KR20230054610A - Il-17의 산생을 억제하는 비피더스균 - Google Patents

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카즈야 우에하라
아케미 이기
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Abstract

(과제) 본 발명은, IL-17의 산생을 억제하여, 음식품에 적합하게 이용할 수 있는 유아 장 내 유래의 비피더스균 및 당해 비피더스균을 함유하는 음식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(해결 수단) IL-17의 산생을 억제하는 비피도박테리움속 롱검종의 비피더스균을 제공한다. 또한, 당해 비피더스균은 비피도박테리움·롱검 N714주(NITE BP-03004)이다. 또한, 당해 비피더스균을 함유하는 음식품을 제공한다. 이에 따라, IL-17의 항진에 의해 일으켜지는 만성 염증성 질환을 경감할 수 있을 가능성이 있다.

Description

IL-17의 산생을 억제하는 비피더스균
본 발명은, IL-17의 산생(production)을 억제하는 유아 장 내 유래의 비피더스균의 균주 및 그의 균체를 함유하는 음식품에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum)에 관한 것이다.
종래, 면역에 관여하는 세포로서, 세포성 면역에 관여하는 1형(Type 1) 헬퍼 T(Th1) 세포와, 액성(humoral) 면역에 관여하는 Th2 세포가 알려져 있다. 그리고, 최근의 연구로, Th1 세포, Th2 세포 이외에 Th17 세포라고 불리우는 새로운 T 세포 서브세트(subset)가 발견되었다. 이 Th17 세포는, 알레르기 응답이나 자가 면역, 일부의 감염 방어 등에서 중심적인 역할을 다하고 있는 것을 알 수 있다. 또한, Th17 세포는 특징적인 인터류킨 17(Interleukin-17: IL-17)을 산생하는 점에서 명명되었다.
여기에서, 인터류킨(interleukin: IL)이란, 림프구나 단구, 매크로파지(macrophage) 등 면역 담당 세포가 산생하는 생리 활성 물질의 총칭으로서, 면역 반응에 관련하는 세포 간 상호 작용을 매개하는 단백성 물질이다. 이 중, IL-17은, 주로 Th17 세포로부터 산생되고, 섬유 아세포나 상피 세포, 혈관 내피 세포, 매크로파지 등의 세포에 작용하여, 염증성 사이토카인이나 케모카인(chemokine), 세포 접착 인자 등, 여러 가지의 인자를 유도하여 염증을 일으키는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1, 2 참조).
IL-17에는 복수의 서브세트가 있고, Th17 세포로부터는 IL-17A와 IL-17F가 산생된다. IL-17A와 IL-17F는 아미노산 레벨로 50％의 상동성(homology)을 갖고, 대응하는 리셉터도 동일한 점에서, 많은 기능이 중복되어 있다고 생각되고 있다. 또한, 인간 Th17 세포에서는 IL-17A에 비해, IL-17F의 산생량이 많은 것도 알려져 있다.
한편, IL-17의 항진(enhancement)은, 관절 류머티즘, 건선 및 다발성 경화증을 포함하는 몇 가지의 만성 염증성 질환과 관련하는 것도 명백하게 되어 있다(비특허문헌 3, 4 참조). 그 때문에, 만성 염증성 질환의 치료로서, IL-17을 타깃으로 한 치료법이 모색되고 있다.
Aggarwal S, Gurney AL. IL-17: prototype member of an emerging cytokine family. J Leukoc Biol 2002; 71: 1-8. Kolls JK, Linden A. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity 2004; 21: 467-76. Nakae S, Nambu A, Sudo K, et al. Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice. J Immunol 2003; 171: 6173-7. Komiyama Y, Nakae S, Matsuki T, et al. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2006; 177: 566-73.
