JP2023521802A - 新生物疾患の処置のためのｋｉｆ１８ａ阻害剤 - Google Patents

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Abstract

対象において新生物疾患を処置するために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む、新生物疾患を有する対象を処置する方法が本明細書中で提供される。腫瘍がある対象において腫瘍退縮を誘導するか又は向上させる方法及び対象において腫瘍又はがん成長を低減させる方法も提供される。代表的な態様では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与すること含む。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む、対象において腫瘍又はがん細胞の死を誘導するか又は増加させる方法も本明細書中で提供される。有利に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、正常な体細胞に明白な毒性なく、新生物疾患を選択的に処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、及び／又は腫瘍若しくはがん細胞の死を誘導するか又は増加させる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと２０２０年４月１４日提出の米国仮特許出願第６３／００９，６３７号明細書、２０２０年７月２２日提出の米国仮特許出願第６３／０５５，１１１号明細書及び２０２０年９月３０日提出の米国仮特許出願第６３／０８５，６０７号明細書の優先権を主張する。各出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された材料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれ、以下：２０２１年３月２２日作成の「Ａ－２６０７－ＷＯ－ＰＣＴ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名の２２７，９５４バイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルとして識別される。
癌は、人類を苦しめる最も広まった疾患の１つであり、世界中での主たる死因である。米国だけで、癌は死因の第２位であり、これを超えるのは心疾患だけである。この２０年ほどにわたって、各種の多くの癌の１つ以上に対する有効な処置又は治療を見出すための努力において、数多くのグループが、多大な時間と努力と費用を注ぎ込んできた。しかしながら、現在までに、利用可能な癌の処置及び療法のうちで大きな成功を収めたのはごく僅かのみである。
癌は、正常な細胞過程の脱制御又は無制御の細胞増殖を特徴とすることが多い。癌細胞に形質転換されている細胞は、非調節的及び無制御に増殖し、一部の場合では癌の転移又は拡大につながる。細胞周期及び中心体周期を介して増殖の進行を制御する、細胞経路に関わる１つ以上の遺伝子が損傷されると、細胞増殖の正常な制御が失われる原因となり得る。これらの無秩序遺伝子は、事象のカスケードに関与する様々な腫瘍抑制因子又は癌遺伝子タンパク質をコードし得、抑制の効かない細胞周期進行及び細胞増殖をもたらす。細胞周期及び有糸分裂制御、並びに正常分裂細胞及び癌細胞の進行に重要な役割を果たす様々なキナーゼ及びキネシンタンパク質が特定されている。
癌の経路、表現型、有糸分裂に関連する分化状態及び複製的ストレスは、有糸分裂開始、紡錘体形成、中心体の完全性及び位置決め、ＭＴ－キネトコア接着、姉妹染色体分体接着及びＳＡＣ調節に関連する特異的な脆弱性に繋がり得る。従って、新しい有糸分裂阻害療法の臨床的な可能性を改善するためのストラテジーは、正常組織に対する付帯的な損傷を回避又は軽減しながら、腫瘍特異的な脆弱性を利用すべきである。ＫＩＦ１８Ａ阻害は、有糸分裂におけるＳＡＣの活性化、多極化の誘導及びアポトーシスにつながり、正常な分裂中の体細胞を温存しながらヒト癌細胞株のサブセットの増殖を阻害するので、ＫＩＦ１８Ａは、新興及び有望な抗癌標的である。
有糸分裂は、真核細胞がその複製した染色体を２つの同一の娘核へと分離する過程である。一般的に、この後すぐに細胞質分裂が起こり、これにより核、細胞質、細胞小器官及び細胞膜が、これらの細胞構成成分のほぼ等しい割り当てを含有する２個の娘細胞に分けられる。有糸分裂及び細胞質分裂はまとめて、細胞周期の有糸分裂（Ｍ）期－遺伝子的に互いに及びそれらの親細胞と同一である２個の娘細胞への母細胞の分裂－を定義する。有糸分裂の過程は複雑であり、高度に制御されている。一連の事象は、１セットの活動の完了及び次の開始に対応する、異なる期に分けられる。これらの段階は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期及び分裂終期である。有糸分裂の過程中、複製した染色体が凝縮し、姉妹染色分体を細胞の逆側に引っ張る紡錘体微小管（ＭＴ）繊維に付着する。紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）は、全ての姉妹染色分体が紡錘体キネトコア繊維に正しく付着するまで活性であり、紡錘体の張力が分裂中期の間に達成され、エラーが検出されなければ細胞が分裂後期に進む。次に、細胞質分裂において細胞が分裂して、２つの同一の娘細胞が生じる。
通常、エラーが検出される場合（例えばＤＮＡ損傷、ＤＮＡ複製フォーク停止／崩壊、中心体異常、染色体の誤分配、微小核形成）、細胞周期チェックポイントが活性化される。ゲノムに対するこれらのエラーが修正され得ない場合、細胞において通常、細胞停止及びアポトーシスが起こる。しかし、細胞がその細胞周期を通じて進み、チェックなく進行することが許される場合、突然変異、染色体の誤分配、中心体の異常が経時的に蓄積し得る。これらの遺伝子／核型／中心体の変化が起こり得、最終的に適応を通じて細胞子孫が前悪性又は悪性新生物の特徴を有するようになる（例えば無制御増殖）。
