CN116113435A - 用于预测对癌症治疗的响应的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于预测对癌症治疗的响应的生物标志物及使用了该生物标志物的方法。本发明还提供一种方法,其以从受试体得到的样品中的细胞亚群的组成作为用于预测受试体对癌症治疗的响应的指标。通过将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4‑CCR6+细胞亚群的量与基准值进行比较,从而能够预测受试体对癌症治疗的响应。
Description
技术领域
本发明涉及癌症治疗的效果预测领域。更详细而言,涉及基于受试体的T细胞组成来预测受试体对癌症治疗的响应性的方法。
背景技术
在癌症治疗中,根据其癌症患者的特性来选择适当的治疗法,其中,癌症免疫疗法与以癌细胞代谢等为靶标的以往抗癌症治疗(烷基化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、微管聚合抑制剂、微管解聚抑制剂等)相比,癌症免疫疗法的副作用更小,显示更大的效果,近年来备受注目。在癌症免疫疗法中,抗PD-1免疫检查点抑制是特别备受关注的治疗。
对于作为抗PD-1抗体的纳武单抗(Nivolumab),作为非小细胞肺癌的二次治疗,总生存期以较大差别优于作为以往标准治疗的多西他赛(Docetaxel),在肺癌学会指南中也成为推荐度A的标准治疗(非专利文献1)。同为抗PD-1抗体的派姆单抗(Pembrolizumab)在首次治疗中总生存期优于作为以往标准治疗的细胞损伤性抗癌剂(但是,其是在肿瘤细胞上PD-L1表达50%以上的患者中),将来会确定为非小细胞肺癌标准治疗。
现在,抗PD-1抗体的效果不仅限于肺癌,在很多癌症中正在不断地得到证明,在日本,医疗保险已经应用于肾癌、尿路上皮癌、头颈癌、消化道癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、大肠癌、恶性胸膜间皮瘤,将来有待还应用于肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌。
但是,虽然抗PD-1抗体似乎在临床上取得了极大的成功,但实际上存在重大问题。根据无进展生存期(PFS)的数据,在几乎所有的抗PD-1抗体临床试验中确认到在3个月以内病情加重的“无效组”。另一方面,对于抗PD-1抗体1年以上有效的组,此后几乎未确认到病情加重,可见取得接近治愈的状态。这表明在临床效果中存在“无效组”“高效组”“中间组”这样的3个不同亚组,但是预测其的生物标志物尚不为人知。将预期成为几乎所有癌症的标准治疗的抗PD-1抗体施用至高达约40%的无效组不仅在医学上是有问题的,在医疗经济性方面也是有问题的。
针对这样的问题,本发明人已经发现在针对癌症免疫疗法(例如抗PD-1治疗或抗PD-L1治疗)的治疗效果为进展(PD)、稳定(SD)、缓解(完全缓解(CR)及部分缓解(PR))的三组中分别呈现不同的免疫状态,提供了如下方法,即,在对受试体进行癌症免疫疗法的情况下,预期针对该癌症免疫疗法的响应为进展(PD)、稳定(SD)或缓解(完全缓解(CR)及部分缓解(PR))的任一者的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第6664684号
非专利文献
非专利文献1:Brahmer J,et al.N Engl J Med 2015;373:123-135
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述情况而完成的,通过对患者的免疫状态进行评价,从而找出用于预测癌症治疗对该患者的效果的标志物。而且,由于将从受试体得到的样品中的细胞亚群的组成用作用于预测该受试体对癌症治疗的响应的指标,因此发现了与以往已知不同的细胞亚群的组成能够作为用于预测对癌症治疗的响应的新指标。
具体而言,本发明的发明人们发现:通过测定相对于CD4 T细胞全体的CCR6+CCR4-细胞比例(优选为CD62L低CCR6+CCR4-细胞比例),从而能够得到超出用于预测对癌症治疗的响应的以往指标的预测性能,而且,即使使用CCR6+CCR4-细胞比例,也能得到与CD62L低CCR6+CCR4-细胞比例同等的预测性能。本发明是部分基于本发明人们的发现(即、对癌症治疗的响应性与受试体的T细胞组成相关、能够作为生物标志物进行利用)而完成的,本发明的生物标志物的灵敏度、特异度均极高,并且便利性也高。
本发明的发明人们发现通过癌症免疫疗法(例如抗PD-1治疗或抗PD-L1治疗)治疗后的无进展生存期(PFS)与特定的T细胞组成显著相关。由此,在本发明的一个实施方式中,提供一种在对受试体进行癌症免疫疗法时用于预测对该癌症免疫疗法的响应的方法。另外,本发明的发明人们发现:例如通过放射线治疗、分子靶向药治疗等除癌症免疫疗法以外的癌症治疗进行治疗后的无进展生存期(PFS)与特定的T细胞组成显著相关。由此,在本发明的一个实施方式中,提供一种在对受试体进行癌症治疗时用于预测对该癌症治疗的响应的方法。
因此,本发明提供以下方案。
(方案1)一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标,
上述方法包括确定来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的相对量的工序,
上述方法将上述相对量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。
(方案2)根据方案1所述的方法,其中,上述方法将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。
(方案3)根据方案1或2所述的方法,其中,上述方法将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
(方案4)根据方案1~3中任一项所述的方法,其中,上述方法将上述相对量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症治疗是否为无效组的指标。
(方案5)根据方案1~4中任一项所述的方法,其中,上述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CXCR3+细胞亚群。
(方案6)根据方案1~4中任一项所述的方法,其中,上述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CXCR3-细胞亚群。
(方案7)根据方案1~6中任一项所述的方法,其中,上述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为FoxP3-细胞亚群。
(方案8)根据方案1~7中任一项所述的方法,其中,上述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CD62L低细胞亚群。
(方案9)根据方案1~7中任一项所述的方法,其中,上述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CD45RA-细胞亚群。
(方案10)根据方案1~9中任一项所述的方法,其中,上述癌症治疗包括癌症免疫疗法、放射线疗法、分子靶向药治疗、外科手术、细胞转移或这些治疗的任意组合。
(方案11)根据方案1~10中任一项所述的方法,其中,上述癌症治疗为癌症免疫疗法。
(方案12)根据方案11所述的方法,其中,上述癌症免疫疗法包括免疫检查点抑制剂的施用。
(方案13)根据方案12所述的方法,其中,上述免疫检查点抑制剂包括选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂中的抑制剂。
(方案14)根据方案12所述的方法,其中,上述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂与CTLA-4抑制剂的组合。
(方案15)根据方案13或14所述的方法,其中,上述PD-1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-1抗体。
(方案16)根据方案13~15中任一项所述的方法,其中,上述PD-1抑制剂包括纳武单抗或派姆单抗。
(方案17)根据方案13~16中任一项所述的方法,其中,上述PD-L1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-L1抗体。
(方案18)根据方案17所述的方法,其中,上述PD-L1抑制剂包括度伐利尤单抗(Durvalumab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)及阿维鲁单抗(Avelumab)。
(方案19)根据方案13~18中任一项所述的方法,其中,上述CTLA-4抑制剂包括伊匹单抗(Ipilimumab)及曲美木单抗(Tremelimumab)。
(方案20)根据方案4~19中任一项所述的方法,其中,考虑关于无效组检测的灵敏度及特异度来确定上述无效组阈值。
(方案21)根据方案4~20中任一项所述的方法,其中,上述无效组阈值按照使关于无效组检测的灵敏度超过约90%的方式来确定。
(方案22)根据方案4~21中任一项所述的方法,其中,上述无效组阈值按照使关于无效组检测的特异度超过约90%的方式来确定。
(方案23)根据方案1~22中任一项所述的方法,其特征在于,上述方法使用外周血样品来测定上述细胞的相对量。
(方案24)根据方案2~23中任一项所述的方法,其中,上述相对量为上述基准值以上表示上述受试体对上述癌症治疗进行响应。
(方案25)一种组合物,其特征在于,其是用于在受试体中治疗癌症的、包含免疫检查点抑制剂的组合物,上述受试体是通过方案11~24中任一项所述的方法预测为对癌症免疫疗法进行响应的受试体。
(方案26)根据方案25所述的组合物,其中,上述免疫检查点抑制剂包括选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂中的抑制剂。
(方案27)根据方案26所述的组合物,其中,上述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂与CTLA-4抑制剂的组合。
(方案28)根据方案26或27所述的组合物,其中,上述PD-1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-1抗体。
(方案29)根据方案26~28中任一项所述的组合物,其中,上述PD-1抑制剂包括纳武单抗或派姆单抗。
(方案30)根据方案26~27中任一项所述的组合物,其中,上述PD-L1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-L1抗体。
(方案31)根据方案30所述的组合物,其中,上述PD-L1抑制剂包括度伐利尤单抗、阿替利珠单抗或阿维鲁单抗。
(方案32)根据方案26~31中任一项所述的组合物,其中,上述CTLA-4抑制剂包括伊匹单抗。
(方案33)一种试剂盒,其是包含针对CD4的检测剂、针对CCR4的检测剂及针对CCR6的检测剂的、用于预测受试体对癌症治疗的响应的试剂盒,上述预测通过将上述受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标来进行。
(方案34)根据方案33所述的试剂盒,其中,上述试剂盒将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。
(方案35)根据方案33或34所述的试剂盒,其中,上述试剂盒将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
(方案36)根据方案33~35中任一项所述的试剂盒,其中,上述试剂盒将上述相对量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症治疗是否为无效组的指标。
(方案37)根据方案33~36中任一项所述的试剂盒,其中,上述检测剂为抗体。
(方案38)根据方案33~37中任一项所述的试剂盒,其中,上述试剂盒进一步包含针对CXCR3的检测剂。
(方案39)根据方案33~38中任一项所述的试剂盒,其中,上述癌症治疗包括癌症免疫疗法、放射线疗法、分子靶向药治疗、外科手术、细胞转移或这些治疗的任意组合。
(方案40)根据方案33~39中任一项所述的试剂盒,其中,上述癌症治疗为癌症免疫疗法。
在本发明中旨在上述的1个或多个特征除了所明示的组合以外还可进一步组合来提供。对于本发明的另外的实施方式及优点,只要根据需要阅读以下的详细说明并加以理解,就能被本领域技术人员所认识。
需要说明的是,对于除上述以外的本发明的特征及显著的作用、·效果,本领域技术人员通过参照以下的发明的实施方式的项及附图便可明确获得。
附图说明
图1是表示人CD4 T细胞的Th分化的示意图。
图2是外周血CD4+T细胞基于CyTOF质谱流式细胞术(Mass Cytometry)得到的映射解析的结果。
图3是在本发明的一个实施方式中各种细胞亚群基于CyTOF质谱流式细胞术得到的映射解析的结果。
图4是表示在本发明的一个实施方式中CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-(Th1/17)和CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-(CCR6 SP)2个团簇与无进展生存期的相关关系的图表。图4右侧是将CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-(Th1/17)和CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-(CCR6 SP)2个团簇合并的情况,图4左侧是表示%CD62L低/CD4+与无进展生存期的相关关系的图表。
