하고, 성체 기준 15-80kg의 몸무게를 가지고 있어, 인간과의 약동력학적 특성이 유사하다. 또한, 성 성숙 주기가 1 내지 2년으로 짧고, 산자수가 평균 4-8 마리이며, 길들이기 쉬운 특성을 가져 관리가 용이하며, 중대형 실험동물 중 영장류나 개에 비해 상대적으로 윤리적 부담이 적고, 유지관리 비용이 경제적이라는 장점이 있다.
현재 사용되는 미니피그의 품종으로는 유카탄 미니돼지 (Yucatan miniature pig), 핸포드 미니돼지 (Hanford miniature pig), 싱클레어 미니돼지 (Sinclair miniature pig 8)와 괴팅겐 미니돼지 (Gottingen miniature pig), 오미니 미니돼지 (Ohmini miniature pig)를 포함하여, 45종 이상이 있다.
미니돼지는 평균 체중 18-26kg의 극소형 (extremely tiny, ET)부터 평균체중 37-85.6kg의 대형 (large, L) 크기까지 다양한 미니돼지가 있다. 그 중, ET-타입은 면역 반응이 잘 일어나기 때문에 L-타입에 비하여 사후관리가 어렵다는 단점은 있지만, 생물의학 연구에 가장 적합한 모델로 여겨진다.
이러한 미니돼지 ET-타입과 L-타입은 개체의 크기로 구분이 가능하지만, 실험용 돼지 피부 또는 장기 등으로 분리한 경우에는 양자를 구분할 수 없는 문제점이 있다. 따라서, 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 유전자 분석을 통하여 타입을 구분할 필요가 있다.
바이오장기 이식용 연구에 있어 체형 이외에 초급성, 급성 등 면역거부반응 유전자들에 대해 게놈 수준에서 변이체 발굴, 기능 예측 등 자료 생산은 이종장기 연구에 활용이 가능하다. 이에, 단일염기서열다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 정보의 활용뿐만 아니라 유전체 예측을 위하여 반수체(Haplotype) 정보가 활용되며, SNP-Chip 데이터가 아닌 전장유전체 정보를 개체별로 생산하여 SNP 추출 기 방법 중에 반수체 정보를 생산하여 개체별 또는 집단별 변이 비교 분석 연구들이 이루어지고 있다.
유전자 분석을 이용하여 돼지의 품종을 구분하는 방법에 관한 선행기술로는, 한국등록특허 제 10-1860431호 "마이크로피그 판별용 SNP마커 조성물 및 이를 이용한 마이크로피그 판별방법"에 SNP마커를 이용하여 일반돼지와 마이크로피그를 구분하는 판별방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-2242575호 "이베리코 돼지 품종 판별용 SNP마터 세트"에 SNP 500개를 포함하는 SNP마커 세트를 이용하여 유색 돼지 집단에서 이베리코 품종을 판별하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 미니돼지 L-타입, ET-타입의 혈액 DNA를 활용하여 미니돼지 타입별 판별 마커(SNP)를 찾기 위한 전장유전체 데이터를 생산하여 집단 유전체 분석(Re sequencing)을 수행하였고, L-타입과 ET-타입에서 유전자 마커 DNAH9는 4개의 SNP마커를, GRTP1는 1개의 SNP마커를, HECW1는 11개의 SNP마커를 가지고 있으며, 이들은 서로 각기 다른 유전자형을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미니돼지 ET-타입과 L-타입에 유의한 SNP마커를 이용한 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 G인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 C인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 G인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 미니돼지로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 전장유전체 정보의 단일염기서열다형성을 활용하여 집단유전체 분석을 통한 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 유의한 SNP마커를 이용한 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법을 제공함으로써, 상기 SNP마커로 개체의 SNP 대립유전자의 유전형을 확인하는 것 만으로도 미니돼지 ET-타입과 L-타입을 쉽고 빠르게 구분할 수 있다.
도1은 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 전장유전체 데이터 생산과 분석 과정을 나타낸 도면이다.
도2는 전장유전체 분석 파이프라인 모식도이다.
도3은 미니돼지 ET-타입과 L-타입에 대한 iHS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도4는 미니돼지 ET-타입과 L-타입에 대한 XP-EHH 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도2는 전장유전체 분석 파이프라인 모식도이다.