腫瘍内不均一性が高く、染色体の不安定性（ＣＩＮ）がある癌は、数的（得るか又は失う）及び構造的な交代の結果起こる継続的な染色体変化のために、複雑な核型を有する。ＣＩＮに関与すると考えられる機序は、キネトコアＭＴ付着ダイナミクス、中心体コピー数、有糸分裂チェックポイント機能、染色体接着及び細胞周期制御における欠陥を含む。染色体不安定性（ＣＩＮ）は、細胞周期進行／チェックポイント、中心体周期及びＤＮＡ修復を制御する腫瘍サプレッサー及び癌遺伝子のサブセット（例としては、ＴＰ５３、ＲＢ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、相同組み換え修復欠損（ＨＲＤ）遺伝子、ＦＢＸＷ７、ＣＣＮＥ１、ＭＹＣが挙げられるが限定されない）における遺伝学的な損傷に対して強化された、複製及び有糸分裂ストレスのレベル上昇と関連する（ＳＬ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；２０：２８５－９５及びＲ Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６；１７：１５１６－１５３１）。
有糸分裂又は細胞分裂は、癌の処置における有効な介入点である。承認された抗有糸分裂薬は、微小管の機能を阻害する抗癌剤である。微小管は、有糸分裂の最後に紡錘体装置の形成及び細胞質分裂において重量な役割を果たすα－チューブリン及びβ－チューブリンヘテロ二量体により形成されるタンパク質ポリマーである。微小管を標的とする抗癌剤は、癌細胞の増殖に介入するための実績のあるアプローチに相当する。タキサンは、パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソテール）を含む抗有糸分裂剤のうち最も卓越したクラスである。ビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビノレルビンを含む微小管を不安定化する薬剤のクラスである。他の新しいチューブリン結合抗癌薬としては、イクサベピロン及びエリブリンが挙げられる。これらの抗有糸分裂剤は、微小管の安定化又は不安定化の何れかにより癌細胞の増殖を防ぐために作用する。この微小管の直接的な阻害の結果、アポトーシス、分裂死及び致死的な多極性分裂を通じて細胞停止及び細胞死が起こる。パクリタキセルは、最初に発見されたタキサンシリーズの化合物であった。パクリタキセルの構造類似体であるドセタキセルが後に発見された。パクリタキセル及びドセタキセルは、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、食道癌、前立腺癌及びＡＩＤＳ関連のカポジ肉腫を含む、様々なヒト悪性腫瘍を処置するために一般的に使用される。タキサンの主な副作用は、骨髄抑制、主に好中球減少症であり、一方で他の副作用としては、末梢浮腫及び神経毒性（末梢神経傷害）が挙げられる。
タキサンなどの抗有糸分裂剤への耐性は、良好な癌治療に対する複雑化要因であり、ＭＤＲ－１コード遺伝子及びその産物、Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の発現上昇と関連があることが多い。タキサンに対する獲得された耐性の確認された他の機序としては、チューブリン突然変異、過剰発現、増幅及びアイソタイプスイッチが挙げられる。α－又はβ－チューブリンにおける突然変異は、微小管上の正しい場所へのタキサンの結合を阻害し；これにより薬物が無効となる。化学療法剤（例えば白金剤、アントラサイクリン）及び標的化治療（例えばＴＫＩ、ＰＡＲＰ阻害剤）を含むが限定されない他の抗癌薬クラスに対する耐性は、癌の有効な処置において大きな欠点となっており、必然的に患者の死亡につながる。結果的に、薬物耐性の発生は、依然として全ての抗癌療法に関連する問題となっている。
高精度の薬物は、正常組織に対する毒性を低下させ、治療処置から利益を得る可能性が最も高い患者に対して強化するため又は重要なこととして利益を得る可能性がない患者を排除するために、層別化マーカーを利用することによって、癌患者の反応率を改善することを目的としている。バイオマーカーに誘導されるアプローチは、より高い反応率を達成するため及び患者転帰及びクオリティーオブライフの改善を推進するために、癌患者の処置をカスタム化する可能性を有する。現在の抗有糸分裂療法から利益を得る可能性が最も高い患者を選択するために利用可能な確立された層別化マーカー（バイオマーカー）が欠けている。
従って、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置から利益を得るであろう患者を同定するためのバイオマーカーが必要とされている。
ＳＬ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；２０：２８５－９５ Ｒ Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６；１７：１５１６－１５３１
本明細書中で、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対する感受性のバイオマーカーを証明するデータが初めて与えられる。不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は：（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つを示す癌細胞は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する感受性を明らかにした。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に感受性がある癌細胞がＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性低下又は感受性喪失又は耐性を示すことを明らかにするデータも本明細書中で提供される。このデータは、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性癌細胞がＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して感受性低下又は感受性喪失又は耐性を示すことをさらに裏付ける。