图5是表示在本发明的一个实施方式中%CCR6+CCR4-/CD4+与无进展生存期的相关关系的图表。
图6是表示在本发明的一个实施方式中使用流式细胞仪解析(Fortessa)得到的%CCR6+CCR4-/CD4+与无进展生存期的相关关系、以及使用CyTOF得到的%CCR6+CCR4-/CD4+与无进展生存期的相关关系的各个相关关系的图表。
图7是表示在本发明的一个实施方式中派姆单抗单剂治疗后的无进展生存期与基于CyTOF的Th解析结果的相关关系的图表。
图8是表示在本发明的一个实施方式中CD62L低Th1/17及CD62L低CCR6SP团簇总数与无进展生存期的相关关系的图表。
图9是表示在本发明的一个实施方式中Th1/17与CCR6 SP之和能够以CCR4-CCR6+细胞团簇的形式进行测定的相关图表。
图10是表示在本发明的一个实施方式中Th团簇与总生存期的相关关系的表。
图11是表示在本发明的一个实施方式中CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇与无进展生存期及总生存期的相关与其他标志物进行了比较的图表。
图12是表示在本发明的一个实施方式中CD4+T细胞中的CCR6+CCR4-细胞的比率作为用于预测总生存期的指标的性能的图表。右侧是将使阈值变化时的灵敏度和特异度绘制成的图。所绘制的点的下方区域的面积为0.9628,认为是非常优异的标志物。
图13是表示在本发明的一个实施方式中化学放射线治疗后的PFS与CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇的相关的图表。
图14是表示在本发明的一个实施方式中EGFR-TKI治疗后的PFS与CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇的相关的图表。
图15是表示CD62L低Th1、CD62L低Th1/17、CD62L低CCR6 SP、CD62L低Th17、CD62L低TP的各自的TCR Chrono型数的示意图。
图16是表示CD62L低Th1/17+CD62L低CCR6 SP细胞团簇与Th1/17+CCR6SP细胞团簇相关的图表。
图17是表示外周血CD4+T细胞团簇和在各区段表达的趋化因子受体(chemokinereceptor)的示意图。
图18是表示外周血CD4+T细胞团簇与抗PD-1抗体治疗后的PFS相关的多重解析结果的表。
图19是表示外周血CD4+T细胞团簇的基因表达的伪时间解析及DNA甲基化解析(methylome analysis)的结果的图。
图20是表示各治疗线中的Th1/17及CCR6 SP与PFS的相关的图。
图21是表示肿瘤微小环境中的CD4+T细胞与PFS的相关的图。
图22是外周血中的细胞团簇及肿瘤微小环境(TME)中的细胞团簇的网络解析结果。
图23是表示手术前后的外周血中的细胞团簇的变动的图表。
具体实施方式
以下,示出最佳方式对本发明进行说明。在整个本说明书中,只要没有特别说明,单数形式的表达应理解为也包括其复数形式的概念。因此,只要没有特别说明,单数形式的冠词(例如,在英语的情况下“a”、“an”、“the”等)应理解为也包括其复数形式的概念。另外,只要没有特别说明,本说明书中所使用的术语应理解为以该领域中通常使用的含义来使用。因此,只要没有其他定义,本说明书中所使用的所有专业术语及科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在矛盾的情况下,以本说明书(包括定义)为准。
以下,对在本说明书中所特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容进行适当说明。
在本说明书中,“约”是指后续数值±10%。
在本说明书中,“生物标志物”是指能够作为对通常的生物学过程、病理学过程或治疗干预的药理学响应的指标而客观地测定和评价的特性。
在本说明书中“癌症”或“癌”能互换使用,是指异型性强、增殖比正常细胞快、可破坏性地浸润或转移至周围组织的恶性肿瘤或此种恶性肿瘤存在的状态。在本发明中,癌包括实体癌及造血器官肿瘤,包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾癌、霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)、头颈部癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、大肠癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor)、胰腺神经内分泌肿瘤、皮肤癌等,但并不限定于此。
在本说明书中,“癌症免疫疗法”或“癌免疫疗法”是指使用生物所具有的免疫机构等生体防御机制来治疗癌症的方法。
在本说明书中,“抗肿瘤免疫响应”是指对生体内肿瘤的任意的免疫响应。
在本说明书中,“相关”是指2个事项在统计学上具有显著的相关关系。例如,“与A相关的B的相对量”是指:在发生事项A的情况下,B的相对量在统计学上受到显著影响(例如增加或减少)。
在本说明书中,“免疫活化”是指免疫功能的排除体内异物的功能增大,可通过在免疫功能中起正向作用的任意因子(例如免疫细胞或细胞因子)的量的增大来表示。
在本说明书中,“细胞亚群”是指包含多种特性的细胞的细胞群中的、具有某些共同特征的任意细胞的集合。关于在本技术领域中已知特定名称的细胞亚群,可以使用该术语来提及该特定的细胞亚群,也可以记载任意的性质(例如细胞表面标志物的表达)来提及特定的细胞亚群。
在本说明书中,关于细胞的术语“相对量”能够与“比例”互换地使用。代表性地,术语“相对量”及“比例”是指:相对于形成特定的细胞群(例如CD4+T细胞群)的细胞的数量而言,形成所期望望的细胞亚群(例如CCR4-CCR6+细胞亚群)的细胞的数量。
在本说明书中,“灵敏度(sensitivity)”是指:在从受试体群中选择具有所期望特征的受试体的情况下,所选择的对象中的具有所期望特征的受试体数相对于受试体群中所含的具有所期望特征的总受试体数的比例。例如,在选择受试体群中所含的具有所期望特征的全部受试体的情况下,灵敏度为100%,在选择受试体群中所含的具有所期望特征的受试体的半数的情况下,灵敏度为50%,在完全不选择受试体群中所含的具有所期望特征的受试体的情况下,灵敏度为0%。灵敏度例如以(所选择的对象中的具有所期望特征的受试体数)/(受试体群中所含的具有所期望特征的总受试体数)来确定。灵敏度高的判定是指:在希望找出为某状态(例如癌症免疫疗法的结果为长期生存)的受试体的情况下,此种受试体易于可靠地判定为此种状态。
在本说明书中,“特异度(specificity)”是指:在从受试体群中选择具有所期望特征的受试体的情况下,所选择的对象中的具有所期望特征的受试体数相对于所选择的对象的总数的比例。例如,在从受试体群中所选择的候补全部具有所期望特征的情况下,特异度为100%,在从受试体群的中所选择的候补的半数具有所期望特征的情况下,特异度为50%,在从受试体群中所选择的候补全部不具有所期望特征的情况下,特异度为0%。例如,特异度以(所选择的对象中的具有所期望特征的受试体数)/(所选择的对象的总数)来确定。特异度高的判定是指:不是某状态(例如对癌症免疫疗法为缓解组)的受试体被错误地判断为不是该状态(例如癌症免疫疗法的结果为长期生存)的概率低。
在本说明书中,“无进展生存期(PFS)”是指治疗中或治疗后癌未进展而稳定的状态的期间。即,为病情未进展的期间。在本说明书中,只要是在临床上判断为癌未发展而稳定的状态或病情未发展的期间,则均包括在“无进展生存期(PFS)”中。
在本说明书中,“无效组”是指:在接受癌症治疗时的治疗效果按照RECIST ver1.1进行判定的情况下,在治疗开始后约9周为止的早期判定为病情加重(PD:Progressivedisease)的受试体组。无效组也称为PD组、进展组、NR(Non-responder,无响应)组,在本说明书中可互换使用。
在本说明书中,“部分缓解组”是指:在接受癌症治疗时的治疗效果按照RECISTver1.1进行判定的情况下,判定为部分缓解(PR:Partial response)的受试体组。部分缓解组也称为PR组,在本说明书中可互换使用。
在本说明书中,“相对值”是指某值以其他值作为比较对象而算出的值。
在用于本说明书中的情况下,术语“检测剂”,广义上是指能够检测出目标物质(例如细胞表面标志物等)的所有因子。
在本说明书中,某细胞亚群的“量”包括某细胞的绝对数和细胞群中的比例的相对量。
在本说明书中,“基准”或“基准值”是指用于确定在本说明书中所记载的标志物的量的增减的比较对象的量。在确定某处置(例如癌症免疫疗法)前后的某量的增减的情况下,例如,作为“基准值”,可列举在处置前的该量。另外,作为基准或基准值,也可采取已知显示某数量(例如无进展生存期)的规定的细胞的量或相对量。
在本说明书中,“阈值”是相对于某变化的值而设定的值,是指变化的值在其以上或其以下时赋予某些意义的值。在本说明书中,也称为界限(cut-off)值。
在本说明书中,“无效组阈值”是指:在所给的受试体群中,为了识别无效组与稳定组+缓解组而使用的阈值。对于无效组阈值,按照在选择所给的受试体群中的无效组的情况下实现规定的灵敏度及特异度的方式来选择。
在本说明书中,“缓解组阈值”是指:在所给的受试体群中、或在使用无效组阈值从所给的受试体群中除去无效组后的群体中,为了识别稳定组与缓解组而使用的阈值。对于缓解阈值,按照在所给的受试体群中或在使用无效组阈值从所给的受试体群中除去无效组的群体中在选择缓解组的情况下达到规定的灵敏度及特异度的方式来选择。
在本说明书中,“长期生存”表示无进展生存期为一定期间以上,长期生存者是指例如在纳武单抗疗法后经过一定期间以上病情未加重的患者。对于推定为长期生存的患者,由于可预测通过癌症免疫疗法获得的长期响应性,因此临床医师能够判断应该将癌症免疫疗法以最小限(例如以一次的施用)结束。另外,在本说明书中,只要没有特别说明,能够判断为长期生存的期间可以根据患者的属性(年龄、性别、既往病史等)、癌的种类、投药状况或治疗史等而不同。例如可以为500天以上、400天以上、300天以上、150天以上等,另外,能够判断为高龄者长期生存的期间可以比能够判断为低龄者长期生存的期间短,能够判断为并发其他疾病的患者长期生存的期间可以比能够判断为非此种患者长期生存的期间短。
在本说明书中,“流式细胞仪”是指:对在液体中悬浊的细胞、个体及其他生物粒子的粒子数、各个物理·化学·生物学的性状进行测量的技术。代表性地,流式细胞仪的结果可通过按照以FSC为X轴、以SSC为Y轴的散点图(dot plot)的形式来表现。各细胞以图中的一个点(dot)来表示,它们的位置通过FSC和SSC的相对值来确定。尺寸较小且内部结构简单的淋巴细胞相位于左下部、尺寸大且内部具有颗粒的粒细胞位于右上部、并且尺寸大但内部结构简单的单核细胞位于淋巴细胞与粒细胞之间,制成各自相互分离的群体来表示。另外,流式细胞仪的结果可以用直方图(histogram)或散点图等来表示。
在本说明书中,“效应细胞”是指未受到抗原刺激的原代细胞(naive cell)分化而得到实际上与免疫相关的作用的免疫细胞,特别是在人的辅助性T细胞中主要已知有Th1、Th2、Th17三个种类。能够分别释放出干扰素γ(IFNγ)、白介素17(IL-17)等特征性的细胞因子。另外,Th1表达T-bet、Th2表达GATA-3等在各Th亚群中存在特征性的转录因子,但是还存在表达T-bet和GATA-3两者的细胞,此种细胞表示为“Th1/Th2”或“Th1/2”。在本说明书中,对于“Th1/Th17”或“Th1/17”,表达Th1特征性的T-bet和Th17特征性的RORγt两者。
另外,Th1、Th2、Th17等效应细胞还能根据所表达的趋化因子受体(CCR)的种类来分类,例如Th1表达CXCR3,Th2表达CCR4,Th17表达CCR4及CCR6。Th亚群的分类例如能够按照图1(Annual Review of Immunology,Vol.34:317-334Heterogeneity of Human CD4+TCells Against Microbes,Fig.1)那样表示。在本说明书中,对于“Th1/Th17”或“Th1/17”,表达Th1特征性的CXCR3、和Th17特征性的2个CCR中的CCR6。另外,在本说明书中,CCR6 SP(single positive)是指在基于CCR的Th型分类中目前未被分类的类型,是仅表达CCR4、CCR6及CXCR3中的CCR6的Th亚群。另外,在本说明书中,TP(triple positive)是在基于CCR的Th型分类中目前未被分类的类型,是表达CCR4、CCR6及CXCR3三者的Th亚群。
在本说明书中,“癌症治疗”是指针对癌症患者为了使肿瘤除去或缩小而进行的任意治疗,包括癌症免疫疗法、放射线疗法、分子靶向药治疗、外科手术、细胞转移或这些治疗的任意的组合等,但并不限定于此。
(癌症免疫疗法)
癌症免疫疗法是指使用生物所具有的生物体防御机制来治疗癌症的方法。癌症免疫疗法大致分为:通过强化对癌症的免疫功能进行的癌症免疫疗法和通过抑制癌症的免疫回避功能进行的癌症免疫疗法。进而,癌症免疫疗法包括:激活在体内的免疫功能的能动免疫疗法、和将在体外激活免疫功能或使其增殖的免疫细胞返回体内的受动免疫疗法。本发明的生物标志物评价CD4+T细胞免疫整体的平衡,并且整体上评价肿瘤免疫本身,因此能够广泛地预测癌症免疫疗法整体的治疗效果。
