KR20230030591A - P95her2에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

P95her2에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230030591A
KR20230030591A KR1020227045910A KR20227045910A KR20230030591A KR 20230030591 A KR20230030591 A KR 20230030591A KR 1020227045910 A KR1020227045910 A KR 1020227045910A KR 20227045910 A KR20227045910 A KR 20227045910A KR 20230030591 A KR20230030591 A KR 20230030591A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
region
sequence
functionally equivalent
nos
Prior art date
Application number
KR1020227045910A
Other languages
English (en)
Inventor
호아킨 아리바스 로페즈
아이린 리우스 루이즈
마카레나 로만 알론소
알레나 그로스 비달
카를로스 알베르토 파하르도 칼데론
크리스티안 클라인
에케하르트 뫼스너
Original Assignee
펀다시오 프리바다 인스티튜트 드인베스티가시오 온콜로지카 데 발 헤브론
인스티튜시오 카탈라나 드 르세르카 아이 에스투디스 아반카츠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 펀다시오 프리바다 인스티튜트 드인베스티가시오 온콜로지카 데 발 헤브론, 인스티튜시오 카탈라나 드 르세르카 아이 에스투디스 아반카츠 filed Critical 펀다시오 프리바다 인스티튜트 드인베스티가시오 온콜로지카 데 발 헤브론
Publication of KR20230030591A publication Critical patent/KR20230030591A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 p95HER2 발현 세포를 표적화할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 p95HER2 항원에 결합할 수 있는 단쇄 가변 단편(ScFv), 항원 결합 도메인 및 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 진단 방법, 및 암을 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 CAR 및/또는 항원 결합 도메인 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

P95HER2에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
본 발명은 생명공학 및 생물의학 분야에 포함된다. 본 발명은 구체적으로 HER2의 p95 단편에 특이적인 항체뿐만 아니라, 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 암의 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
암은 전 세계적으로 질병과 사망의 주요 원인 중 하나이다. 암은 현재 전 세계적으로 거의 6건 중 1건의 사망에 대한 책임이 있으며, 새로운 사례의 수는 향후 20년 동안 약 70% 증가할 것으로 예상된다.
현재 많은 약물이 암 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 많은 경우에 암은 항암 요법에 반응하지 않거나, 암의 성장 및/또는 전이가 단지 느려질 뿐이다. 종양의 크기가 줄어들거나 관해가 되면서 항종양 요법에 초기에 반응하는 경우에도, 종양은 종종 약물에 대한 내성을 발달시킨다. 이러한 이유로, 여전히 이용 가능한 치료가 없는 암 및 다제 내성 암의 치료에 사용될 수 있는 새로운 항암제 및 약물이 필요하다.
HER2는 유방암 및 위암의 약 25%에서 과발현되는 수용체 티로신 키나아제이다. 단클론 항체 트라스투주맙 또는 억제제 라파티닙과 같은 항-HER2 요법의 성공에도 불구하고, 높은 비율(40%)의 진행성 유방암 사례는 결국 진행된다. 또한, 심근세포에서 HER2의 발현으로 인한 심장독성이 치료 환자에서 빈번하게 관찰되었다. 따라서, HER2로 유래된 종양에 대해 보다 효과적이고 안전한 치료제를 개발할 임상적 필요가 있다. 또한 HER2를 표적으로 하는 CAR도 개발되었다. 그러나, HER2를 표적으로 하는 입양 세포 요법은 건강한 조직에서의 HER2의 발현에 의해 제한되고 있는데, 이는 중대한 부작용으로 이어진다.
p95HER2는 일부 HER2 양성 종양에서만 독점적으로 발현되는 HER2의 단편이다. T 세포는 T 세포 이중특이적 항체를 통해 p95HER2에 대해 안전하게 유도될 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, p95HER2에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)에 기초한 입양 세포 요법은 개발되지 않았다. 실제로, p95HER2 CAR을 생성하려는 이전의 시도는 T 세포 표면에서 발현시키는데 실패하였고, p95HER2를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 없었다(연구 공개, 데이터베이스 번호 667070). 따라서, p95HER2를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 항종양 요법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
본 발명의 저자들은 p95HER2를 발현하는 세포를 표적화하고 p95HER2 양성 종양에 대한 강력한 항종양 활성을 유도할 수 있지만, 정상 수준의 HER2를 발현하는 세포에 대한 명백한 활성은 없는 키메라 항원 수용체(CAR)를 획득하였다. CAR은 이전에 기능적 CAR을 제공하지 못하고 ScFv의 인간화 및 ScFv 내의 VH 및 VL 영역의 순서를 특정한 배열로의 변형을 필요로 했던 항-p95HER2 ScFv로부터의 ScFv를 사용하여 획득하였다. 이는 본 문서의 실시예 1에 도시되어 있으며, 여기서 본 발명의 CAR은 p95HER2를 발현하는 세포에 특이적인 세포독성 효과를 유도하였고, 대조적으로 p95HER2를 발현하지 않는 세포에는 어떠한 영향도 미치지 않았음이 입증되었다.
또한, 본 발명의 저자들은 상이한 항-p95HER2 ScFv로부터 CAR을 생성하였고, CAR이 p95HER2를 발현하는 세포에 대한 강력한 세포독성 효과를 유도할 수 있음을 보여주었다. 이는 본 문서의 실시예 2 및 3에 도시되어 있다. 또한, 인간화 ScFv 버전의 사용은 도 6 및 도 8에 도시된 바와 같이, 비인간화 버전과 비교하여, 정상 수준의 HER2를 발현하는 세포의 사멸 감소로 인해 p95HER2에 대해 보다 특이적인 CAR T를 생성한다. 따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다:
(i) p95HER2에 특이적인 항원 결합 도메인,
(ii) 막관통 도메인 및
(iii) 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인,
여기서, 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 다음을 특징으로 하는 ScFv(ScFv1):
- VL 및 VH 영역의 프레임워크 영역은 인간화되어 있음;
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체, 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함,
(ii) 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 1):
- 적어도 하나의 VH 및 적어도 하나의 VL 영역을 가짐,
- 적어도 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함, 및
(iii) 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 2):
- 적어도 하나의 VH 및 적어도 하나의 VL 영역을 가짐,
- 적어도 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체의 서열을 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태의 핵산 또는 본 발명의 제3 양태의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 ScFv에 관한 것이다:
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- VL 영역의 CDR1 CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체, 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
제6 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인에 관한 것이다:
- 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 적어도 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함함.
제7 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다:
적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 적어도 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제8 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제8 양태의 핵산 또는 본 발명의 제9 양태의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
제11 양태에서, 본 발명은 환자에서 암을 진단하는 다음 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명의 제5, 제6 또는 제7 양태에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체와 종양 세포를 함유하는 환자의 샘플을 접촉시키는 단계; 및
(ii) ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체가 샘플 내 세포에 결합하는 것을 검출하는 단계로서,
이러한 결합의 존재는 환자가 암을 앓고 있음을 나타내는 것인, 단계.
제12 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 또는 제7 양태에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 비히클을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제13 양태에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태의 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체에 관한 것이다.
최종 양태에서, 본 발명은 암을 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태의 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체에 관한 것이다.
도 1 . 본 문서에 개시된 3개의 p95HER2 CAR의 개략도. (a) 인간화 32H2 p95HER2 CAR. (b) 214D8 p95HER2 CAR. (c) 215C2 p95HER2 CAR.
도 2 . 32H2 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) 전장 HER2 또는 p95HER2에 결합하는 ScFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도. (b) 형질도입 후 5일 차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포를 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에서 생존 표적 세포를 유세포 계측법으로 평가하였다 UTD: 미형질도입 T 세포; Trast: 트라스투주맙 기반 CAR.
도 3. 인간화 32H2 p95HER2 CAR T의 설계 및 발현. (a) 전장 HER2 또는 p95HER2에 결합하는 ScFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도. (b) 형질도입 후 5일 차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. UTD: 미형질도입 T 세포; Trast: 트라스투주맙 기반 CAR.
도 4. h32H2 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) 전장 HER2 또는 p95HER2에 결합하는 ScFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도. (b) 형질도입 후 5일 차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포를 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. (d) 표시된 비율로 CAR T 세포와 함께 MCF10A 세포를 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. UTD: 미형질도입 T 세포; Trast: 트라스투주맙 기반 CAR.
도 5. 214D8 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) 전장 HER2 또는 p95HER2에 결합하는 scFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도. (b) 형질도입 후 5일 차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포를 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. UTD: 미형질도입 T 세포; Trast: 트라스투주맙 기반 CAR.
도 6. 인간화 214D8 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) p95HER2에 결합하는 scFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도 (b) 형질도입 후 5일차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포 또는 MCF10A 야생형을 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. UTD: 미형질도입 T 세포.
도 7. 215C2 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) 전장 HER2 또는 p95HER2에 결합하는 scFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도. (b) 형질도입 후 5일 차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포를 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. UTD: 미형질도입 T 세포; Trast: 트라스투주맙 기반 CAR.
도 8. 인간화 215C2 p95HER2 CAR T의 설계, 발현 및 세포독성. (a) p95HER2에 결합하는 scFv를 함유하는 키메라 수용체의 개략도 (b) 형질도입 후 5일차에 T 세포 상 a에 표시된 CAR의 표면 발현; 총 T 세포로부터의 양성 CAR T의 백분율이 표시되어 있다. (c) MCF10A p95HER2 세포 또는 MCF10A 야생형을 표시된 비율로 CAR T 세포와 공동 배양하였다. 48시간에 유세포 계측법으로 생존 표적 세포를 평가하였다. UTD: 미형질도입 T 세포.
도 9: 생체 내 p95HER2 양성 종양의 성장에 대한 m215 유래 p95HER2 CAR T의 효과. (a) 마우스에게 MCF7p95HER2 세포를 동소 이식하였다. 종양이 약 300 mm3에 도달하면, 3 x 106 CAR+ T 세포로 처리하였다. (b) 144일 차에, 총 백혈구 대비 혈액 μl당 순환하는 인간 CD3+ T 세포의 백분율.
도 10. 생체 내에서 p95HER2 양성(MCF7p95HER2) 및 p95HER2 음성(MCF7) 종양의 생장에 대한 h1_214 유래 p95HER2 CAR T의 특이적 항종양 효과. 마우스에게 MCF7p95HER2 세포(a) 또는 MCF7 세포(d)를 동소 이식하였다. 종양이 약 300 mm3에 도달했을 때, 꼬리 정맥 주사를 통해 3 x 106 CAR+ T 세포 또는 UTD T 세포를 마우스에 처리하였고, 10일 후에 동일한 수의 T 세포를 갖는 제2 투여량을 수여하였다. 제2 투여량의 투여 후 10일 차에 혈액 μl 당 순환하는 인간 CD3+ T 세포의 수(b, e)를 결정하였다. 밀리그램의 종양 당 종양 침윤 CD3 세포의 수를 표시된 시점(c, f)에서 평가하였다.
도 11. 본 문서에 개시된 p95HER2-CAR의 완전한 아미노산 서열.
도 12. scFv 아미노산 서열 요약.
본 발명은 암 치료를 위한 새로운 화합물의 제공에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 일 양태의 맥락에서 개시된 모든 구현예 및 정의는 본 발명의 다른 양태에도 적용될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
제1 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다:
(i) p95HER2에 특이적인 항원 결합 도메인,
(ii) 막관통 도메인 및
(iii) 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인,
여기서, 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 다음을 특징으로 하는 ScFv1:
- VL 및 VH 영역의 프레임워크 영역은 인간화되고,
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고;
- VL 영역의 CDR1 CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체, 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
(ii) 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 1):
- 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 적어도 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함, 및
(iii) 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 2):
- 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
본원에서 사용되는 바와 같이, 키메라 T 세포 수용체, T-바디, 인공 T 세포 수용체 및 키메라 면역 수용체(CIR)로도 알려진 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 조작된 수용체이며, 이는 면역 효과기 세포 상에 임의적인 특이성을 접목시킨 것이다. 고전적인 CAR에서, 단클론 항체의 특이성이 T 세포에 접목된다. 따라서, CAR은 적어도 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인 또는 세포외 도메인, 세포외 도메인이 유래된 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 세포내 공동자극 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명에 따르면, "세포외 도메인", 항원 결합 도메인", "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이라는 표현은 상호 교환적으로 사용되고, 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 온전한 항체의 적어도 일부분, 또는 이의 재조합 변이체, 예를 들어 항체 단편의 표적에 대한 인식 및 특이적 결합을 허용하기에 충분한 온전한 항체의 항원 가변 영역을 지칭하는 항체 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 도메인은 적어도 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab'-, F(ab')2 및 Fv 단편, ScFv 항체 단편 및 선형 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 도메인 또는 항체 단편은 적어도 하나의 VH 및 하나의 VL 영역을 포함하지만, 2개의 VL 영역 및 2개의 VH 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 ScFv이므로, 이는 하나의 VL 및 하나의 VH 영역만을 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fab 단편이며, 이 경우, 이는 하나의 VL 및 VH(Fab 또는 Fab') 또는 2개의 VH 및 2개의 VL 영역(Fab2, 또는 F(ab')2)을 포함할 것이다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비인간(예를 들어, 쥣과) 항체 또는 항원 결합 도메인의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하거나 서열을 함유하지 않는 키메라 항체 또는 항원 결합 도메인이다. 대부분의 경우, 인간화 항체 또는 항원 결합 도메인은, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체 또는 항원 결합 도메인은 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 일반적으로 항체 또는 항원 결합 도메인 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 항원 결합 도메인은 적어도 하나, 및 통상적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것으로, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 초가변 루프와 상응하고 FR 잔기의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 FR 잔기이다. 인간화 항체는 또한 일반적으로 인간 면역글로불린의 부분인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인은 HER2, p95HER2의 카르복시 말단 단편을 특이적으로 인식한다.
용어 "HER2" 및 "HER2 수용체"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, ErbB2 단백질(문헌에서 HER2/neu로도 지칭됨)을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 HER2의 변이체(예를 들어, 스플라이스 변이체), 이소형, 및 상동체(오소로그 및 파라로그 둘 다)를 포함하도록 의도된다. 일부 양태에서, HER2에 대한 본원에 개시된 항-HER2 결합 분자의 결합은 HER2와 다른 ErbB 패밀리 구성원 사이의 이종이성질체 복합체의 형성을 억제함으로써, 예를 들어, EGFR 또는 HER3와의 이종이량체화를 억제함으로써 HER2를 발현하는 세포(즉, 일반적으로 종양 세포, 및 특히 낮은 수준의 HER2를 발현하는 암세포)의 성장을 억제한다.
HER2는 수용체 티로신 키나아제이며, (i) 리간드 결합을 담당하는 2개의 류신-풍부 도메인(도메인 I/L1 및 도메인 III/L2), 및 (ii) 수용체 이량체화를 담당하는 2개의 시스테인-풍부 도메인(도메인 II/CR1 및 도메인 IV/CR2)으로 이루어진 세포외 도메인(ECD); 막관통 도메인; 및 세포내 티로신 키나아제 도메인으로 구성된다. HER2의 대안적인 스플라이스 변이체가 존재하며 본 발명의 일부일 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "p95HER2"는 HER2 수용체 단백질의 카르복시 말단 단편(CTF)을 지칭하며, 이는 "611-CTF" 또는 "100-115 kDa p95HER2"로도 알려져 있다. p95HER2 단편은 전장 HER2 분자의 코돈 위치 611에서 HER2 mRNA의 번역 개시를 통해 세포에서 생성된다(Anido 등의 문헌[EMBO J 25; 3234-44 (2006)]). 이는 100 내지 115 kDa의 분자량을 가지며, 세포막에서 발현되고, 여기서 분자간 이황화 결합에 의해 유지되는 동종이량체를 형성할 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR) 또는 상보적 결정 영역(CDR)을 포함한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR", "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 6개의 CDR; VH에서 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 따라서, CDR은 단백질의 친화도(대략 결합 강도) 및 특이적 항원에 대한 특이성을 결정한다. 각 쌍의 2개의 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합하는 기능을 수득한다. 결과적으로, 중쇄 가변 사슬 및 경쇄 가변 사슬 둘 다는 각각 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 및 VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3인 3개의 CDR을 특징으로 한다.
CDR 서열은, 예를 들어, 종래의 기준에 따라, 예를 들어, IgBLAST의 기준(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ (Ye 등의 문헌[2013, Nucleic Acids Res 41 (Web Server issue:W34-40])에 의해, Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed.,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)])에 제공된 번호화를 따라, 또는 Chothia 등의 문헌[1989, Nature 342:877-83]에 제공된 번호화에 따라 결정될 수 있다. 이러한 특정 영역은 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 및 Chothia 등의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 여기서 이러한 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 서브세트 또는 중첩을 포함한다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어떤 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다. 본원에서 주어진 CDR 서열은 일반적으로 Kabat 정의에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인은 ScFv이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단쇄 가변 단편(ScFv)"은 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체로부터 유래된 단쇄 폴리펩티드를 의미한다. ScFv의 예시는 재조합 DNA 기술에 의해 형성되고, 면역글로불린 중쇄(VH 사슬) 및 경쇄(VL 사슬) 단편의 가변(Fv) 영역이 스페이서 서열을 통해 연결되는 항체 폴리펩티드를 포함한다. ScFv를 제조하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며, 미국 특허 제4694778호, 문헌[Nature, vol. 334, p. 54454 (1989)], 및 문헌[Science, vol. 242, pp. 1038-1041 (1988)]에 기술된 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR의 제2 요소는 CAR의 세포외 도메인에 부착되는 막관통 도메인이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "막관통 도메인"(TMD)은 세포막을 가로지르는 CAR의 영역을 지칭한다. 본 발명의 CAR의 막관통 도메인은 막관통 단백질(예를 들어, I형 막관통 단백질), 인공 소수성 서열, 또는 이들의 조합의 막관통 도메인이다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어, 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 연관된 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 연관된 하나 이상의 추가 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 연관된 도메인이다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해, 예를 들어, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택될 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CART 세포 표면 상에서 다른 CAR과 동종이량체화될 수 있다. 상이한 양태에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CART에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하도록 변형되거나 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호 전달을 할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 비제한적인 실시예 또는 막관통 도메인은, 예를 들어, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, CD3 제타, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD1 la, CD18), ICOS(CD 278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, CTLA4, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4 CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDGA, CDGA, CD103, ITGAL, CDLa, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDlc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, LGA ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(접촉), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A) , Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, Kp30, NKp46(NKG2D를 포함함), 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인의 적어도 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 CD4 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, CTLA4 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인 및 CD3 제타 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 특정 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 서열 FWVLVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열번호 113)를 포함한다.