本開示は、新生物疾患（例えば癌）がある対象に対する処置を決定する方法を提供する。代表的な実施形態では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて、対象から得られた試料をアッセイすることを含む。様々な態様では、対象に対して決定された処置は、試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は、不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む。代表的な実施形態では、本方法は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、対象に対する処置は、新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性であるか又は耐性である場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む処置として決定される。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、対象に対する処置は、新生物疾患がＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して非感受性であるか又は耐性である場合、ＣＤＫ４／６阻害剤を含む処置として決定される。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイすることを含む。様々な例では、対象は、試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は、不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に感受性があるものとして同定される。
本開示は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法をさらに提供する。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、対象は、試料の癌細胞がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして同定される。
対象においてＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を維持する方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。
新生物疾患がある対象を処置する方法、例えば対象において新生物疾患を処置する方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、患者を処置するためにＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含む。任意選択的に、新生物疾患は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性である。様々な例では、対象は、ＣＤＫ４／６阻害剤で処置されるか又は処置されたことがある。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤と同時投与される。様々な例では、本方法は、ＣＤＫ４／６阻害剤及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む医薬の組み合わせを投与することを含む。従って、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤を含む医薬の組み合わせが本明細書中で提供される。
腫瘍がある対象において腫瘍退縮を誘導するか又は向上させる方法が本明細書中でさらに提供される。代表的な実施形態では、本方法は、腫瘍退縮を誘導するか又は向上させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。本開示は、対象において腫瘍成長又は癌の成長を低減させる方法も提供する。代表的な実施形態では、本方法は、腫瘍又は癌の成長を低減させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。対象において腫瘍細胞又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させる方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態における方法は、腫瘍細胞又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。様々な態様では、新生物疾患は、癌、任意選択的に、乳癌、卵巣癌又は前立腺癌である。様々な例では、新生物疾患は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳癌又は高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である。代表的な態様では、新生物疾患は、子宮内膜癌、任意選択的に漿液性子宮内膜癌である。任意選択的に、癌は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性であり、及び／又は不活性化されたＲｂ遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は過剰発現されたＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む。いくつかの態様では、癌は、突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性である細胞を含む。様々な例では、癌は、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、発現抑制されたＢＲＣＡ１遺伝子、欠失Ｒｂ１遺伝子又はそれらの組み合わせについて陽性である細胞を含む。