作为癌症免疫疗法的例子,可列举非特异性免疫赋活药、细胞因子疗法、癌症疫苗疗法、树突状细胞疗法、过继免疫疗法、非特异性淋巴细胞疗法、癌症抗原特异性T细胞疗法、抗体疗法、免疫检查点抑制疗法等。虽然并无限定,但是在本说明书的实施例中已经证实了本发明的生物标志物特别是能够准确地预测免疫检查点抑制疗法的治疗效果。
免疫检查点抑制剂的代表性的例子为PD-1抑制剂。作为PD-1抑制剂,可列举作为抗PD-1抗体的纳武单抗(Nivolumab;作为OPDIVOTM销售)及派姆单抗(Pembrolizumab),但并不限定于此。在一优选实施方式中,可选择纳武单抗作为对象。虽然不期望受到理论束缚,但作为优选使用纳武单抗的疗法的理由之一在于:在实施例中表明在使用本发明的生物标志物时能够明确地识别响应性的受试体和非响应性受试体,特别是判明通过特定的阈值能够明确地区分响应性和非响应性。当然,对于其他的PD-1抑制剂也能同程度地利用本发明的生物标志物。
在本发明中,PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂也能与PD-1抑制剂同样使用。
抗PD-1抗体通过解除基于PD-1信号的T细胞活化的抑制来发挥抗癌效果。另外,抗PD-L1抗体也通过解除基于PD-1信号的T细胞活化的抑制来发挥抗癌效果。PD-1抑制T细胞功能的机制虽然未完全解明,但是认为PD-1(programmed death 1)与PD-L1或PD-L2相互作用时,向PD-1的细胞质结构域中补充SHP-1,2(其是酪氨酸脱磷酸化酶的一种),使作为T细胞受体信号传递蛋白的ZAP70失活,从而抑制T细胞的活化(Okazaki,T.,Chikuma,S.,Iwai,Y.et al.:A rheostat for immune responses:the unique properties of PD-1andtheir advantages for clinical application.Nat.Immunol.,14,1212-1218(2013))。认为这是由于:在ITSM基元这一部分中补充SHP-1,2,将附近的T细胞受体(T cell receptor)的近端信号激酶(proximal signaling kinase)进行脱磷酸化,换言之,也可以说从受到抗原刺激的T细胞中消除该“受到抗原刺激”的记忆。
PD-1在浸润于癌组织的杀伤性T细胞及自然杀伤性细胞中高水平地表达。另外,认为在肿瘤上的PD-L1的作用下由基于PD-1的PD-1信号介导的免疫响应减弱。虽然在PD-L1作用下该PD-1信号介导的免疫响应减弱,但是通过抗PD-1抗体来抑制PD-1与PD-L1的相互作用和/或由相互作用产生的信号传递时,可得到抗肿瘤免疫响应的增强效果。
作为免疫检查点抑制剂的其他例,可列举PD-L1抑制剂(例如作为抗PD-L1抗体的阿维鲁单抗、度伐利尤单抗或阿替利珠单抗)。
PD-L1抑制剂与PD-L1侧结合抑制上述的PD-1路径,抑制PD-1与PD-L1的相互作用和/或由相互作用产生的信号传递,产生抗肿瘤免疫响应。因此,虽然不期望受到理论束缚,但是认为在使用本发明的生物标志物时能够明确地识别针对抑制PD-1路径的疗法(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)为响应性的受试体还是非响应性受试体。
作为免疫检查点抑制剂的其他例,可列举CTLA-4抑制剂(例如作为抗CTLA-4抗体的伊匹单抗或曲美木单抗)。
CTLA-4抑制剂将T细胞活化,产生抗肿瘤免疫响应。T细胞通过表面的CD28与CD80或CD86相互作用来活化。然而,即使是已经暂时活化的T细胞,在表面表达的CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)也会以比CD28高的亲和性优先与CD80或CD86相互作用,由此抑制活化。CTLA-4抑制剂通过抑制CTLA-4而防止CD28与CD80或CD86的相互作用被抑制,从而产生抗肿瘤免疫响应。
在另外的实施方式中,免疫检查点抑制剂可以以TIM-3(T-cell immunoglobulinand mucin containing protein-3)、LAG-3(lymphocyte activation gene-3)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)或TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain)等免疫检查点蛋白作为靶标。
虽然认为如上所述的免疫检查点抑制对自体组织的免疫响应,但是在病毒等抗原长期存在于生物体内的情况下,在T细胞中免疫检查点也会增加。针对肿瘤组织,也成为在生物体内长期间存在的抗原,因此通过这些免疫检查点来回避抗肿瘤免疫响应,如上所述的免疫检查点抑制剂使此种回避功能无效,发挥抗肿瘤效果。虽然不期望受到理论限制,但是认为,本发明的生物标志物可评价人的抗肿瘤免疫响应整体的平衡,能够用作用于准确地预测此种免疫检查点抑制剂的治疗效果的指标。
在本发明的一个实施方式种,提供包含免疫检查点抑制剂的组合物。包含免疫检查点抑制剂的组合物通过对利用本发明的生物标志物进行评价并选择的受试体进行施用,从而能够显著地以高概率获得治疗效果。
本发明的包含免疫检查点抑制剂的组合物通常以全身或局部、经口或非经口的形式来施用。
施用量因年龄、体重、症状、治疗效果、施用方法、处理时间等而不同,但通常为例如:按照成人每人每次0.1mg~100mg的范围、1天1次经口施用数次;或者按照成人每人每次0.01mg~30mg的范围、1天1次非经口施用(优选静脉内施用)数次;或者按照1天1小时~24小时的范围静脉内持续施用。当然,施用量因各种条件而发生变动,因此也存在以比上述施用量少的量就足够的情况,另外也存在需要超出该范围的情况。
对于包含免疫检查点抑制剂的组合物,在施用时可采取用于经口施用的内服用固体制剂、内服用液剂及用于非经口施用的注射剂、外用剂、栓剂等剂型。用于经口施用的内服用固体制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等。胶囊剂包括硬胶囊及软胶囊。
对于本发明的组合物,根据需要,1种或1种以上的活性成分(例如针对免疫检查点蛋白的抗体)直接或者与赋形剂(乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等)、粘合剂(羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、偏硅酸铝酸镁等)、崩解剂(纤维素乙醇酸钙等)、润滑剂(硬脂酸镁等)、稳定剂、溶解辅助剂(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合并按照常规方法制剂化来使用。另外,可以根据需要用涂布剂(白糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)被覆,另外,也可以用2个以上的层被覆。进而,也包括如明胶那样的可被吸收的物质的胶囊。
对于本发明的组合物,在为了经口施用而作为内服用液剂制剂化的情况下,包含药学上可接受的水剂、悬浊剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等。在这样的液剂中,一种或一种以上的活性物质在一般所使用的稀释剂(纯化水、乙醇或它们的混液等)中溶解、悬浊或乳化。进而,该液剂可以含有湿润剂、悬浊化剂、乳化剂、甜味剂、风味剂、芳香剂、保存剂、缓冲剂等。
作为用于非经口施用的注射剂,包含溶液、悬浊液、乳浊液及用时溶解或悬浊于溶剂使用的固体的注射剂。注射剂使一种或一种以上的活性物质在溶剂中溶解、悬浊或乳化来使用。作为溶剂,可使用例如注射用蒸馏水、生理食盐水、植物油、丙二醇、聚乙二醇、乙醇之类的醇类等及它们的组合。进而,该注射剂可以包含稳定剂、溶解辅助剂(谷氨酸、天冬氨酸、聚山梨酯80(注册商标)等)、悬浊化剂、乳化剂、无痛化剂、缓冲剂、保存剂等。它们可在最终工序中灭菌或通过无菌操作法来制备。另外,也可以制造无菌的固体制剂、例如冻结干燥品并且在其使用前进行无菌化或溶解于无菌的注射用蒸馏水或其他溶剂来使用。
(癌症)
作为本发明中成为对象的癌,可列举黑素瘤(恶性黑色素瘤)、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、头颈部癌、泌尿器科癌(膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌)、小细胞肺癌、胸腺癌、胃癌、食道癌、胃食道接合部癌、肝癌(肝细胞癌、肝内胆管细胞癌)、原发性脑肿瘤(成胶质细胞瘤、中枢神经系原发淋巴瘤)、恶性胸膜间皮瘤、妇科癌(卵巢癌、子宫颈癌、子宫体癌、)、软部肉瘤、胆道癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、大肠癌等,但是并不限定于此。
(细胞的分级·分离)
用于T细胞分级·分离的样品可按照常规方法从受试体适当地采集。例如,可由受试体的外周血、骨髓、肿瘤组织、造血组织、脾脏、正常组织、淋巴液等进行。关于来自外周血的样品采集,由于是非侵袭性且简便,因此是有利的。
受试体的样品中的T细胞的组成可以由本领域技术人员按照常规方法来测定。通常,关于规定样品中的目标细胞亚群的标志物(例如CD4),能够使用流式细胞仪等来测定呈阳性的细胞的数量。细胞群的组成的测定一般使用流式细胞仪,但是,除此以外,也可以使用对包含细胞的样品的免疫染色、使用抗体阵列的方法、包含细胞的样品中的蛋白表达分析(例如蛋白质印迹、质量分析、HPLC等)、包含细胞的样品中的mRNA表达分析(例如微点阵、下一代测序等)等来进行。
在测量CXCR3+CCR6+CCR4-T细胞亚群、CXCR3-CCR6+CCR4-T细胞亚群等细胞亚群的各自的细胞数时,可以从全体细胞中以实验方法除去除各个细胞亚群以外的细胞来求得。例如,可以如CD4+效应记忆性T细胞分离(Isolation)试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)等那样不使用规定的抗体而从外周血分离相当于目标T细胞亚群的细胞。例如在使用CD4+效应记忆性T细胞分离试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)时,能够不使用CD4抗体和CD62L抗体而从外周血中分离相当于CD4+CD62L低T细胞亚群的细胞。能够预先对全体的活细胞数进行计数并记录,也能够使用该试剂盒对所得的细胞数进行计数并记录。另外,在使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)时,能够不使用抗FoxP3抗体而求出相当于CD4+CD25+CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群的细胞的数量。FoxP3定位在细胞内的核中,因此具有省略用于染色核内分子的步骤的优点。作为同样的试剂盒,还可选择CD4+CD25+CD127dim/-调节性T细胞分离试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)、CD25+CD49d-调节性T细胞分离试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)。在本发明的一个实施方式中,只要能够测量目标T细胞亚群的各自的细胞数,则也能使用任意的试剂盒。
另外,也可以不使用抗体。抗体能够特异性地识别并结合在各个细胞中表达的分子,而且,抗体与在细胞表面上或细胞内表达的分子结合时能够显色以进行检测,针对显色的细胞的数量进行计数。此处,由于上述的在细胞表面上或细胞内表达的分子为蛋白,因此在表达该蛋白的情况下,编码该蛋白的mRNA也在细胞内。即,可以对各个细胞内的mRNA进行调查并调查有无编码所注目的蛋白分子的mRNA。能够对其进行单细胞的基因表达解析、即1细胞水平的mRNA解析。作为单细胞的基因表达解析,可列举例如:1)通过Quartz-Seq进行下一代测序的方法;2)使用Fluidigm C1 System或ICELL8 SIngle-Cell System对细胞进行分离,用SMART-Seq v4进行文库制备的方法;3)用细胞分选器(cell sorter)对细胞进行分离,使用Ambion Single Cell-to-CT试剂盒,用定量PCR进行测量的方法;4)CyTOF SYSTEM(Helios公司)等。
即,取得血液,对活细胞数进行计数,用细胞分选器等对细胞进行分离。对所分离的各个细胞,例如能够使用Ambion Single Cell-to-CT试剂盒、并且用定量PCR法的装置针对特定的基因测量表达量。基于该结果,也能够对各个细胞是属于CXCR3+CCR6+CCR4-T细胞亚群或CXCR3-CCR6+CCR4-T细胞亚群的哪个亚群进行调查、并且对属于各个亚群的细胞的数量进行计数。作为对表达进行调查的基因的候补,包括αβTCR、CD3、CD4、CD25、CTLA4、GITR、FoxP3、STAT5、FoxO1、FoxO3、IL-10、TGFbeta、IL-35、SMAD2、SMAD3、SMAD4、CD62L、CD44、IL-7R(CD127)、IL-15R、CCR7、BLIMP1等,但并不限定于此,能够根据目标细胞亚群进行适当变更。
本发明中的细胞亚群的比例的测定、或者与基准值或阈值的比较可以使用具有规定信号的标准样品来进行。将以产生与规定细胞亚群对应的荧光信号的方式制备的标准(例如附着有荧光色素的粒子)与包含细胞群的样品之间的信号进行比较,通过与标准的比较,能够测定样品中的细胞亚群的量或比例。另外,将以产生与规定基准值或阈值对应的荧光信号的方式制备的标准(例如附着荧光色素的粒子)与包含细胞群的样品之间的信号进行比较,通过与标准的比较,能够判断样品中的T细胞组成中的本发明的标志物的有无或量。