본 발명에 따른 CAR은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 포함한다.
용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭하며, 보다 구체적으로는 세포에서 생물학적 과정의 활성화 또는 억제를 유발하는 신호를 송신하는 도메인으로서 기능하는 것으로 알려진 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR-함유 세포, 예를 들어, CAR-T 세포의 면역 효과기 기능을 자극하는 신호를 생성한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 기능 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포(예를 들어, T 세포)가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 일부일 수 있다.
일반적으로, 전체 세포 내 신호 전달 도메인이 사용될 수 있지만; 신호전달 도메인의 어떠한 부분이 사용되든지 간에 효과기 기능 신호를 여전히 전달할 수 있는 경우, 전체 도메인을 사용할 필요가 없다는 것이 이해된다. 또한, 실질적으로 동일하거나 더 큰 기능적 능력을 갖는 이러한 세포내 신호전달 도메인의 변이체가 사용될 수도 있음을 이해할 것이다. 이에 따라, 변이체가 효과기 기능 신호와 실질적으로 동일하거나 더 큰 전달을 가져야 한다는 의미를 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 동일하거나 더 큰 신호 전달은, 변형되지 않은 세포 내 신호 전달 도메인의 신호 전달의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120% 이상을 포함하며, 여기서 변형되지 않은 세포 내 신호 전달 도메인의 신호 전달은 100%에 상응한다. 효과기 기능 신호의 전달을 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 전달된 신호를 나타내는 분자(예를 들어, 사이토카인과 같은 단백질)의 양 및/또는 활성을 평가하는 것을 포함한다. 따라서, 신호가 T 세포의 세포용해 기능인 경우, 방법은 T 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 사이토카인의 측정을 포함할 수 있으며, 이 사이토카인은 세포용해 활성(예를 들어, I FN 감마)을 갖는 것으로 알려져 있다. 세포용해 기능을 평가하는 다른 수단은, 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 유세포 계측법에 의한 CFSE 염색 및 양성 세포 계수 또는 크롬 방출 분석에 의한 것이다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는, T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하도록 함께 작용하는 공동 수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR만을 통해 생성된 신호는 일반적으로 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 이차 및/또는 공동자극 신호가 또한 필요할 수 있다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 다음의 2개의 구별되는 부류의 세포 내 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 지칭될 수 있다: TCR(일차 세포 내 신호전달 도메인)을 통해 항원 의존성 일차 활성화를 개시하는 것들 및 이차 또는 공동자극 신호(공동자극 도메인과 같은 이차 세포 내 신호전달 도메인)를 제공하기 위해 항원 독립적인 방식으로 작용하는 것들. 공동자극 도메인은 효과기 기능의 활성화를 촉진하고 또한 효과기 기능의 유지 및/또는 세포의 생존을 촉진할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 ITAM)으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 ITAM을 함유하는 일차 세포내 신호전달 도메인의 예는 CD3 제타, Fc 수용체 감마, Fc 수용체 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 것들을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타이고, 보다 구체적으로, 본 발명의 CAR은 서열 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 114)을 포함한다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank 진입 번호 BAG36664.1로 표시되는 단백질, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 영장류, 등으로부터의 동등한 잔기로 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3 제타 자극 도메인" 또는 "TCR 제타 자극 도메인"은 T 세포 등을 활성화하는 데 필요한 일차 신호의 기능적 전달에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인의 아미노산 잔기로 정의된다. 일 양태에서, 제타 세포질 도메인은 BAG36664.1의 GenBank 엔트리 단백질 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 영장류 등으로부터의 동등한 잔기(이들의 기능적 이종상동체임)를 포함하는 잔기 52 내지 164를 포함한다.
세포내 신호 전달 도메인의 하나 이상의 ITAM이, 예를 들어 돌연변이에 의해 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 변형은 천연 ITAM 도메인과 비교하여 ITAM의 신호 전달 기능을 증가시키거나 감소시키는 데 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 세포내 신호전달 도메인은 그 자체로 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인과 같은 하나 이상의 이차 세포내 신호전달 도메인과 조합하여 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 그 자체로서 또는 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인과 같은 하나 이상의 다른 세포내 신호 전달 도메인과 조합하여 포함할 수 있다.
공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다.
용어 "공동 자극 분자"는 공동 자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포에 의해 발휘되는 공동 자극 반응, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 증식을 매개하는 인식 가능한 T 세포 결합 파트너를 지칭한다. 공동 자극 분자는 효과적인 면역 반응에 필요한 항원-특이적 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자는 항원에 대한 면역 세포(예를 들어, 림프구)의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자일 수 있다. 공동자극 분자는 다음 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 림프구 활성화 신호 전달 분자(SLAM 단백질) 및 NK 세포 활성화 수용체. 이러한 분자의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 4-1 BB(CD137), OX40, ICOS, DAP10, CD27, CD28, CDS, CD30, CD137(4-1BB), CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, GITR, NKG2C, SLAMF7, NKp80, BAFFR, HVEM, BTLA, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공동 자극은 시험관 내에서 인간 CART 세포의 확장, 효과기 기능, 및 생존을 향상시키고, 생체 내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증강시키는 것으로 입증되었다(Song 등의 문헌[Blood. 2012; 1 19(3):696-706]).
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR은 공동자극 분자 CD28의 세포내 도메인, 보다 구체적으로는, 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 115)을 을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 일차 신호전달 도메인 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), DAP10, DAP 12, 및 4-1BB(CD137), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 세포내 도메인에 대해 N-말단측에 배열된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자 CD28의 세포내 도메인이고, CD3-제타 세포내 도메인에 대해 N-말단 측에 배열된다.
본 발명의 CAR의 세포내 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 2개 내지 10개의 길이인 아미노산(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산)은 세포내 신호전달 서열 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 글리신-세린 이중선은 적절한 링커로서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알라닌 또는 글리신과 같은 단일 아미노산이 적절한 링커로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 둘 이상의, 예를 들어, 3개, 4개, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 구현예에서, 2개 이상, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 본원에 기술된 것과 같은 링커 분자에 의해 분리된다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
바람직한 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 다음을 포함한다:
- CD3 제타의 신호 전달 도메인 및 CD28의 신호 전달 도메인,
- CD3-제타의 신호 전달 도메인 및 4-1 BB의 신호 전달 도메인,
- CD3-제타의 신호 전달 도메인 및 OX40의 신호 전달 도메인,
- CD3-제타의 신호 전달 도메인 및 ICOS의 신호 전달 도메인,
- CD3-제타의 신호 전달 도메인 및 DAP10의 신호 전달 도메인
- CD3-제타의 신호 전달 도메인, 4-1 BB의 신호 전달 도메인 및 OX40의 신호 전달 도메인.
- 4-1 BB의 신호 전달 도메인 및 CD28의 신호 전달 도메인,
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 부분은 CD3-제타의 신호 전달 도메인, 4-1 BB의 신호 전달 도메인 및 CD28의 신호 전달 도메인을 포함한다.
세포내 신호 전달 도메인은 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호 전달 도메인, 그 유래 분자, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인은 ScFv1 및 2개의 항원 결합 도메인, 즉 항원 결합 도메인 1 및 항원 결합 도메인 2로부터 선택된다.
ScFv1은 다음을 특징으로 한다:
- VL 및 VH 영역은 인간화되고,
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
VL 영역의 CDR1 CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, ScFv1의 VL 영역은 VH 영역에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치한다. 보다 바람직한 구현예에서, ScFv1의 VL 영역은 VH 영역에 대해 N-말단에 위치한다.
적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 갖는 항원 결합 도메인 1은 다음을 특징으로 한다:
- 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 갖는 항원 결합 도메인 2는 다음을 특징으로 한다:
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하고,
- VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR 서열의 기능적으로 동등한 변이체"는 그것과 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지며 본원에 기술된 ScFv와 같은 항체, 항체 단편 또는 항원 결합 도메인의 일부일 때 그것의 동족 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 유지하는 특정 CDR 서열의 서열 변이체를 지칭한다. 예를 들어, CDR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하는 상기 서열의 폴리펩티드 서열 유도체일 수 있다. 일 구현예에서, 하나의 아미노산을 기능적으로 동등한 변이체 내 다른 것으로 치환하는 것은 보존적 치환이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 다음의 6개의 그룹은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 각각 함유한다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
본 발명에 따른 CDR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 위의 참조 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열을 포함한다. 또한, CDR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 위의 참조 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N- 및 C-말단 둘 다에서 적어도 1개의 아미노산, 또는 적어도 2개의 아미노산, 또는 적어도 3개의 아미노산, 또는 적어도 4개의 아미노산, 또는 적어도 5개의 아미노산, 또는 적어도 6개의 아미노산, 또는 적어도 7개의 아미노산, 또는 적어도 8개의 아미노산, 또는 적어도 9개의 아미노산, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 첨가를 포함한다는 것이 고려된다. 마찬가지로, 변이체는 위에 언급된 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N- 및 C-말단 둘 다에서 적어도 1개의 아미노산, 또는 적어도 2개의 아미노산, 또는 적어도 3개의 아미노산, 또는 적어도 4개의 아미노산, 또는 적어도 5개의 아미노산, 또는 적어도 6개의 아미노산, 또는 적어도 7개의 아미노산, 또는 적어도 8개의 아미노산, 또는 적어도 9개의 아미노산, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 결실을 포함한다는 것이 고려된다.
본 발명에 따른 CDR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 본 발명의 CAR의 ScFv와 같은 항체 단편 또는 항원 결합 도메인의 일부일 때 서열번호 1~18 및 174~179 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 그의 동족 항원에 결합하는 능력의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 또는 적어도 200% 이상을 유지할 것이다. 동족 항원에 결합하는 이러한 능력은 항체 또는 항체 단편의 동족 항원에 대한 친화도, 결합능, 특이성 및/또는 선택성의 값으로서 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, ScFv1의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 19, 20, 21 및 22의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, ScFv1의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 23, 24, 25 및 26의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34, 서열번호 65, 66, 67 및 68 또는 서열번호 73, 74, 75 및 76의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38, 서열번호 69, 70, 71 및 72 또는 서열번호 77, 78, 79 및 80의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 2의 적어도 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45, 서열번호 89, 90, 91 및 92 또는 서열번호 97, 98, 99 및 100의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49, 또는 서열번호 93, 94, 95 및 96의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체"는 그것과 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지며 본원에 기술된 항체 또는 항체 결합 도메인의 일부일 때 그의 동족 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 유지하는 특정 FR 서열의 서열 변이체를 지칭한다. 예를 들어, FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하는 상기 서열의 폴리펩티드 서열 유도체일 수 있다.
본 발명에 따른 FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 위의 참조 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열과 적어도 대략 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 FR 서열을 포함한다. 또한, FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 위의 참조 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N- 및 C-말단 둘 다에서 적어도 1개의 아미노산, 또는 적어도 2개의 아미노산, 또는 적어도 3개의 아미노산, 또는 적어도 4개의 아미노산, 또는 적어도 5개의 아미노산, 또는 적어도 6개의 아미노산, 또는 적어도 7개의 아미노산, 또는 적어도 8개의 아미노산, 또는 적어도 9개의 아미노산, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 첨가를 포함한다는 것이 고려된다. 마찬가지로, 변이체는 위에 언급된 서열 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N- 및 C-말단 둘 다에서 적어도 1개의 아미노산, 또는 적어도 2개의 아미노산, 또는 적어도 3개의 아미노산, 또는 적어도 4개의 아미노산, 또는 적어도 5개의 아미노산, 또는 적어도 6개의 아미노산, 또는 적어도 7개의 아미노산, 또는 적어도 8개의 아미노산, 또는 적어도 9개의 아미노산, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 결실을 포함한다는 것이 고려된다.
본 발명에 따른 FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인의 일부일 때 서열번호 19~26, 31~38 및 42~49 중 하나에 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 그의 동족 항원에 결합하는 능력의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 또는 적어도 200% 이상을 유지할 것이다. 동족 항원에 결합하는 이러한 능력은 항체 또는 항체 단편의 동족 항원에 대한 친화도, 결합능, 특이성 및/또는 선택성의 값으로서 결정될 수 있다.
일 구현예에서, ScFv1의 VL은 서열번호 27 또는 180의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하고, ScFc1의 VH는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 서열번호 28 또는 181의 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 VH는 서열번호 40의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 39, 54 또는 56의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 40, 53 또는 55의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다,
일 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VL은 서열번호 50 또는 184의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH는 기능적으로 동등한 이의 변이체의 서열번호 51의 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 50, 184, 60 또는 62의 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 51, 59 또는 61로부터 선택된 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
ScFv1의 VL 및 VH 영역의 바람직한 구현예는 아래에 정의된 바와 같다:
1. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VL은 다음을 특징으로 한다:
1.1. CDR1 영역이 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 10 또는 16)을 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4) 또는 서열 RASQSVGTAVA(서열번호 175)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.2. CDR1 영역이 5번 위치에 Asn 잔기를 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4) 또는 서열 RASQSVGTAVA(서열번호 175)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.3. CDR1 영역이 KASQSVGTAVA(서열번호 4)의 서열 또는 서열 RASQSVGTAVA(서열번호 175)에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4) 또는 서열 RASQSVGTAVA(서열번호 175)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보인다.
1.4. CDR1 영역이 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 10 또는 16)을 함유하지 않으며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개의 아미노산 또는 모든 아미노산이 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4) 또는 서열 RASQSVGTAVA(서열번호 175) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
1.5. CDR1 영역이 서열 KASQNVGTAVA(서열 번호 10 또는 16)를 함유하지 않으며, KASQSVGTAVA(서열 번호 4)의 서열 또는 서열 RASQSVGVA(서열 번호 175)와 공통적인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 아미노산을 함유한다.
2. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VL은 다음을 특징으로 한다:
2.1. CDR2 영역이 서열 SASNRYT(서열번호 11 또는 17)을 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 SASNRFT(서열번호 5)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.2. CDR2 영역이 6번 위치에서 Tyr 잔기를 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 SASNRFT(서열번호 5)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.3. CDR2 영역이 SASNRYT(서열번호 5)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 SASNRFT(서열번호 5)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.4. CDR2 영역이 서열 SASNRYT(서열 번호 11 또는 17)를 함유하지 않으며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 모든 아미노산은 서열 SASNRFT(서열 번호 5) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
2.5. CDR2 영역이 서열 SASNRYT(서열 번호 11 또는 17)를 함유하지 않으며, 서열 SASNRFT(서열 번호 5)와 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산을 함유한다.
3. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VL은 다음을 특징으로 한다:
3.1. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12) 또는 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)을 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLA(서열번호 6)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.2. CDR3 영역이 9번 위치에서 Thr 잔기 및/또는 5번 위치에서 Ser 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLA(서열번호 6)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.3. CDR3 영역이 QQYSTYPLA(서열번호 6)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLA(서열번호 6)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.4. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLT(서열 번호 12) 또는 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)를 함유하지 않으며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 아미노산이 서열 QQYSTYPLA(서열 번호 6) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
3.5. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLT(서열 번호 12) 또는 서열QQYSSYPLT(서열번호 18)를 함유하지 않으며, QQYSTYPLA(서열 번호 6)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유한다.
4. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VH는 다음을 특징으로 한다:
4.1. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열번호 7) 또는 서열 DYGMS(서열번호 13)을 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 DFGMS(서열번호 1)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.2. CDR1 영역이 1번 위치에서 Thr 잔기, 2번 위치에서 Tyr 잔기 및/또는 5번 위치에서 Ala 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 DFGMS(서열번호 1)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.3. CDR1 영역이 DFGMS(서열번호 1)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 DFGMS(서열번호 1)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.4. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 또는 서열 DYGMS(서열번호 13)를 함유하지 않으며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 DFGMS(서열 번호 1) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
4.5. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 또는 서열 DYGMS(서열번호 13)를 함유하지 않고, 서열 DFGMS(서열 번호 1)와 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
5. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VH는 다음을 특징으로 한다:
5.1. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 174)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.2. CDR2 영역이 4번 위치에서 Ser 또는 Gly 잔기, 7번 위치에서 Val 잔기, 8번 위치에서 Lys 잔기, 9번 위치에서 Ile 잔기, 10번 위치에서 Tyr 잔기, 11번 위치에서 His 잔기, 12번 위치에서 Val 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 174)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.3. CDR2 영역이 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 14)에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 174)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보인다.
5.4. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개의 아미노산 또는 모두가 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 174) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
5.5. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고, 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDSVKG(서열번호 174)와 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 아미노산을 함유한다.
6. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 ScFv1의 VH는 다음을 특징으로 한다:
6.1. CDR3 영역이 서열 EGFDY(서열번호 9 또는 15)를 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 EGLDY(서열번호 3)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.2. CDR3 영역이 3번 위치에서 Phe 잔기를 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 EGLDY(서열번호 3)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.3. CDR3 영역이 EGLDY(서열번호 3)의 서열에 대해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 EGLDY(서열번호 3)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.4. CDR3 영역이 서열 EGFDY(서열번호 9 또는 15)를 함유하지 않으며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 EGFDY(서열 번호 3) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
6.5. CDR3 영역이 서열 EGFDY(서열번호 9 또는 15)를 함유하지 않으며, EGFDY(서열 번호 3)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
항원 결합 도메인 1의 VL 및 VH 영역의 바람직한 구현예는 아래에 정의된 바와 같다:
1. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VL은 다음을 특징으로 한다
1.1. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 10)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.2. CDR1 영역이 5번 위치에서 Ser 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 10)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.3. CDR1 영역이 KASQNVGTAVA(서열번호 10)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 10)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.4. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열 번호 4)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개의 아미노산 또는 모든 아미노산이 서열 KASQNVGTAVA(서열 번호 10) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
1.5. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열 번호 4)를 함유하지 않고, 서열 KASQSVGTAVA(서열 번호 10)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 아미노산을 함유한다.
2. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VL은 다음을 특징으로 한다
2.1. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열번호 5)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 11)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.2. CDR2 영역이 6번 위치에서 Phe 잔기를 함유하지 않으며, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 11)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.3. CDR2 영역이 SASNRYT(서열번호 11)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 11)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.4. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열 번호 5)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 모든 아미노산이 서열 SASNRYT(서열 번호 11) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
2.5. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열 번호 5)를 함유하지 않고, SASNRYT(서열번호 11)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산을 함유한다.
3. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VL은 다음을 특징으로 한다
3.1. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열번호 6) 또는 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)을 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.2. CDR3 영역이 9번 위치에서 Ala 잔기 및/또는 5번 위치에서 세린 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.3. CDR3 영역이 QQYSTYPLT(서열번호 12)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.4. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열 번호 6) 또는 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 아미노산이 서열 QQYSTYPLT(서열 번호 12) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
3.5. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열 번호 6) 또는 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)를 함유하지 않고, QQYSTYPLT(서열번호 12)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유한다.
4. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VH는 다음을 특징으로 한다
4.1. CDR1 영역이 서열 DFGMS(서열번호 1) 또는 서열 DYGMS(서열번호 13)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TYGMA(서열번호 7)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.2. CDR1 영역이 1번 위치에서 Asp 잔기, 2번 위치에서 Phe 잔기 및/또는 5번 위치에서 Ser 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TYGMA(서열번호 7)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.3. CDR1 영역이 TYGMA(서열번호 7)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 TYGMA(서열번호 7)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.4. CDR1 영역이 서열 DFGMS(서열 번호 1) 또는 서열 DYGMS(서열번호 13)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
4.5. CDR1 영역이 서열 DFGMS 또는 서열 DYGMS를 함유하지 않고, 서열 TYGMA(서열번호 7)과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
5. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VH는 다음을 특징으로 한다
5.1. CDR2 영역이 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.2. CDR2 영역이 4번 위치에서 Thr 또는 Gly 잔기, 7번 위치에서 Val 잔기, 8번 위치에서 Thr, 9번 위치에서 Ile 잔기, 10번 위치에서 His 잔기, 12번 위치에서 Val 잔기 및/또는 14번 위치에서 Asn 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.3. CDR2 영역이 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8)의 서열에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보인다.
5.4. CDR2 영역이 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개의 아미노산 또는 모두가 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
5.5. CDR2 영역이 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2) 또는 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)를 함유하지 않고,TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 아미노산을 함유한다.
6. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 1의 VH는 다음을 특징으로 한다.
6.1. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열번호 3)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 9) 또는 서열 DY와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다,
6.2. CDR3 영역이 3번 위치에서 Leu 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 9) 또는 서열 DY와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.3. CDR3 영역이 EGFDY(서열번호 9)의 서열에 대해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 9) 또는 서열 DY와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.4. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열 번호 3)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 EGFDY(서열 번호 9) 또는 DY 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
6.5. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열 번호 3)를 함유하지 않고, EGFDY(서열 번호 9)의 서열 또는 서열 DY와 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
항원 결합 도메인 2의 VL 및 VH 영역의 바람직한 구현예는 아래에 정의된 바와 같다.
1. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VL은 다음을 특징으로 한다
1.1. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열번호 4)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 16) 또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.2. CDR1 영역이 5번 위치에서 Ser 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 16) 또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
1.3. CDR1 영역이 KASQNVGTAVA(서열번호 16)의 서열 또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179)의 서열에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 KASQNVGTAVA(서열번호 16) 또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보인다.
1.4. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열 번호 4)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개의 아미노산 또는 모든 아미노산이 서열 KASQNVGTAVA(서열 번호 16) 또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
1.5. CDR1 영역이 서열 KASQSVGTAVA(서열 번호 4)를 함유하지 않고, 서열 KASQNVGTAVA(서열 번호 16)의 서열또는 서열 RASQNVGTAVA(서열번호 179)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 아미노산을 함유한다.
2. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VL은 다음을 특징으로 한다
2.1. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열번호 5)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 17)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.2. CDR2 영역이 6번 위치에서 Phe 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 17)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.3. CDR2 영역이 SASNRYT(서열번호 17)의 서열에 대해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 SASNRYT(서열번호 17)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
2.4. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열 번호 5)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 모든 아미노산이 서열 SASNRYT(서열 번호 17) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
2.5. CDR2 영역이 서열 SASNRFT(서열 번호 5)를 함유하지 않고, SASNRYT(서열번호 17)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산을 함유한다.
3. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VL은 다음을 특징으로 한다
3.1. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열번호 6) 또는 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)을 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.2. CDR3 영역이 9번 위치에서 Ala 잔기 및/또는 5번 위치에서 Thr 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.3. CDR3 영역이 QQYSSYPLT(서열번호 18)의 서열과 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 QQYSSYPLT(서열번호 18)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
3.4. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열 번호 6) 또는 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 모든 아미노산이 서열 QQYSSYPLT(서열 번호 18) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
3.5. CDR3 영역이 서열 QQYSTYPLA(서열 번호 6) 또는 서열 QQYSTYPLT(서열번호 12)를 함유하지 않고, QQYSSYPLT(서열번호 18)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유한다.
4. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VH는 다음을 특징으로 한다
4.1. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 또는 서열 DFGMS(서열 번호 1)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 DYGMS(서열번호 13)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다,
4.2. CDR1 영역이 1번 위치에서 Thr 잔기, 2번 위치에서 Phe 잔기 및/또는 5번 위치에서 Ala 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 DYGMS(서열번호 13)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다,
4.3. CDR1 영역이 DYGMS(서열 번호13)의 서열에 대해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 DYGMS(서열번호 13)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
4.4. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 또는 서열 DFGMS(서열 번호 1)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 DYGMS(서열 번호 13) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
4.5. CDR1 영역이 서열 TYGMA(서열 번호 7) 또는 서열 DFGMS(서열번호 1)를 함유하지 않고, DYGMS(서열번호 13)과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
5. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VH는 다음을 특징으로 한다
5.1. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.2. CDR2 영역이 4번 위치에서 Ser 또는 Thr 잔기, 7번 위치에서 Gly 잔기, 8번 위치에서 Thr 잔기, 9번 위치에서 Thr 잔기, 10번 위치에서 His 잔기, 11번 위치에서 His 잔기, 12번 위치에서 Pro 잔기 및/또는 14번 위치에서 Asn 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
5.3. CDR2 영역이 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)의 서열에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보인다.
5.4. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개의 아미노산 또는 모두가 서열 TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
5.5. CDR2 영역이 서열 TINSNGGKTYHPDSVKG(서열번호 8) 또는 서열 TINTNGGTTHYPDNVKG(서열번호 2)를 함유하지 않고, TINGNGVKIYYVDSVKG(서열번호 14)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 아미노산을 함유하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 아미노산을 함유한다.
6. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 도메인 2의 VH는 다음을 특징으로 한다
6.1. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열번호 3)를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 15)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다,
6.2. CDR3 영역이 3번 위치에서 Leu 잔기를 함유하지 않고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 15)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.3. CDR3 영역이 EGFDY(서열번호 15)의 서열에 대하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 상이하고, 선택적으로, 서열 EGFDY(서열번호 15)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 보인다.
6.4. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열 번호 3)를 함유하지 않고, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산이 서열 EGFDY(서열 번호 15) 내 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산의 보존적 치환이다.
6.5. CDR3 영역이 서열 EGLDY(서열 번호 3)를 함유하지 않고, EGFDY(서열 번호 15)의 서열과 공통인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 함유한다.
또 다른 구현예에서, ScFv1은 서열번호 30 또는 182의 서열 또는 이의 기능적 동등체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 41 또는 이의 기능적 동등체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 41, 187, 188 또는 189의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 서열번호 52 또는 186의 서열 또는 이의 기능적 동등체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 서열번호 52, 186, 190 또는 191의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, ScFv1의 VL은 서열번호 27 또는 180과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, ScFv1의 VL은 서열번호 27 또는 180의 서열 또는 서열번호 27 또는 180과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, ScFv1의 VH는 서열번호 28 또는 181과 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, ScFv1의 VH는 서열번호 28 또는 181의 서열 또는 서열번호 28 또는 181과 적어도 67%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, ScFv1은 서열번호 28의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, ScFv1는 서열번호 30 또는 182와 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, ScFv1은 서열번호 30 또는 182의 서열 또는 서열번호 30 또는 182와 적어도 76%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39의 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH는 서열번호 40의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39의 서열 또는 서열번호 39와 적어도 39%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH는 서열번호 40과 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%의 서열번호 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH는 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40과 적어도 74%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 41의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 41과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 41의 서열 또는 서열번호 41과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VL은 서열번호 50 또는 184의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH는 서열번호 51의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VL은 서열번호 50 또는 184와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 의 적어도 하나의 VL은 서열번호 50 또는 184의 서열 또는 서열번호 50 또는 184와 적어도 89%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH는 서열번호 51과 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH는 서열번호 51의 서열 또는 서열번호 51과 적어도 67%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 서열번호 52 또는 186의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 서열번호 52 또는 186과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 도메인 은 서열번호 52 또는 186의 서열 또는 서열번호 52 또는 186과 적어도 78%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 1 및 2의 VH 및/또는 VL 영역은 인간화된다.
따라서, 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 53 및 55으로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 54 및 56으로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 서열번호 187, 188 및 189로부터 선택된 인간화 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 65, 66, 67 및 68의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 적어도 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 69, 70, 71 및 72의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 73, 74, 75 및 76의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 77, 78, 79 및 80의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함하되, 이러한 FR 영역은 다음으로부터 선택된다:
FR1: 서열번호 65 및 73;
FR2: 서열번호 66 및 74;
FR3: 서열번호 67 및 75; 및
FR4: 서열번호 68 및 76;
또는 기능적으로 동등한 이의 변이체.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함하되, 이러한 FR 영역은 다음으로부터 선택된다:
FR1: 서열번호 69 및 77;
FR2: 서열번호 70 및 78;
FR3: 서열번호 71 및 79 i; 및
FR4: 서열번호 72 및 80.
또는 기능적으로 동등한 이의 변이체.
따라서, 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 59 및 61로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 60 및 62로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 서열번호 190 및 191로부터 선택된 인간화 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 89, 90, 91 및 92의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 93, 94, 95 및 96의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 97, 98, 99 및 100의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 101, 102, 103 및 104의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 FR 영역은, FR1의 경우 서열번호 89 및 97, FR2의 경우 서열번호 90 및 98, FR3의 경우 서열번호 91 및 99 및 FR4의 경우 서열번호 92 및 100 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VL 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 FR 영역은, FR1의 경우 서열번호 93 및 101, FR2의 경우 서열번호 94 및 102, FR3의 경우 서열번호 95 및 103 및 FR4의 경우 서열번호 96 및 104 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 경우에, CAR은 임의의 2개의 인접한 도메인 사이에 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 항원 결합 도메인의 공동 자극 도메인과 막관통 도메인 사이에 배치될 수 있다. 다른 예시로서, 링커는 항원 결합 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 배치될 수 있다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인이 ScFv인 경우, 항원 결합 도메인의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를포함하는 링커 영역에 의해 연결된다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인 1은 ScFv이고, ScFv의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인 2는 ScFv이고, ScFv의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된다.
특정 구현예에서, 링커는 ScFv의 VH와 VL 영역 사이에 위치한다. 보다 구체적인 구현예에서, VH와 VL 사이의 링커는 서열 번호 29 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR의 ScFv가 ScFv1인 경우, ScFv는 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CAR의 ScFv가 ScFv1인 경우, ScFv는 VL-링커-VH 구조를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 1 또는 2가 ScFv인 경우, ScFv는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 VL 영역에 대해 C-말단에 위치하고 VH 영역에 대해 N-말단에 위치한다(즉, VL-링커-VH).
용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하거나 본 발명의 CAR의 임의의 영역 또는 영역을 연결하기 위해, 단독으로 사용되거나 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커를 지칭한다.
링커 펩티드는 다양한 아미노산 서열 중 어느 하나를 가질 수 있다. 다른 화학적 결합이 배제되는 것은 아니지만, 단백질은 일반적으로 가요성 성질의 스페이서 펩티드에 의해 결합될 수 있다. 링커는 약 6개 내지 약 40개 아미노산의 길이, 또는 약 6개 내지 약 25개 아미노산의 길이의 펩티드일 수 있다. 이들 링커는 합성, 링커 암호화 올리고뉴클레오티드를 사용해 단백질을 결합시킴으로써 생산될 수 있다. 유연성 정도를 갖는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 연결 펩티드는, 적절한 링커가 일반적으로 가요성 펩티드를 생성하는 서열을 가질 것이라는 점을 염두에 두고, 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 글리신 및 알라닌과 같은 작은 아미노산의 사용은 가요성 펩티드를 생성하는 데 사용된다. 이러한 서열의 생성은 당업자에게 통상적이다.
적절한 링커는 쉽게 선택될 수 있고, 예컨대 1개 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산, 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산과 같은 임의의 상이한 적절한 길이일 수 있고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 아미노산일 수 있다.
예시적인 가요성 링커는 서열 TGSTSGKPGSGEGS(서열 번호 29)를 갖는 링커를 포함한다. 적합한 링커는 글리신 중합체(G) n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS) n, GSGGS n(서열번호 117) 및 GGGS n(서열번호 118)을 포함함, 여기서 n은 적어도 하나의 정수), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 화학식 (G4S)3의 글리신 중합체를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 이들 아미노산 둘 모두가 비교적 비구조화되어 있으므로, 관심 대상이며, 따라서 성분 사이의 중립 테더로서 기능할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 상당히 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한되기 때문에, 글리신 중합체는 특히 관심이 있다. 예시적인 가요성 링커는 GGSG(서열번호 119), GGSGG(서열번호 120), GSGSG(서열번호 121), GSGGG(서열번호 122), GGGSG(서열번호 123), GSSSG(서열번호 124) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 당업자는 전술한 임의의 요소에 접합된 펩티드의 설계가, 링커가 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분뿐만 아니라 가요성 링커를 포함할 수 있도록, 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "힌지 도메인", "힌지 영역" 또는 "스페이서"는 결합 모이어티 및 T 세포 막의 분리 및 가요성을 허용하는 아미노산 영역을 지칭한다. 가요성 힌지의 길이는 또한 상대적으로 접근 불가능한 에피토프에 대한 더 양호한 결합을 허용하며, 예를 들어, 더 긴 힌지 도메인은 최적의 결합을 허용한다. 당업자는 주어진 CAR 표적에 대한 적절한 힌지를 결정할 수 있을 것이다.
일부 경우에, 본 발명에 따른 CAR의 제1 폴리펩티드는 힌지 도메인을 포함하며, 힌지 도메인은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 삽입된다. 일부 경우에, 힌지 도메인은 면역글로불린 중쇄 힌지 도메인이다. 일부 경우에, 힌지 도메인은 수용체로부터 유래된 도메인 영역 폴리펩티드(예를 들어, CD8 유래된 힌지 도메인)이다.
힌지 도메인은 약 10개 아미노산 내지 약 200개 아미노산, 바람직하게는 50개 내지 150개 아미노산, 보다 바람직하게는 75개 내지 125개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
예시적인 스페이서는 글리신 중합체(G) n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS) n, (GSGGS) n(서열번호 125) 및 (GGGS) n(서열번호 126)을 포함하며, 여기서 n은 적어도 하나의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 사용될 수 있고; Gly 및 Ser 둘 다는 비교적 비구조화되어 있으며, 따라서 성분 사이의 중립 테더로서 기능할 수 있다. 글리신 중합체가 사용될 수 있고; 글리신은 심지어 알라닌보다 상당히 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다. 예시적인 스페이서는 GGSG(서열 번호 127), GGSGG(서열 번호 128), GSGSG(서열 번호 129), GSGGG(서열 번호 130), GGGSG(서열 번호 131), GSSSG(서열 번호 132) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호 116)를 포함한다.
일부 경우에, 본 발명에 따른 CAR의 제1 폴리펩티드 내의 힌지 도메인은 적어도 하나의 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 힌지 도메인은 서열 Cys-Pro-Pro-Cys(서열 번호 133)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 제1 CAR의 힌지 도메인 내의 시스테인은 제2 CAR 내 힌지 도메인과 이황화 결합을 형성하기 위해 이용 가능할 수 있다.
면역글로불린 힌지 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, Tan 등의 문헌 [(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162]; 및 Huck 등의 문헌 [(1986) Nucl. Acids Res. 14:1779]을 참조한다. 비제한적인 예로서, 면역글로불린 힌지 도메인은 다음의 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다: DKTHT(서열번호 134); CPPC(서열번호 133); CPEPKSCDTPPPCPR(서열번호 136)(예를 들어, Glaser 등의 문헌[(2005) J. Biol. Chem. 280:41494] 참조); ELKTPLGDTTHT(서열번호 137); KSCDKTHTCP(서열번호 138); KCCVDCP(서열번호 139); KYGPPCP(서열번호 140); EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 141)(인간 IgG1 힌지); ERKCCVECPPCP(서열번호 142(인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호 143) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ(서열번호 144)(인간 IgG4 힌지); 등.
힌지 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 힌지 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 야생형(자연 발생) 힌지 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지의 His 229는 Tyr로 치환될 수 있으므로, 힌지 도메인은 서열 EPKSCDKTYTCPPCP(서열 번호 145)를 포함한다. 예를 들어, Yan 등의 문헌 [(2012) J. Biol. Chem. 287:5891]을 참조한다.
힌지 도메인은 인간 CD8로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 예를 들어, 힌지 도메인은 아미노산 서열 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 146), 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CAR은 N-말단에서부터 C-말단으로 항-p95HER2 경쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-p95HER2 중쇄 가변 도메인, CD8, 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 이어서 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이고, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이고, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 공동자극 도메인이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR은 CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인 및 CD28 공동자극 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR에 관련된 핵산 및 숙주 세포
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 개시는 본 발명의 CAR 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 또는 이중 가닥 형태인 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이러한 용어는 기준 핵산의 결합 능력과 유사한 결합 능력을 가지며 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사하게 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특이적 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈으로의 치환), 대립유전자, 오소로그, SNP 및 상보적 서열뿐만 아니라 직접 형태로 표시된 서열을 암시한다. 특히, 축퇴성 코돈으로의 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기를 갖는 잔기에 의해 대체되는 서열을 생성함으로써 수득될 수 있다.
일부 경우에, 대상 핵산은, 예를 들어, 포유류 세포에서 본 개시의 CAR의 생성을 제공한다. 다른 경우에, 대상 핵산은 CAR 암호화 핵산의 증폭을 제공한다.
본 발명의 임의의 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서 등에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
적절한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현의 경우 적합한 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 진핵 세포에서의 발현의 경우, 적합한 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복체에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 다양한 당업계에 공지된 조직 특이적 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
가역적 유도성 프로모터를 포함하는 적절한 가역적 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터는 많은 유기체, 예를 들어, 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고 유래될 수 있다. 제2 유기체에 사용하기 위한 제1 유기체, 예를 들어, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등으로부터 유래된 가역적 프로모터의 변형은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 가역적 프로모터, 및 이러한 가역성 프로모터에 기반하지만, 추가 조절 단백질을 또한 포함하는 시스템은, 이에 제한되지는 않지만, 알코올 조절 프로모터(예를 들어, 알코올 탈수소효소 I(alcA) 유전자 프로모터, 알코올 전사활성화 단백질(AlcR)에 반응하는 프로모터, 등). 테트라사이클린 조절 프로모터,(예를 들어, TetActivator, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절 프로모터(예를 들어, 랫트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템, 등). 금속 조절 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터 시스템, 등). 병원성 관련 조절 프로모터(예를 들어, 살리실산 조절 프로모터, 에틸렌 조절 프로모터, 벤조티아디아졸 조절 프로모터, 등). 온도 조절 프로모터(예를 들어, 열충격 유도성 프로모터(예를 들어, HSP-70, HSP-90, 대두 열충격 프로모터, 등). 광 조절 프로모터, 합성 유도성 프로모터, 등이다.
