KR20230062834A

KR20230062834A - 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커

Info

Publication number: KR20230062834A
Application number: KR1020237008651A
Authority: KR
Inventors: 히로시 카가무
Original assignee: 각코우호우징 사이타마이카다이가쿠
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2023-05-09
Also published as: EP4212174A1; WO2022054796A1; CN116113435A; JPWO2022054796A1; JP7175068B2; JP2023021999A

Abstract

본 발명은 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 피험자로부터 수득된 샘플 내 세포의 아집단의 조성이 피험자의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용되는 방법을 제공한다. 피험자의 암 치료에 대한 반응은 피험자의 CD4+ T 세포 집단에서 CCR4-CCR6+ 세포 아집단의 양을 기준 값과 비교하여 예측할 수 있다.

Description

암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커

본 발명은 암 치료의 효과 예측 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는 피험체에 대한 암 치료에 대한 반응성을 피험체의 T 세포 조성에 기초하여 예측하는 방법에 관한 것이다.

암 치료에 있어서는 그 암 환자의 특성에 따라 적절한 치료법이 선택되고 있으며 그 중에서도 암 면역 요법은 암 세포의 대사 등을 표적으로 하는 종래의 항암 치료(알킬화제, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소머라제 저해제, 미세소관 중합 저해제, 미세소관 탈중합 저해제 등)과 비교하여 부작용이 적고 큰 효과를 나타내는 것으로 최근 주목을 받고 있다. 암 면역 요법 중에서 항 PD-1 면역 체크 포인트 억제는 특히 큰 관심을 받고 있는 치료이다.

항PD-1 항체인 니볼루맙(Nivolumab)은 비소세포폐암의 2차 치료제로서 종래의 표준치료였던 도세탁셀에 대해 전체 생존기간에서 큰 차이로 승리하였으며 폐암학회 가이드라인에서도 추천도 A의 표준치료가 되고 있다(비특허문헌 1). 동일한 항PD-1 항체인 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)은 최초 치료에 있어서 종래의 표준 치료였던 세포독성 항암제에 대해 전체 생존기간에서 승리하였으며(단, 종양 세포상 PD-L1 50% 이상 발현된 환자에서) 앞으로 비소 세포 폐암 표준 치료가 될 것으로 결정되고 있다.

현재 항 PD-1 항체의 효과는 폐암에 머무르지 않고 다수의 암종에서 증명되고 있으며 일본에서도 신장암, 요로상피암, 두경부암, 소화기암, 악성 림프종, 유방암, 소세포폐암, 대장암, 악성흉막중피종에 대한 보험적응이 되며 향후 간세포암, 난소암, 자궁경부암에서도 적응할 것으로 기대된다.

그런데 임상적으로 매우 큰 성공을 거두고 있는 것처럼 보이는 항-PD-1 항체이지만, 사실은 큰 문제점을 내포하고 있다. 무 증악 생존기간 (PFS)의 데이터는 거의 모든 항 PD-1 항체 임상 시험에서 3 개월 이내에 병세 악화되는 "무효군"을 나타낸다. 한편 1년 이상 유효했던 군은 그 이후 거의 병세 악화가 인정되지 않아 치유에 가까운 상태를 얻고 있음을 알 수 있다. 이는 임상효과에서 '무효군', '저효군', '중간군'과 같은 3가지 다른 하위군이 존재함을 시사하지만 이를 예측하는 바이오마커는 알려지지 않았다. 거의 모든 암종에서 표준 치료가 될 것으로 예상되는 항 PD-1 항체를 약 40%의 무효군에 투여하는 것은 의학적 뿐만 아니라 의료 경제의 측면에서도 문제가 된다.

이러한 문제에 대해 본 발명자는 이미 암 면역 요법(예를 들어 항 PD-1 치료 또는 항 PD-L1 치료)에 대한 치료 효과가 진행(PD), 안정(SD), 주효(완전 주효)(CR) 및 부분주효(PR))가 되는 3군이 각각 다른 면역상태를 나타내는 것을 발견하고 피험체에 암 면역요법을 실시한 경우, 그 암 면역요법에 대한 반응이 진행(PD), 안정(SD) 또는 주효(완전주효(CR) 및 부분주효(PR)) 중 어느 하나인 것을 예상하는 방법을 제공하고 있다(특허문헌 1).

특허문헌 1 : 특허 제6664684호

비특허문헌 1 : Brahmer J, et al. N'Engl J J Med 2015; 373 : 123-135

본 발명은 이러한 상황을 감안하여 환자의 면역 상태를 평가함으로써 상기 환자에 대한 암 치료의 효과를 예측하기 위한 마커를 발견했다. 그리고 피험체으로부터 수득된 샘플에 있어서의 세포 아집단의 조성을 해당 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하기 때문에 기존에 알려진 것과는 다른 세포 아집단의 조성이 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 새로운 지표가 될 수 있음을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 CD4 T 세포 전체에 대한 CCR6⁺CCR4^- 세포 비율 (바람직하게는 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^- 세포 비율)을 측정함으로써 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 종래의 지표를 넘어서는 성능 예측을 얻는 것이 가능하고, 또한 CCR6⁺CCR4^- 세포 비율을 사용해도 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^- 세포 비율과 동등한 예측 성능을 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 암 치료에 대한 반응성이 피험체에서 T 세포 조성과 관련되어 있어 바이오 마커로서 이용 될 수 있다는 본 발명자들의 발견에 부분적으로 기초하여 이루어진 것으로, 바이오마커는 감도, 특이도 모두 매우 높으며 편리성도 높다.

본 발명자들은 암 면역요법(예를 들어 항-PD-1 치료 또는 항-PD-L1 치료)에 의한 치료 후 무진행 생존기간(PFS)과 특정 T 세포 조성이 유의한 상관관계를 보임을 발견하였다. 이에 따라 본 발명의 하나의 실시형태에서는 피험체에 암 면역요법이 수행되는 경우, 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법이 제공된다. 또한 본 발명자들은 예를 들어 방사선 치료나 분자 표적약에 의한 치료 등 암 면역 요법 이외의 암 치료에 의한 치료 후 무진행 생존기간(PFS)과 특정한 T 세포 조성이 유의한 상관관계를 나타내는 것을 발견하였다. 이에 따라 본 발명의 하나의 실시형태에서 피험체에 암 치료가 수행되는 경우 암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법이 제공된다.

따라서 본 발명은 다음을 제공하는 것이다.

(항목 1) 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을, 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법으로서, 상기 피험체 유래의 샘플 중의 상기 세포 아집단의 상대량을 결정하는 단계를 포함하고, 상대 양이 대상의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용되는 방법.

(항목 2) 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 항목 1에 기재된 방법.

(항목 3) 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 항목 1 또는 2에 기재된 방법.

(항목 4) 상기 상대량과 무효군 임계치의 비교를 상기 피험체가 상기 암 치료에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 이용하는 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 5) 상기 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단이 더욱 CXCR3⁺ 세포 아집단인 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 6) CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단이 더욱 CXCR3^- 세포 아집단인 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 7) CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단이 더욱 FoxP3^- 세포 아집단인 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 8) 상기 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단이 더욱 CD62L^low 세포 아집단인 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 9) 상기 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단이 더욱 CD45RA^- 세포 아집단인 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 10) 상기 암 치료는 암 면역 요법, 방사선 요법, 분자 표적 약물 치료, 외과적 수술, 세포 전달 또는 이들 치료의 임의의 조합을 포함하는 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 11) 상기 암 치료는 암 면역 요법인 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 12) 상기 암 면역 요법은 면역 체크 포인트 저해제의 투여를 포함하는 항목 11에 기재된 방법.

(항목 13) 상기 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA-4 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 저해제를 포함하는 항목 12에 기재된 방법.

(항목 14) 상기 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제와 CTLA-4 저해제의 조합을 포함하는 항목 12에 기재된 방법.

(항목 15) 상기 PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항 PD-1 항체인 항목 13 또는 14에 기재된 방법.

(항목 16) 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 포함하는 항목 13 내지 15 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 17) 상기 PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항 PD-L1 항체인 항목 13 내지 16 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 18) PD-L1 저해제가 두르발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙을 포함하는 항목 17에 따른 방법.

(항목 19) 상기 CTLA-4 저해제가 이피리무맙 및 트레멜릴맙을 포함하는 항목 13 내지 18 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 20) 상기 무효군 임계치가 무효군의 검출에 대한 감도 및 특이도를 고려하여 결정되는 항목 4 내지 19 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 21) 상기 무효군 임계치가 무효군의 검출에 대한 감도가 약 90% 이상이 되도록 결정되는 항목 4 내지 20 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 22) 상기 무효 군 임계치가 무효군의 검출에 대한 특이도가 약 90% 이상이 되도록 결정되는 항목 4 내지 21 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 23) 상기 세포의 상대량을 말초 혈액 샘플을 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 24) 상기 상대량이 상기 기준치 이상인 것이 상기 피험체가 상기 암 치료에 반응하는 것을 나타내는 항목 2 내지 23 중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(항목 25) 피험체에서 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, 상기 피험체는 항목 11 내지 24 중 어느 한 항목에 기재된 방법에 의해 암 면역 치료에 반응할 것으로 예상되는 피험체인 것을 특징으로 하는 조성물.

(항목 26) 상기 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA-4 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 저해제를 포함하는 항목 25에 기재된 조성물.

(항목 27) 상기 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제와 CTLA-4 저해제의 조합을 포함하는 항목 26에 기재된 조성물.

(항목 28) 상기 PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항 PD-1 항체인 항목 26 또는 27에 기재된 조성물.

(항목 29) 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 펨 브롤리주맙을 포함하는 항목 26 내지 28 중 어느 한 항목에 기재된 조성물.

(항목 30) 상기 PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항 PD-L1 항체인 항목 26 내지 27 중 어느 한 항목에 기재된 조성물.

(항목 31) 상기 PD-L1 저해제는 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함하는 항목 30에 따른 조성물.

(항목 32) 상기 CTLA-4 저해제는 이피리무맙을 포함하는 항목 26 내지 31 중 어느 한 항목에 기재된 조성물.

(항목 33) CD4에 대한 검출제, CCR4에 대한 검출제 및 CCR6에 대한 검출제를 포함하는, 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 키트로서, 상기 예측은 상기 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대적 양은 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용함으로써 수행되는 키트.

(항목 34) 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는, 항목 33에 기재된 키트.

(항목 35) 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 항목 33 또는 34에 기재된 키트.

(항목 36) 상기 상대량과 무효군 임계치의 비교를, 상기 피험체가 상기 암 치료에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 이용하는 항목 33 내지 35 중 어느 한 항에 기재된 키트.

(항목 37) 상기 검출제가 항체인 항목 33 내지 36 중 어느 한 항목에 기재된 키트.

(항목 38) CXCR3에 대한 검출제를 추가로 포함하는 항목 33 내지 37 중 어느 한 항에 기재된 키트.

(항목 39) 상기 암 치료는 암 면역 요법, 방사선 요법, 분자 표적 약물 치료, 외과적 수술, 세포 전달 또는 이들 치료의 임의의 조합을 포함하는 항목 33 내지 38 중 어느 한 항목에 기재된 키트.

(항목 40) 상기 암 치료는 암 면역 요법인 항목 33 내지 39 중 어느 한 항목에 기재된 키트.

본 발명에서 전술한 하나 또는 다수의 특징은 명시된 조합 외에 추가로 조합하여 제공될 수 있는 것으로 의도된다. 본 발명의 또 다른 실시형태 및 이점은 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해하면 당업자에게 인식될 것이다.

또한 상기한 것 이외의 본 발명의 특징 및 현저한 작용·효과는, 이하의 발명의 실시형태의 항 및 도면을 참조함으로써 당업자에게 명확해질 것이다.

도 1은 인간 CD4 T 세포의 Th 분화를 나타내는 모식도이다.
도 2는 말초 혈액 CD4⁺ T세포의 CyTOF의 질량 세포 계측법에 의한 매핑 분석의 결과이다.
도 3은 본 발명의 하나의 실시형태에서 다양한 세포 소집단의 CyTOF의 질량 세포 계측법에 의한 매핑 분석의 결과이다.
도 4는 본 발명의 하나의 실시형태에서 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-(Th1/17)와 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-(CCR6 SP) 두 클러스터와 무진행 생존기간과의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 도 4 우측은 D62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-(Th1/17)와 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-(CCR6 SP) 두 클러스터를 합친 것이고 도 4 좌측은 %CD62L^low/CD4⁺와 무진행 생존기간의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 하나의 실시형태에서 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺와 무진행 생존기간 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 하나의 실시형태에서 유동 세포 계측 분석(Fortessa)을 사용하여 얻은 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺와 무진행 생존기간 사이의 상관관계 및 CyTOF를 사용하여 얻은 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺와 무진행 생존기간과의 상관관계의 각각의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 하나의 실시형태에서 펨브롤리주맙 단일제 치료 후의 무진행 생존기간과 CyTOF에 의한 Th 해석 결과의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 하나의 실시형태에서 CD62L^low Th1/17및 CD62L^low CCR6 SP클러스터 총 수와 무진행 생존기간의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 하나의 실시형태에서 Th1/17과 CCR6 SP의 합은 CCR4^-CCR6⁺ 세포 클러스터로서 측정될 수 있음을 나타내는 상관 그래프이다.
도 10은 본 발명의 하나의 실시형태에서 Th 클러스터와 총 생존기간 사이의 상관관계를 나타내는 표이다.
도 11은 본 발명의 하나의 실시형태에서 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터의 무진행 생존기간 및 총 생존기간과의 상관관계를 다른 마커와 비교한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 하나의 실시형태에서 CD4⁺ T세포에서 CCR6⁺CCR4^- 세포의 비율의 총 생존기간을 예측하기 위한 지표로서의 성능을 나타내는 그래프이다. 임계치를 변화시킨 경우의 감도와 특이도를 플롯한 것이 우측 패널이다. 플롯된 점 아래의 영역의 면적은 0.9628이며, 매우 우수한 마커인 것으로 이해된다.
도 13은 본 발명의 하나의 실시형태에서 화학 방사선 치료 후 PFS와 CCR6⁺CCR4^- CD4 T 세포 클러스터 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 하나의 실시형태에서 EGFR-TKI 치료 후 PFS와 CCR6⁺CCR4^- CD4 T세포 클러스터의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 15는 CD62L^lowTh1, CD62L^lowTh1/17, CD62L^lowCCR6 SP, CD62L^lowTh17, CD62L^lowTP의 각각의 TCR 크로노타입 수를 나타내는 모식도이다.
도 16은 CD62L^lowTh1/17+CD62L^lowCCR6 SP세포 클러스터와 Th1/17+CCR6 SP 세포 클러스터와 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 17은 말초 혈액 CD4⁺ T세포 클러스터 및 각 구획에서 발현되는 케모카인 수용체를 나타내는 개략도이다.
도 18은 말초 혈액 CD4⁺ T세포 클러스터와 항 PD-1 항체 치료 후의 PFS 상관관계를 나타내는 다중 분석 결과의 표이다.
도 19는 말초 혈액 CD4⁺ T세포 클러스터의 유전자 발현의 의사 시간 분석 및 DNA 메틸롬(메틸화) 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 각 치료 라인에서 Th1/17 및 CCR6 SP의 PFS와의 상관관계를 나타내는 도면이다.
도 21은 종양 미세 환경에서 CD4⁺ T세포와 PFS의 상관관계를 나타내는 도면이다.
도 22는 말초 혈액의 세포 클러스터 및 종양 미세 환경(TME)의 세포 클러스터의 네트워크 분석 결과이다.
도 23은 수술 전후의 말초 혈액에서 세포 클러스터의 변화를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 최선의 형태를 나타내면서 설명한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 단수형의 표현은 달리 언급되지 않는 한 복수형의 개념을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 단수형 관사(예를 들어 영어의 경우 "a", "an", "the" 등)는 달리 언급되지 않는 한 복수형의 개념을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 언급되지 않는 한 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미로 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모순되는 경우, 본 명세서(정의를 포함하여)가 우선한다.

