KR20230011932A - 신생물 질환의 치료를 위한 kif18a 저해제 - Google Patents

신생물 질환의 치료를 위한 kif18a 저해제 Download PDF

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마르크 노엘 페이튼
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암젠 인크
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Abstract

신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체에서 신생물 질환을 치료하기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키는 방법 및 대상체에서 종양 또는 암 성장을 감소시키는 방법이 제공된다. 예시적인 양태에서, 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 유리하게는, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 선택적으로 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 정상 체세포에 대한 명시적인 독성 없이 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시킨다.

Description

신생물 질환의 치료를 위한 KIF18A 저해제
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2020년 4월 14일에 출원된 미국 임시 출원 제63/009,637호, 2020년 7월 22일에 출원된 미국 임시 출원 제63/055,111호, 및 2020년 9월 30일에 출원된 미국 임시 출원 제63/085,607호의 이익을 주장한다. 각각의 출원의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
전자적으로 제출된 물질의 참조에 의한 통합
2021년 3월 22일에 생성되고 본원에 동반되어 제출되고 하기와 같이 식별되는 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열의 나열은 그 전문이 참조로서 포함된다: 227,954 바이트 아스키(Text) 파일명 "A-2607-WO-PCT_Seqlisting.txt".
암은 인류에 영향을 미치는 가장 광범위한 질환 중 하나이고, 세계적으로 사망의 주된 원인이다. 미국에서만, 암은 사망의 두번째로 가장 흔한 원인이고, 심질환만 이를 앞선다. 지난 수십년에 걸쳐 많은 상이한 암 중 하나 이상에 대한 효과적인 치료 또는 치유를 찾고자 하는 노력에서, 수많은 그룹은 어마어마한 양의 시간, 노력 및 재정 자원을 투자하였다. 그러나, 현재까지, 이용 가능한 암 치료 및 치료법 중에서, 몇몇만이 임의의 상당한 정도의 성공을 제공한다.
암은 종종 정상적인 세포 과정의 탈조절 또는 비조절된 세포 증식을 특징으로 한다. 암성 세포로 형질전환된 세포는 비제어되고 비조절된 방식으로 증식하여, 일부 경우 암의 전이 또는 확산을 유발한다. 세포 주기 및 중심체 주기를 통해 증식의 진행을 제어하는 세포 경로를 책임지는 하나 이상의 유전자에 대한 손상은 세포 증식의 정상적인 조절의 소실을 야기할 수 있다. 이들 탈조절된 유전자는 비검문된(unchecked) 세포-주기 진행 및 세포 증식을 유발하는 사건의 캐스케이드에 참여하는 다양한 종양 억제자 또는 종양유전자 단백질을 코딩할 수 있다. 정상적인 분열 세포 및 암세포의 세포 주기 및 유사분열 조절과 진행에서 핵심적인 역할을 하는 다양한 키나제 및 키네신 단백질이 식별되었다.
암 경로, 표현형, 유사분열과 관련된 분화 상태 및 복제 스트레스는 유사분열 진입, 유사분열 방추체 형성, 중심체 온전성과 위치화(positioning), MT-동원체 부착, 자매 염색분체 응집, 및 SAC 제어와 관련된 특정 취약성을 유발할 수 있다. 그러므로, 새로운 항유사분열 치료법의 임상적 잠재성을 향상시키기 위한 전략은 정상 조직에 대한 부수적 손상을 모면시키거나(sparing) 감소시키는 한편 종양-특이적 취약성을 활용해야 한다. KIF18A 저해가 유사분열에서 SAC의 활성화, 다극성(multipolarity)의 유도 및 아폽토시스(apoptosis)를 유발하고, 정상적인 분열 체세포를 모면시키는 한편 인간 암 세포주의 하위세트(subset)의 성장을 저해하므로 KIF18A는 신생의 유망한 항암 표적이다.
유사분열은 진핵 세포가 이의 복제된 염색체를 2개의 동일한 딸핵(daughter nuclei)으로 분리하는 과정이다. 일반적으로 이 다음에 바로, 핵, 세포질, 세포소기관 및 세포막을 이들 세포성 구성요소의 대략 동일한 할당(share)을 함유하는 2개의 딸세포로 나누는 세포질 분열이 이어진다. 유사분열 및 세포질 분열은 함께 세포 주기 중 유사분열(M) 기(phase) - 서로 그리고 이들의 부모 세포와 유전적으로 동일한 2개의 딸세포로의 모세포(mother cell)의 분리를 정의한다. 유사분열 과정은 복잡하고 고도로 조절된다. 사건의 순서는 활성의 한 세트의 완료 및 다음 세트의 시작에 상응하는 별개의 기로 나뉜다. 이들 단계는 전기(prophase), 전중기(prometaphase), 중기(metaphase), 후기(anaphase) 및 말기(telophase)이다. 유사분열 과정 동안 복제된 염색체는 응축되고 방추체 미세소관(MT: microtubule) 섬유에 부착되며, 상기 미세소관은 자매 염색분체를 세포의 반대편으로 끌어당긴다. 방추체 조립 검문소(SAC: spindle assembly checkpoint)는 모든 자매 염색분체가 방추 동원체 섬유에 적절하게 부착되고 방추체 장력(tension)이 중기 동안 달성될 때까지 활성이며, 어떠한 오류도 검출되지 않는다면 세포는 후기로 진행된다. 그 후에, 세포는 세포질 분열에서 나뉘어서, 2개의 동일한 딸세포를 생성한다.
정상적으로, 세포-주기 검문소는 오류(예를 들어 DNA 손상, DNA 복제 분기점(replication fork) 정체/붕괴, 중심체 일탈(aberration), 염색체 오-분리(mis-segregation), 미세핵(micronuclei) 형성)가 검출된다면 활성화된다. 게놈에 대한 이들 오류를 바로잡을 수 없다면, 세포는 정상적으로 세포 억제 및 아폽토시스를 겪는다. 그러나, 세포가 이의 세포-주기를 통해 이동하고 비검문된(unchecked) 채로 진행되게 된다면, 시간이 지남에 따라 돌연변이, 염색체 오-분리, 중심체 일탈이 축적될 수 있다. 이들 유전자/핵형/중심체 변경은 누적되고 결국 적응(adaptation)을 통해 전암성(pre-malignant) 또는 악성 신생물 특징(예를 들어 비제어된 증식)을 갖는 세포 자손을 유발할 수 있다.
높은 종양내 이질성(heterogeneity) 및 염색체 불안정성(CIN: chromosomal instability)을 갖는 암은 수치상(numerical)(획득 또는 소실) 변경 및 구조적 변경으로부터 비롯되는 연속적인 염색체 변화로 인해 복잡한 핵형을 갖는다. CIN에 기여하는 것으로 여겨지는 기전은 동원체 MT 부착 동역학, 중심체 사본 수, 유사분열 검문소 기능, 염색체 응집, 및 세포 주기 조절에서의 결함을 포함한다. 염색체 불안정성(CIN)은 세포-주기 진행/검문소, 중심체-주기, 및 DNA 수선을 조절하는 종양 억제자 및 종양유전자(예는 TP53, RB1, BRCA1, BRCA2, 상동성 재조합 결핍(HRD: homologous recombination deficient) 유전자, FBXW7, CCNE1, MYC를 포함하지만 이로 제한되지 않음)의 하위세트에서 유전적 병변에 대해 풍부화된(enriched) 증가된 수준의 복제 및 유사분열 스트레스와 관련이 있다(문헌[SL Thompson et al Current Biology. 2010;20:285-95] 및 문헌[R Nagel et al EMBO Reports 2016;17:1516-1531]).
유사분열, 또는 세포 분열은 암을 치료하는 데 있어서 확증된 개입 지점(point-of-intervention)이다. 승인된 항유사분열 약물은 미세소관의 기능을 저해하는 항암제이다. 미세소관은 유사분열의 종료 시 유사분열 방추체 장치(spindle apparatus)의 형성 및 세포질 분열에서 중요한 역할을 하는 α-튜불린 및 β-튜불린 헤테로이량체에 의해 형성되는 단백질 중합체이다. 미세소관을 표적화하는 항암제는 암세포의 증식에 개입하기 위한 입증된 접근법을 나타낸다. 탁산(taxane)은 항유사분열제의 가장 유망한 부류이고, 파클리탁셀(택솔(taxol)) 및 도세탁셀(탁소텔(taxotere))을 포함한다. 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)는 미세소관-탈안정화제의 부류이고, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 및 비노렐빈(vinorelbine)을 포함한다. 다른 새로운 튜불린 결합 항암 약물은 익사베필론(ixabepilone) 및 에리불린(eribulin)을 포함한다. 이들 항유사분열제는 안정화-미세소관 또는 탈안정화-미세소관에 의해 암세포의 증식을 방지하도록 작용한다. 미세소관의 이러한 직접 저해는 아폽토시스, 유사분열 재난(catastrophe), 및 치명적 다극 분열(lethal multipolar division)을 통해 세포 억제 및 사멸을 초래한다. 파클리탁셀은 발견된 탁산 시리즈 중 최초의 화합물이었다. 파클리탁셀의 구조적 유사체인 도세탁셀은 이후에 발견되었다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 보편적으로 난소암, 유방암, 두경부암, 폐암, 위암, 식도암, 전립선암, 및 AIDS-관련 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)을 포함한 여러 가지 인간 악성물을 치료하는 데 사용된다. 탁산의 1차 부작용은 골수억제(myelosuppression), 주로 호중구감소증(neutropenia)인 한편, 다른 부작용은 말초 부종(peripheral edema), 및 신경독성(말초 신경병증(peripheral neuropathy))을 포함한다.
항유사분열제, 예컨대 탁산에 대한 내성은 성공적인 암 치료를 복잡하게 만드는 인자이고, 종종 MDR-1 인코딩된 유전자와 이의 생성물, P-당단백질(P-gp)의 증가된 발현과 관련이 있다. 탁산에 대해 획득된 내성의 다른 문서화된 기전은 튜불린 돌연변이, 과발현, 증폭, 및 이소타입 스위칭(isotype switching)을 포함한다. α-튜불린 또는 β-튜불린에서의 돌연변이는 탁산이 미세소관 상의 올바른 장소에 결합하는 것을 저해하며; 이는 약물을 효과가 없게 만든다. 비제한적으로 화학치료제(예를 들어 백금 제제, 안트라사이클린(anthracycline)) 및 표적화된 치료법(예를 들어 TKI, PARP 저해제)을 포함한 다른 항암 약물 부류에 대한 내성은 암의 효과적인 치료에서 주요 결점이 되었고, 불가피하게도 환자 사망을 유발한다. 결과적으로, 약물 내성의 발달은 모든 항암 치료법이 갖는 문제로 남아 있다.
정밀 의학은 정상 조직에 대한 독성을 감소시키고 계층화(stratification) 마커를 활용하여 치료법 처리로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 큰 환자를 풍부화시키거나 중요하게는 이익을 얻을 가능성이 거의 없는 환자를 배제함으로써 암 환자 반응율을 향상시키는 것을 목표로 한다. 바이오마커 가이드 접근법은 더 높은 반응율을 달성하기 위해 그리고 환자 성과 및 삶의 질에서 향상을 유도하기 위해 암 환자 치료를 맞춤화하는 잠재성을 갖는다. 현재의 항유사분열 치료법으로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 큰 환자를 선택하는 데 이용 가능한 확립된 계층화 마커(바이오마커)의 결여가 존재한다.
그러므로, KIF18A 저해제 치료로부터 이익을 얻을 환자를 식별하기 위해 바이오마커에 대한 필요성이 존재한다.
KIF18A 저해제 치료에 대한 민감성의 바이오마커를 입증하는 데이터가 본원에 처음으로 제시된다. 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나를 나타내는 암세포는 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성을 실증하였다. 또한 KIF18A 저해제-민감성 암세포가 CDK4/6 저해제에 대해 감소된 또는 상실된 민감성 또는 내성을 나타냄을 실증하는 데이터가 본원에 제공된다. 데이터는 추가로, CDK4/6 저해제-민감성 암세포가 KIF18A 저해제에 대해 감소된 또는 상실된 민감성 또는 내성을 나타냄을 뒷받침한다.
본 개시내용은 신생물 질환(예를 들어, 암)을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) 하기 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함한다: (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합. 다양한 양태에서, 대상체에 대해 결정된 치료는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때, KIF18A 저해제를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체의 치료는 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성이거나 내성일 때 KIF18A 저해제를 포함하는 치료로서 결정된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체에 대한 치료는 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 둔감성이거나 내성일 때 CDK4/6 저해제를 포함하는 치료로서 결정된다.
KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) 하기 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함한다: (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합. 다양한 경우, 대상체는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 식별된다.
본 개시내용은 추가로 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체는, 시료의 암세포가 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 식별된다.
대상체에서 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 유지시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법, 예를 들어, 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 투여하여 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이다. 다양한 경우, 대상체는 CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료되었다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제와 함께 공동-투여된다. 다양한 경우, 방법은 CDK4/6 저해제 및 KIF18A 저해제를 포함하는 약학적 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 이에, KIF18A 저해제 및 CDK4/6 저해제를 포함하는 약학적 조합이 본원에 제공된다.
종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 종양 성장 또는 암 성장을 감소시키는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 또는 암 성장을 감소시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체에서 종양 세포 또는 암세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 세포 또는 암세포의 사멸을 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 암, 선택적으로, 유방암, 난소암, 또는 전립선암이다. 다양한 경우, 신생물 질환은 삼중-음성 유방암(TNBC), 비-관강(non-luminal) 유방암, 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC)이다. 예시적인 양태에서, 신생물 질환은 자궁내막암, 선택적으로, 장액성 자궁내막암이다. 선택적으로, 암은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 과발현된 CCNE1 유전자 생성물, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성인 세포를 포함한다. 다양한 경우, 암은 증폭된 CCNE1 유전자, 침묵화된(silenced) BRCA1 유전자, 결핍(deficient) Rb1 유전자, 또는 이들의 조합에 대해 양성인 세포를 포함한다. 선택적으로, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해 선택적으로 1일 1회 투여된다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 50% 또는 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80% 또는 85% 또는 적어도 90% 또는 95%)의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적이다. 다양한 경우, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 선택적으로 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 선택적으로 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 선택적으로 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 선택적으로 유도하거나 증가시키고, KIF18A 저해제는 정상 체세포에 독성이지 않다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키고, 대상체에서 정상 체세포의 증식은 대조군 대상체의 정상 체세포의 증식과 실질적으로 동일하다. 예시적인 경우, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키고, 정상 체세포의 아폽토시스 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준에 비해 상기 대상체에서 증가되지 않으며, 선택적으로 정상 체세포의 아폽토시스 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준과 실질적으로 동일하다.
본 개시내용의 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 화학식 I의 화합물이다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 C1, 화합물 C2, 화합물 C3, 화합물 C4, 화합물 C5, 화합물 C6, 화합물 C7, 화합물 C8, 화합물 C9, 화합물 C10, 화합물 C11, 화합물 C12, 화합물 C13, 또는 화합물 C14, 또는 이의 임의의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
대안적인 양태에서, KIF18A 저해제는 고분자(large molecule) KIF18A 저해제, 예컨대 비-코딩(non-coding) RNA, 예를 들어, siRNA이다.
도 1a 내지 도 1c는 실시예 1에서 참조된 표를 제공한다. 도 1a는 지시된 조직으로부터 기원하는 지시된 세포주에 대한 조직 배양 성장 조건을 나열하는 표 1A를 제공한다. 도 1b는 각각의 시험된 세포주에 대한 NCA에 대한 시딩 밀도(seeding density)를 나열하는 표 1B를 제공한다. 도 1c는 암 세포주 및 제1 KIF18A 저해제에 대한 이의 민감성을 나열하는 표 1C를 제공한다.
도 2a 내지 도 2f는 KIF18A 저해제(실선 정사각형) 또는 CDK4/6 저해제(열린 원형)의 농도의 함수로서 플롯화된 POC의 그래프이다. 도 2a 내지 도 2c는 KIF18A 저해제-민감성, CDK4/6 저해제-둔감성 세포를 실증한다. 세포 및 도 2d 내지 도 2f는 KIF18A 저해제-둔감성 세포, CDK4/6 저해제-민감성 세포를 실증한다.
도 3a는 OVCAR-8 HGSOC 세포주에 대해 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 3b는 MX-1 TNBC 세포주에 대해 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 3c는 MAX401NL TNBC 세포주에 대해 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 3d는 HCC-1937 TNBC 세포주에 대해 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 3e는 OVCAR-8 암 세포주에 대해 KIF18A 저해제 화합물 C14, 올라파립, 파클리탁셀, 독소루비신, 또는 카르보플라틴의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다.
도 4a는 암 세포주 및 제2 KIF18A 저해제에 대한 이의 민감성을 나열하는 표 2를 제공한다. 도 4b는 암 세포주 및 제2 KIF18A 저해제에 대한 이의 민감성을 나열하는 표 3을 제공한다. 도 4c는 KIF18A 저해제 처리에 대해 민감성을 실증한 유방 및 난소 암 세포주에 대한 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 4d는 KIF18A 저해제 처리에 대해 둔감성이었던 유방 및 난소 암 세포주에 대한 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 4e는 KIF18A 저해제 처리에 대해 민감성을 실증한 난소 및 유방 암 세포주의 제2 군에 대한 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다. 도 4f는 KIF18A 저해제 처리에 대해 둔감성이었던 난소 및 유방 암 세포주의 제2 군에 대한 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 POC를 플롯화하는 그래프이다.
도 5a는 세포 이식 후 시간의 함수로서 플롯화된 KIF18A 저해제-치료된 또는 비히클-치료된 마우스의 종양 부피의 그래프이다. 도 5b는 세포 이식 후 시간의 함수로서 플롯화된 KIF18A 저해제-치료된 또는 비히클-치료된 마우스의 체중의 그래프이다.
도 6a는 세포 이식 후 시간의 함수로서 플롯화된 KIF18A 저해제-치료된 또는 비히클-치료된 마우스의 종양 부피의 그래프이다. 도 6b는 세포 이식 후 시간의 함수로서 플롯화된 KIF18A 저해제-치료된 또는 비히클-치료된 마우스의 체중의 그래프이다.
도 7a는 본원에 기재된 바와 같은 DMSO-처리된 세포 또는 KIF18A 저해제 세포의 이미지이다. 도 7b는 KIF18A 저해제 농도의 함수로서 플롯화된 p-히스톤 또는 페리센트린(Pericentrin) 반점%를 실증하는 그래프 쌍이다. 도 7c는 본원에 기재된 바와 같이 p-히스톤 또는 페리센트린 반점에 관하여 KIF18A 저해제의 EC50을 나열하는 표이다.
도 8a는 KIF18A 저해제 또는 DMSO 대조군으로 처리 시 센트린-3, 페리센트린, 또는 중심체 마커에 대해 치료된 2개 유형의 암세포의 이미지 시리즈이다. 도 8b는 DMSO 대조군, KIF18A 저해제, 또는 Eg5 저해제로 치료된 세포에서 cI-PARP의 단백질 수준을 도시하는 웨스턴 블롯이다. GADPH는 로딩 대조군이다.
도 9는 DMSO 대조군 또는 KIF18A 저해제로 처리된 동기화된(synchronized) 또는 비동기화된(asynchronized) 세포에서 지시된 단백질(cI-PARP, 사이클린 B1, Mcl-1 사이클린 E1, KIF18A, BubR1)의 수준을 도시하는 웨스턴 블롯 시리즈이다. B-액틴은 로딩 대조군이다.
도 10a는 DMSO 대조군 또는 KIF18A 저해제로 처리된 세포에서 지시된 단백질(p-히스톤 H3, y-H2A.X, cI-PARP, BubR1, 전체 HEC1, p-Hec1)의 수준을 도시하는 웨스턴 블롯 시리즈이다. GADPH는 로딩 대조군이다. 도 10b는 cGAS(녹색), yH2A.X(적색), 또는 DAPI(청색)에 대해 염색된 세포를 도시하는 이미지 쌍이다. 세포는 DMSO 대조군 또는 KIF18A 저해제로 처리되었다.
도 11은 센트린-3(녹색), KIF18A(적색), 또는 DNA(DAPI(청색))로 염색된 세포를 도시하는 이미지 쌍이다. 세포는 DMSO 대조군 또는 KIF18A 저해제로 처리되었다.
도 12는 지시된 양의 비히클 대조군의 KIF18A 저해제로 처리된 세포에서 p-히스톤 H3의 그래프이다.
도 13a는 P-gp 저해제의 존재(열린 원형) 또는 부재(닫힌 원형) 하에 KIF18A 저해제 화합물 C14로 처리된 세포의 농도(log 농도)의 함수로서 플롯화된 POC의 그래프이다. 도 13b는 P-gp 저해제의 존재(열린 원형) 또는 부재(닫힌 원형) 하에 파클리탁셀(튜불린)로 처리된 세포의 농도(log 농도)의 함수로서 플롯화된 POC의 그래프이다.
도 14a는 DMSO, KIF18A 저해제 화합물 C9 또는 화합물 C11, 이스피네십, 파클리탁셀 또는 팔보시클립으로 치료된 인간 골수 단핵 세포(HBMNC)의 DNA 함량을 실증하는 FACS 플롯 시리즈이다. 도 14b는 항-BrdU(상단 그래프)로 염색되거나 세포 주기 중 SubG1(하단 그래프)에서 공여자 37612 또는 공여자 37534로부터의 인간 골수 단핵 세포(HBMNC)%를 실증하는 그래프이며, HBMNC는 DMSO, KIF18A 저해제 화합물 C9 또는 화합물 C11, 이스피네십(Eg5), 파클리탁셀(튜불린) 또는 팔보시클립(CDK4/6)으로 48시간 동안 치료되었다. 도 14c는 DMSO, KIF18A 저해제 화합물 C9 또는 화합물 C11, 이스피네십(Eg5), 파클리탁셀(튜불린) 또는 팔보시클립(CDK4/6)으로 96시간 동안 치료 후 공여자 37612 또는 공여자 37534로부터의 세포 중 살아 있는 세포 카운트(1 x 106당)의 그래프이다. 도 14d는 DMSO 또는 상이한 용량의 KIF18A 저해제 화합물 C11, 이스피네십(Eg5), 또는 팔보시클립(CDK4/6)으로 48시간 동안 처리된 BrdU에 대해 양성으로 염색된 인간 포피 섬유아세포(hFSF) 세포%를 플롯화하는 그래프 시리즈이다. 도 14e는 DMSO 또는 상이한 용량의 KIF18A 저해제 화합물 C11, 이스피네십(Eg5), 또는 팔보시클립(CDK4/6)으로 48시간 동안 처리된 BrdU에 대해 양성으로 염색된 인간 유선 상피 세포(HMEC)%를 플롯화하는 그래프 시리즈이다.
도 15a 내지 도 15e는 DMSO, KIF18A 저해제 화합물 C9 또는 화합물 C11, BI-2536 PLK1, 파클리탁셀(튜불린), 이스피네십(Eg5), GSK923295(CENP-E), 너틀린-3A(Nutlin-3A)(MDM2), 또는 팔보시클립(CDK4/6)으로 처리된 세포의 상대적인 전체 물질 카운트(object count)(도 15a), BrdU 혼입(도 15b), cl-PARP 발현(도 15c), p21 단백질 발현(도 15d), 및 yHH2X 발현(도 15e)을 실증하는 히트맵(heatmap)이다.
도 16은 개별 KIF18A siRNA, 또는 비-표적화 대조군(NTC) siRNA로 처리된 정상 HMEC(좌측 패널) 및 BT-549 TNBC 세포(우측 패널), 또는 양성 대조군(+ 대조군; 노코다졸(NOC: nocodazole)로 처리된 HeLa 세포 또는 스타우로스포린(staurosporine)으로 처리된 Jurkat 세포)의 용해물의 웨스턴 블롯 시리즈이다. 절단된 PARP(cl-PARP) 아폽토시스 마커 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블롯은 각각의 레인에서 동일한 단백질 로딩을 실증한다.
도 17a는 KIF18A siRNA, 비-표적화 대조군(NTC) siRNA siRNA, 또는 양성 대조군 siRNA(Eg5 siRNA)로 처리된 세포의 POC의 그래프 시리즈이다. 점선은 NTC siRNA 대조군에 기초하여 50% 세포 성장 저해를 나타낸다. KIF18A siRNA는 카운트를 NTC siRNA에 비해 >50% 감소시켰으며 p-값 < 0.05와 함께 KIF18A siRNA 민감성인 것으로 여겨졌다. 도 17b는 도 16a의 그래프에 대한 범례에 세포주 정보(조직 기원, 종양 하위유형, 및 유전적 상태)를 제공하는 표이다. NTC에 비해 KIF18A siRNA에 대한 p-값 및 세포 성장 저해이다. KIF18A siRNA는 카운트를 NTC siRNA에 비해 >50% 감소시켰으며 p-값 < 0.05와 함께 KIF18A siRNA 민감성인 것으로 여겨졌다. 도 17c는 KIF18A 및 β-액틴 단백질 발현 수준을 보여주는 KIF18A siRNA 민감성 또는 둔감성 세포의 용해물의 웨스턴 블롯이다.
도 18은 WGD 상태 및 TP53 상태에 의해 상이해지는 유방 및 난소 암 세포주의 4개 군 각각에 대한 KIF18A 저해제 화합물 C9에 대한 민감성의 그래프이다.
도 19a는 DMSO 대조군(POC)에 관해 MT-ATPase 발광 신호로서 제시된 KIF18A 운동(motor) 활성의 ADP-Glo 농도-반응 프로파일을 제공하고, 값은 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
OVCAR-3 HGSOC(도 19b) 또는 CAL-51 TNBC 종양 이종이식편(도 19c)에서 화합물 C9 및 C12의 종양 효능 및 내약성 분석이다. 종양이 확립된 마우스는 IP 용량의 비히클 단독, 100 mg/kg에서 화합물 C9, 또는 25 mg/kg에서 화합물 C12를 연속 18일 동안 매일 투여받았다. 그래프는 평균 ± SEM 대 시간(일수)으로서 제시된 종양 부피(좌측, 효능) 및 체중(우측, 내약성) 측정을 보여준다(군당 n = 10). 비히클 단독군과 비교하여 치료군이며, 다중 비교를 위해 RMANOVA와 뒤이어 던넷 검정(Dunnett test)에 의해 ****p < 0.0001이다.
OVCAR-8 HGSOC 종양 이종이식편에서 C9 및 C12의 종양 효능, 내약성, 종양 재성장 분석이다. 도 19d의 그래프는 평균 ± SEM 대 시간(일수)으로서 제시된 종양 부피(좌측, 효능) 및 체중(우측, 내약성) 측정을 도시한다(군당 n = 10). 비히클 단독군과 비교하여 치료군이며, 다중 비교를 위해 RMANOVA와 뒤이어 던넷 검정에 의해 ****p < 0.0001이다.
치료를 결정하는 방법, 치료에 대한 반응자를 식별하는 방법, 및 관련된 방법
본 개시내용은 신생물 질환(예를 들어, 암)을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) 하기 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함한다: (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합. 다양한 양태에서, 대상체에 대해 결정된 치료는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때, KIF18A 저해제를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 방법은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체의 치료는 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성이거나 내성일 때 KIF18A 저해제를 포함하는 치료로서 결정된다.
예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체에 대한 치료는 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 둔감성이거나 내성일 때 CDK4/6 저해제를 포함하는 치료로서 결정된다.
KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) 하기 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함한다: (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합. 다양한 경우, 대상체는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 식별된다.
본 개시내용은 추가로 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 대상체는, 시료의 암세포가 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 식별된다.
대상체에서 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 유지시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
더욱이, 대상체에서 KIF18A 저해제를 이용한 치료의 효능을 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 하기 중 하나 이상에 대한 KIF18A 저해제를 이용한 치료의 시작 후 대상체로부터 수득된 시료를 검정하는 단계를 포함한다:
a) p-히스톤 H3의 발현 수준
b) 중심체 특질(중심립 및 PCM 마커는 센트린-1-3, 페리센트린, γ-튜불린을 포함하지만 이로 제한되지 않으며; 반점화 패턴(spotting pattern) 또는 분절화, 극간 거리(pole-to-pole)를 측정함), nsis
c) 염색체 특질(DNA 염료; 유사분열 염색질 치수, 지체(lagging) 염색체/후기 브릿지를 측정함, 미세핵 형성),
d) 방추체 특질(튜불린 마커, 다극성 및 방추체 기하학을 측정함),
e) KIF18A 단백질 국소화(KIF18A 마커; 유사분열에서 KIF18A의 국소화를 측정함),
f) KIF18A 단백질 번역후 변형(웨스턴 분석에 의한 KIF18A 단백질 이중체 검출),
g) 단백질 또는 유전자 발현 조절(예컨대 사이클린 B1, 세큐린(securin), p-히스톤 H3(ser-10), 사이클린 E1, Mcl-1, BubR1, SAC 구성요소, cl-PARP, cl-카스파제-3/-7),
h) 아폽토시스의 마커(예컨대 TUNEL), DNA 손상 및 수선(예컨대 γ-H2AX(Ser-139)).
KIF18A 저해제
본 개시내용은 KIF18A 저해제에 관한 것이다. 용어 "KIF18A 저해제"는 신생물 질환(예를 들어, 암), 염증, 또는 섬모병태(ciliopathology)를 포함한 KIF18A-매개 질병 및/또는 질환을 치료하기 위해 KIF18A 단백질을 단독으로 또는 미세소관(MT)과의 결합된 복합체에서 조절하는 데 유용한 임의의 화합물을 의미한다. 본원에 개시된 KIF18A 저해제 화합물은 MT-기초 KIF18A 조절 활성, 특히 KIF18A 저해 활성을 갖는다. 이를 위해, 본 개시내용은 또한 암을 포함하지만 이로 제한되지 않는 KIF18A 매개 질환 및 장애의 치료적, 예방적, 급성 또는 만성 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제의 제조 및 생산에 있어서 이들 화합물, 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다. 그러므로, 본 개시내용의 화합물은 항암 약제의 제조에 유용하다.
다양한 양태에서, 용어 "KIF18A 저해제"는 KIF18A를 표적화하고 KIF18A 활성을 감소시키거나 저해하는 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다. KIF18A 유전자는 키네신-8 하위계열에 속하고, 양의-말단-방향 운동(plus-end-directed motor)이다. KIF18A는 동원체 미세소관의 양의 말단에서 동역학에 영향을 미쳐, 올바른 염색체 위치화(positioning) 및 방추체 긴장을 제어하는 것으로 여겨진다. 인간 KIF18A의 결핍은 더 긴 방추체, 중기에서 증가된 염색체 진동(chromosome oscillation), 및 HeLa 자궁경부암 세포에서 유사분열 방추사 조립 검문소의 활성화를 유발한다(문헌[MI Mayr et al, Current Biology 17, 488-98, 2007]). KIF18A는 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 방광암, 두부암(head cancer), 경부암(neck cancer), 자궁경부암, 및 난소암을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 유형의 암에서 과발현된다. KIF18A의 과발현은 자매 염색분체 진동을 약화시켜, 밀접한 중기판을 초래한다. KIF18Agcd2/gcd2 마우스(운동 도메인에서의 미스센스 돌연변이(R308K))에서의 돌연변이발생 에틸메타노설포네이트(EMS) 처리에 의한 또는 KIF18A 넉아웃 마우스에서 KIF18A 운동 기능의 비활성화는 명백한 고환 비대 및 불임을 제외하고는 주요 기관에서 어떠한 총체적인 이상(abnormality)도 갖지 않는 생존 가능한(viable) 마우스를 초래한다(문헌[J Stumpff et al Developmental Cell. 2008;14:252-262]; 문헌[J Stumpff et al Developmental Cell. 2012;22:1017-1029]; 문헌[XS Liu et al Genes & Cancer. 2010;1:26-39]; 문헌[CL Fonseca et al J Cell Biol. 2019;1-16]; 문헌[A Czechanski et al Developmental Biology. 2015;402:253-262]. 문헌[O Rath, F Kozielski. Nature Reviews Cancer. 2012;12:527-539]). 정상 인간 및 마우스 KIF18A-결핍 체세포는 상대적으로 정상적인 유사분열 진행과 함께 세포 분열을 완료하는 것으로 나타났으나, 정상적인 핵형을 갖는 딸세포를 초래하는 적절한 염색체 정렬 없이, 유사분열로부터의 출구에서 일부 결함은 더 느린 증식에서 미세핵 형성을 초래하는 정상 세포의 하위세트에서 주목되었다(문헌[CL Fonseca et al J Cell Biol. 2019;1-16]). 이들 유전적 연구는 정상적인 생식세포 및 체세포가 염색체 정렬을 위한 요건에 대해 상이한 의존도를 가짐을 시사하고, KIF18A가 정상적인 정배수성(euploidy) 체세포 분열에 불필요할 수 있음을 나타낸다(문헌[XS Liu et al Genes & Cancer. 2010;1:26-39]; 문헌[A Czechanski et al Developmental Biology. 2015;402:253-262]). 정상적인 인간 조직에서, KIF18A의 발현은 활성적인 주기 세포를 갖는 조직에서 상승되며, 고환에서 최고 발현을 갖는다(문헌[GTEx Portal, GTEx Portal, J Lonsdale et al Nature Genetics. 2013:29;45:580]). 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 ATPase 활성을 저해한다. 예를 들어, KIF18A 저해제는 MT-ATPase 활성을 저해하고, 기저(basal) ATPase 활성을 저해하지 않는다.
KIF18A 저해제에 의해 제공되는 감소 또는 저해는 100% 또는 완전 저해 또는 폐기(abrogation) 또는 감소가 아닐 수 있다. 그보다는, 다양한 정도의 감소 또는 저해가 존재하며, 이 중 하나를 당업자는 잠재적인 이익 또는 치료적 효과가 있다고 인식한다. 이러한 측면에서, KIF18A 저해제는 KIF18A 단백질(들)을 임의의 양 또는 수준까지 저해할 수 있다. 예시적인 구현예에서, KIF18A 저해제에 의해 제공되는 감소 또는 저해는 적어도 또는 약 10% 감소 또는 저해(예를 들어, 적어도 또는 약 20% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 30% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 40% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 50% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 60% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 70% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 80% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 90% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 95% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 98% 감소 또는 저해)이다.
예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 본 방법에 사용될 수 있는 KIF18A 저해제 화합물은 화학식 I의 저분자 화합물 또는 이의 임의의 약학적으로-허용 가능한 염이고:
[화학식 I]
Figure pct00001
;
화학식 I에서,
X1은 N 또는 -CR6이며;
X2는 N 또는 -CR5이고;
X3은 N 또는 -CR3이며;
X4는 N 또는 -CR9이고;
X1, X2, X3 및 X4 중 0, 1, 또는 2개는 N이며;
R1은 -CN, 또는 -Z-R12 기이고, Z는 -C0-4알크-, -NR11-, -NR11SO2-, -SO2NR11-, -NR11-S(=O)(=NH), -S(=O)(=NH)-, -S-, -S(=O)-, -SO2-, C0-4알크-O-, -(C=O)-, -(C=O)NR11-, -C=N(OH)-, 또는 -NR11(C=O)이거나;
-Z-R12 기는 -N=S(=O)-(R12)2이고, 2개의 R12 쌍은 대안적으로 이들 각각에 부착된 황 원자와 조합되어 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 또는 6-원 단환식 고리를 형성할 수 있고;
R2는 할로 또는 -Y-R13 기이고, Y는 -C0-4알크-, -N(C0-1알크)-C0-4알크-, -C(=O)NRaRa(C1-4알크), -O-C0-4알크-, S, S=O, S(=O)2, -SO2NR13, 또는 -S(=O)(=NH)-이며;
R3은 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R4는 H, 할로, R4a 또는 R4b이며;
R5는 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R6은 H, 할로, C1-8알크, C1-4할로알크, -O-C1-8알크, 또는 -O-R6a이고; R6a는 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 또는 6-원 단환식 고리이며;
R7은 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R8은 H, 할로, C1-8알크, C1-4할로알크, -OH, -O-R8a, 또는 -O-R8b이며;
R9는 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
Rx는
Figure pct00002
Figure pct00003
및
Figure pct00004
로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R10a, R10b, R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j는 각각 H, 할로, R10k, 또는 R10l이거나;
대안적으로, R10a와 R10b 쌍, R10c와 R10d 쌍, R10e와 R10f 쌍, R10g와 R10h 쌍, 또는 R10i와 R10j 쌍은 각각 독립적으로 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합될 수 있고, Rx 고리에 대해 스피로(spiro)인 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리를 형성하며; 상기 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리는 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하고, 추가로 상기 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -NRaRa, 또는 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되고;
Ry는 H, C1-4알크, 또는 C1-4할로알크이며;
R11은 H, R11a, 또는 R11b이고;
R12는 H, R12a, 또는 R12b이며;
R13은 R13a 또는 R13b이고;
R4a, R8a, R10k, R11a, R12a, 및 R13a는 독립적으로 각각의 경우, 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된, 부분적으로-포화된 또는 불포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원, 또는 7-원 단환식 또는 4-원, 5-원, 6-원, 7-원, 8-원, 9-원, 10-원, 11-원, 또는 12-원 이환식 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -OC2-6알크NRaRa, -OC2-6알크ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, -NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb, -N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, -NRaC2-6알크NRaRa, -NRaC2-6알크ORa, -C1-6알크NRaRa, -C1-6알크ORa, -C1-6알크N(Ra)C(=O)Rb, -C1-6알크OC(=O)Rb, -C1-6알크C(=O)NRaRa, -C1-6알크C(=O)ORa, R14, 및 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되며;
R4b, R8b, R10l, R11b, R12b, 및 R13b는 독립적으로 각각의 경우, F, Cl, Br, -ORa, -OC1-4할로알크, 또는 CN으로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 기(들)에 의해 치환되는 C1-6알크로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R14는 독립적으로 각각의 경우, 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0 또는 1개의 원자를 함유하는 포화된, 부분적으로-포화된 또는 불포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원, 또는 7-원 단환식 또는 4-원, 5-원, 6-원, 7-원, 8-원, 9-원, 10-원, 11-원, 또는 12-원 이환식 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -OC2-6알크NRaRa, -OC2-6알크ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, -NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb,-N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, -NRaC2-6알크NRaRa, -NRaC2-6알크ORa, -C1-6알크NRaRa, -C1-6알크ORa, -C1-6알크N(Ra)C(=O)Rb, -C1-6알크OC(=O)Rb, -C1-6알크C(=O)NRaRa, -C1-6알크C(=O)ORa, 및 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되며;
Ra는 독립적으로 각각의 경우, H 또는 Rb이고;
Rb는 독립적으로 각각의 경우, C1-6알크, 페닐, 또는 벤질이며, C1-6알크는 할로, -OH, -OC1-4알크, -NH2, -NHC1-4알크, -OC(=O)C1-4알크, 또는 -N(C1-4알크)C1-4알크로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되고; 페닐 또는 벤질은 할로, C1-4알크, C1-3할로알크, -OH, -OC1-4알크, -NH2, -NHC1-4알크, -OC(=O)C1-4알크, 또는 -N(C1-4알크)C1-4알크로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환된다.
화학식 I의 화합물의 제조는 이전에 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 62/783,061호 및 62/783,069호에서 찾을 수 있으며; 이들은 각각 2018년 12월 20일에 출원되었고; 미국 임시 특허 출원 일련 번호 62/882,255 및 62/882,268호에서 찾을 수 있으며; 이들은 각각 2019년 8월 2일에 출원되었다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 0개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 1개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 2개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1 및 X3이 각각 N이며; X2가 -CR5이고; X4가 -CR9이며; 화학식 Ia를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
[화학식 Ia]
Figure pct00005
.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 N이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Ib를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
[화학식 Ib]
Figure pct00006
.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1이 N이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Ic를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
[화학식 Ic]
Figure pct00007
.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Id를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
[화학식 Id]
Figure pct00008
.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -N이고; 화학식 Ie를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
[화학식 Ie]
Figure pct00009
.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 Ry가 H 또는 메틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다. 또 다른 하위구현예에서, Ry는 H이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j가 각각 H, 할로, C1-6알크, 또는 C1-4할로알크이며; R10a와 R10b 쌍이 각각 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합되어 Rx 고리에 대해 스피로인 포화된 3-원, 4-원, 또는 5-원 단환식 고리를 형성하고; 상기 고리가 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j가 각각 H, 메틸, 또는 에틸이며; R10a와 R10b 쌍이 각각 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합되어 Rx 고리에 대해 스피로인 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸 고리를 형성하는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염은
Figure pct00010
기가
Figure pct00011
인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -S(=O)(=NH)-, -NHSO2-, -SO2-, -SO2NH-, 또는 -NH-이고; R12가 사이클로프로필, -CH2CH2-OH, -CH(CH3)CH2-OH, -C(CH3)2CH2-OH, 메틸옥세타닐, 또는 tert-부틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -NHSO2- 또는 -NH-이고; R12가 -CH2CH2-OH, -CH(CH3)CH2-OH, 또는 -C(CH3)2CH2-OH인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -NHSO2-이고; R12가 -CH2CH2-OH인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R2가 -Y-R13 기이며; Y가 -C0-4알크-, -O-C0-4알크-, S, S=O, S(=O)2, 또는 -SO2NH-이고; -R13이 4,4-디플루오로-1-피페리디닐; -CH2CH2-CF3, tert-부틸, 사이클로펜틸, 또는 2-메틸모르폴리닐인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R2가 F, Cl, Br, 메틸, 또는 CF3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되는 피페리디닐 또는 모르폴리닐이거나; R2가 -O-CH2CH2-CF3, -SO2NH-C(CH3)3, 또는 -SO2-사이클로펜틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R2가 -Y-R13 기이며; Y가 -C0-4알크-이고; -R13이 4,4-디플루오로-1-피페리디닐 또는 2-메틸모르폴리닐인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R4가 H 또는 메틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R5가 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R6이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R7이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R8이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 R9가 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 저해제는 상기 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
*실시예 #는 실시예 번호뿐만 아니라 본원에, 예를 들어 실시예에 사용된 KIF18A 저해제 화합물의 약어를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00016
이며; 이는 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-(R-사이클로프로필설폰이미도일)-N-(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-(R-사이클로프로필설폰이미도일)-N-(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00017
이며; 이는 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-(S-사이클로프로필설폰이미도일)-N-(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-(S-사이클로프로필설폰이미도일)-N-(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00018
이며; 이는 4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-N-(6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-N-(6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00019
이며; 이는 N-(6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드이다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00020
이며; 이는 (R)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 (R)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00021
이며; 이는 (S)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 (S)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00022
이며; 이는 N-(3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸페닐)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸페닐)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00023
이며; 이는 N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00024
이며; 이는 4-(N-(tert-부틸)설파모일)-N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 4-(N-(tert-부틸)설파모일)-N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00025
이며; 이는 N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00026
이며; 이는 4-(N-(tert-부틸)설파모일)-N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(3-(사이클로펜틸설포닐)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00027
이고; 이는 (R)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-N-(6-(2-메틸모르폴리노)피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 (R)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-N-(6-(2-메틸모르폴리노)피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00028
이며; 이는 (S)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-N-(6-(2-메틸모르폴리노)피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 (S)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-N-(6-(2-메틸모르폴리노)피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 임의의 하나의 방법을 제공하며, 여기서 KIF18A 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 예컨대 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염이고, 상기 화합물은
Figure pct00029
이며; 이는 N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로 명명된다. 하위구현예에서, 염은 HCl 염이고, 상기 화합물은 N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 하이드로클로라이드로 명명된다.