在本发明中,在针对特定的标志物判定高(高表达)或低(低表达)的情况下,本领域技术人员能够使用本技术领域中一般所使用的表达强度的分类基准来进行。例如,针对CD62L,以使用PE标记抗人CD62L抗体时的与10E2的信号对应的信号强度作为边界,能够明确地分割CD62L低和CD62L高(WO2018/147291)。
在本发明的一个实施方式中,本领域技术人员能够适当地识别所示的细胞的表面标志物来对细胞进行分级或计数。
已知CD4 T细胞作为效应细胞会变化为若干的分化状态。包括主要产生IFNγ且与细胞性免疫密切相关的Th1、主要产生IL4、IL-5且与过敏相关的Th2、以及已知与自体免疫疾病等有关且产生IL-17的Th17等。已知分化为各个分化状态的CD4 T细胞表达特征性的趋化因子受体(CCR),能够根据所表达的CCR的种类对Th型进行分类。已知人CD4 T细胞的Th分化与小鼠等相比较为复杂,例如能够如图1那样进行分类(Annual Review of Immunology,Vol.34:317-334Heterogeneity of HumanCD4+T Cells Against Microbes,Fig.1)。
(优选的实施方式)
在本发明的一个方面,提供一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。在一个实施方式中,本发明的方法包括确定来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的相对量的工序,该方法将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。在其他实施方式中,将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
在本发明的另一方面,提供一种方法,其将受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。在一个实施方式中,本发明的方法包括确定来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的量的工序,该方法将上述量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标。在其他实施方式中,将上述量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
在本发明的一个方面,提供一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标,该方法将来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的相对量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症治疗是否为无效组的指标。
在本发明的另一方面,提供一种方法,其将受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量用作用于预测上述受试体对癌症治疗的响应的指标,该方法将来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症治疗是否为无效组的指标。
在本发明的一个实施方式中,通过上述量或相对量为无效组阈值以上,能够表明上述受试体对上述癌症治疗不是无效组。另外,在另一实施方式中,通过上述量或相对量为基准值以上,能够表明上述受试体对上述癌症治疗进行响应或具有癌症治疗后的长期的无进展生存期。
另外,在本发明的另一方面,提供一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标。在一个实施方式中,本发明的方法包括确定来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的相对量的工序,该方法将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标。在其他实施方式中,将上述相对量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
在本发明的另一方面,提供一种方法,其将受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标。在一个实施方式中,本发明的方法包括确定来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的量的工序,该方法将上述量与基准值的比较用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标。在其他实施方式中,将上述量与基准值的比较用作用于预测上述受试体的长期生存的指标。
在本发明的一个方面,提供一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标,该方法将来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的相对量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症免疫疗法是否为无效组的指标。
在本发明的另一方面,提供一种方法,其将受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量用作用于预测上述受试体对癌症免疫疗法的响应的指标,该方法将来自上述受试体的样品中的上述细胞亚群的量与无效组阈值的比较用作用于预测上述受试体对上述癌症免疫疗法是否为无效组的指标。
在本发明的一个实施方式中,通过上述量或相对量为无效组阈值以上,从而能够表明上述受试体对上述癌症免疫疗法不是无效组。另外,在其他实施方式中,通过上述量或相对量为基准值以上,从而能够表明上述受试体对上述癌症免疫疗法进行响应或者具有癌症免疫疗法后的长期的无进展生存期。
在本发明中发现:如实施例中所示那样,受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量或其相对量与癌症免疫疗法、放射线治疗及分子靶向药施用等的癌症治疗后的无进展生存期成比例。因此,在一个实施方式中,受试体的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量或其相对量多能够预测为该受试体对癌症免疫疗法(特别是基于免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法)、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗具有响应性。
因此,在本发明中,将细胞亚群量与适当的基准进行比较,通过比较,也能预测受试体中的癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗中的长期生存(例如在癌症免疫疗法后500天以上的无进展生存期)。例如,样品中的细胞亚群的量和与无进展生存期为500天的CCR4-CCR6+CD4+T细胞亚群的量相当的基准相比有所增加时,表明在受试体中能够预测癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗中的长期生存。或者,样品中的细胞亚群的量与基准相比未增加时,表明在受试体中不能预测癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗中的长期生存。
作为基准或基准值,可列举例如癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗前的受试体的样品中的所对应的细胞亚群的量,但是并不限定于此。除此以外,作为基准,也能使用根据未接受过癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的受试体的样品以实验方法算出的值等。另外,作为基准或基准值,也能采用显示规定的无进展生存期的值。
与基准相比有所增加可通过以下方式来表示,即,癌症免疫疗法后的细胞亚群量为超出基准的量;或者增加了超出基准的1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%;或者增加了超出基准的1.5倍、2倍、3倍、5倍。典型地,只要超出基准的值,则认为比基准有所增加。在基准以实验方法来计算的情况下,从基准值来看而观察到超出适当误差的增加时,可以为与基准相比有所增加。作为适当的误差,可列举例如1倍标准偏差、2倍标准偏差、3倍标准偏差或超出它们的误差。
可以将受试体的CD4+T细胞群中的本发明的特定的细胞亚群的相对量用于长期生存组检测、无效组检测、缓解组检测和/或稳定组检测。这些组的检测可通过将受试体的CD4+T细胞群中的本发明的特定的细胞亚群的相对量与阈值进行比较来达成。
该阈值可以考虑灵敏度及特异度来确定。灵敏度及特异度可以为关于长期生存组检测、无效组检测、缓解组检测或稳定组检测的灵敏度及特异度。在一个实施方式中,本发明的生物标志物可以设定灵敏度、特异度均为100%的阈值。在使用2个以上作为本发明的生物标志物所记载的指标的情况下,可以针对这些指标来分别确定阈值,在需要的情况下,可以按照第1阈值、第2阈值、第3阈值、第4阈值那样来区分使用。
按照使关于长期生存组检测、无效组检测、缓解组检测或稳定组检测的灵敏度超过约90%的方式来确定阈值。在另一实施方式中,按照使关于无效组检测、缓解组检测或稳定组检测的灵敏度达到约100%的方式来确定阈值。进而,在另一实施方式中,按照使关于无效组检测、缓解组检测或稳定组检测的特异度超过约90%的方式来确定阈值。进而在又一实施方式中,按照使关于无效组检测、缓解组检测或稳定组检测的特异度达到约100%的方式来确定阈值。
本发明的生物标志物认为是评价包含CD4+T细胞、树突状细胞和/或CD8+T细胞在内的抗肿瘤免疫响应整体的平衡,是整体上评价肿瘤免疫本身。因此,可以说本发明的方法对广泛的癌症有效。另外,由于本发明评价抗肿瘤免疫响应整体的平衡,因此能够预测不仅对于针对PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂有效、而且对于针对其他免疫检查点起作用的抗癌症治疗也有效。另外,关于放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗,也与生物体内的抗肿瘤免疫协同地治愈肿瘤,因此通过可评价抗肿瘤免疫状态的本发明的生物标志物或使用其的方法,可以说对除癌症免疫疗法以外的癌症治疗也有效。
另外,对于本发明的CCR4-CCR6+细胞亚群、CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群或CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群等特定的细胞群,在存在大量该细胞群的情况下,能够评价为准备了充分发挥原本抗肿瘤效果的T细胞免疫,因此成为其治疗对象的患者所罹患的癌症种类并无特别限定。作为癌症,可以为实体癌或造血器官肿瘤中的任一者,能够预测对如下癌症的癌症治疗的效果,例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾癌、霍奇金氏病、头颈部癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、大肠癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、胃肠道间质瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、皮肤癌等所谓抗肿瘤免疫相关治疗的癌症。
虽然不期望受到理论的束缚,以抗PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制药的抗肿瘤效果可通过预先存在于载癌宿主中的T细胞免疫的状态来确定。利用此,在日本专利第6664684号中,通过进行外周血T细胞团簇解析而得到的%CD62L低/CD4+CD3+T细胞能够预测PD-1抑制药治疗的短期缓解的有无、无进展生存期、总生存期。对于该性能,即使使用与CD62L同样的CCR7(其为向二次淋巴组织的归巢分子)也不能再现,即使通过分类为约120种类的T细胞团簇进行预测性能解析,也没能超越%CD62L低/CD4+CD3+T细胞。
另一方面,如上所述,已知CD4 T细胞作为效应细胞而变化为若干个分化状态。包括主要产生IFNγ且与细胞性免疫密切相关的Th1、主要产生IL4、IL-5且与过敏相关的Th2、以及已知与自体免疫疾病等有关且产生IL-17的Th17等。已知各个分化的CD4 T细胞表达特征性的趋化因子受体(CCR),能够根据所表达的CCR的种类对Th型进行分类。已知人CD4 T细胞的Th分化与小鼠等相比较为复杂,例如能够如图1那样进行分类(Annual Review ofImmunology,Vol.34:317-334Heterogeneity of Human CD4+T Cells Against Microbes,Fig.1)。
在本发明中,利用CD62L低CD4+CD3+T细胞与抗肿瘤免疫密切相关这一点,将CD62L低CD4+CD3+T细胞进一步通过CCR型进行Th分类,对与抗肿瘤效果最密切相关的Th团簇进行解析,由此得到新的生物标志物。在一个实施方式中,作为评价抗肿瘤效果的数值,使用了Pembrolizumab治疗后的无进展生存期(PFS)。
另外,如上所述,本发明的方法能够通过CD62L低CD4+CD3+T细胞中特定的Th团簇的存在量来评价受试体中的抗肿瘤免疫的状态。免疫状态与对该受试体的治疗效果相关联,因此,通过本发明的方法,不仅能够预测对癌症免疫疗法的效果,而且还能预测对放射线治疗、分子靶向药施用以及基于外科手术的癌症治疗的效果。