일부 경우에, 적절한 프로모터를 함유하는 유전자좌 또는 작제물 또는 이식 유전자는 유도성 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 전환된다. 비가역적 스위치의 유도에 적합한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 비가역적 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합을 사용할 수 있다. 당업계에 알려진 재조합효소, 엔도뉴클레아제, 리가아제, 재조합 부위 등의 임의의 적절한 조합이 비가역적으로 전환 가능한 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기술된 부위 특이적 재조합을 수행하기 위한 방법, 기전, 및 요건은 비가역적으로 전환된 프로모터의 생성을 위한 용도를 발견하고, 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 경우에, 프로모터는 CD8 세포-특이적 프로모터, CD4 세포-특이적 프로모터, 호중구-특이적 프로모터, 또는 NK-특이적 프로모터이다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. 또 다른 실시예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포 특이적 발현은 Ncr1(p46) 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있다; 예를 들어, Eckelhart 등의 문헌 [(2011) Blood 117:1565]을 참조한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 효모 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터는 구조성 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절 가능한 프로모터, 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1(예를 들어, 피치아에서 사용)이다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
원핵 숙주 세포에 사용하기에 적합한 프로모터는, 이에 제한되지는 않으나, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 혼성화 프로모터, 예를 들어, lac/tac 혼성화 프로모터, tac/trc 혼성화 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터, 등; araBAD 프로모터; 생체 내 조절 프로모터, 예를 들어, ssaG 프로모터 또는 관련 프로모터, pagC 프로모터, nirB 프로모터, 등; 시그마70 프로모터, 예를 들어, 컨센서스 시그마70 프로모터; 정지상 프로모터, 예를 들어, dps 프로모터, spv 프로모터, 등; 병원성 섬 SPI-2로부터 유래된 프로모터; actA 프로모터; rpsM 프로모터; tet 프로모터; SP6 프로모터; 등을 포함한다. 대장균과 같은 원핵생물에 사용하기에 적합한 강력한 프로모터는 Trc, Tac, T5, T7, 및 P 람다를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 박테리아 숙주 세포에 사용하기 위한 작동자의 비제한적인 예는 락토오스 프로모터 작동자(LacI 억제자 단백질은 락토오스와 접촉될 때 형태가 변화하고, 이에 따라 LacI 억제자 단백질이 작동자에 결합하는 것을 방지함), 트립토판 프로모터 작동자(트립토판과 복합체화될 때, TrpR 억제자 단백질은 작동자에 결합하는 형태를 가지며; 트립토판이 없는 경우, TrpR 억제자 단백질은 작동자에 결합하지 않는 형태를 가짐), 및 tac 프로모터 작동자를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR을 암호화하는 핵산은 핵산의 발현 후에, CAR에 대해 N-말단에 위치하는 신호 서열을 생성하는 리더 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "리더 펩티드"는 당업계 내 그의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 약 5~30개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드를 지칭한다. 리더 펩티드는 분비 경로의 일부를 형성하는 새롭게 합성된 단백질의 N-말단에 존재한다. 분비 경로의 단백질은 특정 소기관(소포체, 골지 또는 엔도솜) 내에 상주하거나, 세포로부터 분비되거나, 세포막에 삽입되는 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 리더 펩티드는 단백질의 막관통 도메인의 일부를 형성한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산은 N-말단에서부터 C-말단으로 단백질을 암호화한다: 리더 펩티드는 분비 경로의 일부를 형성하는 새롭게 합성된 단백질의 N-말단에 존재한다. 분비 경로의 단백질은 특정 소기관(소포체, 골지 또는 엔도솜) 내에 상주하거나, 세포로부터 분비되거나, 세포막에 삽입되는 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 리더 펩티드는 단백질의 막관통 도메인의 일부를 형성한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산은 N-말단에서부터 C-말단으로 다음의 단백질을 암호화한다: 리더 펩티드, 항-p95HER2 경쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-p95HER2 중쇄 가변 도메인, CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 공동 자극 도메인에 이어서 CD3 제타 세포 내 신호 전달 도메인.
또 다른 구현예에서, 리더 서열은 CD8 리더 서열이다. 특정 구현예에서, 리더 펩티드는 서열번호 147(MALPVTALLLPLALLLHAARP) 서열을 포함한다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 이에 의해 숙주가 형질전환되는 비히클이며 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)은 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있어서 플라스미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 벡터를 촉진하는 비히클을 의미한다.
본 발명의 임의의 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 발현 벡터는 선택성 마커, 복제 기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지보수를 제공하는 다른 특징부를 포함할 수 있다. 적절한 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다.
많은 수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있으며; 많은 수가 대상 재조합 작제물을 생성하기 위해 상업적으로 이용 가능하다. 하기 벡터는 예로서 제공된다. 박테리아: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5(Pharmacia, Sweden). 진핵생물: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동하는 선택성 마커가 존재할 수 있다. 적절한 발현 벡터는, 이에 제한되지는 않지만, 바이러스 벡터(예를 들어, 우두 바이러스에 기초한 바이러스 벡터; 폴리오바이러스; 아데노바이러스; 아데노-연관 바이러스; SV40; 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스; 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 루스 사르코마 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수 증식 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터); 등을 포함한다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR 중 어느 하나를 포함하는 핵산은 일부 구현예에서 RNA, 예를 들어 시험관 내 합성된 RNA일 것이다. RNA의 시험관 내 합성 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 임의의 공지된 방법은 본 개시의 이종이량체, 조건부 활성 CAR의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 합성하는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포 내로 RNA를 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 개시의 이종이량체, 조건부 활성 CAR의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 시험관 내 또는 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 본 개시의 이종이량체, 조건부 활성 CAR의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA로 시험관 내 또는 생체 외에서 전기천공될 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 이의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선택성 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염되는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 할 수 있고; 다른 양태에서, 선택성 마커는 별도의 DNA 조각 상에서 운반될 수 있고 동시 형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택성 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열 측면에 위치할 수 있다. 유용한 선택성 마커는, 예를 들어, neo 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다. 리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고, 발현이 쉽게 검출 가능한 일부 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 구현되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적절한 리포터 유전자는 루시페라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 분비된 알칼리 인산분해효소, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 적절한 발현 시스템은 잘 알려져 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 가장 높은 발현 수준을 보여주는 최소 5' 측면 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고, 프로모터-유도 전사를 조절하는 능력에 대한 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "숙주 세포" 또는 "조작된 세포"는 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 첨가 또는 변형에 의해 변형, 형질전환 또는 조작되는 임의의 유기체의 임의의 세포를 의미한다. 이는 또한 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 본 발명의 숙주 세포 또는 유전적으로 조작된 세포는 단리된 면역 세포, 예컨대 키메라 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체 복합체를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하고 세포 표면 상에서 키메라 수용체를 발현하는 T, NK, 또는 NKT 세포를 포함한다. 단리된 숙주 세포 및 조작된 세포는, 예를 들어, NK 또는 NKT 세포 활성 또는 T 림프구 활성을 향상시키기 위해, 암의 치료, 및 감염성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 세포; 또는 본원에 기술된 CAR 폴리펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산은 포유류 세포이다.
적합한 포유류 세포는 일차 세포 및 불멸화 세포주를 포함한다. 적절한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는, 이에 제한되지는 않으나, HeLa 세포(예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC No. CRL-1573), 베로 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포(ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, Jurkat, HL-60, NK 세포주(예를 들어, NKL, NK92, 및 YTS) 등을 포함한다.
일 구현예에서, 포유류 세포는 본원에 기술된 CAR 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함한다. 포유류 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있지만, 임의의 다른 포유류 세포가 사용될 수 있다. 임의의 양태의 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간이다.
일부 경우에, 세포는 불멸화 세포주가 아니라, 대신에 개체로부터 수득된 세포(예를 들어, 일차 세포)이다. 예를 들어, 일부 경우에, 세포는 개체로부터 수득된 면역 세포이다.
조작된 세포는 말초 혈액, 제대혈, 골수, 종양 침윤 림프구, 림프절 조직, 또는 흉선 조직으로부터 수득될 수 있다. 숙주 세포는 태반 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있다. 세포는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 및 이의 유전자이식 종으로부터 수득될 수 있다. 세포는 확립된 세포주로부터 수득될 수 있다.
위의 세포는 임의의 공지된 수단에 의해 수득될 수 있다. 세포는 조작된 세포의 수용자에 대해 자가, 동종, 동종이계, 또는 이종일 수 있다. 용어 "자가"는 나중에 개체에 다시 도입되기 위해 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않을 때, 둘 이상의 개체는 서로에 대해 동종이계인 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원과 관련하여 상호작용하기에 충분히 유전적으로 상이할 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "동종"은 특히 항원 또는 면역 반응과 관련하여 매우 가까운 유전적 유사성 또는 동일성을 지칭한다. 동종 시스템은, 예를 들어, 기관 및 세포(예를 들어, 암 세포 및 이들의 비암성 대응체)가 동일한 개체로부터 나오는 모델, 및/또는 기관 및 세포가 동일한 교배 계통의 상이한 개별 동물로부터 나오는 모델을 포함한다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 세포"는 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 조혈 기원이며, B 세포 및 T 세포와 같은 림프구; 자연 살해 세포; 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염구 및 과립구와 같은 골수 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포; NK 세포; NKT 세포; B 세포 및 T 세포와 같은 림프구; 및 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구와 같은 골수 세포이다.
면역 세포는 암, 혈장 세포 장애, 또는 자가면역 질환 또는 장애를 가진 것으로 진단받거나 이를 갖는 대상체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 암, 예를 들어, 다발성 골수종, 무증상 골수종, 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 가진 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 항-BCMA 요법에 내성을 갖는 대상체로부터 수득된다. 면역 세포는 또한 세포의 의도된 수용자와 동일한 종의 비유전자적으로 동일한 개체인 동종이계 공여자로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 면역 세포(예를 들어, 인간 면역 세포)는 생체 외 변형 및 확장 후, 세포가 나중에 투여될 대상으로부터 수득된 자가 세포를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포는 암, 형질 세포 장애, 또는 자가면역 질환 또는 장애를 가진 것으로 진단받거나 이를 가진 개체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 또한 세포의 의도된 수용자와 동일한 종의 비유전자적으로 동일한 개체인 동종이계 공여자로부터 수득될 수 있다. 본 발명에 유용한 면역 세포는 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 NKT 세포이다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 상호 교환 가능하고 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 예는 미처리 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
천연 살해 세포 또는 "NK 세포"는 당업계에 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 자연 살해 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주를 포함한다. NK 세포주의 추가 예는 NKG, YT, NK-YS, HANK-1, YTS 세포, 및 NKL 세포를 포함한다. NK 세포는 인간에서 CD16, CD56, 및 CD8과 같은 특이적 표면 마커에 의해 검출될 수 있다. NK 세포는 T 세포 항원 수용체, 팬 T 마커 CD3, 또는 표면 면역글로불린 B 세포 수용체를 발현하지 않는다.
NK 세포는 GvHD(이식편대숙주병)의 위험 없이 항종양 효과를 매개하며 T 세포에 비해 수명이 짧다. 따라서, NK 세포는 암세포를 파괴한 직후 소진되어, 변형된 세포를 제거하게 될 CAR 작제물 상의 유도성 자살 유전자에 대한 필요성을 감소시킬 것이다.
자연 살해 T(NKT) 세포는 T 세포와 자연 살해 세포 모두의 특성을 공유하는 이종 T 세포 군이다. 따라서, NKT 세포는 αβT 세포 수용체를 공발현하지만, 또한 NK1과 같은 NK 세포와 통상적으로 연관된 다양한 분자 마커도 발현하는 T 세포의 서브세트이다. 이들 세포 중 다수는 자기 및 외래 지질 및 당지질에 결합하는 항원 제시 분자인 비다형성 CD1d 분자를 인식한다. 이들은 전체 말초 혈액 T 세포의 약 0.1%만을 구성한다. 자연 살해 T 세포는 자연 살해 세포와 혼동해서는 안 된다.
특정 구현예에서, T, NK 및 NKT 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구성분채집술 산물(PBSC), 인간 배아 줄기 세포(hESC), 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 골수, 또는 탯줄로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 면역 세포(예를 들어, 인간 면역 세포)는 생체 외 변형 및 확장 후, 세포가 나중에 투여될 대상체로부터 수득된 자가 세포를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포는 암을 가지거나로 암을 가진 것으로 진단된 개체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 또한 세포의 의도된 수용자와 동일한 종의 비유전자적으로 동일한 개체인 동종이계 공여자로부터 수득될 수 있다. 본 발명에 유용한 면역 세포는 T, NK 및 NKT 세포를 포함한다.
T, NK 및 NKT 세포를 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기술된 조작된 면역 세포에 유용할 수 있다. T, NK 및 NKT 세포는 일반적으로, 예를 들어, 이식된 포트 또는 카테터를 통한 정맥천자 또는 회수에 의해 대상체로부터 수집된 말초 혈액으로부터 수득된다. 선택적으로, 혈액은 백혈구성분채집술을 포함하는 프로세스에 의해 수득될 수 있으며, 이 과정에서 백혈구는 대상체의 혈액으로부터 수득되고, 다른 혈액 성분은 대상체에게 반환된다. 혈액 또는 백혈구성분채집술 산물(신선 또는 동결보존됨)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 T, NK 또는 NKT 세포를 풍부하게 하기 위해 가공된다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리(예를 들어, Ficoll 사용) 및/또는 반대 유동 원심 용리를 수행하여 단핵 세포(T, NK 또는 NKT 세포를 포함함)를 풍부하게 만들 수 있다. 일 실시예에서, T 세포의 경우 T 세포를 자극하고 다른 세포, 예를 들어, B 세포를 고갈시키기 위해, 예를 들어, 자성 비드에 코팅된 CD3/CD28 항체, 또는 예를 들어, 세포 표면-결합 항-CD3 및 항-CD28 항체 단편을 발현하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하는 T 세포 자극 단계(아래 참조)가 추가로 수행될 수 있다. 그런 다음, 농축된 T 세포 제제의 T 세포는 유전적 변형을 거칠 수 있다.
말초 혈액에 대한 대안으로서, 골수, 림프절, 비장 및 종양을 포함하는 조직이 T 세포 및 NK 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. T 세포 및 NK 세포는 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개, 또는 고양이 기원일 수 있지만, 임의의 다른 포유류 세포가 사용될 수 있다. 임의의 양태의 특정 구현예에서, T 또는 NK 세포는 인간이다.
T, NK 또는 NKT 세포와 같은 면역 세포는 다수의 공급원 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 세포주(예를 들어, T 세포주와 같은 면역 세포주)가 또한 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, T, NK 또는 NKT 세포)는 FicollTM 분리와 같은 당업계에 공지된 임의의 적절한 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득된다. 또 다른 구현예에서, 대상체의 순환하는 혈액 유래의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 산물에는 일반적으로 T, NK 또는 NKT 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구가 포함되어 있다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 넣을 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척될 수 있다. 대안적으로, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고 마그네슘이 결여되어 있을 수 있거나, 2가 양이온이 모두가 아닌 다수가 결여되어 있을 수 있다. 칼슘이 없는 상태에서의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 세척 단계는, 제조업체의 지침에 따라 반자동 "통과" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같이, 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는, 예를 들어, 완충제의 유무와 상관없이 무 Ca, 무 Mg PBS, PlasmaLyte A, 또는 다른 식염수와 같은 다양한 생체적합성 완충제에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 시료의 바람직하지 않은 성분이 제거되고 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통해 원심분리하거나 반대 유동 원심 용리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 당업계에 공지된 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(예를 들어, 3x28)-접합 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T로 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, T 세포의 집단은, 예를 들어, 음성으로 선택된 세포에 대해 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합에 의한 음성 선택에 의해 농축될 수 있다. 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 계측법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR을 발현하도록 변형되는 대상체로부터 유래된 세포는 이들의 사용 전에 일정 기간 동안 보관될 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 아래의 치료 방법 참조). 예를 들어, 세포는 선택적으로 세척된 후 동결될 수 있거나, 필요할 때까지 (예를 들어, 2~10℃에서 또는 실온에서 회전자 상에서) 생존성이 유지되도록 적절한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포는 필요할 수 있는 시간까지 저장될 수 있다. 이들은 변형되지 않은 상태(즉, 본 발명의 CAR을 발현하지 않는 상태) 또는 변형된 상태(즉, 본 발명의 CAR을 발현하도록 변형된 상태)로 저장될 수 있다. 이하에서 추가로 설명되는 치료 적용에 사용하기 전에, 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 일반적으로 활성화되고 확장될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과 접촉함으로써 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공동-자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)을 포함하는데, 당업계에 일반적으로 공지된 다른 방법에서와 같이 사용될 수 있다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 천공된 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체 외 확장은 약 8~9일 이전에 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포의 집단을 생성하는 반면, 약 8~9일 후에는 T 세포의 집단이 점점 더 많은 TC 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 대상체에게 TH 세포를 우세하게 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원 특이적 서브세트가 단리된 경우, 이러한 서브세트를 더 많이 확장하는 것이 유익할 수 있다.
특정 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
특히, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질도입되기 전에 확장될 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, T 세포는 대상체에게 기능적 T 세포를 남기는 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 일부 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 정상적으로 치료로부터 회복되어야 하는 기간 동안인 치료 직후에, 수득된 T 세포의 질은 생체 외에서 생식하는 능력과 관련하여 최적화되거나 개선될 수 있음을 주목하였다. 또한, 본원에 기술된 방법을 사용한 생체 외 조작 후, 이들 세포는 접목 및 생체 내 전파를 향상시키기 위해 바람직한 조건에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명과 관련하여, 이러한 회복 단계 동안, T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포의 생산을 제공한다. 또한, 일부 양태에서, 가동화 모드(예를 들어, GM-CSF를 사용한 가동화) 및 특정 조건의 확립은, 특히 치료 후 특정 시간 범위의 시간에 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 재생산이 유리한 조건을 대상체에서 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
본 개시의 조작된 세포는 또한 자살 시스템을 포함할 수 있다. 자살 시스템은 전술한 바와 같이, 조작된 세포가 비활성화되거나 파괴될 수 있는 메커니즘을 제공한다. 이러한 특징은 조작된 세포가 사용되는 임의의 치료제의 정확한 치료적 제어를 가능하게 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 자살 시스템은 자살 시스템을 갖는 세포가 비활성화되거나 파괴될 수 있는 메커니즘을 제공한다. 자살 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다.