任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、経口投与のために、任意選択的に１日１回投与される。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量は、対照と比較して、少なくとも５０％又は少なくとも７５％（例えば少なくとも８０％又は８５％又は少なくとも９０％又は９５％）の腫瘍退縮を誘導するために有効である。様々な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、新生物疾患を選択的に処置し、腫瘍退縮を選択的に誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を選択的に低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を選択的に誘導するか若しくは増加させ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は正常な体細胞に対して毒性がない。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導するか若しくは増加させ、対象における正常な体細胞の増殖は、対照対象の正常な体細胞の増殖と実質的に同じである。代表的な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導するか若しくは増加させ、正常な体細胞のアポトーシスのレベルは、対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと比較して、対象において上昇せず、任意選択的に、正常な体細胞のアポトーシスのレベルは対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと実質的に同じである。
本開示の様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物である。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、本明細書中で記載のように、化合物Ｃ１、化合物Ｃ２、化合物Ｃ３、化合物Ｃ４、化合物Ｃ５、化合物Ｃ６、化合物Ｃ７、化合物Ｃ８、化合物Ｃ９、化合物Ｃ１０、化合物Ｃ１１、化合物Ｃ１２、化合物Ｃ１３若しくは化合物Ｃ１４又は何れかの薬学的に許容可能なその塩である。
代替的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、大分子ＫＩＦ１８Ａ阻害剤、例えば非コードＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡなどである。
図１Ａ～１Ｃは、実施例１で参照される表を提供する。図１Ａは、指定される組織に由来する指定される細胞株に対する組織培養増殖条件を列挙する表１Ａを提供する。 図１Ａ～１Ｃは、実施例１で参照される表を提供する。図１Ｂは、各試験細胞株に対するＮＣＡについて播種密度を列挙する表１Ｂを提供する。 図１Ａ～１Ｃは、実施例１で参照される表を提供する。図１Ｃは、癌細胞株及び第１のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表１Ｃを提供する。 図１Ａ～１Ｃは、実施例１で参照される表を提供する。図１Ｃは、癌細胞株及び第１のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表１Ｃを提供する。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（黒四角）又はＣＤＫ４／６阻害剤（白丸）の濃度の関数としてプロットされたＰＯＣのグラフである。図２Ａ～２Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性、ＣＤＫ４／６阻害剤非感受性の細胞を示す。細胞及び図２Ｄ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤非感受性の細胞、ＣＤＫ４／６阻害剤感受性の細胞を示す。 図３Ａは、ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ細胞株に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図３Ｂは、ＭＸ－１ ＴＮＢＣ細胞株に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図３Ｃは、ＭＡＸ４０１ＮＬ ＴＮＢＣ 細胞株に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図３Ｄは、ＨＣＣ－１９３７ ＴＮＢＣ細胞株に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図３Ｅは、ＯＶＣＡＲ－８癌細胞株に対する、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４、オラパリブ、パクリタキセル、ドキソルビシン又はカルボプラチンの濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図４Ａは、癌細胞株及び第２のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表２を提供する。 図４Ａは、癌細胞株及び第２のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表２を提供する。 図４Ｂは、癌細胞株及び第２のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表３を提供する。 図４Ｂは、癌細胞株及び第２のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対するそれらの感受性を列挙する表３を提供する。 