도3은 미니돼지 ET-타입과 L-타입에 대한 iHS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도4는 미니돼지 ET-타입과 L-타입에 대한 XP-EHH 분석 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 G인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 C인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 G인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 제공한다.
미니피그는 피부의 형태와 기능, 소화기, 심혈관계, 신요도계 뿐만 아니라 면역체계에서 사람과 높은 유사성을 가지고 있어, 다양한 분야에서 연구용 동물모델로 사용되고 있다.
상기 미니돼지 ET (extremely tiny)-타입과 L (large)-타입은 어퓨어스 회사에서 판매하는 미니돼지의 종류이다.
상기 미니돼지 ET-타입은 생시 체중이 0.18-0.3kg이며 12/24개월 체중이 18/26kg이고, 체장 55.6-65cm, 체고 32.3-40cm, 흉심 20.6-25cm이다.
상기 미내돼지 L-타입은 생시 체중이 0.5-0.7kg이며, 12/24개월 체중이 37/85kg이고, 체장 72.5-84cm, 체고 41.6-54cm, 흉심 28.36cm이다.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다.
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다.
상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다.
역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 Ecoli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
일례로, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 G인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 C인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 G인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 토종닭의 체중형질을 예측할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다.
이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물을 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 1) 미니돼지로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다.
예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.
그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 단계 2)의 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이 (microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T인 경우, 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T인 경우, 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 또는 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 어퓨어스 회사에서 판매하는 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 혈액 10점 (각 5점)에 대한 DNA 추출 및 퀄리티 컨트롤(QC) 을 수행하였고, 여기서 기준 이상의 퀄리티만 라이브러리로 제작하였다 도1). 또한, 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 변이 정보를 이용하여 집단유전체 분석 (XP-EHH, iHS, ZHp)을 수행하여 미니돼지 ET-타입과 L-타입을 판별할 수 있는 SNP 16개를 선발하였다 (도 2 내지 4).
따라서, 본 발명에 따른 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물, 이를 포함하는 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 키트, 또는 이를 이용한 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법은 미니돼지 ET-타입과 L-타입을 정확하게 판별하고, 어퓨어스 회사에서 판매하는 미니돼지를 이용하는 소비자, 유관 기관 등 미니돼지 타입 판별을 위한 칩 제작, 유전적 특징 파악 등 다양한 목적으로 활용이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 청구 범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.
<실시예 1> 미니돼지 ET-타입과 L-타입 별 전장유전체 (Re sequencing)데이터 생산 및 분석
<1-1> 미니돼지 DNA 추출, 라이브러리제작 및 시퀀싱
미니돼지 ET-타입과 L-타입 유전체 및 전사체를 분석하기 위하여, 미니돼지 ET-타입과 L-타입의 혈액 10점 (각 5점)에 대한 DNA 추출 및 퀄리티 컨트롤(QC) 수행하였고, 여기서 기준 이상의 퀄리티만 라이브러리를 제작하였다. 이때, 페어드 엔드 (paired-end) 라이브러리의 평균적인 삽입 크기는 150 ± 50 bp였다.
시퀀싱 라이브러리는 DNA 샘플의 무작위 단편화에 이어 5' 및 3' 어댑터 결찰에 의해 준비 또는 "태그화"는 단편화 및 결찰 반응을 단일 단계로 결합하여 라이브러리 준비 프로세스의 효율성을 크게 높인다.
어댑터 결찰 단편은 PCR 증폭되고 겔 정제를 하였다. 클러스터 생성을 위해 라이브러리는 라이브러리 어댑터에 보완적인 표면 결합 올리고 Lawn에서 조각이 캡처되는 플로우 셀에 로드된 후 각 단편은 브리지 증폭을 통해 별개의 클론 클러스터로 증폭된다. 클러스터 생성이 완료되어 템플릿을 시퀀싱 할 준비가 된다.
Illumina SBS 기술은 단일 염기가 DNA 템플릿 가닥에 통합될 때 이를 감지하는 독점적인 가역적 터미네이터 기반 방법을 사용한다. 4개의 가역적 종료자 결합 dNTP가 각 시퀀싱 주기 동안 지속되기 때문에 자연스러운 경쟁은 통합 편향을 최소화하고 다른 기술에 비해 원시 오류율을 크게 줄일 수 있다.