KIF18A 저해제 화합물은 본 발명의 모든 약학적으로 허용 가능한 동위원소적으로-표지된 화합물을 포함하며, 하나 이상의 원자는 동일한 원자 번호를 갖지만 원자 질량 또는 질량수는 자연상에서 지배적인 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자에 의해 대체되는 것으로 고려된다.
본 발명의 화합물에 포함되기에 적합한 동위원소의 예는 수소의 동위원소, 예컨대 2H 및 3H, 탄소의 동위원소, 예컨대 11C, 13C 및 14C, 염소의 동위원소, 예컨대 38Cl, 불소의 동위원소, 예컨대 18F, 요오드의 동위원소, 예컨대 123I 및 125I, 질소의 동위원소, 예컨대 13N 및 15N, 산소의 동위원소, 예컨대 15O, 17O 및 18O, 인의 동위원소, 예컨대 32P, 및 황의 동위원소, 예컨대 35S를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 소정의 동위원소적으로-표지된 화합물, 예를 들어, 방사성 동위원소를 혼입하는 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 방사성 동위원소 삼중수소(tritium), 즉, 3H, 및 탄소-14, 즉, 14C가 이의 혼입 용이성 및 손쉬운 검출 수단의 측면에서 이러한 목적에 특히 유용하다.
더 무거운 동위원소, 예컨대 이중수소(deuterium), 즉, 2H를 이용한 치환은 더 큰 대사 안정성으로부터 비롯되는 소정의 치료적 이점, 예를 들어 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투약 요건을 제공할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다.
양전자 방출 동위원소, 예컨대 11C, 18F, 15O 및 13N을 이용한 치환은 기질 수용체 점유율을 검사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에 유용할 수 있다.
본 발명의 동위원소적으로-표지된 화합물은 이전에 이용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소적으로-표지된 시약을 사용하여 일반적으로 당업자에게 알려진 종래의 기법에 의해 또는 첨부된 실시예 및 제조에 기재된 것과 유사한 과정에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 용매화물은 결정화 용매가 동위원소적으로 치환될 수 있는 것, 예를 들어 D2O, d6-아세톤, d6-DMSO를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예는 아래 실시예에서 예시된 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 복합체, 용매화물, 다형체, 입체이성질체, 대사산물, 전구약물, 및 이의 다른 유도체를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 하기 정의는 명세서 및 청구범위에서 발견되는 용어에 적용된다:
"Ca-b알크"는 분지형 또는 선형 관계 또는 이들의 임의의 조합에서 최소 a개의 탄소 원자 및 최대 b개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미하며, a 및 b는 정수를 나타낸다. 본 섹션에 기재된 알킬기는 또한 1개 또는 2개의 이중 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. C0알크의 명칭은 직접 결합을 나타낸다. C1-6알킬의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00030
용어 "옥소" 및 "티옥소"는 =O 기(카르보닐에서와 같이) 및 =S 기(티오카르보닐에서와 같이)를 각각 나타낸다.
"할로" 또는 "할로겐"은 F, Cl, Br 및 I로부터 선택되는 할로겐 원자를 의미한다.
"Cα-β할로알크"는 상기 기재된 바와 같은 알크기를 의미하며, 여기서 알크 사슬에 부착된 임의의 수 -적어도 하나-의 수소 원자는 F, Cl, Br 또는 I에 의해 대체된다.
N(Ra)Ra 기 등은 2개의 Ra 기가 함께 선택적으로 N, O 또는 S 원자를 포함하는 고리를 형성하는 치환기를 포함하고, 예컨대 하기 기를 포함한다:
Figure pct00031
α 및 β가 상기 정의된 바와 같은 N(Cα-β알크) Cα-β알크는 2개의 Cα-β알크기가 함께 고리를 형성하고 선택적으로 N, O 또는 S 원자를 포함하는 치환기를 포함하며, 기, 예컨대 하기를 포함한다:
Figure pct00032
"이환식" 구조는 2개의 접합된 고리를 특징으로 하는 기를 의미한다. 이환식 고리는 카르보환식(모든 고리 원자가 탄소임) 또는 헤테로환식(고리 원자가 탄소 원자에 더하여 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 헤테로원자, 예컨대 N, O, 또는 S로 구성됨)일 수 있다. 2개의 고리는 모두 지방족일 수 있거나(예를 들어 데칼린(decalin) 및 노르보르난), 방향족(예를 들어 나프탈렌), 또는 지방족과 방향족의 조합(예를 들어 테트랄린(tetralin))일 수 있다. 이환식 고리는 (a) 스피로환식 화합물을 포함하며, 여기서 2개의 고리는 단지 하나의 단일 원자, 스피로 원자를 공유하며, 이러한 원자는 통상 4차 탄소이다. 스피로환식 화합물의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00033
(b) 이환식 고리는 융합된 이환식 화합물을 포함하며, 여기서 2개의 고리는 2개의 인접한 원자를 공유한다. 다시 말해, 고리는 하나의 공유 결합을 공유하며, 즉, 브릿지헤드(bridgehead) 원자가 직접 연결된다(예를 들어 α-투옌(thujene) 및 데칼린). 융합된 이환식 고리의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00034
; 그리고
(c) 이환식 고리는 브릿지형 이환식 화합물을 포함하며, 여기서 2개의 고리는 적어도 하나의 원자를 함유하는 브릿지에 의해 2개의 브릿지헤드 원자를 분리하는 3개 이상의 원자를 공유한다. 예를 들어, 비사이클로[2.2.1]헵탄으로도 알려진 노르보르난은 각각이 이의 5개의 탄소 원자 중 3개를 공유하는 사이클로펜탄 고리의 쌍인 것으로 생각될 수 있다. 브릿지형 이환식 고리의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00035
또는
Figure pct00036
"카르보사이클" 또는 "카르보환식"은 그 자체를 포함하거나 다른 용어와 조합되어 포함하는 고리를 의미하며, 달리 언급되지 않는 한, "Cα-β알크"의 환식 버전을 나타낸다. 카르보사이클의 예는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로부틸렌, 사이클로헥실렌 등을 포함한다.
"약학적으로-허용 가능한 염"은 종래의 수단에 의해 제조된 염을 의미하고, 당업자에게 잘 알려져 있다. "약물학적으로 허용 가능한 염"은 염산, 하이드로브롬산, 황산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 말산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 말레산, 살리실산, 벤조산, 페닐아세트산, 만델산 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 무기산 및 유기산의 염기성 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 산성 작용기, 예컨대 카르복시기를 포함할 때, 카르복시기에 적합한 약학적으로 허용 가능한 양이온 쌍은 당업자에게 잘 알려져 있고, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 4차 암모늄 양이온 등을 포함한다. "약물학적으로 허용 가능한 염"의 추가 예에 대해, 아래 및 문헌[Berge et. al., J. Pharm. Sci. 66:1(1977)]을 참조한다.
"포화된, 부분적으로-포화된 또는 불포화된"은 수소로 포화된 치환기, 수소로 완전히 불포화된 치환기 및 수소로 부분적으로 포화된 치환기를 포함한다.
본 발명의 화합물이, 호변이성질체 형태, 예컨대 환식 및 비환식(acyclic) 아미딘기 및 구아닌기, 헤테로원자 치환된 헤테로아릴기(Y' = O, S, NR) 등으로 존재할 수 있는 기를 함유할 수 있음을 주목해야 하며, 이는 하기 예에서 예시되고:
Figure pct00037
.
하나의 형태가 본원에서 명명, 기재, 표시 및/또는 청구되더라도, 모든 호변이성질체 형태는 이러한 명칭, 설명, 표시 및/또는 청구범위에 내재적으로 포함되고자 한다.
본 발명의 화합물의 전구약물은 또한 본 발명의 방법에 사용되는 것으로 고려된다. 전구약물은 이러한 전구약물을 환자에게 투여한 후 생체내 생리학적 작용, 예컨대 가수분해, 대사 등을 통해 본 발명의 화합물로 화학적으로 변형되는 활성 또는 비활성 화합물이다. 전구약물을 제조하고 사용하는 데 관여하는 적합성 및 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 에스테르를 수반하는 전구약물의 일반적인 논의에 대해 문헌[Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165(1988)] 및 문헌[Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier(1985)]을 참조한다. 마스킹된 카르복실레이트 음이온의 예는 여러 가지 에스테르, 예컨대 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), 사이클로알킬(예를 들어, 사이클로헥실), 아르알킬(예를 들어, 벤질, p-메톡시벤질), 및 알킬카르보닐옥시알킬(예를 들어, 피발로일옥시메틸)을 포함한다. 아민은 자유(free) 약물 및 포름알데하이드를 생체내에서 방출시키는 에스테라제에 의해 절단되는 아릴카르보닐옥시메틸 치환된 유도체로서 마스킹되었다(문헌[Bungaard J. Med. Chem. 2503(1989)]). 또한, 산성 NH 기, 예컨대 이미다졸, 이미드, 인돌 등을 함유하는 약물은 N-아실옥시메틸기로 마스킹되었다(문헌[Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier(1985)]). 하이드록시기는 에스테르 및 에테르로서 마스킹되었다. EP 039,051(Sloan and Little, 4/11/81)은 만니히-염기 하이드록삼산 전구약물, 이의 제조 및 용도를 개시한다.
명세서 및 청구범위는 언어 "... 및 ...로부터 선택되는" 및 "... 또는 ...이다"(이따금 마쿠시 그룹으로 지칭됨)를 사용하는 종의 목록을 포함한다. 이러한 언어가 본 출원에 사용될 때, 달리 언급되지 않는 한, 이는 기를 전체적으로, 또는 이의 임의의 단일 구성원, 또는 이의 임의의 하위군으로서 포함하는 것으로 의미된다. 이러한 언어의 사용은 단지 축약 목적을 위한 것이고, 필요하다면 개별 요소 또는 하위군의 제거를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 고분자(large molecule) 화합물, 예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단백질이다. 다양한 경우, KIF18A 저해제는 KIF18A를 인코딩하는 핵산을 표적화하고/하거나 이에 결합하는 분자이다. 다양한 양태에서, KIF18A를 인코딩하는 핵산은 인간 KIF18A 유전자 서열(본원에서 SEQ ID NO: 30으로서 제공됨) 또는 인간 KIF18A mRNA 서열(본원에서 SEQ ID NO: 31로서 제공됨)이고, 인코딩된 KIF18A 단백질은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, KIF18A 저해제는 KIF18A를 인코딩하는 핵산, 선택적으로, SEQ ID NO: 30 또는 31을 표적화하고/하거나 이에 결합하는 핵산을 포함한다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 KIF18A를 인코딩하는 핵산(예를 들어, SEQ ID NO: 30 또는 31)의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 선택적으로, KIF18A 저해제는 KIF18A 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 또는 엑손 7의 일부에 결합하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "핵산"이란 "폴리뉴클레오타이드," "올리고뉴클레오타이드," 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 중합체, 또는 이의 변형된 형태를 의미하며, 이는 합성되거나 천연 공급원으로부터 수득되는(예를 들어, 단리되고/되거나 정제되는) 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있으며, 비변형된 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드간 연결부(linkage), 예컨대 포스포로아미데이트 연결부 또는 포스포로티오에이트 연결부를 함유할 수 있다. 다양한 양태에서, 핵산은 KIF18A를 인코딩하는 핵산을 표적화하고/하거나 이에 결합하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 임의의 삽입, 결실, 역전(inversion), 및/또는 치환을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 삽입, 결실, 역전, 및/또는 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 당업계에 알려진 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 리게이션(ligation) 반응에 기초하여 작제된다. 예를 들어, 상기 문헌 Sambrook et. al.; 및 상기 문헌 Ausubel et. al.을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 혼성화 시 형성되는 듀플렉스(예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드)의 물리적 안정성을 증가시키기 위해 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드 또는 천연적으로 발생하는 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실 큐에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부토신(wybutosine), 슈도우라틸(pseudouratil), 큐에우오신(queuosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 개시내용의 핵산 중 하나 이상은 Macromolecular Resources(Fort Collins, CO) 및 Synthegen(Houston, TX)과 같은 회사로부터 구매될 수 있다.
다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 KIF18A의 발현을 감소시킨다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 KIF18A의 발현을 감소시키는 비-코딩 RNA(ncRNA)이다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 KIF18A 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물(예를 들어, KIF18A mRNA, KIF18A 단백질)의 발현을 감소시킨다. KIF18A 저해제에 의해 제공되는 KIF18A 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물(예를 들어, KIF18A mRNA, KIF18A 단백질)의 발현 감소는 100% 또는 완전 감소 또는 저해나 폐기가 아닐 수 있다. 그보다는, 다양한 정도의 감소가 존재하며, 이 중 하나를 당업자는 잠재적인 이익 또는 치료적 효과가 있다고 인식한다. 이러한 측면에서, KIF18A 저해제는 KIF18A 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현을 임의의 양 또는 수준까지 감소시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, KIF18A 저해제에 의해 제공되는 감소는 적어도 또는 약 10% 감소(예를 들어, 적어도 또는 약 20% 감소, 적어도 또는 약 30% 감소, 적어도 또는 약 40% 감소, 적어도 또는 약 50% 감소, 적어도 또는 약 60% 감소, 적어도 또는 약 70% 감소, 적어도 또는 약 80% 감소, 적어도 또는 약 90% 감소, 적어도 또는 약 95% 감소, 적어도 또는 약 98% 감소)이다. 핵산(예를 들어, KIF18A 유전자, KIF18A RNA, 예를 들어, mRNA)의 발현 수준을 결정하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있고, 정량적중합효소 연쇄 반응(qPCR)(예를 들어, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)), RNAseq, 및 노던 블로팅을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유전자 발현을 측정하기 위한 기법은 예를 들어, 유전자 칩의 사용을 수반하거나 수반하지 않는 유전자 발현 검정을 포함하거나, 유전자 발현 마이크로어레이는 문헌[Onken et. al., J Molec Diag 12(4): 461-468(2010)]; 및 문헌[Kirby et. al., Adv Clin Chem 44: 247-292(2007)]에 기재되어 있다. Affymetrix 유전자 칩과 RNA 칩 및 유전자 발현 검정 키트(예를 들어, Applied Biosystems? TaqMan® 유전자 발현 검정)가 또한 ThermoFisher Scientific(Waltham, MA)과 같은 회사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 단백질의 발현 수준을 결정하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있고, 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블로팅, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 면역조직화학 검정 및 면역조직화학 검정) 또는 비드-기초 멀티플렉스 검정, 예를 들어, 문헌[Djoba Siawaya JF, Roberts T, Babb C, Black G, Golakai HJ, Stanley K, et al(2008)], 문헌[An Evaluation of Commercial Fluorescent Bead-Based Luminex Cytokine Assays. PLoS ONE 3(7): e2535]에 기재된 것을 포함한다.
다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 단백질로 번역되지 않는 ncRNA이다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 예를 들어, 약 30개 미만의 뉴클레오타이드를 포함하는 짧은 ncRNA이다. 대안적인 양태에서, KIF18A 저해제는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 예를 들어, 약 200개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는 긴 ncRNA이다. 선택적으로, 짧은 ncRNA는 microRNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 또는 PIWI-상호작용 RNA(piRNA)이다. 다양한 양태에서, ncRNA는 작은 핵소체(small nucleolar) RNA(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 세포외 RNA(exRNA), 또는 작은 카잘체-특이적 RNA(scaRNA)이다. 예를 들어, 문헌[Esteller, Nature Reviews Genetics 12: 861-874(2011)]을 참조한다.
예시적인 경우, KIF18A 저해제는 RNA 간섭(RNAi)을 매개하거나 촉발하는 분자이다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 RNAi 촉발제(촉발제)이다. RNAi는 표적 mRNA가 서열-특이적 방식으로 분해될 수 있는 식물 및 동물에서 유전자 조절의 유비쿼터스 기전(ubiquitous mechanism)이다(문헌[Setten et. al., Nature Reviews Drug Discovery 18: 421-446(2019)]; 문헌[Sharp, Genes Dev., 15, 485-490(2001)]; 문헌[Hutvagner et. al., Curr. Opin. Genet Dev., 12, 225-232(2002)]; 문헌[Fire et. al., Nature, 391, 806-811(1998); Zamore et. al., Cell, 101, 25-33(2000)). RNA 분해 과정은 dsRNA-특이적 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 매개되며, 이러한 다이서는 작은 간섭 RNA(siRNA; 짧은 간섭 RNA로도 알려져 있음)라고 하는 21 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 단편으로의 긴 dsRNA 전구체의 절단을 촉진한다(문헌[Zamore, et. al., Cell. 101, 25-33(2000)]; 문헌[Elbashir et. al., Genes Dev., 15, 188-200(2001)]; 문헌[Hammond et. al., Nature, 404, 293-296(2000)]; 문헌[Bernstein et. al., Nature, 409, 363-366(2001)]). siRNA는 표적 mRNA를 인식하고 절단하는 큰 단백질 복합체 내로 혼입된다(문헌[Nykanen et. al., Cell, 107, 309-321(2001)]). 세포에서 siRNA의 성숙화에서 다이서에 대한 요건은 합성 21-뉴클레오타이드 siRNA 듀플렉스를 도입함으로써 우회될 수 있으며, 이는 여러 가지 포유류 세포에서 형질주입된 그리고 내인성 유전자의 발현을 저해한다(문헌[Elbashir et. al., Nature, 411: 494-498(2001)]).
siRNA는 세포내도입을 통해 세포에 진입하고 세포기질에서 RNAi 효소, 다이서 및 TAR RNA-결합 단백질(TRBP)와 직접 상호작용하여 RISC-로딩 복합체(RLC)를 형성하도록 조작되고/되거나 합성되고 가닥 선택을 겪어서 성숙 RNA-유도 침묵화 복합체(RISC)를 생성할 수 있다. 성숙 RISC는 mRNA 번역을 저해하고, 세포질체(cytoplasmic body) 내로의 mRNA 격리를 유도하고, mRNA 분해를 촉진하고, 전사적 유전자 침묵화를 지시함으로써 유전자 발현을 조절한다. siRNA는 통상 단일 표적 mRNA에 대해 완전한 상보성을 가져서 강력하고 좁게 표적화되는 유전자 침묵화를 유도한다.
예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 RNAi를 매개하고, 다양한 경우 KIF18A 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)의 발현을 저해하는 데 특이적인 siRNA 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "siRNA"는 RNAi를 지시하거나 매개할 수 있는 약 10개 내지 약 50개 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 RNA(또는 RNA 유사체)를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, siRNA 분자는 약 15개 내지 약 30개 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체) 또는 약 18개 내지 약 25개 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체), 예를 들어, 19개 내지 21개 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. siRNA는 이중 또는 단일 가닥일 수 있다.
대안적인 양태에서, KIF18A 저해제는 KIF18A 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)의 발현을 저해하는 데 특이적인 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "shRNA"는 단일-가닥 RNA가 부분적으로 회문형(palindromic) 염기 서열을 함유하고 그 안에서 이중-가닥 구조(즉, 헤어핀 구조)를 형성하는 약 20개 이상 염기쌍의 분자를 지칭한다. shRNA는 헤어핀 구조로 접히는 siRNA(또는 siRNA 유사체)일 수 있다. shRNA는 전형적으로 헤어핀의 대략 21개 뉴클레오타이드 안티센스 및 센스 부분, 약 2개 내지 약 6개 뉴클레오타이드 길이의 비-루프 측면 상에서의 선택적인 오버행(overhang), 및 예를 들어 약 3개 내지 약 10개 뉴클레오타이드 길이일 수 있는 루프 부분을 포함한 약 45개 내지 약 60개 뉴클레오타이드를 포함한다. shRNA는 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, shRNA는 DNA 서열의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 역방향으로 연결하고 DNA를 주형으로서 사용하면서 시험관내에서 T7 RNA 중합효소를 이용하여 RNA를 합성함으로써 생성될 수 있다. 임의의 이론 또는 기전으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, shRNA가 세포 내로 도입된 후, shRNA는 약 20개 염기 이상(예를 들어, 대표적으로 21개, 22개, 23개 염기)의 길이로 분해되고, RNAi를 야기하여 저해 효과를 유발하는 것으로 여겨진다. 그러므로, shRNA는 RNAi를 유도하고, 따라서 개시내용의 효과적인 구성요소로서 사용될 수 있다. shRNA는 바람직하게는 3'-돌출 단부를 가질 수 있다. 이중-가닥 부분의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 약 10개 이상 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 20개 이상 뉴클레오타이드이다. 본원에서, 3'-돌출 단부는 바람직하게는 DNA, 더 바람직하게는 적어도 2개 뉴클레오타이드 길이의 DNA, 더욱 더 바람직하게는 2개 내지 4개 뉴클레오타이드 길이의 DNA일 수 있다.
예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 microRNA(miRNA)이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "microRNA"는 작은(예를 들어, 15개 내지 22개 뉴클레오타이드), 비-코딩 RNA 분자를 지칭하며, 이는 mRNA 분자와 염기쌍을 형성하여 번역 억제 또는 표적 분해를 통해 유전자 발현을 침묵화시킨다. microRNA 및 이의 치료적 잠재력은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Mulligan, MicroRNA: Expression, Detection, and Therapeutic Strategies, Nova Science Publishers, Inc., Hauppauge, NY, 2011]; 문헌[Bader and Lammers, "The Therapeutic Potential of microRNAs" Innovations in Pharmaceutical Technology, pages 52-55(March 2011)]을 참조한다.
다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 RNA 촉발제이며, 이는 전체 길이가 15 내지 30 bp 범위의 완벽하게 염기쌍-형성된 dsRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. 다양한 경우, KIF18A 저해제는 더 큰(21 bp 초과) RNA 복합체이고, 이는 RLC로의 절단 및 핸드오프(handoff)를 위해 RNAi 경로 효소 다이서와 상호작용한다. 대안적인 양태에서, KIF18A 저해제는 더 짧은(21 bp 미만) siRNA 또는 이의 유사체로서, TRBP에 의해 매개되는 상호작용을 통해 다이서 절단을 우회하고 RISC에 진입할 수 있다. 이러한 제2 경로는 다이서의 부재 하에서도 여전히 기능성일 수 있다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 상기 문헌 Setten et. al., 2019에 기재된 바와 같이 ss-siRNA, sshRNA, 소수성적으로-변형된 siRNA, sisiRNA, siRNA(ESC), siRNN, GalXC, DsiRNA, 또는 shRNA이다. KIF18A 유전자의 감소된 발현을 야기하기 위해 또는 KIF18A 유전자 기능의 완전한 무효화, 예를 들어 유전자 넉아웃을 야기하기 위해 게놈 편집을 매개하는 예시적인 KIF18A 저해제가 본원에 기재되어 있다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 SEQ ID NO: 12 내지 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함한다.
약학적 조성물, 투약, 및 투여 경로
다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 약학적 조성물의 일부로서 제공된다. 이에, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 예를 들어, 희석제 또는 담체와 더불어 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 본 개시내용에 의해 제공된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 화합물 및 약학적 조성물은 화합물이 이의 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있는 것을 포함한다. 화합물의 투여는 아래에서 더 상세히 기재된다.
적합한 약학적 제형은 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435-712(18th ed., Mack Publishing Co, Easton, Pennsylvania, 1990)]을 참조한다. 제형은 투여된 제제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 투여 경로에 따라, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관(organ) 크기에 따라 계산될 수 있다. 적절한 치료 용량을 결정하는 데 필요한 계산의 추가 개선은 과도한 실험 없이, 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 검정, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 임상 시험을 통해 수득 가능한 약물동력학 데이터의 측면에서 당업자에 의해 일상적으로 이루어진다.
어구 "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"은 동물 또는 인간에게 투여될 때 유해, 알레르기 또는 다른 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 실체(entity) 및 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한"은 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 성분에 대한 이러한 부형제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 배지 또는 제제가 치료 조성물과 비상용적(incompatible)인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제형은 옥수수 시럽 고체, 고올레산 홍화유, 코코넛유, 대두유, L-류신, 칼슘 포스페이트 3염기성(tribasic), L-티로신, L-프롤린, L-리신 아세테이트, DATEM(유화제), L-글루타민, L-발린, 포타슘 포스페이트 2염기성(dibasic), L-이소류신, L-아르기닌, L-알라닌, 글리신, L-아스파라긴 모노하이드레이트, L-세린, 포타슘 시트레이트, L-트레오닌, 소듐 시트레이트, 마그네슘 클로라이드, L-히스티딘, L-메티오닌, 아스코르브산, 칼슘 카르보네이트, L-글루탐산, L-시스틴 디하이드로클로라이드, L-트립토판, L-아스파르트산, 콜린 클로라이드, 타우린, m-이노시톨, 페러스(ferrous) 설페이트, 아스코르빌 팔미테이트, 아연 설페이트, L-카르니틴, 알파-토코페릴 아세테이트, 소듐 클로라이드, 니아신아미드, 혼합 토코페롤, 칼슘 판토테네이트, 큐프릭(cupric) 설페이트, 티아민 클로라이드 하이드로클로라이드, 비타민 A 팔미테이트, 망간 설페이트, 리보플라빈, 피리독신 하이드로클로라이드, 엽산, 베타-카로텐, 포타슘 요오다이드, 필로퀴논, 비오틴, 소듐 셀레네이트, 크로뮴 클로라이드, 소듐 몰리브데이트, 비타민 D3 및 시아노코발라민을 포함할 수 있다.
화합물은 약학적 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 염으로서 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 염"은 예를 들어 염기 부가염 및 산 부가염을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 금속 또는 아민, 예컨대 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민으로 형성될 수 있다. 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 약학적으로 허용 가능한 양이온으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 양이온은 당업자에게 잘 알려져 있고, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 4차 암모늄 양이온을 포함한다. 카르보네이트 또는 하이드로겐 카르보네이트가 또한 가능하다. 양이온으로서 사용되는 금속의 예는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 등이다. 적합한 아민의 예는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디사이클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 무기 또는 유기 산 염을 포함한다. 적합한 산 염의 예는 하이드로클로라이드, 포르메이트, 아세테이트, 시트레이트, 살리실레이트, 니트레이트, 포스페이트를 포함한다. 다른 적합한 약학적으로 허용 가능한 염은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산, 염산, 하이드로브롬산, 황산 또는 인산과의 염; 유기 카르복실산, 설폰산, 설포산 또는 포스포산 또는 N-치환된 설팜산, 예를 들어 아세트산, 트리플루오로아세트산(TFA), 프로피온산, 글리콜산, 숙신산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 락트산, 옥살산, 글루콘산, 글루카르산, 글루쿠론산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 2-페녹시벤조산, 2-아세톡시벤조산, 엠본산, 니코틴산 또는 이소니코틴산과의 염; 및 아미노산, 예컨대 자연상에서 단백질 합성에 관여하는 20개의 알파 아미노산, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산, 그리고 또한 페닐아세트산, 메탄설폰산(메실레이트), 톨루엔설폰산(토실레이트), 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 에탄 1,2-디설폰산, 벤젠설폰산(베실레이트), 4-메틸벤젠설폰산, 나프탈렌 2-설폰산, 나프탈렌 1,5-디설폰산, 2- 또는 3-포스포글리세레이트, 글루코스 6-포스페이트, N-사이클로헥실설팜산(사이클라메이트의 형성과 함께), 또는 다른 산 유기 화합물, 예컨대 아스코르브산과의 염을 포함한다.
본원에 개시된 화합물을 함유하는 약학적 조성물은 통상적인 방식으로, 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조(dragee-making), 레비게이팅(levigating), 유화, 캡슐화, 포집(entrapping), 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
경구 투여를 위해, 적합한 조성물은 본원에 개시된 화합물을 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 담체와 조합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 이러한 부형제 및 담체는 본 화합물이 치료될 환자에 의한 경구 섭취용 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화되게 할 수 있다. 경구 사용을 위한 약학적 조제물은 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 고체 부형제와 함께 첨가하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 충전제 및 셀룰로스 조제물을 포함한다. 원한다면, 붕해제가 첨가될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 성분은 다양한 유형의 제형에 대해 잘 알려져 있고, 예를 들어 다양한 제형 유형에 대한 결합제(예를 들어, 천연 또는 합성 중합체), 윤활제, 계면활성제, 감미제, 풍미제, 코팅 물질, 보존제, 염료, 증점제, 아쥬반트, 항미생물제, 항산화제 및 담체일 수 있다.
치료적 유효량의 본원에 개시된 화합물이 경구 투여될 때, 조성물은 전형적으로 고체 형태(예를 들어, 정제, 캡슐, 알약, 분말 또는 트로키) 또는 액체 제형(예를 들어, 수성 현탁액, 용액, 엘릭셔 또는 시럽)으로 존재한다.
정제 형태로 투여될 때, 조성물은 기능적 고체 및/또는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 아쥬반트를 추가로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 약 1% 내지 약 95% 화합물, 바람직하게는 약 15% 내지 약 90% 화합물을 함유할 수 있다.
액체 또는 현탁액 형태로 투여될 때, 기능적인 액체 및/또는 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 또는 동물이나 식물 기원의 오일이 첨가될 수 있다. 액체 형태의 조성물은 생리학적 식염수, 당 알코올 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체 또는 현탁액 형태로 투여될 때, 조성물은 약 0.5 내지 약 90 중량%의 본원에 개시된 화합물, 바람직하게는 약 1 내지 약 50 중량%의 본원에 개시된 화합물을 함유할 수 있다. 고려되는 일 구현예에서, 액체 담체는 비-수성 또는 실질적으로 비-수성이다. 액체 형태의 투여를 위해, 조성물은 투여 직전에 용해 또는 현탁을 위한 신속-용해성 고체 제형으로서 공급될 수 있다.
치료적 유효량의 본원에 개시된 화합물이 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여될 때, 조성물은 발열원-무함유의 비경구적으로 허용 가능한 수용액 형태로 존재한다. pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여 이러한 비경구적으로 허용 가능한 용액의 제조는 당업계 내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 조성물은 전형적으로 본원에 개시된 화합물에 더하여 등장성 비히클을 함유한다. 이러한 조성물은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물에서 자유(free) 염기 또는 약물학적으로 허용 가능한 염의 용액으로서 투여되기 위해 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일상적인 조건 하에, 이들 조제물은 선택적으로 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유할 수 있다.
주사 가능한 조성물은 멸균 수용액, 현탁액 또는 분산액, 및 멸균 주사 가능한 용액, 현탁액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 구현예에서, 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사성(syringability)이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균류의 오염 작용을 선택적으로 보존제를 포함함으로써 견뎌야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 고려되는 일 구현예에서, 담체는 비-수성 또는 실질적으로 비-수성이다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 구현예에서 화합물의 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 일어날 수 있다. 많은 구현예에서, 등장성제, 예를 들어 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 위에서 나열된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입하고, 필요하다면 뒤이어 여과된 멸균화를 수행함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은, 염기성 분산 매질 및 위에서 나열된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 구현예에서, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기법이며, 이러한 기법은 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 산출한다.
GI 관 내 체액과 접촉하여 활성 화합물의 제어 방출을 달성하기 위해, 그리고 혈액 혈장 내 활성 화합물의 실질적으로 일정하고 효과적인 수준을 제공하기 위해 서방성(slow release) 또는 지효성(sustained release) 제형이 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 방출은 용해, 확산 및 이온-교환 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다. 이에 더하여, 서방성 접근법은 GI 관 내에서 포화 가능한 경로 또는 제한 경로를 통해 흡수를 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 화합물은 이러한 목적을 위해 분해성 중합체, 수용성 중합체 또는 둘 모두의 혼합물, 및 선택적으로 적합한 계면활성제의 중합체 매트릭스에 포매될 수 있다. 포매는 이러한 맥락에서 중합체 매트릭스에서 미세-입자의 혼입을 의미할 수 있다. 기지의 분산액 또는 에멀젼 코팅 기술을 통한 분산된 미세-입자 또는 유화된 미세-액적의 캡슐화를 통해 제어 방출 제형이 또한 수득된다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 편리하게는 적합한 프로펠런트(propellant)를 사용하여, 가압된 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제시 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 구현예에서, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하도록 제형화될 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 주사에 의한(예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한) 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태로(예를 들어, 앰플에서 또는 다용량 용기에서) 제시될 수 있다. 조성물은 이러한 형태를 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제, 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학적 제형은 수용성 형태 중 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일 또는 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 성분을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 화합물의 용해도를 증가시키고 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 조성물은 사용 전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균 발열원-무함유 물)과의 구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 또한 직장 조성물, 예컨대 좌제 또는 체류 관장물(예를 들어, 종래의 좌제 베이스를 함유함)로 제형화될 수 있다. 이전에 기재된 제형에 더하여, 화합물은 또한 데폿(depot) 조제물로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기-작용성 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화되거나, 희박하게 가용성인 유도체로서, 예를 들어 희박하게 가용성인 염으로서 제형화될 수 있다.
특히, 본원에 개시된 화합물은 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스를 함유하는 정제의 형태로, 또는 캡슐이나 오뷸(ovule)에서, 단독으로 또는 부형제와의 혼합물로서, 또는 풍미제 또는 착색제를 함유하는 현탁액 또는 엘릭셔의 형태로 경구, 협측, 또는 설하 투여될 수 있다. 이러한 액체 조제물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예컨대 현탁화제와 함께 제조될 수 있다. 화합물은 또한 비경구, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 또는 관상동맥내 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 화합물은 최상으로는, 혈액과 등장성인 용액을 만들기 위해 다른 성분, 예를 들어 염 또는 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 사용된다.
수의학적 사용을 위해, 본원에 개시된 화합물은 정상적인 수의학 관행에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여된다. 수의학자는 특정 동물에게 가장 적합한 투약 요법 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 단독으로 또는 KIF18A-관련 장애의 치료를 위해 통상적으로 사용되는 또 다른 제제 또는 개입과 조합하여 사용하는 이러한 질환의 치료를 위한 모든 필요한 구성요소는 키트 내로 포장될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 본원에 개시된 화합물뿐만 아니라 전달 가능한 형태의 약제를 제조하기 위한 완충액 및 다른 구성요소를 포함하는 상기 약제의 포장된 세트, 및/또는 이러한 약제를 전달하기 위한 장치, 및/또는 본원에 개시된 화합물을 이용한 병용 치료법에 사용되는 임의의 제제, 및/또는 약제와 함께 포장되는 질환의 치료에 대한 설명서를 포함하는 질환의 치료적 개입에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 설명서는 임의의 유형 매체, 예컨대 인쇄지, 또는 컴퓨터 판독 가능한 자기 또는 광학 매체, 또는 원격 컴퓨터 데이터 공급원, 예컨대 인터넷을 통해 접근 가능한 월드 와이드 웹 페이지를 참조하는 설명서로 고정될 수 있다.
"치료적 유효량"은 치료받는 대상체를 치료하거나 이의 발병을 예방하거나, 이의 기존의 증상을 경감시키기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용의 측면에서 당업자의 능력 내에 잘 있다. 일반적으로, "치료적 유효 용량"은 원하는 효과를 달성하는 것을 초래하는 화합물의 해당 양을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, 치료적 유효량의 본원에 개시된 화합물은 KIF18A 활성을 대조군과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%만큼 저하시킨다.
투여되는 화합물의 양은 치료받는 대상체, 대상체의 연령, 건강, 성별 및 체중, 동반 치료(있다면)의 종류, 병의 중증도, 원하는 효과의 성질, 치료의 방식과 빈도, 및 처방의의 판단에 의존할 수 있다. 투약 빈도는 또한 동맥 산소압에 미치는 약동학적 효과에 의존할 수 있다. 개별적인 필요성이 다양한 한편, 화합물의 유효량의 최적 범위의 결정은 당업계의 숙련 내에 있다. 이러한 용량은 단일 용량으로 투여될 수 있거나 이는 다중 용량으로 나뉠 수 있다.
비활성화된 유전자, 증폭된 유전자, 및 발현 수준에 대한 검정
본 개시내용의 다양한 구현예에서, 방법은 시료를 비활성화된 유전자(예를 들어, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 및/또는 비활성화된 BRCA)에 대해 검정하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자의 맥락에서 용어 "비활성화된"은 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 감소 또는 소실을 지칭한다. 유전자의 비활성화는 하나 이상의 기지의 기전에 의해 야기될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 비활성화는 상응하는 야생형 유전자, RNA, 또는 단백질에 비해 DNA 서열, RNA 서열 또는 단백질 서열에서의 변이(예를 들어 이의 소실을 포함함)에 의해 야기될 수 있거나, 유전자의 DNA 서열에 임의의 변경을 수반하지 않는 후성적 변이에 의해 야기될 수 있다.
다양한 양태에서, 검정 단계는 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물에서 변이 또는 이형(anomaly)의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 변이 또는 이형은 상응하는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물에 비한 것이고, 변이의 존재는 유전자의 침묵화, 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 발현의 감소 또는 소실, 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 감소 또는 소실, 또는 이들의 조합을 유발하거나 이와 관련이 있다. 다양한 경우, 유전자 생성물은 RNA 전사물 또는 단백질이다. 다양한 경우, 변이는 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 적어도 감소 또는 소실을 유발한다. 다양한 경우, 변이는 TP53 유전자 또는 TP53 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 적어도 감소 또는 소실을 유발한다. 다양한 경우, 변이는 Rb1 유전자 또는 Rb1 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 적어도 감소 또는 소실을 유발한다. 다양한 경우, 변이는 BRCA 유전자 또는 BRCA 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 기능의 적어도 감소 또는 소실을 유발한다.
유전자에서의 변이는 유전자 내 임의의 장소에서, 예를 들어 인트론 또는 엑손 내에서, 5'-비번역 영역(5'-UTR), 또는 3'-비번역 영역(3'-UTR) 내에서 존재할 수 있다. 변이는 유전자에 의해 인코딩된 전사물(예를 들어, RNA 전사물, 1차 전사물, pre-mRNA, mRNA)의 임의의 부분 내에서 또는 부분에서 존재할 수 있거나, 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 임의의 부분 내에서 또는 부분에서 존재할 수 있다.
다양한 양태에서, 변이는 DNA 서열, RNA 서열 또는 단백질 서열에서 상응하는 야생형 유전자, RNA, 또는 단백질에 관한 차이이다. 다양한 양태에서, 시료는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 분석하거나, 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 분석하거나, 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 분석하고 시료의 유전자의 서열을 유전자, RNA, 또는 단백질의 상응하는 야생형 인간 서열과 비교함으로써 비활성화된 유전자에 대해 검정된다. 예시적인 양태에서, 변이는 DNA 서열 또는 RNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 또는 치환, 단백질 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 또는 치환을 상응하는 야생형 유전자, RNA, 또는 단백질에 비해 포함한다. 예시적인 양태에서, 변이는 DNA, RNA, 또는 단백질의 유전자 사본 수 획득 또는 증폭을 초래할 수 있는 DNA 서열 또는 RNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 또는 치환, 단백질 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 또는 치환을 상응하는 야생형 유전자, RNA, 또는 단백질에 비해 포함한다. 다양한 양태에서, 검정은 유전자에서 유전자 돌연변이의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 검정은 유전자에서 유전자 돌연변이의 존재 또는 유전자에서 뉴클레오타이드의 소실을 검출하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 유전자 돌연변이는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 삽입, 결실, 복제, 프레임 이동 돌연변이, 절두, 또는 반복 확장이다. 다양한 경우, 비활성화된 TP53 유전자는 돌연변이, 결실, 또는 절두를 포함하고/하거나, 비활성화된 Rb1 유전자는 돌연변이, 결실, 또는 절두를 포함하고/하거나, 비활성화된 BRCA 유전자는 돌연변이, 결실, 또는 절두를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "BRCA 유전자"는 BRCA1 또는 BRCA2 유전자를 지칭한다. 예시적인 경우, BRCA 유전자는 BRCA1이다. 예시적인 양태에서, BRCA 유전자는 BRCA2이다.