일 구현예에서, 자살 시스템은 필요에 따라 함유 세포를 제거하기 위해 약리학적으로 활성화될 수 있는 유전자를 포함한다. 특정 양태에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오티드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 일 실시예에서, 자살 시스템은 CD20이 조작된 세포의 세포 표면 상에서 발현되게 하는 유전자를 포함한다. 따라서, 리툭시맙의 투여는 유전자를 함유하는 조작된 세포를 파괴하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 자살 시스템은 에피토프 태그를 포함한다. 에피토프 태그의 예는 c-myc 태그, CD52 스트렙타비딘-결합 펩티드(SBP), 및 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 포함한다. 본 구현예에서, 에피토프 태그는 조작된 세포에서 발현된다. 따라서, 에피토프 태그에 대한 항체의 투여는 유전자를 함유하는 조작된 세포를 파괴하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 시스템은 절단된 표피 성장 인자 수용체를 조작된 세포의 표면 상에서 발현되게 하는 유전자를 포함한다. 따라서, 세툭시맙의 투여는 유전자를 함유하는 조작된 세포를 파괴하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 시스템은 조작된 세포의 표면에서 발현될 CD52를 포함한다. 따라서, 항-52 단클론 항체(CAMPATH, 알렘투주맙)의 투여는 유전자를 함유하는 조작된 세포를 파괴하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 시스템은 CAMPATH(알렘투주맙)를 포함한다. 따라서, 항-52 단클론 항체(CAMPATH)의 투여는 CAR T 세포로서 태그 또는 유전자를 발현하지 않는 조작된 세포 또는 CD52 고발현 T 세포를 파괴하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 카스파제 8 유전자, 카스파제 9 유전자, 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소(CD), 또는 시토크롬 P450을 포함할 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계 내 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유류, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충돌, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 예를 들어, 인간 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 수두바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산액 시스템, 및 수중유 유화액, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)을 위해 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 결합될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부에서 캡슐화될 수 있거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재될 수 있거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 결합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착될 수 있거나, 리포솜에 포획될 수 있거나, 리포솜과 복합체를 형성할 수 있거나, 지질을 함유하는 용액에 분산될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 조합될 수 있거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유될 수 있거나, 미셀에 함유되거나 미셀과 복합체화될 수 있거나 그렇지 않으면 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 내의 임의의 특정 구조에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조, 미셀로서 존재하거나, "접힌" 구조를 가질 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 내에 산재되어, 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생할 수 있는 지방 물질 또는 합성 지질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스티 포스파티딜콜린("DMPC")은 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마로부터 수득될 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 미국 뉴욕주 플레인뷰 소재의 케이 앤드 케이 래버러토리즈(Plainview, NY)로부터 수득될 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 칼비오케미-베링으로부터 수득될 수 있고; 디미리스티 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 기타 지질은 아반티 폴라 리피드 사(Birmingham, AL)로부터 수득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 원액은 약 -20°C에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하므로 유일한 용매로 사용된다.
"리포솜"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중 층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중 층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조를 형성하기 전에 자체 재배열을 거치고, 물을 포획하고, 지질 이중층 사이에 용질을 용해시킨다. 그러나, 용액 중의 정상적인 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀라 구조를 가정할 수 있거나, 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체도 고려된다.
본 개시의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 세포 중 어느 하나는 2개의 벡터에 의해 도입될 수 있으며, 각각의 벡터는 상이한 CAR을 갖는다.
외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하거나 달리 본 개시의 폴리뉴클레오티드에 세포를 노출시키는 데 사용되는 방법에 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 "분자 생물학적" 검정; 면역학적 수단(ELlSA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본원에 기술된 검정에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하여 본 개시의 범위 내에 속하는 제제를 식별하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
본 발명의 ScFv, 항원 결합 도메인 및 항체
제5 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 ScFv에 관한 것이다:
- VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- VL 영역의 CDR1 CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 ScFv의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 152, 153, 154 및 155의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 본 발명의 ScFv 또는 항원 결합 도메인의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 156, 157, 158 및 159의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 ScFv의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 152, 153, 154 및 155, 서열번호 19, 20, 21 및 22 또는 서열번호 163, 164, 165 및 166의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 156, 157, 158 및 159, 서열번호 23, 24, 25 및 26 또는 서열번호 167, 168, 169 또는 170의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 ScFv의 VL은 서열번호 160 또는 193의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, ScFv의 VH는 서열번호 161 또는 194의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 ScFv의 VL은 서열번호 160, 193, 27, 171 또는 180의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, VH는 서열번호 161,194, 28, 172 또는 181의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 ScFv의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된다.
특정 구현예에서, 링커는 항원 결합 도메인의 VH와 VL 영역 사이에 위치한다. 일 구현예에서, ScFv는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 VL 영역에 대해 C-말단에 위치하고 VH 영역에 대해 N-말단에 위치한다(즉, VL-링커-VH).
추가의 구현예에서, 본 발명의 ScFv는 서열 번호 162 또는 195 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 ScFv는 서열 번호 162, 195, 30, 173 또는 182의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
본 발명의 CAR의 맥락에서 주어진 정의는 본 발명의 ScFv에 동일하게 적용된다. 유사한 방식으로, 본원에 제공된 본 발명의 ScFv의 일부를 형성하는 CDR의 가능한 기능적으로 동등한 변이체는 이전에 정의되었고 본 사례에 동일하게 적용 가능하다.
제6 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 항원 결합 도메인에 관한 것이다:
- 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 상기 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34, 서열번호 65, 66, 67 및 68 또는 서열번호 73, 74, 75 및 76의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 본 발명의 항원 결합 도메인의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38, 서열번호 69, 70, 71, 72 또는 서열번호 77, 78, 79 및 80의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 본 발명의 ScFv의 적어도 하나의 VH는 서열번호 40의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인의 적어도 하나의 VL은 서열번호 39, 54 및 56의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 40, 53 및 55의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인이 ScFv인 경우, 이후 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인이 ScFv인 경우,링커는 항원 결합 도메인의 VH와 VL 영역 사이에 위치한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인 1이 ScFv인 경우, ScFv는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인이 ScFv인 경우, 링커는 VL 영역에 대해 C-말단에 위치하고 VH 영역에 대해 N-말단에 위치한다(즉, VL-링커-VH).
추가의 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 41의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인은 서열번호 41, 187, 188 또는 189의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
본 발명의 CAR의 맥락에서 주어진 정의는 본 발명의 항원 결합 도메인에 동일하게 적용된다. 유사한 방식으로, 본원에 제공된 본 발명의 항원 결합 도메인의 일부를 형성하는 CDR의 가능한 기능적으로 동등한 변이체는 이전에 정의되었으며 본 사례에 동일하게 적용 가능하다.
제7 양태에서, 본 발명은 다음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다:
- 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
- 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
- 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함함.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45, 서열번호 89, 90, 91 및 92 또는 서열번호 97, 98, 99 및 100의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49, 서열번호 93, 94, 95 및 96 또는 서열번호 101, 102, 103 및 104 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VL은 서열번호 50 또는 184의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VH는 서열번호 51의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 50 또는 184, 60 또는 62의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 51, 59 및 61의 서열 및 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 ScFv인 경우, 항체 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 VH 및 VL 영역은 서열 번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 ScFv인 경우,링커는 VH와 VL 영역 사이에 위치한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 ScFv인 경우, ScFv는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 ScFv인 경우, 링커는 VL 영역에 대해 C-말단에 위치하고 VH 영역에 대해 N-말단에 위치한다(즉, VL-링커-VH).
추가의 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 번호 52 또는 186의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 번호 52, 186, 190 또는 191의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자를 지칭하거나, 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 분자의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자의 단편("항원")을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 항체는 일반적으로 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 이루어진 사량체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 일반적으로 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된 중쇄 불변 도메인으로 구성된다. 중쇄는 IgG(lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 아형)를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 일반적으로 항원 인식을 담당하는 반면, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1 q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 도메인은, "프레임워크 영역"(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 서열의 도메인에 배치된 "상보성 결정 영역"으로 지칭되는 초가변성 도메인으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노 말단에서부터 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 도메인 및 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1 -CDR1 -FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 자연에서 발생할 수 있는 것과 구별되는 물리적 환경에 존재하도록 "단리된" 또는 아미노산 서열이 자연적으로 발생하는 항체와 상이하도록 변형된 항체 및 이들의 에피토프-결합 단편이 특히 관련된다.
용어 "항체"는 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 전체 단클론 항체 또는 다클론 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 기원의 항체를 포함한다.
"단클론성 항체"는 단일 부위 또는 항원 "결정인자"에 대해 유도되는 균질하고, 고도로 특이적인 항체 집단이다. "다클론 항체"는 상이한 항원 결정인자를 표적으로 하는 이종 항체 집단을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 비인간 기원, 바람직하게는 쥣과 기원의 항체이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 단클론 항체이다.
항체의 기본 구조 단위는 사량체를 포함한다는 것이 잘 알려져 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 이들 각각은 경쇄(25 KDa) 및 중쇄(50~75 KDa)로 구성된다. 각 사슬의 아미노-말단 영역은 항원 인식에 관여하는 약 100~110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 영역은 효과기 기능을 매개하는 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 각 쌍의 가변 영역은 항체의 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 경쇄는 K 또는 λ로 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 및 ε으로 분류되며, 이들은 항체의 이소형을 각각 lgG, lgM, IgA, lgD 또는 lgE로 정의한다.
경쇄 및 중쇄의 각 쌍의 가변 영역은 항체의 결합 부위를 형성한다. 이들은, 본 발명의 CAR의 세포외 도메인 또는 항원 결합 도메인의 맥락에서 정의된 바와 같이, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 프레임워크(FR)로 불리는 비교적 보존된 영역으로 구성된 동일한 일반 구조를 특징으로 한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 도메인의 특이성을 정의한 CDR 및 FR 서열의 기능적으로 동등한 변이체가 여기에 고려된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 및 FR을 정의하는 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 정의뿐만 아니라 본 발명의 범위 내에 있는 서열에 대한 동일성 백분율의 정의는 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인의 맥락에서 이미 정의되었으며 본 발명의 항체에 균등하게 적용된다.
당업자는 본 발명의 항체 또는 항체 단편이 특정 항원, 즉 p95HER2 펩티드에 결합하는 그의 능력과 관련되므로 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 2의 모든 특성을 공유한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, p95HER2 펩티드에 대한 결합과 관련된 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인 2의 모든 특징은 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편(이는 그의 가변 영역을 지칭함)에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 전장 항체(예를 들어, IgG)뿐 아니라, 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 비인간 기원의 항체, 재조합 항체, 및 유전자 조작 기술에 의해 생산된 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드, 예를 들어, 단쇄 Fv(scFv), 디아바디, 이의 중쇄 또는 단편, 이의 경쇄 또는 단편, 이의 VH 또는 이량체, 이의 VL 또는 이량체, 이황화 가교에 의해 안정화된 Fv 단편(dsFv), 단쇄 가변 영역 도메인을 갖는 분자(Abs), 미니바디, scFv-Fc, VL 및 VH 도메인 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 또는 원하는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 단편은 항원 결합 단편을 지칭할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 단클론 항체, F(ab), F(ab'), Fv, ScFv 및 미니바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 항체"는 2개의 상이한 종 또는 2개의 상이한 공급원으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 합성 분자, 예를 들어, 비인간 CDR 및 인간 프레임워크 또는 불변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 항체는 재조합 DNA 분자로부터 생산되거나 합성된다.
당업자는 폴리펩티드의 일차 서열이 변경되더라도 p95HER 항원에 결합하는 항체의 능력이 유지되도록 하는 본 발명의 항체의 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 치환은 보존적 치환일 수 있고, 일반적으로 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 하나의 아미노산을 치환하는 것(예를 들어, 글루탐산(음전하 아미노산)을 아스파르트산으로 치환하는 것은 보존적 아미노산 치환일 것임)을 나타내기 위해 적용된다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 핵산을 암호화하는 항체 내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이에 삽입 및/또는 이의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은, 최종 작제물이 원하는 특성을 갖는다는 전제 하에, 최종 작제물을 달성하기 위해 만들어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경하는 것과 같은, 단백질의 번역 후 가공을 변경할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이까지 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 펩티드 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 분자의 다른 삽입 변이체는 효소의 N-말단 또는 C-말단에 대한 융합, 또는 그의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 분자 내에 상이한 잔기로 대체된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 항체의 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 큰 관심 부위는 초가변을 포함한다.
특정 구현예에서, ScFv, 항원 결합 도메인 및 항체 또는 이의 항체 단편은 인간화된다.
인간화라는 용어는 본 발명의 CAR의 맥락에서 이미 정의되었고 본 사례에 동일하게 적용된다. 유사하게, 본 발명의 항원 결합 도메인 및 항체 또는 항체 단편(이의 가변 영역을 지칭하므로, 각각 항원 결합 도메인 1 및 항원 결합 도메인 2와 동등함)의 적절한 인간화 서열은 본 발명의 CAR의 맥락에서 이미 이전에 정의되었으며, 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 이의 항체 단편에 동일하게 적용된다. 유사한 방식으로, 본 발명의 ScFv는 인간화될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, ScFv는 인간화되고, 보다 구체적으로, ScFv의 VH 및/또는 VL 영역이 인간화된다.
특정 구현예에서, ScFv의 VL 영역은 서열번호 27, 171 및 180으로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, VH 영역은 서열번호 28, 172 및 181로부터 선택된 인간화 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, ScFv는 서열번호 30, 173 및 182로부터 선택된 인간화 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, ScFv의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 19, 20, 21 및 22의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 23, 24, 25 및 26의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, ScFv의 VH 및 VL 영역은 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하되, VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 163, 164, 165 및 166의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 167, 168, 169 및 170의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, ScFv의 VH 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 FR1의 경우 서열번호 19 또는 163, FR2의 경우 서열번호 20 또는 164, FR3의 경우 서열번호 21 또는 165, FR4의 경우 서열번호 22 및 166 또는 전술한 것 중 어느 하나의 기능적으로 동등한 변이체로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, ScFv의 VL 영역은 적어도 하나의 인간화 FR 영역, 적어도 2개의 인간화 FR 영역, 적어도 3개의 인간화 FR 영역 또는 적어도 4개의 인간화 FR 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 인간화 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 FR1의 경우 서열번호 23 또는 167, FR2의 경우 서열번호 24 또는 168, FR3의 경우 서열번호 25 또는 169, FR4의 경우 서열번호 26 및 170 또는 전술한 것 중 어느 하나의 기능적으로 동등한 변이체로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체의 유도체를 제공한다. 유도체화된 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체는 표적화 특성, 예를 들어, ScFv, 항원 결합 도메인에 대해 특정한 용도에서 증가된 반감기를 제공하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도된 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체는 검출 가능한(또는 표지된) 잔기(예를 들어, 방사성, 비색법, 항원성, 또는 효소 분자에 결합하는 분자, 검출 가능한 비드(예를 들어, 자기 또는 전자 밀도(예를 들어, 금) 비드), 또는 다른 분자(예를 들어, 비오틴 또는 스트렙타비딘) 치료 또는 진단 잔기(예를 들어, 방사성, 세포독성, 또는 약학적으로 활성인 잔기), 또는 특정 용도(예를 들어, 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에 투여 또는 기타 생체 내 또는 시험관 내 용도)를 위한 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체의 적합성이 증가된 분자를 포함할 수 있다. ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체를 유도체화하기 위해 사용되는 분자의 예는 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체의 알부민-결합 및 페길화된 유도체는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체는 하나 이상의 표지를 포함할 수 있다. "표지"는 임의의 검출 가능한 물질을 의미한다. 적절한 표지 그룹의 예로서, 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I), 형광기(예를 들어, FITC, 로다민, 란타노이드 형광 물질), 효소기(예를 들어, 호스 래디시 퍼옥시다아제, b-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리 인산분해효소), 화학발광기, 비오티닐기, 또는 이차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 공간 암을 통해 항체에 결합된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 특정 목적을 위한 적절한 표지 및 적절한 방법을 선택할 것이다.
일반적으로, 표지는 검출 방법에 따라 다음과 같이 분류될 수 있다: a) 방사성 또는 동위원소 표지; b) 자기 표지(예를 들어, 자기 입자); c) 산화- 환원 활성 잔기; d) 광학 염료; 효소기(예를 들어, 호스 래디시 퍼옥시다아제, b-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제); e) 비오티닐기; 및 f) 이차 리포터에 의해 인식되는 특정 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그, 등). 일부 구현예에서, 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 공간 암을 통해 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체에 결합된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
일 실시예에서, 표지는 발색단, 형광체 및 형광 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 광학 염료를 포함한다. 형광 물질은 작은 분자 형광 물질 또는 단백질 형광 물질일 수 있다.
"형광 표지"는 물질이 갖는 형광 특성에 의해 검출되는 임의의 분자를 의미한다. 형광 표지의 예는, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루 J, 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC 적색 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 적색 705, 오리건 그린, 알렉사-플루오르 염료(알렉사-플루오르 350, 알렉사-플루오르 430, 알렉사-플루오르 488, 알렉사-플루오르 546, 알렉사-플루오르 568, 알렉사-플루오르 594, 알렉사-플루오르 633, 알렉사-플루오르 647, 알렉사-플루오르 660, 알렉사-플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우 및 R-피코에리트린(PE), FITC,), Cy5, Cy5.5, 및 Cy7 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단백질 형광 표지 물질은 레닐라, 프틸로사르쿠스 또는 아에쿠오레아 종의 GFP, EGFP(Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762)를 포함하는 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 향상된 황색 형광 단백질, b 갈락토시다아제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
제8 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제8 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제8 양태의 핵산 또는 본 발명의 제9 양태의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 ScFv와 관련된 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 정의 및 특이점은 본 발명의 CAR의 맥락에서 정의된 것과 동일하다.