이하, 본 명세서에서 특히 사용되는 용어의 정의 및/또는 기본적 기술내용을 적절히 설명한다.

본 명세서에서 "약"은 후속 수치의 ±10%를 의미한다.

본 명세서에서 "바이오마커"는 통상적인 생물학적 과정, 병리학적 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 특성을 말한다.

본 명세서에서 "암" 또는 "암"은 상호교환 가능하게 사용되며 이형성이 강하고 증식이 정상 세포보다 빠르며 주변 조직에 파괴적으로 침투하거나 전이를 일으킬 수 있는 악성 종양 또는 이러한 악성 종양이 존재하는 상태를 말한다. 본 발명에 있어서 암은 고형암 및 조혈기 종양을 포함하고 예를 들면 비소세포폐암, 소세포폐암, 신장암, 호지킨병, 두경부암, 유방암, 위암, 악성흑색종, 대장암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 위장관 간질 종양, 췌장 신경 내분비 종양, 피부암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 '암 면역요법' 또는 '암 면역요법'이란 생물이 지니는 면역 기구 등의 생체 방어 기구를 이용하여 암을 치료하는 방법을 말한다.

본 명세서에서 '항종양 면역 반응'은 생체 내 종양에 대한 임의의 면역 반응을 의미한다.

본 명세서에서 '상관'이란, 2개의 사건이 통계적으로 유의한 상관관계를 갖는 것을 말한다. 예를 들면 'A와 상관되는 B의 상대량'이란 이벤트 A가 발생했을 경우에 B의 상대량이 통계적으로 유의하게 영향을 받는(예를 들면 증가 내지 감소함)것을 말한다.

본 명세서에서 '면역 활성화'는 면역 기능의 신체에서 이물질을 제거하는 기능이 증가하는 것을 의미하며 면역 기능에서 양성으로 작용하는 임의의 인자 (예를 들어 면역 세포 또는 사이토카인) 양의 증가에 의해 나타날 수 있다.

본 명세서에서 '세포 아집단'은 다양한 특성의 세포를 포함하는 세포 집단 중 일부 공통된 특징을 갖는 임의의 세포의 집합을 지칭한다. 특정 명칭이 당업계에 공지된 것에 대해서는 이러한 용어를 사용하여 특정 세포 아집단을 언급할 수도 있으며 임의의 성질(예를 들어 세포 표면 마커의 발현)을 기재하여 특정 세포 아집단을 언급할 수도 있다.

본 명세서에서 세포에 관한 용어 '상대량'은 '비율'과 상호 교환가능하게 사용된다. 전형적으로, 용어 '상대량' 및 '비율'은 특정 세포 집단(예를 들어 CD4⁺ T세포 집단)을 형성하는 세포의 수에 대한 원하는 세포 아집단(예를 들어 CCR4^-CCR6^- 세포 아집단)을 형성하는 세포의 수를 의미한다.

본 명세서에서 '감도(sensitivity)'란 피험체의 집단 중에서 예상되는 특징을 갖는 피험체를 선택하는 경우에 피험체 집단에 포함되는 예상되는 특징을 갖는 총 피험체 수에 대한 선택된 대상에서 예상되는 특징을 갖는 피험체 수의 비율을 말한다. 예를 들면 피험체 집단에 포함되는 예상되는 특징을 갖는 피험체가 모두 선택되었을 경우에는 감도는 100%이며 피험체의 집단에 포함되는 예상되는 특징을 갖는 피험체의 절반이 선택된 경우에는 감도는 50%이고 피험체의 집단에 포함되는 예상되는 특징을 갖는 피험체가 전혀 선택되지 않은 경우에는 감도는 0%이다. 감도는 예를 들면 (선택된 대상에서 예상되는 특징을 갖는 피험체의 수)/(피험체 집단에 포함되는 예상되는 특징을 갖는 총 피험체의 수)로서 결정된다. 감도가 높은 판정은, 어느 상태(예를 들면 암 면역 요법의 결과, 장기 생존이다)인 피험체를 찾아내고 싶은 경우에, 그러한 피험체가 확실히 그러한 상태로서 판정되기 쉬운 것 의미한다.

본 명세서에서 '특이도(specificity)'란 피험체 집단 중에서 예상되는 특징을 갖는 피험체를 선택하는 경우에 선택된 대상의 총수에 대한 선택된 대상 중의 예상되는 특징을 갖는 피험체 수의 비율을 말한다. 예를 들면 피험체 집단 중에서 선택된 후보가 모두 예상되는 특징을 갖는 경우에는 특이도는 100%이며, 피험체 집단 중에서 선택된 후보의 절반이 예상되는 특징을 갖는 경우에는 특이도는 50 %이고 피험체 집단 중에서 선택된 모든 후보가 원하는 특성을 갖지 않는 경우 특이도는 0 %이다. 예를 들어 특이도는 (선택된 대상 중에서 원하는 특징을 갖는 피험체의 수)/(선택된 대상의 총 수)로서 결정된다. 특이도가 높은 판정은 어느 상태(예를 들면 암 면역요법에 대하여 주효군이다)가 아닌 피험체가 잘못해서 그렇지 않은 상태(예를 들면 암 면역요법의 결과, 장기 생존이다)로 판정될 확률이 낮음을 의미한다.

본 명세서에서 '무진행 생존기간(PFS)'이란 치료 중 또는 치료 후에 암이 진행되지 않고 안정한 상태인 기간을 말한다. 즉 병세가 진행되지 않는 기간이 된다. 본 명세서에서 임상적으로 암이 진행되지 않고 안정한 상태, 또는 병세가 진행하고 있지 않다고 판단되는 기간이면 '무진행 생존기간(PFS)'에 포함된다.

본 명세서에서 「무효군」이란, 암 치료를 받았을 경우의 치료 효과가, RECIST ver1.1에 따라 판정한 경우에, 치료 개시 후 약 9주까지의 조기에 병세 악화(PD:Progressive disease)로 판정되는 피험체의 군을 말한다. 무효 그룹은 PD 그룹, 진행 그룹, NR (Non-responder)로도 지칭되며, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 '부분주효군'이란 암 치료를 받았을 경우의 치료효과가 RECIST ver1.1에 따라 판정했을 경우에 부분주효(PR:Partialresponse)로 판정되는 피험체의 그룹을 말한다. 부분주효군은 PR 그룹으로도 지칭되며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 '상대값'이란 어느 값에 대해서 다른 값을 비교의 대상으로서 산출되는 값을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '검출제'는 광의적으로 목적 물질(예를 들어 세포 표면 마커 등)을 검출할 수 있는 임의의 인자를 의미한다.

본 명세서에서 특정 세포 아집단의 '양'은 특정 세포의 절대 수와 세포 집단에서의 비율의 상대적 양을 포함한다.

본 명세서에서 '기준' 또는 '기준치'이란 본 명세서에 기재된 마커 양의 증감을 결정하기 위한 비교 대상이 되는 양을 말한다. 특정 치료(예: 암 면역 요법) 전후의 특정 양의 증감을 결정하는 경우, 예를 들어 '기준치'은 치료 전의 해당 양을 들 수 있다. 또한 기준 또는 기준치로서는 어떤 수량(예를 들면 무진행 생존기간)을 나타낸다는 것을 알고 있는 소정의 세포의 양 또는 상대량을 취할 수도 있다.

본 명세서에서 '임계치'란 어느 변화하는 값에 대해서 설정되는 값이며 변화하는 값이 그 이상이거나 또는 그 이하인 경우에 어떠한 의미를 부여하는 값을 말한다. 본 명세서에서 컷오프(cut-off) 값이라고도 불린다.

본 명세서에서 '무효군 임계치'란, 주어진 피험체의 집단에 있어서 무효군과 안정군＋주효군을 식별하기 위해서 사용되는 임계치를 말한다. 무효군 임계치는 주어진 피험체 집단에서 무효군을 선택할 때 미리 결정된 감도 및 특이도를 달성하도록 선택된다.

본 명세서에서 '주효군 임계치'란 주어진 피험체의 집단에서 또는 무효군 임계치를 이용하여 주어진 피험체의 집단으로부터 무효군을 제외한 집단에 있어서 안정군과 주효군을 식별하는 데 사용되는 임계 값을 말한다. 효능 임계값은 주어진 피험체 집단에서 또는 무효군 임계치를 사용하여 주어진 피험체 집단에서 무효군을 제외한 집단에서 주효군을 선택할 때 소정의 감도 및 특이도를 달성하도록 선택된다.

본 명세서에 있어서 '장기 생존'이란 무진행 생존기간이 일정 기간 이상인 것을 나타내고 장기 생존자란 예를 들면 니볼루맙 치료 후 일정 기간 이상에 걸쳐 악화가 발생하지 않는 환자를 말한다. 장기 생존으로 추정되는 환자는 암 면역 요법에 의한 장기간의 반응성이 예측되기 때문에 임상 의사는 암 면역 요법을 최소한으로 (예: 한 번의 투여로) 종료해야 한다고 결정할 수 있다. 또한 본 명세서에서 장기 생존이라고 판단할 수 있는 기간은 특별히 한정되는 것은 아니며 환자의 속성(연령, 성별, 기왕력 등), 암의 종류, 투약 상황 또는 치료력 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들면 500일 이상, 400일 이상, 300일 이상, 150일 이상 등으로 해도 좋으며 또한 고령자에서 장기 생존이라고 판단할 수 있는 기간은 젊은 연령자에서 장기 생존으로 판단할 수 있는 기간보다 짧을 수 있으며 다른 질병을 동반하는 환자에서 장기 생존으로 판단할 수 있는 기간은 그렇지 않은 환자에서 장기 생존으로 판단할 수 있는 기간보다 짧을 수 있다.

본 명세서에서 '유동 세포 계측법'은 액체에 현탁되는 세포, 개체 및 기타 생물 입자의 입자 수, 개별 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 측정하는 기술을 의미한다. 유동 세포 계측법의 결과는 전형적으로 FSC를 X 축으로, SSC를 Y 축으로 취한 도트 플롯으로 표현될 수 있다. 각 세포는 도면에서 하나의 도트(점)으로 표시되며 그 위치는 FSC와 SSC의 상대 값에 의해 결정된다. 비교적 크기가 작고 내부구조가 단순한 림프구는 좌하부에, 사이즈가 크고 내부에 과립을 가지는 과립구는 우상부에, 또 사이즈는 크지만 내부구조가 단순한 단구는 림프구와 과립구 사이에, 각각 서로 분리된 집단을 만들어 표시된다. 유동 세포 계측법의 결과는 히스토그램, 도트 플롯 등으로 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 '이펙터 세포'란 항원 자극을 받지 않은 나이브 세포가 분화하여 실제로 면역에 관여하는 작용을 얻은 면역 세포를 말하며 특히 인간의 헬퍼 T 세포에서는 주로 Th1, Th2, Th17의 3종류가 알려져 있다. 각각 인터페론 감마(IFNγ)나 인터루킨 17(IL-17) 등 특징적인 사이토카인을 방출할 수 있다. 또한 Th1은 T-bet을, Th2는 GATA-3을 발현하는 등, 각 Th 서브세트에 특징적인 전사 인자가 존재하는데 T-bet과 GATA-3을 모두 발현하고 있는 세포도 존재한다, 이러한 세포는 "Th1/Th2" 또는 "Th1/2"로 표현된다. 본 명세서에서 "Th1/Th17"또는 "Th1/17"은 Th1에 특징적인 T-bet 및 Th17에 특징적인 RORγt를 모두 발현한다.

또한 Th1, Th2, Th17 등의 이펙터 세포는 발현하는 케모카인 수용체(CCR)의 종류에 의해서도 분류할 수 있으며 예를 들어 Th1은 CXCR3을, Th2는 CCR4를, Th17은 CCR4 및 CCR6을 각각 발현하고 있다. Th 서브세트의 분류는 예를 들어 도 1(Annual Review of Immunology, Vol. 34: 317-334 Heterogeneity of Human CD4+ T Cells Against Microbes, Fig.1)과 같이 나타낼 수 있다. 본 명세서에 있어서 'Th1/Th17' 또는 'Th1/17'은 Th1에 특징적인 CXCR3과 Th17에 특징적인 2개의 CCR 중 CCR6을 발현하고 있다.