図４Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対する感受性を示した乳癌及び卵巣癌細胞株について、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図４Ｄは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対して非感受性であった乳癌及び卵巣癌細胞株について、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図４Ｅは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対する感受性を示した第２の群の卵巣及び乳癌細胞株について、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図４Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対して非感受性であった卵巣及び乳癌細胞株の第２の群について、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてＰＯＣをプロットするグラフである。 図５Ａは、細胞移植後の時間の関数としてプロットされるＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置したか又はビヒクルで処置したマウスの腫瘍体積のグラフである。 図５Ｂは、細胞移植後の時間の関数としてプロットされるＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置したか又はビヒクルで処置したマウスの体重のグラフである。 図６Ａは、細胞移植後の時間の関数としてプロットされるＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置したか又はビヒクルで処置したマウスの腫瘍体積のグラフである。 図６Ｂは、細胞移植後の時間の関数としてプロットされるＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置したか又はビヒクルで処置したマウスの体重のグラフである。 図７Ａは、本明細書中に記載のようなＤＭＳＯで処理した細胞又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤細胞の画像である。 図７Ｂは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤濃度の関数としてプロットされる％ｐ－ヒストン又はペリセントリンスポットを示すグラフの対である。 図７Ｃは、本明細書中で記載のようなｐ－ヒストン又はペリセントリンスポットに関するＫＩＦ１８Ａ阻害剤のＥＣ５０を列挙する表である。 図８Ａは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤又はＤＭＳＯ対照での処理時の、セントリン－３、ペルセントリン又は中心体マーカーについて染色された２種類の癌細胞の一連の画像である。 図８Ｂは、ＤＭＳＯ対照、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤又はＥｇ５阻害剤で処理した細胞におけるｃＩ－ＰＡＲＰのタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。ＧＡＤＰＨはローディング対照である。 図９は、ＤＭＳＯ対照又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理された同調させたか又は同調させない細胞における指定タンパク質（ｃＩ－ＰＡＲＰ、サイクリンＢ１、Ｍｃｌ－１サイクリンＥ１、ＫＩＦ１８Ａ、ＢｕｂＲ１）のレベルを示す一連のウエスタンブロットである。Ｂ－アクチンはローディング対照である。 図１０Ａは、ＤＭＳＯ対照又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理された細胞における指定タンパク質（ｐ－ヒストンＨ３、ｙ－Ｈ２Ａ．Ｘ、ｃＩ－ＰＡＲＰ、ＢｕｂＲ１、総ＨＥＣ１、ｐ－Ｈｅｃ１）のレベルを示す一連のウエスタンブロットである。ＧＡＤＰＨはローディング対照である。 図１０Ｂは、ｃＧＡＳ（緑色）、ｙＨ２Ａ．Ｘ（赤色）又はＤＡＰＩ（青色）について染色された細胞を示す画像の対である。ＤＭＳＯ対照又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤で細胞を処理した。 図１１は、セントリン－３（緑色）、ＫＩＦ１８Ａ（赤色）又はＤＮＡ（ＤＡＰＩ（青色））について染色された細胞を示す画像の対である。細胞をＤＭＳＯ対照又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理した。 図１２は、ビヒクル対照の指定量のＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理した細胞におけるｐ－ヒストンＨ３のグラフである。 図１３Ａは、Ｐ－ｇｐ阻害剤の存在下（白丸）又は非存在下（黒四角）でＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４で処理した細胞の濃度（ｌｏｇ濃度）の関数としてプロットされるＰＯＣのグラフである。 図１３Ｂは、Ｐ－ｇｐ阻害剤の存在下（白丸）又は非存在下（黒四角）でパクリタキセル（チューブリン）で処理した細胞の濃度（ｌｏｇ濃度）の関数としてプロットされるＰＯＣのグラフである。 図１４Ａは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、イスピネシブ、パクリタキセル又はパルボシクリブで処理したヒト骨髄単核細胞（ＨＢＭＮＣ）のＤＮＡ含量を示す一連のＦＡＣＳプロットである。 図１４Ｂは、抗ＢｒｄＵ（上のグラフ）で染色した、又は細胞周期のＳｕｂＧ１における（下のグラフ）、ドナー３７６１２又はドナー３７５３４からの％ヒト骨髄単核細胞（ＨＢＭＮＣ）を示すグラフであり、ここでＨＢＭＮＣは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、イスピネシブ（Ｅｇ５）、パクリタキセル（チューブリン）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で４８時間処理した。 