진단 방법
제11 양태에서, 본 발명은 환자에서 암을 진단하는 다음 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(i) 종양 세포를 함유하는 환자의 샘플을 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 1 도메인 또는 항체와 접촉시키는 단계 및
(ii) ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체가 샘플 내 세포에 결합하는 것을 검출하는 단계로서,
이러한 결합의 존재는 환자가 암을 앓고 있음을 나타내는 것인, 단계.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 또는 "종양" 또는 "종양 질환"은 미조절된 세포 성장을 수반하고 악성 신생물로도 지칭되는 광범위한 질환군을 지칭한다. 이 용어는 일반적으로 조절되지 않은 세포 분열(또는 생존 또는 세포자멸사 내성의 증가) 및 이러한 세포가 다른 이웃 조직을 침범(침윤)하고, 림프관 및 혈관을 통해 세포가 정상적으로 위치하지 않는 신체의 다른 부위로 확산(전이)되고, 혈류를 통해 순환하고, 이어서 신체의 다른 곳에서 정상 조직을 침범하는 능력을 특징으로 하는 질환에 적용된다. 종양이 침윤 및 전이에 의해 확산될 수 있는지 여부에 따라, 종양은 양성 또는 악성으로 분류된다: 양성 종양은 침윤 또는 전이에 의해 확산될 수 없는 종양, 즉, 국소적으로만 성장하는 종양인 반면; 악성 종양은 침윤 및 전이에 의해 확산될 수 있는 종양이다. 암과 관련된 것으로 알려진 생물학적 과정은 혈관 신생, 면역 세포 침윤, 세포 이동 및 전이를 포함한다. 암은 일반적으로 다음의 특징 중 일부를 공유한다: 증식성 신호 전달 지속, 성장 억제자 회피, 세포 사멸에 내성, 복제 불멸성 활성화, 혈관 신생 유도, 및 침윤 활성화 및 결국 전이. 암은 신체의 주변 부위를 침범하고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 더 먼 부위로 확산될 수도 있다. 암은 종양 세포와 유사하여 종양의 기원으로 추정되는 세포 유형에 의해 분류된다.
암 또는 종양의 예는 제한 없이, 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 직장, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 간담도 및 간 종양을 포함한다. 특히, 종양/암은 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 생식세포종, 교아세포종, 신경교종, 혈관내피종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경아세포종, 간담도암, 골육종, 망막아종, 횡문근육종, 육종, 기형종, 말단성 흑색종, 광선 각화증 선암종, 선양 낭성 암종, 샘육종, 선편평세포 암종, 성상세포 종양, 바르톨린선 암종, 기저 세포 암종, 기관지선 암종, 암육종, 담관암종, 낭샘종, 내배엽 동 종양, 자궁내막 증식증, 자궁내막 기질 육종, 자궁내막모양 선암종, 뇌실막세포종, 스윙 육종, 국소 결절성 증식증, 생식 세포 종양, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증, 간세포 암종, 인슐린종, 상피내 종양, 상피간 편평 세포 종양, 침습적 편평 세포 암종, 대세포 암종, 평활근육종, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 속질 상피종, 점막표피양 암종, 신경상피 선암종, 결절성 흑색종, 유두상 장액성 선암종, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가성육종, 폐 모세포종, 신장 세포 암종, 장액 암종, 소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴 분비 종양, 편평 암종, 편평 세포 암종, 미분화 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 비포마, 빌름 종양의 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 암은 유방암이다. 바람직한 구현예에서, 암은 p95HER2 양성 암이다.
용어 "p95HER2" 및 HER2는 본 발명의 CAR의 맥락에서 이미 정의되었으며, 이러한 정의는 본 진단 방법에 동일하게 적용된다.
"p95HER2 양성인 암"은 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯, 또는 VeraTag® 검정(Monogram Biosciences)에 의해 결정했을 때, 암 세포의 적어도 일부가 p95HER2를 함유하는 암을 지칭한다. 일부 구현예에서, 암은 IHC에 의해 p95HER2 양성인 것으로 결정된다. 일부 이러한 구현예에서, 암은 VeraTag 검정에서 항-p95 항체 클론 D9를 사용하는 방법과 같이 Sperinde 등의 문헌[Clin. canc. Res., 2010, 16(16): 4226-4235]에 기재된 방법을 사용하여 p95HER2 양성인 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 암은 접근 번호 DSM ACC2904 또는 DSM ACC2980 하에 Deutschland Sammlung von Mikroorganismen and Zellen에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체를 사용하는 방법과 같이 미국 특허 제8,389,227 B2호에 기재된 방법을 사용하여 p95HER2 양성인 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 암은 검정 제조사 또는 검정 실험실의 지침에 따라 p95HER2 양성인 것으로 결정된다. p95HER2는 카르복시 말단 HER2 단편의 집합체를 지칭하며, 일부 구현예에서는, 95- 내지 100-kDa 단편 및 100- 내지 115-kDa 단편으로 분할될 수 있다. 예를 들어, Arribas 등의 문헌[Cancer Res., 2011, 71: 1515-1519]을 참조한다. 일부 구현예에서, p95HER2 양성인 암은 HER2의 100- 내지 115-kDa 단편을 함유한다.
용어 "검출", "진단하는", "진단" 또는 이러한 단어의 파생어는 본원에서 구별되지 않고 사용되고 병리학적 병태의 존재 또는 특징의 식별을 지칭한다. 이는 대상체에서 가능한 질환을 결정 및/또는 식별하려고 시도하는 과정, 즉 진단 절차, 및 이러한 과정에 의해 도달되는 의견, 즉 진단 의견을 지칭한다. 이와 같이, 이는 또한 개인의 병태를 치료와 예후에 대한 의학적 결정을 내릴 수 있게 하는 별개의 구별되는 범주로 분류하는 시도로서 간주될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 이러한 진단은, 비록 그것이 바람직하지만, 대상체에 대해 100% 정확하지 않을 수 있다. 그러나 이러한 용어는 통계적으로 유의한 대상체의 일부가 본 발명의 맥락에서 암을 앓고 있는 것으로 식별될 수 있는 것을 필요로 한다. 당업자는, 잘 알려진 상이한 통계적 평가 도구, 예를 들어, 신뢰 구간의 결정, p-값 결정, 스튜던트 검정, 만-휘트니 등을 사용하여, 당사자가 통계적으로 유의한지 여부를 결정할 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. p-값은 바람직하게는 0,015, 0,001, 0,0005 이하이다.
일반적으로, 방법은 p95HER2 항원을 발현하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계, 및 면역 복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에서, p95HER2 항원에 선택적으로 결합하거나 검출할 수 있는 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.
샘플은, 예를 들어, 조직 절편 또는 시편, 균질화된 조직 추출물, 세포, 소기관, 전술한 항원 함유 조성물 중 어느 하나의 분리된 및/또는 정제된 형태, 또는 혈액, 혈청 및 혈장을 포함하는 임의의 생물학적 유체와 같은, p95HER2 항원을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 샘플은 바람직하게는 환자의 종양으로부터 유래하거나 이로부터 유래한 종양 세포를 포함하는 샘플인 "종양 샘플"이다. 본원의 종양 샘플의 예는 종양 생검, 순환하는 종양 세포, 순환하는 혈장 단백질, 복수, 종양으로부터 유래되거나 종양-유사 특성을 나타내는 일차 세포 배양물 또는 세포주뿐만 아니라 포르말린-고정, 파라핀-포매 종양 샘플 또는 냉동 종양 샘플과 같은 보존된 종양 샘플을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 및 적절하고 효과적인 조건 하에서 선택된 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체를 단순히 샘플에 첨가하고 항체가 면역 복합체를 형성하기에 충분히 긴 기간 동안 혼합물을 인큐베이션하는 문제이다.
유효 조건은 바람직하게는 샘플 및/또는 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)/Tween과 같은 용액으로 희석하는 단계를 포함한다. 이들 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적합한" 또는 "적절한" 조건은 또한 인큐베이션이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도에서 또는 기간 동안 되는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 바람직하게는 약 25°C 내지 27°C의 온도에서 통상적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 정도이거나 약 4°C 이하의 온도에서 밤새 이루어질 수 있다.
형성된 복합체의 양을 결정하는 것은 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체가 표지되고, 결합이 직접 결정된다. 예를 들어, 이는 p95HER2 항원 단백질을 고형 지지체에 부착하고, 표지된 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체(예를 들어, 형광 표지)를 첨가하고, 과량의 시약을 세척하고, 표지가 고형 지지체 상에 존재하는지 여부를 결정함으로써 수행될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이 다양한 차단 및 세척 단계가 사용될 수 있다.
일반적으로, 면역 복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있고, 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예컨대 이들 방사성, 형광, 생물학적 및 효소적 태그의 검출에 기초한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이, 당업자는 이차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열과 같은 이차 결합 리간드의 사용을 통해 추가적인 이점을 발견할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체는 고형 지지체 상에 배열된다.
ScFv 또는 다른 항원 결합 도메인 또는 항체와 같은 다른 폴리펩티드는 검정에 사용하기 위해 다양한 고형 지지체 상에 고정될 수 있다. 특이적 결합 구성원을 고정시키는 데 사용될 수 있는 고상은 고상 결합 검정에서 고상으로서 개발되고/되거나 사용되는 것을 포함한다. 적절한 고상의 예는 멤브레인 필터, 셀룰로오스계 종이, 비드(중합체, 라텍스 및 상자성 입자 포함), 유리, 실리콘 웨이퍼, 미세입자, 나노입자, TentaGels, AgroGels, PEGA 겔, SPOCC 겔, 및 다중-웰 플레이트를 포함한다. 분석 스트립은 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 이의 복수의 것을 고형 지지체 상의 어레이로 코팅함으로써 제조될 수 있다. 그런 다음, 이 스트립을 시험 샘플 내로 침지시킨 다음, 세척 및 검출 단계를 통해 신속하게 처리하여 컬러 스폿과 같은 측정 가능한 신호를 생성할 수 있다. ScFv 또는 다른 항원 결합 도메인 또는 항체와 같은 다른 폴리펩티드는 검정 장치 표면에 직접 접합되거나 간접 결합에 의해 검정 장치의 특정 구역에 결합될 수 있다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 표지되지 않은 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체(일차 항체) 및 표지된 본 발명의 항체(이차 항체)를 사용하는 본 발명에 사용될 수 있는 광범위한 종래의 검정이 있으며; 이들 기술은 웨스턴 블롯 또는 면역블롯, ELISA(효소-결합 면역흡착 분석), RIA (방사성 면역 분석), 경쟁 EIA(경쟁 효소 면역검정), DAS-ELISA(이중 항체 샌드위치-ELISA), 면역세포화학적 및 면역조직화학 기술, 단백질 미소구체, 바이오칩 또는 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체를 포함하는 마이크로어레이를 사용하는 것에 기초한 유세포 계측법 또는 다중 검출 기술을 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 p95HER2 항원을 검출하고 정량화하는 다른 방법은 친화도 크로마토그래피 기술, 리간드 결합 분석 또는 렉틴 결합 분석을 포함한다.
또한, 표지되지 않은 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체는 표지될 추가 시약, 예를 들어 표지된 이차 항체로 검출될 필요가 있다는 것을 이해할 것이다. 이는, 신호를 증폭시킬 수 있기 때문에, 검출 방법의 민감도를 증가시키는 데 특히 유용하다.
또한, 항체의 검출은 또한 항체의 동족 항원에 대한 결합의 결과로서 발생하는 샘플 내의 물리적 특성의 변화를 검출함으로써 수행될 수 있다. 이들 검정은 당업계에 공지된, 샘플 내의 투과 관련 파라미터를 결정하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투과 관련 파라미터"는, 샘플의 입사광에 대한 투과광의 비율 또는 이로부터 유도된 파라미터와 상관되거나 이를 나타내는 파라미터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 투과 관련 파라미터는 비탁법 또는 혼탁법에 의해 결정된다.
또 다른 구현예에서, 그의 동족 항원에 대한 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, SPR은 레이저 빔이 금속 박막에 조사될 때 반사된 광의 세기가 특정 입사각(즉, 공명각)에서 급격하게 감소하는 현상을 지칭한다. SPR은 전술한 현상에 기초한 측정 방법이며, 높은 감도를 갖는 센서인 금속 박막의 표면에 흡착된 물질을 분석할 수 있다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 그런 다음, 샘플 내의 표적 물질은 하나 이상의 본 발명에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체를 사전에 금속 박막의 표면에 고정하고, 샘플을 금속 박막의 표면을 통과하게 하고, 샘플 통과 전 후에 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체와 표적 항원의 결합으로 인한 금속 박막의 표면 상에 흡착된 물질의 양의 차이를 검출함으로써 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 전술한 관련 기술 중 어느 하나 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 것에 의해 측정된 결합의 존재는 환자가 암을 앓고 있음을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 진단 방법은 연구 중인 대상체에서 수득된 수준을 기준 값과 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 기준 값에 대해 증가된 p95HER2의 수준은 환자가 암을 앓고 있음을 나타낸다.
p95HER2의 수준과 관련하여, 용어 "증가된"은 샘플에서 본 발명에 따른 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체를 사용하여 검출된 p95HER2의 기준 값보다 낮은 임의의 수준의 발현에 관한 것이다. 따라서, p95HER2 발현 수준은 이의 기준 값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%이상 낮을 때 이의 기준 값보다 낮아지거나 감소한 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기준 값"은 대상체로부터 수집된 샘플로부터 수득된 값 또는 데이터를 평가하기 위한 기준으로서 사용되는 사전결정된 기준에 관한 것이다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대 값; 상대 값; 상한 또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 산술 평균 값; 중앙값; 평균 값; 또는 특정 대조군 또는 베이스라인 값과 비교한 값일 수 있다. 기준 값은 개별 샘플 값, 예를 들어, 더 이른 시점에 시험 중인 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 값에 기초할 수 있다. 기준 값은 많은 수의 샘플, 예컨대 역연령 일치 그룹의 대상체의 모집단으로부터의 샘플에 기초하거나, 시험할 샘플을 포함하거나 배제하는 샘플의 풀에 기초할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 값은 건강한 대상체에서 결정된 p95HER2 발현의 수준에 상응하며, 이에 의해 건강한 대상체는 p95HER2 발현 수준이 결정되는 순간에 증식성 질환을 나타내지 않고, 바람직하게는 암의 병력이 나타나지 않는 대상체로서 이해된다.
또 다른 구현예에서, 기준 값은 임상 관점에서 잘 문서화되고, 질환이 없는, 특히 암을 앓고 있지 않은, 특히 p95HER2 양성 암을 앓고 있지 않은 환자군으로부터 수득된 샘플의 풀로부터 결정된 p95HER2 발현의 산술 평균 또는 평균 수준에 대응한다. 위의 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어 기준 집단에서의 평균 발현 수준의 결정에 의해 결정될 수 있다. 기준 값을 결정할 때, 연령, 성별, 물리적 상태 또는 환자의 다른 특징과 같은 샘플 유형의 일부 특징을 고려해야 한다. 예를 들어, 기준 샘플은 적어도 2개, 적어도 10개, 적어도 100개 내지 1000개 초과의 개체의 동일한 양의 그룹로부터 수득될 수 있어서, 모집단은 통계적으로 유의하다.
본원에서 사용되는 용어 "발현" 또는 "발현 수준"은 측정 가능한 양의 단백질 또는 항원을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 발현 수준은 단백질 또는 항원을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 따라서, 본 경우에서, p95HER2의 발현 수준은 p95HER2 항원과 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체 사이에 형성된 면역 복합체의 양을 결정함으로써 측정되며, 위와 관련이 있고 당업자에 의해 공지된 다수의 방식으로 수행될 수 있다.
약학적 조성물
제12 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태에 따른 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체 중 어느 하나 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
용어 "약학적 조성물"은, 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 조성물이 투여되는 대상체에게 효과적이게 하고 허용되지 않는 독성을 가질 수 있게 하는 이러한 형태이다. 추가 성분을 포함하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 대상체에게 독성이 없는 활성 성분 이외의 약학적 조성물의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 본 발명의 숙주 세포, 보다 구체적으로는, 본 발명의 CAR, 즉, ScFv1, 항원 결합 도메인 1, 항원 결합 도메인 2 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 CAR을 중 어느 하나를 발현하도록 유전적으로 조작된 면역 세포(예를 들어, T, NK 또는 NKT 세포)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 숙주 세포 및 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1 또는 항체 둘 다를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물 및 제형은 원하는 순도를 갖는 활성 성분을 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd ed Edition, 2012)와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 독성이 없고, 이에 한정되지는 않으나, 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본원의 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질과 같은 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질(sHASEGP), 예컨대, rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)과 같은 내재성 약물 분산액 제제를 추가로 포함한다.
치료 방법
본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1, 항체 또는 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는 면역 요법을 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유도하는 면역 세포 집단의 전달에 의해 치료된다.
따라서, 제13 양태에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태의 ScFv1, 항원 결합 도메인 1, 또는 항체 중 어느 하나에 관한 것이다.
최종 양태에서, 본 발명은 암을 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태의 ScFv1, 항원 결합 단편 1 또는 항체 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 암은 유방암이다. 바람직한 구현예에서, 암은 p95HER2 양성이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료", 또는 "개선". 이러한 용어는 치료적 처치를 지칭하며, 이의 목적은 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 감소, 억제, 지연 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료"는 병태, 예컨대, 암, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 병태를 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소될 때 "효과적"이다. 대안적으로, 질환 진행이 지연되거나 중단되는 경우 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라, 치료 부재 시 예상되는 증상의 진행 또는 악화를 나타내는 적어도 하나의 병태의 중단을 포함한다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 검출 가능하든 그렇지 않든, 하나 이상의 증상의 감소, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정한(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환이며, 이는 진행 연기 또는 지연, 질환 상태의 완화 또는 개선, 및 관해(부분 또는 전체)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 질환의 용어 "치료"는 또한 질환의 증상 또는 부작용의 경감을 제공하는 것(대증적 치료 포함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 암의 치료는 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 암 전이 억제, 수명 연장, 암 세포 성장 감소, 세포 생존 감소, 또는 암 상태 감소를 포함한다. 이는 관련된 다양한 생리학적 증상의 완화를 포함한다.
본 개시의 특정 구현예에서, 면역 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예컨대 암을 갖는 개체에게 전달된다. 그런 다음, 세포는 각각의 암세포를 공격하도록 개체의 면역 체계를 강화한다. 일부 경우에, 개체는 하나 이상의 투여량의 면역 세포를 제공 받는다. 개체에게 2회 이상의 투여량의 면역 세포가 제공되는 경우, 투여 사이의 지속 시간은 개체에서의 전파를 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하며, 특정 구현예에서 투여 사이의 지속 시간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상일 것이다.