또한 본 명세서에서 CCR6 SP(single positive)란 CCR에 의한 Th 타입 분류에 있어서 종래에는 분류되지 않았던 타입으로 CCR4, CCR6 및 CXCR3 중 CCR6만을 발현하는 Th 서브세트이다. 또한 본 명세서에서 TP(triple-positive)란 CCR에 의한 Th 타입 분류에 있어서 종래에는 분류되지 않았던 타입으로 CCR4, CCR6 및 CXCR3의 3개를 발현하는 Th 서브세트이다.

본 명세서에서 '암 치료'란 암 환자에 대하여 종양을 제거 또는 축소시키기 위해서 행해지는 임의의 치료를 말하며 암 면역 요법, 방사선 요법, 분자 표적 약물 치료, 외과적 수술, 세포 전달 또는 이들 치료의 임의의 조합 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

(암 면역 요법)

암 면역 요법은 유기체가 갖는 생체 방어 메커니즘을 사용하여 암을 치료하는 방법이다. 암 면역 요법은 크게 암에 대한 면역 기능을 강화시킴으로써 암 면역 요법과 암의 면역 회피 기능을 억제함으로써 암 면역 요법이 존재한다. 또한 암 면역 요법에는 체내 면역 기능을 활성화하는 능동 면역 요법과 체외에서 면역 기능을 활성화 또는 증식시킨 면역 세포를 체내로 되돌리는 것에 의한 수동 면역 요법을 포함한다. 본 발명의 바이오마커는 CD4⁺ T 세포 면역 전체의 균형을 평가하는 것이며 종양 면역 그 자체를 전체적으로 평가하는 것으로 생각되기 때문에 암 면역 요법 전반의 치료 효과를 널리 예측하는 것 가능하다고 생각된다.

암 면역 요법의 예로는 비특이적 면역 자극제, 사이토 카인 요법, 암 백신 요법, 수지상 세포 요법, 입양 면역 요법, 비특이적 림프구 요법, 암 항원 특이적 T 세포 요법, 항체 요법, 면역 체크포인트 억제 요법 등을 들 수 있다. 제한되지 않지만 본 발명의 바이오마커는 특히 면역 체크포인트 억제 요법의 치료 효과를 정확하게 예측하는 것으로 본 명세서의 실시예에서 입증되었다.

면역 체크포인트 저해제의 대표적인 예는 PD-1 저해제다. PD-1 저해제는 항-PD-1 항체인 니볼루맙(Nivolumab; 옵지보로 판매됨) 및 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab) 을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 실시형태에서 니볼루맙이 대상으로서 선택될 수 있다. 이론에 구속되기를 원하지 않지만 니볼루맙을 이용한 요법이 바람직한 한 가지 이유는 본 발명의 바이오마커를 사용하면 반응성 피험체와 비반응성 피험체를 명확하게 식별할 수 있다는 것이 실시예에서 나타나고 있으며 특히 특정 임계치에 의해 명확하게 반응성과 비반응성을 구별 할 수 있음이 밝혀졌기 때문이다. 물론 다른 PD-1 저해제에 대해서도 동일한 정도로 본 발명의 바이오마커를 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명에서 PD-L1 저해제 및 CTLA-4 저해제는 또한 PD-1 저해제와 유사하게 사용될 수 있다.

항 PD-1 항체는 PD-1 신호에 의한 T 세포 활성화의 억제를 해제함으로써 항암 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 항 PD-L1 항체는 또한 PD-1 신호에 의한 T 세포 활성화의 억제를 해제함으로써 항암 효과를 나타내는 것으로 생각된다. PD-1이 T 세포 기능을 저해하는 메커니즘은 완전히 규명되지 않았지만 PD-1(programmed death 1)과 PD-L1 또는 PD-L2가 상호작용하면 PD-1의 세포질 도메인에 티로신 탈인산화 효소의 일종인 SHP-1,2가 리크루트 되어 T 세포 수용체 신호 전달 단백질인 ZAP70을 불활성화시킴으로써 T 세포의 활성화가 억제되는 것으로 생각되고 있다 (Okazaki, T., Chikuma, S., Iwai, Y.etal.14, 1212-1218(2013)). 이것은 ITSM 모티프라는 부분에 SHP-1, 2가 리크루트 되어 근방의 T cell receptor의 proximal signaling kinase를 탈인산화 하는 것에 의한 것으로 생각되며 바꾸어 말하면 항원 자극을 받은 T 세포로부터 이러한 항원 자극을 받았다는 기억을 지워버린다고도 할 수 있다.

PD-1은 암 조직에 침투하는 킬러 T 세포 및 자연 킬러 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 종양상의 PD-L1은 PD-1에 의한 PD-1 신호를 통한 면역 반응을 약화시키는 것으로 여겨진다. PD-L1은 이러한 PD-1 신호를 통한 면역 반응을 약화시키지만 항 PD-1 항체에 의해 PD-1과 PD-L1의 상호 작용 및/또는 상호 작용에 의해 생기는 신호 전달을 저해할 때 항 종양 면역 반응의 증강 효과를 얻을 수 있다.

면역 체크포인트 저해제의 다른 예는 PD-L1 저해제(예를 들어 항-PD-L1 항체인 아벨루맙, 두르발루맙 또는 아테졸리주맙)를 포함한다.

PD-L1 저해제는 상기 PD-1 경로를 PD-L1 측에 결합하여 저해하고, PD-1과 PD-L1의 상호작용 및/또는 상호작용에 의해 발생하는 신호전달을 저해하고 항 종양 면역 반응을 일으킨다. 따라서 이론에 속하는 것을 원하지 않지만 본 발명의 바이오마커를 사용하면 PD-1 경로를 저해하는 치료법(예를 들어 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체)에 반응성 피험체와 비반응성 피험체를 명확하게 식별할 수 있다고 할 수 있다.

면역 체크포인트 저해제의 다른 예는 CTLA-4 저해제(예를 들어 항-CTLA-4 항체인 이피리무맙 또는 트레메릴루맙)를 포함한다.

CTLA-4 저해제는 T 세포를 활성화시켜 항 종양 면역 반응을 일으킨다. T 세포는 표면의 CD28이 CD80 또는 CD86과 상호 작용하여 활성화된다. 그러나 일단 활성화된 T 세포라도 표면에 발현된 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)가 CD80 또는 CD86과 CD28보다 높은 친화성으로 우선적으로 상호 작용하고 그에 따라 활성화가 억제되는 것으로 생각된다. CTLA-4 저해제는 CTLA-4를 억제함으로써 CD28과 CD80 또는 CD86의 상호 작용이 저해되는 것을 방지함으로써 항 종양 면역 반응을 일으킨다.

추가의 실시형태에서 면역 체크포인트 저해제는 TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucinin containing protein-3), LAG-3(lymphocyte-H3-ec-a)(VISTA) 또는 TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain)와 같은 면역 체크포인트 단백질을 표적으로 할 수 있다.

상기와 같은 면역 체크포인트는 자가조직에 대한 면역 반응을 억제하는 것으로 생각되지만, 바이러스 등의 항원이 생체 내에 장기간 존재하는 경우에도 T 세포에 면역 체크포인트가 증가한다. 종양 조직에 대해서도 생체 내에 장기간 존재하는 항원으로 되어 있기 때문에 이러한 면역 체크포인트에 의해 항종양 면역 반응을 회피하고 있는 것으로 생각되며 상기와 같은 면역 체크포인트 저해제는 이러한 회피 기능을 무효화하여 항종양 효과를 나타낸다. 이론에 구속되는 것은 아니지만 본 발명의 바이오마커는 인간의 항종양 면역 반응 전체의 균형을 평가하는 것으로서 이러한 면역 체크포인트 저해제의 치료 효과를 정확하게 예측하기 위한 지표로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명의 하나의 실시형태에서 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물이 제공된다. 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 본 발명의 바이오마커에 의해 평가하여 선택된 피험체에 투여함으로써 현저하게 높은 확률로 치료 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 통상적으로 전신적으로 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 형태로 투여된다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 다르지만 통상 예를 들면 성인 1인당, 1회당 0.1mg 내지 100mg의 범위에서 1일 1회 내지 수회 경구 투여되거나 성인 1회당 0.01mg 내지 30mg의 범위에서 1일 1회 내지 수회 비경구 투여(바람직하게는 정맥 내 투여) 또는 1일 1시간 내지 24시간의 범위에서 정맥 내로 지속적으로 투여된다. 물론 투여량은 여러 조건에 따라 변동하기 때문에 상기 투여량보다 적은 양으로 충분할 수도 있고 또한 범위를 넘어서 필요한 경우도 있다.

면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 투여시 경구 투여를 위한 내복용 고형제, 내복용 액제 및 비경구 투여를 위한 주사제, 외용제, 좌제 등의 투여 형태를 취할 수 있다. 경구 투여를 위한 내복용 고형제는 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등을 포함한다. 캡슐은 하드 캡슐 및 소프트 캡슐을 포함한다.

본 발명의 조성물은 필요에 따라 하나 또는 그 이상의 활성 성분(예를 들어 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체) 그대로 또는 부형제(락토스, 만니톨, 글루코스, 미정질 셀룰로오스, 전분 등), 결합제(히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 등), 붕해제(섬유소 글리콜산칼슘 등), 윤활제(스테아르산마그네슘 등), 안정제, 용해 보조제(글루탐산, 아스파르트산 등) 등과 혼합되고, 통상의 방법에 따라 제제화하여 사용된다. 또한 필요에 따라 코팅제(백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트 등)로 피복해도 좋고, 또한 2 이상의 층으로 피복해도 좋다. 또한 젤라틴과 같은 흡수 가능한 물질의 캡슐도 포함된다.

본 발명의 조성물은 경구 투여를 위해 내복용 액제로서 제형화되는 경우, 약제학적으로 허용되는 수제, 현탁제, 에멀젼, 시럽제, 엘릭실제 등을 포함한다. 이러한 액제에서는 하나 이상의 활성 물질이 일반적으로 사용되는 희석제 (정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합물 등)에 용해, 현탁 또는 유화된다. 또한 이 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다.

비경구 투여를 위한 주사제로서는 용액, 현탁액, 유탁액 및 사용시 용매에 용해되거나 현탁되어 사용되는 고형의 주사제를 포함한다. 주사제는 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 용매에 용해, 현탁 또는 유화시켜 사용된다. 용매로서는 예를 들면 주사용 증류수, 생리식염수, 식물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올과 같은 알코올류 등 및 이들의 조합이 사용된다. 또한 이 주사제는 안정제, 용해 보조제(글루탐산, 아스파르트산, 폴리소르베이트 80(등록상표) 등), 현탁화제, 유화제, 무통화제, 완충제, 보존제 등을 포함하고 있어도 된다. 이들은 최종 공정에서 멸균되거나 무균 조작법에 의해 제조된다. 또한 무균 고형제, 예를 들어 동결건조품을 제조하고 그 사용 전에 무균화 또는 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용제에 용해하여 사용할 수도 있다.

(암)

본 발명에서 대상으로 하는 암으로서는 흑색종(악성 흑색종), 비소세포 폐암, 신세포암, 악성 림프종(호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종), 두경부암, 비뇨기과 암(방광암, 요로 상피암, 전립선암), 소세포폐암, 흉선암, 위암, 식도암, 위식도 접합부암, 간암(간세포암, 간내 담관세포암), 원발성 뇌종양(교아종, 중추신경계 원발림프종), 악성흉막중피종, 부인과암(난소암, 자궁경부암, 자궁체암), 연부육종, 담도암, 다발성 골수종, 유방암, 대장암 등을 들 수 있다 그러나 이에 국한되지는 않는다.

(세포의 분획·분리)

T 세포의 분획 및 분리를 위한 샘플은 통상적인 방법에 의해 피험체로부터 적절하게 채취될 수 있다. 예를 들면 피험체의 말초혈, 골수, 종양조직, 조혈조직, 비장, 정상조직, 림프액 등으로부터 실시할 수 있다. 말초 혈액으로부터의 샘플 수집은 비침습적이고 간편하기 때문에 유리할 수 있다.

피험체 샘플에서 T 세포의 조성은 당업자가 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 통상 샘플 내 목적으로 하는 세포 아집단을 규정하는 마커(예를 들어 CD4)에 대해서 양성인 세포의 수를 유세포 계측법 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 세포 집단 조성의 측정은 유세포 계측법을 사용하는 것이 일반적이지만 그 외에도 세포를 포함한 샘플에 대한 면역염색, 항체 어레이를 사용하는 방법, 세포를 포함한 샘플 중에서의 단백질 발현 분석(예를 들어 웨스턴 블롯, 질량 분석, HPLC 등), 세포를 포함하는 샘플에서 mRNA 발현 분석(예를 들어 마이크로어레이, 차세대 시퀀싱 등) 등을 사용하여 수행할 수 있다.

CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^- T세포 아집단, CXCR3^-CCR6⁺CCR4^- T세포 아집단 등의 세포 아집단의 각 세포 수를 측정하려면 전체 세포에서 각 세포의 아집단 이외의 세포를 실험적으로 제외해 두고 구해도 된다. 예를 들어 CD4⁺ Effector Memory T cell 분리 키트, 인간(Militenyi Biotech 사) 등과 같이 소정의 항체를 사용하지 않고 말초 혈액으로부터 목적하는 T 세포 아집단에 상당하는 세포를 분리해도 된다. 예를 들어 CD4⁺ Effector Memory T cell분리 키트, 인간(Militenyi Biotech 사)을 사용하면 CD4 항체와 CD62L 항체를 사용하지 않고 말초 혈액에서 CD4⁺CD62L^low T세포 아집단에 해당하는 세포를 분리할 수 있다.