図１４Ｃは、９６時間にわたるＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、イスピネシブ（Ｅｇ５）、パクリタキセル（チューブリン）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）での処理後の、ドナー３７６１２又はドナー３７５３４からの細胞の生細胞数（／１ｘ１０６）のグラフである。 図１４Ｄは、ＤＭＳＯ又は異なる用量のＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１１、イスピネシブ（Ｅｇ５）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で４８時間処理した、ＢｒｄＵについて陽性に染色されるヒト包皮線維芽（ｈＦＳＦ）細胞の％をプロットする一連のグラフである。 図１４Ｅは、ＤＭＳＯ又は異なる用量のＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１１、イスピネシブ（Ｅｇ５）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で４８時間処理した、ＢｒｄＵについて陽性染色されるヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の％をプロットする一連のグラフである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、ＢＩ－２５３６ ＰＬＫ１、パクリタキセル（チューブリン）、イスピネシブ（Ｅｇ５）、ＧＳＫ９２３２９５（ＣＥＮＰ－Ｅ）、ヌトリン－３Ａ（ＭＤＭ２）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で処理した細胞の、相対的な総対象物カウント（図１５Ａ）、ＢｒｄＵ取り込み（図１５Ｂ）、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現（図１５Ｄ）及びｙＨＨ２Ｘ発現（図１５Ｅ）を示すヒートマップである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、ＢＩ－２５３６ ＰＬＫ１、パクリタキセル（チューブリン）、イスピネシブ（Ｅｇ５）、ＧＳＫ９２３２９５（ＣＥＮＰ－Ｅ）、ヌトリン－３Ａ（ＭＤＭ２）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で処理した細胞の、相対的な総対象物カウント（図１５Ａ）、ＢｒｄＵ取り込み（図１５Ｂ）、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現（図１５Ｄ）及びｙＨＨ２Ｘ発現（図１５Ｅ）を示すヒートマップである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、ＢＩ－２５３６ ＰＬＫ１、パクリタキセル（チューブリン）、イスピネシブ（Ｅｇ５）、ＧＳＫ９２３２９５（ＣＥＮＰ－Ｅ）、ヌトリン－３Ａ（ＭＤＭ２）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で処理した細胞の、相対的な総対象物カウント（図１５Ａ）、ＢｒｄＵ取り込み（図１５Ｂ）、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現（図１５Ｄ）及びｙＨＨ２Ｘ発現（図１５Ｅ）を示すヒートマップである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、ＢＩ－２５３６ ＰＬＫ１、パクリタキセル（チューブリン）、イスピネシブ（Ｅｇ５）、ＧＳＫ９２３２９５（ＣＥＮＰ－Ｅ）、ヌトリン－３Ａ（ＭＤＭ２）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で処理した細胞の、相対的な総対象物カウント（図１５Ａ）、ＢｒｄＵ取り込み（図１５Ｂ）、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現（図１５Ｄ）及びｙＨＨ２Ｘ発現（図１５Ｅ）を示すヒートマップである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１、ＢＩ－２５３６ ＰＬＫ１、パクリタキセル（チューブリン）、イスピネシブ（Ｅｇ５）、ＧＳＫ９２３２９５（ＣＥＮＰ－Ｅ）、ヌトリン－３Ａ（ＭＤＭ２）又はパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）で処理した細胞の、相対的な総対象物カウント（図１５Ａ）、ＢｒｄＵ取り込み（図１５Ｂ）、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現（図１５Ｄ）及びｙＨＨ２Ｘ発現（図１５Ｅ）を示すヒートマップである。 図１６は、個々のＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ又は非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡで処理した、正常ＨＭＥＣ（左パネル）及びＢＴ－５４９ ＴＮＢＣ細胞（右パネル）又は陽性対照（＋対照；ノコダゾール（ＮＯＣ）で処理したＨｅＬａ細胞又はスタウロスポリンで処理したＪｕｒｋａｔ細胞）の溶解液の一連のウエスタンブロットである。各レーンでの等しいタンパク質ローディングを示すための、切断されたＰＡＲＰ（ｃｌ－ＰＡＲＰ）アポトーシスマーカー及びβ－アクチンに対するウエスタンブロット。 図１７Ａは、ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ、非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡ ｓｉＲＮＡｓ又は陽性対照ｓｉＲＮＡ（Ｅｇ５ ｓｉＲＮＡ）で処理した細胞のＰＯＣの一連のグラフである。