在本发明的一个实施方式中,除了CCR4-CCR6+细胞亚群以外,还能进一步使用CXCR3+细胞亚群。该细胞亚群为CCR4-CCR6+CXCR3+,以Th型进行分类,则分类为Th1/17。
在本发明的一个实施方式中,除了CCR4-CCR6+细胞亚群以外,还能进一步使用CXCR3-细胞亚群。该细胞亚群为CCR4-CCR6+CXCR3-,以Th型进行分类,则分类为CCR6 SP(single positive)。
进而,在本发明的其他实施方式中,除了CCR4-CCR6+细胞亚群以外,还能进一步使用FoxP3-细胞亚群。该细胞亚群为CCR4-CCR6+FoxP3-,以Th型进行分类,则为Th1/17和CCR6SP的组合。
进而,在本发明的其他实施方式中,除了CCR4-CCR6+细胞亚群以外,还能进一步使用CD62L低细胞亚群。或者,除了CCR4-CCR6+细胞亚群以外,还能进一步使用CD45RA-细胞亚群。
在本发明中,如上所述,利用CD62L低CD4+CD3+T细胞与抗肿瘤免疫密切相关这一点,将CD62L低CD4+CD3+T细胞进一步通过CCR型进行Th分类,对与抗肿瘤效果最密切相关的Th团簇进行解析,由此得到新的生物标志物。而且,本发明的发明人们为了对该CD62L低这一性状的意义进行调查而进行了基于single cell RNAseq的TCR库解析。其结果可知:对于外周血循环中CD62L低分级,由选择性极高的微量克隆构成,利用放射线治疗释放癌抗原后只有CD62L低T细胞克隆增加。由此,本发明的发明人们发现:CD62L低T细胞由癌抗原特异性T细胞克隆构成,担负着用于发挥生物体内抗肿瘤效果的重要作用。
另外,在本发明中,在通过如图2所示的CyTOF的viSNE解析对CD4+细胞进行映射的情况下,找出CD62L低CD4+T细胞中所含的5种Th分类(Th1、Th1/17、Th17、CCR6 SP、TP)中哪些团簇对抗肿瘤免疫较为重要。虽然不期望受到理论的束缚,但由于在癌抗原释放中进行反应并克隆增殖的T细胞仅出现在CD62L低CD4+T细胞中,因此CD62L低CD4+T细胞中所含的5种Th分类的任一者担负着抗肿瘤效果。因此,在本发明的一个方面,提供一种方法,其中,从CD62L低CD4+T细胞所含的5种Th分类中,选择能够适当地评价各个癌症种类或与该癌症种类治疗法对应的免疫状态的团簇或细胞亚群,使用该细胞亚群的存在量或相对量,用作用于预测受试体对癌症治疗的响应的指标。
在本发明中发现:如实施例所示,CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+和CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+两个团簇与无进展生存期显著相关。虽然不期望受到理论的束缚,但是,在CyTOF的viSNE解析中,如图2所示,这两个团簇相邻存在,被认为是各种分子表达近似的团簇。由使用了Single cell RNAseq的结果也判明:虽然具有不同的基因表达,但是具有近似的基因表达图谱。另一方面,这两个团簇的基因表达图谱与Th1、Th17细胞不同(图15)。因此认为:这两个团簇虽然与Th1、Th17细胞不同,但是处于发挥彼此近似的细胞功能的分化状态。另外,在本发明中发现:如实施例所示,相对于CD4+细胞全体的CXCR3+CCR6+CCR4-及CXCR3-CCR6+CCR4-的细胞比率与CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-、CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-及CD62L低CD4+细胞比例之间显著相关(图16),由此发现:即使不使用CD62L而使用CXCR3+CCR6+CCR4-及CXCR3-CCR6+CCR4-的细胞比率,也能得到与CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+及CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞比例同等的预测性能。
在抗肿瘤免疫响应中,认为T细胞组成是重要的,结果CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+细胞、CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞具有CD62L低CD4+T细胞中特有的基因表达图谱,T细胞受体克隆型也不同于其他CD62L低CD4+T细胞。对于CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+细胞、CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞中特有的基因表达,担负着对于辅助由树突状细胞等抗原呈递细胞介导的CD8+T细胞的启动(priming)、迁移能力、肿瘤浸润能力、杀细胞功能所必须的CD4+T细胞功能,特有的克隆型具有癌抗原特异性。如果没有准备具有此种细胞功能和抗原特异性的CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+细胞和/或CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞,则即使施用免疫检查点抑制药,也不能充分地进行抗肿瘤免疫响应。因此,CD4+T细胞中的CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+细胞和/或CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞的比例成为预测由免疫检查点抑制药带来的抗肿瘤效果的指标。在本发明中,数理学网络解析的结果发现:显示同样的CCR表达图谱但表达CD62L的CD62L高CXCR3+CCR6+CCR4-细胞和/或CD62L高CXCR3-CCR6+CCR4-细胞相对于CD4+T细胞的比例与CD62L低CXCR3+CCR6+CCR4-CD4+细胞和/或CD62L低CXCR3-CCR6+CCR4-CD4+细胞比例具有一定的相关关系。其结果表明,能够成为由CD4+细胞中的CXCR3+CCR6+CCR4-及CXCR3-CCR6+CCR4-全体的细胞之和即CCR4-CCR6+细胞亚群的量或相对量以具备同等的预测性能的状态预测通过包含免疫检查点抑制药在内的癌症治疗得到的抗肿瘤效果的指标。
在本发明的一个方面,本发明为一种方法,其探索或确定用于预测对癌症治疗(例如基于免疫检查点抑制剂进行的治疗)的响应的指标,该方法可包括:
·使该癌症治疗前的受试体的CD62L低CD4+T细胞中的亚群与该受试体对癌症治疗的响应相关的工序;和
·基于该相关,将与该癌症治疗相关的亚群作为用于预测对该癌症治疗的响应的指标的工序。
在优选的实施方式中,该亚群可以为5种Th分类、即Th1(CXCR3+CCR6-CCR4-)、Th1/17(CXCR3+CCR6+CCR4-)、Th17(CXCR3-CCR6+CCR4+)、CCR6 SP(CXCR3-CCR6+CCR4-)、TP(CXCR3+CCR6+CCR4+)。
即,如上所述,本发明能够提供一种方法,其中,从CD62L低CD4+T细胞所含的5种Th分类中选择能够适当地评价各个癌症种类或与该癌症种类治疗法对应的免疫状态的团簇或细胞亚群,使用该细胞亚群的存在量或相对量,用作用于预测受试体对癌症治疗的响应的指标。除了5种Th分类以外、或它们的代替地、作为能够适当地评价各个癌症种类或与该癌症种类治疗法对应的免疫状态的团簇或细胞亚群,包括CD62L高CD4+T细胞所含的6种Th分类、即CD62L高Th1(CXCR3+CCR4-CCR6-)细胞亚群、CD62L高Th1/17(CXCR3+CCR4-CCR6+)细胞亚群、CD62L高CCR6 SP(CXCR3-CCR4-CCR6+)细胞亚群、CD62L高Th17(CXCR3-CCR4+CCR6+)细胞亚群、CD62L高Th2(CXCR3-CCR4+CCR6-)细胞亚群、CD62L高TN(CXCR3-CCR4-CCR6-)细胞亚群。
进而,作为通过加入Th分类亚群而能够适当评价免疫状态的效应性CD4+T细胞亚群,可列举CCR7+CD62L低CD4+T细胞亚群、PD1+CCR7+CD62L低CD4+T细胞亚群、LAG-3+CCR7+CD62L低CD4+T细胞亚群、CD45RA-Foxp3-CD4+T细胞亚群,作为控制性T细胞亚群,可列举CD127+CD25+CD4+T细胞亚群、CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群、Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群,作为效应性CD8+T细胞亚群,可列举CD62L低CD8+T细胞亚群。
(试剂盒)
在本发明的一个方面,提供一种试剂盒,其包含针对细胞表面标志物的检测剂,所述试剂盒用于预测受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应。本发明人发现受试体的T细胞所表达的这些细胞表面标志物与受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的长期无进展生存有关。由此可理解为:这些包含针对细胞表面标志物的检测剂的试剂盒可有效用于预测对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的长期无进展生存。该试剂盒可包含针对下述分子的1个或多个检测剂,该分子适合用于检测本说明书所记载的细胞亚群。此种检测剂的组合能够用于确定受试体的T细胞组成。此种试剂盒能够用于测定受试体中的、作为本说明书所记载的新型生物标志物的特定的细胞亚群的比例。
在本发明的一个实施方式中,本发明的试剂盒通过将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量与基准值的比较用作用于预测该受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应的指标,从而能够预测受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应。在其他实施方式中,本发明的试剂盒通过将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量与无效组阈值的比较用作该受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗是否为无效组的指标,从而能够预测受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应。
在本发明的一个实施方式中,本发明的试剂盒能够包含针对CD4、CCR4及CCR6的检测剂,在其他实施方式中,本发明的试剂盒还能进一步包含针对CXCR3、CD62L的检测剂。在一个实施方式中,检测剂为抗体。优选使抗体被适当地标记而容易进行标志物的检测。
在一个实施方式中,受试体的T细胞的组成为从受试体得到的样品中的T细胞的组成,优选样品为外周血样品。本发明中所提供的生物标志物能够使用外周血样品来测定,因此具有非侵袭性、廉价且可经时性地施行这样的临床应用中的巨大优越性(统计学)。
在一个实施方式中,癌症免疫疗法包括免疫检查点抑制剂的施用。本发明的生物标志物特别是能够准确地预测受试体针对此种癌症免疫疗法的响应。
在本发明的优选实施方式中,在受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗不进行响应的情况下,例如CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的量或相对量低于基准值的情况下,可研究应该进行追加治疗的情况。在该情况下,作为追加的治疗,除了所施用的癌症免疫疗法以外,还能进行不是癌症免疫疗法的治疗(例如化学疗法、放射线疗法、外科程序、温热疗法等)、或者进行进一步的癌症免疫疗法(例如免疫检查点抑制药、过继细胞转移等)。代表性地,针对已经施用的免疫检查点抑制药,可研究其他化学疗法药物或第2免疫检查点抑制药的并用。针对组合治疗,可进行本申请说明书中记载的任意治疗。
在一个实施方式中,免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。作为PD-1抑制剂,可列举抑制PD-1与PD-L1相互作用(例如结合)的抗PD-1抗体、例如纳武单抗、派姆单抗等抗PD-1抗体,但是并不限定于此。作为PD-L1抑制剂,可列举抑制PD-1与PD-L1相互作用(例如结合)的抗PD-L1抗体、例如度伐利尤单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗等抗PD-L1抗体,但是并不限定于此。
本发明的另一方面提供一种方法,其中,使用受试体的T细胞的组成来预测受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应,对具有癌症的受试体进行治疗。或者,提供在具有特定T细胞组成的受试体中治疗癌症的方法、或者用于其的组合物。已知每个受试体对癌症免疫疗法、特别是免疫检查点抑制疗法的响应性的差别较大,通过本发明的生物标志物选择受试体来实施癌症免疫疗法,这能够显著地提高发挥肿瘤缩小等治疗效果的概率。
对受试体(其使用包括上述内容的本说明书所记载的方法,显示出对于癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等的癌症治疗进行响应)实施癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗。癌症免疫疗法可以为本说明书中记载的任意的癌症免疫疗法。