전체 살아있는 세포 수를 세어 기록하고 이 키트를 사용하여 얻은 세포 수를 세어 기록 할 수 있다. 또한 CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포 분리 키트, 인간(Militenyi Biotech 사)을 사용하면 항 FoxP3 항체를 사용하지 않고 CD4⁺CD25⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T세포 아집단에 해당하는 세포의 수를 구할 수 있다. FoxP3는 세포 내 핵에 국소화되므로 핵 내 분자를 염색하기 위한 단계를 생략하는 이점이 있다. 같은 키트로 CD4⁺CD25⁺CD127dim/-조절 T 세포 분리 키트, 인간(Militenyi Biotech사), CD25+CD49d-조절 T 세포 분리 키트, 인간(Militenyi Biotech사)도 선택할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서는 목적의 T세포 아집단의 각각의 세포 수를 계측할 수 있는 것이라면 어떠한 키트도 사용할 수 있다.

또한 항체를 사용하지 않아도 된다. 항체는 개별 세포에 발현되는 분자를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 것으로서 또한 항체가 세포 표면상 또는 세포 내에서 발현하고 있는 분자에 결합할 때 발색 할 수 있도록 하여 검출하고 발색하는 세포의 수를 계측한다. 여기서 그러한 세포 표면 또는 세포 내에서 발현되는 분자는 단백질이기 때문에 단백질을 발현하고 있는 경우에는 이를 암호화하는 mRNA도 세포 내에 존재한다.

즉, 개별 세포 내의 mRNA를 조사하여 주목하고 있는 단백질 분자를 암호화하는 mRNA의 유무를 조사하면 된다. 이것을 가능하게 하는 것이 단일 세포의 유전자 발현 분석, 즉 1 세포 레벨의 mRNA 분석이다. 단세포의 유전자 발현 해석으로서는 예를 들면 1) Quartz-Seq에 의해 차세대 시퀀싱을 행하는 방법, 2) Fluidigm C1 System이나 ICELL8 Signe-Cell System을 사용하여 세포를 분리해 SMART-Seq v4로 라이브러리 제작하는 방법, 3) 세포 분류기로 세포를 분리하고 Ambion Single Cell-to-CT 키트를 이용하여 정량 PCR로 계측하는 방법, 4) CyTOF SYSTEM(Helios사) 등을 들 수 있다.

즉, 혈액을 수득하여 살아있는 세포의 수를 세고, 세포 분류기 등으로 세포를 분리한다. 분리된 개별 세포에 대해 예를 들어 Ambion Single Cell-to-CT 키트를 사용하여 특정 유전자에 대해 발현량을 정량 PCR 방법의 장치로 측정할 수 있다. 그 결과에 근거하여 개별 세포가 CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^- T세포 아집단 또는 CXCR3^-CCR6⁺CCR4^- T세포 아집단의 어느 아집단에 해당하는지를 조사하여 각각의 아집단에 해당하는 세포의 수를 세는 것도 가능하다. 발현을 조사하는 유전자 후보로는 αβTCR, CD3, CD4, CD25, CTLA4, GITR, FoxP3, STAT5, FoxO1, FoxO3, IL-10, TGFbeta, IL-35, SMAD2, SMAD3, SMAD4, CD62L, CD44, IL-7R(CD127), IL-15R, CCR7, BLIMP1 등이 있으나 이들에 한정되지 않으며 목적의 세포 아집단에 따라 적절히 변경 가능하다.

본 발명에 있어서 세포 아집단의 비율의 측정 또는 기준치나 임계치와의 비교는 규정된 신호를 갖는 표준 샘플을 사용하여 행해도 된다. 소정의 세포 아집단에 상응하는 형광 신호를 생성하도록 제조된 표준(예를 들어 형광 염료가 부착된 입자)과 세포 집단을 포함하는 샘플 사이의 신호를 비교하고 표준과의 비교에 의해 샘플 중의 세포 아집단의 양 또는 비율을 측정할 수 있다. 또한 소정의 기준치 및 임계값에 대응하는 형광 신호를 생성하도록 제조된 표준(예를 들어 형광 염료가 부착된 입자)과 세포 집단을 포함하는 샘플 사이의 신호를 비교하고 표준과의 비교에 의해 샘플 중의 T 세포 조성에서 본 발명의 마커의 유무 또는 양을 판정하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 특정 마커에 대하여 high(고발현) 또는 low(저발현)를 판정하는 경우 당업자는 당업계에서 일반적으로 사용되고 있는 발현 강도의 분류 기준을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어 CD62L에 대해서 PE 표지된 항-인간 CD62L 항체를 사용한 경우의 10E2의 신호에 대응하는 신호 강도를 경계로 하여 CD62L^low와 CD62L^high를 명확하게 분할할 수 있다(WO 2018/147291호).

본 발명의 하나의 실시형태에서 당업자는 표시된 세포의 표면 마커를 적절하게 식별하여 세포를 분획 또는 계수할 수 있다.

CD4 T 세포는 이펙터 세포로서 여러 분화 상태로 변화하는 것으로 알려져 있다. IFNγ를 주로 생산하고 세포성 면역에 강하게 관여하는 Th1이나 IL4, IL-5를 주로 생산하여 알레르기에 관여하는 Th2, 또 자가면역 질환 등에 관여하는 것으로 알려져 IL-17을 생산하는 Th17 등 있다. 각각으로 분화된 CD4 T 세포는 특징적인 케모카인 수용체(CCR)를 발현하는 것으로 알려져 있으며 발현하는 CCR의 종류에 따라 Th 타입을 분류할 수 있다. 인간 CD4 T 세포의 Th 분화는 마우스 등에 비해 복잡한 것으로 알려져 있으며 예를 들어 도 1과 같이 분류할 수 있다(Annual Review of Immunology, Vol. 34: 317-334 Heterogeneity of Human CD4+ T Cells Against Microbes, Fig.1).

(바람직한 실시형태)

본 발명의 한 측면에서 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 내의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 방법은 상기 피험체 유래 샘플에서 상기 세포 아집단의 상대적 양을 결정하는 단계를 포함하고 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 치료에 대한 응답을 예측하기 위한 지표로서 사용한다. 또 다른 실시형태에서 상기 상대량과 기준치의 비교는 대상의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용된다.

본 발명의 다른 측면에서 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양을 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 방법은 상기 피험체로부터의 샘플에서 상기 세포 아집단의 양을 결정하는 단계를 포함하고 상기 양과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용한다. 또 다른 실시형태에서 상기 양과 기준치의 비교는 대상의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용된다.

본 발명의 측면에서 피험체의 CD4⁺ T세포 집단에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법으로서, 상기 피험체 유래 샘플 중의 상기 세포 아집단의 상대량과 무효군 임계치의 비교를 상기 피험체가 상기 암 치료에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양을 상기 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법으로서, 상기 피험체로 유래 샘플 중의 상기 세포 아집단의 양과 무효군 임계치의 비교를 상기 피험체가 상기 암 치료에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다.

본 발명의 하나의 실시형태에 있어서 상기 양 또는 상대량이 무효군 임계치 이상인 것에 의해 상기 피험체가 상기 암 치료에 대하여 무효군이 아닌 것을 나타낼 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서 상기 양 또는 상대량이 기준치 이상인 것에 의해 상기 피험체가 상기 암 치료에 대하여 반응하거나 암 치료 후의 장기간 무진행 생존기간을 나타낼 수 있다.

또한 본 발명의 다른 측면에서 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 상기 피험체의 암 면역 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 방법은 상기 피험체 유래 샘플에서 상기 세포 아집단의 상대량을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 상대량과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 면역 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용한다. 또 다른 실시형태에서 상대량과 기준치의 비교는 대상의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용된다.

본 발명의 다른 측면에서 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양을 피험체의 암 면역 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 방법은 상기 피험체 유래 샘플에서 상기 세포 아집단의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 양과 기준치의 비교를 상기 피험체의 암 면역요법에 대한 응답을 예측하기 위한 지표로 사용한다. 또 다른 실시 양태에서 양과 기준치의 비교는 대상의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용된다.

본 발명의 측면에서 피험체의 CD4⁺ T세포 집단에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 상기 피험체의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법으로서, 상기 피험체 유래 샘플 중의 상기 세포 아집단의 상대량과 무효군 임계치의 비교를 피험체가 암 면역요법에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양을 상기 피험체의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법으로서, 상기 피험체 유래 샘플 중의 상기 세포 아집단의 양과 무효군 임계치의 비교를 상기 피험체가 상기 암 면역 요법에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용되는 방법이 제공된다.

본 발명의 하나의 실시형태에 있어서 상기 양 또는 상대량이 무효군 임계치 이상인 것에 의해 상기 피험체가 상기 암 면역요법에 대하여 무효군이 아닌 것을 나타낼 수 있다. 또 다른 실시형태에서 상기 양 또는 상대량이 기준치 이상인 것에 의해 상기 피험체가 상기 암 면역요법에 대해 반응하거나 또는 암 면역요법 후의 장기간 무진행 생존기간을 나타낼 수 있다.

본 발명에서는 실시예에 나타낸 바와 같이 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양 또는 그의 상대량이 암 면역요법, 방사선 치료 및 분자 표적 약물 투여와 같은 암 치료 후의 무진행 생존기간에 비례하는 것으로 나타났다. 따라서 하나의 실시형태에서 피험체의 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양 또는 그의 상대량이 많은 것은 피험체가 암 면역요법(특히 면역 체크포인트 저해제에 의한 암 면역요법), 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에 대해 반응성이라고 예측할 수 있다.

따라서 본 발명에서 세포 아집단 양을 적절한 기준과 비교하고 비교를 통해 피험체에서의 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에서의 장기 생존(예를 들면 암 면역요법 후에 500일 이상의 무진행 생존기간)을 예측할 수도 있다. 예를 들어 샘플에서 세포 아집단의 양이 무진행 생존기간으로서 500일을 나타내는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 아집단의 양에 상당하는 기준보다 증가하고 있다는 것은 피험체에서 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에서의 장기 생존이 예측된다는 것을 나타낼 수 있다. 대안으로 샘플에서 세포 아집단의 양이 기준보다 증가하지 않은 것은 피험체에서 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에서의 장기 생존이 예측되지 않는다는 것을 나타낼 수 있다.

기준 또는 기준치로는 예를 들어 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료 전의 피험체 샘플에서 대응하는 세포 아집단의 양을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이 외에 기준으로는 암 면역요법, 방사선치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등 암치료를 받지 않은 피험체 샘플로부터 실험적으로 산출한 값 등을 이용하는 것도 가능하다. 또한 기준 또는 기준치로서는 소정의 무진행 생존기간을 나타내는 값을 적용할 수도 있다.

기준에 비해 증가하고 있는 것은 암 면역요법 후의 세포 아집단 양이 기준을 초과하는 양이거나 기준의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 %를 초과하여 증가하거나 또는 기준의 1.5배, 2배, 3배, 5배를 초과하여 증가하는 것으로 나타날 수 있다. 일반적으로 기준 값을 초과하면 기준과 비교하여 증가하는 것으로 간주된다. 기준이 실험적으로 산출되는 경우, 기준치에서 보아 적절한 오차를 초과하는 증가가 관찰된 경우에 기준과 비교하여 증가하고 있다고 할 수 있다. 적합한 오차는 예를 들어 1 표준 편차, 2 표준 편차, 3 표준 편차 또는 이들 이상을 포함한다.

피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 본 발명의 특정 세포 아집단의 상대적 양을 장기 생존군 검출, 무효군 검출, 효능군 검출 및/또는 안정군 검출에 사용한다. 이들 군의 검출은 피험체의 CD4⁺ T세포 집단에서 본 발명의 특정 세포 아집단의 상대적 양을 임계치와 비교함으로써 달성될 수 있다.

이 임계값은 감도 및 특이도를 고려하여 결정할 수 있다. 감도 및 특이도는 장기 생존군 검출, 무효군 검출, 주효군 검출 또는 안정군의 검출에 대한 감도 및 특이도일 수 있다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 바이오 마커는 감도 및 특이도 모두 100 %가 되는 임계 값을 설정할 수 있다. 본 발명의 바이오 마커로서 기재되는 지표 중 2개 이상을 사용하는 경우, 이들 지표에 대하여 각각 임계치를 정할 수 있으며 필요할 경우에는 제1 임계치, 제2 임계치, 제3 임계치, 제 4 임계치와 같이 구별하여 사용할 수 있다.

임계치는 장기 생존군의 검출, 무효군의 검출, 주효군의 검출, 또는 안정군의 검출에 대한 감도가 약 90% 초과가 되도록 결정될 수 있다. 다른 실시예에서 임계치는 무효군의 검출, 주효군의 검출 또는 안정군의 검출에 대한 감도가 약 100%가 되도록 결정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서 임계치는 무효군의 검출, 주효군의 검출 또는 안정군의 검출에 대한 특이도가 약 90% 초과가 되도록 결정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서 임계치는 무효군의 검출, 주효군의 검출 또는 안정군의 검출에 대해 특이도가 약 100%가 되도록 결정될 수 있다.

본 발명의 바이오 마커는 CD4⁺ T세포, 수지상 세포 및/또는 CD8⁺ T세포를 포함한 전체 항종양 면역 반응의 균형을 평가하는 것으로 종양 면역 자체를 전체적으로 평가하는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 방법은 광범위한 암종에 효과적일 수 있다. 또한 본 발명은 항 종양 면역 반응 전체의 균형을 평가하기 때문에 PD-1 및 PD-L1에 대한 면역 체크 포인트 저해제 뿐만 아니라 다른 면역 체크 포인트에 작용하는 항암 치료에도 효과적일 것으로 예상된다. 또한 방사선 치료나 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에 대해서도 생체 내의 항종양 면역과 협동하여 종양을 치유하는 것이기 때문에 항종양 면역의 상태를 평가할 수 있는 본 발명의 바이오 마커나 이를 이용한 방법에 의해 암 면역요법 이외의 암 치료에도 유효하다고 할 수 있다.

또한 본 발명의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단, CCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단, 또는 CCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단과 같은 특정 세포집단은 그 세포 집단이 많이 존재하는 경우에는 본래 항종양 효과를 발휘하기에 충분한 T 세포 면역이 준비되어 있다고 평가할 수 있는 것이기 때문에 그 치료 대상이 되는 환자가 이환하고 있는 암종은 특별히 한정되지 않는다. 암으로는 고형암이나 조혈기 종양 중 어느 것이어도 좋고 예를 들면 비소세포폐암, 소세포폐암, 신장암, 호지킨병, 두경부암, 유방암, 위암, 악성흑색종, 대장암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 위장관 간질 종양, 췌장 신경 내분비종 종양, 피부암 등 소위 항 종양 면역과 관련하여 치료하는 암에 대한 암 치료의 효과를 예측할 수 있다.