点線は、ＮＴＣ ｓｉＲＮＡ対照に基づく５０％細胞増殖阻害を示す。ＮＴＣ ｓｉＲＮＡと比較したＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡの＞５０％のカウント減少は、ｐ－値＜０．０５でＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ感受性とみなした。 図１７Ｂは、細胞株情報（組織の起源、腫瘍サブタイプ及び遺伝学的状態）を伴う図１６Ａのグラフに対するレジェンドを提供する表である。ＮＴＣと比較したｐ－値及び細胞増殖阻害ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ。ＮＴＣ ｓｉＲＮＡと比較したＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡの＞５０％のカウントの減少は、ｐ－値＜０．０５でＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ感受性とみなした。 図１７Ｃは、ＫＩＦ１８Ａ及びβ－アクチンタンパク質発現レベルを示すＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ感受性又は非感受性の細胞の溶液のウエスタンブロットである。 図１８は、ＷＧＤ状況及びＴＰ５３状況が異なる乳癌及び卵巣癌細胞株の４つの群のそれぞれについての、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９に対する感受性のグラフである。 図１９Ａは、ＤＭＳＯ対照と比較したＭＴ－ＡＴＰａｓｅ発光シグナルとして与えられるＫＩＦ１８Ａモーター活性のＡＤＰ－Ｇｌｏ濃度－応答プロファイル（ＰＯＣ）を提供し、値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ（図１９Ｂ）又はＣＡＬ－５１ ＴＮＢＣ腫瘍異種移植片（図１９Ｃ）における化合物Ｃ９及びＣ１２の腫瘍効力及び忍容性分析。確立された腫瘍があるマウスに、連続１８日間にわたり毎日、ビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ９又は２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１２の用量をＩＰ投与した。グラフは、平均±ＳＥＭ対時間（日）として表される腫瘍体積（左、効力）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ腫瘍異種移植片におけるＣ９及びＣ１２の腫瘍有効性、忍容性、腫瘍再成長分析。図１９Ｄのグラフは、時間（日）に対する平均±ＳＥＭとして与えられる腫瘍体積（左、有効性）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１９Ａは、ＤＭＳＯ対照と比較したＭＴ－ＡＴＰａｓｅ発光シグナルとして与えられるＫＩＦ１８Ａモーター活性のＡＤＰ－Ｇｌｏ濃度－応答プロファイル（ＰＯＣ）を提供し、値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ（図１９Ｂ）又はＣＡＬ－５１ ＴＮＢＣ腫瘍異種移植片（図１９Ｃ）における化合物Ｃ９及びＣ１２の腫瘍効力及び忍容性分析。確立された腫瘍があるマウスに、連続１８日間にわたり毎日、ビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ９又は２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１２の用量をＩＰ投与した。グラフは、平均±ＳＥＭ対時間（日）として表される腫瘍体積（左、効力）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ腫瘍異種移植片におけるＣ９及びＣ１２の腫瘍有効性、忍容性、腫瘍再成長分析。図１９Ｄのグラフは、時間（日）に対する平均±ＳＥＭとして与えられる腫瘍体積（左、有効性）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１９Ａは、ＤＭＳＯ対照と比較したＭＴ－ＡＴＰａｓｅ発光シグナルとして与えられるＫＩＦ１８Ａモーター活性のＡＤＰ－Ｇｌｏ濃度－応答プロファイル（ＰＯＣ）を提供し、値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ（図１９Ｂ）又はＣＡＬ－５１ ＴＮＢＣ腫瘍異種移植片（図１９Ｃ）における化合物Ｃ９及びＣ１２の腫瘍効力及び忍容性分析。確立された腫瘍があるマウスに、連続１８日間にわたり毎日、ビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ９又は２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１２の用量をＩＰ投与した。グラフは、平均±ＳＥＭ対時間（日）として表される腫瘍体積（左、効力）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ腫瘍異種移植片におけるＣ９及びＣ１２の腫瘍有効性、忍容性、腫瘍再成長分析。図１９Ｄのグラフは、時間（日）に対する平均±ＳＥＭとして与えられる腫瘍体積（左、有効性）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１９Ａは、ＤＭＳＯ対照と比較したＭＴ－ＡＴＰａｓｅ発光シグナルとして与えられるＫＩＦ１８Ａモーター活性のＡＤＰ－Ｇｌｏ濃度－応答プロファイル（ＰＯＣ）を提供し、値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ（図１９Ｂ）又はＣＡＬ－５１ ＴＮＢＣ腫瘍異種移植片（図１９Ｃ）における化合物Ｃ９及びＣ１２の腫瘍効力及び忍容性分析。確立された腫瘍があるマウスに、連続１８日間にわたり毎日、ビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ９又は２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１２の用量をＩＰ投与した。グラフは、平均±ＳＥＭ対時間（日）として表される腫瘍体積（左、効力）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ腫瘍異種移植片におけるＣ９及びＣ１２の腫瘍有効性、忍容性、腫瘍再成長分析。図１９Ｄのグラフは、時間（日）に対する平均±ＳＥＭとして与えられる腫瘍体積（左、有効性）及び体重（右、忍容性）測定を示す（ｎ＝１０／群）。処置群をビヒクル単独群と比較、ＲＭＡＮＯＶＡとそれに続く多重比較のためのダネット検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