다양한 경우, 변이는 후성적이고, 유전자의 DNA 서열에서 임의의 변경을 수반하지 않는다. 예시적인 양태에서, 비활성화된 유전자는 후성적으로 침묵화되고, 선택적으로 DNA 또는 히스톤 단백질의 공유 변형을 수반한다. DNA의 공유 변형은 예를 들어, 시토신 메틸화 또는 하이드록시메틸화일 수 있다. 히스톤 단백질의 공유 변형은 예를 들어, 리신 아세틸화, 리신 또는 아르기닌 메틸화, 세린 또는 트레오닌 인산화, 또는 리신 유비퀴틴화 또는 수모화(sumoylation)일 수 있다. 유전자 침묵화에 대한 기전은 전사 또는 번역 동안 발생할 수 있다. 유전자 침묵화의 예시적인 기전은 DNA 메틸화, 히스톤 변형, 및 RNA 간섭(RNAi)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 다양한 양태에서, 비활성화된 유전자는 후성적으로 침묵화된 프로모터를 갖는 후성적으로 침묵화된 유전자이다. 선택적으로, 비활성화된 TP53 유전자는 후성적으로 침묵화된 TP53 프로모터를 갖거나, 비활성화된 Rb1 유전자는 후성적으로 침묵화된 Rb1 프로모터를 갖거나, 비활성화된 BRCA 유전자는 후성적으로 침묵화된 BRCA 프로모터를 갖는다. 후성적 침묵화를 검정하기에 적합한 기법은 염색질 면역침전(ChIP-on chip, ChIP-Seq) 형광 제자리 혼성화(FISH), 메틸화-민감성 제한 효소, DNA 아데닌 메틸트랜스퍼라제 식별(DamID) 및 비설파이트(bisulfite) 시퀀싱을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Verma et. al., Cancer Epidemiology, Biomarkers, and Prevention 23: 223-233(2014)]을 참조한다.
다양한 양태에서, 비활성화된 유전자는 바이러스-유도 유전자 침묵화(VIGS)에 의해 비활성화된다. 다양한 경우, 비활성화된 TP53 유전자는 바이러스 단백질, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV) E6 단백질에 의해 비활성화된다. 선택적으로, HPV E6 단백질은 TP53 유전자에 의해 인코딩된 p53 단백질과 상호작용하고 p53 단백질을 비활성으로 만든다. 다양한 경우, 비활성화된 Rb1 유전자는 바이러스 단백질, 예를 들어, HPV E7 단백질에 의해 비활성화된다. 선택적으로, HPV E7 단백질은 Rb1 유전자에 의해 인코딩된 Rb 단백질과 상호작용하고 Rb 단백질을 비활성으로 만든다. 이러한 침묵화 방식은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Jiang and Milner, Oncogene 21: 6041-6048(2002)]를 참조한다.
본 개시내용의 다양한 구현예에서, 방법은 유전자 증폭, 예를 들어, CCNE1 증폭, 또는 유전자의 사본 수의 증가, 예를 들어 유전자의 유전자 사본 수 획득에 대해 시료를 검정하는 단계를 포함한다. 다양한 경우, 시료는 획득 또는 증폭된 유전자에 대해 DNA-기초 또는 RNA-기초 기법(유전자 발현 분석[비교 게놈 혼성화, RNA-기초 혼성화], NGS, PCR, 또는 서던 블롯)에 의해 또는 분자 세포유전자 기법(유전자-특이적 프로브를 이용하는 FISH2, CISH(발색단 제자리 혼성화))에 의해 검정된다. 다양한 양태에서, 경쟁적 또는 정량적 PCR, cDNA 마이크로어레이에 대한 게놈 혼성화, RNA에 대한 유전자의 혼성화 및 정량화가 수행되어 유전자 증폭 또는 유전자 사본 수 획득을 검출한다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Stewart, Genome Res 3: 163-168(1993); Heiskanen et. al., Cancer Res 60(4): 799-802(2000)]을 참조한다. 다양한 경우, 방법은 MDM2 유전자의 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및/또는 FBXW7 유전자의 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 또는 돌연변이에 대해 시료를 검정하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 MDM2 유전자의 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및 p53 단백질 수준의 감소에 대해 시료를 검정하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 FBXW7 유전자에서의 돌연변이 및 CCNE1 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 과발현에 대해 시료를 검정하는 단계를 포함한다. 유전자 영역이 시퀀싱되고 시퀀싱 판독물이 다른 유전자와 비교되어 관심 유전자의 획득 또는 소실을 추론하는 차세대 시퀀싱(NGS)이 또한, 유전자 사본 수 획득이나 소실 또는 유전자 증폭을 검출하는 방법으로서 이용될 수 있다.
예시적인 양태에서, 비활성화된 TP53 유전자는 (i) TP53 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 TP53 프로모터를 포함하거나, (ii) 바이러스 단백질에 의해 또는 MDM2 유전자의 유전자 증폭을 통해 비활성화되거나, (iii) 이들의 조합이다. 선택적으로, 바이러스 단백질은 인간 유두종 바이러스(HPV) E6 단백질이다. 예시적인 양태에서, 비활성화된 Rb1 유전자는 (i) Rb1 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 Rb1 프로모터를 포함하거나, (ii) 바이러스 단백질에 의해 비활성화되거나, (iii) 이들의 조합이다. 선택적으로, 바이러스 단백질은 인간 유두종 바이러스(HPV) E7 단백질이다. 예시적인 양태에서, 비활성화된 BRCA 유전자는 (i) RCA 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 BRCA 프로모터를 포함한다. 선택적으로, BRCA 유전자는 BRCA1 유전자이다. 대안적으로, BRCA 유전자는 BRCA2 유전자이다.
다양한 양태에서, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, CCNE1 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및/또는 비활성화된 BRCA 유전자는 신생물 질환(예를 들어, 암)의 생식세포계 세포에 존재한다. 다양한 양태에서, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, CCNE1 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및/또는 비활성화된 BRCA 유전자는 신생물 질환(예를 들어, 암)의 생식세포계 세포에 존재하고 신생물 질환(예를 들어, 암)의 체세포에 부재한다. 선택적으로, 신생물 질환의 체세포 돌연변이로 인해, 신생물 질환의 체세포는 야생형 유전자형으로 다시 되돌아갔고, 따라서 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, CCNE1 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및/또는 비활성화된 BRCA 유전자를 나타내지 않지만, 신생물 질환의 생식세포계 세포는 여전히 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, CCNE1 유전자 사본 수 획득 또는 증폭 및/또는 비활성화된 BRCA 유전자를 실증한다. 예를 들어, 신생물 질환은 PARP 저해제-내성 암일 수 있고, 암의 생식세포계 세포만 비활성화된 BRCA1 유전자를 갖는 반면, 암의 체세포는 복구된 BRCA1 코딩 영역 및 기능을 나타낸다.
예시적인 경우, 검정 단계는 비활성화된 또는 증폭된 유전자 또는 유전자 사본 수 획득, 예를 들어, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 비활성화된 BRCA 유전자의 존재를 검출하기 위한 세포유전학 방법 및/또는 분자 방법을 포함한다. 예시적인 양태에서, 검정 단계는 직접 DNA 시퀀싱, DNA 혼성화 및/또는 제한 효소 분해를 포함한다. 선택적으로, 세포유전학 방법은 핵형분석(karyotyping), 형광 제자리 혼성화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 경우, 분자 방법은 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 멀티플렉스 리게이션 의존적 프로브 증폭(MLPA), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE), 단일 가닥 입체형태 다형성(SSCP), 헤테로듀플렉스 분석, 미스매치의 화학적 절단(CCM), 단백질 절두 시험(PTT), 올리고뉴클레오타이드 리게이션 검정(OLA), 또는 이들의 조합을 포함한다. 선택적으로, PCR은 멀티플렉스 PCR, 네스티드 PCR, RT-PCR, 또는 실시간 정량적 PCR이다. 다양한 양태에서, 검정 단계는 TP53 유전자, Rb1 유전자, CCNE1 유전자, 및/또는 BRCA 유전자에 의해 인코딩된 RNA 또는 단백질의 발현 수준을 검정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 검정 단계는 ARMS, FISH, IHC, 또는 NGS를 포함한다. 이러한 기법은 문헌[Su et al., J Experimental Clin Cancer Research 36: 121(2017)] 및 문헌[He et al., Blood 127(24): 3004-3014(2016)]에 기재되어 있다. 다양한 경우, 검정 단계는 전체-엑솜 시퀀싱 또는 전체 게놈 시퀀싱을 포함한다. 예시적인 양태에서, 검정은 액체 생검을 포함한다. 액체 생검은 당업계에 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Poulet et al., Acta Cytol 63(6): 449-455(2019)], 문헌[Chen and Zhao, Hum Genomes 13(1): 34(2019)]를 참조한다.
다양한 양태에서, 유전자 사본 수 획득 또는 증폭은 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물(예를 들어, RNA 및/또는 단백질)의 과발현된 또는 증가된 수준을 유발한다. RNA 및/또는 단백질에서 증가된 수준을 검출하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예시적인 양태에서, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득 또는 증폭은 CCNE1 유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 과발현된 또는 증가된 수준을 유발한다. 예시적인 양태에서, CCNE1 유전자 생성물의 과발현은 FBXW7 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 다양한 양태에서, 시료는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현 및 FBXW7 유전자에서의 돌연변이에 대해 양성이다.
다양한 경우, 본 개시내용의 방법은 대상체로부터 수득된 시료(예를 들어, 조직 또는 혈액을 포함하는 시료)에서 RNA 전사물, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 또는 단백질을 통해 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 본 개시된 방법의 예시적인 양태에서, 방법은 TP53, Rb1, BRCA, CCNE1, 또는 유전자에 의해 인코딩된 임의의 유전자 생성물, 또는 이들의 임의의 조합의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 핵산(예를 들어, 유전자, RNA, mRNA)의 발현 수준을 결정하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있고, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)(예를 들어, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)), RNAseq, Nanostring, 및 노던 블로팅을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유전자 발현을 측정하기 위한 기법은 또한 예를 들어, 유전자 칩의 사용을 갖거나 갖지 않는 유전자 발현 검정을 포함하거나 유전자 발현 마이크로어레이는 문헌[Onken et. al., J Molec Diag 12(4): 461-468(2010)]; 및 문헌[Kirby et. al., Adv Clin Chem 44: 247-292(2007)]에 기재되어 있다. Affymetrix 유전자 칩 및 RNA 칩 및 유전자 발현 검정 키트(예를 들어, Applied Biosystems? TaqMan® 유전자 발현 검정)가 또한 예컨대 ThermoFisher Scientific(Waltham, MA), 및 Nanostring(문헌[Geiss et. al., Nature Biotechnology 26: 317-325(2008)])과 같은 회사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 단백질의 발현 수준을 결정하기 위한 적합한 방법은 당업계에 알려져 있고, 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블로팅, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 및 면역조직화학 검정) 또는 비드-기초 멀티플렉스 검정, 예를 들어, 문헌[Djoba Siawaya JF, Roberts T, Babb C, Black G, Golakai HJ, Stanley K, et al.(2008) An Evaluation of Commercial Fluorescent Bead-Based Luminex Cytokine Assays. PLoS ONE 3(7): e2535]에 기재된 것을 포함한다. 특정 생물학적 시스템의 단백질의 시스템적 식별 및 정량화인 프로테오믹(proteomic) 분석이 알려져 있다. 질량 분광법이 전형적으로 이러한 목적에 사용되는 기법이다.
예시적인 양태에서, 방법은 상기 유전자에 의해 인코딩된 RNA에 기초한 상보적 DNA(cDNA)의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 간략하게는, 방법은 시료로부터(예를 들어 시료의 종양 세포(들)로부터) RNA를 추출하거나 단리하는 단계 및 시료로부터 단리된 RNA에 기초하여 cDNA를 합성하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 양태에서, 발현 수준을 측정하는 단계는 시료로부터 RNA를 단리하는 단계, RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 생성하는 단계, cDNA를 증폭시키는 단계 및 cDNA를 유전자 발현 마이크로어레이에 혼성화하는 단계를 포함한다. 이에, 일부 양태에서, 발현 수준을 측정하는 단계는 시료로부터 RNA를 단리하는 단계 및 RNA를 RNA-Seq에 의해 정량화하는 단계를 포함한다. 대안적인 또는 추가의 양태에서, 발현 수준은 면역조직화학 검정을 통해 결정된다. 예시적인 양태에서, 발현 수준을 측정하는 단계는 시료를 TP53, Rb1, BRCA, 또는 CCNE1, 또는 이의 유전자 생성물, 또는 이들의 조합에 대한 결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 결합제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 양태에서, 결합제는 TP53, Rb1, BRCA, 또는 CCNE1, 또는 이의 RNA 전사물, 또는 이의 보체에 특이적인 핵산 프로브이다.
일단 TP53, Rb1, BRCA, 또는 CCNE1, 또는 이의 유전자 생성물의 발현 수준이 대상체로부터 수득된 시료로부터 측정되면, 측정된 발현 수준은 기준 수준과 비교되고, 하우스키핑 유전자로 정규화되고, 수학적으로 변환될 수 있다. 예시적인 경우, TP53, Rb1, BRCA, 또는 CCNE1, 또는 이의 유전자 생성물의 측정된 발현 수준은 센터링되고 스케일링된다. 생물학적 데이터를 센터링하고 스케일링하는 적합한 기법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[van den Berg et. al., BMC Genomes 7: 142(2006)]을 참조한다.
야생형 TP53, Rb1, CCNE1, 및 BRCA 유전자, 뿐만 아니라 이들 유전자에 의해 인코딩된 RNA 및 단백질은 당업계에 알려져 있다. 각각의 예시적인 서열은 미국 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)에 대한 웹사이트에서 입수 가능하고 여기에 제출된 서열 목록에 제공된다.
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예시적인 구현예에서, 방법은 표 A에 나열되지 않은 추가의 유전자, RNA, 및/또는 단백질을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 적어도 하나 추가의 유전자, RNA, 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 방법은 시료에서 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 추가의 유전자, 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 추가의 RNA, 및/또는 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 추가의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 방법은 시료에서 적어도 10, 15, 20개 이상의 추가의 유전자, 적어도 10, 15, 20개 이상의 추가의 RNA, 및/또는 적어도 10, 15, 20개 이상의 추가의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 방법은 시료에서 적어도 50, 100, 200개 이상의 추가의 유전자, 적어도 50, 100, 200개 이상의 추가의 RNA, 및/또는 적어도 50, 100, 200개 이상의 추가의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 방법은 표 A에 나열된 하나 이상에 더하여 복수의 상이한 유전자, 복수의 RNA, 및/또는 복수의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 BRCA1, BRCA2, ATM, ATRX, BARD1, BLM, BRIP1, CDK12, CHEK1, CHEK2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCI, FANCL, FANCM, MRE11, NBN, PALB2, RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, RAD54L, 및 RPA1을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 상동성 재조합 결핍(HRD) 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함한다(문헌[DR Hodgson et al British Journal of Cancer. 2018;119:1401-9]; 문헌[AL Heeke et al JCO Precis Oncol. 2018;2:1-3]). 예시적인 양태에서, 방법은 하나 이상의 키네신 유전자, ABC 수송 유전자, SAC 유전자, 동원체 유전자, EMT 유전자, PAM50 시그너처(문헌[B Wallden et al BMC Medical Genomics. 2015;8(1):54]), CIN25/70 유전자 시그너처의 유전자(문헌[SL Carter et al Nature Genetics. 2006;38(9):1043-8]), 또는 이들의 조합의 발현을 측정하는 단계를 포함한다.
검정 단계는 시료가 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 "양성" 또는 "음성"으로 식별되게 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 시료의 맥락에서 용어 "양성"은 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나가 시료에 존재함을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 시료의 맥락에서 용어 "음성"은 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나가 시료에 부재하며, 예를 들어, 시료가 비활성화된 TP53 유전자를 갖지 않고/않거나 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나가 시료에 존재함을 의미한다.
반응성, 민감성 및 내성
본 개시내용은 약물, 예를 들어, KIF18A 저해제, CDK4/6 저해제에 대한 반응성, 민감성 및/또는 내성에 관한 것이다. 본 개시내용은 신생물 질환을 갖는 대상체를 본원에 제공된 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성이거나 반응성인 것으로 식별하는 방법을 제공한다. KIF18A 저해제에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계 또는 CDK4/6 저해제에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함하는, 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법이 본원에 개시된다. 본 개시내용은 또한 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성인 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "민감성"은 신생물 질환(예를 들어, 암, 종양)이 약물/화합물, 예를 들어, KIF18A 저해제, CDK4/6 저해제에 반응하는 방식을 지칭한다. 예시적인 양태에서, "민감성"은 "치료에 대해 반응성"임을 의미하고, "민감성" 및 "반응성"의 개념은, 약물/화합물 치료에 대해 반응성인 신생물 질환(예를 들어, 종양 또는 암 세포)이 해당 약물에 대해 민감성이라고 한다는 점에서 양의 관계에 있다. 예시적인 경우 "민감성"은 문헌[Pelikan, Edward, Glossary of Terms and Symbols used in Pharmacology(Boston University School of Medicine의 Pharmacology and Experimental Therapeutics Department Glossary)]에 따라 다른 사람의 능력에 비해 특정 약물 용량에 정성적으로 정상적인 방식으로 반응하는 집단, 개체 또는 조직의 능력으로서 정의된다. 효과를 발휘하는 데 필요한 용량이 적을수록, 반응 시스템은 더 민감성이다. "민감성"은 가로좌표 값의 축 또는 이에 평행한 선과 함께 용량-효과 곡선의 교차점의 측면에서 정량적으로 측정되거나 기재될 수 있으며; 이러한 점은 주어진 효과 정도를 발휘하는 데 딱 필요한 용량에 상응한다. 이와 유사하게, 측정 시스템의 "민감성"은 주어진 정도의 출력값(효과)을 발휘하는 데 필요한 최저 입력값(최소 용량)으로서 정의된다. 예시적인 양태에서, "민감성"은 "내성"과 반대되고, "내성"의 개념은 "민감성"과 음의 관계에 있다. 예를 들어, 약물 치료에 내성인 종양은 해당 약물에 대해 민감성이 아니거나 반응성이지 않거나, 초기에는 약물에 대해 민감성이었고 내성의 획득 시 더 이상 민감성이지 않으며; 해당 약물은 해당 종양 또는 암 세포에 대한 효과적인 치료가 아니다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "반응성"은 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST) 또는 다른 유사한 기준에 따라 약물/화합물(예를 들어, KIF18A 저해제, CDK4/6 저해제) 또는 다른 치료(예를 들어, 방사선 치료법)에 대한 암세포 또는 종양의 치료적 반응 또는 반응성의 정도를 지칭한다. RECIST는 미국 국립 암 연구소, 캐나다 국립 암 연구소 임상 시험 그룹 및 유럽 암 연구 및 치료 기구가 공동으로 만든 종양 및/또는 암세포의 진행, 안정화 또는 반응성을 평가하기 위한 기준 세트이다. RECIST에 따르면, 특정 종양은 약물(예를 들어 CDK4/6 억제제)로 치료한 후 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해 평가(예를 들어 임상 시험) 초기에 측정된다. 종양에 대한 반응 평가 및 평가 기준은 문헌[Eisenhauer et. al., Eur J Cancer 45:228-247(2009)] 및 문헌[Liti
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re et. al., Journal of Clinical Oncology 37(13): 1102-1110(2019) DOI: 10.1200/JCO.18.01100]에 공개되어 있다. 간략하게는, 상기 문헌 Eisenhauer et. al., 2009의 섹션 4.3은 하기와 같이 표적 병변에 대한 객관적인 종양 반응을 결정하는 데 사용되는 반응 기준을 교시한다:
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이상적인 경우, 약물 또는 다른 치료는 반응의 지속되는 기간(DOR)과 함께 최상의 전체 반응으로서 CR 또는 PR을 초래한다. 일부 양태에서, PD 또는 짧은 DOR을 갖는 SD의 반응은 약물이 암에 대한 효과적인 치료가 아니거나 종양이 치료에 반응하여 중단되었음을 보여주는 데 사용된다.
예시적인 양태에서, 반응성은 최상의 전체 반응이 16주 초과 및 24주의 안정 질환(SD), 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)으로서 결정되는 환자의 비율로서 정의되는 임상 이익률(CBR: clinical benefit rate)을 설명하거나 이에 기초한다. 선택적으로, CBR은 최상의 전체 반응이 16주 초과 및 24주의 안정 질환(SD), 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)으로서 결정되는 환자의 비율에 관한 것이며, 상기 환자는 불응성 또는 재발성 유방암 또는 난소암을 갖는다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이러한 종양 또는 암 세포는 치료에 대한 민감성을 상실한 것 및/또는 치료에 대해 내성으로 된 것으로서 이해된다.
신생물 질환을 갖는 대상체를 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성 또는 반응성으로서 식별하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하며, 상기 대상체는 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 식별된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 CDK4/6을 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 민감성이지 않을 때, 신생물 질환은 KIF18A 저해제에 대해 민감성인 것으로 여겨진다. 다양한 양태에서, 신생물 질환을 갖는 대상체를 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성이거나 반응성인 것으로 식별하는 방법이 제공된다. 예시적인 양태에서, 방법은 KIA18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 민감성이지 않을 때, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제에 대해 민감성인 것으로 여겨진다. 다양한 양태에서, 대상체를 KIA18A 저해제를 이용한 치료 시 완전 반응을 달성하는 가능성이 있는 것으로 식별하는 방법이 제공된다. 다양한 양태에서, 대상체를 KIA18A 저해제를 이용한 치료 시 적어도 부분 반응을 달성하는 가능성이 있는 것으로 식별하는 방법이 제공된다. 다양한 양태에서, 대상체를 KIA18A 저해제를 이용한 치료 시 안정 질환 또는 진행성 질환을 나타내지 않는 가능성이 있는 것으로 식별하는 방법이 제공된다.
임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 예시적인 구현예에서, CDK4/6 저해제에 대해 민감성 또는 반응성인 신생물 질환은 KIF18A 저해제에 대해 민감성 또는 반응성이지 않고 KIF18A 저해제에 대해 민감성 또는 반응성인 신생물 질환은 CDK4/6 저해제에 대해 민감성 또는 반응성이지 않다. 그러므로, 본 개시내용은 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법을 제공하며, KIF18A 저해제 또는 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성일 때, 대상체에 대한 치료는 KIF18A 저해제를 포함하는 치료로서 결정되고, 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 둔감성일 때, 대상체에 대한 치료는 CDK4/6 저해제를 포함하는 치료로서 결정된다. 이에, 본 개시내용은 KIF18A 저해제를 투여하여 환자를 치료하는 단계를 포함하는, CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성인 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법, 및 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료된 적이 있는 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 선택적으로 KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제와 공동-투여된다. 또한, 본 개시내용은 CDK4/6 저해제를 투여하여 환자를 치료하는 단계를 포함하는, KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 내성인 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법, 및 CDK4/6 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, KIF18A 저해제로 치료되거나 치료된 적이 있는 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 선택적으로 CDK4/6 저해제는 KIF18A 저해제와 공동-투여된다. CDK4/6 저해제와 KIF18A 저해제를 포함하는 약학적 조합이 제공된다.
본 개시된 방법의 다양한 경우, 방법은 CDK4/6 저해제에 대한 민감성을 결정하거나 KIF18A 저해제에 대한 민감성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 경우, 방법은 CDK4/6 저해제에 대한 민감성을 검정하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 민감성의 검정은 가로좌표 값의 축 또는 이에 평행한 선과 함께 용량-효과 곡선의 교차점의 측면에서 정량적으로 측정하거나 기재하는 단계를 포함하며; 이러한 점은 주어진 효과 정도를 발휘하는 데 딱 필요한 용량에 상응한다. 다양한 양태에서, 민감성의 검정은 핵 카운트 검정, 중심체 카운트 검정, 성장 검정, 및/또는 종양 퇴화 검정, 예컨대 본원에 기재된 것 중 하나 이상을 수행하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 실시예 1 내지 4를 참조한다.
본 개시된 방법의 다양한 경우, CDK4/6 저해제에 대한 민감성은 대상체로부터 수득된 시료를 (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 또는 (iii) 이들의 조합의 부재에 대해 검정함으로써 결정된다.
대상체에서 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 유지시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 치료에 대한 민감성 중 적어도 50%가 유지된다. 선택적으로, 치료에 대한 민감성 중 적어도 또는 약 50% 증가, 적어도 또는 약 60% 증가, 적어도 또는 약 70% 증가, 적어도 또는 약 80% 증가, 적어도 또는 약 90% 증가, 적어도 또는 약 95% 증가, 또는 적어도 또는 약 98% 증가, 적어도 또는 약 100% 증가가 유지된다.
추가의 단계
발명의 방법에 관하여, 방법은 추가의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 상기 방법의 언급된 단계(들) 중 하나 이상을 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 이에, 예시적인 양태에서, 방법은 대상체로부터 수득된 제2 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하며, 상기 제2 시료는 제1 시료가 대상체로부터 수득된 시점에 비해 상이한 시점에서 대상체로부터 수득된다. 예시적인 양태에서, 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 1개월마다, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 또는 6개월 내지 12개월마다 검정하는 단계를 포함하고, 상기 검정은 동일한 대상체로부터 수득된 상이한 시료에 기초한다.
예시적인 양태에서, 본 개시된 방법은 대상체로부터 시료를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 양태에서, 시료는 채혈, 성분채집술, 백혈구 성분채집술, 생검에 의해 또는 소변 수집에 의해 수득된다.
예시적인 양태에서, 방법은 일단 KIF18A 저해제에 대한 필요성이 결정되면 이러한 KIF18A 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 방법은 약학적 조합을 투여하는 임의의 본 개시된 방법과 동일하거나 유사할 수 있다.
다양한 양태에서, 방법은 방추사 조립 검문소(SAC) 활성화, 중심체 일탈(aberration), 다극성 방추체 또는 이들의 조합에 대해 시료를 검정하는 단계를 추가로 포함한다. 이들 특징/특질에 대해 시료를 검정하는 적합한 방법은 본원에 기재되어 있다. 실시예 5 내지 10을 참조한다.
본원에 기재된 단계의 임의의 그리고 모든 가능한 조합은 본 방법의 목적을 위해 고려된다.
약학적 조합
예시적인 구현예에서, 본원에 기재된 KIF18A 저해제는 단독으로 투여되고, 대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 KIF18A 저해제는 또 다른 치료제, 예를 들어 상이한 유형(예를 들어 구조)이지만 또 다른 KIF18A 저해제, 또는 KIF18A를 저해하지 않는 또 다른 치료제와 조합되어 투여된다. 예시적인 양태에서, 다른 치료제는 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 것을 목표로 한다. 예시적인 양태에서, 다른 치료제는 CDK4/6 저해제이다. 이에, 본 개시내용은 KIF18A 저해제를 포함하는 약학적 조합을 제공한다. 약학적 조합은 KIF18A 저해제 및 또 다른 활성제를 포함한다. 예시적인 경우, KIF18A 저해제는 다른 활성제와 함께 제형화되고, 2개의 활성제가 동시에 투여된다. 예시적인 경우, KIF18A 저해제는 다른 활성제와 함께 제형화되지 않고, 2개의 활성제는 별개로 또는 함께 투여된다. 다양한 양태에서, 2개의 활성제는 대상체에게 순차적으로 투여된다.
예시적인 구현예에서, 약학적 조합은 KIF18A 저해제 및 CDK4/6 저해제를 포함한다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제와 별개로 제형화된다.
다양한 양태에서, 약학적 조합 또는 KIF18A 저해제 또는 CDK4/6 저해제는 예를 들어, 산성화제, 첨가제, 흡착제, 에어로졸 프로펠런트, 공기 치환제, 알칼리화제, 고화방지제(anticaking agent), 항응고제, 항미생물 보존제, 항산화제, 소독제, 염기, 결합제, 완충제, 킬레이트제, 코팅제, 착색제, 건조제, 세제, 희석제, 살균제, 붕해제, 분산제, 용해 증강제, 염료, 연화제, 유화제, 에멀젼 안정화제, 충전제, 필름 형성제, 풍미 증강제, 풍미제, 유동 증강제, 겔화제, 과립화제, 보습제, 윤활제, 점막접착제, 연고 베이스, 연고, 유지성 비히클, 유기 베이스, 패스틸 베이스(pastille base), 안료, 가소제, 연마제, 보존제, 격리제, 피부 침투제, 가용화제, 용매, 안정화제, 좌제 베이스, 표면 활성제, 계면활성제, 현탁화제, 감미제, 치료제, 증점제, 장성제(tonicity agent), 독성제, 점도-증가제, 흡수제, 수-혼화성 공용매, 연수제, 또는 습윤제를 포함한 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 제형화된다.
다양한 양태에서, 약학적 조합 또는 KIF18A 저해제 또는 CDK4/6 저해제는 경구 투여 또는 전신 또는 비경구 투여(예를 들어 정맥내, 피하, 근육내 투여)를 위해 제형화된다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해 제형화된다. 다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 경구 투여를 위해 제형화된다.
CDK4/6 저해제
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDK4/6 저해제"는 사이클린-의존적 키나제, CDK4 및 CDK6을 표적화하고 이들의 효소 활성, 예를 들어, 키나제 활성을 감소시키거나 저해하는 임의의 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예시적인 양태에서, CDK4/6 저해제는 CDK4 및 CDK6에 작용하여 세포-주기 억제를 유도한다. 세포 주기 진행 동안, CDK4 및 CDK6은 인산화를 위해 성장-억제성 단백질, 망막아종 단백질(Rb)을 표적화하고, Rb 단백질은 인산화될 때 비활성화된다. CDK4 및 CDK6이 CDK4/6 저해제에 의해 저해될 때, Rb가 이의 성장-억제성 기능을 자유롭게 수행하도록 Rb는 인산화되지 않는다(또는 덜 인산화됨). 예시적인 구현예에서, CDK4/6 저해제는 세린/트레오닌 키나제 저해제, 시토크롬 P450(CYP450) 3A 저해제, 또는 둘 다이다. 다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 망막아종(Rb) 단백질의 인산화를 저해한다. 다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 CYP4503A의 기능을 저해한다.
CDK4/6 저해제에 의해 제공되는 감소 또는 저해는 100% 또는 완전 저해 또는 폐기 또는 감소가 아닐 수 있다. 그보다는, 당업자가 잠재적인 이익 또는 치료적 효과가 있다고 인식하는 다양한 정도의 감소 또는 저해가 존재한다. 이러한 측면에서, CDK4/6 저해제는 CDK4 및/또는 CDK6 단백질(들)을 임의의 양 또는 수준까지 저해할 수 있다. 예시적인 구현예에서, CDK4/6 저해제에 의해 제공되는 감소 또는 저해는 적어도 또는 약 10% 감소 또는 저해(예를 들어, 적어도 또는 약 20% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 30% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 40% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 50% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 60% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 70% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 80% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 90% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 95% 감소 또는 저해, 적어도 또는 약 98% 감소 또는 저해)이다.
예시적인 양태에서, CDK4/6 저해제는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00041
다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 구조 I 또는 구조 II의 구조를 포함하고, A-B의 구조를 추가로 포함하며, 여기서 A는 이환식 구조를 포함하고 B는 단환식 구조를 포함한다. 예시적인 양태에서, A-B는 구조 III 또는 구조 IV 또는 구조 V의 구조를 포함한다:
Figure pct00042
예시적인 양태에서, 구조 III 또는 IV의 B는 사이클로펜탄이다. 예시적인 양태에서, 구조 V의 B는 피리미딘을 포함한다.
다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 하기의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00043
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다양한 양태에서, CDK4/6 저해제는 하기의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00044
.
다양한 경우, CDK4/6 저해제는 하기의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00045
.
치료 방법
나아가, 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", 뿐만 아니라 이와 관련된 단어는 본질적으로 100% 또는 완전 치료를 내포하지는 않는다. 그보다는, 당업자가 잠재적인 이익 또는 치료적 효과가 있다고 인식하는 다양한 정도의 감소 또는 저해가 존재한다. 이러한 측면에서, 본 개시내용의 신생물 질환을 치료하는 방법은 임의의 양 또는 임의의 수준의 치료를 제공할 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 방법에 의해 제공된 치료는 치료받는 신생물 질환의 하나 이상의 질병 또는 증상 또는 징후의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공된 치료는 신생물 질환의 진행을 늦추는 단계를 포괄할 수 있다. 예를 들어, 방법은 신생물 질환에 대한 T 세포 활성 또는 면역 반응을 증강시키거나, 종양이나 암 성장 또는 종양 부담(burden)을 감소시키거나, 종양 세포의 전이를 감소시키거나, 종양 또는 암 세포의 세포 사멸을 증가시키거나 종양 퇴화를 증가시키는 등에 의해 신생물 질환을 치료할 수 있다. 전술한 내용에 따르면, 대상체에서 종양 성장 또는 종양 부담을 감소시키거나 종양 퇴화를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 선택적으로 CDK4/6 저해제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 대상체는 CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료된 적이 있고, 방법은 대상체에게 KIF18A 저해제를 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 치유적 치료법, 예방적 치료법, 및 방지적 치료법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 치료법을 지칭한다. 예방적 치료는 일반적으로 장애의 발병을 함께 방지하거나 개체에서 장애의 전임상적으로 명백한 병기(stage)의 발병을 지연시키는 것으로 이루어진다.
다양한 양태에서, 방법은 신생물 질환의 발병 또는 재발을 적어도 1일, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 15일, 30일, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년 이상만큼 지연시킴으로써 치료한다. 다양한 양태에서, 방법은 대상체의 생존율을 증가시킴으로써 치료한다. 예시적인 양태에서, 본 개시내용의 방법은 전이의 발생 또는 발병을 지연시킴으로써 치료를 제공한다. 다양한 경우, 방법은 새로운 전이의 발생 또는 발병을 지연시킴으로써 치료를 제공한다. 이에, 암을 갖는 대상체에서 전이의 발생 또는 발병을 지연시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 KIF18A 저해제를 선택적으로 CDK4/6 저해제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 경우, 제공된 치료는 임상 시험으로부터 수득된 데이터의 측면에서 또는 이에 의해 지지될 수 있으며, 이러한 시험의 평가변수는 무진행 생존율(PFS), 전체 생존율(OS), 또는 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행 상태의 저하까지의 시간이다. 다양한 양태에서, 본 개시내용은 신생물 질환을 갖는 대상체에서 PFS, OS, 또는 ECOG 수행 상태의 저하까지의 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제에 대해 내성이거나 이에 대해 감소된 민감성을 갖고, 방법은 KIF18A 저해제를 선택적으로 CDK4/6 저해제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무진행 생존율" 또는 "PFS"는 치료받는 환자가 암의 악화 없이 경험하는 시간(악화를 측정하기 위해 어떤 측정치가 사용되든지 간에)을 의미한다. 용어 "전체 생존율"은 환자가 치료 후에 얼마나 오래 살아 있는지를 의미한다. ECOG 수행 상태는 환자의 질환, 예를 들어 질환이 어떻게 진행되고 있는/퇴행하고 있는지, 질환이 환자의 매일 생활 능력에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해, 그리고 적절한 치료 및 예후를 결정하기 위해 의사 및 연구자에 의해 사용되는 스케일에 따른 등급 또는 점수이다. ECOG 수행 상태는 하기 기준에 따라 결정된다:
Figure pct00046
Oken et. al., Am. J. Clin. Oncol 5: 649-655 (1982)
예시적인 구현예에서, 신생물 질환에 대해 대상체를 치료하는 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체는 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성이고, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법은 (A) 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) 하기 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계: (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합, 및 (B) KIF18A 저해제를 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이고, 이러한 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법은 KIF18A 저해제를 투여하여 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 대상체는 CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료된 적
이 있고, 이러한 대상체를 치료하는 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 선택적으로, KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제와 공동-투여된다.
예시적인 구현예에서, 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법은 KIF18A 저해제를 포함하는 현재 개시된 약학적 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우, 약학적 조합은 KIF18A 저해제와 CDK4/6 저해제를 포함한다.
다양한 양태에서, 암은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함한다.
예시적인 양태에서, KIF18A 저해제는 대상체에게 매일(일일 1회, 일일 2회, 일일 3회, 일일 4회, 일일 5회, 일일 6회), 1주 3회, 1주 2회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 격주로, 3주마다, 매달, 또는 격월로 투여된다. 다양한 경우, CDK 저해제는 대상체에게 매일 1회 투여된다. 선택적으로, KIF18A 저해제는 1일 1회 경구 투여된다.
나아가, 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 종양 성장 또는 암 성장을 감소시키는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 또는 암 성장을 감소시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체에서 종양 세포 또는 암세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 종양 세포 또는 암세포의 사멸을 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 암, 선택적으로, 유방암, 난소암, 또는 전립선암이다. 다양한 경우, 신생물 질환은 삼중-음성 유방암(TNBC), 비-관강 유방암, 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC)이다. 예시적인 양태에서, 신생물 질환은 자궁내막암, 선택적으로, 장액성 자궁내막암이다. 선택적으로, 암은 비활성화된TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 과발현된 CCNE1 유전자 생성물, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성인 세포를 포함한다. 다양한 경우, 암은 증폭된 CCNE1 유전자, 침묵화된 BRCA1 유전자, 결핍 Rb1 유전자, 또는 이들의 조합에 대해 양성인 세포를 포함한다. 선택적으로, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해, 선택적으로 1일 1회 투여된다. 예시적인 양태에서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 50% 또는 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80% 또는 85% 또는 적어도 90% 또는 95%)의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적이다.
예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 유리하게는 신생물 질환의 세포에 대해 고도로 특이적이다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 대상체에서 정상 체세포에 대한 거의 적은 독성 내지는 독성 없이 신생물 질환을 효과적으로 치료하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시킨다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 대상체에서 정상 체세포의 증식에 있어서 실질적인 저하 없이, 신생물 질환을 치료하고/하거나, CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 민감성을 유지시키고/시키거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 예시적인 경우, KIF18A 저해제는 정상 체세포의 아폽토시스에 있어서 실질적인 증가 없이, 신생물 질환을 치료하고/하거나, CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 민감성을 유지시키고/시키거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포에 관하여 용어 "정상"은 신생물이 아니고/아니거나 질환에 걸리지 않은 세포를 의미한다. 다양한 양태에서, 정상 체세포는 인간 골수 단핵 세포이다. 다양한 경우, 정상 체세포는 TP53MUT으로서 유전적으로 특징화되지 않거나 TP53WT으로서 유전적으로 특징화된다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 정상 체세포의 아폽토시스에서 25% 이하의 증가를 야기한다. 다양한 양태에서, KIF18A 저해제는 대상체에서의 정상 체세포의 증식에서 25% 이하의 저하를 야기한다. 선택적으로, 정상 체세포의 아폽토시스의 증가 또는 정상 체세포의 증식의 저하는 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 정상 체세포의 증식 및/또는 정상 체세포의 아폽토시스를 측정하는 방법이 본원에 기재된다.
신생물 질환
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신생물 질환"은 종양의 성장을 야기하는 임의의 질병을 지칭한다. 예시적인 양태에서, 종양은 양성 종양이다. 예시적인 양태에서, 종양은 악성 종양이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 암이다. 다양한 양태에서, 암은 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포성 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma), 골암, 뇌암, 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장의 암, 눈의 암, 간내 담관의 암, 관절의 암, 목, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강의 암, 음문의 암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 위장 유암종 종양, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 장막, 장간막 암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암(예를 들어, 신세포 암종(RCC)), 소장암, 연조직암, 위암, 고환암, 갑상선암, 수뇨관암, 또는 비뇨기 방광암이다. 특정 양태에서, 암은 두경부암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 췌장암, 위장암, 위암, 유방암, 자궁내막암, 결장직장암, 간세포 암종, 교모세포종, 방광암, 폐암, 예를 들어, 비-소세포 폐암(NSCLC), 또는 세기관지폐포 암종이다. 특정 구현예에서, 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC), 두경부암, 신장암, 삼중 음성 유방암, 또는 위암이다. 예시적인 양태에서, 대상체는 종양(예를 들어, 고체 종양, 혈액학적 악성물, 또는 림프성 악성물)을 갖고, 약학적 조성물은 대상체에서 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 다른 예시적인 양태에서, 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 두경부암, 신장암, 유방암, 흑색종, 난소암, 간암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 위암, 림프종 또는 백혈병이고, 약학적 조성물은 대상체에서 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
용어 "암" 및 "암성"은 본원에서 사용될 때 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 질병을 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 육종, 모세포종(blastoma) 및 백혈병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 편평 세포 암종, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암종, 및 두경부암, 난소암, 및 자궁내막암을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "암"이 임의의 하나의 특정 형태의 질환으로 제한되지는 않지만, 본 발명의 방법은 포유류에서 적절한 염색체 격리 및 생존을 위해 KIF18A에 의존하거나 KIF18A의 비조절된 수준에 의해 수반되는 것으로 발견된 암에 특히 효과적일 것으로 여겨진다.
다양한 양태에서, 암은 전이성이거나, 종양은 절제 불가능하거나, 이들의 조합이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자, CCNE1 유전자의 유전자 사본 수 획득, 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 삼중 음성 유방암(TNBC), 비관강 유방암(예를 들어, 기저 유사 중간엽(basal like mesenchymal)), 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC)이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이거나 민감성이지 않다(둔감성임). 다양한 양태에서, 신생물 질환은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이거나 민감성이지 않고(둔감성임), Rb1 능숙하다(vs. Rb1 결핍). 다양한 양태에서, 신생물 질환은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이고 Rb1 결핍(vs. Rb1 능숙)이다.