이론에 구속되는 것은 바람직하지 않지만 항 PD-1 항체로 대표되는 면역 체크 포인트 저해제의 항 종양 효과는 담암 숙주에 미리 존재하는 T 세포 면역의 상태에 의해 결정된다. 이를 이용하여 특허 제6664684호에서는 말초혈 T세포 클러스터 분석을 실시함으로써 얻을 수 있는 %CD62L^low/CD4⁺CD3⁺ T세포가 PD-1 저해제 치료의 단기적 주효 유무, 무진행 생존기간, 전체 생존기간을 예측할 수 있도록 하고 있다. 이 성능은 CD62L과 같은 2차 림프 조직에 대한 호밍 분자인 CCR7을 사용해도 재현할 수 없으며 약 120종류로 분류한 T세포 클러스터에 의한 예측 성능 해석에서도 %CD62L^low/CD4⁺CD3⁺ T세포를 능가하는 것은 없었다.

한편 상기한 바와 같이 CD4 T 세포는 이펙터 세포로서 몇가지분화 상태로 변화하는 것으로 알려져 있다. IFNγ를 주로 생산하여 세포성 면역에 강하게 관여하는 Th1과 IL4, IL-5를 주로 생산하여 알레르기에 관여하는 Th2, 또한 자가면역 질환 등에 관여하는 것이 알려져 IL-17을 생산하는 Th17 등이 있다. 각각 분화된 CD4 T 세포는 특징적인 케모카인 수용체(CCR)를 발현하는 것으로 알려져 있으며 발현하는 CCR의 종류에 따라 Th 타입을 분류할 수 있다. 인간 CD4 T 세포의 Th 분화는 마우스 등에 비하면 복잡한 것으로 알려져 있으며 예를 들어 도 1과 같이 분류할 수 있다(Annual Review of Immunology, Vol. 34: 317-334 Heterogeneity of Human CD4+ T Cells Against Microbes, Fig.1).

본 발명에서는 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포가 항종양 면역과 강하게 상관되는 것을 이용하여 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포를 CCR 타입에 따라 Th 분류하여 항종양 효과와 가장 강하게 상관되는 Th 클러스터를 해석함으로써 새로운 바이오마커를 얻고 있다. 하나의 실시형태에서 항 종양 효과를 평가하기 위한 수치로서 펨브롤리주맙 치료 후 무진행 생존기간(PFS)이 사용된다.

또한 상기한 바와 같이 본 발명의 방법은 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포 중에서도 특정 Th 클러스터의 존재량을 통해 피험체에서의 항종양 면역의 상태를 평가할 수 있는 것이다. 면역상태는 그 피험체에 대한 치료의 효과와 관련되기 때문에 본 발명의 방법에 의해 암 면역요법뿐만 아니라 방사선 치료나 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술에 의한 암 치료에 대한 효과를 예측할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단 외에 추가로 CXCR3⁺ 세포 아집단을 사용할 수도 있다. 이러한 세포 아집단은 CCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺가 되고 Th 타입으로 분류하면 Th1/17로 분류된다.

본 발명의 하나의 실시형태에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단 외에 추가로 CXCR3^- 세포 아집단을 사용할 수도 있다. 이러한 세포 아집단은 CCR4^-CCR6⁺CXCR3^-이 되고 Th 타입으로 분류하면 CCR6 SP(single positive)로 분류된다.

또한 본 발명의 또 다른 실시형태에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단 이외에 추가로 FoxP3^- 세포 아집단을 사용할 수도 있다. 이러한 세포 아집단은 CCR4^-CCR6⁺FoxP3^-이 되고 Th 타입으로 분류하면 Th1/17과 CCR6 SP를 조합한 것이 된다.

또한 본 발명의 또 다른 실시형태에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단 이외에 추가로 CD62L^low 세포 아집단을 사용할 수도 있다. 또는 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단 이외에 CD45RA^- 세포 아집단을 추가로 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 상기한 바와 같이 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포가 항종양 면역과 강하게 상관하는 것을 이용하여 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포를 다시 CCR 타입에 따라 Th 분류하여 항종양 효과와 가장 강하게 상관하는 Th 클러스터를 분석함으로써 새로운 바이오 마커를 수득하였다. 그리고 본 발명자들은 이 CD62L^low라는 형질의 의의를 조사하기 위해 single cell RNAseq에 의한 TCR 레퍼토어 해석을 행하고 있다. 그 결과, 말초 혈액 순환 중 CD62L^low 분획은 매우 선택성이 높은 근소한 클론으로 구성되어 있으며 방사선 치료에서 암 항원을 방출시킨 후에 증가하는 것은 CD62L^low T세포 클론 뿐인 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명자들은 CD62L^low T세포가 암 항원 특이적 T 세포 클론으로 구성되어 생체 내에서의 항종양 효과를 발휘하기 위한 중요한 역할을 담당하고 있는 것을 발견했다.

또한 본 발명은 도 2에 나타낸 바와 같은 CyTOF의 viSNE 해석에 의해 CD4⁺ 세포를 맵핑한 경우에 CD62L^lowCD4⁺ T세포에 포함된 5종류의 Th 분류(Th1, Th1/17, Th17, CCR6 SP, TP ) 중 어느 클러스터가 항 종양 면역에 중요한지를 밝혀낸다. 이론에 구속되기를 바라지 않지만 암 항원 방출에 반응하여 클론 증식하는 T 세포는 CD62L^lowCD4⁺ T세포에서만 발견되기 때문에 CD62L^lowCD4⁺ T세포에 포함된 5 종류의 Th 분류 중 하나가 항 종양 효과를 담당하게 된다. 따라서 본 발명의 한 국면에서 CD62L^lowCD4⁺ T세포에 포함된 5 종류의 Th 분류 중에서 각각의 암종이나 그에 대한 치료법에 따른 면역 상태를 적절하게 평가할 수 있는 클러스터 또는 세포 아집단을 선택하여 세포 아집단의 존재량 및 상대량을 이용하여 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서는 실시예에 나타낸 바와 같이, CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺와 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺의 2개의 클러스터가 무진행 생존기간과 유의미한 상관관계를 보이는 것을 발견하였다. 이론에 구속되는 것을 바라지 않지만 CyTOF의 viSNE 분석에서는 도 2에 나타낸 바와 같이 이 2개의 클러스터는 인접해 있어 각종 분자 발현이 근사한 클러스터라고 생각된다. Single cell RNAseq를 사용한 결과에서도 서로 다른 유전자 발현을 지니면서 근사한 유전자 발현 패턴을 지니고 있는 것이 판명되었다. 한편 이 2개의 클러스터는 Th1, Th17 세포와는 유전자 발현 패턴이 상이하다(도 15). 따라서 이 2개의 클러스터는 Th1, Th17 세포와는 달리 서로 근사한 세포 기능을 발휘하는 분화 상태에 있는 것으로 생각된다.

또한 본 발명에서는 실시예에 나타낸 바와 같이 CD4⁺ 세포 전체에 대한 CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-및 CXCR3^-CCR6⁺CCR4^-의 세포 비율은 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-, CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^- 및 CD62L^lowCD4⁺ 세포 비율 사이에 유의미한 상관관계를 나타내는 것을 발견하였으며(도 16), 이를 통해 CD62L을 이용하지 않고 CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^- 및 CXCR3^-CCR6⁺CCR4^-의 세포비율을 이용해도 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 및 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4⁺ 세포비율과 동등한 예측성능을 얻을 수 있음을 발견하였다.

항종양 면역 반응에 있어서는 T 세포 조성이 중요하다고 생각되는 바, CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포, CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포는 CD62L^lowCD4⁺ T세포 중에서도 특유한 유전자 발현 패턴을 지니며 다른 CD62L^lowCD4⁺ T세포와는 T세포 리셉터 클로노타입도 상이하다. CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포, CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포에 특유한 유전자 발현은 수지상 세포 등의 항원 제시 세포를 통한 CD8⁺ T세포의 프라이밍, 유주능, 종양침윤능, 살세포 기능을 돕는데 필수적인 CD4⁺ T세포 기능을 담당하며 특유의 클로노타입은 암 항원 특이성을 갖는 것으로 생각된다.

이러한 세포 기능과 항원 특이성을 갖는 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포, 및/또는 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포가 준비되어 있지 않으면 항종양 면역 체크포인트 저해제를 투여하더라도 항종양 면역 반응을 충분히 수행할 수 없다. 따라서 CD4⁺ T세포에서 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포 및/또는 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포의 비율은 면역 체크포인트 저해제에 의한 항종양 효과를 예측하는 지표가 된다.

본 발명에서는 수리학적 네트워크 해석 결과 비슷한 CCR 발현 패턴을 나타내지만 CD62L을 발현하는 CD62L^highCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^- 세포 및/또는 CD62L^highCXCR3^-CCR6⁺CCR4^- 세포의 CD4⁺ T세포에 대한 비율이 CD62L^lowCXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-CD⁺ 세포 및/또는 CD62L^lowCXCR3^-CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 세포 비율과 일정한 상관관계를 지니는 것을 발견하였다. 이 결과 CD4⁺ 세포에서의 CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^- 및 CXCR3^-CCR6⁺CCR4^- 전체 세포의 합인 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 양 또는 상대량에서 동등한 예측 성능을 제공하면서 면역 체크포인트 저해제를 포함한 암 치료에 의한 항종양 효과를 예측하는 지표가 될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 한 측면에서 본 발명은 암 치료(예를 들어 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료)에 대한 반응을 예측하기 위한 지표를 탐색 또는 결정하는 방법으로서,

- 해당 암 치료 전의 피험체의 CD62L^lowCD4⁺ T세포에서의 아집단과 해당 피험체의 암 치료에 대한 반응을 상관시키는 공정과,

- 이러한 상관관계를 바탕으로 해당 암 치료와 상관관계가 있는 아집단을 해당 암 치료에 대한 반응의 예측을 위한 지표로 하는 공정

을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 이러한 아집단은 5가지 Th 분류, 즉 Th1(CXCR3⁺CCR6^-CCR4^-), Th1/17(CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-), Th17(CXCR3^-CCR6⁺CCR4⁺), CCR6 SP(CXCR3^-CCR6⁺CCR4^-), TP(CXCR3⁺CCR6⁺CCR4⁺)일 수 있다.

즉, 상기한 바와 같이 본 발명은 CD62L^lowCD4⁺ T세포에 포함되는 5종류의 Th 분류 중에서 각각의 암종이나 그에 대한 치료법에 따른 면역 상태를 적절하게 평가할 수 있는 클러스터 또는 세포 아집단을 선택하여 세포 아집단의 존재량이나 상대량을 이용하여 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용하는 방법을 제공할 수 있다. 5종류의 Th 분류 이외에 또는 이들의 대체적으로 각각의 암종이나 그에 대한 치료법에 따른 면역 상태를 적절하게 평가할 수 있는 클러스터 또는 세포 아집단으로서는, CD62L^highCD4⁺ T세포에 포함된 6종류의 Th분류 즉 CD62L^highTh1(CXCR3⁺CCR4^-CCR6^-) 세포 아집단, CD62L^highTh1/17(CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺) 세포 아집단, CD62L^highCCR6 SP(CXCR3^-CCCR4^-CCR6⁺) 세포 아집단, CD62L^highTh17(CXCR3^-CCR4⁺CCR6⁺) 세포 아집단, CD62L^highTh2(CXCR3^-CCR4⁺CCR6^-) 세포 아집단, CD62L^highTN(CXCR3^-CCR4^-CCR6^-) 세포 아집단이 있다.

또한 Th분류 아집단에 가함으로써 면역상태를 적절히 평가할 수 있는 이펙터 CD4+ T세포 아집단으로서 CCR7⁺CD62L^lowCD4⁺ T세포 아집단, PD1⁺CCR7⁺CD62L^lowCD4⁺ T세포 아집단, LAG-3⁺CCR7⁺CD62L^lowCD4⁺ T세포 아집단, CD45RA^-Foxp3^-CD4⁺ T세포 아집단을, 제어성 T세포 아집단으로서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T세포 아집단, CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T세포 아집단, Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T세포 아집단을, 이펙터 CD8⁺ T세포 아집단으로 CD62L^lowCD8⁺ T세포 아집단을 각각 들 수 있다.

(키트)

본 발명의 한 측면에서 피험체의 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 세포 표면 마커에 대한 검출제를 포함하는 키트가 제공된다. 피험체의 T 세포가 발현하는 이들 세포 표면 마커가 피험체의 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 장기 무진행 생존과 관련됨이 본 발명자에 의해 발견되었다. 이를 통해 이들 세포 표면 마커에 대한 검출제를 포함하는 키트가 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 장기 무진행 생존의 예측에 유용한 것으로 이해된다. 이러한 키트는 본발명에 기재된 세포 아집단을 검출하기에 적합한 분자에 대한 하나 이상의 검출제를 포함할 수 있다. 이러한 검출제의 조합은 피험체의 T 세포 조성을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 키트는 피험체에서 본 발명에 기재된 신규한 바이오마커로서 특정 세포 아집단의 비율을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에서 본 발명의 키트는 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량과 기준치의 비교를 해당 피험체의 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용함으로써 피험체의 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에 대한 반응을 예측할 수 있다. 또 다른 실시형태에서 본 발명의 키트는 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량과 무효군 임계치의 비교를 해당 피험체가 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대해 무효군인지의 지표로 사용함으로써 피험체의 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 반응을 예측할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에서 본 발명의 키트는 CD4, CCR4 및 CCR6에 대한 검출제를 포함할 수 있으며 다른 실시형태에서 본 발명의 키트는 CXCR3, CD62L에 대한 검출제를 추가로 포함할 수도 있다. 하나의 실시형태에서 검출제는 항체이다. 바람직하게는 항체는 적절하게 표지되어 마커의 검출을 용이하게 한다.