결과적으로 반복적인 서열 영역 및 호모폴리머 내에서도 서열 컨텍스트 별 오류를 사실상 제거하는 매우 정확한 염기별 시퀀싱 방법이다 (도1). Illumina NovaSeq 플랫폼을 활용하여 전사체 자료를 생산하였다.
<1-2> 전장유전체 정보 활용 변이 추출
전장유전체 변이는 하기와 같은 방법을 이용하여 추출하였으며 돼지 품종의 유전체 및 전사체는 온라인으로 등록된 데이터 (NCBI)를 이용하였다. 초기 전장유전체 데이터나 트리밍 (trimming)이 끝난 후 데이터의 퀄리티를 확인하기 위하여 FastQC 또는 MultiQC 프로그램을 이용하였다.
낮은 퀄리티의 리드, N base, 어댑터 등을 제거하기 위해 Trimmomatic 프로그램을 수행하였다. 돼지 표준유전체 지도(Sus Scrofa 11.1버전)을 BWA의 Index 옵션을 사용하여 Indexing을 한 후, 여기에 필터링을 한 전장유전체 데이터를 BWA 프로그램의 MEM 옵션을 활용하여 맵핑을 수행하였다.
변이 정보를 발굴하기 위해 Picard와 GATK Toolkit을 병용하여 분석 수행하였다. SNPs의 유전자 정보를 추가 기입하기 위해 SnpEff 프로그램을 수행하였다. 전장 유전체 분석 파이프라인 모식도는 도2에 나타내었다.
<1-3> 전장유전체 변이 정보 활용을 통해 집단유전체 분석
미니돼지 L-Type과 ET-Type의 변이 정보를 이용하여 다음과 같은 집단유전체 분석 (XP-EHH (cross-population extended haplotype homozygosity method, Sabeti PC), iHS (integrated haplotype score), ZHp (Z-scores of pooled heterozygosity))을 수행하였고, XP-EHH(P≤0.005, >|1.5|), iHS(P≤0.005, >|1.5|), ZHp(<-1.5)에서 공통적인 SNP 마커를 선별하였다.
XP-EHH (cross-population extended haplotype homozygosity method) 는 두 모집단 간의 일배체형 (haplotype) 차이를 평가하고 집단 1과 집단 2 사이의 일배체형을 비교하여 EHH와 log-ratio iHH를 계산하여 비교 대상인 두 모집단 중 하나에서 고정 또는 거의 고정의 지점까지 빈도가 증가한 대립유전자를 검출하도록 설계되었다.
iHS (integrated haplotype score) 는 조상 대립유전자 (ancestral alleles)보다 긴 일배체형에서 대립유전자가 존재하는 유전자좌를 검색하여 선택 스윕 유전자를 식별하고 파생 (derived) 대립유전자와 조상 대립유전자 간의 EHH를 비교하는 프로그램이다. 이 방법을 사용하면 인구통계학적 이력에 덜 영향을 받고 샘플에서 선택된 스윕이 고정되지 않은 불완전한 스윕을 식별할 수 있다.
ZHp를 계산하기 위해 먼저 선택 신호를 스캔하기 위해 각 위치에서 예상되는 이형 접합 점수 (heterozygosity score, Hp)를 얻었다. 개별 SNP의 Hp 값은 먼저 수학식 1에 따라 계산되었으며, 그 후, 선택 신호를 감지하기 위해 Hp 값은 수학식 2를 사용하여 Z 변환되었다.
[수학식 1]
여기서 ∑nMAJ 및 ∑nMIN은 각 유전자좌의 주요 대립유전자 수와 부 대립유전자 수의 합을 나타낸다.
[수학식 2]
10k bin 크기의 10k 창에 대해 XP-EHH, ZHp 및 iHS 점수가 높은 영역의 게놈 좌표를 사내 python 스크립트를 사용하여 계산하고 각 영역의 gene_id 정보를 가져오기 위한 입력 데이터로 사용했다.
미니돼지 L-타입과 ET-타입의 전장유전체정보를 활용하여 집단유전체분석(XP-EHH, iHS, ZHp) 후, 유의성이 가장 높은 35개의 유전자를 확보하였다 (도3 및 4).