일부 구현예에서, 대상체에게 면역 세포 요법 전에 비골수제거 림프구고갈 화학요법이 투여될 수 있다. 비골수제거 림프구고갈 화학요법은 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있는 임의의 적절한 이러한 요법일 수 있다. 비골수제거 림프구고갈 화학요법은 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우, 예를 들어, 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 시클로포스파미드 및 플루다라빈을 투여하는 예시적인 경로는 정맥 내 투여이다. 마찬가지로, 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 임의의 적절한 투여량이 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 약 60 mg/kg의 시클로포스파미드가 2일 동안 투여된 후, 약 25 mg/m2의 플루다라빈이 5일 동안 투여된다.
특정 구현예에서, 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 성장 인자는 면역 세포와 동시에 투여되거나 면역 세포에 후속하여 투여된다. 면역 세포 성장 인자는 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 임의의 적절한 성장 인자일 수 있다. 적절한 면역 세포 성장 인자의 예는 인터루킨(IL)-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12를 포함하며, 이는 단독으로 또는 IL-2 및 IL-7, IL-2 및 IL-15, IL-7 및 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15, IL-12 및 IL-7, IL-12 및 IL-15, 또는 IL-12 및 IL2와 같은 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
치료적 유효량의 면역 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 또는 관절 내 주사, 또는 주입을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
면역 세포 집단은 질환과 일치하는 치료 요법, 예를 들어, 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 장기간에 걸친 주기적 투여 또는 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 1회 또는 수회의 투여량으로 투여될 수 있다. 제형에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 심각성에 따라 달라질 것이며, 의료인 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 치료적으로 유효한 수의 면역 세포는 치료 중인 대상체, 고통의 중증도 및 유형, 및 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 수의 면역 세포는 체중 kg 당 약 5 x l06 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5 x l08 세포, 예컨대 체중 kg 당 약 2 x l07 세포 내지 약 5 x l08 세포, 또는 체중 kg 당 약 5 x l07 세포 내지 약 2 x l08 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 수는 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 상태에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 유효 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가 요법과 조합된 ScFv 또는 면역 세포 집단과 관련된다. 추가 요법은 방사선 요법, 수술(예를 들어, 덩이절제술 및 유방절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 골수 이식, 나노요법, 단클론 항체 요법, 또는 전술한 것들의 조합일 수 있다. 추가 요법은 보조 또는 신보조 요법의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 부작용 제한제(예를 들어, 항-오심 제제 등과 같은 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 완화하도록 의도된 제제)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 방사선 요법 및 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 감마 조사이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 PBK/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 세포자멸사 억제제, 및/또는 화학예방제를 표적으로 하는 요법이다. 추가 요법은 당업계에 공지된 화학요법제 중 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 면역 세포 요법은 면역 관문 요법과 같은 추가 암 요법 이전에, 도중에, 이후에, 또는 이와 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시, 수 분 내지 수 일 내지 수 주 범위의 간격일 수 있다. 면역 세포 요법이 추가 치료제와 별개로 환자에게 제공되는 일부 구현예에서, 2개의 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 각각의 전달 시간 사이에서 유의한 시간이 만료되지 않았음을 일반적으로 보장할 것이다. 이러한 경우, 환자에게 서로 약 12 내지 24 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6 내지 12시간 이내에 항체 요법 및 항암 요법을 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 치료 기간을 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)의 경과로 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기의 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물 또는 면역 세포 요법은 "A"이고, 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
본 구현예의 임의의 화합물 또는 요법을 환자에게 투여하는 것은, 만약 있다면, 제제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
매우 다양한 화학요법제가 본 발명의 약학적 조성물 또는 면역 세포 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학요법제"는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 지칭하는 데 사용된다. 이들 제제 또는 약물은, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부와 어떤 단계에서 영향을 미치는지에 따라 세포 내에서의 그들의 활성 방식에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 가교 결합하거나, DNA 내로 삽입되거나, 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력에 기초하여 특징지어질 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드; 알킬 술폰산염, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 울레도파(urreopa); 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에티일렌티오포스포라미드, 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민 및 에틸렌이민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 콜린포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 엔다이인 항생제(예를 들어, 칼리키마이신, 특히 칼리키마이신 감마올 및 칼리키마이신 오메갈); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 염색체 단백질 엔디인 항생균 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리딘-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라니신, 올리보마이신, 펠로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠알라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-피우오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모퍼, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스탄올론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충기, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 엔일루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르미틴; 아세트산 엘립티늄; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이나인; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리조신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베르라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 마노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 택소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 백금 조정 복합체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸히로니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카르바진,폴리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 전이백금, 및 전술한 것 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
***
본 발명은 본 발명의 범주를 한정하지 않고 단지 예시적인 것으로 간주되는 다음의 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
방법론
CAR 벡터 설계 및 생산
p95HER2 CAR(h32H2, 214D8, H1 214D8, H2 214D8, H3 214D8, 215C2, H1 215C2, H2 215C2)를 코딩하는 벡터 플라스미드를 합성하고 pMSGV-1 레트로바이러스 벡터(Genscript, Netherlands)에 클로닝하였다. 그런 다음, p95HER2 CAR, HER2 CAR 및 빈(UTD) CAR 레트로바이러스의 스톡을 생성하였다. 요약하자면, GP-293 세포(#631458, Clontech)에 0.7 μg의 외피 플라스미드(RD-114) 및 1.5 μg의 전달 플라스미드(pMSGV-1 중 p95HER2, HER2, 빈 CAR)를 공동 형질감염시켰다. 2일 및 3일 후, 레트로바이러스 입자를 함유하는 세포 상청액을 수집하고 향후 형질도입을 위해 -80C에서 보관하였다.
CAR T 세포의 형질도입 및 확장
형질도입 전에 PBMC를 10 ng/ul의 α-CD3(OKT3)(#16-0037-85, Thermo-Fisher) 및 300 U/ml IL-2(#703892-4, Novartis)로 48시간 동안 자극하였다. 그런 다음, 레트로바이러스 입자를 함유하는 세포 상청액을 해동하고, 레트로넥틴(#T100A, Takara)으로 코팅된 6-웰 플레이트에서 2000g으로 2시간 동안 원심분리하였다. 다음으로, 2 x 106개의 자극된 PBMC를 상단에 첨가하고 400g에서 10분 동안 원심분리하였다. 5일 후, CAR 발현 및 세포독성 검정을 수행하였다. 미형질도입 T 세포(UTD)를 빈 CAR 레트로바이러스로 형질도입하였다.
CAR 발현 분석
0,2 x 106 CAR T를 1xPBS로 2회 세척하고, 1xPBS, 2.5 mM EDTA, 1% BSA, 및 5% 말 혈청에 20분 동안 재현탁하였다. 그런 다음, 세포를 1/20 비오틴 항-IgG(#115-065-072, Jackson ImmunoResearch)로 30분 동안 염색하고 1xPBS로 2회 세척하였다. 1/150 APC-스트렙타비딘 항체(#405207, Biolegend) 및 1/300 항-CD3-PE(#300408, Biolegend)를 30분 동안 첨가하였다. 좀비 아쿠아(#423101, Biolegend)를 1:1000 희석액에서 생존력 마커로서 사용하였다. CAR 발현을 FACSCelesta(BD Bioscience) 상에서 측정하고 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
CAR T 세포독성 검정
CFSE로 표지된 MCF10A p95HER2/빈 세포를 지시된 E: CAR T 비율로 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 CAR T 세포와 공동배양하였다. 48시간 인큐베이션 후, 세포의 혼합물을 1xPBS로 세척하고, 1xPBS, 2.5 mM EDTA, 1% BSA, 및 5% 말 혈청에 20분 동안 재현탁하였다. 그런 다음, 생존력 마커인 1:1000 희석된 좀비 아쿠아(#423101, Biolegend)로 세포를 염색하였다. LSR Fortesa(BD Bioscience)에서 CFSE 양성 세포를 계수하고 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
생체 내 모델
NSG 마우스에게 3 x 106 MCF7p95HER2/부모 세포를 동소로 주사하였다. 종양 부피가 300 mm3에 도달하면, 동물을 3 x 106 CAR+ T 세포로 최대 4회 투여량으로 7~10일마다 정맥 내(i.v.) 치료하였다. MCF7p95HER2 세포의 경우, 마우스를 음용수 중 독시사이클린(1 g/L)의 존재 하에 유지시켰다.
결과
실시예 1: 인간화 32H2 p95HER2 CAR
항-p95HER2 항체 32H2는 WO/2010/000565로 공개된 PCT 출원에 개시되어 있다. 초기에, 항-p95HER2 항체 32H2의 단쇄 단편 가변(scFv)을 사용하여 32H2 유래 p95HER2 CAR의 두 가지 버전을 생성하였다.
두 가지 버전의 32H2 p95HER2 CAR은 32H2 항체의 단쇄 단편 가변(scFv)의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 배열 순서가 상이하였다(도 2a). 두 가지 32H2 p95HER2 CAR은 CAR 서열의 시작 시 CD8 리더 서열(MALPVTALLLALLLHAARP 서열번호 147), 가변 영역 사이에 링커(TGSTSGKPGSGEGS 서열번호 29), CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타 도메인을 함유하였다. 전장 HER2를 표적으로 하는 트라스투주맙 기반 CAR을 양성 대조군으로서 사용하였다(도 2a).
생성된 32H2 p95HER2 CAR 중 어느 것도 세포 표면에서 검출되지 않았다(도 2b). 따라서, p95HER2를 발현하는 MCF10A 세포의 사멸이 결여된 것에 의해 보여지듯 두 가지 32H2 p95HER2 CAR T는기능적이 아니었다(도 2c).
32H2의 scFv를 인간화하여, 인간화의 등급에 따라 VH 및 VL의 2가지 인간화 버전을 생성하였다(표 1).
V H VL
H1 32H2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFGMSWVRQAPGKGLEWVSTINTNGGTTHYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGLDYWGQGTLVTVSS (서열번호 28) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASNRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSTYPLAFGQGTKLEIK(서열번호 27)
H2 32H2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFGMSWVRQAPGKGLEWVSTINTNGGTTHYPDSVKGRFTISRDNSKKFVYLQMNSLRAEDTAVYYCPREGLDYWGQGTLVTVSS (서열번호 171) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGTAVAWYQLKPGQAPRLLIYSASNRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSTYPLAFGQGTKLEIK (서열번호172)
32H2 EVQLVESGGGIVQPGGSLKLSCAASGFTFNDFGMSWIRQTPDKRLELVATINTNGGTTHYPDNVKGRFSISRDNAKKFVYLQMSSLKSDDTAIYYCPREGLDYWGQGTTLTVSS (서열번호 161) DIVLTQSQKFMSTSVGDRVSIICKASQSVGTAVAWYQLKAGQSPKLLIYSASNRFTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSTYPLAFGAGTKLELK (서열번호 160)
표 1: 상이한 인간화 32H2 버전의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 H1: 인간화 버전 1; H2: 인간화 버전 2.
경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 배열 순서가 상이한 4가지 버전의 인간화 32H2 p95HER2 CAR을 생성하였고, 인간화 버전(H1 또는 H2)을 사용하였다. 4개의 인간화 32H2 p95HER2 CAR은 CAR 서열의 시작 시 CD8 리더 서열, 가변 영역 사이의 링커, CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타 도메인을 함유하였다. (도 3a). VL-VH H1 32H2 p95HER2 CAR(도 3b, 4b)은 나머지 인간화 32H2 p95HER2 CAR 버전(도 3b)과 대조적으로 세포 표면에서 발현되었다. 따라서, VL-VH H1 32H2 p95HER2 CAR을 추가 실험에 사용하였고, 이를 인간화 32H2(h32H2) p95HER2 CAR로 명명하였다.
추가 실험에서, h32H2 p95HER2는 트라스투주맙-기반 CAR과 유사한 수준으로 세포 표면에서 발현될 수 있다(도 4b). 또한, p95HER2를 발현하는 MCF10A 세포와 공동 배양된 h32H2 p95HER2 CAR T에서는 특이적 세포독성 효과가 유도되었지만(도 4c), 효능은 높은 표적: CAR T 세포의 비율에서 명확하였다. 대조적으로, h32H2 p95HER2 CAR T는 MCF10A 세포에 어떠한 영향도 미치지 않았으며(도 4d), 이는 p95HER2에 대한 특이성을 시사한다.
실시예 2: 214D8 p95HER2 CAR
214D8 p95HER2 CAR은 US2011/0135653으로 공개된 미국 특허 출원(그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 개시된 항-p95HER2 항체 214D8의 scFv로부터 생성되었다.
214D8 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 배열 순서가 상이한 두 가지 버전의 214D8 p95HER2 CAR을 개발하였다(표 2, 도 5a). 두 가지 214D8 p95HER2 CAR은 CD8 리더 서열, 링커, CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타 도메인을 함유하였다.
두 가지 214D8 p95HER2 CAR은 세포 표면에서 발현되었는데, VL-VH 214D8 p95HER2 CAR이 더 높은 수준으로 발현되었다(도 5b). p95HER2를 발현하는 MCF10A 세포와 공동 배양된 VL-VH 214D8 p95HER2 CAR T는 낮은 표적: CAR T 세포 비율에서도 높은 세포독성 효과를 유도하였다(도 5c).
V H
VL
214D8 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMAWVRQTPDRRLELVATINSNGGKTYHPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTREGFDYWGQGTTLTVSS (서열번호 40) DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKILIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMKSEDLADYFCQQYSTYPLTFGAGTKLELK (서열번호 39)
표 2: 214D8 항-p95HER2 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열.
표 3에 나타낸 바와 같이, 214 항-p95HER2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 버전이 또한 수득되었다.
V H VL
H1 214D8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMAWVRQTPDRRLELVATINSNGGKTYHPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTREGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호: 53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVAWFQQKPGKAPKILIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPLTFGQGTKLEIK (서열번호: 54)
H2 214D8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMAWVRQAPGKGLEWVSTINSNGGKTYHPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTREGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 55) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVAWFQQKPGKAPKILIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPLTFGQGTKLEIK (서열번호 56)
표 3: 상이한 인간화 214 항-p95HER2 버전의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열.
인간화 214 항-p95HER2 CAR 버전은 세포 표면에서 발현되었고(도 6b), 적어도 H1 214 및 H2 214 인간화 CAR 버전은 낮은 표적: CAR T 세포 비율에서도 높은 세포독성 효과를 유도하였다(도 6d). 또한, 도 6c에 도시된 바와 같이, 인간화 ScFv 버전의 사용은 비인간화 버전과 비교하여, 정상 수준의 HER2를 발현하는 세포의 사멸의 감소로 인해 p95HER2에 대해 보다 특이적인 CAR T를 생성한다.
실시예 3: 215C2 p95HER2 CAR
215C2 p95HER2 CAR을 항-p95HER2 항체 215C2의 ScFv로부터 생성하였다.
215C2 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 배열 순서가 상이한 두 가지 버전의 215C2 p95HER2 CAR을 개발하였다(표 4, 도 7a). 두 가지 215C2 p95HER2 CAR은 CD8 리더 서열, 링커, CD8 힌지 도메인, CD28 막관통 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타 도메인을 함유하였다.
두 가지 215C2 p95HER2 CAR은 세포 표면에서 발현되었는데, VL-VH 215C2 p95HER2 CAR이 더 높은 수준으로 발현되었다(도 7b). 또한, p95HER2를 발현하는 MCF10A 세포와 공동 배양된 VL-VH 215C2 p95HER2 CAR T는 낮은 표적: CAR T 세포 비율에서 높은 세포독성 효과를 유도하였다(도 7c).
V H VL
215C2 EVHLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMSWVRQTPDKRLELVATINGNGVKIYYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAIYYCPREGFDYWGQGTTLTVSS (서열번호 51) DIVMTQSQKFMSTSEGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKVLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTTLELK (서열번호 50)
표 4: 215C2 항-p95HER2 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
표 5에 나타낸 바와 같이, 215 항-p95HER2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 버전도 수득하였다
V H VL
H1 215C2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMSWVRQAPGKRLELVATINGNGVKIYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCPREGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 59) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVAWFQQKPGKAPKVLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK (서열번호 60)
H2 215C2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMSWVRQAPGKGLEWVATINGNGVKIYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCPREGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 61 ) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTAVAWFQQKPGKAPKSLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK서열번호 62)
표 5: 상이한 인간화 215 항-p95HER2 버전의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열.
인간화 215 항-p95HER2 CAR 버전 H1 및 H2는 세포 표면에서 발현되었으며(도 8b), 낮은 표적: CAR T 세포 비율에서도 높은 세포독성 효과를 유도하였다(도 8c). 또한, 도 8d에 도시된 바와 같이, 인간화 ScFv 버전의 사용은 비인간화 버전과 비교하여, 정상 수준의 HER2를 발현하는 세포의 사멸의 감소로 인해 p95HER2에 대해 보다 특이적인 CAR T를 생성한다.
실시예 4: p95HER2 양성 종양의 성장에 대한 m215 유래 p95HER2 CAR T의 생체 내 효과 .
NSG 마우스에게 MCF7p95HER2 세포를 동소 이식하였다. 종양이 약 300 mm3에 도달했을 때, 3 x 106 m215 유래 p95HER2 CAR+ T 세포 또는 UTD T 세포로 동물을 치료하였다. CAR + T 세포 치료를 3회 반복한 후 종양의 완전한 관해를 달성하였다(도 9a). 또한, 순환하는 인간 CD3+ 세포가 치료 35일 후에 검출되었으며, 이는 적절한 CAR T 지속성을 시사한다.
실시예 5: p95HER2 양성 및 p95HER2 음성 종양의 성장에 대한 H1 214 유래 p95HER2 CAR T의 생체 내 효과.
NSG 마우스에게 MCF7p95HER2 세포 또는 MCF7 세포를 동소 이식하였다. 종양이 약 300 mm3에 도달했을 때, 마우스에 3 x 106 H1 214 p95HER2 CAR+ T 세포 또는 UTD T 세포를 처리하였다. 종양이 p95HER2를 발현했을 때, 2회의 H1 214 CAR T 세포 치료 후, 종양의 완전한 관해를 달성하였는데(도 10a), 이는 H1 214 유래 p95HER2 CAR T의 높은 효능을 시사한다. 또한, 종양이 p95HER2는 발현하지 않지만 정상 수준의 HER2를 발현했을 때 종양 성장에 대한 효과가 관찰되지 않았으며(도 10d), 이는 H1 214 CAR T의 p95HER2에 대한 매우 높은 특이성을 시사한다. 또한, 종양이 p95HER2를 발현하고(도 10b), MCF7 종양을 가지지 않는 경우만(도 10e), 제2 투여 후 10일차에 순환하는 인간 CD3+ 세포 수준이 UTD 그룹과 비교하여 증가하였는데, 이는 동족 항원의 존재 하에서만 적절하고 특이적인 CAR T 확장을 시사한다(도 10b). 대조군(UTD)과 비교하여, 정상 HER2 발현 MCF7 종양(도 10f)이 아닌 MCF7p95HER2 종양에서만(도 10c) CD3+ 세포의 침윤 증가가 관찰되었기 때문에, 이러한 결과는 종양 내 인간 CD3+의 수준과 상관 관계가 있다.