하나의 실시형태에서 피험체의 T 세포의 조성은 피험체로부터 수득된 샘플 중의 T 세포의 조성이며 바람직하게는 샘플은 말초 혈액 샘플이다. 본 발명에서 제공되는 바이오 마커는 말초 혈액 샘플을 사용하여 측정할 수 있기 때문에 비 침습적이고 저렴하며 시간이 지남에 따라 시행 가능하다는 점에서 임상 응용에서 큰 이점을 지닌다.

하나의 실시형태에서 암 면역요법은 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함한다. 본 발명의 바이오마커는 특히 이러한 암 면역요법에 대한 피험체의 반응을 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서 피험체가 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 반응하지 않는 것으로 나타나는 경우, 예를 들어 CD4⁺ T세포 집단 중 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 양 또는 상대적 양이 기준치보다 작으면 추가 치료가 수행되어야 함이 고려된다. 이 경우 추가 치료로 투여되는 암 면역 요법 외에도 암 면역 요법이 아닌 치료(예를 들어 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 절차, 온열 요법 등)를 수행하거나 추가적인 암 면역요법(예를 들어 면역 체크포인트 저해제, 양자 세포 전달 등)이 수행될 수 있다. 대표적으로는 이미 투여된 면역 체크포인트 저해제에 대해 다른 화학요법제 또는 제2의 면역 체크포인트 저해제의 병용이 고려될 수 있다. 조합된 치료에 대해서는 본 명세서에 기재된 임의의 치료가 수행될 수 있다.

하나의 실시형태에서 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제를 포함한다. PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호작용(예를 들어 결합)을 억제하는 항-PD-1 항체, 예를 들어 니볼루맙, 펨브롤리주맙과 같은 항-PD-1 항체를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호작용(예를 들어 결합)을 억제하는 항-PD-L1 항체, 예를 들어 두발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 등의 항-PD-L1 항체를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험체의 T 세포의 조성을 이용하여 피험체의 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에 대한 반응을 예측하고 암을 지니는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 대안적으로 특정 T 세포의 조성을 지니는 피험체에서 암을 치료하는 방법 또는 이를 위한 조성물을 제공한다. 암 면역요법, 특히 면역 체크포인트 저해요법은 피험체별 반응성의 차이가 큰 것으로 알려져 있으며 본 발명의 바이오마커에 따라 피험체를 선택하여 암 면역요법을 실시하는 것은 종양 축소 등의 치료 효과가 나타날 확률을 현저하게 높일 수 있다.

상기 기재된 방법을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 반응하는 것으로 표시된 피험체에 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료가 실시될 수 있다. 암 면역요법은 본 명세서에 기재된 임의의 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서 암을 지니는 피험체를 치료하는 방법으로서 상기 피험체 유래 샘플에서 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 결정하는 단계와 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량이 기준치보다 높은 경우에 상기 피험체가 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료에 대해 반응한다고 판정하는 단계와, 상기 피험체가 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 반응하는 것으로 판정된 경우에 피험체에게 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는 암 면역요법에 대해 반응할 것으로 예상되는 피험체에서 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물이다. 본 발명에서 또한 첨부된 문서 및 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 제품이 제공될 수 있다. 첨부된 문서는 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 단계에 따라 면역 체크포인트 저해제를 사용하기 위한 지시를 기재한 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태는 암 면역요법에 반응할 것으로 예측된 피험체에서 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서 상기 피험체는 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량이 기준치 이상인 것을 특징으로 하는 조성물이다.

하나의 실시형태에서 조성물은 PD-1 저해제를 포함한다. PD-1 저해제는 예를 들어 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는 항-PD-1 항체이며 예를 들어 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 일 수 있다. 또 다른 실시형태에서 조성물은 PD-L1 저해제를 포함한다. PD-L1 저해제는 예를 들어 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는 항-PD-L1 항체이며 예를 들어 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙일 수 있다. 이들 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 본 발명의 바이오마커에 의해 선택된 피험체에 투여되는 경우 특히 높은 확률로 치료 효과를 발휘하는 것으로 생각된다. 본 발명의 조성물은 임의의 다른 약제와 병용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에 있어서 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료를 받은 피험체에서의 세포 아집단의 조성을 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플에서 세포 아집단의 조성을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 아집단의 조성의 분석은 본 명세서에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 또는 인실리코 일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서 세포 아집단의 양과 적절한 기준의 비교에 의해 피험체에서의 면역 활성화 여부가 나타난다. 특히 세포 아집단은 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단을 사용할 수 있다.

(세포 요법 및 그 목적 세포의 증식)

본 발명자는 CD4⁺ T세포 집단 중의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단, CCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단 또는 CCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단 등 특정 세포 집단의 비율과 암 면역 요법(특히 암 면역 체크 포인트 저해제에 의한 암 면역 요법), 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술 등의 암 치료 반응 사이에 명확한 상관관계가 있다는 점, 구체적으로는 암 면역 체크포인트 저해제에 의한 항종양 효과가 발휘되기 위해서는 항종양 효과를 발휘하는 T세포인 특정 세포 아집단을 많이 포함하는 것이 필수적임을 발견했다.

이론에 구속되는 것은 아니지만 이러한 발견으로부터 CD4⁺ T세포 집단 중에 CR4^-CCR6⁺ 세포 아집단(특히, CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단), CCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단(특히 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단) 또는 CCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단(특히 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단)과 같은 특정 세포집단을 많이 포함하는 암환자의 경우에는 본래 항종양 효과를 발휘하기에 충분한 T 세포 면역이 준비되면서 면역 체크포인트 분자 발현에 의한 항원 인식 신호의 감소에 의해 면역 회피되고 있는 것으로 이해된다. 한편 이러한 특정 세포 집단을 많이 포함하지 않는 환자의 경우에는 면역 체크포인트 저해제에 의해 면역 도피 메카니즘을 차단하더라도 CD8⁺ T세포 기능을 도울 수 있는 CD4⁺ T세포 기능의 회복을 바랄 수 없어 결과적으로 만족할 만한 항 종양 효과가 발휘되지 않을 것으로 생각된다.

이상에서 CD4+ T세포 집단 중에 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단, CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단 또는 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단 또는 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단, CCR4^-CCR6⁺CXCR3⁺ 세포 아집단 또는 CCR4^-CCR6⁺CXCR3^- 세포 아집단 등 특정 세포집단이 적기 때문에 면역 체크포인트 저해제에 의한 항종양 효과가 발휘되지 않는 환자의 경우 이들 특정 세포집단을 투여함으로써 면역 체크포인트 저해제에 의한 항종양 효과를 발휘/증강시키는 것이 가능할 것으로 생각된다.

따라서 본 발명의 또 다른 양태는 특정 세포를 전달함으로써 암 면역요법의 치료 효과를 개선, 유지 또는 계속하기 위한 방법 또는 이를 위한 조성물이다.

CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 및/또는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포가 암 면역 요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 피험체의 반응에 중요한 것으로 나타났으며 이러한 T 세포를 사용함으로써 피험체의 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료에 대한 반응성을 개선 또는 유지할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명의 하나의 실시형태는 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 또는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포를 포함하는 조성물이다. CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 또는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포, 또는 이를 포함하는 조성물은 암 면역요법, 방사선 치료, 분자 표적 약물 투여 및 외과적 수술과 같은 암 치료와 병용하는데 유용하다.

예를 들어 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 또는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포를 포함하는 조성물의 제조 방법은 인간 유래의 T 세포 집단으로부터 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 또는 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포를 순화하는 단계를 포함할 수 있다. 순화하는 단계는 CCR6⁺CD4⁺ T세포로부터 CD62L^high 세포 또는 CCR4⁺ 세포를 제거하는 것을 포함할 수 있다(음성 선택). CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포를 항체 및/또는 자기 비드, 정렬 방법 등을 사용하여 음성 선택에 의해 순화시키는 것은 사용하고자 하는 세포 상에 항체나 자기 비드 등의 오염물이 남아 있지 않기 때문에 바람직하다. CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포는 CD62L^high세포, CCR4⁺ 세포를 음성 선택한 세포군으로부터 CCR6⁺ 세포를 정렬에 의해 양성 선택함으로써 수득된다.

T 림프구는 공지된 기술에 따라 수집되어 유동 세포 측정법 및/또는 면역 자기 선택과 같은 항체 친화 결합과 같은 공지된 기술에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 농축 및/또는 고갈 단계 후, 원하는 T 림프구의 시험관 내 증식은 공지된 기술(Riddell 등의 미국 특허 제6,040,177호에 기재된 것을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다) 또는 당업자에게 명백할 수 있는 변형에 따라 수행될 수 있다.

예를 들어 원하는 T 세포 집단 또는 아집단을 시험관 내에서 첫 번째 T 림프구 집단을 배지에 첨가한 다음, 배지에 피더 세포를 첨가하여(예를 들어 생성된 세포 집단이 증식되어야 하는 첫 번째 집단의 하나의 T 림프구에 대해 적어도 약 5개, 10개, 20개 또는 40개 또는 그 이상의 피더 세포를 포함하도록), 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 증가시키기에 충분한 시간) 인큐베이션 하여 성장시킬 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도와 같은 조건 하에서 인큐베이션 될 수 있다. 인간 T 림프구의 성장에 대해 예를 들어 온도는 일반적으로 적어도 섭씨 약 25도, 바람직하게는 적어도 약 30도, 더욱 바람직하게는 약 37도일 것이다.

세포는 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 방법에 따라 분리 및/또는 증식한 후 필요에 따라 저장한 후 피험체에게 투여할 수 있다.

본 발명의 세포를 포함하는 조성물에서 목적하는 세포(예를 들어 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포)의 양은 당업자가 의도된 효과를 발휘하도록 적절하게 결정될 수 있으나 예를 들어 적어도 2×10⁸개, 바람직하게는 적어도 6×10⁸개, 보다 바람직하게는 적어도 2×10⁹개일 수 있다.

본 명세서에 기재된 세포를 포함하는 조성물은 목적하는 세포(예를 들어 CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ 세포) 이외에, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 '약제학적으로 허용 가능한'은 동물, 보다 상세하게는 인간에서 사용하기 위해 정부의 감독관청에 허가되었거나 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 '담체'는 치료제를 함께 투여하는 배양액, 이입액, 관류액, 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 세포를 포함하는 조성물은 세포를 주성분으로 포함하기 때문에 담체로서는 배양액, 이입액, 관류액 등의 세포를 유지할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어 약제학적 조성물을 정맥 내 투여하는 경우, 생리 식염수 및 수성 덱스트로스가 바람직한 담체이다. 바람직하게는 생리 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 주사 가능 용액의 액체 담체로서 사용된다. 약제를 경구 투여하는 경우 물이 바람직한 담체이다.

적합한 부형제는 경질 무수 규산, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올, 카르멜로스칼슘, 카르멜로스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염 등이 포함된다. 조성물은 바람직하게는 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 또한 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 필, 캡슐, 분말, 지속 방출 배합물 등의 형태를 취할 수도 있다. 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세라이드를 사용하여 조성물을 좌약으로서 제형화하는 것도 가능하다. 경구 제제는 또한 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.

적합한 담체의 예는 E.I. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark, Publishing Company, Easton, 미국)에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여되는 형태를 제공하도록 적절한 양의 담체와 함께 치료 유효량의 치료제, 바람직하게는 정제된 형태를 함유한다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 이들 외에 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 윤활제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함할 수 있다.

(일반기술)

본 명세서에서 사용되는 분자 생물학적 방법, 생화학적 방법 및 미생물학적 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되며 예를 들어 Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 및 그 3rd Ed. (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand Wiley-Interscience; Ausubel, F. M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium off Method Process ProC Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.I. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium off Method Processor Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium off Method Processor Associates; Innis, M.I. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, 별책 실험의학 '유전자 도입&발현 해석 실험법' 양토사, 1997 등에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 관련된 부분(전부일 수 있음)이 참고로 원용된다.

본 명세서에서 '또는'은 문장에 열거된 사항의 '적어도 하나 이상'이 적용될 수 있을 때 사용된다. '아니면'도 마찬가지이다. 본 명세서에 있어서 '2개의 값'의 '범위 내'라고 명기한 경우, 그 범위에는 2개의 값 자체도 포함된다.

본 명세서에 인용된 과학문헌, 특허, 특허출원 등의 참고문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 있어서 참고로서 원용된다.

이상, 본 발명을 이해의 용이함을 위해 바람직한 실시형태를 나타내어 설명하였다. 하기에는 실시예를 바탕으로 본 발명을 설명하였으나 상술한 설명 및 하기 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명을 한정하는 목적으로 제공되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태 또는 실시예에 한정되지 않으며 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

실시예

이상, 본 발명을 이해의 용이함을 위해 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명해 왔다. 하기에는 실시예를 바탕으로 본 발명을 설명하였으며 상술한 설명 및 하기 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명을 한정하는 목적으로 제공되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태 또는 실시예에 한정되지 않으며 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

(실시예 1) 항PD-1 항체의 치료 효과와 T 세포 집단 조성

1. 목적

본 실시예에서는 CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포가 항종양 면역과 강하게 상관되는 것을 이용하여(특허 제6664684호), CD62L^lowCD4⁺CD3⁺ T세포를 CCR 타입에 의해 Th 분류하여 항종양 효과와 가장 강하게 상관하는 Th 클러스터를 분석하였다.

2. 방법 및 재료

펨브롤리주맙 치료를 받기 전의 환자 유래 말초 혈액으로부터 Bacutina spitz^TM을 사용하여 단핵구를 분리하고 동결 보존하였다(액체 질소). 보존된 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 이용하여 유동세포계측법 및 질량측정법 분석을 수행하였다. 항종양 효과를 평가하는 수치로서는 펨브롤리주맙 치료 후의 무진행 생존기간(PFS)을 사용하였다.

3. 결과

도 3에 질량 사이토메트리(CyTOF^TM)에 의한 맵핑 해석의 결과를 나타내었다. 그 결과, 하기 표 1과 같은 Th 클러스터에 의해 CD62L^low 분획과 CD62L^highCD45RA^- 분획이 구성되어 있는 것이 판명되었다. CD62L^highCD45RA⁺ 분획은 이펙터 분화되지 않은 순진한 세포군으로 간주되었으며 CXCR3, CCR4 및 CCR6의 발현은 관찰되지 않았다 (표 1).