예시적인 양태에서, 신생물 질환은 유방암, 선택적으로, 관강 유방암 또는 TNBC이다. 다양한 양태에서, 유방암은 (a) 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 전이성 또는 국소적으로 재발성 에스트로겐 수용체(ER)-음성(예를 들어, 면역조직화학[IHC]에 의해 1% 미만)이었으며, (b) 프로게스테론 수용체(PR)-음성(예를 들어, 1% 미만의 IHC)이었고, (c) 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2)-음성(형광 제자리 혼성화[FISH] 음성, IHC에 의해 0 또는 1+, 또는 IHC2+ 및 ASCO/CAP 정의에 따라 FISH 음성)이었다. 예시적인 양태에서, 신생물 질환은 신생물 질환에 임상적 이익을 제공하는 것으로 알려진 기존의 치료법(들)에 비내약성(intolerant)이거나 전이성 설정에서 전신 화학치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 불응성 및/또는 재발성이다. 예시적인 경우, 암은 면역 검문소 저해제로 치료되어 왔다. 다양한 경우, 유방암은 호르몬 수용체(HR)-양성 및/또는 HER2-음성이다. 다양한 양태에서, 유방암은 진행성 유방암 및/또는 전이성 유방암이다. 다양한 양태에서, 유방암은 내분비 치료법 후 진행된 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암이다. 일부 양태에서, 유방암은 암이 확산/전이된 후 내분비 치료법 및 화학치료법으로 이전에 치료된 호르몬 수용체-양성(HR+)/HER2-음성(HER2-) 진행성 또는 전이성 유방암이다. 다양한 경우, 암은 호르몬 치료법(아리미덱스(Arimidex)(화학명: 아나스트로졸(anastrozole)), 아로마신(Aromasin)(화학명: 엑세메스탄(exemestane)), 및 페마라(Femara)(화학명: 레트로졸(letrozole))로 치료되지 않은 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암이다. 다양한 경우, 유방암은 호르몬 치료법으로 치료받은 후 성장한 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암이다. 다양한 경우, 유방암은 표 2의 HER2-양성 유방암 세포와 유사한 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 HER2-양성 유방암이다. 선택적으로, 유방암은 HER2-양성, 에스트로겐 수용체(ER)-음성 유방암이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 난소암, 선택적으로 고등급 장액성 난소암(HGSOC)이다. 선택적으로, 난소암은 백금-내성 HGSOC이다. 예시적인 양태에서, 난소암은 1차 복막암 또는 나팔관암이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 전이성 또는 절제 불가능한 HGSOC이고, 6개월의 백금-함유 요법 동안 또는 이내에 진행되는 것으로 정의되는 백금-내성이 동반된다. 다양한 양태에서, 난소암은 백금-내성 재발 치료법으로 치료된 적이 있거나 치료되고 있다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 장액성 자궁내막암이다. 선택적으로, 신생물 질환은 전이성 또는 재발성 장액성 자궁내막암이다. 다양한 경우, 자궁내막암은 신생물 질환에 대해 임상 이익을 제공하는 것으로 알려진 기존의 치료법(들)에 대해 비내약성이거나 전이성/재발성 설정에서 전신 치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 불응성 및/또는 재발성이다. 다양한 경우, 신생물 질환은 절제 불가능하고 전신 화학치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 재발성 및/또는 불응성이거나 비내약성인 진행성 또는 전이성 고체 종양이다. 선택적으로, 진행성 또는 전이성 고체 종양은 TP53MUT이다.
다양한 경우, 신생물 질환은 하나 이상의 약물을 이용한 치료에 대해 내성이다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 하나 이상의 약물을 이용한 치료에 대해 감소된 민감성을 나타낸다. 선택적으로, 신생물 질환은 다제약물 내성 신생물 질환이다. 예시적인 경우, 종양 또는 암 세포(예를 들어, 신생물 질환의)는 다제약물 내성 종양 또는 암 세포이고/이거나 다제약물 내성 1(MDR-1) 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물의 증가된 발현을 나타낸다. 예시적인 경우, 종양 또는 암 세포(예를 들어, 신생물 질환의)는 MDR-1 유전자에 의해 인코딩된 P-당단백질(P-gp)의 증가된 발현을 나타낸다. 다양한 양태에서, 신생물 질환은 항유사분열제 또는 안트라사이클린 항생제, 선택적으로, 파클리탁셀 또는 독소루비신을 이용한 치료에 대해 감소된 민감성 또는 내성을 나타낸다. 다양한 양태에서, 종양 또는 암 세포(예를 들어, 신생물 질환의)는 튜불린 유전자에서의 돌연변이, 튜불린의 과발현, 튜불린 증폭, 및/또는 이소타입 전환된 튜불린 발현을 나타낸다. 다양한 양태에서, α- 또는 β-튜불린에서의 돌연변이는 미세소관 상의 올바른 장소에 탁산이 결합하는 것을 저해하여, 탁산을 비효과적으로 만든다. 예시적인 양태에서, 신생물 질환은 백금 제제, 안트라사이클린, 표적화된 치료법(예를 들어 TKI, PARP 저해제) 중 임의의 하나 이상을 이용한 치료에 대해 감소된 민감성 또는 내성을 나타낸다.
다양한 양태에서, 신생물 질환은 하나 이상의 전체 게놈 복제 또는 전체 게놈 배가(WGD: whole genome doubling) 사건을 포함하는 암이다. 암의 맥락에서 WGD는 문헌[Lens and Hemdema, Nature Reviews Cancer 19: 32-45(2019)]; 문헌[Ganem et. al., Current Opinion in Genetics & Development 17, 157-162], 및 문헌[Davoli et. al., Annual Review of Cell and Developmental Biology 27, 585-610]에서 논의된다.
대상체
본 개시내용의 예시적인 구현예에서, 대상체는 설치류목의 포유류, 예컨대 마우스 및 햄스터, 및 토끼목의 포유류, 예컨대 토끼, 고양이과(고양이) 및 개과(개)를 포함한 육식동물목의 포유류, 소과(소) 및 돼지과(돼지)를 포함한 우제류목의 포유류, 또는 말과(말)를 포함한 말목의 포유류를 포함하지만 이로 제한되지 않는 포유류이다. 일부 양태에서, 포유류는 영장(Primates), 세보이드(Ceboids), 또는 시모이드(Simoids)(원숭이) 목 또는 유인원목(인간 및 유인원)의 것이다. 일부 양태에서, 포유류는 인간이다. 다양한 양태에서, 대상체는 신생물 질환, 예를 들어, 본원에 기재된 것들 중 임의의 하나를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "환자", "대상체" 또는 "포유류"는 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함한 임의의 "환자", "대상체" 또는 "포유류"를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 포유류는 인간이다.
예시적인 양태에서, 대상체는 전이를 갖는 암, 절제 불가능한 종양, 또는 이들의 조합을 갖는다. 다양한 양태에서, 암 또는 종양은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성 또는 감소된 민감성을 나타내거나 갖는다. 예시적인 양태에서, 대상체는 유방암, 선택적으로, 관강 유방암 또는 삼중 음성 유방암(TNBC)을 갖는다. 다양한 양태에서, 유방암은 (a) 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 전이성 또는 국소적으로 재발성 에스트로겐 수용체(ER)-음성(예를 들어, 면역조직화학[IHC]에 의해 1% 미만)이었으며, (b) 프로게스테론 수용체(PR)-음성(예를 들어, 1% 미만의 IHC)이었고, (c) 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2)-음성(형광 제자리 혼성화[FISH] 음성, IHC에 의해 0 또는 1+, 또는 IHC2+ 및 ASCO/CAP 정의에 따라 FISH 음성)이었다. 예시적인 양태에서, 대상체는 이의 질병에 임상적 이익을 제공하는 것으로 알려진 기존의 치료법(들)에 비내약성이거나 전이성 설정에서 전신 화학치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 불응성 및/또는 재발성이다. 예시적인 경우, 대상체는 면역 검문소 저해제에 대해 사전 노출을 갖는다. 다양한 경우, 유방암은 호르몬 수용체(HR)-양성 및/또는 HER2-음성이다. 다양한 양태에서, 유방암은 진행성 유방암 및/또는 전이성 유방암이다. 다양한 양태에서, 대상체는 내분비 치료법 후 진행된 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암을 갖는다. 일부 양태에서, 대상체는 암이 확산/전이된 후 내분비 치료법 및 화학치료법으로 이전에 치료된 호르몬 수용체-양성(HR+)/HER2-음성(HER2-) 진행성 또는 전이성 유방암 환자이다. 다양한 경우, 대상체는 폐경후 여성에서 이전에 호르몬 치료법으로 치료받은 적이 없는 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암을 갖는다(아리미덱스(화학명: 아나스트로졸), 아로마신(화학명: 엑세메스탄), 및 페마라(화학명: 레트로졸). 다양한 경우, 대상체는 호르몬 치료법으로 치료받은 후 성장한 HR+/HER2- 진행성 또는 전이성 유방암을 갖는 폐경후 여성이다. 소정의 양태에서, 대상체는 HR+, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)-음성 진행성 또는 전이성 유방암을 갖는 폐경전/폐경주위 또는 폐경후 여성이고, 내분비-기초 치료법을 받았다. 선택적으로, 대상체는 HR+, HER2- 진행성 또는 전이성 유방암을 갖는 폐경후 여성이고, 초기 내분비-기초 치료법을 받았거나 내분비 치료법을 이용한 치료 시 질환 진행을 갖는다. 다양한 양태에서, 대상체는 난소암, 선택적으로 고등급 장액성 난소암(HGSOC)을 갖는다. 선택적으로, 난소암은 백금-내성 HGSOC이다. 예시적인 양태에서, 대상체는 1차 복막암 및/또는 나팔관암을 갖는다. 다양한 양태에서, 대상체는 전이성 또는 절제 불가능한 HGSOC의 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 진단을 갖고, 6개월의 백금-함유 요법 동안 또는 이내에 진행되는 것으로 정의되는 백금-내성이 동반된다. 다양한 양태에서, 대상체는 난소암을 갖고, 백금-내성 재발 치료법을 받았거나 받고 있다. 다양한 양태에서, 대상체는 장액성 자궁내막암을 갖는다. 선택적으로, 대상체는 전이성 또는 재발성 장액성 자궁내막암의 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 진단을 갖는다. 다양한 경우, 대상체는 이의 질병에 대해 임상적 이익을 제공하는 것으로 알려진 기존의 치료법(들)에 대해 비내약성이거나 전이성/재발성 설정에서 전신 치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 재발성 및/또는 불응성이다. 다양한 경우, 대상체는 절제 불가능하고 전신 화학치료법 중 적어도 하나의 라인에 대해 재발성 및/또는 불응성이거나 비내약성인 진행성 또는 전이성 고체 종양을 갖는다. 선택적으로, 진행성 또는 전이성 고체 종양은 TP53MUT이다.
예시적인 양태에서, 대상체는 하기 중 임의의 것을 갖지 않는다: (a) 활성 뇌 전이, (b) 1차 중추신경계(CNS) 종양, 혈액학적 악성물 또는 림프종, (c) 비제어된 흉막 삼출액(들), 심낭 삼출액, 또는 복수, (d) 경구 약제를 섭취하지 못하게 하는 위장(GI)관 질환.
시료
본원에 개시된 방법에 관하여, 시료는 대상체로부터 수득된 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 유즙, 타액, 점액, 정액, 질 분비물, 세포성 추출물, 염증성 유체, 뇌척수액, 배설물, 유리체액(vitreous humor), 골수 흡인물, 복막강액(예를 들어, 악성 복수(malignant ascite)), 또는 소변을 포함하지만 이로 제한되지 않는 체액을 포함한다. 예시적인 양태에서, 시료는 전술한 시료 중 적어도 2개의 복합 패널이다. 일부 양태에서, 시료는 혈액 시료, 혈장 시료, 혈청 시료, 및 소변 시료 중 적어도 2개의 복합 패널이다. 예시적인 양태에서, 시료는 혈액 또는 이의 분획(예를 들어, 백혈구 성분채집술(leukopheresis)을 통해 수득된 혈장, 혈청, 분획)을 포함한다. 다양한 양태에서, 시료는 암세포, 종양 세포, 비-종양 세포, 혈액, 혈액 세포, 또는 혈장을 포함한다. 예시적인 경우, 시료는 세포-무함유 DNA(cfDNA)를 포함한다. 예시적인 경우, 시료는 신생물 질환(예를 들어, 암)의 생식세포계 세포를 포함한다. 예시적인 경우, 시료는 신생물 질환(예를 들어, 암)의 체세포를 포함한다.
대조군
본원에 기재된 방법에서, 결정되는 수준은 대조군 수준 또는 컷오프(cut off) 수준 또는 역치 수준과 동일할 수 있거나, 대조군 수준 또는 컷오프 수준 또는 역치 수준에 비해 증가되거나 저하될 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 대상체는 동일한 종, 성별, 인종, 연령 군, 흡연 상태, BMI, 현재의 치료 요법 상태, 병력, 또는 이들의 조합의 매칭된 대조군이지만, 대조군은 문제의 질환을 앓고 있지 않거나 질환에 대한 위험에 있지 않다는 점에서 진단되고 있는 대상체와 상이하다.
대조군 수준에 비해, 결정되는 수준은 증가된 수준일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 수준(예를 들어, 발현 수준, 생물학적 활성 수준)에 관하여 용어 "증가된"은 대조군 수준을 초과하는 임의의 증가%를 지칭한다. 증가된 수준은 대조군 수준에 비해 적어도 또는 약 5% 증가, 적어도 또는 약 10% 증가, 적어도 또는 약 15% 증가, 적어도 또는 약 20% 증가, 적어도 또는 약 25% 증가, 적어도 또는 약 30% 증가, 적어도 또는 약 35% 증가, 적어도 또는 약 40% 증가, 적어도 또는 약 45% 증가, 적어도 또는 약 50% 증가, 적어도 또는 약 55% 증가, 적어도 또는 약 60% 증가, 적어도 또는 약 65% 증가, 적어도 또는 약 70% 증가, 적어도 또는 약 75% 증가, 적어도 또는 약 80% 증가, 적어도 또는 약 85% 증가, 적어도 또는 약 90% 증가, 적어도 또는 약 95% 증가일 수 있다.
대조군 수준에 비해, 결정되는 수준은 저하된 수준일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 수준(예를 들어, 발현 수준, 생물학적 활성 수준)에 관하여 용어 "저하된"은 대조군 수준 미만의 임의의 저하%를 지칭한다. 저하된 수준은 대조군 수준에 비해 적어도 또는 약 5% 저하, 적어도 또는 약 10% 저하, 적어도 또는 약 15% 저하, 적어도 또는 약 20% 저하, 적어도 또는 약 25% 저하, 적어도 또는 약 30% 저하, 적어도 또는 약 35% 저하, 적어도 또는 약 40% 저하, 적어도 또는 약 45% 저하, 적어도 또는 약 50% 저하, 적어도 또는 약 55% 저하, 적어도 또는 약 60% 저하, 적어도 또는 약 65% 저하, 적어도 또는 약 70% 저하, 적어도 또는 약 75% 저하, 적어도 또는 약 80% 저하, 적어도 또는 약 85% 저하, 적어도 또는 약 90% 저하, 적어도 또는 약 95% 저하일 수 있다.
예시적인 구현예
본 발명의 예시적인 구현예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
E1. 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 대상체에 대해 결정된 치료는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때, KIF18A 저해제를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E2. 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 (A) 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계, 및 (B) 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 대상체에게 KIF18A 저해제를 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로 상기 방법은 대상체로부터 시료를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E3. 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체는 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함하고, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, KIF18A 저해제.
E4. KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하고, 대상체는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성일 때 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 식별되는, 방법.
E5. 구현예 E1 내지 E4 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자는 (i) TP53 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 TP53 프로모터를 포함하거나, (ii) 바이러스 단백질에 의해 또는 MDM2 유전자의 증폭을 통해 비활성화되거나, (iii) 이들의 조합인, 방법.
E6. 구현예 E5에 있어서, 바이러스 단백질은 인간 유두종 바이러스(HPV: Human Papillomavirus) E6 단백질인, 방법.
E7. 구현예 E1 내지 E6 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 Rb1 유전자는 (i) Rb1 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 Rb1 프로모터를 포함하거나, (ii) 바이러스 단백질에 의해 비활성화되거나, (iii) 이들의 조합인, 방법.
E8. 구현예 E7에 있어서, 바이러스 단백질은 인간 유두종 바이러스(HPV) E7 단백질인, 방법.
E9. 구현예 E1 내지 E8 중 어느 한 구현예에 있어서, CCNE1 유전자 생성물의 과발현은 FBXw7 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되는, 방법.
E10. 구현예 E1 내지 E9 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 BRCA 유전자는 (i) BRCA 유전자 돌연변이, 결실, 절두, 및/또는 후성적으로 침묵화된 BRCA 프로모터를 포함하는, 방법.
E11. 구현예 E10에 있어서, BRCA 유전자는 BRCA1 유전자인, 방법.
E12. 구현예 E10에 있어서, BRCA 유전자는 BRCA2 유전자인, 방법.
E13. 구현예 E1 내지 E12 중 어느 한 구현예에 있어서, 시료의 세포의 CDK4/6 저해제에 대한 민감성을 결정하는 단계, 선택적으로 CDK4/6 저해제에 대한 민감성에 대해 검정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E14. 구현예 E1 내지 E13 중 어느 한 구현예에 있어서, 검정 단계는 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 또는 비활성화된 BRCA 유전자의 존재를 검출하기 위한 세포유전학 방법 및/또는 분자 방법을 포함하는, 방법.
E15. 구현예 E1 내지 E14 중 어느 한 구현예에 있어서, 검정 단계는 직접 시퀀싱(direct sequencing), DNA 혼성화 및/또는 제한 효소 분해(restriction enzyme digestion)를 포함하는, 방법.
E16. 구현예 E14에 있어서, 세포유전학 방법은 핵형분석(karyotyping), 형광 제자리 혼성화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
E17. 구현예 E14에 있어서, 분자 방법은 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 멀티플렉스 리게이션 의존적 프로브 증폭(MLPA), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE), 단일 가닥 입체형태 다형성(SSCP), 헤테로듀플렉스 분석, 미스매치의 화학적 절단(CCM), 단백질 절두 시험(PTT), 올리고뉴클레오타이드 리게이션 검정(OLA), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
E18. 구현예 E17에 있어서, PCR은 멀티플렉스 PCR, 네스티드 PCR, RT-PCR, 또는 실시간 PCR인, 방법.
E19. 구현예 E1 내지 E18 중 어느 한 구현예에 있어서, 검정 단계는 TP53 유전자, Rb1 유전자, CCNE1 유전자, 및/또는 BRCA 유전자에 의해 인코딩되는 RNA 또는 단백질의 발현 수준을 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
E20. 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 대상체에 대한 치료는 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성인 경우 KIF18A 저해제를 포함하는 치료로서 결정되는, 방법.
E21. 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 대상체에 대한 치료는 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 둔감성일 때 CDK4/6 저해제를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 치료로서 결정되는, 방법.
E22. CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 내성인 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 투여하여 환자를 치료하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E23. CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료된 적이 있는 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제와 함께 공동-투여되는, 방법.
E24. 대상체에서 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 신생물 질환의 민감성을 유지시키는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E25. KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 암을 갖는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 대상체는, 시료의 암세포가 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성인 경우, KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 식별되는, 방법.
E26. 구현예 E20 내지 E25 중 어느 한 구현예에 있어서, CDK4/6 저해제에 대한 민감성은 대상체로부터 수득된 시료를 (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 또는 (iii) 이들의 조합의 부재에 대해 검정함으로써 결정되는, 방법.
E27. 구현예 E1 내지 E26 중 어느 한 구현예에 있어서, 시료는 암세포, 종양 세포, 비-종양 세포, 혈액, 혈액 세포, 또는 혈장을 포함하고, 선택적으로, 시료는 생식세포계 암세포 또는 체세포계 암세포를 포함하는, 방법.
E28. 구현예 E27에 있어서, 시료는 세포-무함유 DNA(cfDNA)를 포함하는, 방법.
E29. CDK4/6 저해제 및 KIF18A 저해제를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 약학적 조합.
E30. 구현예 E20 내지 E29 중 어느 한 구현예에 있어서, CDK4/6 저해제는 팔보시클립, 리보시클립, 및/또는 아베마시클립인, 방법 또는 약학적 조합.
E31. 구현예 E23, E27, E28, 및 E30 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제 및 CDK4/6 저해제는 대상체에게 별개로 투여되는, 방법.
E32. 구현예 E23, E27, E28, E30, 및 E31 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 CDK4/6 저해제로부터 별개로 제형화되고/되거나 포장되는, 방법.
E33. 구현예 E1 내지 E32 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 암, 선택적으로, 유방암인, 방법.
E34. 구현예 E33에 있어서, 암은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 과발현된 CCNE1 유전자 생성물, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법.
E35. 구현예 E1 내지 E34 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 삼중-음성 유방암(TNBC), 비-관강 유방암, 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC)인, 방법.
E36. 구현예 E1 내지 E35 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해 선택적으로 1일 1회 투여되는, 방법 또는 약학적 조합.
E37. 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 신생물 질환을 치료하기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E38. 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E39. 종양을 갖는 대상체에서 종양 또는 암 성장을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양 또는 암 성장을 감소시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E40. 대상체에서 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키기에 효과적인 양의 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E41. 구현예 E1 내지 E40 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 암, 선택적으로, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 전립선암인, 방법.
E42. 구현예 E41에 있어서, 신생물 질환은 삼중-음성 유방암(TNBC), 비-관강 유방암, 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC)인, 방법.
E43. 구현예 E42에 있어서, 신생물 질환은 TNBC인, 방법.
E44. 구현예 E42에 있어서, 신생물 질환은 비-관강 유방암인, 방법.
E45. 구현예 E42에 있어서, 신생물 질환은 HGSOC인, 방법.
E46. 구현예 E41에 있어서, 신생물 질환은 자궁내막암, 선택적으로, 장액성 자궁내막암인, 방법.
E47. 구현예 E41 내지 E46 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 과발현된 CCNE1 유전자 생성물, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법.
E48. 구현예 E47에 있어서, 암은 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법.
E49. 구현예 E47 또는 E48에 있어서, 암은 증폭된 CCNE1 유전자, 침묵화된 BRCA1 유전자, 결핍 Rb1 유전자, 또는 이들의 조합에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법.
E50. 구현예 E1 내지 E49 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해 선택적으로 1일 1회 투여되는, 방법.
E51. 구현예 E1 내지 E50 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 50%의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적인, 방법.
E52. 구현예 E1 내지 E51 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 75%의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적인, 방법.
E53. 구현예 E1 내지 E52 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 80% 또는 85%의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적인, 방법.
E54. 구현예 E1 내지 E53 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제의 양은 대조군과 비교하여 적어도 90% 또는 95%의 종양 퇴화를 유도하기에 효과적인, 방법.
E55. 구현예 E1 내지 E54 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 화학식 I의 화합물 또는 이의 임의의 약학적으로-허용 가능한 염이고:
[화학식 I]
Figure pct00047
;
화학식 I에서,
X1은 N 또는 -CR6이며;
X2는 N 또는 -CR5이고;
X3은 N 또는 -CR3이며;
X4는 N 또는 -CR9이고;
X1, X2, X3 및 X4 중 0, 1, 또는 2개는 N이며;
R1은 -CN, 또는 -Z-R12 기이고, Z는 -C0-4알크-, -NR11-, -NR11SO2-, -SO2NR11-, -NR11-S(=O)(=NH), -S(=O)(=NH)-, -S-, -S(=O)-, -SO2-, C0-4알크-O-, -(C=O)-, -(C=O)NR11-, -C=N(OH)-, 또는 -NR11(C=O)이거나;
-Z-R12 기는 -N=S(=O)-(R12)2이고, 2개의 R12 쌍은 대안적으로 이들 각각에 부착된 황 원자와 조합되어 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 또는 6-원 단환식 고리를 형성할 수 있고;
R2는 할로 또는 -Y-R13 기이고, Y는 -C0-4알크-, -N(C0-1알크)-C0-4알크-, -C(=O)NRaRa(C1-4알크), -O-C0-4알크-, S, S=O, S(=O)2, -SO2NR13, 또는 -S(=O)(=NH)-이며;
R3은 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R4는 H, 할로, R4a 또는 R4b이며;
R5는 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R6은 H, 할로, C1-8알크, C1-4할로알크, -O-C1-8알크, 또는 -O-R6a이고; R6a는 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 또는 6-원 단환식 고리이며;
R7은 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
R8은 H, 할로, C1-8알크, C1-4할로알크, -OH, -O-R8a, 또는 -O-R8b이며;
R9는 H, 할로, C1-8알크, 또는 C1-4할로알크이고;
Rx는
Figure pct00048
Figure pct00049
및
Figure pct00050
로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R10a, R10b, R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j는 각각 H, 할로, R10k, 또는 R10l이거나;
대안적으로, R10a와 R10b 쌍, R10c와 R10d 쌍, R10e와 R10f 쌍, R10g와 R10h 쌍, 또는 R10i와 R10j 쌍은 각각 독립적으로 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합되어, Rx 고리에 대해 스피로(spiro)인 포화된 또는 부분적으로-포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리를 형성하며; 상기 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리는 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하고, 추가로 상기 3-원, 4-원, 5-원, 6-원 단환식 고리는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -NRaRa, 또는 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되고;
Ry는 H, C1-4알크, 또는 C1-4할로알크이며;
R11은 H, R11a, 또는 R11b이고;
R12는 H, R12a, 또는 R12b이며;
R13은 R13a 또는 R13b이고;
R4a, R8a, R10k, R11a, R12a, 및 R13a는 독립적으로 각각의 경우, 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 포화된, 부분적으로-포화된 또는 불포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원, 또는 7-원 단환식 또는 4-원, 5-원, 6-원, 7-원, 8-원, 9-원, 10-원, 11-원, 또는 12-원 이환식 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -OC2-6알크NRaRa, -OC2-6알크ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, -NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb,-N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, -NRaC2-6알크NRaRa, -NRaC2-6알크ORa, -C1-6알크NRaRa, -C1-6알크ORa, -C1-6알크N(Ra)C(=O)Rb, -C1-6알크OC(=O)Rb, -C1-6알크C(=O)NRaRa, -C1-6알크C(=O)ORa, R14, 및 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되며;
R4b, R8b, R10l, R11b, R12b, 및 R13b는 독립적으로 각각의 경우, F, Cl, Br, -ORa, -OC1-4할로알크, 또는 CN으로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 기(들)에 의해 치환되는 C1-6알크로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R14는 독립적으로 각각의 경우, 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0 또는 1개의 원자를 함유하는 포화된, 부분적으로-포화된 또는 불포화된 3-원, 4-원, 5-원, 6-원, 또는 7-원 단환식 또는 4-원, 5-원, 6-원, 7-원, 8-원, 9-원, 10-원, 11-원, 또는 12-원 이환식 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 F, Cl, Br, C1-6알크, C1-4할로알크, -ORa, -OC1-4할로알크, CN, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -OC2-6알크NRaRa, -OC2-6알크ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, -NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb,-N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, -NRaC2-6알크NRaRa, -NRaC2-6알크ORa, -C1-6알크NRaRa, -C1-6알크ORa, -C1-6알크N(Ra)C(=O)Rb, -C1-6알크OC(=O)Rb, -C1-6알크C(=O)NRaRa, -C1-6알크C(=O)ORa, 및 옥소로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되며;
Ra는 독립적으로 각각의 경우, H 또는 Rb이고;
Rb는 독립적으로 각각의 경우, C1-6알크, 페닐, 또는 벤질이며, C1-6알크는 할로, -OH, -OC1-4알크, -NH2, -NHC1-4알크, -OC(=O)C1-4알크, 또는 -N(C1-4알크)C1-4알크로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되고; 페닐 또는 벤질은 할로, C1-4알크, C1-3할로알크, -OH, -OC1-4알크, -NH2, -NHC1-4알크, -OC(=O)C1-4알크, 또는 -N(C1-4알크)C1-4알크로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되는, 방법.
E56. 구현예 E1 내지 E55 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 0개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E57. 구현예 E1 내지 E56 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 1개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E58. 구현예 E1 내지 E57 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1, X2, X3 및 X4 중 2개가 N인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E59. 구현예 E1 내지 E58 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1 및 X3이 각각 N이며; X2가 -CR5이고; X4가 -CR9이며; 화학식 Ia를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
[화학식 Ia]
Figure pct00051
.
E60. 구현예 E1 내지 E59 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 N이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Ib를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
[화학식 Ib]
Figure pct00052
.
E61. 구현예 E1 내지 E60 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1이 N이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Ic를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
[화학식 Ic]
Figure pct00053
.
E62. 구현예 E1 내지 E61 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -CR9이고; 화학식 Id를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
[화학식 Id]
Figure pct00054
.
E63. 구현예 E1 내지 E62 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 X1이 -CR6이며; X2가 -CR5이고; X3이 -CR3이며; X4가 -N이고; 화학식 Ie를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
[화학식 Ie]
Figure pct00055
.
E64. 구현예 E1 내지 E63 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 Ry가 H 또는 메틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E65. 구현예 E1 내지 E64 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j가 각각 H, 할로, C1-6알크, 또는 C1-4할로알크이며; R10a와 R10b 쌍이 각각 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합되어 Rx 고리에 대해 스피로인 포화된 3-원, 4-원, 또는 5-원 단환식 고리를 형성하고; 상기 고리가 0, 1, 2 또는 3개의 N 원자 및 O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 2개의 원자를 함유하는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E66. 구현예 E1 내지 E65 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R10c, R10d, R10e, R10f, R10g, R10h, R10i, 및 R10j가 각각 H, 메틸, 또는 에틸이며; R10a와 R10b 쌍이 각각 이들 각각에 부착된 탄소 원자와 조합되어 Rx 고리에 대해 스피로인 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸 고리를 형성하는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E67. 구현예 E1 내지 E66 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는
Figure pct00056
기가
Figure pct00057
인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E68. 구현예 E1 내지 E67 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -S(=O)(=NH)-, -NHSO2-, -SO2-, -SO2NH-, 또는 -NH-이고; R12가 사이클로프로필, -CH2CH2-OH, -CH(CH3)CH2-OH, -C(CH3)2CH2-OH, 메틸옥세타닐, 또는 tert-부틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E69. 구현예 E1 내지 E68 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -NHSO2- 또는 -NH-이고; R12가 -CH2CH2-OH, -CH(CH3)CH2-OH, 또는 -C(CH3)2CH2-OH인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E70. 구현예 E1 내지 E69 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R1이 -Z-R12 기이며; Z가 -NHSO2-이고; R12가 -CH2CH2-OH인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E71. 구현예 E1 내지 E70 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R2가 -Y-R13 기이며; Y가 -C0-4알크-, -O-C0-4알크-, S, S=O, S(=O)2, 또는 -SO2NH-이고; -R13이 4,4-디플루오로-1-피페리디닐; -CH2CH2-CF3, tert-부틸, 사이클로펜틸, 또는 2-메틸모르폴리닐인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E72. 구현예 E1 내지 E71 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R2가 F, Cl, Br, 메틸, 또는 CF3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기(들)에 의해 치환되는 피페리디닐 또는 모르폴리닐이거나; R2가 -O-CH2CH2-CF3, -SO2NH-C(CH3)3, 또는 -SO2-사이클로펜틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E73. 구현예 E1 내지 E72 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R2가 -Y-R13 기이며; Y가 -C0-4알크-이고; -R13이 4,4-디플루오로-1-피페리디닐 또는 2-메틸모르폴리닐인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E74. 구현예 E1 내지 E73 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R4가 H 또는 메틸인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E75. 구현예 E1 내지 E74 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R5가 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E76. 구현예 E1 내지 E75 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R6이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E77. 구현예 E1 내지 E76 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R7이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E78. 구현예 E1 내지 E77 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R8이 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E79. 구현예 E1 내지 E78 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 R9가 H인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E80. 구현예 E1 내지 E79 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 상기 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법:
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
*실시예 #는 실시예 번호뿐만 아니라 본원에, 예를 들어 실시예에 사용된 KIF18A 저해제 화합물의 약어를 나타낸다.
E81. 구현예 E1 내지 E80 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 상기 화합물이 화합물 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, 또는 C14, 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염 중 임의의 하나인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염인, 방법.
E82. 구현예 E81에 있어서, 상기 염은 설페이트, HCl, 메실레이트, 토실레이트, 또는 베실레이트 염인, 방법.
E83. 구현예 E82에 있어서, 상기 염은 HCl 염인, 방법.
E84. 구현예 E1 내지 E83 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 선택적으로 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 선택적으로 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 선택적으로 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 선택적으로 유도하거나 증가시키고, KIF18A 저해제는 정상 체세포에 독성이지 않은, 방법.
E85. 구현예 E1 내지 E84 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키고, 대상체에서 정상 체세포의 증식은 대조군 대상체의 정상 체세포의 증식과 실질적으로 동일한, 방법.
E86. 구현예 E1 내지 E85 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키고, 정상 체세포의 아폽토시스 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준에 비해 대상체에서 증가되지 않으며, 선택적으로, 정상 체세포의 아폽토시스 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준과 실질적으로 동일한, 방법.
E87. 구현예 E84 내지 E86 중 어느 한 구현예에 있어서, 정상 체세포는 인간 골수 단핵 세포, 인간 유선 상피 세포, 또는 인간 포피 섬유아세포 세포인, 방법.
E88. 구현예 E84 내지 E87 중 어느 한 구현예에 있어서, 정상 체세포는 TP53MUT가 아니거나 정상 체세포는 TP53WT인, 방법.
E89. 구현예 E1 내지 E88 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 다제약물 내성 신생물 질환인, 방법.
E90. 구현예 E1 내지 E89 중 어느 한 구현예에 있어서, 종양 또는 암 세포는 다제약물 내성 종양 또는 암 세포이고/이거나 다제약물 내성 1(MDR-1) 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물의 증가된 발현을 나타내는, 방법.
E91. 구현예 E99에 있어서, 종양 또는 암 세포는 P-당단백질(P-gp)의 증가된 발현을 나타내는, 방법.
E92. 구현예 E1 내지 E91 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 항유사분열제 또는 안트라사이클린 항생제, 선택적으로 파클리탁셀 또는 독소루비신을 이용한 치료에 대해 내성인, 방법.
E93. 항유사분열제 또는 안트라사이클린 항생제로 치료되거나 치료된 적이 있는 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 KIF18A 저해제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E94. 구현예 E1 내지 E93 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 KIF18A 유전자 및/또는 KIF18A 유전자 생성물의 발현을 감소시키는, 방법.
E95. 구현예 E94에 있어서, KIF18A 저해제는 비-코딩 RNA인, 방법.
E96. 구현예 E95에 있어서, KIF18A 저해제는 RNAi를 매개하는, 방법.
E97. 구현예 E1 내지 E96 중 어느 한 구현예에 있어서, KIF18A 저해제는 siRNA인, 방법.
E98. 구현예 E97에 있어서, siRNA는 SEQ ID NO: 12 내지 SEQ ID NO: 18 중 임의의 하나의 서열을 포함하는, 방법.
E99. 구현예 E1 내지 E98 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E100. 구현예 E1 내지 E99 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 Rb1 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E101. 구현예 E1 내지 E100 중 어느 한 구현예에 있어서, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E102. 구현예 E1 내지 E101 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E103. 구현예 E1 내지 E102 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자 및 비활성화된 Rb1 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E104. 구현예 E1 내지 E103 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자 및 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E105. 구현예 E1 내지 E104 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E106. 구현예 E1 내지 E105 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 Rb1 유전자 및 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E107. 구현예 E1 내지 E106 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 Rb1 유전자 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E108. 구현예 E1 내지 E107 중 어느 한 구현예에 있어서, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E109. 구현예 E1 내지 E108 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 및 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E110. 구현예 E1 내지 E109 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E111. 구현예 E1 내지 E110 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E112. 구현예 E1 내지 E111 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 Rb1 유전자, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E113.구현예 E1 내지 E112 중 어느 한 구현예에 있어서, 비활성화된 TP53 유전자, 비활성화된 Rb1 유전자, 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 및 비활성화된 BRCA 유전자에 대해 검정하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 방법.
E114. 구현예 E1 내지 E113 중 어느 한 구현예에 있어서, 신생물 질환은 하나 이상의 전체 게놈 복제 또는 전체 게놈 배가(WGD) 사건을 포함하는 암인, 방법.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 주어지고 임의의 방식으로 이의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
이 실시예는 CDK4/6 저해제 및 Eg5 저해제에 비해 KIF18A 저해제에 대한 민감성에 대한 암 세포주의 분석을 기재한다.
KIF18A 저해제, 화합물 C14를 4-일 이미지-기초 핵 카운트 검정(NCA)에서 유방암 세포주, 난소암 세포주, 및 전립선암 세포주를 포함한 암 세포주 패널을 사용하여 평가하였다. Eg5 운동 저해제(이스피네십)를 세포독성 대조군으로서 사용하였다. CDK4/6 저해제(팔보시클립)를 온전한 Rb 경로를 갖는 세포주에서 활성인 비교제로서 사용하였다(문헌[T VanArsdale et al, Clinical Cancer Research. 2015;1;21:2905-2910]).
인간 암 세포주 및 세포주에 대한 세포 배양 방법의 설명을 도 1a의 표 1A에 제공한다. 모든 인간 암 세포주를 달리 명시되지 않는 한 American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)으로부터 수득하였다. 유방암 세포주 CAL-51을 DSMZ(GmbH)로부터 수득하였다. OVCAR-5 및 P-당단백질(P-gp)을 발현하는 국립 암 연구소(NCI) 난소암 세포주 OVCAR-8_NCI/ADR-RES를 Amgen Cell Bank로부터 수득하였다. MAX401NLPDX 세포주를 Charles River Laboratories로부터 수득하였다. 이 보고서에서 사용된 세포주는 원래 NCI로부터 ACB에 의해 수득된 OVCAR-5 암 세포주를 제외하고는 짧은 탠덤 반복부(STR: Short Tandem Repeats) 방법을 사용하여 ATCC에 의해 인증을 받았고, OVCAR-5 세포에 대해 ATCC로부터 수득된 STR 프로파일은 ExPasy 데이터베이스에 대해 검색되었고 OVCAR-5와 100% 매치를 보여주었다. 모든 세포주 배양물을 37℃및 5% CO2 분위기에서 유지하였다.
암 세포주를 Corning 96-웰 편평 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 플레이트(Corning, NY)에서 100 μL의 적절한 완전 배지에 적절한 밀도로 시딩하고, 24시간 동안 성장시켰다. NCA 연구에 사용된 세포주 시딩 밀도의 설명을 도 1b의 표 1B에 제공한다.
하나의 실험 세트에서, 세포 치료를 위한 조제물에서, 2X 농도의: 화합물 C14, 파블로시클립(Pablociclib)(CDK4/6 저해제), 또는 이스피네십(Eg5 저해제) 중 하나를 BRAVO[스태거드 용량 접근법(staggered dose approach)을 사용하여 10 μM 내지 0.0003 μM(화합물 C14 또는 팔보시클립에 대해) 및 1 μM 내지 0.00003 μM(이스피네십)의 최종 20-점 농도 범위]를 사용하여 100 μL의 완전 배지 내로 일련으로 희석시켰다. 화합물을 0.5% DMSO를 함유하는 완전 배지에서 200 μL의 최종 부피로 세포에 첨가하였다.
제2 실험 세트에서, 세포 치료를 위한 조제물에서, 2X 농도의: 화합물 C14, 올라파립(PARP 저해제), 파클리탁셀(탁산), 독소루비신(안트라사이클린), 및 카르보플라틴(백금) 중 하나를 BRAVO[스태거드 용량 접근법을 사용하여 10 μM 내지 0.0003 μM(화합물 C14), 100 μM 내지 0.003 μM(올라파립, 카르보플라틴), 1 μM 내지 0.00003 μM(파클리탁셀), 및 2 μM 내지 0.00006 μM(독소루비신)의 최종 20-점 농도 범위]를 사용하여 100 μL의 완전 배지 내로 일련으로 희석시켰다. 화합물을 0.5% DMSO를 함유하는 완전 배지에서 200 μL의 최종 부피로 세포에 첨가하였다.
4일(96시간) 또는 6일(144시간)의 치료 후, 각각의 웰로부터 100 μL의 완전 배지를 제거하고 이를 100 μL의 2x 포름알데하이드(최종 4%)로 대체하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 세포를 고정하였다. 고정 후, 세포를 투과시키고, 2 μg/mL Hoechst 33342 DNA 염료를 함유하는 200 μL 세척 완충액(1% BSA, 0.2% Triton X-100, 1X PBS)에서 염색하였다. 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 데이터 획득 시까지 세포를 암실에서 4
Figure pct00061
에서 저장하였다. 이미지화 데이터를 Cellomics ArrayScan VTI HCS 판독기(SN03090745F, ThermoFisher Scientific) 상에서 표적 활성화 V4 검정 프로토콜(10X 대물렌즈와 함께 Ve 6.6.0(Build 8153), 웰당 16-필드를 수집함)을 사용하여 획득하였다. DMSO-치료된 대조군의 ± 3 SD 내에 있는 Hoechst 33342 핵 물질 특질(채널 1에서의 면적, 전체 및 가변 강도)을 사용하여 유효 물질 카운트를 결정하였다. 전체 유효 물질 카운트를 하기 식을 사용하여 카운트 POC(DMSO 대조군의 백분율)로서 나타내었다:
카운트 POC = (처리된 웰에서의 전체 유효 물질 카운트) χ (DMSO 처리된 웰에서의 전체 유효 물질 카운트) x 100.