在本发明的另外的实施方式中,提供一种方法,其是治疗具有癌症的受试体的方法,该方法包括如下工序,即,确定来自该受试体的样品中的、CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量的工序;在CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量比基准值高的情况下,判定为上述受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗进行响应的工序;以及,在判定上述受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗进行响应的情况下,对上述受试体实施上述癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的工序。
本发明的另一方面为一种组合物,其包含免疫检查点抑制剂,所述组合用于在已预测为对癌症免疫疗法进行响应的受试体中治疗癌症。在本发明中,还可提供一种制品,其包含添附文件和免疫检查点抑制剂。添附文件可以记载有按照本说明书所记载的方法的任意一个或多个工序来使用免疫检查点抑制剂的指示。
本发明的一个实施方式为一种组合物,其特征在于,其是用于在已预测为对癌症免疫疗法进行响应的受试体中治疗癌症的、包含免疫检查点抑制剂的组合物,上述受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量为基准值以上。
在一个实施方式中,组合物包含PD-1抑制剂。PD-1抑制剂例如为抑制PD-L1与PD-1结合的抗PD-1抗体,例如可以为纳武单抗或派姆单抗。在其他实施方式中,组合物包含PD-L1抑制剂。PD-L1抑制剂例如为抑制PD-L1与PD-1结合的抗PD-L1抗体,例如可以为度伐利尤单抗、阿替利珠单抗或阿维鲁单抗。在包含这些免疫检查点抑制剂的组合物施用于通过本发明的生物标志物选择的受试体的情况下,以特别高的概率发挥治疗效果。本发明的组合物可以与任意的其他药剂并用。
在本发明的一个实施方式中,提供一种方法,其将接受了癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的受试体中的细胞亚群的组成用作用于预测对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应的指标。方法包含对样品中的细胞亚群的组成进行分析的工序。细胞亚群的组成的分析可通过记载于本说明书的方法或对本领域技术人员公知的任意方法来进行。方法可以为体外(in vitro)方法或in silico方法。在本发明的一个实施方式中,通过细胞亚群的量与适当基准的比较,从而显示受试体中有无免疫活化。特别是,细胞亚群能够使用CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群。
(细胞疗法及用于其的目标细胞的增殖)
本发明人发现:在CD4+T细胞群中的、CCR4-CCR6+细胞亚群、CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群或CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群等特定的细胞群的比例与癌症免疫疗法(特别是利用癌症免疫检查点抑制剂进行的癌症免疫疗法)、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应之间存在明确的相关关系,具体而言,为了发挥通过癌症免疫检查点抑制剂得到的抗肿瘤效果,必须含有大量特定的细胞亚群(其为发挥抗肿瘤效果的T细胞)。
虽然不期望受到理论限制,但是由该见解可理解为:在CD4+T细胞群中大量地包含CR4-CCR6+细胞亚群(特别是CD62L低CCR4-CCR6+细胞亚群)、CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群(特别是CD62L低CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群)或CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群(特别是CD62L低CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群)等特定细胞群的癌症患者的情况下,准备了充分发挥原本抗肿瘤效果的T细胞免疫,同时由于因免疫检查点分子表达而导致的抗原识别信号减弱,故而进行了免疫回避。另一方面,在没有大量包含上述特定细胞群的患者中,即使通过免疫检查点抑制剂来阻断免疫逃避机构,也无法期望能够辅助CD8+T细胞功能的CD4+T细胞功能的恢复,结果不能发挥令人满意的抗肿瘤效果。
综上所述,针对在CD4+T细胞群中特定细胞群(例如,CD62L低CCR4-CCR6+细胞亚群、CD62L低CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群、或CD62L低CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群、或CCR4-CCR6+细胞亚群、CCR4-CCR6+CXCR3+细胞亚群或CCR4-CCR6+CXCR3-细胞亚群等)少因此不能发挥由免疫检查点抑制剂得到的抗肿瘤效果的患者,通过施用上述特定细胞群,能够发挥/增强由免疫检查点抑制剂得到的抗肿瘤效果。
因此,本发明的另一方面为一种用于通过移入特定的细胞来改善或维持·继续癌症免疫疗法治疗效果的方法或用于其的组合物。
发现CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞和/或CCR4-CCR6+CD4+T细胞对于受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应是至关重要的,通过使用此种T细胞,从而能够改善或维持受试体对癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗的响应性。本发明的一个实施方式为一种组合物,其包含CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞或CCR4-CCR6+CD4+T细胞。对于CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞或CCR4-CCR6+CD4+T细胞、或者包含其的组成物,可有效用于与癌症免疫疗法、放射线治疗、分子靶向药施用及外科手术等癌症治疗并用。
例如,包含CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞或CCR4-CCR6+CD4+T细胞的组合物的制造方法可以包括从来自人的T细胞群中纯化CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞或CCR4-CCR6+CD4+T细胞的工序。纯化工序可以包括从CCR6+CD4+T细胞中除去CD62L高细胞、CCR4+细胞的步骤(负筛选)。使用抗体和/或磁珠、分选法等并且通过负筛选对CCR4-CCR6+CD4+T细胞进行纯化时,不会在想要使用的细胞上残留抗体、磁珠等夹杂物,故优选。CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞可如下获得,即,从对CD62L高细胞、CCR4+细胞进行了负筛选的细胞群中通过分选对CCR6+细胞进行正筛选来得到。
T淋巴细胞可按照公知的技术进行收集、并且通过流式细胞仪和/或免疫磁选择等对抗体的亲和结合等公知技术来进行浓缩或消除。浓缩和/或消除步骤后,所期望的T淋巴细胞的体外增殖可按照公知技术(可列举Riddell等的美国专利第6,040,177号中记载的技术,但是并不限定于此)或本领域技术人员显而易见的变更技术来执行。
例如,所期望的T细胞群或亚群可以通过以下方式进行增殖,即,在体外将最初的T淋巴细胞群加入至培养基中,之后向该培养基中加入饲养细胞(例如,使得所产生的细胞群相对于所应增殖的最初的群体中的1个T淋巴细胞含有至少约5个、10个、20个或40个、或者其以上的饲养细胞),将其培养物进行(例如充分使T细胞的数量增加的时间)培养,从而使其增殖。典型而言,培养物能够在适合于T淋巴细胞生长的温度等条件下进行培养。关于人T淋巴细胞的生长,例如,通常情况下温度为至少约25℃,优选为至少约30℃,更优选为约37℃。
细胞可以按照本说明书中所记载的方法或本技术领域周知的方法进行分离和/或增殖后,根据需要进行保存,之后施用于受试体。
本发明的包含细胞的组合物中的目标细胞(例如CCR4-CCR6+CD4+T细胞)的量可以由本领域技术人员适当地确定以发挥所想要的效果,例如可以为至少2×108个,优选为至少6×108个,更优选为至少2×109个。
对于本说明书中所记载的包含细胞的组合物,除了目标细胞(例如CCR4-CCR6+CD4+细胞)以外还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。在本说明书中“药学上可接受”是指:为了在动物中使用、更具体而言为了在人中使用,而得到政府的监管局批准、或者被列举在药典或其他受到广泛认可的药典中。在本说明书中所使用的“载体”是指将治疗剂一起施用的培养液、移入液、灌流液、稀释剂、佐剂(adjuvant)、赋形剂或媒介物(vehicle)。本发明的包含细胞的组合物包含细胞作为主成分,因此,作为载体,优选为培养液、移入液、灌流液等可维持细胞的载体。例如,当在静脉内施用药物组合物的情况下,生理食盐水及水性葡萄糖(dextrose)是优选的载体。优选将生理食盐水溶液以及水性葡萄糖及甘油溶液用作能注射的溶液的液体载体。在经口给药的情况下,水为优选的载体。适当的赋形剂包括轻质无水硅酸、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、小麦粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、脱脂粉乳、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在理想的情况下,组合物还能含有少量的湿润剂或乳化剂、或者pH缓冲剂。这些组合物还能以溶液、悬浊物、乳液、片剂、药丸(pill)、胶囊、粉末、缓释配合物等的形式获得。也可以使用传统的粘合剂及载体例如三甘油酯,以栓剂的形式配合组合物。经口配合物也能包括药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等标准的载体。适当的载体的例子记载于E.W.Martin,Remington’s PharmaceuticalSciences(Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)中。对于上述组合物,同时含有适量的载体和治疗有效量的疗法剂、优选纯化型的疗法剂以便能够以适合施用于患者的形式提供。配合物必须适合于施用方式。除此以外,可以包含例如表面活性剂、赋形剂、着色料、着香料、保存料、稳定剂、缓冲剂、悬浊剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。
(一般技术)
在本说明书中所使用的分子生物学方法、生化学方法、微生物学方法是在该领域中周知且惯用的方法,例如记载于Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor及其3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.AssociatES and Wiley-Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,AcademicPress;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、增刊实验医学“基因导入&表达解析实验法”羊土社、1997等中,其相关部分(可以是全部)作为参考援引入本说明书。
在本说明书中,“或”在能够采用文章中所列举的事项的“至少1个以上”时使用。“或者”也同样。在本说明书中,在明确记载为“2个值”的“范围内”的情况下,该范围也包括2个值本身。
对于在本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献,其整体与各自具体的记载程度相同地作为参考被引用在本说明书中。
以上,为了便于理解而示出优选的实施方式来说明本发明。以下,基于实施例来说明本发明,但是,上述的说明及以下的实施例仅以例示的目的来提供,并不以限定本发明的目的来提供。因此,本发明的范围并不限定于本说明书中具体记载的实施方式和实施例,而仅受到权利要求书的限定。
实施例
以上,为了便于理解而示出优选的实施方式来说明本发明。以下,基于实施例来说明本发明,但是,上述的说明及以下的实施例仅以例示的目的来提供,并不以限定本发明的目的来提供。因此,本发明的范围并不限定于本说明书中具体记载的实施方式和实施例,而仅受到权利要求书的限定。
(实施例1:抗PD-1抗体的治疗效果和T细胞群组成)
1.目的
在本实施例中,利用CD62L低CD4+CD3+T细胞与抗肿瘤免疫密切相关这一点(日本专利第6664684号),将CD62L低CD4+CD3+T细胞进一步通过CCR型进行Th分类,对与抗肿瘤效果最密切相关的Th团簇进行解析。
2.方法及材料