이 연구에서, 본 발명자들은, IL-17의 산생을 식사에 의해 억제할 수 없는가 검토를 행했다. 그리고, 유아 분변을 분리원으로 한 비피더스균 중에 IL-17의 산생을 억제하는 비피더스균이 존재하는 것을 새롭게 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기 과제 해결을 위해, 본 발명은, IL-17의 산생을 억제하는 비피도박테리움속(genus)에 속하는 비피더스균인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 과제 해결을 위해, 본 발명은, 상기 비피더스균이, 비피도박테리움·롱검 N714주(株)(NITE BP-03004)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 과제 해결을 위해, 본 발명은 상기 비피더스균을 함유하는 음식품인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비피더스균은, IL-17의 산생을 억제한다. 이에 따라, IL-17의 항진에 의해 일으켜지는 만성 염증성 질환을 경감할 수 있다.
도 1은 본 발명의 균주와 비교 균주(comparative strain)의 IL-17F 산생 억제 효과를 비교한 도면이다.
도 2는 본 발명의 균주와 기준주(type strain)의 IL-17F 산생 억제 효과를 비교한 도면이다.
(발명을 실시하기 위한 형태)
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 비피도박테리움 · 롱검 N714주 ( NITE BP-03004)
본 발명의 비피더스균은 비피도박테리움·롱검이다. 본 발명에 있어서의 N714의 기호는, 닛신쇼쿠힝홀딩스 가부시키가이샤에서 독자적으로 균주에 부여한 번호이다. 본 발명의 균주는, 유아 분변으로부터 본 발명자에 의해 처음으로 분리된 것이다.
본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주는, 하기의 조건으로 기탁되어 있다.
(1) 기탁 기관명: 일본의 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터
(2) 연락처: (우)292-0818 일본국 지바현 키사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 122호실
(3) 수탁 번호: NITE BP-03004
(4) 식별을 위한 표시: N714
(5) 기탁일: 2019년 7월 10일
본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주의 균학적 성질은, 이하의 표 1 및 표 2에 나타내는 바와 같다. 본 균학적 성질은, Bergey's manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)에 기재된 방법에 따른다. 표 1은 본 균주에 관한 형상 및 다른 특성들을, 표 2는 아피(Api) 50CH 및 아피 CHL(비오메리으)에 의한 생리·생화학적 성상 시험의 결과를 나타낸다. 표 1 및 2에 있어서, 「＋」가 양성, 「－」는 음성을 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
2. IL-17의 산생 억제 시험
본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주는, 후술하는 실험예에 나타내는 바와 같이, 높은 IL-17 산생 억제능을 갖는다. IL-17 산생 억제는, 이하의 방법에 따라 확인했다.
＜IL-17 산생 억제 시험에 이용한 시료의 조제＞
IL-17 산생 억제 시험에 이용한 시료는, 비피더스균을 표 3에 나타내는 GAM 배지(닛스이(Nippon Suisan Kaisha, Ltd.))에서 37℃, 24시간 배양함으로써 얻었다. 이어서, 원심 분리기를 이용하여 증식시킨 균체를 집균했다. 집균한 균체를 멸균수로 세정하여, 원심 분리기에서 집균을 행했다. 세정과 집균을 반복하여 3회 행했다. 그 후, 가열 살균을 실시하고, 동결 건조기를 이용하여 가열 살균체를 동결 건조하여, 건조 균체 분말을 얻었다.