화합물 농도 및 카운트 POC 값을 GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 플롯화하고, 곡선-적합을 4-파라미터 방정식(가변 기울기)으로 수행하였다. 농도-반응 곡선 및 표준 편차는 2벌로 진행된 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
표 1C(도 1c)는 각각의 세포주 및 수명에 대한 평균 카운트 EC50 값을 나타내고(POC 상단 - 하단), 수명이 50%를 초과하지 않는다면, 세포주는 둔감성으로 여겨졌다. 모든 민감성 세포주에 걸친 평균 카운트 EC50 값(± SD)을 각각의 시험제에 대해 결정하였다.
표 1C에 대한 공통 정보. 세포주 특징(조직 유형, 종양 하위유형, TP53 돌연변이 상태, Rb 경로 상태)을 하기 온라인 데이터베이스로부터 수득하였다(Cancer DepMap and CCLE(https://depmap.org/portal/depmap), Broad Institute; Cell Model Passports(https://cellmodelpassports.sanger.ac.uk/passports), Sanger Institute IARC(http://p53.iarc.fr/OtherResources.aspx), International Agency for Research on Cancer) 및 참조문헌(O'Brien et al, 2018; Konecny et al, 2012; Finn et al, 2009; Dai et al, 2017; Tilley et al, 1990; Witkiewicz et al, 2018).
표 1C에 대한 약어. 미스센스 돌연변이(MM), 넌센스 돌연변이(NM), 프레임 이동 결실(FSD), 프레임 이동 삽입(FSI), 정지 코돈(*), 프레임 이동(fs), 증폭(AMP), 능숙(PROF), 결핍(DEF), 아미노산(A.A.), 양성(POS), 음성(NEG), 에스트로겐 수용체(ER), 및 안드로겐 수용체(AR). MDA-MB-453 HER-2 증폭 상태에 대한 정보는 불확실(?).
표 1C에 대한 참조문헌:
O'Brien N, Conklin D, Beckmann R, Luo T, Chau K, Thomas J, et al. Preclinical activity of abemaciclib alone or in combination with antimitotic and targeted therapies in breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 2018;17(5):897-907.
Konecny GE, et al. Expression of p16 and retinoblastoma determines response to CDK4/6 inhibition in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 2011 Mar 15;17(6):1591-1602.
Finn RS et al. PD 0332991, a selective cyclin D kinase 4/6 inhibitor, preferentially inhibits proliferation of luminal estrogen receptor-positive human breast cancer cell lines in vitro. Breast Cancer Research. 2009;11(5):R77.
Dai X, Cheng H, Bai Z, Li J. Breast cancer cell line classification and its relevance with breast tumor subtyping. Journal of Cancer. 2017;8(16):3131.
Tilley WD, Wilson CM, Marcelli M, McPhaul MJ. Androgen receptor gene expression in human prostate carcinoma cell lines. Cancer Research. 1990 ;50(17):5382-5386.
Witkiewicz AK, Chung S, Brough R, Vail P, Franco J, Lord CJ, Knudsen ES. Targeting the vulnerability of RB tumor suppressor loss in triple-negative breast cancer. Cell reports. 2018;22(5):1185-1199.
도 1c의 표 1C에 제시된 바와 같이, KIA18A 저해제에 대해 민감성을 나타낸 모든 세포주는 돌연변이체 TP53 암 세포주였다. 12개의 세포주 중 7개는 "민감성"으로 채점되었고, 유사한 4-일 평균 카운트 EC50 값(0.0563 μM과 함께 SD ±0.008)을 보여주었다. 4개의 TP53 WT 라인(CAL-51, ZR-75-1, MCF-7, OVCAR-5) 및 1개의 TP53 NULL 라인(MDA-MB-453)을 포함하여 5개의 Rb-능숙 암 세포주는 팔보시클립-민감성 및 KIF18A 저해제-둔감성이었다. 하나(HCC-1937 BRCA1 돌연변이체)를 제외한 모든 KIF18A 저해제-민감성 세포주에서, 세포주는 CCNE1 증폭 또는 RbDEF 상태를 가졌다. 더불어, 이들 데이터는 KIF18A 저해제 및 팔보시클립이 별도의 그리고 대체로 비중첩적인 민감성 프로파일을 가짐을 나타내고, 이는 Rb 경로 상태가 분절화 바이오마커(예를 들어 RB1 소실 및 CCE1 증폭)로서 역할을 할 수 있음을 시사한다. KIF18A 저해제 민감성 프로파일은 이스피네십의 세포독성 효과로부터 명백하게 별도이고, 암 세포주의 하위세트만 상승된 유사분열-특이적 취약성 및 KIF18A 의존도를 나타냄을 시사하는 초점(focal) 민감성 프로파일이 동반된다.
도 2a 내지 도 2f는 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 플롯화된 시험된 세포주 중 6개에 대한 카운트 POC 값의 그래프이다. 도 2a 내지 도 2f의 6개 세포주는 BT-549(TP53MUT 및 RBDEF로서 특징화된 TNBC), OVCAR-3(TP53MUT 및 CCNE1AMP로서 특징화된 HGSOC), DU-145(TP53MUT 및 RBDEF로서 특징화된 CR-PC), CAL-51(TP53WT 및 RBPROF로서 특징화된 TNBC), OVCAR-5(TP53WT 및 RBPROF로서 특징화된 HGSOC), 및 ZR-75(TP53WT 및 RBPROF로서 특징화된 관강 유방암)였다. 도 2a 내지 도 2f의 농도-반응 적합-곡선을 오차 막대(SD)와 함께 대조군(DMSO)의 백분율을 기준으로 평균 카운트로서 나타낸다. 검정을 2개의 독립적인 실험에서 2벌로 수행하였다. 흥미롭게도, KIF18A 저해제에 대해 민감성인 세포주는 CDK4-6 저해제, 팔보시클립에 대해 민감성이지 않았고, 그 반대이기도 하였다. 이들 데이터는, CDK4/6 저해제 민감성 암세포가 KIF18A 저해제에 대해 민감성인 암세포에 대한 음성 예측자로서 역할을 할 수 있고, Rb 경로 비활성화(예를 들어 RB1 소실 및 CCE1 증폭)가 KIF18A 저해제 치료에 대한 잠재적인 반응 바이오마커로서 역할을 할 수 있음을 시사한다.
도 3a 내지 도 3d는 KIF18A 저해제의 농도의 함수로서 플롯화된 시험된 세포주 중 4개에 대한 카운트 POC 값의 그래프 시리즈를 나타낸다. 도 3a 내지 도 3d의 4개 세포주는 OVCAR-8(TP53MUT 및 BRCA1침묵화로서 특징화된 HGSOC), MX-1(삼중 음성 유방암(TP53MUT 및 BRCA1MUT로서 특징화된 TNBC)), MAX401NL PDX(TP53MUT 및 BRCA1MUT로서 특징화된 TNBC), 및 HCC-1937(TP53MUT 및 BRCA1MUT로서 특징화된 TNBC)이었다. 도 3a 내지 도 3d의 각각의 그래프에 도시된 바와 같이, TP53MUT 및 BRCA1-결핍 암 세포주는 0.051 내지 0.082 μM 범위에서 카운트 EC50 값과 함께 KIA18A 저해제를 이용한 치료에 대한 민감성을 실증하였다.
도 3e는 KIF18A 저해제, PARP 저해제, 파클리탁셀, 독소루비신, 또는 카르보플라틴의 농도의 함수로서 플롯화된 OVCAR-8 NCI-ADR RES 하위주에 대한 카운트 POC 값의 그래프이다. 도 3e에 도시된 바와 같이, 세포주는 KIF18A 저해제에 대한 가장 큰 민감성을 실증하였다. OVCAR-8 NCI-ADR RES 세포는 항암제에 대한 다제-약물 내성을 유도하는 것으로 알려진 약물 펌프 MDR1 또는 ABCB1 유전자(P-당단백질을 인코딩함)를 과발현하고(문헌[A Vert et al OncoTargets and Therapy 2018:11;221-37]), 이러한 데이터는 약물-유출로 인한 KIF18A 저해제 민감성이 올라파립, 파클리탁셀, 및 독소루비신에 비해 단지 중간 정도 영향을 받음을 시사한다. 더욱이, 다수의 ABCB1 전사 융합은 화학치료법 내성 재발성 난소암에서 보고되었다(문헌[EL Christie et al Nature Communications. 2019:20;10:1-10]).
실시예 2
이 실시예는 KIF18A 저해제 화합물 C9에 대한 민감성에 대한 암 세포주의 분석을 실증한다.
KIF18A 저해제 화합물 C9에 대한 암 세포주 민감성 프로파일을 식별하기 위해 분석을 수행하였다. 이 분석에서, 상이한 인간 유방 및 난소 암 세포주의 패널(도 4a의 표 2 및 도 4b의 표 3)을 4일 또는 6일 암 세포주 성장 검정 스크린에 사용하였다.
4일 성장 검정 스크린에서, 암 세포주를 사전-최적화된 시딩 밀도에서 96-웰 조직 배양 플레이트에서 처리하였다. 성장 배지 조건을 ChemPartners(Shanghai, China)에 의해 결정하였다. 24시간 후, 세포를 CellTiter-GLO 2.0 판독물(CTG, Promega)을 사용하여 생존 세포의 지표로서 ATP의 정량화에 기초한 4일 세포 성장 검정에서 KIF18A 저해제(화합물 C9; 최종 10-점 농도 범위 2.0 μM 내지 0.0001 μM, 3배 희석)로 처리하였다. CTG 검정을 각각의 세포주에 대해 2벌로 수행하였다. 검출을 발광 플레이트 판독기를 사용하여 수행하고, POC(DMSO 대조군의 백분율)에 기초한 상대 발광 단위(RLU)로서 표현하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 4-파라미터 방정식(가변 기울기)을 이용한 곡선-적합 분석을 위해 원(raw) 데이터를 Amgen에게 제공하였다. 농도-반응 곡선 및 표준 편차를 그래프화하였다(대표적인 곡선은 도 4c 및 4d에 도시됨). 각각의 암 세포주 및 분류된 세포주에 대한 EC50(IP) 및 수명에 대한 값(적합점에 대한 최대 반응과 최소 반응 사이의 차이)은 EC50 값 < 0.1 μM 및 수명 ≥ 40일 때 KIF18A 저해제 화합물에 대해 민감성인 것으로 보고되었다.
확장된 스크린을 6일 성장 검정을 사용하여 수행함에 따라, 암 세포주를 블랙 384-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 500개 내지 1500개 세포로 처리하였다. 성장 배지 조건을 Horizon Discovery(Cambridge, United Kingdom)에 의해 결정하였다. 24시간 후, 세포를 CellTiter-GLO 2.0 판독물(Promega)을 사용하여 생존 세포의 지표로서 ATP의 정량화에 기초한 6일 세포 성장 검정에서 KIF18A 저해제(화합물 C9; 최종 11-점 농도 범위 2.0 μM 내지 0.0000339 μM, 3배 희석)로 처리하였다. 발광을 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 수행하고, POC(대조군의 백분율)에 기초한 상대 발광 단위(RLU)로서 표현하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 4-파라미터 방정식(가변 기울기)을 이용한 곡선-적합 분석을 위해 원 데이터를 Amgen에게 제공하였다. 농도-반응 곡선 및 표준 편차를 그래프화하였다(대표적인 곡선은 도 4e 및 4f에 도시됨). 곡선-적합 분석을 또한 Horizon 소유의 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각각의 암 세포주 및 분류된 세포주에 대한 EC50(IP) 및 최대 반응(관찰치)에 대한 Horizon 발견 보고된 값은 EC50 값 < 0.1 μM 및 최대 반응 ≥ 59.5일 때 KIF18A 저해제 화합물에 대해 민감성인 것으로 보고되었다.
추가로, 세포 카운트 세포주 성장 검정 스크린을 하기와 같이 KIF18A 저해제로 수행하였다: 유방 및 난소 암 세포주의 하위세트를 상기 기재된 바와 같이 이미지화-기초 핵 카운트 검정(NCA)을 사용하여 KIF18A 저해제 화합물 C9로 스크리닝하였다. 내부 데이터 KIF18A 저해제 4일 또는 6일 NCA였다. 곡선-적합을 Amgen에서 GraphPad Prism 7을 사용하여 수행하였다. 보고된 값은 하기와 같았다: 각각의 암 세포주 및 분류된 세포주에 대한 EC50(IP) 및 수명(적합점에 대한 최대 반응과 최소 반응 사이의 차이)은 IC50 값 < 0.1 μM 및 수명 ≥ 40일 때 KIF18A 저해제 화합물에 대해 민감성인 것으로 보고되었다.
세포 카운트 검정의 결과를 표 2와 표 3 및 도 4c 내지 도 4f에 나타낸다. 표 2는 인간 유방암 세포주 패널에 대한 분석의 요약이고, 표 3은 인간 난소암 세포주 패널에 대한 분석의 요약이다.
표 2 및 표 3에서, "?"는 제1 스크린과 제2 스크린 사이에서 민감성 콜(call)의 차이가 존재하였음을 의미하고, "ND"는 결정되지 않았음을 의미한다. 제1 스크린 또는 제2 스크린을 통해 스크린을 수행하였다. 제1 스크린(ChemPartner, CP)은 4일 CellTiter-Glo® 검정(CTG) 검정이었다. GraphPad Prism 7을 사용하여 곡선-적합을 수행하였다. 표 2 및 표 3에서 보고된 값은 하기와 같다: EC50 값(IP) 및 수명 또는 최대 반응(적합점에 대한 최대 반응과 최소 반응 사이의 차이). 제1 스크린 민감성 채점[민감성 세포주 군은 EC50 값 < 0.1 μM과 함께 수명 ≥ 40으로서 정의됨]. 제2 스크린(Horizon Discovery, HR)은 6일 CTG 검정이었다. 곡선-적합을 HR에 의해 수행하였다. 표 2 및 표 3에서 보고된 값은 하기와 같다: EC50 값(IP) 및 최대 반응(관찰치). 제2 스크린 민감성 채점[민감성 세포주 군은 EC50 값 < 0.1 μM과 함께 수명 ≥ 59.5로서 정의됨]. 제3 스크린(Amgen, AM)이 수행되었고, 이는 4일 또는 6일 핵 카운트 검정(NCA)이었다. GraphPad Prism 7을 사용하여 곡선-적합을 수행하였다. 표 2 및 표 3에서 보고된 값은 하기와 같다: EC50 값(IP) 및 수명(적합점에 대한 최대 반응과 최소 반응 사이의 차이). 제3 스크린 민감성 채점 [민감성 세포주 군은 EC50 값 < 0.1 μM과 함께 수명 ≥ 40으로서 정의됨].
도 4a 내지 도 4f에 대한 공통 정보. 세포주 특징(조직 유형, 종양 하위유형, TP53 돌연변이 상태, TP53 변이체 유형, p53 단백질 변화)을 하기 온라인 데이터베이스로부터 수득하였다(Cancer DepMap and CCLE (https://depmap.org/portal/depmap), Broad Institute; Cell Model Passports (https://cellmodelpassports.sanger.ac.uk/passports), Sanger Institute IARC (http://p53.iarc.fr/OtherResources.aspx), International Agency for Research on Cancer) 및 참조문헌(문헌[Dai et al Journal of Cancer, 2017]; 문헌[O'Brien et al Mol. Cancer Ther., 2018]; 문헌[Domcke et al Nature Comm., 2013]).
표 2 및 표 3에 대한 약어. ChemPartner 스크린(CP), Horizon 발견 스크린(HR), Amgen 스크린(AM), 결정되지 않음(ND), (TNBC), 고등급 장액성 난소암(HGSOC), 에스트로겐 수용체(ER), 음성(NEG), 양성(POS), HER2 수용체 양성(HER2), 관강 A(LumA), 관강 B(LumB), 돌연변이체(MUT), 야생형(WT), 발현의 소실(LOE), 미스센스 돌연변이(MM), 넌센스 돌연변이(NM), 프레임 이동 결실(FSD), 프레임 이동 삽입(FSI), 정지 코돈(*), 프레임 이동(FS), 스플라이스 부위(SS), 인 프레임 결실(IFD), 인 프레임 삽입(IFI), 침묵(S), 아미노산(A.A.), CP 스크린과 HR 스크린 사이에서 콜의 민감성 컬럼 차이(?), 및 종양 하위유형 및 TP53 공통 컬럼 콜 불확실(?).
종양 하위유형: 문헌[Source XDai et al Journal of Cancer_2017, O'Brien et al Mol. Cancer Ther._2018 (유방암)], 문헌[Domcke et al _Nature Comm 2013 (난소암)]. TNBC 삼중 음성 유방암, HGSOC = 고등급 장액성 난소암, ER = 에스트로겐 수용체, NEG = 음성, POS = 양성, HER2 = HER2 수용체 양성, LumA = 관강 A, LumB = 관강 B, ? = 하위유형 불확실.
TP53 상태: Source CCLE/Sanger/IARC 콜: 공통 콜이 불확실하다면, 문헌 또는 목록에서 불확실(?)로 표시된다. MUT(돌연변이체), WT(야생형), LOE(발현 소실). 변이체 분류. MM(미스센스_돌연변이), NM(넌센스_돌연변이), SS(스플라이스_부위), IFD(인_프레임_Del), FSI(프레임_이동_Ins), FSD(프레임_이동_Del), NULL, IFI(인_프레임_Ins), 침묵.
표 2 및 표 3에 대한 참조문헌.
Dai X, Cheng H, Bai Z, Li J. Breast cancer cell line classification and its relevance with breast tumor subtyping. Journal of Cancer. 2017;8(16):3131.
O'Brien N, Conklin D, Beckmann R, Luo T, Chau K, Thomas J, et al. Preclinical activity of abemaciclib alone or in combination with antimitotic and targeted therapies in breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 2018;17(5):897-907.
Domcke S, Sinha R, Levine DA, Sander C, Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nature Communications, 2013; 4(1): 1-10.
표 2에서와 같이, KIA18A 저해제를 이용한 치료에 대한 유방암 세포주 민감성은 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성이었고, 이들 중 많은 것은 미스센스 돌연변이로 인해 돌연변이체 TP53 단백질을 발현하였다. 2개의 TNBC 라인(CAL-51, DU4475)을 포함하여 9개의 TP53 야생형 유방암 세포주 중 어느 것도 KIF18A 저해제에 대해 민감성이지 않았다. KIA18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 모든 유방암 세포주는 음성 에스트로겐 수용체(ER) 상태를 가졌고, 이들 세포주 중 약 3/4이 또한 음성 HER2 상태를 가졌다. 관강 A 또는 관강 B 유방암 세포주 중 어느 것도 KIF18A 저해제에 대해 민감성이지 않았다.
표 3에 제시된 바와 같이, KIA18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 난소암 세포주는 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성이었고, 이들 중 많은 것은 미스센스 돌연변이로 인해 돌연변이체 TP53 단백질을 발현하였다. 9개의 TP53 야생형 난소암 세포주 중 어느 것도 KIF18A 저해제에 대해 민감성이지 않았다. 이들 암 세포주 중 대부분에 대해, 종양 하위유형은 분자 분류에 기초하여 고등급 장액성 난소암(HGSOC)일 "가능성이 크거나" "가능성이 있었다"(문헌[S. Domcke et al Nature Communications 2013:4:1-10]).
제1 스크린(도 4c 및 도 4d) 및 제2 스크린(도 4e 및 도 4f)으로부터의 대표적인 농도-반응 곡선을 도 4c 내지 도 4f에 각각 도시한다. 도 4c 내지 도 4f에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제 민감성 프로파일을 유방 및 난소 암 세포주에 대해 "민감성" 도 4c, 4e) 및 "둔감성"(도 4d, 4f)으로 군을 만들었다.
실시예 3
이 실시예는 KIF18A 저해제 화합물 C14가 암컷 무흉선 누드 마우스에서의 인간 OVCAR-3 HGSOC 이종이식 모델(TP53 MUT, CCNE1 AMP)에서 종양 퇴화를 유도함을 실증한다.
KIF18A 저해제가 종양 퇴화에 미친 효과를 실증하기 위해, OVCAR-3 세포를 생체 내에서 그리고 후속적으로 재선택하였다(OVCAR-3SQ3). 암컷 무흉선 누드 마우스의 우측 옆구리에 0.1 mL 중 5 x 106개 세포를 피하 주사하였다. 종양이 확립된 후(150 mm3의 평균 종양 부피), 동물을 4개의 치료군(비히클 단독, 10, 30, 또는 100 mg/kg에서 KIF18A 저해제)으로 군당 10 마리의 동물로 무작위화하고, 종양 이식 후 제25일에 시작하여 일당 1회 경구(PO, QD) 치료하였다. PRO-MAX 전자 디지털 캘리퍼(Japan Micrometer Mfg. Co. LTD)로 측정된 종양의 길이, 폭 및 높이로부터 종양 측정을 계산하였다. 종양 부피를 [L x W x H]로서 계산하고, mm3로 표현하였다. 종양 부피 및 동물 체중 측정을 주당 2회 결정하였다(연구 시작 제25일, 연구 종료 제45일). 화합물과 관련이 없는 가능성이 큰 발견인 복부 팽만으로 인해 단일 마우스를 연구(KIF18A 저해제 30 mg/kg 군)로부터 제거하였다.
종양 성장 저해(TGI) 및 종양 퇴화 식.
Figure pct00062
GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 데이터를 플롯화하였고, 종양 부피 및 체중 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차로서 표현하고, 시간의 함수로서 플롯화한다. 성장 곡선 사이에서 관찰된 차이의 통계학적 유의성을 SLACR 패키지(v.1.0.3)를 사용하여 계산하였다. 종양 퇴화에 대한 통계학적 유의성을 모든 3개의 KIF18A 저해제 치료군에 대한 유의한 종양 퇴화 p-값(***p ≤ 0.0001)과 함께 초기 및 최종 종양 부피에서 대응 스튜던츠 t-검정에 의해 수행하였다. KIF18A 저해제 용량 10 mg/kg(81% 퇴화, 10 중 5 무종양), 30 mg/kg(98% 퇴화, 9 중 8 무종양), 및 100 mg/kg(97% 퇴화, 10 중 7 무종양)이었다. 명시적인 독성의 어떠한 증거도 동물 체중의 변화에 의해 결정된 바와 같이 비히클 치료군에 비해 KIF18A 저해제 치료군에서 관찰되지 않았다.
결과를 도 5a 및 도 5b에 도시한다. 도 5a에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제의 경구 일일 투여는 OVCAR-3 HGSOC 종양(TP53 돌연변이체, CCNE1 증폭)의 성장을 유의하게 저해하였고, 모든 3개 용량에서 퇴화를 유도하였다. KIF18A 저해제의 중단 후 종양 재성장 잠재력의 평가는 명시적인 독성의 증거 없이 동물 중 50% 이상에서 지속적인 종양 퇴화 치유를 보여주었으며, 이는 KIF18A 저해제의 내약성이 양호하였음을 나타낸다.
실시예 4
이 실시예는 KIF18A 저해제 화합물 C14가 암컷 무흉선 누드 마우스에서의 인간 OVCAR-3 HGSOC 이종이식 모델(TP53 MUT, BRCA1 침묵화 )에서 종양 퇴화를 유도함을 실증한다.
암컷 무흉선 누드 마우스의 우측 옆구리에 0.1 mL 중 5 x 106개 OVCAR-8 세포를 피하 주사하였다. 종양이 확립된 동물(약 134 mm3의 평균 종양 부피)을 4개의 치료군(비히클 단독, 10, 30, 또는 100 mg/kg에서 화합물 C14)으로 군당 10 마리의 동물로 무작위화하고, 종양 이식 후 제25일에 시작하여 일당 1회 경구(PO, QD) 치료하였다. 종양 부피 및 동물 체중 측정을 주당 2회 결정하였다(연구 시작 제25일, 연구 종료 제45일). 종양 측정, 식, 및 퇴화 분석은 도 5a 및 도 5b에 대해 상기에서 기재된 바와 같다. GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 데이터를 플롯화하였고, 종양 부피 및 체중 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차로서 표현하고, 시간의 함수로서 플롯화한다. 성장 곡선 사이에서 관찰된 차이의 통계학적 유의성을 SLACR 패키지(v.1.0.3)를 사용하여 계산하였다. 종양 성장 저해에 대한 통계학적 유의성을 비히클군에 비한 던넷 비교와 함께 RMANOVA에 의해 화합물 C14 10 mg/kg 군(57% TGI, p 0.003)에 대해 결정하였다. 종양 퇴화에 대한 통계학적 유의성을 화합물 C14 30 mg/kg(86% 퇴화, p ≤ 0.0001, 10 중 4 무종양), 및 화합물 C14 100 mg/kg(98% 퇴화, p ≤ 0.0001, 10 중 8 무종양)과 함께 초기 및 최종 종양 부피에서 대응 스튜던츠 t-검정에 의해 수행하였다. 명시적인 독성의 어떠한 증거도 동물 체중의 변화에 의해 결정된 바와 같이 비히클 치료군에 비해 화합물 C14 치료군에서 관찰되지 않았다.
결과를 도 6a 및 도 6b에 도시한다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제의 경구 일일 투여는 명시적인 독성의 어떠한 증거 없이 OVCAR-8 HGSOC 종양(TP53 돌연변이체, BRCA1침묵화)의 성장을 유의하게 저해하였고, 30 mg/kg 및 100 mg/kg 용량에서 퇴화를 유도하였으며, 이는 KIF18A 저해제의 내약성이 양호하였음을 나타낸다.
실시예 5
이 실시예는 KIF18A 저해제가 암세포의 유사분열 표현형에 미치는 효과를 분석하기 위한 연구를 기재한다.
KIF18A 저해제가 암세포의 유사분열 표현형에 미치는 효과를 분석하기 위해, KIF18A 저해제를 사용하여 수행된 이미지화-기초 중심체 카운트 검정(CCA)을 수행하였다. 평판배양을 위한 조제물에서, MDA-MB-157 TNBC 세포를 10 mL 주사기를 통해 18-G 바늘을 이용하여 7회 재현탁시켜 단일-세포 현탁액을 만들었다. BRAVO 자동화된 액체 취급 플랫폼(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 세포를 웰당 30,000개 세포의 밀도로 Corning 96-웰 편평 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 플레이트(Corning, NY) 내로 100 μL의 완전 배지에 시딩하고, 24시간 동안 성장시켰다. 세포 치료를 위한 조제물에서, 2X 농도의 KIF18A 저해제 화합물 C14를 BRAVO(스태거드 용량 접근법을 사용하여 최종 20-점 농도 범위 5.0 μM 내지 0.00015 μM)를 사용하여 100 μL의 완전 배지 내로 일련으로 희석시킨 다음, 0.5%의 최종 DMSO 농도와 함께 평판배양된 세포를 함유하는 100 μL의 완전 배지에 첨가하였다. 24시간의 치료 후, 100 μL의 완전 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 잔여 100 μL 완전 배지를 함유하는 각각의 웰에 100 μL 포름알데하이드(최종 4%)를 첨가함으로써 세포를 고정하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 고정 후, 액체를 제거하고, 세포를 200 μL 세척 완충액(1% BSA, 0.2% Triton X-100, 1X PBS)에서 세척하였다. 세척 완충액을 웰당 100 μL의 차단 완충액(5 mL 세척 완충액당 2 방울의 말 혈청(Vector Labs, Burlingame, CA))으로 대체하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 세포를 웰당 200 μL의 세척 완충액으로 세척하였다. 세포를 실온에서 2시간 동안 100 μL 세척 완충액 중 항-p-히스톤 H3 마우스 항체(0.5 μg/mL, 05-806, aka pH3 또는 p-HH3, Millipore) 및 항-페리센트린 토끼 항체(0.5 μg/mL, ab4448-100, Abcam)로 염색하였다. 세포를 200 μL 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 암실에서 실온에서 2시간 동안 Hoechst 33342 DNA 염료(2 μg/mL)를 함유하는 세척 완충액에서 Invitrogen 염소 항-마우스 IgG-alexa-647(A21236) 및 염소 항-토끼 IgG-alexa-488(A11034)로 1 μg/mL로 염색하였다. 세포를 웰당 200 μL의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 150 μL의 1X PBS를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하였다(Perkin Elmer, Waltham, MA). 20X 대물렌즈와 함께 SpotDetector.V4 검정 프로토콜(Ver 6.6.0 (Build 8153)을 사용하는 Cellomics ArrayScan VTI HCS 판독기(SN03090745F, ThermoFisher Scientific) 상에서 이미지화 데이터를 획득하였고, 실험 #1은 웰당 100-필드로 수집되었고; 실험 #2는 웰당 67-필드로 수집되었다. 우선, 획득된 유사분열 지수 데이터(p-히스톤 H3 양성 물질의 백분율)를 상기 기재된 바와 같이 획득하였다. 다음, 채널 스왑(핵 물질 대신에 분절화를 위한 1차 물질로서 p-히스톤 H3 양성 물질을 사용함)과 함께 가상 스캔을 실시하여, 각각의 유사분열 물질에 대한 페리센트린 반점의 수를 열거하였다. 2개 초과의 페리센트린 반점(중심체 수에 대한 대리물)을 갖는 유사분열 물질의 백분율을 각각의 웰에 대해 결정하였다. p-히스톤 H3 양성 물질의 최소 수를 DMSO 대조군에 대해 웰당 250개 물질로서 설정하였다. 데이터 출력은 하기를 포함한다:
(1) 유효 물질 카운트. 이는 웰당 전체 유효 핵 물질 카운트를 나타낸다(Object.Area.Ch1 및 Object.VarIntensity.Ch1에 기초하여 이를 유효 물질에 대한 범위를 설정하는 데 사용하였고, 이 범위 밖의 물질은 거부되었음).
(2) 선택된 물질 카운트, pHH3. 이는 alexa-647(채널 3)을 사용하여 설정된 형광 강도 역치에 기초하여 전체 유효 p-히스톤 H3 양성 유사분열 물질 카운트를 나타낸다.
(3) 선택된 물질 pHH3%. 이는 p-히스톤 H3 양성 물질의 백분율을 나타낸다[(선택된 물질 카운트, pHH3 χ 유효 물질 카운트) x100].
(4) HIGH_ObjectSpotTotalCountCh2%.
GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 각각의 KIF18A 저해제 농도에 대한 p-히스톤 H3 양성 유사분열 물질의 백분율을 플롯화하고, 4-파라미터 방정식(가변 기울기)를 사용하여 농도-반응 곡선을 적합화하였다. 평균 EC50 값 및 표준 편차를 2벌로 진행된 2개의 독립적인 실험으로부터 결정하였다.
DMSO-치료된 세포 및 KIF18A 저해제-치료된 세포의 대표적인 필드-수준 이미지를 도 7a에 제공한다. 2개 초과의 페리센트린 반점을 갖는 유사분열 물질의 평균 백분율 또는 p-히스톤 H3 양성 물질의 평균 백분율을 보여주는 KIF18A 저해제 농도-반응 적합-곡선을 도 7b에 제공한다. 오차 막대(SD)를 제시한다. 페리센트린 반점 카운트 및 p-히스톤 H3에 대한 평균 EC50 값을 도 7c의 표에 제시한다.
도 7a의 검정색 물질은 p-히스톤 H3 양성 유사분열 세포를 나타낸다. 각각의 p-히스톤 H3 양성 유사분열 세포에 대해 회색 반점(페리센트린 양성)이 열거된다. 도 7a 내지 도 7c에 도시된 바와 같이, KIA18A 저해제를 이용한 치료는 0.0794 μM의 EC50 값과 함께 p-히스톤 H3 양성 세포에서의 증가에 의해 측정되는 유사분열에서의 방추사 조립 검문소(SAC)를 활성화시킨다. KIF18A 저해제는 EC50 값 0.0522 μM과 함께 페리센트린 반점(유사분열 물질당 2개 초과의 반점)에서의 농도-의존적 증가를 유도하였고, 이는 p-히스톤 H3 검정 EC50 값과 유사하였으며, 이들 유사분열 표현형은 MDA-MB-157 세포에서 커플링될 가능성이 크다는 것을 시사한다. 종합하자면, 이들 데이터는 KIF18A 저분자 저해제를 이용한 KIF18A ATPase 운동 활성의 저해가 유사분열 세포 억제 및 과도한 페리센트린 반점을 유발함을 시사한다.
실시예 6
이 실시예는 KIF18A 저해제가 암세포의 아폽토시스 및 유사분열 중심체/염색체 특질에 미치는 효과를 분석하기 위한 연구를 기재한다.
KIF18A 저해제가 암세포의 아폽토시스 및 유사분열 중심체/염색체 특질에 미치는 효과를 분석하기 위해, CAL-51 및 MDA-MB-157 TNBC 세포에서의 중심체 특질을 면역형광 이미지화 분석에 의해 분석하였다. 세포를 세포 담체 Ultra 96-웰 폴리스티렌 플레이트(PerkinElmer) 내로 200 μL의 완전 배지에서 시딩하고, 성장시켰다. 24시간 후, 세포를 DMSO(0.05%) 또는 KIF18A 저해제 화합물 C11(0.5 μM)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 실온에서 2% 포름알데하이드로 20분 동안 고정하고, 뒤이어 실온에서 0.1% Triton X-100을 포함하는 1X PBS에서 20분 동안 투과시켰다. 세포를 200 μL 세척 완충액(1X PBS/0.5% BSA, Rockland Immunochemicals)으로 2회 세척하였다. 세포를 200 μL 세척 완충액 중 100 μL 항-CETN3 마우스 항체(1:2000, H00001070-M01, Abnova) 및 항-페리센트린 토끼 항체(1:2000, ab4448-100, Abcam)로 염색하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 세포를 200 μL 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 세척 완충액 중 100 μL 2차 항체[염소 항-마우스 IgG-alexa-488(1:1000, A11029, Invitrogen) 및 염소 항-토끼 IgG-alexa-647(1:1000, A21244, Invitrogen)]로 빛으로부터 보호된 채로 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 세포를 2회 세척하고, 뒤이어 Hoechst 33342 DNA 염료(2 μg/mL)를 함유하는 100 μL 세척 완충액을 첨가하였다. 세포를 405 nm(Hoechst), 488 nm(alexa-488), 및 647 nm(alexa-647)의 레이저 여기 파장을 갖는 60x 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 PerkinElmer Ultraview Vox 듀얼 스피닝 디스크 공초점 현미경 상에서 이미지화하였다. 대표적인 최대 투사 이미지를 각각의 치료 웰로부터의 유사분열 물질에 대해 수집하였다. 이미지를 도 8a에 도시한다.
별개의 실험에서, 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였다. 간략하게는, CAL-51 및 MDA-MB-157 TNBC 세포주를 완전 성장 배지에서 각각 웰당 125,000개 및 150,000개 밀도로 6-웰 플레이트 내로 시딩하였다. 다음날, 세포를 3 mL의 완전 배지에서 0.5%의 최종 DMSO 농도에서 DMSO, KIF18A 저해제(0.5 μM), 또는 Eg5 저해제 이스피네십(0.05 μM)으로 처리하였다. 48시간 후, 세포 용해물을 각각의 치료군에 대해 제조하였다(3개 웰로부터의 조합된 배지 및 세포). 세포를 용해시키고, 웨스턴 블로팅을 실시예 5에서 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다. 1차 항체는 마우스 항-절단-PARP(cl-PARP) (#51-900017, BD Pharmingen, 1:500), 마우스 항-사이클린 B1(554179, BD Pharmingen, 1:500), 및 토끼 항-GAPDH (2118, Cell Signaling, 1:10,000)를 포함하였다. 결과는 도 8b에 제시된다.
도 8a 및 도 8b에 제시된 바와 같이, KIF18A 저해제를 이용한 TNBC 세포주의 처리는 MDA-MB-157 TP53 돌연변이체 및 CCNE1 증폭된 세포에서만 유사분열 세포 중심체 특질(중심립 주변물질과 중심립 수치 변화 및 단편화) 및 아폽토시스의 변경을 선택적으로 유도한 반면, CAL-51 TP53 야생형 세포는 DMSO 처리된 세포에 비해 중심체 특질 또는 아폽토시스에서 어떠한 변화도 보여주지 않았다. 종합하자면, 이들 데이터는 TP53 돌연변이체 TNBC 세포가 적절한 염색체 정렬 및 격리를 위해 KIF18A 운동 활성에 의존하고, KIF18A 저해가 SAC 활성화 및/또는 일탈된 중심체 특질을 유발하여 다극성 방추체 및 아폽토시스를 초래함을 시사한다.
실시예 7
이 실시예는 KIF18A 저해제로 처리된 HGSOC 세포에서 세포 주기 및 아폽토시스 단백질 발현의 시간 경과 연구를 실증한다.
OVCAR-3 HGSOC 세포를 10 mL의 완전 성장 배지에서 100 mm 조직 배양 플레이트 내로 140만개 세포의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 2 mM 티미딘을 함유하는 완전 성장 배지를 세포에 첨가하고, 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1X PBS에서 3회 세척한 후, 완전 성장 배지를 8시간 동안 첨가하고, 뒤이어 제2의 2 mM 티미딘 블록을 16시간 동안 첨가하였다. 이중 티미딘 블록은 세포 주기의 G1/S 기에서 세포를 억제시켰다. 세포를 우선 1X PBS에서 3회 세척한 후 완전 성장 배지를 DMSO 또는 KIF18A 저해제(0.5 μM에서 화합물 C11)와 함께 첨가함으로써 G1/S 블록으로부터 방출시켰다. 세포 용해물을 다수의 시점(4, 8, 10, 12, 14, 및 24시간)에서 제조하였다. 대조군으로서, 비동기적으로(asynchronous) 성장하는 OVCAR-3 세포를 DMSO 또는 KIF18A 저해제(0.5 μM에서 화합물 C11)로 처리하고, 용해물을 24시간째에 제조하였다. 1차 항체는 마우스 항-절단-PARP(cl-PARP)(51-900017, BD Pharmingen, 1:500), 마우스 항-사이클린 B1(554179, BD Pharmingen, 1:500), 토끼 항-Mcl-1(5453, Cell Signaling, 1:500), 마우스 항-사이클린 E1(MS-870-P, HE12, Neomarkers, 1:2000), 마우스 항-BubR1(612503, BD Pharmingen, 1:5000), 및 토끼 항-KIF18A(HPA039484, Simga, 1:2000), 및 마우스 항-β-액틴(A5441, Simga, 1:5000)을 포함하였다. 결과는 도 9에 제시된다.
블롯의 이미지는 도 9에 제시된다. 도 9에 제시된 바와 같이, KIF18A 저해제-치료된 세포는 사이클린 B1 및 cl-PARP 단백질 수준의 증가 및 Mcl-1 및 사이클린 E1 수준의 저하를 보여주었다. 또한, KIF18A 및 BubR1 단백질 수준의 증가가 제시된다. 도 9에서, "FL"은 전장 사이클린 E1 단백질을 지칭하고, "LMW"는 사이클린 E1의 저분자량 형태를 지칭한다. BubR1 단백질은 번역후 변형, 예를 들어 인산화된 형태 및 비-변형된 형태로 인해 단백질 이중체(doublet)로서 블롯화된다.
결과는, OVCAR-3 HGSOC 세포의 KIF18A 저해제 처리가 세포 주기와 유사분열 진행(사이클린 B1, 사이클린 E1, BubR1, KIF18A) 및 아폽토시스(Mcl-1, cl-PARP)를 조절하는 단백질에서 두드러진 변화를 보여주고, 이들 변화는 KIF18A 저해제 민감성 암에서 표적 참여(target engagement)의 마커로서 역할을 할 수 있었음을 시사한다.
실시예 8
이 실시예는 KIF18A 저해제로 처리된 TNBC 세포(TP53 돌연변이체, RB1 결핍)에서 유사분열, DNA 손상 및 아폽토시스에 미치는 효과를 실증한다.
유사분열에 미치는 효과를 분석하기 위해, BT-549 TNBC 세포를 4 mL의 완전 성장 배지에서 3벌 중복 웰에서 6-웰 플레이트 내로 웰당 100,000개의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 세포를 4 mL의 완전 배지 중 0.5%의 최종 DMSO 농도에서 DMSO, KIF18A 저해제 #1(화합물 C11, 0.5 μM), 또는 KIF18A 저해제 #2(화합물 C9, 0.01 μM)로 처리하였다. 48시간 후, 세포 용해물을 각각의 치료군에 대해 프로테아제 저해제 칵테일(cOmpletea, Roche) 및 포스파타제 저해제(PhosphoStop, Roche)가 보충된 MinuteTM 전체 단백질 추출 키트(SD-001, Invent Biotechnologies) 용해 조건을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 제조하였다(3개 웰로부터의 조합된 배지 및 세포). 1차 항체는 토끼 항-p-히스톤 H3(세린-10)(06-570, Millipore, 1: 2000), 마우스 항-γH2A.X(세린-139) (05-636, Millipore, 1: 2000), 마우스 항-절단-PARP(cl-PARP)(#51-900017, BD Pharmingen, 1:500), 마우스 항-BubR1(612503, BD Pharmingen, 1:5000), 마우스 항-전체 HEC1(ab3613, ABCAM, 1: 1000), 토끼 항-pHEC1(세린-55)(GTX70017, Genetex, 1: 500), 및 토끼 항-GAPDH(2118, Cell Signaling, 1:10,000)을 포함하였다. 웨스턴 블롯의 이미지를 도 10a에 도시한다.