도3과 4은 집단유전체분석(XP-EHH, iHS, ZHp) 각각의 분석 프로그램에서 미니돼지 ET-타입과 L-타입에서 차이가 보이는 공통된 selective sweep region을 확인한 결과이다.
총 35개의 후보 유전자를 확인하였으며, 도3은 iHS 분석을 통해 염색체 영역에서의 iHS 값을 시각화 하였을 때 공통된 35개 유전자의 염색체 위치 그리고 iHS 값을 시각화 한 그림이며, 도4는 XP-EHH 값을 도3처럼 시각화한 그림이다.
상기 집단유전체분석을 통해 유의성이 가장 높은 35개의 유전자를 확보한 후, 유전자형 (Genotype) 정보를 확인하여 35개의 유전자 중 미니돼지 ET-타입과 L-타입을 판별할 수 있는 유의한 3개 유전자 DNAH9, GRTP1, HECW1를 선별하였고, 하기 표1에 기재하였다.
| Gene_Id | ENS_id | Chr | XP-EHH | iHS | ZHp |
| DNAH9 | ENSSSCG00000018015 | 12 | 4.629307 | 4.190057 | -3.37387 |
| GRTP1 | ENSSSCG00000009554 | 11 | 3.342655 | 3.69934 | -4.27623 |
| HECW1 | ENSSSCG00000036443 | 18 | 3.328043 | 5.28945 | -3.96387 |
미니돼지 ET-타입과 L-타입에서 유전자 마커 DNAH9는 총 4개의 SNP마커를 가지고 있으며, 서로 다른 유전자형을 가지고 있음을 확인하였다. DNAH9 유전자 마커 내의 SNP마커 정보는 하기 표2에 기재하였다.
| 유전자 명 | REF | ALT | SNP 마커 ID | 염색체 | 위치 | L-Type 유전자형 정보 | ET-Type 유전자형 정보 |
| DNAH9 | A | G | rs704934785 | 12 | 56099043 | G/G | A/G |
| G | A | . | 12 | 56099057 | A/A | G/A | |
| A | C | rs711993881 | 12 | 56337218 | C/C | A/C | |
| T | G | . | 12 | 56337227 | T/T | T/G |
미니돼지 ET-타입과 L-타입에서 유전자 마커 GRTP1은 총 1개의 SNP마커를 가지고 있으며, 서로 다른 유전자형을 가지고 있음을 확인하였다. GRTP1 유전자 마커 내의 SNP마커 정보는 하기 표3에 기재하였다.
| 유전자 명 | REF | ALT | SNP 마커 ID | 염색체 | 위치 | L-Type 유전자형 정보 | ET-Type 유전자형 정보 |
| GRTP1 | G | A | rs343221613 | 11 | 78622345 | A/A | G/A |
미니돼지 ET-타입과 L-타입에서 유전자 마커 HECW1은 총 11개의 SNP마커를 가지고 있으며, 서로 다른 유전자형을 가지고 있음을 확인하였다. HECW1 유전자 마커 내의 SNP마커 정보는 하기 표4에 기재하였다.
| 유전자 명 | REF | ALT | SNP 마커 ID | 염색체 | 위치 | L-Type 유전자형 정보 | ET-Type 유전자형 정보 |
| HECW1 | T | C | . | 18 | 51394137 | C/C | T/C |
| G | A | rs338255366 | 18 | 51776652 | G/G | G/A | |
| C | G | rs342899939 | 18 | 51777616 | C/C | C/G | |
| T | A | rs318787317 | 18 | 51778363 | T/T | T/A | |
| A | G | rs321871424 | 18 | 51781832 | A/A | A/G | |
| C | T | rs708289921 | 18 | 51783581 | C/C | C/T | |
| A | T | . | 18 | 51394731 | T/T | A/T | |
| G | A | rs341748438 | 18 | 51469844 | A/A | G/A | |
| G | A | rs694930347 | 18 | 51756965 | A/A | G/A | |
| C | T | rs342704139 | 18 | 51699618 | C/C | C/T | |
| G | A | . | 18 | 51466466 | A/A | G/G |
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> SNP marker for discriminating between ET-type and L-type in
mini-pigs use thereof
<130> 2021P-09-022
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs704934785
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is A or G
<400> 1
gatccccaca catgagagtt tgatgtgtgg ctcagaactc tcactccttt nggtgagtct 60
ctgggaacag ttagtttcca gtctgtgggg cttcccaccc g 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> .