Figure pct00003
＜IL-17 산생 억제 시험＞
IL-17 산생 억제 시험에서는, 세포로서 인간 말초혈 단핵구(hPBMC, CTL)를 사용했다. 10％ 소 태아 혈청, 4mM GlutaMAX(Gibco)를 더한 IMDM 배지(Sigma)를 이용하여, 세포를 1.0×106cells/well, 상기에서 얻은 시료를 10ng/well이 되도록 96well 플레이트에 파종했다. 여기에, Th17 세포 분화 자극제로서 25ng/mL rhIL-6(BioLegend), 12.5ng/mL rhIL-23(BioLegend), 25ng/mL rhIL-21(BioLegend), 2ng/mL rhTGF-β1(BioLegend), 25ng/mL rhIL-1β(BioLegend)를 더하고, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 96시간 배양했다. 배양 후, hPBMC의 배양상청(supernatant)을 회수하고, 상청 중의 IL-17F를 시판의 이뮤노어세이 키트(R&D)로 측정했다.
3. 음식품
본 발명의 비피더스균은 음식품에 함유시켜 사용할 수 있다. 본 발명의 비피더스균은 특히 음료에 적합하게 이용할 수 있는데, 예를 들면, 발효유 및 유산균 음료를 생각할 수 있다. 현행의 유(Milk) 및 유제품의 성분 규격 등에 관한 일본의 성령(Ministerial Ordinance)에서는, 성분 규격으로서 발효유(무지유 고형분 8.0％ 이상의 것)나 유제품 유산균 음료(무지유 고형분 3.0％ 이상의 것)이면 1.0×107cfu/mL 이상, 유산균 음료(무지유 고형분 3.0％ 미만의 것)이면 1.0×106cfu/mL 이상 필요시 되지만, 유 등의 발효액 중에서 증식시키거나, 최종 제품의 형태로 증식시키거나 함으로써 상기의 균수를 실현할 수 있다. 또한, 상기 비피더스균은, 비피더스균을 함유하는 발효유 및 유산균 음료 이외에도, 버터 등의 유제품, 마요네즈 등의 달걀 가공품, 버터 케이크 등의 과자 빵류 등에도 이용할 수 있다. 또한, 상기 비피더스균은, 즉석면이나 쿠키 등의 가공 식품에도 적합하게 이용할 수 있다. 상기의 외에, 본 발명의 식품은, 상기 비피더스균과 함께, 필요에 따라서 적당한 담체 및 첨가제를 첨가하여 제제화된 형태(예를 들면, 분말, 과립, 캡슐, 정제 등)라도 좋다.
본 발명의 비피더스균은, 일반의 음료나 식품 이외에도 특정 보건용 식품, 영양 보조 식품 등에 함유시키는 것도 유용하다. 또한, 본 발명의 비피더스균은, 식품 이외에도 화장수 등의 화장품 분야, 정장제 등의 의약품 분야, 치약 등의 일용품 분야, 사일리지(silage), 동물용 먹이, 식물 액체 비료 등의 동물 사료·식물 비료 분야에 있어서도 응용 가능하다.
본 발명의 비피더스균(비피도박테리움·롱검 N714주)은, IL-17의 산생 억제에 대해서 높은 활성을 갖는다.
실시예
이하, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
＜시험예 1＞ IL-17 산생 억제 시험
본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주와, 닛신쇼쿠힝홀딩스 가부시키가이샤 보유의 비피도박테리움·롱검 비교주(comparison strain)에 대해서 IL-17의 산생 억제 시험을 실시했다.
우선, 본 발명의 균주, 후술하는 기준주 및, 비교 균주의 각각에 대해서, 표 3에 나타내는 GAM 배지(닛스이)에서 37℃, 24시간 배양했다. 배양에는 아네로팩(미츠비시가스카가쿠)을 이용하여, 혐기 조건하에서 배양했다. 다음으로, 증식한 균체를 원심 분리하여 집균했다. 집균한 균체를 멸균수로 3회 세정하여, 가열 살균 후, 동결했다. 그 후, 동결 건조기를 이용하여 상기 균체를 동결 건조하여, 건조 균체 분말을 얻었다. 얻어진 건조 균체 분말을 PBS(－)에 현탁한 것을 비피더스균 현탁액으로 했다.