또한, BT-549 TNBC 세포에서의 cGAS 및 γH2A.X(세린-139) 면역염색을 수행하였다. 세포를 완전 성장 배지에서 챔버당 50,000개 세포의 밀도로 Lab-Tek 2-웰 챔버 슬라이드 내로 시딩하고, 2일 동안 대략 50% 합류도(confluency)까지 성장시켰다. 세포를 2 mL의 완전 배지 중 DMSO(0.1%), KIF18A 저해제(화합물 C9, 0.2 μM)로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 실온에서 4% 포름알데하이드에서 15분 동안 고정시키고, 뒤이어 4℃에서 빙냉 90% 메탄올에서 10분 동안 2차 고정시켰다. 고정 후, 세포를 2 mL 세척 완충액(1% BSA, 0.2% Triton X-100, 1X PBS)에서 세척하고, 1 mL의 차단 완충액(5 mL 세척 완충액당 2 방울의 말 혈청Vector Labs, Burlingame, CA))으로 차단시켰다. 세포를 실온에서 1 mL 세척 완충액 중 항-cGAS 토끼 항체(1:500, 15102, Cell Signaling) 및 항-γH2A.X(세린-139) 마우스 항체(1:1000, 05-636, Millipore)로 2시간 동안 염색한다. 세포를 2 mL 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 DAPI DNA 염료(1:5000, 268298, Millipore)를 함유하는 세척 완충액 중 2차 항체[염소 항-마우스 IgG-alexa-488(1:2000, A11029, Invitrogen) 및 염소 항-토끼 IgG-alexa-568(1:2000, A11036, Invitrogen)로 빛으로부터 보호된 채로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 세포를 2 mL로 2회 세척하고, 챔버를 제거하고, 1 방울의 ProLong 항-Fade(P36934, Invitrogen)를 첨가한 후, 커버슬립을 유리 슬라이드 상으로 마운팅하였다. Elements 소프트웨어를 실행하는 업라이트 Nikon Eclipse NI-E 에피-형광 현미경 상에서 40x 대물렌즈를 사용하여 와이드-필드 이미지를 포착하였다. 40x 와이드 필드 대물렌즈로 촬영된 대표적인 이미지를 도 10b에 제공한다.
도 10a에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제를 이용한 TP53 돌연변이체 및 RB1 소실 TNBC 세포의 처리는 유사분열 마커(p-히스톤 H3, p-HEC1, BubR1 이중항), DNA 손상 마커(γH2A.X), 및 아폽토시스 마커(cl-PARP)의 증가된 발현을 유발하고, 이는 KIF18A 저해가 SAC 활성화를 유발하여 DNA 손상 및 아폽토시스의 증가를 초래함을 시사하고, 이들 변화는 KIF18A 저해제 민감성 암에서 표적 연계의 마커로서 역할을 할 수 있었다.
도 10b에 도시된 바와 같이, 세포질 미세핵은 cGAS 및/또는 γH2A.X에 대해 양성으로 염색되었고, 이는 KIF18A 저해제 처리가 DNA 손상 및 면역자극성 세포질 DNA의 공급원으로서 역할을 할 수 있는 cGAS 양성 미세핵의 증가를 유발함을 시사한다.
실시예 9
이 실시예는 KIF18A 저해제로 처리된 암세포에서의 유사분열에서 KIF18A 단백질 국소화의 효과를 분석하기 위한 실험을 실증한다.
KIF18A 저해제로 처리된 암세포에서 KIF18A 단백질 국소화의 효과를 분석하기 위해, KIF18A 및 센트린-3을 HeLa 세포에서 면역염색하였다(도 11). 세포를 완전 성장 배지에서 챔버당 100,000개 세포의 밀도로 Lab-Tek 2-웰 챔버 슬라이드 내로 시딩하고, 2일 동안 대략 80% 부유도까지 성장시켰다. 세포를 2 mL의 완전 배지 중 DMSO, KIF18A 저해제(화합물 C9, 0.05 μM)로 6시간 동안 처리하였다. 세포를 실온에서 4% 포름알데하이드에서 15분 동안 고정시키고, 뒤이어 4℃에서 빙냉 90% 메탄올에서 10분 동안 2차 고정시켰다. 고정 후, 세포를 2 mL 세척 완충액(1% BSA, 0.2% Triton X-100, 1X PBS)에서 세척하고, 1 mL의 차단 완충액(5 mL 세척 완충액당 2 방울의 말 혈청(Vector Labs, Burlingame, CA))으로 차단시켰다. 세포를 1 mL 세척 완충액 중 항-KIF18A 토끼 항체(1:3000, A301-080A 05-806, Bethyl) 및 항-CETN3 마우스 항체(1:1000, H00001070-M01, Abnova)로 실온에서 2시간 동안 염색한다. 세포를 2 mL 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 DAPI DNA 염료(1:5000, 268298, Millipore)를 함유하는 세척 완충액 중 2차 항체[염소 항-마우스 IgG-alexa-488(1:2000, A11029, Invitrogen) 및 염소 항-토끼 IgG-alexa-568(1:2000, A11036, Invitrogen)로 빛으로부터 보호된 채로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 세포를 2 mL로 2회 세척하고, 챔버를 제거하고, 1 방울의 ProLong 항-Fade(P36934, Invitrogen)를 첨가한 후 커버슬립을 유리 슬라이드 상에 마운팅하였다. Elements 소프트웨어를 실행하는 업라이트 Nikon Eclipse NI-E 에피-형광 현미경 상에서 40x 대물렌즈를 사용하여 와이드-필드 이미지를 포착하였다. 면역염색된 유사분열 세포의 대표적인 이미지를 도 11에 제공한다. KIF18A는 적색으로 나타나고, 센트린-3은 녹색으로 나타난다.
도 11에서 제시된 바와 같이, KIF18A 저해제 처리는 유사분열에서 KIF18A 단백질 잘못-국소화(mis-localization)를 초래하고, KIF18A 단백질 국소화에서의 이들 변화는 대리(surrogate) 증식중인 정상 조직 및 암에서 표적 참여의 마커로서 역할을 할 수 있었다.
실시예 10
이 실시예는 화합물 C14가 암컷 무흉선 누드 마우스에서의 인간 OVCAR-3 HGSOC 종양 이종이식 모델(TP53 MUT, CCNE1 AMP)에서 p-히스톤 H3 유사분열 마커를 유도함을 실증한다.
암컷 무흉선 누드 마우스의 우측 옆구리에 0.1 mL 중 5 x 106개 OVCAR-3 세포를 피하 주사하였다. 종양이 확립된 후(450 내지 750 mm3의 평균 종양 부피), 동물을 5개의 치료군(비히클 단독, 3, 10, 30, 또는 100 mg/kg에서 KIF18A 저해제)으로 군당 3 마리의 동물로 무작위화하였다. 약물동력학적 분석을 위해 치료-후 24시간째에 종양 및 혈액 혈장을 수집하고, 약동학적 분석을 위해 종양을 수집하였다. 종양 단백질의 제조를 위해 용해물을 급속 냉동시키고, 분쇄하고, 용해시키고, EpiQuik 전체 히스톤 추출 키트(OP-0006 Epigentek, Farmingdale, NY) 프로토콜을 사용하여 가공하였다. BCA 단백질 검정 키트(23227, Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 용해물 농도를 결정하였다. 웰당 전체 단백질에 대해 정규화된 용해물을 Meso Scale Discovery(MSD) 전기화학발광 면역검정 플레이트 상으로 용해 완충액 중 30 μg/웰로 로딩하고, 포스포-히스톤 H3(세린-10) 항체(pHH3)를 사용하는 싱글-플렉스 MSD 검정을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 pHH3 MSD 분석을 처리하고, Sector Imager S16000 발광 검출 판독기(MSD, Gaithersburg, MD) 상에서 분석하였다. 용해물을 전체 단백질에 대해 정규화하고, pHH3 배수 유도는 비히클 처리군의 평균 원 MSD 값으로 나눈 군 평균 원 MSD 값을 나타낸다. GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 데이터를 플롯화하였고, 컬럼 그래프는 평균의 표준 오차(SEM)와 함께 각각의 치료군에 대한 평균 RU로서 표시된 pHH3 신호의 수준을 보여준다. pHH3에서의 배수 유도는 비히클군에 대한 평균 기준선 pHH3 신호에 비해 각각의 KIF18A 저해제 치료군에 대해 두드러진다. 혈장 및 종양에서 KIF18A 저해제의 마이크로몰 농도를 우측 수직축에 나타낸다. 통계학적 유의성을 일원 ANOVA, 뒤이어 던넷 사후 분석에 의해 결정하였다(***p = 0.0002, ****p ≤ 0.0001).
p-히스톤 H3 수준을 나타내는 발광 그래프를 각각의 용량의 KIF18A 저해제(또는 비히클 대조군)에 대해 플롯화하였고, 도 12에 도시한다. 그래프는 SEM과 함께 각각의 치료군에 대한 평균 RU로서 표시된 p-히스톤 H3 신호의 수준을 보여준다. p-히스톤 H3에서의 배수 유도는 비히클군에 대한 평균 기준선 p-히스톤 신호에 비해 각각의 KIF18A 저해제 치료군에 대해 두드러진다. 혈장(▲) 및 종양(■) 내 KIF18A 저해제(μM)의 농도를 우측 수직축 상에 나타낸다. 통계학적 유의성을 일원 ANOVA, 뒤이어 던넷 사후 분석에 의해 결정한다(***p = 0.0002, ****p < 0.0001).
도 12에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제는 마우스에서 OVCAR-3 HGSOC(TP53 MUT, CCNE1 AMP) 종양 이종이식편에서 p-히스톤 H3 유사분열 마커 수준의 용량-의존적 증가를 유도하였다. 이들 데이터는 p-히스톤 H3의 증가된 수준이 용량-의존적 및 노출-의존적이었음을 시사하고, 이는 p-히스톤 H3이 적합한 약동학적 마커이고, p-히스톤 H3 신호의 4.6배 이상의 유도는 10 mg/kg 이상의 KIF18A 저해제 용량에서 종양 퇴화와 상관관계가 있음을 나타낸다.
실시예 11
이 실시예는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시된 KIF18A 저해제를 만들기 위한 예시적인 단계를 기재한다.
하기 약어를 이 실시예 전반에 걸쳐 사용할 수 있다:
Figure pct00063
Figure pct00064
달리 주목되지 않는 한, 모든 물질을 상업적인 공급업체로부터 수득하고, 추가 정제 없이 사용하였다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 부(part)는 중량에 의한 것이고, 온도는 섭씨도이다. 모든 마이크로파 보조 반응을 BiotageTM으로부터의 Smith SynthesizerTM로 실시하였다. 모든 화합물은 이의 지정된 구조와 일관된 NMR 스펙트럼을 보여주었다. 용융점을 Buchi 장치 상에서 결정하였고, 교정하지 않는다. 질량 스펙트럼 데이터를 전기분무 이온화 기법에 의해 결정하였다. 모든 실시예를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 90% 초과의 순도로 정제하였다. 달리 언급되지 않는 한, 반응을 실온에서 진행시켰다.
본 발명의 화합물을 합성하는 데 있어서, 소정의 이탈기를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "이탈기"("LG")는 일반적으로 친핵체에 의해 전치 가능한 기를 지칭한다. 이러한 이탈기는 당업계에 알려져 있다. 이탈기의 예는 할라이드(예를 들어, I, Br, F, Cl), 설포네이트(예를 들어, 메실레이트, 토실레이트), 설파이드(예를 들어, SCH3), N-하이드록시숙신이미드, N-하이드록시벤조트리아졸 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 친핵체의 예는 아민, 티올, 알코올, 그리나드 시약, 음이온성 화학종(예를 들어, 알콕사이드, 아미드, 탄소음이온) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
아래 제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 구현예를 예시한다. 이들 실시예는 대표적인 것으로 의미되고, 청구범위의 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
백분율(%)이 액체에 관하여 사용될 때, 이는 용액에 관한 부피 백분율임을 주목한다. 고체와 함께 사용될 때, 이는 고체 조성물에 관한 백분율이다. 상업적인 공급업체로부터 수득된 물질을 전형적으로 추가 정제 없이 사용하였다. 공기 및 수분 민감성 시약을 수반하는 반응을 전형적으로 질소 또는 아르곤 분위기 하에 수행하였다. 254 nm 및 215 nm에서의 UV 검출을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(시스템 A: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm, 5 μm, 1.5 mL/분에서 15분 동안 0.1% TFA와 함께 H2O 중 5% 내지 100% CH3CN; 시스템 B: Zorbax SB-C8, 4.6 x 75 mm, 1.0 mL/분에서 12분 동안 0.1% 포름산과 함께 H2O 중 10% 내지 90% CH3CN)(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 순도를 측정하였다. 실리카 겔 크로마토그래피를 일반적으로 예비패킹된 실리카 겔 카트리지(Biotage, Uppsala, Sweden 또는 Teledyne-Isco, Lincoln, NE)로 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼을 Bruker AV-400(400 MHz) 분광계(Bruker Corporation, Madison, WI) 또는 Varian(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 400 MHz 분광계 상에서 주위 온도에서 기록하였다. 모든 관찰된 양성자를 지시된 적절한 용매에서 테트라메틸실란(TMS) 또는 다른 내부 기준으로부터 백만분율(ppm)용 다운필드로서 기록한다. 데이터를 하기와 같이 기록한다: 화학적 이동, 다중도(s = 단일항, d = 이중항, t = 삼중항, q = 사중항, br = 브로드(broad), m = 다중항), 커플링 상수, 및 양성자의 수. 저해상도 질량 스펙트럼(MS) 데이터를 254 nm 및 215 nm에서의 UV 검출 및 저공진(low resonance) 전기분무 모드(ESI)와 함께 Agilent 1100 Series(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) LC/MS 상에서 결정하였다.
중간체 화합물 중간체 1 내지 13의 제조:
중간체 1: 2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-아민
Figure pct00065
NMP(460 mL, 10.00 mL/g) 중 2-클로로-6-메틸피리미딘-4-아민(46 g, 320 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA), 4,4-디플루오로피페리딘 하이드로클로라이드(76 g, 481 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA) 및 DIPEA(166 mL, 961 mmol)의 혼합물을 고압멸균기(1 L)에 넣고, 180℃에서 30시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 물(500 mL)로 소광시키고, 에틸 아세테이트(2 x 1000 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 물질을 실리카 겔 플러그 상으로 흡착시키고, 및 용리제로서 헥산 중 50% 내지 100% E로 용리하는 실리카 겔에 걸친 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메쉬)에 의해 정제하여, 생성물을 얻었다. 이를 에틸 아세테이트(500 mL)에 재용해시키고, 물(2 x 500 mL)로 세척하였다. 유기층을 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 황색 고체를 헥산(400 mL)에 다시 한번 현탁시키고, 30분 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 헥산(100 mL)으로 세척하고, 진공 하에 건조하여, 표제 화합물(58 g, 79% 수율)을 담황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 6.33 (s, 2H), 5.63 (s, 1H), 3.80 - 3.78 (dd, J = 6.8, 4.7 Hz, 4H), 2.06 (s, 3H), 1.95 - 1.85 (tt, J = 14.2, 5.7 Hz, 4H). m/z (ESI): 229.2 (M+H)+.
중간체 2: 6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-아민
Figure pct00066
1,4-디옥산(500 mL) 중 6-플루오로피리딘-2-아민(50 g, 450 mmol, Combi-Blocks)의 용액에 3,3,3-트리플루오로프로판-1-올(102 g, 892 mmol, Apollo)을 질소 분위기 하에 첨가하고, 반응을 0℃까지 냉각시켰다. NaH(미네랄 오일 중 60%, 42.8 g, 1780 mmol)를 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉수(500 mL)로 소광시키고, 에틸 아세테이트(2 x 1000 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 헥산 중 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔에 걸친 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메쉬)에 의해 정제하여, 표제 화합물(45 g, 50% 수율)을 담갈색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.30 - 7.26 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.02 - 6.00 (dd, J = 7.8, 0.8 Hz, 1H), 5.89 - 5.86 (m, 3H), 4.36 - 4.33 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.79 - 2.67 (qt, J = 11.5, 6.2 Hz, 2H). m/z (ESI): 207.1 (M+H)+.
중간체 3: 6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-아민
Figure pct00067
단계 1: 고압멸균기에 NMP(800 mL) 중 2,6-디클로로-4-메틸피리딘(80 g, 490 mmol), 4,4-디플루오로피페리딘 하이드로클로라이드(86 g, 540 mmol), 및 DIPEA(342 mL, 1980 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 180℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 10% 수성 NaHCO3 용액을 사용하여 약 pH 9까지 염기성화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2 x 1500 mL)로 추출하고, 물(1500 mL)로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 물질을 헥산 중 5 내지 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔에 걸친 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메쉬)에 의해 정제하여, 1:3 비의 2,6-디클로로-4-메틸피리딘 및 2-클로로-6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘의 혼합물(102 g)을 담갈색 오일로서 얻었다. 이러한 혼합물(102 g)을 수 중 60% 아세토니트릴을 용리제로서 사용하는 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여, 2-클로로-6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘(70 g, 58% 수율)을 담갈색 액체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 6.76 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 3.66 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.03 - 1.91 (m, 4H). m/z (ESI): 247.1 (M+H)+.
단계 2:
1,4-디옥산(300 mL) 중 2-클로로-6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘(30.0 g, 122 mmol)의 용액에 (4-메톡시페닐)메탄아민(23.8 mL, 182 mmol) 및 Cs2CO3(79 g, 240 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기시키고, 질소로 30분 동안 퍼지하였다. BINAP(7.57 g, 12.2 mmol) 및 팔라듐(II)아세테이트(2.73 g, 12.2 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, CELITE® 베드를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(100 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 EtOAc(2 x 500 mL)로 추출하고, 물(500 mL), 뒤이어 염수(500 mL)로 세척하였다. 조합된 유기 추출물을 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 헥산 중 5 내지 8% 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔에 걸친 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메쉬)에 의해 정제하여, 6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-N-(4-메톡시벤질)-4-메틸피리딘-2-아민 (48 g, 76% 수율)을 황색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.22 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.64 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.84 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.56 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 2.05 (s, 3H), 1.90 - 1.80 (m, 4H). m/z (ESI): 348.1 (M+H)+.
단계 3: 건조 디클로로메탄(480 mL) 중 6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-N-(4-메톡시벤질)-4-메틸피리딘-2-아민(48.0 g, 138 mmol)의 용액에 아니솔(30.2 mL, 276 mmol) 및 TFA(240 mL, 3120 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 4시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 물(200 mL)에 용해시키고, 10% 수성 소듐 비카르보네이트 용액으로 약 pH 8로 염기성화시키고, 에틸 아세테이트(2 x 500 mL)로 추출하였다. 조합된 유기층을 물(200 mL), 뒤이어 염수(200 mL)로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 헥산 중 25% 내지 35% 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔에 걸친 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-아민(LCMS 약 85%)을 갈색 오일로서 얻었다. 이 물질을 수 중 50 내지 60% 아세토니트릴을 사용하는 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여, 6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-아민(16.5 g, 72 mmol, 53% 수율)을 갈색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 5.86 (s, 1H), 5.65 (s, 1H), 5.48 (s, 2H), 3.56 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.06 (s, 3H), 1.96 - 1.87 (m, 4H). m/z (ESI): 228.2 (M+H)+.
중간체 4:3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸아닐린
Figure pct00068
단계 1: 톨루엔(50 mL) 중 1-브로모-3-메틸-5-니트로벤젠(5 g, 23.14 mmol), 4,4-디플루오로피페리딘(4.21 g, 34.7 mmol), 소듐 tert-부톡사이드(6.67 g, 69.4 mmol), Pd2(dba)3(2.12 g, 2.31 mmol) 및 xantphos(1.34 g, 2.31 mmol)의 혼합물을 100℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시키고, 석유 에테르 중 10% EtOAc를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 4,4-디플루오로-1-(3-메틸-5-니트로페닐)피페리딘(3.70 g, 14.44 mmol, 62% 수율)을 회색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ ppm 7.55 (t, J=2.3 Hz, 1 H), 7.45 (s, 1 H), 7.32 (d, J=2.3 Hz, 1 H), 3.46 (t, J=5.8 Hz, 4 H), 2.38 (s, 3 H), 1.96 - 2. 04 (m, 4 H). m/z (ESI): 257.1 (M+H)+.
단계 2: EtOH(30 mL)와 물(7 mL) 중 4,4-디플루오로-1-(3-메틸-5-니트로페닐)피페리딘(3.7 g, 14.44 mmol), 철 분말(8.06 g, 144 mmol) 및 암모늄 클로라이드(7.72 g, 144 mmol)의 혼합물을 75℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CELITE® 패드를 통해 여과하고, 메탄올로 세척하고, 여과물을 농축시켰다. 잔여물을 물로 희석시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시키고, 석유 에테르 중 30 내지 40% EtOAc로 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸아닐린(2.6 g, 11.49 mmol, 80% 수율)을 갈색 고체로서 제공했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ ppm 6.00 (s, 2 H), 5.89 (s, 1 H), 4.81 (s, 2 H), 3.16 - 3.22 (m, 4 H), 2.09 (s, 3 H), 1.94 - 2.04 (m, 4 H). m/z (ESI): 227.1 (M+H)+.
중간체 5: 4-메틸-6-모르폴리노피리딘-2-아민
Figure pct00069
250-mL 압력 튜브에 6-플루오로-4-메틸피리딘-2-아민(10.0 g, 79 mmol, Sibian chemicals, China), 모르폴린(8.29 g, 95 mmol), 및 DIPEA(41.5 mL, 238 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 150℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)로 소광시키고, EtOAc(2 x 250 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 실리카 겔 플러그 상으로 흡착시키고, 헥산 중 1% 내지 15% EtOAc의 구배로 용리하는 Redi-Sep 사전-패킹된 실리카 겔 컬럼(40 g)을 통한 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물(8.5 g, 44.0 mmol, 56% 수율)을 갈색 반고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 5.75 (s, 1H), 5.67 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 3.65 (t, J = 8.4 Hz, 4H), 3.30 (t, J = 8.4 Hz, 4H), 2.06 (s, 3H). m/z (ESI): 194.2 (M+H)+.
중간체 6: 4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산
Figure pct00070
DMSO(2.1 L) 중 2-플루오로-4-요오도벤조산(300 g, 1.13 mol, Combi-Blocks, San Diego, CA)의 용액에 6-아자스피로[2.5]옥탄 하이드로클로라이드(216 g, 1.47 mol, Wuxi AppTec)를 20℃에서 첨가하였다. 그 후에, K2CO3(468 g, 3.38 mol)를 첨가하고, 반응 용액을 N2 하에 140℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 얼음물(4.20 L)에 서서히 부은 다음, 헥산(2 L x 3)으로 추출하였다. 수상을 분리하고, HCl(2 M)로 pH = 6으로 조정하였다. 고체를 침전시키고, 수집하였다. 고체를 물(700 mL x 3)로 세척하고, 여과하였다. 습윤된 고체를 큰 와치 유리 상으로 확산시키고, 공기 중에서 25℃에서 72시간 동안 건조하였다. 4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산(280 g, 777 mmol, 69% 수율)을 밝은 황색 고체로서 수득하였다. 400 MHz DMSO-d6 δ ppm 8.07 (s, 1H), 7.76 - 7.66 (m, 2H), 3.10 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.55 (br s, 4H), 0.41 (s, 4H).
중간체 7: 4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산
Figure pct00071
단계 1: 유리 마이크로파 반응 용기(20 mL)에서, DMSO(15.0 mL) 중 메틸 4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조에이트(2.0 g, 5.39 mmol, 중간체 7에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 수득됨)의 용액에 포타슘 메타비설파이트(2.40 g, 10.78 mmol), TBAB(1.91 g, 5.93 mmol), 소듐 포르메이트(0.81 g, 11.85 mmol), 트리페닐 포스핀(0.212 g, 0.81 mmol), 1,10-페난트롤린(0.146 g, 0.81 mmol) 및 팔라듐 아세테이트(0.060 g, 0.27 mmol)를 질소 분위기 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기시키고, 질소로 10분 동안 퍼지하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 70℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 RT까지 냉각시키고,3-요오도옥세탄(2.39 g, 12.97 mmol)을 첨가하고, 120℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)로 소광시키고, EtOAc(2 x 100 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 실리카 겔 플러그(60 내지 120 메쉬) 상으로 흡착시키고, 헥산 중 1 내지 40% EtOAc의 구배로 용리하는 Redi-Sep 사전-패킹된 실리카 겔 컬럼(40 g)을 통한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 메틸 4-(옥세탄-3-일설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조에이트(360 mg, 15% 수율)를 황색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d): δ 7.79 (dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.0, 1.8 Hz, 1H), 4.98 (dd, J = 7.4, 6.2 Hz, 2H), 4.80 (dd, J = 8.4, 7.1 Hz, 2H), 4.45 (tt, J = 8.4, 6.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.22 - 3.10 (m, 4H), 1.52 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 0.38 (s, 4H). m/z (ESI): 366.1 [M+1].
단계 2: THF(5 mL) 중 메틸 4-(옥세탄-3-일설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조에이트(350 mg, 0.96 mmol)의 용액에 LiHMDS(헥산 중 1.0 M 용액, 1.92 mL, 1.91 mmol)를 -78℃에서 질소 분위기 하에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 요오도메탄(71.9 μL, 1.15 mmol)을 반응 혼합물에 서서히 첨가하고, RT까지 서서히 가온시켰다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액(25 mL)으로 소광시키고, EtOAc(2 x 50 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 실리카 겔 플러그(60 내지 120 메쉬) 상으로 흡착시키고, 헥산 중 1 내지 50% EtOAc의 구배로 용리하는 Redi-Sep 사전-패킹된 실리카 겔 컬럼(12 g)을 통한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 메틸 4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조에이트(260 mg, 72% 수율)를 담황색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d): δ 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.43 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.24 - 3.12 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.58 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 0.40 (s, 4H). m/z (ESI): 380.2 [M+1].
단계 3: THF(5 mL), 물(5 mL) 및 메탄올(1 mL) 중 메틸 4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조에이트(250 mg, 0.66 mmol)의 용액에 리튬 하이드록사이드(63 mg, 2.64 mmol)를 첨가하고, RT에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1.5 N HCl pH 대략 4로 산성화시켰다. 수성층을 EtOAc(3 x 50 mL)로 추출하고, 염수(25 mL)로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜, 4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산(200 mg, 83% 수율)을 유백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 16.01 (s, 1H), 8.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.72 (dd, J = 8.0, 1.8 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 4.48 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.60 - 1.52 (m, 7H), 0.41 (s, 4H). m/z (ESI): 366.2 [M+1].
중간체 8: 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴산.
Figure pct00072
단계 1: 2,6-디플루오로니코틴산(10.6 g, 66.6 mmol) 및 티오닐 클로라이드(35 mL, 480 mmol)을 질소 하에 조합하고, 부드러운 환류로 2시간 동안 가열하였다. 용액을 감압 하에 농축 건조하였다. 톨루엔(100 mL)을 미정제 물질에 첨가하고, 이를 1회 더 증발 건조하였다. 미정제 산 클로라이드를 질소 하에 DCM(50 mL)에 용해시키고, 얼음 배쓰에서 냉각시켰다. DCM(50 mL) 중 트리에틸아민(25 mL, 180 mmol)과 벤질 알코올(7.25 mL, 70.1 mmol)의 혼합물을 10분에 걸쳐 적가하고, 혼합물을 RT에서 30분 동안 교반하였다. 그 후에, 0.1 N HCl(100 mL)을 첨가하고, 상을 혼합하고, 분리하였다. 유기상을 취하고, 마그네슘 설페이트로 건조하고, 감압 하에 증발 건조하여, 벤질 2,6-디플루오로니코티네이트를 제공하였고, 이를 정제 없이 사용하였다. m/z (ESI): 250.0 (M+H)+.
단계 2: 4,4-디메틸옥사졸리딘-2-온(0.80 g, 6.95 mmol)을 질소 하에 THF(15 mL)에 용해시켰다. 포타슘 t-부톡사이드(0.75 g, 6.68 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 RT에서 5분 동안 교반하였다. N,N-디메틸아세타미드(40 mL) 중 벤질 2,6-디플루오로니코티네이트(1.60 g, 6.42 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반하였다. 물(75 mL), EtOAc(150 mL), 및 포화 암모늄 클로라이드(25 mL)를 첨가하고, 상을 혼합하고 분리하였다. 유기상을 취하고, 염수(50 mL)로 세척하고, 감압 하에 증발 건조하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄 내지 EtOAc 구배)에 의한 정제는 벤질 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-플루오로니코티네이트(1.82 g, 5.29 mmol, 82% 수율)를 백색 고체로서 제공하였다.
단계 3: 벤질 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-플루오로니코티네이트(1.81 g, 5.23 mmol)를 NMP(20 mL)에 용해시켰다. 세슘 카르보네이트(2.00 g, 6.14 mmol) 및 6-아자스피로[2.5]옥탄(0.60 g, 5.40 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반하였다. 물(100 mL) 및 EtOAc(150 mL)를 첨가하고, 상을 혼합하고 분리하였다. 유기상을 취하고, 염수로 세척하고, 감압 하에 증발 건조하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄 중 0% 내지 40% EtOAc)를 사용한 정제는 벤질 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코티네이트(1.77 g, 4.06 mmol, 78% 수율)를 우유빛 오일로서 제공하였다. m/z (ESI): 436.1 (M+H)+.
단계 4: 벤질 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코티네이트(1.77 g, 4.06 mmol)를 EtOAc(30 mL)에 용해시키고, 압력 용기로 옮겼다. 에탄올(60 mL)을 첨가하고, 뒤이어 탄소 상 5% 팔라듐(건조 중량, 50% 물, 0.250 g, 0.117 mmol)을 첨가하였다. 현탁액을 40 psi 수소 하에 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 CELITE® 패드를 통해 여과하고, 고체를 EtOAc(50 mL)로 세척하였다. 조합된 여과물을 감압 하에 증발 건조하여, 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴산(1.15 g, 3.33 mmol, 82% 수율)을 백색 고체로서 얻었다. m/z (ESI): 346.0 (M+H)+.
중간체 9: N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드
Figure pct00073
4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산(150.0 g, 420 mmol, 중간체 6)을 아르곤 하에 디클로로메탄(1000 mL)에 현탁시켰다. 촉매적 DMF(1.0 mL)를 첨가하고, 뒤이어 디클로로메탄(500 mL) 중 티오닐 클로라이드(54.6 g, 28 mL, 459 mmol, Sigma-Aldrich Corporation)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 주위 온도에서 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 감압 하에 증발 건조하였다. 미정제 물질을 톨루엔(2 x 300 mL)으로 공비혼합하고, 아르곤 하에 디클로로메탄(300 mL)에 현탁시켰다. 3염기성 포타슘 포스페이트(267 g, 1.26 mol, Sigma-Aldrich Corporation)를 첨가하고, 뒤이어 DCM(300 mL, 5분에 걸쳐 첨가됨) 중 2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-아민(100 g, 438 mmol, 중간체 4) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(200 mL, 1.14 mol, Sigma-Aldrich Corporation)의 용액을 첨가하였다. 황색 혼합물을 주위 온도에서 3시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조하였다. 미정제 고체를 디클로로메탄(1 L)에 현탁시키고, 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 프릿(frit)을 통해 여과하고, 고체를 추가의 디클로로메탄(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 고체를 폐기하고, 여과물을 감압 하에 증발 건조하였다. 미정제 잔여물을 아세토니트릴(750 mL)에 현탁시키고, 주위 온도에서 15분 동안 교반하였다. 현탁액을 유리 프릿을 통해 여과하고, 고체를 추가의 아세토니트릴(75 mL)로 세척하였다. 고체를 질소 스트림 하에 건조하여, N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(186 g, 328 mmol, 78% 수율)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 13.38 (br s, 1 H) 7.72 - 7.87 (m, 3 H) 7.39 (s, 1 H) 3.91 (br s, 4 H) 2.99 - 3.06 (m, 4 H) 2.32 (s, 3 H) 1.92 - 2.07 (m, 4 H) 1.62 - 1.85 (m, 4 H) 0.38 (s, 4 H). m/z (ESI): 568.0 (M-H)+.
중간체 10 내지 13을 중간체 9에 대해 기재된 바와 같은 유사한 절차에 따라 제조하였다.
Figure pct00074
실시예 C1 및 C2: 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-( R -사이클로프로필설폰이미도일)- N -(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드 및 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-( S -사이클로프로필설폰이미도일)- N -(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드
Figure pct00075
단계 1: 20 mL 마이크로파 용기 내로 N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(1.00 g, 1.762 mmol, 중간체 19), 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐(0)(0.161 g, 0.176 mmol) 및 4,5-비스(디페닐포스-피노)-9,9-디메틸-크산텐(0.102 g, 0.176 mmol), 뒤이어 1,4-디옥산(10 mL)을 넣었다. 생성된 혼합물을 교반하고, 질소로 5분 동안 퍼지한 후, 1,1'-디메틸트리에틸아민(0.616 mL, 3.52 mmol)을 질소 하에 첨가하고, 뒤이어 사이클로프로판티올(0.142 mL, 1.939 mmol)로 첨가하였다. 용기를 밀봉하고, 마이크로파 조건을 거치게 하였다(10시간, 90℃). 미정제 혼합물을 실리카 겔 사전컬럼 상으로 직접 로딩하고, MeOH/DCM(0%에서 5분 및 0% 내지 6%로 25분)로 용리하는 40-g ISCO 골드 컬럼 상에서 콤비-플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 2회 거치게 하여, 4-(사이클로프로필티오)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.92 g, 1.791 mmol, 102% 수율)를 유백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, 디클로로메탄-d2) δ ppm 13.33 (s, 1H), 8.15 (d, J=8.29 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.22-7.35 (m, 2H), 3.91-4.09 (m, 4H), 3.06 (br t, J=5.18 Hz, 4H), 2.35 (s, 3H), 2.17-2.28 (m, 1H), 1.62-2.10 (m, 6H), 1.52 (s, 2H), 1.13-1.21 (m, 2H), 0.68-0.76 (m, 2H), 0.40 (s, 4H). m/z (ESI): 514.1 (M+H)+.
단계 2: MeOH(4.5 mL)와 디클로로메탄(9.0 mL) 중 4-(사이클로프로필티오)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.89 g, 1.733 mmol) 및 암모늄 카르보네이트(0.250 g, 2.60 mmol)의 교반된 용액에 (아세틸옥시)(페닐)-요오다닐 아세테이트(1.284 g, 3.99 mmol)를 고체로서 한번에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 열린 공기 중에서 rt에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 실리카 겔 사전컬럼(25 g) 상으로 직접 로딩하고, MeOH/DCM(0%에서 3분 및 0% 내지 14%로 25분)로 용리하는 40-g ISCO 골드 컬럼 상에서 콤비-플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 거치게 하여,4-(사이클로프로판설폰이미도일)-N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.95 g, 1.744 mmol, 101% 수율)의 라세미 혼합물을 유백색 고체로서 얻었다. 거울상이성질체를, 60 mL/분의 유속을 사용하여 50% 액체 CO2 및 50% MeOH의 이동상과 함께 Regis (S,S) Whelk-01(250 X 21 mm, 5 mm)를 사용하는 분취 SFC를 통해 분리하여, 하기를 생성하였다:
실시예 C1: 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-( R -사이클로프로필설폰이미도일)- N -(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드. 제1 용리 피크, 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 13.20 (br d, J=3.73 Hz, 1H), 8.44 (d, J =8.29 Hz, 1H), 7.96 (d, J=1.45 Hz, 1H), 7.87 (dd, J=1.66, 8.29 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 4.03 (br s, 4H), 3.14 (t, J=5.29 Hz, 4H), 2.53-2.63 (m, 1H), 2.44 (br s, 3H), 1.95-2.10 (m, 4H), 1.53-1.89 (m, 5H), 1.45 (tdd, J=5.08, 6.92, 10.29 Hz, 1H), 1.20-1.30 (m, 1H), 1.07-1.17 (m, 1H), 0.93-1.03 (m, 1H), 0.44 (s, 4H). m/z (ESI): 545.2 (M+H)+.
실시예 C2: 2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-4-( R -사이클로프로필설폰이미도일)- N -(2-(4,4-디플루오로-1-피페리디닐)-6-메틸-4-피리미디닐)벤즈아미드. 제2 용리 피크. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 13.20 (br d, J=3.73 Hz, 1H), 8.44 (d, J=8.29 Hz, 1H), 7.96 (d, J=1.45 Hz, 1H), 7.87 (dd, J=1.66, 8.29 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 4.03 (br s, 4H), 3.14 (t, J=5.29 Hz, 4H), 2.53-2.63 (m, 1H), 2.44 (br s, 3H), 1.95-2.10 (m, 4H), 1.53-1.89 (m, 5H), 1.45 (tdd, J=5.08, 6.92, 10.29 Hz, 1H), 1.20-1.30 (m, 1H), 1.07-1.17 (m, 1H), 0.93-1.03 (m, 1H), 0.44 (s, 4H). m/z (ESI): 545.2 (M+H)+. 입체화학 지정은 임의적이었다.
실시예 C3: 4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)- N -(6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-일)벤즈아미드
Figure pct00076
2-하이드록시에탄-1-설폰아미드(0.741 g, 5.92 mmol, Wuxi AppTec), 사르코신(0.172 g, 1.93 mmol, Ark Pharm, Inc.), 구리(I) 요오다이드(0.241 g, 1.26 mmol, Sigma-Aldrich Corporation), 포타슘 카르보네이트(2.78 g, 20.1 mmol, Thermo Fisher Scientific) 및 4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-N-(6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-일)벤즈아미드(2.74 g, 5.02 mmol, 중간체 38)를 탈기된 건조 N,N-디메틸포름아미드(5 mL)에서 아르곤 하에 조합하고, 130℃까지 50분 동안 가열하였다. 반응을 주위 온도까지 냉각시키고, 물(100 mL) 및 에틸 아세테이트(150 mL)를 첨가하고, 상을 혼합하고 분리하였다. 유기층을 포화 NH4Cl: NH4OH:H2O(1:1:8, 2 x 75 mL)로 세척하고, 감압 하에 증발 건조하였다. 미정제 생성물을 톨루엔(30 mL)에 현탁시키고, 90℃까지 15분 동안 가열하였다. 혼합물을 주위 온도까지 냉각시키고, 고체를 여과해 내고, 질소 스트림 하에 건조하였다. 백색 고체를 물(100 mL)에 현탁시키고, 90℃까지 20분 동안 가열하였다. 혼합물을 주위 온도까지 냉각시키고, 고체를 질소 스트림 하에 건조하여, 4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)-N-(6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리딘-2-일)벤즈아미드(2.41 g, 4.44 mmol, 88% 수율)를 얻었다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.18 (s, 1H), 10.19 (br s, 1H), 8.08 (d, J=8.72 Hz, 1H), 7.91 (d, J=7.80 Hz, 1H), 7.76 (t, J=7.96 Hz, 1H), 7.29 (d, J=1.99 Hz, 1H), 7.14 (dd, J=2.07, 8.64 Hz, 1H), 6.57 (d, J=7.96 Hz, 1H), 4.93 (br s, 1H), 4.52 (t, J=6.12 Hz, 2H), 3.77 (t, J=6.43 Hz, 2H), 3.37 (t, J=6.43 Hz, 2H), 3.00 (br t, J=4.74 Hz, 4H), 2.80-2.87 (m, 2H), 1.74 (br s, 4H), 0.39 (s, 4H). m/z (ESI): 543.2.2 (M+H)+.
실시예 C4: N -(6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드
Figure pct00077
DMF(20 mL) 중 4-브로모-N-(6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(1.0 g, 1.9 mmol, 중간체 27), 메틸 2-설파모일아세테이트(0.361 g, 2.89 mmol, Wuxi AppTec), 포타슘 포스페이트(1.23 g, 5.78 mmol), (1R,2R)-N1,N2-디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.137 g, 0.963 mmol) 및 구리(I) 요오다이드(0.183 g, 0.963 mmol)의 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 가열하였다. 그 후에, 반응 혼합물을 CELITE® 플러그를 통해 여과하였다. 여과물을 EtOAc로 희석시키고, 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시켰다. 잔여물을 석유 에테르 중 0% 내지 40% EtOAc의 구배로 용리하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, N-(6-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-4-메틸피리딘-2-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.580 g, 1.02 mmol, 53% 수율)를 유백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 12.85 (s, 1 H), 8.04 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.51 (s, 1 H), 7.23 (d, J=2.2 Hz, 1 H), 7.09 (dd, J=8.7, 2.1 Hz, 1 H), 6.56 (s, 1 H), 3.74 (dt, J=12.5, 6.2 Hz, 6 H), 2.97 (t, J=5.2 Hz, 4 H), 2.26 (s, 3 H), 1.99 (tt, J=13.6, 5.4 Hz, 3 H), 1.79 (s, 4 H), 1.60 (br s, 4 H), 0.38 (s, 4 H). m/z (ESI): 564.2 (M+H)+.