从来自接受派姆单抗(Pembrolizumab)治疗之前的患者的外周血中,使用Vacutina Spitz TM对单核细胞进行分离,并且进行了冻结保存(液体氮)。使用所保存的外周血单核细胞(PBMC),进行了流式细胞仪及质谱流式细胞术解析。作为对抗肿瘤效果进行评价的数值,使用了派姆单抗治疗后的无进展生存期(PFS)。
3.结果
在图3中示出通过质谱流式细胞术(CyTOFTM)进行映射解析的结果。其结果判明:由下述表1所示的Th团簇构成CD62L低分级和CD62L高CD45RA-分级。CD62L高CD45RA+分级被认为是未进行效应性分化的原代细胞群,未确认到CXCR3、CCR4及CCR6的表达(表1)。
[表1]
在CD62L低分级(effector)中与无进展生存期(PFS)显著相关的是CXCR3+CCR6+CCR4-(Th1/17)和CXCR3-CCR6+CCR4-(CCR6 SP)这两者(表2)。
[表2]
在CyTOF的viSNE解析中,这2个团簇相邻地存在,被认为是各种分子表达近似的团簇。这2个团簇相加在一起的细胞比率与PFS极其相关,P<0.0001、r2=0.9083(图4)(作为发现队列(Discovery Cohort),13例非小细胞肺癌的结果)。该数值超出与%CD62L低/CD4+的相关。需要说明的是,CD62L低分级由表1所示的Th团簇构成,因此判明能够转换为%Th1/17+%CCR6 SP=%CCR6+CCR4-。
在CD62L高CD45RA-分级(central memory)中还存在Th1/17及CCR6 SP型的团簇,因此对除去了原代细胞的CD45RA-分级全体中的Th团簇比例与PFS的相关进行了解析,结果Th1/17和CCR6 SP团簇与PFS良好地相关(表2)。显示最佳相关的是Th1/17和CCR6 SP团簇相加的细胞比例。
在CD62L高CD45RA+原代CD4 T细胞分级中完全未确认到分化的Th团簇,CD62L低分级、CD62L高CD45RA-分级也仅由表1所示的Th团簇构成,因此判明CD4+CD3+T细胞全体中的Th1/17和CCR6 SP团簇相加的细胞比例近似地以%CCR6+CCR4-/CD4+来表示。在实际中,%CCR6+CCR4-/CD4+与PFS的相关关系为P<0.0001、r2=0.7920,虽然与%CD62L低CCR6+CCR4-/CD4+相比r2差,但是为不逊色于%CD62L低/CD4+与PFS的相关系数的数值(图5)。需要说明的是,使用通常的流式细胞仪解析得到的%CCR6+CCR4-/CD4+也与由CyTOF得到的数值相关,与PFS(P=0.0002,r2=0.8003)相关(图6)。
对派姆单抗治疗后变化进行了解析,结果仅在缓解例中确认到Th1/17、CCR6 SP细胞比例的显著增加。
由以上结果可知:派姆单抗治疗前的PBMC解析的结果为仅在Th1/17和CCR6 SPCD4+T细胞团簇中确认到与PFS相关。另外,%CD62L低CCR6+CCR4-/CD4+显示出超出%CD62L低/CD4+的、与PFS极好的相关。进而,可知%CCR6+CCR4-/CD4+也显示出与%CD62L低/CD4+同程度的、与PFS的相关。
另外,对派姆单抗单剂治疗后的无进展生存期与基于CyTOF的Th解析结果的相关进行了调查,结果为:如以下表3及图7所示,Th1/17和CCR6 SP CD4+T细胞团簇与派姆单抗单剂治疗后的无进展生存期显示出高相关。
[表3]
派姆单抗单剂治疗后的无进展生存期与Th解析结果的相关(CyTOF)
另外,对%CD62L低CD4与基于CyTOF得到的%Th团簇的相关进行了调查,结果如以下的表4所示,Th1/17及CCR6 SP细胞团簇的存在比与CD62L低细胞团簇的存在比相关(图8、9)。
[表4]
%CD62L低CD4和%Th团簇(CyTOF)
Th1/17、CCR6单阳性细胞团簇的存在比与CD62L低细胞团簇存在比相关
4.结果的意义
在本实施例中发现:通过测定相对于CD4 T细胞全体的CCR6+CCR4-细胞比例,从而能够比使用CD62L时更简便地得到与CD62L低CD4+细胞比例同等的预测性能。作为血液检体,即使使用不进行Ficoll分离等而仅进行固定(fixation)的简便的检体,也能进行解析,能够在全世界进行解析。
5.讨论
据报道T-bet+Th1型(CXCR3+)CD4 T细胞对于抗肿瘤免疫至关重要,通过本发明,明确了CCR6+CCR4-这样的以往未被定义的Th分级的重要性。在CCR6+CCR4-分级中CXCR3+团簇表达T-bet,因此不会否定T-bet+分级的重要性,但重大发现是CXCR3+CCR4-CCR6-这样的经典(classical)的Th1分级与抗肿瘤效果不具有关联。
在CCR6+CCR4-分级中包含CCR7阴性和阳性细胞两者。因此,在仅使用人T细胞分类中所常用的CCR7和CD45RA进行解析的情况下,不能够对该团簇进行鉴定。
另外,即使采用使用小鼠如本发明人那样对CD62L的细胞分级进一步研究这样的方法,小鼠T细胞也会分别分化为Th1、Th2、Th17,几乎不具有Th1/17分级,因此不能对CCR6+CCR4-分级的重要性进行解析。
在本发明中,对人CD62L低CD4 T细胞团簇进行了更详细地解析,这成为CCR6+CCR4-CD4 T细胞团簇在抗肿瘤免疫中的重要性发现的基础。
(实施例2:Th团簇与总生存期的相关关系)
如实施例1所示,可知:在Th团簇中Th1/17和CCR6 SP CD4+T细胞团簇与派姆单抗单剂治疗后的无进展生存期高相关。因此,对Th团簇与总生存期的相关关系进行了调查。将其结果示于图10中。如图10所示,可知:Th1/17和CCR6 SP CD4+T细胞团簇不仅与无进展生存期良好地相关,而且与总生存期良好地相关。
另外,在35个病例的肺癌中使用流式细胞仪进行了解析,结果可知:如图11所示,CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇与其他以往的标志物相比,与无进展生存期及总生存期也显示为高相关。
(实施例3:基于灵敏度及特异度的评价)
关于CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇,通过ROC解析对预测长期生存病例的性能进行评价,将其灵敏度及特异度的结果示于图12中。可知:在使用CCR6+CCR4-CD4+比率的情况下,为相当好(在阈值为4.4时,灵敏度为100%、特异度为77.3%)的生物标志物(图12)。
(实施例4:局部进展非小细胞肺癌化学放射线治疗后PFS)
接着,在局部进展非小细胞肺癌患者中,对能否通过CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇的存在量来预测化学放射线治疗后的PFS进行了调查。将治疗前的Th1/17(CCR6+CCR4-CXCR3+)分级的存在量与PFS的相关结果示于图13中。如图13所示,可知CCR6+CCR4-CD4T细胞的存在量与化学放射线治疗后的PFS极其相关。由此还可知:CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇广泛地反映受试体的免疫状态,因此不仅能够预测通过免疫检查点抑制剂进行的治疗的预后,而且还能预测放射线治疗后的预后。
(实施例5:EGFR-TKI效果预测)
接着,在局部进展非小细胞肺癌患者中,对能否通过CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇的存在量来预测EGFR-TKI治疗后的PFS进行了调查。将治疗前的CCR6+CCR4-分级的存在量与PFS的相关结果示于图14中。如图14所示,可知CCR6+CCR4-CD4T细胞的存在量与EGFR-TKI治疗后的PFS极其相关。由此还可知:CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇广泛地反映受试体的免疫状态,因此不仅能够预测通过免疫检查点抑制剂进行的治疗的预后,而且还能预测用分子靶向治疗药治疗后的预后。即使是分子靶向治疗药,也通过与免疫共同作业来控制肿瘤,因此利用CCR6+CCR4-CD4T细胞团簇来评价免疫的状态,由此能够预测预后。
(实施例6:改善或持续维持癌症免疫疗法治疗效果的细胞疗法)
在开始基于癌症免疫疗法的治疗之前,从受试体的外周血样品纯化CD62L低CCR6+CCR4-CD4+T细胞,在液体氮下进行冻结保存。将经冻结保存的CD62L低CCR6+CCR4-CD4+T细胞解冻,在活体外(ex vivo)赋予伪抗原刺激后,在IL2存在下进行培养,由此使其增殖。将同一患者的外周血CD16+细胞在GMCSF和IL4存在下进行培养,将所得的树突状细胞和经放射线照射的患者癌细胞进行共培养,掺入癌抗原。将掺入癌抗原的树突状细胞和在活体外增殖的CD62L低CCR6+CCR4-CD4+T细胞进行共培养,由此对癌抗原特异性细胞因子的产生进行评价。
为了维持癌症免疫疗法的效果,在该效果不充分或减弱的情况下,将该在活体外增殖的CD62L低CCR6+CCR4-CD4+T细胞对患者经静脉施用。
在判定受试体对癌症免疫疗法呈响应性的情况下,例如,在CCR6+CCR4-CD4+T细胞的比率高的情况下,实施通过如纳武单抗那样的抗PD-1抗体进行的治疗等癌症免疫疗法。在治疗中监测受试体的CD4+T细胞组成。
此处,在受试体的CD4+T细胞组成中,在CCR6+CCR4-CD4+T细胞比率等指标降低、非响应性的免疫状态的情况下,通过移入在活体外增殖的CCR6+CCR4-CD4+T细胞,从而恢复至原来的免疫状态,使癌症免疫疗法的效果得以持续。
通过仅培养并移入CCR6+CCR4-CD4+T细胞,从而能够抑制保存·培养成本,与每两周仅持续使用抗PD-1抗体等免疫检查点抑制剂的方式相比更为经济。
另外,在受试体的CD4+T细胞组成中,通过向判定为CCR6+CCR4-CD4+T细胞比率等指标低且非响应性的受试体中移入从受试体分离并在活体外增殖的CCR6+CCR4-CD4+T细胞,从而使其变化为响应性的免疫状态,之后,进行基于如纳武单抗那样的抗PD-1抗体的癌症免疫疗法。由此,即使在以往未受到基于抗PD-1抗体的癌症免疫疗法的恩惠的受试体中,也能产生癌症免疫疗法的抗肿瘤免疫响应。
(实施例7:Th1/17及CCR6 SP的PFS相关)
如实施例1所示,可知:在Th团簇中,Th1/17和CCR6 SP CD4+T细胞团簇与无进展生存期显示为高相关。针对这一点,将图2制作成示意图、并且将在各区段表达的趋化因子受体归纳于表中制成图17。由该图明确可知:用虚线包围的部分为CD62L低的细胞群,其中,存在趋化因子受体的表达不同的4个团簇(C、D、E、H)。其中的区段D为CXCR3+CCR4-CCR6+所示的Th1/17,区段H为CXCR3-CCR4-CCR6+所示的CCR6 SP。
如上述所示,为了调查这四个团簇中哪个团簇与抗肿瘤效果相关联而对它们与无进展生存期的相关性进行确认,可知Th1/17和CCR6 SP至关重要。将确认其得到的结果示于图18中。在图18中列出基于趋化因子受体表达得到的外周血CD4+T细胞团簇与抗PD-1抗体治疗后的PFS的相关性。对所有的CD4+T细胞团簇与PD-1抑制剂治疗效果的相关性进行了解析。为了避免多重性,FDR设为0.05,将比其小的P值设为有显著性。由该图还可知:Th1及Th17团簇细胞数与PFS及OS均不显著地相关。在CD62L低的细胞群中,Th1/17及CCR6 SP T细胞团簇这2个CD4+T细胞团簇与PFS及OS显示显著的正相关。
图19为对该Th1/17和CCR6 SP这2个外周血CD4+T细胞团簇进行基因表达解析和甲基化解析的结果。关于基因表达,为了探索其相似性,使用CD62L低CD4+级分中出现的4个Th团簇的基因表达,进行了伪时间解析(图19左)。其结果为:CXCR3+CCR4-CCR6+(Th1/17)团簇和CXCR3-CCR4-CCR6+(CCR6SP)团簇在将Th1和Th17配置在伪时间上最远离的位置的情况下,在Th1与Th17之间的正中位置形成了另外的结(node)。这表明,从基因表达谱的观点来看,这2个团簇可能为具有Th1和Th17的中间性质的独立团簇。同样,将6名患者的基因表达谱分层地聚类时,可知CXCR3+CCR4-CCR6+(Th1/17)与CXCR3-CCR4-CCR6+(CCR6 SP)之间的欧氏距离(Euclidean distance)最近。调节T细胞的基因表达的2个重大要因为受TCR信号影响的活化状态和主要起因于DNA甲基化的分化状态。为了调查利用伪时间解析所观察到的基因表达图谱的不同是否对应于分化状态,使用从CD62L低CD4+T细胞中挑选的4个T细胞团簇进行甲基化解析(图19右)。基于甲基化的结果进行了聚类解析,结果Th1和Th17的团簇分离,存在不同于这些团簇的CXCR3+CCR4-CCR6+(Th1/17)团簇,与伪时间解析的结果一致(图19右)。CXCR3-CCR4-CCR6+(CCR6 SP)团簇位于Th17团簇与CXCR3+CCR4-CCR6+团簇的中间。
如上所述,作为发现队列,非小细胞肺癌13个病例的结果可知:Th1/17和CCR6 SP与无进展生存期相关(图4),针对Th1/17和CCR6 SP这2个外周血CD4+T细胞团簇的PFS预测性能,作为验证队列(Validation cohort),使用非小细胞肺癌首次治疗及既往治疗病例进行了进一步确认。