다음으로, 96well 플레이트에 1.0×106cells/well씩 hPBMC를 파종했다. 다음으로, 각 시료군을 최종 농도가 10ng/mL가 되도록 첨가했다. 또한, Th17 세포 분화 자극제로서, 1well당 25ng/mL rhIL-6(BioLegend), 12.5ng/mL rhIL-23(BioLegend), 25ng/mL rhIL-21(BioLegend), 2ng/mL rhTGF-β1(BioLegend), 25ng/mL rhIL-1β(BioLegend)를 더하고, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 96시간 배양했다. 배양 후, hPBMC의 배양상청을 회수하고, 상청 중의 IL-17을 시판의 이뮤노어세이 키트(R&D)로 측정했다. 또한, 비피더스균 현탁액 및 Th17 세포 분화 자극제의 어느 것도 함유하지 않은 것을 『무자극』, Th17 세포 분화 자극제만을 함유한 것을 『자극』이라고 했다.
각 시료군을 첨가한 경우에 있어서의 배양상청 중에 포함되는 IL-17F 농도(pg/mL)를 도 1에 나타낸다.
도 1은, 어떤 비피더스균은 IL-17F의 산생을 억제하고, 반면 다른 비피더스균은 그렇지 않은 것을 나타낸다. 본 발명에 따른 N714주는, 무자극보다는 IL-17F의 산생이 높기는 하지만, 그 외의 비피더스균과 비교하여 IL-17F의 산생 억제에 대해서 가장 높은 활성을 나타냈다. 무자극의 IL-17F 농도가 낮은 것은, Th17 세포로 분화하지 않았기 때문이라고 생각된다. 여기에서, N714주에서 IL-17F의 산생이 억제된 원인에 대해서는 불명하지만, 현 단계에서는 다음과 같이 추찰된다. 가능성의 하나로서, N714주를 첨가함으로써 Th17 세포로의 분화 자체가 억제되고, 결과 IL-17F의 산생이 억제된 것이라고 추찰된다. 다른 가능성으로서는, Th17 세포로는 분화하고 있기는 하지만, 무언가의 이유에 의해 IL-17의 산생이 억제된 것이라고 추찰된다. 이들의 어느 것 혹은 양쪽, 나아가서는 이 이외의 이유에 의해, IL-17의 산생이 억제된 것이라고 추찰된다.
그런데, 본 시험에 있어서 IL-17F를 IL-17의 평가 지표로서 이용한 것은, IL-17 서브세트 중에서 IL-17F의 산생량이 가장 많아, 검출하기 쉽기 때문이다. 한편, IL-17F 이외의 서브세트에 대해서는, 산생량이 매우 적어, 검출이 어렵다. 그 때문에, 본 시험에 있어서는 IL-17F를 평가 지표로 했다. 그러나, 전술의 추찰에 기초하면, IL-17F 이외의 서브세트에 대해서도 본 발명에 따른 비피도박테리움·롱검 N714에 의해 산생이 억제되어 있는 것이라고 추찰된다.
＜시험예 2＞ 비피도박테리움·롱검 N714의 우위성 평가
다음으로, 본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주의 우위성을 확인하기 위해, 기준주인 비피도박테리움·롱검 JCM1217과의 비교로 비피도박테리움·롱검 N714주의 평가를 행했다. 시험은 시험예 1과 마찬가지의 방법으로 3회 행하고, 그의 평균값을 이용하여 자극군과 비교를 행했다. 결과를 도 2에 나타낸다.
도 2로부터도 명백한 바와 같이, 비피도박테리움·롱검 N714주를 함유한 군에서는, 자극군과 비교하여 IL-17의 산생이 의미 있게 억제되었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움·롱검 N714주는 IL-17의 산생을 효과적으로 억제하는 기능을 갖고 있는 것이 명백해졌다.

Claims (3)

  1. IL-17의 산생을 억제하는 비피도박테리움속 롱검종의 비피더스균.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비피더스균은, 비피도박테리움·롱검 N714주(株)(NITE BP-03004)인, 비피더스균.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 비피더스균을 함유하는 음식품.
KR1020227037632A 2020-09-02 2021-09-01 Il-17의 산생을 억제하는 비피더스균 KR20230054610A (ko)

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