실시예 C5 및 C6: ( R )- N -(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드 및 ( S )- N -(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드
Figure pct00078
단계 1: DMF(15 mL) 중 에틸 2-설파모일프로파노에이트(1.44 g, 7.93 mmol, 중간체 22), 구리(I) 요오다이드(0.503 g, 2.64 mmol, Strem), 사르코신(0.47 g, 5.29 mmol, Sigma-Aldrich Corporation), 및 포타슘 포스페이트(4.49 g, 21.2 mmol)의 혼합물을 아르곤 분위기 하에 넣고, 50℃까지 5분 동안 가온시켰다. N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(3.0 g, 5.29 mmol, 중간체 19)를 첨가하고, 혼합물을 100℃까지 3시간 동안 가열한 다음, 실온까지 냉각시켰다. EtOAc(50 mL), IPA(5 mL) 및 물(50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 격렬하게 교반하였다. 생성된 2염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성층을 EtOAc(2 x 20 mL)로 추출한 다음, 조합된 추출물을 물(2 x 50 mL), 9:1 NH4Cl/NH4OH(1 x 50 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 진공 내에서 농축시켜, 오일을 얻었다. 미정제 오일을 0% 내지 50% EtOAc/헵탄 구배로 용리하는 Redi-Sep 사전-패킹된 실리카 겔 컬럼(80 g)을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 에틸 2-(N-(4-((2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)카르바모일)-3-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)페닐)설파모일)프로파노에이트(2.76 g, 4.45 mmol, 84% 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 13.35 (s, 1 H) 10.69 (br s, 1 H) 8.07 (d, J=8.71 Hz, 1 H) 7.40 (s, 1 H) 7.31 (d, J=1.87 Hz, 1 H) 7.17 (dd, J = 8.60, 1.97 Hz, 1 H) 4.06 (qd, J=7.08, 4.87 Hz, 2 H) 3.92 (br t, J=5.49 Hz, 4 H) 2.98 (br t, J=4.77 Hz, 4 H) 2.32 (s, 3 H) 1.85 - 2.06 (m, 5 H) 1.73 (br s, 4 H) 1.48 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.14 (t, J=7.05 Hz, 3 H) 0.39 (s, 4 H). 19F NMR (376 MHz, DMSO-d 6) δ ppm -94.75 (s, 1 F). m/z (ESI): 621.2 (M+H)+.
단계 2: 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 THF(100 mL) 중 에틸 2-(N-(4-((2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)카르바모일)-3-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)페닐)설파모일)프로파노에이트(10.39 g, 16.74 mmol) 및 리튬 보로하이드라이드 용액(THF 중 2.0 M, 16.7 mL, 33.5 mmol, Sigma-Aldrich Corporation)을 첨가하였다. 메탄올(4.29 mL, 134 mmol)을 5분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 1 N HCl(20 mL), 뒤이어 EtOAc(20 mL)를 서서히 첨가하고, 생성된 2염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 상을 분리하였다. 수성층을 EtOAc(1 x 25 mL)로 추출하고, 조합된 추출물을 포화된 NaHCO3(1 x 50 mL), 염수(1 x 50 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시켜, 8.9 g 라세미 혼합물을 얻었다. 이 물질을, 150 mL/분의 유속을 사용하여 0.2% TEA와 함께 85% 액체 CO2 및 15% MeOH의 이동상과 함께 Chiral Tech AD 컬럼(250 X 30 mm, 5 mm)을 사용하는 분취 SFC에 의해 분리하여, 하기 물질을 얻었다:
실시예 C5: ( R )- N -(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드. 제1 용리 피크(3.50 g, 6.05 mmol, 36.1% 수율, >99%ee). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 13.36 (s, 1 H) 8.05 (d, J = 8.50 Hz, 1 H) 7.40 (s, 1 H) 7.31 (d, J = 1.87 Hz, 1 H) 7.17 (dd, J = 8.71, 2.07 Hz, 1H) 3.88 - 3.97 (m, 4 H) 3.84 (dd, J=10.99, 4.35 Hz, 1 H) 3.37 - 3.54 (m, 1 H) 3.25 - 3.30 (m, 1 H) 2.97 (br t, J = 4.77 Hz, 4 H) 2.32 (s, 3 H) 1.84 -2.06 (m, 4 H) 1.57 - 1.84 (br s, 4 H) 1.30 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 0.39 (s, 4 H). 2개의 교환 가능한 양성자가 관찰되지 않았다. 19F NMR (376 MHz, DMSO-d 6) δ ppm -94.74 (s, 1 F). m/z (ESI): 579.2 (M+H)+.
실시예 C6: ( S )- N -(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시-1-메틸에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드. 제2 용리 피크(2.66 g, 4.60 mmol, 27.5% 수율. 98.9%ee). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 13.35 (s, 1 H) 8.05 (d, J=8.50 Hz, 1 H) 7.40 (s, 1 H) 7.31 (d, J=2.07 Hz, 1 H) 7.17 (dd, J=8.60, 1.97 Hz, 1H) 3.88 - 3.97 (m, 4 H) 3.84 (dd, J=10.99, 4.35 Hz, 1 H) 3.50 (dd, J=10.99, 7.46 Hz, 1 H) 3.25 - 3.32 (m, 1 H) 2.97 (br t, J=4.77 Hz, 4 H) 2.31 (s, 3H) 1.83 - 2.06 (m, 4 H) 1.73 (br s, 4 H) 1.30 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 0.39 (s, 4 H). 2개의 교환 가능한 양성자가 관찰되지 않았다. 19F NMR (376 MHz, DMSO-d 6) δ ppm -94.75 (s, 1 F). m/z (ESI): 579.2 (M+H)+. 입체화학은 임의로 지정되었다.
실시예 C7: N -(3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸페닐)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드.
Figure pct00079
DMF(5 mL) 중 4-브로모-N-(3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸페닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.5 g, 0.96 mmol, 중간체 20), 포타슘 포스페이트(0.614 g, 2.89 mmol), 2-하이드록시에탄-1-설폰아미드(0.181 g, 1.45 mmol), (1R,2R)-N1,N2-디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.069 g, 0.48 mmol) 및 구리(I) 요오다이드(0.092 g, 0.48 mmol)의 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물로 소광시키고, CELITE® 베드를 통해 여과하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시키고, 석유 에테르 중 40% EtOAc를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, N-(3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-5-메틸페닐)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(0.31 g, 0.54 mmol, 56% 수율)를 유백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ ppm 11.55 (s, 1 H), 10.09 (s, 1 H), 7.83 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.12 - 7.16 (m, 3 H), 7.03 (dd, J=8.5, 2.1 Hz, 1 H), 6.60 (s, 1 H), 4.97 (br s, 1 H), 3.76 (t, J=6.6 Hz, 2 H), 3.30 - 3.34 (m, 6 H), 2.97 (t, J=5.3 Hz, 4 H), 2.27 (s, 3 H), 2.00 - 2.10 (m, 4 H), 1.55 (br s, 4 H), 0.36 (s, 4 H). m/z (ESI): 563.2 (M+H)+.
실시예 C8: N -(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드
Figure pct00080
DMF(2 mL) 중 4-((3-메틸옥세탄-3-일)설포닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤조산(120 mg, 0.33 mmol, 중간체 15)의 용액에 HATU(187 mg, 0.49 mmol) 및 DIPEA(143 μL, 0.821 mmol)를 RT에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에, 3-아미노-N-(tert-부틸)벤젠설폰아미드(82 mg, 0.36 mmol)를 첨가하고, RT에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(20 mL)로 소광시키고, EtOAc(3 x 25 mL)에 의해 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수 용액(20 mL)으로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 헥산 중 30% EtOAc를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물(110 mg, 58% 수율)을 유백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d): δ 12.33 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.06 - 7.95 (m, 1H), 7.87 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.2, 1.7 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.54 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.52 (s, 1H), 4.47 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.16 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 1.73 (s, 3H), 1.70 - 1.60 (b s, 3H), 1.30 (s, 9H), 0.48 (s, 4H). m/z (ESI): 576.2 [M+1].
실시예 C9를 상기 실시예 C8의 제조와 유사하게 제조하였다:
Figure pct00081
실시예 C10: N -(3-( N -( tert -부틸)설파모일)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드.
Figure pct00082
단계 1: 100-mL 둥근 바닥 플라스크를 6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴산(549 mg, 1.59 mmol, 중간체 11) 및 DCM(8 mL)으로 충전시켰다. RT에서 반응 혼합물에 옥살릴 디클로라이드(1.43 mL, 2.86 mmol, DCM 중 2 M)를 첨가하고, 뒤이어 2 방울의 DMF를 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔여물을 DCM(10 mL)에 재용해시키고, 3-아미노-N-(tert-부틸)벤젠설폰아미드(0.38 mL, 1.67 mmol), 및 DIPEA(1.39 mL, 7.95 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반한 후, 이를 물로 희석시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 농축시켰다. 농축물을 헵탄 중 0% 내지 60% EtOAc로 용리하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드(703 mg, 1.26 mmol, 80% 수율)를 밝은 황색 고체로서 얻었다. MS (ESI, 양이온) m/z: 556.1 [M+1].
단계 2: 유리 바이알을 N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-6-(4,4-디메틸-2-옥소옥사졸리딘-3-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드(703 mg, 1.26 mmol), MeOH(2 mL), 및 소듐 하이드록사이드(1.26 mL, 6.33 mmol, 5 N)로 충전시켰다. 70
Figure pct00083
에서 1시간 동안 교반하고, RT까지 냉각시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔여물을 반(half)-포화된 NH4Cl(10 mL)과 EtOAc(10 mL) 사이에서 분할하였다. 수성 상을 EtOAc(2 x 10 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물(20 mL)로 세척하고, Na2SO4에 걸쳐 건조하였다. 미정제 물질을 실리카 겔 플러그 상으로 흡착시키고, 헵탄 중 0% 내지 60% EtOAc의 구배로 용리하는 Redi-Sep 사전-패킹된 실리카 겔 컬럼을 통한 크로마토그래피에 의해 정제하여, N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드(485 mg, 0.92 mmol, 72% 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 11.21 (s, 1 H), 8.32 (t, J=1.45 Hz, 1 H), 7.84 (dt, J=7.88, 1.45 Hz, 1 H), 7.71 (d, J=8.71 Hz, 1 H), 7.50 - 7.57 (m, 2 H), 7.49 (dt, J=7.88, 1.45 Hz, 1 H), 6.60 (s, 1 H), 6.28 (d, J=8.50 Hz, 1 H), 4.81 (t, J=5.70 Hz, 1 H), 3.59 (d, J=5.81 Hz, 2 H), 3.11 - 3.17 (m, 4 H), 1.44 - 1.51 (m, 4 H), 1.36 (s, 6 H), 1.12 (s, 9 H), 0.31 (s, 4 H). MS (ESI, 양이온) m/z: 530.2 [M+1].
실시예 C11: 실시예 C10의 제조와 유사하게 제조하였다:
Figure pct00084
실시예 C12 및 C13: 실시예 C3의 제조와 유사하게 제조하였다:
Figure pct00085
실시예 C14: N -(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드
Figure pct00086
100 mL 둥근 바닥 플라스크에서 2-하이드록시에탄-1-설폰아미드(1.28 g, 10.3 mmol, Wuxi AppTec), 구리(I) 요오다이드(0.49 g, 2.56 mmol), 포타슘 포스페이트 3염기성(5.44 g, 25.6 mmol), 및 사르코신(0.48 g, 5.13 mmol)의 혼합물을 아르곤 분위기 하에 넣었다. 무수 DMF(20 mL)를 첨가하고, 혼합물을 50℃까지 5분 동안 가온시켰다. N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-요오도-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(2.91 g, 5.13 mmol, 중간체 19)를 고체로서 첨가하고, 혼합물을 100℃까지 가열하고, 2시간 동안 교반한 다음, 실온까지 냉각시켰다. EtOAc(20 mL) 및 물(20 mL)을 첨가하고, 생성된 2염기성 혼합물을 분리하고, 수성층을 EtOAc(3x)로 추출하였다. 그 후에, 조합된 유기 추출물을 물(2x), 9:1 NH4Cl/NH4OH(aq), 염수로 세척하고, 무수 MgSO4에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 진공 내에서 농축시켜, 오일을 얻었다. 오일을 0% 내지 50% EtOAc/헵탄 구배, 그 후에 50% EtOAc/헵탄 등용매 용리로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 유백색 고체를 제공하였다. 이 고체를 메탄올에 현탁시키고, 여과하고, 건조하여, 백색 고체를 얻었다. 그 후에, 이 고체를 물에 현탁시키고, 24시간 동안 교반하고, 여과하고, 진공 내에서 건조하여, N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드(1.55 g, 2.75 mmol, 54% 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 13.37 (s, 1 H) 10.03 - 10.52 (m, 1 H) 8.06 (d, J = 8.71 Hz, 1 H) 7.41 (s, 1 H) 7.28 (d, J = 1.87 Hz, 1 H) 7.15 (dd, J = 8.71, 1.87 Hz, 1 H) 4.73 - 5.14 (m, 1 H) 3.92 (br t, J = 5.39 Hz, 4 H) 3.77 (t, J = 6.43 Hz, 2 H) 3.34 - 3.40 (m, 2 H) 2.98 (br t, J = 4.56 Hz, 4 H) 2.32 (s, 3 H) 1.93 - 2.07 (m, 4 H) 1.58 - 1.85 (m, 4 H) 0.40 (s, 4 H). 19F NMR (376 MHz, DMSO-d 6) δ ppm -94.74 (s, 1 F). m/z (ESI): 565.2 (M+H)+.
당업자는 이들이 당업계에 알려진 종래의 기법을 사용함으로써 본 발명의 화합물을 이의 상응하는 약학적으로 허용 가능한 염으로 전환시킬 수 있음을 이해한다. 예를 들어, 예시된 화합물 C-1 내지 C-14를 이의 상응하는 HCl 염으로 전환시키기 위해, 당업자는 적절한 당량의 염산을 사용하고, 선택적으로 뒤이어 결정화 단계 및 건조 단계를 통해 HCl 염을 단리하는 것을 이해할 것이다.
실시예 12
하기 검정을 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 KIF18A 화합물을 시험하는 데 사용하였다. 아래 기재된 절차에 따라 시험된 이들 실시예에 대한 데이터를 아래 표 4에 제시한다.
KIF18A 효소 검정: 미세소관-자극 ATPase 활성 검정을 사용하여, 화합물을 이용한 처리 후 KIF18A 효소 활성을 측정하였다. 화합물을 22-점 농도 범위에 걸쳐 DMSO(Sigma Inc)에서 2배로 일련으로 희석시켰다. 재조합 인간 KIF18A(1-467 His-태깅된) 단백질을 baculovirus system을 사용하여 발현시키고, Amgen Inc.에 의한 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 반응에서 KIF18A 단백질, 미세소관(MT), 및 ATP의 농도를 ADP-GloTM 키나제/ATPase 검정 키트(Promega Inc)를 사용하여 표준화된 균질한 효소 검정에 대해 최적화하였다. 검정은 ATPase 반응으로부터 형성된 ADP를 측정한다. 반응 완충액[(15 mM 트리스, pH 7.5(Teknova Inc), 10 mM MgCl2(JT Baker Inc), 0.01% Pluronic F-68(Life Technologies Inc), 1 μM 택솔(Cytoskeleton Inc), 및 30 μg/mL 돼지 미세소관(Cytoskeleton Inc)]을 제조한다. 화합물 및 KIF18A 단백질(30 nM)을 첨가하여, 반응 완충액을 제조하고, RT에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, ATP(Km, 75 μM)를 반응 혼합물에 첨가하고, RT에서 추가의 15분 동안 인큐베이션한다. 5 μl의 ADP-GloTM 시약 및 2.5 μl의 반응 혼합물을 혼합하고, RT에서 40분 동안 인큐베이션한다. 10 μl ADP-GloTM 검출 시약을 첨가하고, RT에서 40분 동안 인큐베이션한다. 울트라-발광 모듈(Perkin Elmer Inc)과 함께 EnVision 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 발광을 판독한다. 4-파라미터 로지스틱 회귀 적합 모델과 함께 유전자데이터 스크리너 소프트웨어(Standard 15.0.1, Genedata Inc)를 사용하여 농도-반응 곡선-적합 및 IC50 결정을 수행하였다.
표 4는 하기와 같이 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 대표적인 KIF18A 화합물로서 본 출원에 예시된 화합물에 대한 데이터를 제공한다: 화합물 명칭 및 생물학적 데이터(적용 가능한 경우 IC50, uM. Ex. #는 실시예 번호를 지칭함)
[표 4]
표 4: 생물학적 데이터
Figure pct00087
Figure pct00088
실시예 13
이 실시예는 다제약물 내성 TP53MUT HGSOC 세포에서 KIF18A 저해제 활성을 실증한다.
항유사분열제, 예컨대 탁산에 대한 내성은 성공적인 암 치료에 대한 복잡한 인자이고, 종종 MDR-1 인코딩된 유전자 및 이의 생성물, P-당단백질(P-gp)의 증가된 발현과 관련이 있다. 실시예 1에 제시된 바와 같이, KIA18A 저해제에 대해 민감성을 발현한 모든 세포주는 돌연변이체 TP53 암 세포주였다. 여기서, KIF18A 저해제 치료에 대한 민감성을 TP53MUT 암 세포주에서 다제약물 내성의 존재 또는 부재 하에 평가한다.
P-당단백질(P-gp)의 저해제, 엘라크리다르(Elacridar)(GF120918)로 처리되거나 처리되지 않은 OVCAR-8 NCI/ADR 세포를 사용한 점을 제외하고는, KIF18A 저해제, 화합물 C14를 실시예 1에 본질적으로 기재된 바와 같이 4일 이미지-기초 핵 카운트 검정(NCA)에서 평가하였다. OVCAR-8 NCI-ADR 세포는 항암제에 대한 다제-약물 내성을 유도하는 것으로 알려진 약물 펌프 MDR1 또는 ABCB1 유전자(P-당단백질을 인코딩함)를 과발현한다(문헌[A Vert et al OncoTargets and Therapy 2018:11;221-37]). 비교 목적을 위해, 동일한 OVCAR-8 NCI/ADR 세포에서 파클리탁셀의 4일 이미지-기초 NCA를 화합물 C14 NCA와 함께 수행하였다. 간략하게는, OVCAR-8 세포를 Corning 96-웰 편평 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 플레이트(Corning, NY)에서 100 μL의 적절한 완전 배지에 적절한 밀도로 2벌로 시딩하고, 24시간 동안 성장시켰다. 하나의 플레이트 세트에서, 화합물 C14 또는 파클리탁셀 단독의 농도를 100 μL의 완전 배지 내로 일련으로 희석시키고, 그 후에, 0.5% DMSO를 함유하는 완전 배지에서 200 μL의 최종 부피로 세포에 첨가하였다. 제2 플레이트 세트에서, 화합물 C14 또는 파클리탁셀 단독의 농도와 함께 P-gp 저해제 GF120918(1 μM)을 배양 배지에 첨가하고, 100 μL의 완전 배지 내로 일련으로 희석시키고, 그 후에, 0.5% DMSO를 함유하는 완전 배지에서 200 μL의 최종 부피로 세포에 첨가하였다. 4일(96시간)의 처리 후, 각각의 웰로부터 100 μL의 완전 배지를 제거하고 이를 100 μL의 2x 포름알데하이드(최종 4%)로 대체하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 세포를 고정하였다. 고정 후, 세포를 투과시키고, 2 μg/mL Hoechst 33342 DNA 염료를 함유하는 200 μL 세척 완충액(1% BSA, 0.2% Triton X-100, 1X PBS)에서 염색하였다. 플레이트를 밀봉하고, 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 데이터 획득 시까지 세포를 암실에서 4℃에서 저장하였다. 이미지화 데이터를 Cellomics ArrayScan VTI HCS 판독기(SN03090745F, ThermoFisher Scientific) 상에서 표적 활성화 V4 검정 프로토콜(10X 대물렌즈와 함께 Ve 6.6.0(Build 8153), 웰당 16-필드를 수집함)을 사용하여 획득하였다. DMSO-치료된 대조군의 ± 3 SD 내에 있는 Hoechst 33342 핵 물질 특질(채널 1에서의 면적, 전체 및 가변 강도)을 사용하여 유효 물질 카운트를 결정하였다. 전체 유효 물질 카운트를 하기 식을 사용하여 카운트 POC(DMSO 대조군의 백분율)로서 나타내었다:
카운트 POC = (처리된 웰에서의 전체 유효 물질 카운트) χ (DMSO 처리된 웰에서의 전체 유효 물질 카운트) x 100.
화합물 농도 및 카운트 POC 값을 GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 플롯화하고, 곡선-적합을 4-파라미터 방정식(가변 기울기)으로 수행하였다. 농도-반응 곡선 및 표준 편차는 2벌로 진행된 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
KIF18A 저해제 NCA 및 파클리탁셀 NCA의 결과를 도 13a 및 도 13b에 각각 도시한다. P-gp 저해제의 부재 하에, KIF18A 저해제의 EC50은 P-gp 저해제의 존재 하에 KIF18A 저해제의 EC50보다 약 10배 더 높은 반면, P-gp 저해제의 부재 하에 파클리탁셀의 EC50은 1 μM 초과였고, P-gp 저해제의 존재 하에 파클리탁셀의 EC50은 훨씬 더 적었다(0.0017 μM). P-gp 저해제의 존재 하에 vs P-gp 저해제의 부재 하에 KIF18A 저해제 화합물 C14의 약효에서의 배수 변화는 10 미만인 반면, P-gp 저해제의 존재 하에 vs P-gp 저해제의 부재 하에 파클리탁셀의 약효에서의 배수 변화는 500 초과였다. 이들 결과는 KIF18A 저해제가 암세포, 심지어 다제약물 내성 암세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 시사한다.
실시예 14
이 실시예는 KIF18A 저해제 치료가 정상 체세포에 최소의 효과를 가짐을 실증한다.
KIF18A 저해제 치료가 정상 체세포(예를 들어, 신생물 세포가 아님)의 증식에 미치는 효과를 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 혼입 검정을 통해 인간 골수 단핵 세포(HBMNC), 1차 인간 표피 섬유아세포 세포(hFSF) 및 인간 유선 상피 세포의 증식을 검정함으로써 시험하였고, 이러한 검정에서 뉴클레오사이드 티미딘의 유사체인 BrdU를 사용하여 증식중인 세포를 식별한다(문헌[Payton et. al., Molecular Cancer Therapeutics, 17(12):2575-85(2018)]). 세포를 BD LSRFortessa 유세포분석기 상에서 BD FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였고, 획득-후 데이터 분석을 FSC-Express 소프트웨어(De Novo)를 사용하여 수행하였다. 적층된(stacked) DNA 함량 히스토그램 상에서의 BrdU 양성 게이팅된 사건의 백분율을 기록하였다.
예시적인 유세포분석 결과를 도 14a에 도시한다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 화합물 C9 또는 화합물 C11에 대한 세포 주기 DNA 함량 프로파일은 DMSO 처리된 세포와 유사하며, 이스피네십(Eg5), 항유사분열제(파클리탁셀), 또는 CDK 4/6 저해제(팔보시클립)로 처리된 세포와 대조적으로, 모두 Sub-G1(2N 미만) 집단(세포 사멸을 나타냄)에서의 증가를 포함하여 세포 주기 DNA 함량 프로파일에 두드러진 효과를 보여주었다.
KIF18A 저해제 치료가 HBMNC에 미치는 효과를 추가로 검사하기 위해, BrdU 커플링된 세포 주기 검정 및 세포 카운트 검정(96시간)을 사용하여 2명의 정상적인 공여자를 평가하였다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 제1 공여자로부터의 세포에서 관찰된 증식에 미치는 효과를 제2 공여자로부터의 세포에서 반복하였다. 특히, 이스피네십, 파클리탁셀, 또는 CDK 4/6 저해제(팔보시클립)로 처리된 BrdU-염색된 증식중인 세포의 양은 비히클 대조군-치료된 BrdU-염색된 세포의 양보다 훨씬 더 적었다. 대조적으로, KIF18A 저해제, 화합물 C9 또는 화합물 C11로 처리된 세포 내로 혼입된 BrdU의 양은 비히클 대조군-치료된 BrdU-염색된 세포과 거의 동일하였다. KIF18A 저해제 치료를 또한 살아 있는 세포 카운트에 미치는 영향에 대해 분석하였다. 96시간 후, 살아 있는 세포를 Vi-세포 XR 세포 생존력 분석기(Beckman Coulter)에 의해 카운팅하였다. 도 14c에 도시된 바와 같이, 이스피네십(Eg5), 항유사분열제(파클리탁셀), 또는 CDK 4/6 저해제(팔보시클립)로 처리된 세포는 비히클 대조군 처리된 세포에 비해 더 낮은 세포 카운트를 유발한 반면, KIF18A 저해제(화합물 C9, 화합물 C11)로 처리된 세포는 정상 세포 카운트에 효과를 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않았다. 도 14d 및 도 14e에 도시된 바와 같이, hFSF 및 인간 유선 상피(HMEC) 세포에서 BrdU 혼입에 미치는 효과는 DMSO 처리된 세포에 비해 10 μM 미만의 KIF18A 저해제(화합물 C11) 농도에서 영향을 받지 않았다. 대조적으로, BrdU 혼입의 저하는 이스피네십(Eg5), 또는 CDK 4/6 저해제(팔보시클립)로 처리된 세포에서 관찰되었다. 이들 결과는, 다른 항암제와 달리, KIF18A 저해제는 KIF18A 저해제 민감성 암세포에 대해 효과적인 농도에서 정상 체세포의 증식에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
이미지화 검정을 또한 수행하여, KIF18A 저해제 치료가 정상 체세포에 미치는 효과를 결정하였다. Arrayscan VTi 멀티플렉스 이미지화 검정을 아래 기재된 바와 같이 인간 FSF 세포로 수행하였다. 간략하게는, 정상 인간 표피 섬유아세포 세포를 96-웰 이미지화 플레이트(Corning)에 웰당 6000개 세포로 시딩하고, 밤새 배양하였다. 다음날, 2개의 복제 96-웰 플레이트를 10 μM(KIF18A 저해제 화합물 C11, 너틀린-3a), 1 μM(KIF18A 저해제 화합물 C9, BI-2536, 이스피네십, 파클리탁셀), 또는 5 μM(팔보시클립, GSK923295)의 상부 농도와 함께 3배 희석을 사용하여 9-점 농도 범위에 걸쳐 DMSO 또는 또는 시험제 패널로 처리하였다. 48시간의 처리 후, 하나의 플레이트를 BrdU(Invitrogen)로 3시간 동안 펄스 처리한 후 고정하였다. 96-웰 플레이트를 둘 다 4% 포름알데하이드(Thermo Scientific)로 고정하고, 세척 완충액 [PBS, 1% BSA(Thermo Fisher), 0.2% Triton X-100(Sigma)]으로 2회 세척하였다. 제1의 96-웰 플레이트를 산 세척을 사용한 BrdU 에피토프 검출에 대해 가공하고, 말 혈청(10 mL당 4 방울의 혈청)(Vector Labs)이 보충된 세척 완충액에서 4℃에서 밤새 차단시키고, 항-BrdU-AlexaFluor-647(B35140, Invitrogen, 마우스, mL당 3 μg) 및 항-p21(12D1)(2947, Cell Signaling, 토끼, 1:400) 항체로 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 세포를 세척 완충액에서 2회 세척하고, 2차 항체[항-토끼-IgG-AlexaFluor-488(A11034, Invitrogen, 1:2000)]로 염색하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 제2의 96-웰 플레이트를 말 혈청(10 mL당 4 방울의 혈청)(Vector Labs)이 보충된 세척 완충액에서 4℃에서 밤새 차단시키고, 항-cl-PARP(214/215)(44-6986, Invitrogen, 토끼, 1:1500) 및 항-γH2AX(05-636, Millipore, 마우스, 1:1000) 항체로 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 세포를 세척 완충액에서 2회 세척하고, 2차 항체[항-토끼-IgG-AlexaFluor-647(A21245, Invitrogen, 1:2000), 항-마우스-IgG-AlexaFluor-488(A11029, Invitrogen, 1:2000)]로 염색하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트 둘 다 2회 세척하고, Hoeschst 33342(Invitrogen) 핵 염료로 대조염색하였다. 이미지화 데이터를 ArrayScan VTi HCS 판독기(Thermo Scientific) 상에서 20X 대물렌즈를 사용하여 웰당 64개 필드로부터 와이드필드 이미지화에 의해 수집하였다. 유효 핵 물질 카운트, 뿐만 아니라 각각의 시험제 농도 및 DMSO 대조군에 대한 BrdU, p21, cl-PARP, 및 γH2AX 양성 물질의 백분율을 각각의 웰에 대해 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(V7.0.4)를 사용하여 농도-반응 히트맵을 생성하였다.
결과를 도 15a 내지 도 14e에 도시한다. 도 15a 밑 도 15b에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제(화합물 C11 또는 화합물 C9)로 처리된 세포는 전체 물질 카운트 및 BrdU 혼입의 측면에서 비히클 대조군 처리된 세포처럼 거동하였고, 이는 세포 증식에 미치는 최소의 효과를 나타낸다. 도 15c 내지 도 15e에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제(화합물 C11 또는 화합물 C9)로 처리된 세포는 cl-PARP 발현에 의해 측정된 아폽토시스의 어떠한 유도도 보여주지 않았거나(도 15c), p21 단백질 발현의 유도에 의해 측정되는 어떠한 세포 주기 억제도 보여주지 않았거나(도 15d), γHH2X 발현의 증가에 의해 측정되는 DNA 손상의 어떠한 유도도 보여주지 않았다. 모든 비교제는 DMSO 대조군에 비해 이들 마커 중 하나 이상을 유도하였다. 이들 결과는 다른 항암제와 달리 KIF18A 저해제가 정상 체세포에서 증식에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
종합하자면, 이들 결과는 KIF18A 저해제의 효과가 암세포-특이적이고, 정상 체세포에 독성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않고, KIF18A 저해제 치료가 대상체에서 정상 체세포의 증식의 실질적인 저하의 결여 및/또는 정상 체세포의 아폽토시스의 실질적인 증가의 결여에 의해 실증되는 바와 같이 정상 체세포에 대한 명시적인 독성 없이 신생물 질환을 치료하고/하거나, CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 민감성을 유지시키고/시키거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 데 효과적임을 시사한다.
실시예 15
이 실시예는 KIF18A 유전자 발현을 감소시키는 RNA-기초 KIF18A 저해제를 실증한다.
이 연구에 사용하기 위해 일련의 7개의 KIF18A siRNA를 3개의 상이한 업체(Qiagen, Dharmacon, Ambion)로부터 수득하였다. 비-표적화 대조군(NTC) siRNA 및 Eg5(hKIF11) siRNA를 또한 수득하였고 이는 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 역할을 하였다. siRNA의 뉴클레오타이드 서열을 표 5에 나열한다.
[표 5]
Figure pct00089
Figure pct00090
NTC(비-표적화 대조군); *업체에 의해 제공된 바와 같다
각각의 siRNA의 KIF18A 넉다운 효율을 BT-549, 및 HMEC 세포에서 웨스턴 분석에 의해 시험하였다. 간략하게는, BT-549, 및 HMEC 세포를 6-웰 플레이트(Thermo Scientific)에 웰당 2.0 x 105개 세포로 시딩하고, 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 10 nM 개별 KIF18A siRNA(n = 7) 또는 NTC siRNA(NTC_2)와 함께 RNAiMax 리포펙타민을 제조업체(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 사용하여 RNA-지질 복합체로 처리하였다. 48시간 후, 세포 용해물을 RIPA 완충액을 사용하여 제조하고, 웨스턴 분석을 위해 가공하였다. β-액틴의 수준을 검정하여, 각각의 레인에서 동일한 단백질 로딩을 실증하였다.노코다졸로 밤새 처리된 HeLa 세포를 유사분열 분획 양성 대조군으로서 사용하고, 스타우로스포린으로 처리된 Jurkat 세포를 아폽토시스 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 각각의 KIF18A siRNA(KIF18A_1 내지 KIF18A_7)는 HMEC 및 BT-549 세포에서 KIF18A 단백질 발현을 효과적으로 결핍시킨 반면, 대조군 siRNA(NTC_2)로 형질주입된 세포는 기준선 KIF18A 발현을 보여주었는데, 예상된 바와 같이 HeLa 세포 유사분열 분획은 높은 수준의 KIF18A 발현을 나타내었다. 이들 데이터는 KIF18A 저해제, 예컨대 KIF18A siRNA가 정상 체세포(비암성) 유방 상피 세포에서 아폽토시스의 증거 없이 BT-549 유방암세포의 아폽토시스를 유도함을 보여준다.
실시예 16
이 실시예는 RNA-기초 KIF18A 저해제가 암세포에 미치는 효과를 알아본다.
siRNA-매개 KIF18A 결핍에 의해 유도되는 민감성 및 표현형 패턴을 결정하기 위해, 8개 암 세포주(7개의 유방, 1개의 난소), 뿐만 아니라 1개의 정상 인간 유선 상피 세포주(HMEC)의 패널을 조립하였다. 암 세포주를 종양 하위유형 및 유전적 배경(TP53, RB1, CCNE1)에 기초하여 선택하였다.
이미지화-기초 핵 카운트 검정을 사용하여, 패널을 사용하여 4일 동안 처리된 비-표적화 대조군(NTC, n = 9) 및 세포독성 대조군(KIF11(Eg5), n = 2)이 세포에 미치는 효과와 비교하여, KIF18A(n = 7)에 대한 개별 siRNA의 항증식 효과를 결정하였다. 세포는 세포 성장의 50% 초과의 저해가 관찰되었을 때 KIF18A siRNA 민감성인 것으로 여겨졌다. 도 17a 및 도 17b에 도시된 바와 같이, KIF18A siRNA 민감성을 모든 3개의 CCNE1 증폭된 라인 HCC-1806(TNBC), MDA-MB-157(TNBC), OVCAR-3(HGSOC) 및 RB1-결핍 BT-549 TNBC 라인에서 관찰하였다. KIF18A siRNA 둔감성 유방암 세포주는 TP53 야생형(4 중 3), RB1 능숙(4 중 4), 에스트로겐 수용체 상태(ER 양성 4 중 2 및 ER 음성 4 중 2)였다. 거의 정상적인 핵형을 갖는 TP53 야생형 CAL-51 TNBC 세포는 KIF18A siRNA뿐만 아니라 정상 HMEC 라인에 대해 둔감성이었고, 이는 불멸화된 인간 망막 색소 상피 세포주(hTERT-RPE1)에서의 발견과 일치하였다. 대조적으로 그리고 예측된 바와 같이, Eg5 siRNA는 세포주 패널에 걸쳐 세포독성이었고, 이는 체세포 분열을 위한 이의 필수성을 실증한다(도 17a). NTC 대조군에 비해 KIF18A siRNA의 결과를 도 17a에 제공하고 표(도 17b)에 요약하며, 요약 표는 세포주 정보, 유전적 배경, 및 KIF18A vs NTC siRNA 군 통계학적 평가(t-검정) 및 세포 성장에서의 저하 수준을 함유한다. KIF18A 단백질 발현은 세포주 패널에 걸쳐 다양하였고, 민감성과 어떠한 직접적인 상관관계를 보여주지 않았다(도 17c).
종합하자면, 이들 결과는 KIF18A 발현을 결핍시키는 KIF18A siRNA가 TP53, CCNE1, 및 RB1에 관하여 특정 유전적 배경의 암세포에 대해 선택적 항증식 활성을 실증함을 실증하고, 이 결과는 이전의 관찰과 일치한다(예를 들어, 실시예 1 내지 10). 이들 결과는 또한, KIF18A siRNA가 암세포의 아폽토시스를 유도하고 암세포의 성장을 저해할 수 있음을 시사한다.
실시예 17
이 실시예는 실시예 15 및 16에 사용된 물질 및 방법을 기재한다.
세포주. 달리 명시되지 않는 한 모든 인간 암 세포주를 ATCC 또는 DSMZ(GmbH)를 수득하였다. 세포주는 짧은 탠덤 반복부(STR) DNA 분석을 사용하여 ATCC에 의해 인증을 받았고 ATCC 또는 ExPasy STR 데이터베이스를 참조하였다. 정상 인간 유선 상피 세포(HMEC)를 Lonza Inc로부터 구매하였다. 모든 세포주 배양물을 37℃및 5% CO2의 분위기에서 유지하였다.
이미지화 검정
ArrayScan VTi 핵 카운트 검정(siRNA). 세포주 패널(HCC-1806, BT-549, MDA-MB-157, OVCAR-3, MCF-7, CAL-51, MDA-MB-453, ZR-75-1, HMEC)을 96-웰 이미지화 플레이트(Corning)에 로그기(log phase) 세포 성장을 위해 개별적으로 최적화된 밀도로 시딩하였다. 다음날, 세포를 10 nM 개별 siRNA[KIF18A(n = 7), Eg5(n = 2), NTC(n = 9)], siRNA 세부사항(표 5) 및 0.3 μL RNAiMax 리포펙타민(Invitrogen)을 제조업체(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 함유하는 RNA-지질 복합체로 처리하였다. 4일 후, 세포를 4% 포름알데하이드(Thermo Scientific)로 고정하고, PBS(Invitrogen)로 세척하고, 세척 완충액[PBS, 1% BSA(Thermo Fisher), 0.2% Triton X-100(Sigma)] 중 Hoechst 33342(Invitrogen) 핵 염료로 염색하였다. Target Activation BioApplication(Thermo Scientific)을 사용하는 10X 대물렌즈가 장착된 Cellomics ArrayScan VTi HCS 판독기(Thermo Scientific)를 사용하여 유효 핵 물질(대조군 웰에 대한 평균 핵 물질 면적의 3개의 SD 내에서)을 열거하였고, 유효 핵 물질 카운트 데이터를 웰당 16개의 이미지 필드에 대해 수집하였다. GraphPad Prism 7.04(GraphPad 소프트웨어)를 사용하여 그래프화 및 통계학적 분석을 수행하였다. 데이터를 2벌로 진행된 2개의 독립적인 실험으로부터의 집계된 총합 siRNA 카운트 데이터로부터의 평균 핵 카운트 및 평균의 표준 오차(SEM)로서 표시한다[KIF18A(n = 28), Eg5(n = 8), NTC(n = 36)]. NTC 및 KIF18A siRNA 군을 비교하는 독립(unpair) t-검정을 사용하여 유의성을 계산하였다.
웨스턴 분석:
웨스턴 분석 방법. 프로테아제 및 포스파타제 저해제(Roche)의 칵테일이 보충된 RIPA 완충액(Sigma) 또는 MinuteTM 전체 단백질 추출 키트(Invent Biotechnologies)를 사용하여 비-접착성 세포 분획과 접착성 세포 분획을 조합함으로써 세포 용해물을 제조하였다. 브래드포드 염료-결합 방법(Bio-Rad)을 사용하여 전체 단백질 농도를 결정하고, 용해물을 -80℃에서 저장하였다. 단백질을 단백질 크기에 기초하여 트리스-글리신 겔(Invitrogen)에서 분해하고, PDVF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 단백질 막을 10 mL의 차단 완충액[세척 완충액(PBS, 0.5% Tween-20), 5% 분유(Albertsons), 3 방울의 말 혈청(마우스 항체에 대해, Vector Labs) 또는 염소 혈청(토끼 항체에 대해, Vector Labs)]에서 실온에서 오비탈 진탕기 상에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체를 차단 완충액에 첨가하고, 4℃에서 오비탈 진탕기 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 3회(매회 15분) 세척하고, 뒤이어 Vectastain ABC 키트(PK-4002(마우스), PK-4001(토끼), Vector Labs)를 사용하여 2차 항체를 처리하였다. 웨스턴 광 화학발광 시약(Perkin Elmer)을 이용하여 단백질 검출을 수행한 후, 필름(USA Scientific) 상에서 막을 발색시켰다.
웨스턴 분석 항체. 항-절단-PARP(cl-PARP)(51-900017, BD Pharmingen, 마우스, 1:500), 항-β-액틴(A5441, Sigma, 마우스, 1:5000), 항-KIF18A(HPA039484, Sigma, 토끼, 1:2000).
기준선 KIF18A 및 사이클린 E1 발현의 평가. 세포주 패널을 6-웰 플레이트(Thermo Scientific)에서 로그기 세포 성장을 위해 개별적으로 최적화된 밀도로 시딩하였다. 대략 80% 부유도에서, 세포를 수합하고, 세포 용해물을 RIPA 완충액을 사용하여 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 분석을 위해 가공하였다.
KIF18A siRNA 넉다운 효율의 평가. HMEC, 및 BT-549 세포를 6-웰 플레이트(Thermo Scientific)에 웰당 2.0 x 105개 세포로 시딩하고, 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 10 nM 개별 KIF18A siRNA(n = 7) 또는 NTC siRNA(NTC_2)와 함께 RNAiMax 리포펙타민을 제조업체 프로토콜(Invitrogen)에 따라 사용하여 RNA-지질 복합체로 처리하였다. 개별 siRNA에 대한 정보를 표 5에 제시한다. 48시간 후, RIPA 완충액을 사용하여 세포 용해물을 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 분석을 위해 가공하였다. 0.1 μg/mL의 노코다졸(Millipore)로 밤새 처리된 HeLa 세포를 유사분열 분획 양성 대조군으로서 사용하였다. Jurkat 세포를 cl-PARP 양성 대조군으로서 24시간 동안 1 uM의 스타우로스포린으로 처리하였다.
실시예 18
이 실시예는 하나 이상의 전체 게놈 배가(WGD) 사건을 포함하는 TP53MUT 인간 유방 및 난소 암 세포주가 KIF18A 저해제 치료에 대한 풍부화와 상관관계가 있음을 실증한다.