CD62L^low 분획(effector)에서 무진행 생존기간(PFS)과 유의미한 상관관계를 나타내는 것은 CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^-(Th1/17)와 CXCR3^-CCR6⁺CCR4^-(CCR6 SP)의 2종 이었다 (표 2).

CyTOF의 viSNE 분석에서 이 2 개의 클러스터는 인접해 있어 다양한 분자 발현이 근사한 클러스터로 간주되었다. 이 2개의 클러스터를 더한 세포 비율은 P<0.0001, r²=0.9083(도 4)과 매우 잘 PFS와 상관관계가 있었다(디스커버리 코호트로서 비소세포 폐암 13례의 결과). 이러한 수치는 %CD62L^low/CD4⁺와의 상관관계를 웃돌고 있었다. 또한 CD62L^low 분획은 표 1에 나타낸 Th 클러스터로 구성되기 때문에 %Th1/17+%CCR6 SP=%CCR6⁺CCR4^-로 변환하는 것이 가능한 것으로 판명되었다.

CD62L^highCD45RA^- 분획(central memory)에도 Th1/17 및 CCR6 SP 타입의 클러스터가 존재함에 따라 나이브 세포를 제외한 CD45RA^-분획 전체에 있어서의 Th 클러스터 비율과 PFS의 상관관계를 해석한 결과 역시 Th1/17과 CCR6 SP 클러스터와 PFS는 양호하게 상관되었다(표 2). 가장 좋은 상관관계를 보인 것은 Th1/17과 CCR6 SP 클러스터를 합산한 세포 비율이었다.

CD62L^highCD45RA⁺ 나이브 CD4 T 세포 분획에는 전혀 분화한 Th 클러스터가 인정되지 않고 CD62L^low 분획, CD62L^highCD45RA^- 분획에도 표 1에 나타나는 Th 클러스터만으로 구성됨에 따라 CD4⁺CD3⁺ T세포 전체에서 Th1/17과 CCR6 SP 클러스터를 더한 세포 비율은 근사적으로 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺로 나타난다는 것이 판명되었다. 실제로 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺와 PFS의 상관관계는 P<0.0001, r²=0.7920으로 %CD62L^lowCCR6+CCR4^-/CD4⁺에 비해 r²로 떨어지지만 %CD62L^low/CD4⁺와 PFS의 상관계수와 손색이 없는 수치였다(도 5). 또한 통상의 유세포 계측법 해석을 이용하여 수득된 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺또한 CyTOF에 의해 수득된 수치와 상관해 PFS와 (P=0.0002, r²=0.8003) 상관하였다(도 6).

펨브롤리주맙 치료 후 변화를 분석한 바, 주효예만으로 Th1/17, CCR6 SP 세포 비율의 유의미한 증가가 확인되었다.

이상의 결과로부터, 펨브롤리주맙 치료 전의 PBMC 해석의 결과, Th1/17과 CCR6 SP CD4⁺ T세포 클러스터에서만 PFS와의 상관관계가 인정된 것으로 나타났다. 또한, %CD62L^lowCCR6+CCR4^-/CD4⁺는 %CD62L^low/CD4⁺를 초과하는 매우 양호한 PFS와의 상관관계를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한 %CCR6⁺CCR4^-/CD4⁺또한 %CD62L^low/CD4⁺와 비슷한 정도의 PFS와의 상관관계를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

또한 펨브롤리주맙 단일제 치료 후의 무진행 생존기간과 CyTOF에 의한 Th 해석 결과의 상관관계를 조사한 바, 하기 표 3 및 도 7에 나타낸 바와 같이 Th1/17과 CCR6 SP CD4⁺ T세포 클러스터는 펨브롤리주맙 단일제 치료 후의 무진행 생존기간과 높은 상관관계를 나타내었다.

또한 %CD62L^lowCD4와 CyTOF에 의한 % Th 클러스터의 상관관계를 조사한 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 Th1/17 및 CCR6 SP 세포 클러스터의 존재비는 CD62L^low 세포 클러스터의 존재비와 상관하고 있었다 (도 8, 9).

4. 결과의 의미

본 실시예에서 CD4 T 세포 전체에 대한 CCR6⁺CCR4^- 세포 비율을 측정함으로써 CD62L을 사용하는 경우보다 간편하게 CD62L^lowCD4⁺ 세포 비율과 동등한 예측 성능을 얻을 수 있는 것을 발견했다. 혈액 검체로서 파이콜 분리 등을 실시하지 않고 fixation을 실시하기만 하면 되는 간편한 검체를 사용해도 해석이 가능해 전세계에서 해석할 수 있다.

T-bet⁺Th1타입(CXCR3⁺) CD4 T세포가 항 종양 면역에 중요하다는 것으로 보고되었으나 본 발명에 의해 CCR6⁺CCR4^-라는 이전에 정의된 적 없는 Th 분획의 중요성이 밝혀졌다. CCR6⁺CCR4^- 분획에서 CXCR3⁺인 클러스터는 T-bet을 발현하기 때문에 T-bet⁺ 분획의 중요성을 부정하는 것은 아니지만 CXCR3⁺CCR4^-CCR6^-라는 classical Th1 분획 항종양 효과와 관련이 없다는 것은 큰 발견이었다.

CCR6⁺CCR4^- 분획에는 CCR7 음성 및 양성 세포가 모두 포함되어 있다. 따라서 인간 T 세포 분류에 자주 사용되는 CCR7과 CD45RA만을 사용하여 분석할 때 이러한 클러스터를 동정하는 것은 불가능하였다.

또한 마우스를 이용하여 본 발명자와 같이 CD62L의 세포 분획을 더욱 검토하는 접근법을 채택하더라도 마우스 T 세포는 Th1, Th2, Th17로 각각 분화하여 Th1/17 분획을 거의 갖지 않으므로 CCR6⁺CCR4^- 분획의 중요성을 분석하는 것이 불가능하였다.

본 발명에서는 인간 CD62L^lowCD4 T세포 클러스터를 더욱 상세하게 분석한 것이 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터의 항종양 면역에 있어서 중요성 발견의 기반이 되고 있다.

(실시예 2) Th 클러스터와 전체 생존기간의 상관관계

실시예 1과 같이 Th 클러스터 중에서도, Th1/17과 CCR6 SP CD4⁺ T세포 클러스터는 펨브롤리주맙 단일제 치료 후의 무진행 생존기간과 높은 상관관계를 나타내는 것을 알 수 있었다. 그래서 Th 클러스터와 전체 생존기간의 상관관계를 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이 Th1/17과 CCR6 SP CD4⁺ T세포 클러스터는 무진행 생존기간뿐만 아니라 전체 생존기간과 양호하게 상관관계가 있음을 알 수 있었다.

또한 35 증례의 폐암에서 유세포 계측법을 이용하여 해석한 결과 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터는 도 11과 같이 다른 기존 마커들과 비교해도 무진행 생존기간 및 전체 생존기간과 높은 상관관계를 보이는 것으로 나타났다.

(실시예 3) 감도 및 특이도에 의한 평가

CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터에 대해 장기 생존 증례를 예측하는 성능을 ROC 분석에 의해 평가하고 그 감도 및 특이도 결과를 도 12에 나타내었다. CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ 비율을 이용했을 경우에 4.4를 임계값으로 하면 감도 100%, 특이도 77.3%라고 하는 상당히 양호한 바이오마커임을 알 수 있었다(도 12).

(실시예 4) 국소 진행 비소세포 폐암의 화학 방사선 치료 후 PFS

계속해서 국소 진행 비소세포 폐암 환자에서 화학 방사선 치료 후의 PFS를 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터의 존재량에 따라 예측할 수 있는지 여부를 조사하였다. 치료 전 Th1/17(CCR6⁺CCR4^-CXCR3⁺) 분획의 존재량과 PFS의 상관 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포의 존재량은 화학 방사선 치료 후의 PFS와 매우 잘 상관되는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터는 피험체의 면역 상태를 광범위하게 반영하기 때문에 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료의 예후 예측뿐만 아니라 방사선 치료 후의 예후 예측도 가능한 것으로 나타났다.

(실시예 5) EGFR-TKI 효과 예측

계속해서, 국소 진행 비소세포 폐암 환자에서 EGFR-TKI 치료 후의 PFS를 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터의 존재량에 의해 예측할 수 있는지 여부를 조사하였다. 치료 전의 CCR6⁺CCR4^- 분획의 존재량과 PFS의 상관 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타낸 바와 같이 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포의 존재량은 EGFR-TKI 치료 후의 PFS와 매우 잘 상관되는 것을 알 수 있었다. 이로부터 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터는 피험체의 면역 상태를 광범위하게 반영하기 때문에 면역 체크포인트 저해제를 통한 치료의 예후 예측뿐만 아니라 분자 표적 치료제 치료 후의 예후 예측도 가능한 것으로 나타났다. 분자 표적 치료제라도 면역과의 공동작업으로 종양을 조절하고 있기 때문에 CCR6⁺CCR4^-CD4 T세포 클러스터에 의해 면역 상태를 평가함으로써 예후를 예측할 수 있다.

(실시예 6) 암 면역요법의 치료 효과를 개선 또는 유지 계속하는 세포 요법

암 면역 요법을 통한 치료를 시작하기 전에 피험체의 말초 혈액 샘플로부터 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포를 순화시키고 액체 질소 하에 동결 보존한다. 동결 보존된 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포를 해동하고 ex vivo에서 의사 항원 자극을 준 후 IL2 존재 하에서 배양함으로써 증식시킨다. 동일 환자의 말초혈액 CD16⁺ 세포를 GMCSF와 IL4 존재 하에 배양함으로써 수득한 수지상 세포와 방사선 조사한 환자 암세포를 공동배양 하여 암 항원 흡수를 수행한다. 암 항원을 도입한 수지상 세포와 ex vivo로 증식한 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포를 공동배양 함으로써 암 항원 특이적 사이토카인 생성을 평가한다.

이 ex vivo에서 증식한 CD62L^lowCCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포는 암 면역요법의 효과를 유지하기 위해서 그 효과가 불충분하거나 또는 약화된 경우 환자에게 경정맥적으로 투여된다.

피험체가 암 면역요법에 대한 반응성인 것으로 판정된 경우, 예를 들어 CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포의 비율이 높은 경우에는 니볼루맙과 같은 항PD-1 항체에 의한 치료 등의 암 면역 요법을 실시한다. 치료 중에 피험체의 CD4⁺ T세포 조성을 모니터링 한다.

여기서 피험체의 CD4⁺ T세포 조성에서 CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포 비율 등의 지표가 저하되어 반응성이 아닌 면역 상태가 되었을 경우에는 ex vivo로 증식시킨 CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포를 도입하여 원래의 면역 상태로 되돌려 암 면역 요법의 효과를 지속시킨다.

CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포만을 배양하여 이입함으로써 보존 및 배양 비용을 줄일 수 있으며 항PD-1 항체 등의 면역 체크포인트 저해제 만을 2주마다 계속하는 것보다 경제적이다.

또한 피험체의 CD4⁺ T세포 조성에서 CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포 비율 등의 지표가 낮아 반응성이 아니라고 판정된 피험체에 피험체로부터 분리되어 ex vivo로 증식시킨 CCR6⁺CCR4^-CD4⁺ T세포를 도입함으로써 반응성 면역 상태로 변화시킨 후 니볼루맙과 같은 항 PD-1 항체에 의한 암 면역 요법을 실시한다. 이에 의해 종래는 항PD-1 항체에 의한 암 면역요법의 혜택을 받지 못한 피험체에서도 암 면역요법의 항종양 면역 반응을 일으킬 수 있다.

(실시예 7) Th1/17 및 CCR6 SP의 PFS 상관관계

실시예 1에 나타낸 바와 같이 Th 클러스터 중에서도 Th1/17과 CCR6 SPCD4⁺ T세포 클러스터가 무진행 생존기간과 높은 상관을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이 점에 대해서 도 2를 모식도화 하고 또한 각 구획에 발현하고 있는 케모카인 수용체를 표에 정리한 것이 도 17이다. 이 그림에서 알 수 있듯이 파선으로 둘러싸인 부분은 CD62L^low 세포 집단이며 이 중에는 케모카인 수용체의 발현이 다른 4개의 클러스터(C, D, E, H)가 존재하는 것을 알 수 있다. 이 중의 구획 D가 CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺로 나타내어지는 Th1/17이며, 구획 H가 CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺로 나타내어지는 CCR6 SP이다.

상기한 바와 같이 이 4개의 클러스터 중에서 어느 것이 항종양 효과와 관련되는지를 조사하기 위해 무진행 생존기간과의 상관을 확인하면 Th1/17과 CCR6 SP가 중요하다는 것을 알 수 있다. 있다. 이를 확인한 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18은 케모카인 수용체 발현에 기초한 말초 혈액 CD4⁺ T세포 클러스터의 항 PD-1 항체 치료 후의 PFS 상관관계를 나열한다. 모든 CD4⁺ T세포 클러스터에 대해 PD-1 저해제 치료 효과와의 상관관계를 분석했다. 다중성을 피하기 위해 FDR은 0.05로 하고 이보다 작은 P값을 유의하게 하였다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, Th1 및 Th17 클러스터 세포의 수는 PFS 및 OS 모두와 유의하게 상관되지 않았다. CD62L^low의 세포 집단에서 Th1/17 및 CCR6 SP T 세포 클러스터라는 두 개의 CD4⁺ T세포 클러스터가 PFS 및 OS와 유의한 양의 상관관계를 나타내었다.

이러한 Th1/17과 CCR6 SP라는 2개의 말초혈액 CD4⁺ T세포 클러스터에 대해 유전자 발현 해석과 메틸롬(메틸화) 해석을 행한 결과가 도 19이다. 유전자 발현에 대해서는 그 유사성을 찾기 위해 CD62L^lowCD4⁺ 분획에서 나타나는 4개의 Th 클러스터의 유전자 발현을 이용하여 의사 시간 해석을 수행하였다(도 19 좌측). 그 결과, CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺(Th1/17) 클러스터와 CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺(CCR6 SP) 클러스터는 Th1과 Th17을 의사 시간에서 가장 먼 위치에 배치했을 경우 Th1과 Th17 사이의 위치 한가운데에 다른 노드를 형성하고 있었다. 이것은 이 두 클러스터가 유전자 발현 프로파일의 관점에서 Th1과 Th17의 중간 특성을 지니는 독립적인 클러스터일 가능성을 나타낸다.