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or A
<400> 2
agagtttgat gtgtggctca gaactctcac tcctttaggt gagtctctgg naacagttag 60
tttccagtct gtggggcttc ccacccggga ggtgtgggat t 101
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs711993881
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is A or C
<400> 3
ggctgtgatc ccacctggat tcttgttggc cctggggctt ctcagccctg nctagcgggt 60
ggggccagat tttcccaaaa tggccccctc cagagacagg c 101
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> .
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is T or G
<400> 4
cccacctgga ttcttgttgg ccctggggct tctcagccct gactagcggg nggggccaga 60
ttttcccaaa atggccccct ccagagacag gcatggctgc t 101
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs343221613
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or A
<400> 5
tcttggagcc ttcgctgaac agacaatccc agacgcggag caccgtctgc ngggaacagg 60
gtcggcgtcc gcgcggccgc ccccaccccg gccccggtcc c 101
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> .
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is T or C
<400> 6
cacaagatgc ccatcgtgat aacctgagtg gagcaggagg ggatgtgcag nggggaggag 60
gggagcggat ggaatatgca tcagctgtgc cctgaacgga g 101
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs338255366
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or A
<400> 7
aataatacca tttgcagcaa catggataca actagagatt ctcacactaa ntcattcaga 60
aagagaaata caaataccat acaatatcac ttatatgtag a 101
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs342899939
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is C or G
<400> 8
tcaacattgc taattattag agaaatgcaa acaaaactac aatgaggaat natttcacca 60
ccagtcagaa tggccatcat caaaaagtct acaaataata a 101
<210> 9
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs318787317
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is T or A
<400> 9
ttgtaataac ctataatgga aaatcatctg aaatatataa tatatatata naaaataatc 60
actatggtat acctgaaact aacacaatac tatgctattt t 101
<210> 10
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs321871424
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is A or G
<400> 10
cagacaggaa aaatgaactc caccaaagcg accctaaact cctgccttct ngaagaaaag 60
aaacctgggc ctcatgatta attcactaac agtgctagag c 101
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs708289921
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is C or T
<400> 11
taaatcaaat atactttaat tttaaaaaag aggtattctt ggagttctgc natggcgcaa 60
tagaaatgaa tccaactagg aaccatgagg tttgatccct g 101
<210> 12
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> .
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is A or T
<400> 12
taaattaaaa aaataaaaat aaaagccaat ttagaaaaca gccatttttt naataaaggt 60
tttatgtcct cagagatgtc tcatttggat gccaacattc g 101
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs341748438
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or A
<400> 13
gcgaagtgac cccgtatata tatgcatggc ccatacacgt atacagaccc nccctttccc 60
tttatcatat tatcctccat cattacccca agagactgga t 101
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs694930347
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or A
<400> 14
tggtgtaggt tgcagacgcg gctcggatcc tgcattgctg tggctctggc ntaggccggt 60
ggctacagct ccgattggac ccctagcctg ggaacctcca t 101
<210> 15
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs342704139
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is C or T
<400> 15
ctctttaacc accatcttgc aaaaaataca gtgcttgaca aaatgatcca naaagaaaat 60
gagttagggt ttcttgaaca aaattgactg caaataaaaa a 101
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> .
<220>
<221> variation
<222> (51)
<223> n is G or G
<400> 16
ttttgttgtt gttgctgcta tctcttgggc cgcttccgcg gcatatggag nttcccaggc 60
taggggttga atcggagctg tagccaccag cctacgccag a 101
Claims (21)
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP);
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 G인 SNP;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 C인 SNP;
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 G인 SNP;
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T 또는 A인 SNP;
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP;
서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A 또는 T인 SNP;
서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 G인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 키트.
- 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별용 마이크로어레이.
- 1) 미니돼지로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 미니돼지 ET-타입과 L-타입 판별 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 T인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 A인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 C인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G인 경우, 미니돼지 ET-타입이라고 판별하는 방법.
Priority Applications (1)
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