SEQUENCE LISTING <110> FUNDACI?PRIVADA INSTITUT D'INVESTIGACI?ONCOL?ICA DE VALL HEBRON INSTITUCI?CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVAN?TS <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR P95HER2 AND USES THEREOF <130> P18520PC00 <150> EP20382457.8 <151> 2020-05-28 <160> 195 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VH m32H2 <400> 1 Asp Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH m32H2 <400> 2 Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VH m32H2 <400> 3 Glu Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL m32H2 <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VL m32H2 <400> 5 Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VL m32H2 <400> 6 Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu Ala 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VH 214D8 <400> 7 Thr Tyr Gly Met Ala 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH 214D8 <400> 8 Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VH 214D8 <400> 9 Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL 214D8 <400> 10 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VL 214VL <400> 11 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VL 214D8 <400> 12 Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VH 215C2 <400> 13 Asp Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH 215C2 <400> 14 Thr Ile Asn Gly Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VH 215C2 <400> 15 Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL 215C2 <400> 16 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VL 215C2 <400> 17 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VL 215C2 <400> 18 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H1-32H2 <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H1-32H2 <400> 20 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H1-32H2 <400> 21 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H1-32H2 <400> 22 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H1-32H2 <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H1-32H2 <400> 24 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 25 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H1-32H2 <400> 25 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H1-32H2 <400> 26 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL (FRs H1-32H2 and CDRs m32H2) <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH (FRs H1 32H2 and CDRs m32H2) <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker coneting VH and VL regions <400> 29 Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 30 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH (CDRs m32H2 and FRs H1 32H2) <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Thr 165 170 175 Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Leu 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH 214D8 <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH 214D8 <400> 32 Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH 214D8 <400> 33 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH 214D8 <400> 34 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL 214D8 <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys 20 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL 214D8 <400> 36 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL 214C8 <400> 37 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Met Lys Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL 214D8 <400> 38 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 214D8 <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Lys Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 40 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 214D8 <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 41 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 214D8 VL-VH <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Lys Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ala Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Ser 165 170 175 Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser 195 200 205 Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 42 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH 215C2 <400> 42 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH 215C2 <400> 43 Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH 215C2 <400> 44 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro Arg 20 25 30 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH 215C2 <400> 45 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL 215C2 <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys 20 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL 215C2 <400> 47 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL 215C2 <400> 48 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL 215C2 <400> 49 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 215C2 <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 51 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 215C2 <400> 51 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 52 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 215C2 VL-VH <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val His Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Gly 165 170 175 Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 53 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1-214D8 <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL H1-214D8 <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H2-214D8 <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL H2-214D8 <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1-215C2 <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL H1-215C2 <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H2-215C2 <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL H2-215C2 <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H1-214D8 <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H1-214D8 <400> 66 Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H1-214D8 <400> 67 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H1-214D8 <400> 68 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H1-214D8 <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL H1-214D8 <400> 70 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H1-214D8 <400> 71 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H1-214D8 <400> 72 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 73 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H2-214D8 <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H2-214D8 <400> 74 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H2-214D8 <400> 75 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H2-214D8 <400> 76 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H2-214D8 <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL H2-214D8 <400> 78 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H2-214D8 <400> 79 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H2-214D8 <400> 80 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H1-215C2 <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H1-215C2 <400> 90 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H1-215C2 <400> 91 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg 20 25 30 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H1-215C2 <400> 92 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 93 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H1-215C2 <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL H1-215C2 <400> 94 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H1-215C2 <400> 95 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H1-215C2 <400> 96 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 97 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H2-215C2 <400> 97 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H2-215C2 <400> 98 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H2-215C2 <400> 99 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg 20 25 30 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H2-215C2 <400> 100 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 101 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H2-215C2 <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL H2-215C2 <400> 102 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 103 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H2-215C2 <400> 103 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H2-215C2 <400> 104 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 105 <400> 105 000 <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <400> 107 000 <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <400> 109 000 <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <400> 112 000 <210> 113 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 113 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Asx Cys Val Leu Ala Cys Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 114 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3-zeta intracellular signalling domain <400> 114 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 115 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> intracellualr domain of the coestimulatory domain CD28 <400> 115 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 116 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 116 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 117 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 118 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 119 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 119 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 120 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 121 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 122 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 123 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 124 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 125 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 126 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 127 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 128 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 129 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 130 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 130 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 131 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 132 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 133 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 134 Asp Lys Thr His Thr 1 5 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 136 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 1 5 10 15 <210> 137 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 137 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 138 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 139 Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 140 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 141 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 141 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 142 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 142 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 143 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro <210> 144 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 144 Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln 1 5 10 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 145 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 146 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge region <400> 146 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 147 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> leader sequence <400> 147 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 148 <400> 148 000 <210> 149 <400> 149 000 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <400> 151 000 <210> 152 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 Vh m32H2 <400> 152 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 153 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH m32H2 <400> 153 Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 154 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH m32H2 <400> 154 Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro 20 25 30 Arg <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH m32H2 <400> 155 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 156 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL m32H2 <400> 156 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys 20 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL m32H2 <400> 157 Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 158 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL m32H2 <400> 158 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL m32H2 <400> 159 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 160 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL m32H2 <400> 160 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 161 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH m32H2 <400> 161 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 162 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH m32H2 <400> 162 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe Gly Met Ser Trp Ile 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Thr 165 170 175 Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Ser 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser 195 200 205 Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Leu 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 163 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VH H2-32H2 <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 164 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VH H2-32H2 <400> 164 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 165 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VH H2-32H2 <400> 165 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Phe Val Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro 20 25 30 Arg <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VH H2-32H2 <400> 166 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 167 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 VL H2-32H2 <400> 167 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 VL H2-32H2 <400> 168 Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 169 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 VL H2-32H2 <400> 169 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 VL H2-32H2 <400> 170 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 171 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL H2-32H2 <400> 171 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 172 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H2-32H2 <400> 172 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Phe Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 173 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H2-32H2 <400> 173 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Thr 165 170 175 Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Phe Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Leu 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH H1-32H2 <400> 174 Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 175 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL H1-32H2 <400> 175 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL H2-215C2 <400> 179 Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 180 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL ScFv1 H1-32H2 (CDR2 174) <400> 180 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 181 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1-32H2 CDR1 175 <400> 181 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Lys Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 182 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H1-32H2 (VL CDR2 174 and VH CDR1 175) <400> 182 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Thr 165 170 175 Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly 210 215 220 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 215C2 (CDR 179) <400> 184 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 185 <400> 185 000 <210> 186 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH 215C2 (VL 184) <400> 186 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val His Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Gly 165 170 175 Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 187 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H1-214D8 <400> 187 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ala Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Ser 165 170 175 Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 188 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H2-214D8 <400> 188 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ala Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser 165 170 175 Asn Gly Gly Lys Thr Tyr His Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 189 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H3-214D8 <400> 189 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ala Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser 165 170 175 Asn Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 190 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H1-215C2 <400> 190 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Gly 165 170 175 Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 191 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH H2-215C2 <400> 191 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Gly 165 170 175 Asn Gly Val Lys Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL m32H2 (CDR1 VL 175) <400> 193 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 194 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH m32H2 (CDR2 VH 174) <400> 194 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Pro Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 195 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-VH m32H2 (193 and 194) <400> 195 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe Gly Met Ser Trp Ile 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Thr 165 170 175 Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Gly Arg Phe 180 185 190 Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val Tyr Leu Gln Met Ser 195 200 205 Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Pro Arg Glu Gly 210 215 220 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235

Claims (54)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) p95HER2에 특이적인 항원 결합 도메인,
    (ii) 막관통 도메인 및
    (iii) 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 포함하되,
    상기 항원 결합 도메인은
    (i) ScFv(ScFv1)로서,
    - VL 및 VH 영역의 프레임워크 영역이 인간화되고,
    - 상기 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    - 상기 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 ScFv(ScFv1),
    (ii) 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 1)으로서,
    - 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
    - 상기 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    - 상기 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 1),
    (iii) 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 2)으로서,
    - 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
    - 상기 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    상기 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인 2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, CAR.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ScFv1의 VL 영역은 상기 VH 영역에 대해 N-말단에 위치하는, CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ScFv1의 VH 영역의 FR1, FR2, FR2 및 FR4는 각각 서열번호 19, 20, 21 및 22의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 ScFv1의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 23, 24, 25 및 26의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  4. 제3항에 있어서, 상기 ScFv1의 VL은 서열번호 27 또는 180의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 VH는 서열번호 28 또는 181의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ScFv1의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29의 서열을 포함하는 링커 영역에 의해 연결된, CAR.
  6. 제5항에 있어서, 상기 ScFv1은 서열번호 30 또는 182의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34, 서열번호 65, 66, 67 및 68 또는 서열번호 73, 74, 75의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38, 서열번호 69, 70, 71, 및 72 또는 서열번호 77, 78, 79 및 80의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 39, 54 또는 56의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 항원 결합 도메인 1의 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 40, 53 또는 55의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 1은 ScFv이고, 상기 ScFv의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결되는, CAR.
  10. 제9항에 있어서, ScFv는 서열번호 41, 187, 188 또는 189의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 2의 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45, 서열번호 89, 90, 91 및 92 또는 서열번호 97, 98, 99 및 100의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 항원의 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49, 또는 서열번호 93, 94, 95 및 96의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 50, 184, 60 또는 62의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 VH는 서열번호 51, 59 및 61의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 2는 ScFv이고, 상기 ScFv의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결되는, CAR.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ScFv는 서열번호 52, 186, 190 또는 191의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, CAR.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인과 상기 막관통 도메인 사이에 힌지 도메인을 더 포함하는, CAR.
  16. 제15항에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인인, CAR.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD4 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, CTLA4 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인 및 CD3 제타 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 일차 신호전달 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, CAR.
  19. 제18항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), DAP10, DAP12, 및 4-1BB(CD137), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, CAR.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  21. 제20항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인은 상기 CD3 제타 세포내 도메인에 대해 N-말단측에 배열되는, CAR.
  22. 제21항에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8 힌지 도메인이고, 상기 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28 공동자극 도메인인, CAR.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 암호화하는 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암호화된 CAR은 리더 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리더 서열은 CD8 리더 서열인, 핵산.
  26. 제23항 내지 제25항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체(CAR), 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제26항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인, 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포인, 숙주 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포인, 숙주 세포.
  31. ScFv로서,
    - 상기 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 1, 174 및 3의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    - 상기 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 175, 5 및 6의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는, ScFv.
  32. 제31항에 있어서, 상기 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 152, 153, 154 및 155, 서열번호 19, 20, 21 및 22 또는 서열번호 163, 164, 165 및 166의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 156, 157, 158 및 159, 서열번호 23, 24, 25 및 26 또는 서열번호 167, 168, 169 또는 170의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, ScFv.
  33. 제32항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 160, 193, 27, 171 또는 180의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 VH는 서열번호 161, 194, 28, 172 또는 181의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, ScFv.
  34. 제33항에 있어서, 상기 ScFv1의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결되는, ScFv.
  35. 제334항에 있어서, 상기 ScFv는 서열번호 162, 195, 30, 173 또는 182의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, ScFv.
  36. 항원 결합 도메인으로서,
    - 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
    - 상기 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    - 상기 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 10, 11 및 12의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인.
  37. 제36항에 있어서, 상기 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 31, 32, 33 및 34, 서열번호 65, 66, 67 및 68 또는 서열번호 73, 74, 75 및 76의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 35, 36, 37 및 38, 서열번호 69, 70, 71, 72 또는 서열번호 77, 78, 79 및 80의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항원 결합 도메인.
  38. 제37항에 있어서, 상기 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 39, 54 및 56의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 40, 53 및 55의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항원 결합 도메인.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인 1은 ScFv이고, 상기 항원 결합 도메인의 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결되는, 항원 결합 도메인.
  40. 제39항에 있어서, 상기 ScFv는 서열번호 41, 187, 188 또는 189의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항원 결합 도메인.
  41. 항체 또는 이의 항체 단편으로서,
    - 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역을 가지고,
    - 상기 적어도 하나의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 13, 14 및 15의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고,
    - 상기 적어도 하나의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 16, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체 또는 서열번호 179, 17 및 18의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  42. 제41항에 있어서, 상기 적어도 하나의 VH 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 42, 43, 44 및 45, 서열번호 89, 90, 91 및 92 또는 서열번호 97, 98, 99 및 100의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 VL 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 서열번호 46, 47, 48 및 49, 서열번호 93, 94, 95 및 96 또는 서열번호 101, 102, 103 및 104의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 항체 단편.
  43. 제42항에 있어서, 상기 적어도 하나의 VL 영역은 서열번호 50, 184, 60 또는 62의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 VH 영역은 서열번호 51, 59 또는 61의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 항체 단편.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항체 단편은 ScFv이고, 상기 VH 및 VL 영역은 서열번호 29를 포함하는 링커 영역에 의해 연결되는, 항체 또는 이의 항체 단편.
  45. 제44항에 있어서, 상기 ScFv는 서열번호 52, 186, 190 또는 191의 서열 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 항체 단편.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체를 암호화하는 핵산.
  47. 제46항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  48. 제46항의 핵산 또는 제47항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  49. 환자의 암 진단 방법으로서,
    (i) 종양 세포를 함유하는 환자의 샘플을 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 ScFv, 및 항원 결합 도메인 또는 항체와 접촉시키는 단계, 및
    (ii) 상기 ScFv, 항원 결합 도메인 또는 항체와 상기 샘플 내 세포의 결합을 검출하는 단계로서,
    이러한 결합의 존재는 환자가 암을 앓고 있음을 나타내는 것인, 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 ScFv1, 항원 결합 도메인 또는 항체는 고형 지지체 상에 배열되는, 방법.
  51. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 비히클을 포함하는 약학적 조성물.
  52. 약물에 사용하기 위한 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편.
  53. 암을 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체 단편.
  54. 제53항에 있어서, 암은 p95HER2 양성인, 사용하기 위한 숙주 세포 또는 항체 단편.
KR1020227045910A 2020-05-28 2021-05-28 P95her2에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 KR20230030591A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20382457.8 2020-05-28
EP20382457.8A EP3915576A1 (en) 2020-05-28 2020-05-28 Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
PCT/EP2021/064383 WO2021239965A1 (en) 2020-05-28 2021-05-28 Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230030591A true KR20230030591A (ko) 2023-03-06

Family

ID=70977904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227045910A KR20230030591A (ko) 2020-05-28 2021-05-28 P95her2에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이의 용도

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230348620A1 (ko)
EP (2) EP3915576A1 (ko)
JP (1) JP2023529082A (ko)
KR (1) KR20230030591A (ko)
CN (1) CN115776910A (ko)
AU (1) AU2021279324A1 (ko)
BR (1) BR112022024084A2 (ko)
CA (1) CA3185329A1 (ko)
MX (1) MX2022014790A (ko)
WO (1) WO2021239965A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202114938D0 (en) * 2021-10-19 2021-12-01 Univ Oslo Hf Her2 variant car
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
CN118556082A (zh) * 2022-01-26 2024-08-27 山东先声生物制药有限公司 p95HER2抗体及其应用
EP4253418A1 (en) 2022-03-29 2023-10-04 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Immune cells expressing chimeric antigen receptors and bispecific antibodies and uses thereof
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
CN118477173A (zh) * 2023-02-13 2024-08-13 信达细胞制药(苏州)有限公司 靶向HER2/p95HER2的P329G抗体及其与嵌合抗原受体细胞的组合和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
AU639726B2 (en) 1989-09-08 1993-08-05 Duke University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
DE69428764T2 (de) 1993-12-24 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1934174B1 (en) 2005-10-07 2011-04-06 Exelixis, Inc. Azetidines as mek inhibitors for the treatment of proliferative diseases
ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
PT2330131E (pt) 2009-12-07 2015-01-14 Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avancats Anticorpos contra a variante truncada de her-2 ctf-611
WO2018060301A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
EP3555620A1 (en) * 2016-12-13 2019-10-23 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method to determine the presence of a target antigen in a tumor sample

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023529082A (ja) 2023-07-07
WO2021239965A1 (en) 2021-12-02
BR112022024084A2 (pt) 2023-01-31
EP3915576A1 (en) 2021-12-01
US20230348620A1 (en) 2023-11-02
CN115776910A (zh) 2023-03-10
CA3185329A1 (en) 2021-12-02
MX2022014790A (es) 2023-04-03
EP4157336A1 (en) 2023-04-05
AU2021279324A1 (en) 2022-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230348620A1 (en) Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
JP7284707B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）またはその改変型を発現する操作された細胞および関連方法
EP3558348A1 (en) Engineered t cells for the treatment of cancer
US20210206848A1 (en) Receptor inhibition by phosphatase recruitment
KR20210028140A (ko) 삼중특이성 항원 결합 단백질
JP2022501361A (ja) バリアントｃｄ８０融合タンパク質および関連構築物の方法および使用
KR20200128014A (ko) 입양 세포 요법 및 체크포인트 억제제를 이용한 병용 요법
US20230183342A1 (en) Antibodies to nkp46 and constructs thereof for treatment of cancers and infections
CN110885376B (zh) 抗cd47/cd20双特异性抗体及其用途
KR20220164474A (ko) 키메라 항원 수용체 t 세포를 합텐 표지된 세포로 자극하기 위한 방법 및 조성물
KR20220082775A (ko) 항-pd-1 항체 및 이의 용도
TW202237633A (zh) 嵌合受體及其使用方法
CN111727058A (zh) 靶向tag-72的t细胞疾病治疗
CN114616243A (zh) Car-t细胞组合物及其使用方法
JP2022537419A (ja) Ｃｄ４３の固有のがん関連エピトープを標的にするモノクローナル抗体
WO2016025884A1 (en) Glycosyl-phosphatidylinositol (gpi)-linked gdnf family alpha-receptor 4 (gfralpha4)-specific antibody and uses thereof
KR20220165254A (ko) Cd28h 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체 및 그 사용 방법
EP4253418A1 (en) Immune cells expressing chimeric antigen receptors and bispecific antibodies and uses thereof
WO2024088325A1 (zh) 抗体及其应用
AU2023254830A1 (en) Binding agents and methods of use thereof
TW202309091A (zh) 嵌合受體及其使用方法
KR20210096627A (ko) 항-b7s1 폴리펩티드 및 이의 용도