유사하게 6명의 환자의 유전자 발현 프로파일을 계층적으로 클러스터링 하면 CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺(Th1/17)과 CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺(CCR6 SP) 사이의 유클리드 거리가 가장 가까운 것으로 나타났다. T 세포의 유전자 발현을 조절하는 두 가지 주요 요인은 TCR 신호에 영향을 받는 활성화 상태와 주로 DNA 메틸화에 기인하는 분화 상태이다. 의사시간 해석에서 관찰된 유전자 발현 패턴의 차이가 분화 상태에 대응하는지 조사하기 위해 CD62L^lowCD4⁺ T세포로부터 선별한 4개의 T 세포 클러스터를 이용하여 메틸롬 해석을 수행하였다(도 19 우측).

메틸롬의 결과를 바탕으로 클러스터링 해석을 실시한 결과, Th1과 Th17의 클러스터는 떨어져 있으며 이들 클러스터와는 별도로 CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺(Th1/17) 클러스터가 존재하며 의사 시간 해석 결과와 일치하였다(도 19 우측). CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺(CCR6 SP) 클러스터는 Th17 클러스터와 CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺ 클러스터의 중간에 위치하였다.

상기한 바와 같이, 디스커버리 코호트로서 비소세포폐암 13 사례의 결과, Th1/17과 CCR6 SP는 무진행 생존기간과 상관하는 것으로 나타났으나(도 4) Th1/17과 CCR6 SP라는 2개의 말초 혈액 CD4⁺ T세포 클러스터의 PFS 예측 성능에 대한 검증 코호트로서 비소세포 폐암 초기 치료 및 기존 치료 사례를 사용하여 더욱 확인하였다.

검증 코호트에 있어서 Th1/17(CXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺)과 CCR6 SP(CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺)의T 세포 클러스터의 합계인 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타 클러스터는 PFS와 강한 상관관계를 나타내었다(도 20a, b, P <0.0001, r = 0.9599). 또한 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료의 타이밍에 의해 Th1/17과 CCR6 SP의 PFS와의 상관에 변화가 보여지는지를 확인하기 위해 미치료 비소세포 폐암 환자에게 펨브롤리주맙을 투여한 경우와 기 치료 비소세포폐암 환자에게 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 투여한 경우에서 Th1/17과 CCR6 SP의 PFS와의 상관관계를 조사하였다. 구체적으로 미치료 비소세포 폐암 환자에게 펨브롤리주맙을 투여한 경우와 기치료 비소세포 폐암 환자에게 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 투여한 경우의 2개의 검증 코호트를 사용하여 Th1/17 및 CCR6 SP T 세포 클러스터와 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타 클러스터가 면역 체크포인트 저해 요법 후 임상 결과와 상관관계가 있는지 조사하였다.

2개의 검증 코호트는 PD-L1 TPS가 50% 이상으로 최초로 펨브롤리주맙을 투여한 NSCLC 환자와 종양의 PD-L1 발현에 관계없이 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 투여받은 기치료 환자로 하였다. 2 개의 검증 코호트에서 수득된 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타 클러스터와 PFS의 상관관계를 나타내는 회귀 직선은 y-intercept 및 slope 모두 디스커버리 코호트에서 관찰된 것과 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 펨브롤리주맙으로 1차 치료를 받은 그룹에서는 Th1 및 Th17과 PFS 및 OS간에 유의미한 상관관계가 나타나지 않았다. 그러나 CD62L^lowCXCR3⁺CCR4^-CCR6⁺ 및 CXCR3^-CCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 클러스터는 유의미한 상관관계를 나타내었다. CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타클러스터는 치료 전 말초 혈액에서 질병 진행군에 비해 유의미하게 증가하였으나 Th1 및 Th17에는 차이가 없었다. CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타클러스터는 ROC 곡선 분석에서 200일 이상의 PFS를 유의하게 예측하였으며 곡선 하 면적(AUC)은 0.865였다(도 20c).

CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타 클러스터는 PFS뿐만 아니라 OS와 유의하게 상관관계가 있었다(도 20d). PD-1 저해 요법의 항 종양 효과는 CD62L^lowCCR4^-CCR6⁺CD4⁺ T세포 메타 클러스터에 의존하기 때문에 CD62L^low Th1/17 T세포 클러스터와 CD62L^low CCR6 SP T세포 클러스터가 협력하여 항 종양 면역을 매개하는 것으로 생각된다. 또한 Th1/17과 CCR6 SP 이외의 클러스터도 포함한 CD62L^low 전체의 세포 집단에서도 PFS와의 상관은 확인할 수 있었으나 이것과 비교하면 Th1/17과 CCR6 SP만을 꺼낸 경우에는 더욱 높은 PFS와의 상관관계를 얻을 수 있었다(나타내지 않음). 이것은 CD62L^low 전체의 세포 집단은 Th1/17과 CCR6 SP만의 경우에 특히 항종양 효과와 관련된 클러스터만을 포함하고 있기 때문에 PFS와의 상관이 높아진 것으로 생각된다.

그런 다음 말초 혈액이 아닌 종양 미세 환경에서 CD4 T 세포의 PFS와의 상관관계를 조사하였다. 심침 생검, 경기관지 생검, 수술 생검으로 수득한 종양 표본(n = 46)을 사이토케라틴, CD4, CD8, PD-1, PD-L1, FoxP3으로 염색하였다. 사이토케라틴 + 종양 세포의 검출에 기초하여 멀티 컬러 분석기(OPAL^TM)를 사용하여 종양 주위의 간질과 종양 내의 10,000 개의 세포를 자동으로 계수하였다. 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21 상부에 나타낸 사진은 종양 내 및 간질에서 CD4, CD8, PD-1 등의 분자가 어느 정도 존재하고 있는지를 조사하기 위해 각 분자를 염색한 사진이다. 종양 미세 환경(TME)에 대한 T 세포의 침윤을 조사하면 종양 미세환경에서 면역세포 수의 반복 상관 분석에서는 종양 주위의 간질에 존재하는 CD8⁺ 세포 및 CD4⁺ 세포의 수와 PFS 및 OS 와의 사이에 유의미한 상관관계가 확인되었으나 다중 비교 분석에서는 종양 주위의 간질에 존재하는 CD4⁺ T 세포에 가장 유의한 상관관계가 인정되었다(도 21 좌하 및 우하).

또한 PD-1 저해제의 항 종양 효과와 상관관계가 있는 말초 혈액에서 발견된 CD4⁺ T세포 클러스터와 다른 말초혈액 T 세포 클러스터와 종양 미세 환경에서 T 세포의 존재와의 관계를 밝히기 위해 다중 비교 분석과 네트워크 분석을 수행하였다. 이를 통해 말초 혈액 및 종양 미세 환경(TME)에서 각 세포 클러스터의 수가 어떤 관계로 연동되는지 조사할 수 있다. 말초 혈액 중의 T 세포 클러스터와 TME 중의 면역 세포의 네트워크 해석을 행한 결과를 도 22에 나타내었다. 이 도면에서 특정 세포의 수가 완전히 연동되어 변동하는 경우에는 1.00으로 표시되며 연동이 낮을수록 숫자가 작아진다. 이 도면으로 부터도 알 수 있는 바와 같이, 말초혈 중의 Th1/17과 CCR6 SP를 합한 세포수와 종양 미세 환경(TME) 중의 CD4⁺ 세포 수는 네트워크 해석 결과가 0.92로 나타나 말초혈중의 Th1/17과 CCR6 SP를 합한 클러스터가 CD4⁺ 세포의 종양 미세환경으로의 침윤과 강하게 관련되어 있는 것을 알 수 있었다.

한편 Th1 세포는 종양 미세환경의 CD8⁺ T세포와 직접 관련되어 있었다. 이와 같이 말초혈 중의 Th1/17과 CCR6 SP를 합한 클러스터는 CD4⁺ T세포의 종양 미세환경에의 침윤을 촉진하고 CD62L^lowTh1세포는 CD8⁺ T세포의 침윤을 촉진하고 있었다. 또한 네트워크 분석 결과, 말초혈 중의 Th1/17과 CCR6 SP를 합한 클러스터는 CD45RA⁺CCR7^- 이펙터 CD8⁺ T세포(TEMRA) 빈도와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 이로부터 말초혈의 Th1/17과 CCR6 SP를 확인함으로써 종양 내의 CD4⁺ 세포의 상태를 파악할 수 있는 것으로 나타났다.

이어서 수술 전 말초 혈액의 세포 클러스터와 수술에 의해 종양 조직을 제거한 후 말초 혈액의 세포 클러스터를 비교하였다. 결과를 도 23에 나타내었다. 수술로 종양 조직이 사라진 경우에 말초 혈액에서도 감소하는 세포 클러스터는 종양의 존재에 의해 증가된 세포 클러스터로 간주될 수 있다. 도 23에 나타난 바와 같이, CD62L^low 세포는 수술전(pre)에 비해 수술후(post)에서는 말초혈에서의 세포수가 감소하고 있으며 그 중에서도 특히 Th1/17과 CCR6 SP에서는 수술후에 그 세포 수가 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 이것으로부터 Th1/17과 CCR6 SP는 종양과 관련된 세포 클러스터인 것을 알 수 있다.

(참고)

전술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시형태를 이용하여 본 발명을 예시하였으나 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 특허, 특허 출원 및 기타 문헌은 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재된 것과 마찬가지로 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 하는 것으로 이해된다. 본 발명은 일본 특허청에 2020년 9월 8일자로 출원된 일본 특허출원 제2020-150620호에 대하여 우선권을 주장하며 그 내용은 그 전체가 마치 본 발명의 내용을 구성하는 것과 마찬가지로 참고로 원용된다.

본 발명에서 제공되는 바이오마커는 간편하고 저렴하며 정확하게 암 면역 체크포인트 저해제에 의한 반응을 예측하는데 이용될 수 있으며 의학적, 사회적으로 필수적이다. 본 발명은 전세계, 전암종에 있어서 필요한 기술로 생각되며 매우 큰 시장적 가치를 가지고 있는 것으로 생각된다.

Claims

피험체의 CD4⁺ T세포 집단에서 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법에 있어서,
상기 피험체 유래의 샘플 중의 상기 세포 아집단의 상대량을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 상대량은 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법.
제 1항에 있어서, 상대량과 기준치의 비교를 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상대량과 기준치의 비교를 피험체의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상대량과 무효군 임계치의 비교를 피험체가 상기 암 치료에 대해 무효군인지 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단은 CXCR3⁺세포하위 아집단인 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단은 CXCR3^- 세포 하위 아집단인 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단은 FoxP3^- 세포 하위 아집단인 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단은 CD62L^low 세포 하위 아집단인 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단은 CD45RA^- 세포 하위 아집단인 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료는 암 면역 요법, 방사선 요법, 분자 표적 약물 치료, 외과적 수술, 세포 전달 또는 이들 치료의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료는 암 면역요법인 방법.
제11항에 있어서, 암 면역요법은 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함하는 방법.
제 12항에 있어서, 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA-4 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 저해제를 포함하는 방법.
제 12항에 있어서, 면역 체크 포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제와 CTLA-4 저해제의 조합을 포함하는 방법.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항-PD-1 항체인 방법
제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 포함하는 방법.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항-PD-L1 항체인 방법.
제 17항에 있어서, PD-L1 저해제는 두르발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙을 포함하는 방법.
제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA-4 저해제는 이피리무맙 및 트레메릴루맙을 포함하는 방법.
제 4항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 무효군 임계치는 무효군의 검출에 대한 감도 및 특이도를 고려하여 결정되는 방법.
제 4항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무효군 임계치는 무효군의 검출에 대한 감도가 약 90 %를 초과하도록 결정되는 방법.
제 4 항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 무효군 임계치는 무효군의 검출에 대한 특이도가 약 90 %를 초과하도록 결정되는 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 상대량은 말초 혈액 샘플을 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상대량이 기준치 이상인 것은 피험체가 암 치료에 반응하는 것을 나타내는 방법.
피험체에서 암을 치료하기 위해 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 피험체는 제 11항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 암 면역 요법에 반응할 것으로 예상되는 피험체임을 특징으로 하는 조성물.
제 25항에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA-4 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 저해제를 포함하는 조성물
제 26항에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제와 CTLA-4 저해제의 조합을 포함하는 조성물.
제 26항 또는 제 27항에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항-PD-1 항체인 조성물.
제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 포함하는 조성물.
제 26항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1의 상호 작용을 억제하는 항-PD-L1 항체인 조성물.
제 30항에 있어서, PD-L1 저해제는 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함하는 조성물.
제 26항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA-4 저해제는 이피리무맙을 포함하는 조성물.
CD4에 대한 검출제, CCR4에 대한 검출제 및 CCR6에 대한 검출제를 포함하는, 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 키트에 있어서,
예측은 피험체의 CD4⁺ T세포 집단 내의 CCR4^-CCR6⁺ 세포 아집단의 상대량을 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용하여 수행되는 키트.
제33항에 있어서, 상대량과 기준치의 비교는 피험체의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용되는 키트.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상대량과 기준치의 비교는 피험체의 장기 생존을 예측하기 위한 지표로서 사용되는 키트.
제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상대량과 무효군 임계치의 비교를 피험체가 암 치료에 대해 무효군인지의 여부를 예측하기 위한 지표로서 사용하는 키트.
제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 검출제는 항체인 키트.
제 33항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 더욱 CXCR3에 대한 검출제를 포함하는 키트.
제 33항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료는 암 면역 요법, 방사선 요법, 분자 표적 약물 치료, 외과적 수술, 세포 전달 또는 이들 치료의 임의의 조합을 포함하는 키트.
제 33항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료는 암 면역 요법인 키트.