在验证队列中,Th1/17(CXCR3+CCR4-CCR6+)和CCR6 SP(CXCR3-CCR4-CCR6+)的T细胞团簇的合计即CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇(metacluster)显示与PFS密切相关(图20a、b、P<0.0001、r=0.9599)。进而,为了确认基于免疫检查点抑制剂进行治疗的时机Th1/17和CCR6 SP与PFS的相关性是否出现变化,在对未治疗的非小细胞肺癌症患者施用派姆单抗的情况和对既往治疗的非小细胞肺癌症患者施用派姆单抗或纳武单抗的情况下调查了Th1/17和CCR6 SP与PFS的相关性。具体而言,使用对未治疗的非小细胞肺癌症患者施用派姆单抗时和对既往治疗的非小细胞肺癌症患者施用派姆单抗或纳武单抗时的2个验证队列,对Th1/17及CCR6 SP T细胞团簇和CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇与免疫检查点抑制疗法后的临床转归(clinical outcomes)是否相关进行了调查。2个验证队列为:PD-L1TPS为50%以上且最初施用了派姆单抗的NSCLC患者和无论肿瘤的PD-L1表达与否均施用了派姆单抗或纳武单抗的既往治疗患者。对于表示2个验证队列中所得的CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇与PFS的相关关系的回归直线,在y-intercept及slope中与发现队列中所观察到的没有显示出显著差异。在接受以派姆单抗进行一次治疗的群组中,未出现Th1及Th17与PFS及OS的显著相关。但是,CD62L低CXCR3+CCR4-CCR6+及CXCR3-CCR4-CCR6+CD4+T细胞团簇显示出显著相关。CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇在治疗前的外周血中比疾病进展群显著增加,但是Th1及Th17没有差异。CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇在ROC曲线解析中显著地预测200天以上的PFS,曲线下表面积(AUC)为0.865(图20c)。CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇不仅与PFS显著相关,还与OS显著相关(图20d)。PD-1抑制疗法的抗肿瘤效果依赖于CD62L低CCR4-CCR6+CD4+T细胞元簇,因此认为CD62L低Th1/17T细胞团簇和CD62L低CCR6 SP T细胞团簇协同介导抗肿瘤免疫。需要说明的是,在还包含除Th1/17和CCR6 SP以外的团簇的CD62L低全体的细胞群中也能确认到与PFS相关,但是与其相比,在仅取出Th1/17和CCR6 SP的情况下,能够得到更高的与PFS相关(未图示)。认为这是由于:CD62L低全体的细胞群在仅为Th1/17和CCR6SP的情况下仅包含特别是与抗肿瘤效果相关联的团簇,因此与PFS的相关变高。
接着,针对不是外周血而是肿瘤微小环境中的CD4T细胞与PFS的相关进行了调查。将芯针活检、经支气管活检、外科活检中所得的肿瘤标本(n=46)用细胞角蛋白、CD4、CD8、PD-1、PD-L1、FoxP3进行了染色。基于细胞角蛋白+肿瘤细胞的检测,使用多色分析仪(OPALTM),对肿瘤周围的间质和肿瘤内的10,000个细胞自动地进行计数。将结果示于图21中。图21的上部所示的照片是为了对CD4、CD8、PD-1等分子以何种程度存在于肿瘤内及间质中进而调查而对各分子进行了染色的照片。对T细胞在肿瘤微小环境(TME)中的浸润进行调查时,通过肿瘤微小环境中的免疫细胞数的反复相关解析,从而确认到在肿瘤周围的间质中存在的CD8+细胞及CD4+细胞的数量与PFS及OS之间具有显著的相关关系,但是,在多重比较解析中,确认到在肿瘤周围的间质中存在的CD4+T细胞具有最显著的相关关系(图21左下及右下)。
进而,为了明确在与PD-1抑制剂的抗肿瘤效果相关的外周血中出现的CD4+T细胞团簇与其他外周血T细胞团簇或肿瘤微小环境中的T细胞的存在之间的关系,进行了多重比较解析和网络解析。由此,能够对外周血及肿瘤微小环境(TME)中的各细胞团簇的数量以何种关系连动进行调查。图22为外周血中的T细胞团簇和TME中的免疫细胞进行网络解析的结果。在该图中,在某细胞的数量完全连动地变动的情况下,用1.00表示,并且随着连动变低,数字变小。由该图还可知:外周血中的Th1/17和CCR6 SP合并的细胞数与肿瘤微小环境(TME)中的CD4+细胞数的网络解析结果用0.92表示,外周血中的Th1/17和CCR6 SP合并的团簇与CD4+细胞在肿瘤微小环境中的浸润密切相关。另一方面,Th1细胞与肿瘤微小环境的CD8+T细胞直接相关。这样,外周血中的Th1/17和CCR6 SP合并的团簇促进CD4+T细胞在肿瘤微小环境中的浸润,CD62L低Th1细胞促进CD8+T细胞的浸润。另外,网络解析的结果还表明:外周血中的Th1/17和CCR6 SP合并的团簇与CD45RA+CCR7-效应性CD8+T细胞(TEMRA)的频率存在正相关关系。由此可知:通过确认外周血的Th1/17和CCR6 SP,从而能够了解肿瘤内的CD4+细胞的状态。
接着,将手术前的外周血中的细胞团簇和通过手术切除肿瘤组织后的外周血的细胞团簇进行了比较。将结果示于图23中。在通过手术使肿瘤组织消失的情况下,在外周血中也减少的细胞团簇可认为是因肿瘤的存在而增加的细胞团簇。如图23所示,可知:对于CD62L低细胞,与手术前(pre)相比,在手术后(post)外周血中的细胞数减少,其中,特别是Th1/17和CCR6 SP,在手术后其细胞数显著减少。由此还可知:Th1/17和CCR6 SP是与肿瘤相关联的细胞团簇。
(注释)
综上所述,使用本发明的优选实施方式来例示了本发明,但是可理解为本发明应当仅通过权利要求书来解释其范围。在本说明书中引用的专利、专利申请及其他文献可理解为与其内容本身具体记载于本说明书的情况同样地援引该内容作为针对本说明书的参考。本申请对在2020年9月8日向日本专利局申请的日本特愿2020-150620主张优先权,其内容与其整体宛如构成本申请的内容同样地作为参考而被援用。
产业上的可利用性
本发明中提供的生物标记物可用于以简单、经济、准确的方式预测对癌症免疫检查点抑制剂的响应,在医学上和社会上是必须的。认为本发明是全球所有癌症类型所需的技术,具有极大的市场价值。
Claims (40)
1.一种方法,其将受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测所述受试体对癌症治疗的响应的指标,
所述方法包括确定来自所述受试体的样品中的所述细胞亚群的相对量的工序,
所述方法将所述相对量用作用于预测所述受试体对癌症治疗的响应的指标。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法将所述相对量与基准值的比较用作用于预测所述受试体对癌症治疗的响应的指标。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述方法将所述相对量与基准值的比较用作用于预测所述受试体的长期生存的指标。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,所述方法将所述相对量与无效组阈值的比较用作用于预测所述受试体对所述癌症治疗是否为无效组的指标。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,所述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CXCR3+细胞亚群。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,所述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CXCR3-细胞亚群。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中,所述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为FoxP3-细胞亚群。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的方法,其中,所述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CD62L低细胞亚群。
9.根据权利要求1~7中任一项所述的方法,其中,所述CCR4-CCR6+细胞亚群进一步为CD45RA-细胞亚群。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,所述癌症治疗包括癌症免疫疗法、放射线疗法、分子靶向药治疗、外科手术、细胞转移或这些治疗的任意组合。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的方法,其中,所述癌症治疗为癌症免疫疗法。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述癌症免疫疗法包括免疫检查点抑制剂的施用。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述免疫检查点抑制剂包括选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂中的抑制剂。
14.根据权利要求12所述的方法,其中,所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂与CTLA-4抑制剂的组合。
15.根据权利要求13或14所述的方法,其中,所述PD-1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-1抗体。
16.根据权利要求13~15中任一项所述的方法,其中,所述PD-1抑制剂包括纳武单抗或派姆单抗。
17.根据权利要求13~16中任一项所述的方法,其中,所述PD-L1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-L1抗体。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述PD-L1抑制剂包括度伐利尤单抗、阿替利珠单抗及阿维鲁单抗。
19.根据权利要求13~18中任一项所述的方法,其中,所述CTLA-4抑制剂包括伊匹单抗及曲美木单抗。
20.根据权利要求4~19中任一项所述的方法,其中,考虑关于无效组检测的灵敏度及特异度来确定所述无效组阈值。
21.根据权利要求4~20中任一项所述的方法,其中,所述无效组阈值按照使关于无效组检测的灵敏度超过约90%的方式来确定。
22.根据权利要求4~21中任一项所述的方法,其中,所述无效组阈值按照使关于无效组检测的特异度超过约90%的方式来确定。
23.根据权利要求1~22中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法使用外周血样品来测定所述细胞的相对量。
24.根据权利要求2~23中任一项所述的方法,其中,所述相对量为所述基准值以上表示所述受试体对所述癌症治疗进行响应。
25.一种组合物,其特征在于,其是用于在受试体中治疗癌症的、包含免疫检查点抑制剂的组合物,所述受试体是通过权利要求11~24中任一项所述的方法预测为对癌症免疫疗法进行响应的受试体。
26.根据权利要求25所述的组合物,其中,所述免疫检查点抑制剂包括选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂中的抑制剂。
27.根据权利要求26所述的组合物,其中,所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂与CTLA-4抑制剂的组合。
28.根据权利要求26或27所述的组合物,其中,所述PD-1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-1抗体。
29.根据权利要求26~28中任一项所述的组合物,其中,所述PD-1抑制剂包括纳武单抗或派姆单抗。
30.根据权利要求26~27中任一项所述的组合物,其中,所述PD-L1抑制剂为抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗PD-L1抗体。
31.根据权利要求30所述的组合物,其中,所述PD-L1抑制剂包括度伐利尤单抗、阿替利珠单抗或阿维鲁单抗。
32.根据权利要求26~31中任一项所述的组合物,其中,所述CTLA-4抑制剂包括伊匹单抗。
33.一种试剂盒,其是包含针对CD4的检测剂、针对CCR4的检测剂及针对CCR6的检测剂的、用于预测受试体对癌症治疗的响应的试剂盒,所述预测通过将所述受试体的CD4+T细胞群中的CCR4-CCR6+细胞亚群的相对量用作用于预测所述受试体对癌症治疗的响应的指标来进行。
34.根据权利要求33所述的试剂盒,其中,所述试剂盒将所述相对量与基准值的比较用作用于预测所述受试体对癌症治疗的响应的指标。
35.根据权利要求33或34所述的试剂盒,其中,所述试剂盒将所述相对量与基准值的比较用作用于预测所述受试体的长期生存的指标。
36.根据权利要求33~35中任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒将所述相对量与无效组阈值的比较用作用于预测所述受试体对所述癌症治疗是否为无效组的指标。
37.根据权利要求33~36中任一项所述的试剂盒,其中,所述检测剂为抗体。
38.根据权利要求33~37中任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包含针对CXCR3的检测剂。
39.根据权利要求33~38中任一项所述的试剂盒,其中,所述癌症治疗包括癌症免疫疗法、放射线疗法、分子靶向药治疗、外科手术、细胞转移或这些治疗的任意组合。
40.根据权利要求33~39中任一项所述的试剂盒,其中,所述癌症治疗为癌症免疫疗法。
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