KIF18A 저해제 화합물 C9를 59개의 유방 및 난소 암 세포주를 포함한 PRISM 분자 바코드 암 세포주 패널을 사용하여 스크리닝하였다(문헌[Channing Yu et all, Nature Biotech 2016 Apr;34(4):419-23], 문헌[Steven M Corsello et al Nature Cancer 2020 Feb;1(2):235-248]). 간략하게는, 풀 바코드 세포주를 화합물 C9(8점, 2.5 μM 내지 0.001 μM)로 5일 동안 처리하였다. 곡선-적합 분석을 수행하고, 곡선 아래 면적(AUC) 가변성 값을 각각의 세포주에 대해 계산하였다. 각각의 암 세포주에 대한 WGD 상태 콜을 Quinton et al BioRxiv, 2020.06.18.159095; doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.18.159095로부터 수득하였다. 0, 1 또는 2의 WGD 점수를 상기 문헌 Quinton et al., 2020에 따라 각각의 세포주에 대해 지정하였다. 이러한 상관관계 분석에서, 암 세포주를 2개 군 중 하나에 지정하였다: WGD 음성(0 WGD 사건) 또는 WGD 양성(1 또는 2 WGD 사건). 각각의 암 세포주에 대한 TP53 상태 콜을 Broad Institute 암 의존도 맵으로부터 수득하였다(depmap.org, Mutation DepMap Consortium 20Q2). "TP53 핫스팟" 상태 콜은 세포주가 TP53 돌연변이를 보유하였음을 나타내고, "TP53 기타" 상태 콜은 세포주가 야생형 상태를 가졌음을 나타내었다. 다음, 각각의 세포주에 대한 KIF18A 저해제 화합물 C9 AUC 값을 4개 군으로 그래프화하였다: (1) TP53 기타 WGD(-), (2) TP53 기타 WGD(+), (3) TP53 핫스팟 WGD(-), 및 (4) TP53 핫스팟 WGD(+). 화합물 C9 AUC 가변성 값이 낮을수록, 세포주는 KIF18A 저해제 치료에 대해 더 민감성이었다. 0.65 미만의 AUC 역치는 KIF18A 저해제 민감성을 나타내는 것으로 설정되었다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터 및 통계학적 검정(독립 t-검정, TP53 핫스팟 WGD(-) 대 WGD(+))의 그래프화를 수행하였다. 결과를 도 18에 도시한다.
도 18에 도시된 바와 같이, KIF18A 저해제 민감성은 TP53MUT 암세포(p-값 = 0.00044)에서의 WGD 양성 사건과 통계학적으로 유의하게 상관관계가 있었고, 이는 KIF18A 저해제가 하나 이상의 WGD 사건을 포함하는 TP53MUT 암세포의 성장을 감소시키고/시키거나 아폽토시스를 유도함을 시사한다. 이들 데이터는 TP53 MUT + 하나 이상의 WGD 사건을 갖는 인간 암이 KIF18A 저해제 치료법에 반응하는 가능성이 크다는 것을 지지한다.
실시예 19
이 실시예는 3개의 KI18A 저해제의 특징화를 기재한다.
KIF18A 저해제 트리오(화합물 C9, 화합물 C11, 및 화합물 C12)를 합성하고, 시험관내에서 KIF18A 저해 활성에 대해 시험하였다. 도 19a는 KIF18A 운동 활성의 ADP-Glo 농도-반응 프로파일을 도시한다(DMSO 대조군(POC)에 비해 MT-ATPase 발광 신호로서 제시됨). 값을 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로서 제시한다. 도 19a에 도시된 바와 같이, 모든 3개의 KIF18A 저해제 C9, C11, 및 C12는 강력한 인간 KIF18A 저해 활성을 나타내었다. C9, C11 및 C12에 대한 IC50은 각각 0.180 μM, 0.07 μM, 및 0.04 μM이었다. 마우스에서의 생체내 연구가 계획된 바와 같이, 화합물 C9 및 C12의 마우스 KIF18A 저해 효과를 검정하였다. 마우스에서 화합물 C9 및 C12에 대한 IC50은 각각 0.232 μM 및 0.039 μM이었고, 그러므로, C9 및 C12의 KIF18A 저해 효과는 마우스 및 인간 KIF18A 운동에 본질적으로 동등하였음을 실증하였다.
KIF18A 저해제 암 세포주 민감성 프로파일을 KIF18A 저해제 화합물 C9 및 C11에 대해 결정하였다. 다양한 암 세포주의 세포를 DMSO 또는 증가하는 농도의 C9 또는 C11로 96시간 동안 처리하였다. C9에 대한 암 세포주의 예시적인 농도-반응 프로파일을 도 4c 내지 도 4f에 제공한다. C11에 대한 일부 암 세포주(예를 들어, BT-549, OVCAR-3을 포함함)의 농도-반응 프로파일은 유사하였다. KIF18A 저해제-민감성 세포(예를 들어, OVCAR-3 및 BT-549)에서 C9 및 C11에 대한 평균 카운트 EC50 값은 각각 0.021 μM 및 0.047 μM이었다. 암 세포주 CAL-51, MDA-MG-453 및 OVCAR-5는 C9 및 C11에 대해 둔감성이었다. 흥미롭게도, C9 및 C11에 대한 민감성 프로파일은 CDK 4/6 저해제와 반대되었는데: KIF18A 저해제 C9 및 C11에 대해 민감성인 암 세포주는 CDK 4/6 저해제에 대해 둔감성인 한편, KIF18A 저해제 C9 및 C11에 대해 둔감성인 이들 암 세포주는 CDK 4/6 저해제에 대해 민감성이었다.
화합물 C9, C11, 및 C12의 KIF18A 저해 활성이 세포성 맥락으로 번역될 것인지의 여부를 조사하기 위해, MDA-MB-157 세포에서 pH3 및 PCM 스팟 EC50 값을 결정하였고, 결과는 유사분열 평가변수 사이에서 완벽에 가까운 약효 정렬을 실증하였다. 사실상, 세포 약효는 대조군 화합물에 비해 화합물 C11(70배 초과), 화합물 C9(450배 초과), 및 화합물 C12(120배 초과)에 대해 크게 향상되었다.
KIF18A 저해제 치료 후 반응의 지속성을 더 잘 이해하기 위해, 모든 5개의 KIF18A 저해제-민감성 암 세포주를 6일 세포 성장 검정에서 DMSO 또는 화합물 C11로 처리하였고, 여기서 생존하는 세포를 세척하고, 수집하고, 카운팅하고, 약물-무함유 성장 배지에 재평판배양하고, 추가의 7일 내지 9일 동안 배양하였다. CDK 4/6 저해제로 처리된 MCF-7 세포를 세포정지(cytostatic) 비교물질로서 포함시켰다. 예상된 바와 같이, 화합물 C11을 이용한 처리는 세포 성장 및 콜로니 형성에서 유의한 저하를 보여주었고, 주목할 만하게는 화합물 C11에 이전에 노출된 세포는 DMSO 대조군에 비해 두드러지고 CDK 4/6 저해제로부터 별개의 감소 세포 성장 잠재력을 보여주었다. HCC-1806 및 BT-549 세포는 KIF18A 저해제 제거 후 다른 세포주에 비해 더 큰 재성장 잠재력을 보여주었다.
KIF18A 저해제가 이러한 정상적인 세포 독성 장벽을 피할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 화합물 C9 및 C11가 주기 정상 체세포 유형 패널에 미치는 효과를 조사하였다. 우선, 본 발명자들은 2명의 정상 공여자로부터의 인간 골수 단핵 세포(HBMNC)를 DMSO, 1 μM에서의 화합물 C9 및 C11, 0.05 μM에서의 이스피네십, 0.05 μM에서의 파클리탁셀, 또는 1 μM에서의 팔보시클립으로 48시간(세포 주기) 또는 96시간(세포 성장) 동안 처리하였다. 뚜렷하게도, 세포 주기 분석은 KIF18A 저해제 치료가 3개의 비교제와 별개로 DMSO 대조군에 비해 BrdU 혼입(DNA 합성의 직접 측정치)에서 최소의 감소를 가졌고, 이스피네십 및 파클리탁셀은 명백히 세포독성인 반면, CDK4/6 저해제는 대체로 세포정지성이었음을 드러내었다. 96시간에서의 세포 성장 분석은 KIF18A 저해제와 DMSO 대조군 둘 모두에 대해 대등한 세포 카운트를 보여준 반면, 세포 성장에서의 명백한 감소는 이스피네십 및 파클리탁셀에 대해 관찰되었고(약 88% 감소), 팔보시클립에서는 덜 한 정도로 관찰되었다(68% 감소).
KIF18A 저해제 둘 모두를 이용해 관찰된 종양 PD 효과가 종양 효능을 초래할 것인지의 여부를 확립하기 위해, OVCAR-3 종양을 갖는 누드 마우스(130 mm3, n = 10)에게 비히클 단독, 100 mg/kg에서의 화합물 C9, 또는 25 mg/kg에서의 화합물 C12를 연속 18일 동안 매일 1회 IP 투여하였다. 뚜렷하게도, C9와 C12는 둘 모두 73% 및 46% 종양 퇴화를 각각 유도하였다(p < 0.0001)(도 19b). C9 및 C12 치료는 체중 소실 또는 혈액 카운트(호중구, 망상적혈구, 림프구, 단핵구, 적혈구, 및 백혈구 세포)에서의 변화의 어떠한 증거 없이 마우스에게 양호한 내약성이 있었고, C12(p = 0.043)를 이용한 경우 단핵구에서 저하가 예상되었다. 말기(terminal) PK 분석은 C9 및 C12 혈장 AUC 값을 각각 130 μM·h 및 53 μM·h로 드러내었다. 근이배체(near-diploid) 종양 모델에서 KIF18A 저해제의 항종양 활성을 평가하기 위해, CAL-51 종양을 갖는 누드 마우스(140 mm3, n = 10)에게 비히클 단독, 100 mg/kg에서의 C9, 또는 25 mg/kg에서의 C12를 연속 18일 동안 매일 1회 IP 투여하였다. CAL-51은 시험관내에서 C9 및 C11에 대해 둔감성인 것으로 실증된 암 세포주였다. KIF18A 저해제는 둘 다 비히클 대조군에 비해 CAL-51 종양 성장에 어떠한 관찰 가능한 효과를 보여주지 않았다(도 19c). OVCAR-3 연구와 일치하여, KIF18A 저해제 치료는 체중 소실의 어떠한 증거 없이 마우스에게 내약성이 양호하였고(도 19b), 말기 PK 분석은 연구 사이에서 대등한 혈장 농도-시간 프로파일을 보여주었다.
생체내에서 HGSOC에서 KIF18A 저해제 활성을 추가로 조사하기 위해, OVCAR-8 종양을 갖는 마우스(145 mm3, n = 10)에게 비히클 단독, 50 또는 100 mg/kg에서의 C9, 또는 25 또는 50 mg/kg에서의 C12를 연속 18일 동안 매일 1회 IP 투여하였다. 도 19d에 도시된 바와 같이, C9 또는 C12를 이용한 치료는 50 및 100 mg/kg에서 16% 및 73% 종양 퇴화(p < 0.0001) 및 25 및 50 mg/kg에서 19% 및 75% 종양 퇴화를 각각 초래하였다. 이전과 같이, KIF18A 활성의 저해는 체중 소실의 어떠한 증거 없이 마우스에게 내약성이 양호하였다(도 19d). 매칭된 용량에서, 혈장 AUC 값은 다른 효능 연구에 비해 OVCAR-8 연구에서 C12에 대해 2.8배인 반면, C9 PK 프로파일은 연구에 걸쳐 대등하였다.
종합하자면, 이들 생체내 데이터는 내약성이 양호한 용량에서 두드러진 종양 퇴화 및 완건한 종양 PD 반응과 함께 KIF18A의 저분자 저해제를 이용한 항암 활성의 최초의 증거를 제공한다.
실시예 20
하기 물질 및 방법을 실시예 19의 연구에 사용하였다.
세포주. 달리 명시되지 않는 한 모든 인간 암 세포주를 ATCC 또는 DSMZ(GmbH)로부터 확보하였다. 세포주는 짧은 탠덤 반복부(STR) DNA 분석을 사용하여 ATCC에 의해 인증을 받았고 ATCC 또는 ExPasy Cellosaurus(Robin et al 2020) STR 데이터베이스를 참조하였다. OVCAR-5, OVCAR-8, 및 OVCAR-8 NCI/ADR-RES(ADRRES로도 알려져 있음)(Vert et al 2018) 세포주를 국립 암 연구소로부터 확보하였다. 인간 골수 단핵 세포(HBMNC) 및 인간 유선 상피 세포(HMEC)를 Lonza Inc로부터 확보하였다. 인간 T-세포를 HemaCare Inc로부터 확보한 Leukopaks로부터 단리하였다. MDA-MB-157 Cas9 세포주를 Cellecta Inc로부터 확보하였다. α-튜불린-EGFP 및 H2B-mCherry 단백질을 발현하는 Kyoto HeLa 세포주를 Creative Bioarray Inc로부터 확보하였다. 모든 세포주 배양물을 37℃, 5% CO2의 분위기에서 유지하였다. 생체내 연구에 사용된 OVCAR-3, CAL-51, 및 OVCAR-8 세포주는 미코플라즈마 및 뮤린 바이러스 병원체 패널에 의한 오염이 없는 것으로 결정되었다. 종양 조직 유형, 종양 하위유형, TP53 돌연변이 상태, RB1 및 CCNE1 상태, 및 전체 게놈 배가(WGD) 상태에 대한 세포주 정보는 교차 참조된 공개 데이터 소스(DepMap Consortium, IARC TP53 데이터베이스, Sanger Cell Model Passport, Broad Institute CCLE, ATCC, DSMZ) 및 공개된 연구(Domcke et al 2013, Dai et al 2017, Quinton et al 2020)에 기초하였다.
화학. 분자 구조는 화합물 BI-2536(Steegmaier et al 2007), BTB-1(Catarinella et al 2009), 독소루비신(Carvalho et al 2009), 겜시타빈(Pourquier et al 2002), GF120918(Hyafil et al 1993), GSK923295 및 이스피네십(Rath and Kozielski 2012), 너틀린-3a(Vassilev 2004), 파클리탁셀 및 도세탁셀(Perez 2009), 팔보시클립(O'Leary et al 2016)에 대해 개시되었고, KIF18A 저해제 화합물은 Amgen에 의해 합성되었다.
KIF18A 저해제 활성
KIF18A 화합물 C9, C11, C12를 384-웰 플레이트(Corning)를 사용하여 DMSO에서 22-점 농도 범위에 걸쳐 2배로 일련으로 희석시켰다. 재조합 절두된 키네신 운동 단백질(인간 KIF18A(잔기 1 내지 467, 4 nM), 마우스 KIF18A(잔기 1 내지 467, 4 nM))을 발현시키고 정제하였다. ADP-Glo 발광 검정(Promega)을 사용하여, MT-ATPase 운동 활성을 측정하였다. 돼지 뇌 MT를 Cytoskeleton Inc로부터 확보하였다. 화합물을 상기 지시된 농도의 운동 단백질과 함께 반응 완충액(15 mM 트리스, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.01% Pluronic F-68, 2% DMSO, 1 μM 파클리탁셀, 30 μg/mL MTs)에서 30분 미만 동안 사전인큐베이션하고, 30 μM ATP를 첨가하여, 실온(RT)에서 15분 동안 효소 반응을 개시하였다. ADP-Glo 시약을 제조업체의 프로토콜에 따라 첨가하고, 존재하는 ADP에 비례하는 발광 강도를 EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. 원 발광 신호 데이터를 POC(양성 대조군의 백분율)로 정규화한 다음, 활성(%)를 계산하였다[POC = 100 x(시료 신호 - 음성 대조군 신호) χ (양성 대조군 신호 - 음성 대조군 신호). 활성(%) = POC - 100]. 양성 대조군(효소 + 기질) 및 음성 대조군(기질 단독)은 동등한 농도의 DMSO를 가졌다. 곡선-적합 및 IC50 값을 GraphPad Prism 7.05(GraphPad 소프트웨어)를 사용하는 4-파라미터 비선형 회귀 방정식(가변 기울기)에 의해 결정하였다.
세포 성장 검정. 세포주 패널(HCC-1806, HCC-1937, BT-549, MDA-MB-157, MCF-7, CAL-51, MDA-MB-453, ZR-75-1, OVCAR-3, OVCAR-5)을 96시간 세포 성장 검정에 대해 최적화된 밀도에서 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 세포를 DMSO 또는 하기 화합물 중 하나로 처리하였다: 스태거드 용량 방법을 사용하여 6 μM(19-점 농도 범위)의 상부 농도와 함께, KIF18A 저해제 화합물 C9 및 C11, 또는 팔보시클립. 96시간 후, 세포를 상기 기재된 바와 같이 고정하고, 염색하고, 이미지화하고, 분석하였다. 유효 핵 물질 카운트를 각각의 웰에 대해 결정하고, 카운트 POC 값을 하기 식 [카운트 POC = (처리된 웰 내 유효 핵 물질 카운트) ÷ (DMSO 처리된 웰 내 유효 핵 물질 카운트) x 100]을 사용하여 계산하였다. GraphPad Prism 7.05를 사용한 4-파라미터 비-선형 회귀 방정식에 의해 농도-반응 곡선-적합을 수행하였다. 2벌로 진행된 2개의 독립적인 실험으로부터 각각의 세포주에 대한 평균 카운트 EC50 값을 계산하였다. 50% 초과의 최대 반응이 상부 농도에 도달되지 않는다면, 세포주는 6 μM의 카운트 EC50 값이 지정되었고 둔감성인 것으로 여겨졌다. 평균 카운트 EC50 값을 각각의 시험 제제에 대해 민감성 세포주에 걸쳐 계산하였다.
BrdU 및 세포 주기 분석. 2명의 정상 공여자(#37612, #37534)로부터의 인간 골수 단핵 세포(HBMNC)를 이전에 기재된 바와 같이 정의된 배지에서 8일 동안 배양하였다(Payton et al 2018). HBMNC를 2벌 플레이트에서 24-웰 플레이트에 웰당 1.2 x 106개 세포로 시딩하였다. 세포를 DMSO, 화합물 C9(1 μM), 화합물 C11(1 μM), 이스피네십(0.05 μM), 파클리탁셀(0.1 μM), 또는 팔보시클립(1 μM)으로 처리하였다. 세포를 48시간(세포 주기) 및 96시간(세포 성장)에서 수집하였다. 제1 세트의 플레이트를 BrdU로 2시간 동안 펄스 처리하고, 이전에 기재된 바와 같이 BrdU 세포 주기 분석을 위해 가공하였다(Payton et al 2018). 세포를 BD LSRFortessa 유세포분석기 상에서 BD FACSDiva 소프트웨어를 실행시켜 분석하였고, 획득-후 데이터 분석을 FSC-Express 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 데이터를 BrdU 및 subG1 게이팅된 집단의 백분율에 대해 보고하였다. 제2 세트의 플레이트를 수집하고, 세포를 Vi-세포 XR 세포 가변성 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 카운팅하였다. GraphPad Prism 7.05를 사용하여 각각의 공여자에 대해 그래프화를 수행하였다.
OVCAR-3 종양 이종이식 효능 연구
마우스의 우측 옆구리에 인간 OVCAR-3 세포(5.0 x 106)를 피하 주사하였다. 확립된 종양을 갖는 동물을 4개 군(군당 n = 10)으로 무작위화하였고 평균 종양 부피는 130 mm3였다. 동물에게 매일 비히클 단독, 매일 C9(100 mg/kg), 또는 매일 C12(25 mg/kg)를 IP 투여하였다. 치료는 종양 이식 후 제24일에 시작하였고, 제42일에 치료를 종료하였다. 종양 부피 및 체중을 디지털 캘리퍼 및 분석용 실험실 저울을 각각 사용하여 주당 2회 기록하였다. 제42일에서의 최종 투여 후, 완전한 혈액 카운트 분석(치료군당 n = 6)을 IDEXX Inc에 의해 수행하였다. 혈장 약물동력학 분석을 2, 4, 8, 16 및 24시간(시점당 n = 2)에서 C9 및 C12에 대해 표준 LC-MS/MS 방법에 의해 수행하였다. 종양 성장 저해의 백분율(TGI%)을 비히클 대조군에 비한 TGI%로서 계산하였다: TGI% = 100 - [(치료 - 초기 부피)/(대조군 - 초기 부피) x 100]. 종양 퇴화 백분율(TR%)을 초기 종양 부피에 대해 비교된 최종 종양 부피 TR%로서 계산하였다: TR% = 100 - [(최종 부피)/(초기 부피) x 100]. GraphPad Prism 7.05를 사용하여 데이터를 그래프화하였다. 치료군 상에서 각각 반복된 측정치 ANOVA 및 일원 ANOVA, 뒤이어 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 종양 성장 및 혈액 카운트에 대해 통계학적 분석을 수행하였다.
CAL-51 종양 이종이식 효능 연구
마우스의 우측 옆구리에 인간 CAL-51 세포(5.0 x 106)를 피하 주사하였다. 확립된 종양을 갖는 동물을 4개 군(군당 n = 10)으로 무작위화하였고 평균 종양 부피는 140 mm3였다. 동물에게 매일 비히클 단독, 매일 C9(100 mg/kg), 또는 매일 C12(25 mg/kg)를 IP 투여하였다. 치료는 종양 이식 후 제18일에 시작하였고, 제36일에 치료를 종료하였다. 종양 부피 및 체중 평가를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 제36일에서의 최종 투여 후, 혈장 약물동력학 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 모든 데이터 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
OVCAR-8 종양 이종이식 효능 연구
마우스의 우측 옆구리에 인간 OVCAR-8 세포(5.0 x 106)를 피하 주사하였다. 확립된 종양을 갖는 동물을 4개 군(군당 n = 10)으로 무작위화하였고 평균 종양 부피는 145 mm3였다. 동물에게 비히클 단독, C9(50 또는 100 mg/kg), 또는 C12(25 또는 50 mg/kg)를 매일 IP 투여하였다. 치료는 종양 이식 후 제28일에 시작하였고, 제46일에 치료를 종료하였다. 종양 부피 및 체중 평가를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 제46일에서의 최종 투여 후, 혈액을 안와 출혈 방법에 의해 채혈한 점을 제외하고는 혈장 약물동력학 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
참조문헌
하기 참조문헌이 이 실시예에서 인용된다:
Figure pct00091
본원에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함한 모든 참조문헌은 각각의 참조문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참조문헌으로 포함되는 것으로 표시되고 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 참조문헌으로서 포함된다.
본 개시내용을 설명하는 맥락에서(특히 하기의 청구범위의 맥락에서) 용어 단수형("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 참조의 사용은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수형과 복수형을 둘 모두를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 지시된 구성요소(들)를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는 개방형 용어로 간주되어야 한다(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미함).
본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 및 각각의 평가변수 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 축약 방법으로서 역할을 하고자 하고, 각각의 별개의 값 및 평가변수는 이것이 본원에 개별적으로 언급된 것과 같이 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 그리고 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대)의 사용은 개시내용을 더 잘 설명하기 위한 것일 뿐이고, 달리 청구되지 않는 한 개시내용의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 개시내용의 실행에 필수적인 것으로 임의의 비-청구된 요소를 지시하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
개시내용을 수행하기 위해 발명자들에게 알려진 최상의 방식을 포함하여 본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에 기재된다. 이들 바람직한 구현예의 변이는 전술한 설명을 읽으면 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변이를 적절하게 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 개시내용이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되기를 의도한다. 이에, 본 개시내용은 관련 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 모든 변형 및 이와 동등한 대상체를 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 지시되지 않거나 달리 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 이의 모든 가능한 변이에서 전술한 요소의 임의의 조합은 개시내용에 포괄된다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> KIF18A INHIBITORS FOR TREATMENT OF NEOPLASTIC DISEASES <130> A-2607-WO-PCT <150> 63/085,607 <151> 2020-09-30 <150> 63/055,111 <151> 2020-07-22 <150> 63/009,637 <151> 2020-04-14 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2512 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcaaaagtc tagagccacc gtccagggag caggtagctg ctgggctccg gggacacttt 60 gcgttcgggc tgggagcgtg ctttccacga cggtgacacg cttccctgga ttggcagcca 120 gactgccttc cgggtcactg ccatggagga gccgcagtca gatcctagcg tcgagccccc 180 tctgagtcag gaaacatttt cagacctatg gaaactactt cctgaaaaca acgttctgtc 240 ccccttgccg tcccaagcaa tggatgattt gatgctgtcc ccggacgata ttgaacaatg 300 gttcactgaa gacccaggtc cagatgaagc tcccagaatg ccagaggctg ctccccccgt 360 ggcccctgca ccagcagctc ctacaccggc ggcccctgca ccagccccct cctggcccct 420 gtcatcttct gtcccttccc agaaaaccta ccagggcagc tacggtttcc gtctgggctt 480 cttgcattct gggacagcca agtctgtgac ttgcacgtac tcccctgccc tcaacaagat 540 gttttgccaa ctggccaaga cctgccctgt gcagctgtgg gttgattcca 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Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 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cactcttcag caaattggaa 660 aggacatgtg aacttatata tttgacacaa cccagcagtt cgatatctac tgaaataaat 720 tctgcattgg tgctaaaagt ttcttggatc acatttttat tagctaaagg ggaagtatta 780 caaatggaag atgatctggt gatttcattt cagttaatgc tatgtgtcct tgactatttt 840 attaaactct cacctcccat gttgctcaaa gaaccatata aaacagctgt tatacccatt 900 aatggttcac ctcgaacacc caggcgaggt cagaacagga gtgcacggat agcaaaacaa 960 ctagaaaatg atacaagaat tattgaagtt ctctgtaaag aacatgaatg taatatagat 1020 gaggtgaaaa atgtttattt caaaaatttt atacctttta tgaattctct tggacttgta 1080 acatctaatg gacttccaga ggttgaaaat ctttctaaac gatacgaaga aatttatctt 1140 aaaaataaag atctagatgc aagattattt ttggatcatg ataaaactct tcagactgat 1200 tctatagaca gttttgaaac acagagaaca ccacgaaaaa gtaaccttga tgaagaggtg 1260 aatgtaattc ctccacacac tccagttagg actgttatga acactatcca acaattaatg 1320 atgattttaa attcagcaag tgatcaacct tcagaaaatc tgatttccta ttttaacaac 1380 tgcacagtga atccaaaaga aagtatactg aaaagagtga aggatatagg atacatcttt 1440 aaagagaaat ttgctaaagc tgtgggacag ggttgtgtcg aaattggatc 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atgttgtctg aacaaaatag ggcttctcct ctccccagtg ggctcctcac cccgccacag 1380 agcggtaaga agcagagcag cgggccggaa atggcgtgac caccccatcc ttctccacca 1440 aagacagttg cgcgcctgct ccacgttctc ttctgtctgt tgcagcggag gcgtgcgttt 1500 gcttttacag atatctgaat ggaagagtgt ttcttccaca acagaagtat ttctgtggat 1560 ggcatcaaac agggcaaagt gttttttatt gaatgcttat aggttttttt taaataagtg 1620 ggtcaagtac accagccacc tccagacacc agtgcgtgct cccgatgctg ctatggaagg 1680 tgctacttga cctaagggac tcccacaaca acaaaagctt gaagctgtgg agggccacgg 1740 tggcgtggct ctcctcgcag gtgttctggg ctccgttgta ccaagtggag caggtggttg 1800 cgggcaagcg ttgtgcagag cccatagcca gctgggcagg gggctgccct ctccacatta 1860 tcagttgaca gtgtacaatg cctttgatga actgttttgt aagtgctgct atatctatcc 1920 attttttaat aaagataata ctgtttttga gaca 1954 <210> 6 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Arg Glu Arg Arg Glu Arg Asp Ala Lys Glu Arg Asp Thr Met 1 5 10 15 Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg Lys 20 25 30 Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp 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atccctgagc ttccgtctag ccaagtgtca caaagcacct acacctcact tttatgacct 80280 tggacaagtt acttaacccc atgagtctca ggtttctatt tgtataaaag agataataat 80340 acctcaatgt ttgttgcaaa ggctaaaagg ggtaagtatt aaggtattca gtaaatacca 80400 attctcttcc tatctgcccc actcctgctt cttcttgcca aagagactga gttcatcttt 80460 tgagtttttc tcaatgggct tatgactagc actttgggta ggccaattct tccttgctta 80520 gaactgccct gttatagggc atttagaact gccctattag aggatgtttg gcatttctct 80580 cccctgtcta ttaaaggcca gcagtgtccc atattccttg tgataacaaa aactatctcc 80640 tatacacatt tctaaaagct tttagaaata ttcaacaata ttttaacaga tatactattt 80700 ttaaatgata gattaaatat acataaatga aattgttaac aaagtaaaca taaaatacta 80760 agtgattatt tcaaaataaa ccttagaatc tcaaggctgg aggatatccc tccctaatta 80820 attagttaat taattcatga caactattac atgttggagc caggcagcct aggttaaaat 80880 ctcagctcta tgacgtactg actgtgatag tggataagtt acttaacctc cttgtggctc 80940 agcttcccca tctgtaaagt aagactaaca acagtaccta tctcataaag ttgtaaagat 81000 tacacactta gaacaatact ttgtacagag tatgaactac aagtgtttgc 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ctctcaggac ctcctgaggg 81900 ctgagtcatg ggccatggtc actcatattt ggctcagaat aaatctcttc aaatatttta 81960 cagagtttga ctctttcagt caatagaatt taagtataat gtcaaatata actttgtttc 82020 acaactagtt gcatatttta acaaagacat ggatgttaat ttttaaagta tcatgtattt 82080 ccctatcttt taaaaacaaa tatgtggata gaattttctt aataaaaatg cctaaggtca 82140 acagaatcat caaatgtaaa aattaatcta tgttcaaata tacttacatc tgcaggaatt 82200 aatgagatcg ttcctacatt attatgtggt gccttctttg ttttctagga tggctgacta 82260 aaagaaatga gcatttagtt gattctgaat aaggcacaga gagagtaaat tcttcaacca 82320 tgtttaatat gaagcagcaa aagaaaagcc taaatatcgt tatctgcgca agaatgtgtg 82380 gattcacaaa ttcttttcag acagctgttc agaagatagt attatagcct ctgatcaatt 82440 ttgtcctatc tacccctaag tggtatttac tgaacagaat caaaagagca aactggtagg 82500 atttcattgg tggaactaaa acatgaaaga caaatacttc caacgtgatt attcattata 82560 atcaggttga gcattccaaa tttgaaaatc taaaatctaa aactttgtga gcaccaacat 82620 gacactcaaa ggaaatgctc attagagtat tttggatttt cagattagag atcctcaacc 82680 agtaagcaca atgcaaaaat taaaaaaaaa 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ttatttaatt cattgattgt atgcactgat actttcttca 83580 aaagcattca gatcatgata tgtattgcat gtcatttacc tgctccaaac tatccaatga 83640 cttctcatca taagaataaa atacaaactc cttaccatgg cctataaatt ccacatatgg 83700 ccctgcctac ctctctgaca atgacttcta ctgctgtctc cccatttcat tattctgctt 83760 cagctgcaat gactttctta gcattcctaa aacacttcag tcttgttttg gcctcctggc 83820 ttttttattt ttgcttactg gcaggcatta cctccagata tttgcaaatt gtaatccctc 83880 acttcattat tcaggtctct tcaaatgcca ctttacagag gctttcccta aagaatctat 83940 ctaagatagt gtcaccctgc ctttgcttct ccaatccctt actaggttta tttttctttc 84000 ttgagtttag cactaattgg aaagtatatg ttatctggtt acatatttat tgcttgtttt 84060 ccctctagaa tgtaagcact gtgagagcac ggagttcatc tgcacaccag cacctaggac 84120 actgcttgtc aaatatttag gacccaataa atacttgttg aataaatgaa tgaataaacc 84180 agtacagttt taatagactt atagcatgtt accatttgta tttttaaaag atatatatgt 84240 atatgcatgg tcattcccag aagggtacac aagaaattga taataccact ttccctatag 84300 aagggaaata tgaaggtctg agtgagagac aggtttattt tccatttcat attcttttgt 84360 aatatttaaa 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gaacaaagat ttgaaagcac aaattagaca 1800 tatgatggat ctagcttgtc ttcaggaaca gcaacacagg cagactgaag cagtattgaa 1860 tgctttactt ccaaccctaa gaaaacaata ttgcacatta aaagaagccg gcctgtcaaa 1920 tgctgctttt gaatctgact tcaaagagat cgaacatttg gtagagagga aaaaagtggt 1980 agtttgggct gaccaaactg ccgaacaacc aaagcaaaac gatctaccag ggatttctgt 2040 tcttatgacc tttccacaac ttggaccagt tcagcctatt ccttgttgct catcttcagg 2100 tggaactaat ctggttaaga ttcctacaga aaaaagaact cggagaaaac taatgccatc 2160 tcccttgaaa ggacagcata ctctaaagtc tccaccatct caaagtgtgc agctcaatga 2220 ttctcttagc aaagaacttc agcctattgt atatacacca gaagactgta gaaaagcttt 2280 tcaaaatccg tctacagtaa ccttaatgaa accatcatca tttactacaa gttttcaggc 2340 tatcagctca aacataaaca gtgataattg tctgaaaatg ttgtgtgaag tagctatccc 2400 tcataataga agaaaagaat gtggacagga ggacttggac tctacattta ctatatgtga 2460 agacatcaag agctcgaagt gtaaattacc cgaacaagaa tcactaccaa atgataacaa 2520 agacatttta caacggcttg atccttcttc attctcaact aagcattcta tgcctgtacc 2580 aagcatggtg ccatcctaca tggcaatgac tactgctgcc aaaaggaaac ggaaattaac 2640 aagttctaca tcaaacagtt cgttaactgc agacgtaaat tctggatttg ccaaacgtgt 2700 tcgacaagat aattcaagtg agaagcactt acaagaaaac aaaccaacaa tggaacataa 2760 aagaaacatc tgtaaaataa atccaagcat ggttagaaaa tttggaagaa atatttcaaa 2820 aggaaatcta agataaatca cttcaaaacc aagcaaaatg aagttgatca aatctgcttt 2880 tcaaagttta tcaataccct ttcaaaaata tatttaaaat ctttgaaaga agacccatct 2940 taaagctaag tttacccaag tactttcagc aagcagaaaa atgaaactct ttgttttctt 3000 cttttgtgtt ctaaaaaaat aaaatttcaa aagaaaaggt tgtcttttaa gttttttaaa 3060 tatttgttgc cttttaaaat ccctgagtgt aagttaccat ggtggcagct tagttttact 3120 atgccacaac aagttgacta ggacatttta gtaaatggta gtgagttaaa ttatctttat 3180 tattttttaa aaataagaat ttagaagtgg taaaattatg gcccaagatg tatttggttc 3240 tctattatgt tttgatacat tattttaatc atatatatga ctttcctttt caaaaatact 3300 ttaatgtaca agtgtaaata tatgtgccca taaaatcatt gtaaatatta tttagtcatc 3360 acaaataaaa tattgtccct tgctacttga tatattaaag atgtagattt taaagtggat 3420 gtagatttta aagtg 3435

Claims (25)

  1. 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법으로서, 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하고, 대상체에 대해 결정된 치료는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 경우, KIF18A 저해제를 포함하는, 방법.
  2. 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 KIF18A 저해제로서, 대상체는 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함하는, KIF18A 저해제.
  3. KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 신생물 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법으로서, 대상체로부터 수득된 시료를 (a) 비활성화된 TP53 유전자 및/또는 (b) (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 검정하는 단계를 포함하고, 대상체는, 시료가 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 경우, KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 민감성인 것으로 식별되는, 방법.
  4. 신생물 질환을 갖는 대상체에 대한 치료를 결정하는 방법으로서, CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계(여기서, 대상체에 대한 치료는, 신생물 질환이 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성인 경우, KIF18A 저해제를 포함하는 치료로서 결정됨), 또는 KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계(여기서, 대상체에 대한 치료는, 신생물 질환이 KIF18A 저해제에 대해 둔감성인 경우, CDK4/6 저해제를 포함하는 치료로서 결정됨)를 포함하는, 방법.
  5. KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 암을 갖는 대상체를 식별하는 방법으로서, KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 결정하는 단계를 포함하고, 대상체는, 시료의 암세포가 CDK4/6 저해제에 대해 둔감성인 경우, KIF18A 저해제를 이용한 치료에 대해 반응성인 것으로 식별되는, 방법.
  6. (A) 신생물 질환이 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대해 내성이거나 대상체가 CDK4/6 저해제로 치료되거나 치료된 적이 있는 경우, 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하거나 (B) 선택적으로 KIF18A 저해제가 CDK4/6 저해제와 함께 사용하기 위한 것인 경우, 대상체에서 CDK4/6 저해제를 이용한 치료에 대한 신생물 질환의 민감성을 유지시키는 데 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 민감성을 결정하는 단계는 대상체로부터 수득된 시료를 (i) 비활성화된 Rb1 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 CCNE1 유전자 생성물의 과발현, 또는 (iii) 이들의 조합의 부재에 대해 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 암세포, 종양 세포, 비(非)-종양 세포, 혈액, 혈액 세포, 또는 혈장을 포함하고, 선택적으로 시료는 생식세포계(germline) 암세포 또는 체세포계(somatic) 암세포를 포함하는, 방법.
  9. CDK4/6 저해제 및 KIF18A 저해제를 포함하는 약학적 조합물.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CDK4/6 저해제는 팔보시클립(palbociclib), 리보시클립(ribociclib), 및/또는 아베마시클립(abemaciclib)인, 방법 또는 약학적 조합물.
  11. 신생물 질환을 갖는 대상체를 치료하거고/하거나, 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양을 갖는 대상체에서 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 대상체에서 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키는 데 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 신생물 질환은 암, 선택적으로, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 전립선암인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  13. 제12항에 있어서, 신생물 질환은 삼중-음성 유방암(TNBC: triple-negative breast cancer), 비-관강(non-luminal) 유방암, 또는 고등급 장액성 난소암(HGSOC: high-grade serous ovarian cancer) 또는 자궁내막암, 선택적으로, 장액성 자궁내막암인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 비활성화된 TP53 유전자에 대해 양성이고/이거나 비활성화된 Rb 유전자, (ii) 증폭된 CCNE1 유전자 또는 과발현된 CCNE1 유전자 생성물, (iii) 비활성화된 BRCA 유전자 또는 (iv) 이들의 조합 중 적어도 하나에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  15. 제14항에 있어서, 암은 돌연변이체 TP53 유전자에 대해 양성인 세포를 포함하고/하거나 증폭된 CCNE1 유전자, 침묵화된 BRCA1 유전자, 결핍 Rb1 유전자, 또는 이들의 조합에 대해 양성인 세포를 포함하는, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 신생물 질환을 치료하고/하거나, 종양 퇴화를 유도하거나 증가시키고/시키거나, 종양 또는 암 성장을 감소시키고/시키거나, 종양 또는 암 세포의 사멸을 유도하거나 증가시키고, (A) 대상체에서 정상 체세포의 증식은 대조군 대상체의 정상 체세포의 증식과 실질적으로 동일하고/하거나 (B) 정상 체세포의 아폽토시스(apoptosis) 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준에 비해 대상체에서 증가되지 않고, 선택적으로 정상 체세포의 아폽토시스 수준은 대조군 대상체의 정상 체세포의 아폽토시스 수준과 실질적으로 동일한, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  17. 제16항에 있어서, 정상 체세포는 인간 골수 단핵 세포, 인간 유선 상피 세포, 또는 인간 포피 섬유아세포 세포이고/이거나 정상 체세포는 TP53MUT가 아니거나, 정상 체세포는 TP53WT인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 신생물 질환은 다중약물 내성(multidrug resistant) 신생물 질환이거나, (ii) 종양 또는 암 세포는 다중약물 내성 종양 또는 암 세포이거나, (iii) 종양 또는 암 세포는 다중약물 내성 1(MDR-1) 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물의 증가된 발현을 나타내거나, (iv) 종양 또는 암 세포는 P-당단백질(P-gp)의 증가된 발현을 나타내거나, (v) 이들의 임의의 조합인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 신생물 질환은 항유사분열제 또는 안트라사이클린(anthracycline) 항생제를 이용한 치료에 내성이고, 선택적으로, 항유사분열제 또는 안트라사이클린 항생제는 파클리탁셀 또는 독소루비신인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 경구 투여를 위해 선택적으로 1일 1회 투여되는, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제, 또는 약학적 조합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 4-(N-(tert-부틸)설파모일)-N-(3-(N-(tert-부틸)설파모일)페닐)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로도 알려진 하기 구조를 갖는 KIF18A 저해제 화합물 C9 또는 이의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제:
    Figure pct00092
    .
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 N-(3-(사이클로펜틸설포닐)페닐)-6-((1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)아미노)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)니코틴아미드로도 알려진 하기 구조를 갖는 KIF18A 저해제 화합물 C11 또는 이의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제:
    Figure pct00093
    .
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 (R)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-N-(6-(2-메틸모르폴리노)피리딘-2-일)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로도 알려진 하기 구조를 갖는 KIF18A 저해제 화합물 C12 또는 이의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제:
    Figure pct00094
    .
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, KIF18A 저해제는 N-(2-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-6-메틸피리미딘-4-일)-4-((2-하이드록시에틸)설폰아미도)-2-(6-아자스피로[2.5]옥탄-6-일)벤즈아미드로도 알려진 하기 구조를 갖는 KIF18A 저해제 화합물 C14 또는 이의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염인, 방법 또는 이에 사용하기 위한 KIF18A 저해제:
    Figure pct00095
    .
  25. 항유사분열제 또는 안트라사이클린 항생제를 사용하여 치료되거나 치료된 적이 있는 대상체에서 신생물 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 KIF18A 저해제로서, 선택적으로, KIF18A 저해제는 (A) KIF18A 유전자 및/또는 KIF18A 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나, (B) 비-코딩 RNA이며, 선택적으로 KIF18A 저해제는 RNAi를 매개하고/하거나, (C) 선택적으로 SEQ ID NO: 12 내지 SEQ ID NO: 18 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 siRNA인, KIF18A 저해제.
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