処置を決定する方法、処置に対する反応を同定する方法及び関連方法
本開示は、新生物疾患（例えば癌）がある対象に対する処置を決定する方法を提供する。代表的な実施形態では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子のコピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて、対象から得られた試料をアッセイすることを含む。様々な態様では、対象に対して決定される処置は、試料が不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は、不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む。
代表的な実施形態では、本方法は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、対象に対する処置は、新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性であるか又は耐性がある場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む処置として決定される。
代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、対象に対する処置は、新生物疾患がＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して非感受性であるか又は耐性がある場合、ＣＤＫ４／６阻害剤を含む処置として決定される。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法が本明細書中で提供される代表的な実施形態では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて、対象から得られた試料をアッセイすることを含む。様々な例では、試料が不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、対象は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に感受性があるものとして同定される。
本開示は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法をさらに提供する。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、試料の癌細胞がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、対象は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして同定される。
対象においてＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を維持する方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。
対象においてＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置の有効性を判定する方法がさらに本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、次のうち１つ以上に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置の開始後に対象から得られた試料をアッセイすることを含む：
ａ）ｐ－ヒストンＨ３の発現レベル
ｂ）中心体特性（中心小体及びＰＣＭマーカーは、セントリン－１－３、ペリセントリン、γ－チューブリン；スポッティングパターン又は断片化、ポールとポールとの距離の測定を含むが限定されない）、ｎｓｉｓ
ｃ）染色体の特性（ＤＮＡ色素；有糸分裂クロマチンの寸法測定、ラギング染色体／分裂後期のブリッジ、微小核形成）、
ｄ）紡錘体の特性（チューブリンマーカー、多極化及び紡錘体ジオメトリーの測定）、
ｅ）ＫＩＦ１８Ａタンパク質局在（ＫＩＦ１８Ａマーカー；有糸分裂におけるＫＩＦ１８Ａの局在を測定、
ｆ）ＫＩＦ１８Ａタンパク質翻訳後修飾（ウエスタン分析によるＫＩＦ１８Ａタンパク質ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）検出）、
ｇ）タンパク質又は遺伝子発現調整（サイクリンＢ１、セキュリン、ｐ－ヒストンＨ３（ｓｅｒ－１０）、サイクリンＥ１、Ｍｃｌ－１、ＢｕｂＲ１、ＳＡＣ構成成分、ｃｌ－ＰＡＲＰ、ｃｌ－カスパーゼ－３／－７など）、
ｈ）アポトーシス（ＴＵＮＥＬなど）、ＤＮＡ損傷及び修復（γ－Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ－１３９）など）のマーカー。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤
本開示は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に関する。「ＫＩＦ１８Ａ阻害剤」という用語は、ＫＩＦ１８Ａ介在状態及び／又は新生物疾患（例えば癌）、炎症又は繊毛関連疾患（ｃｉｌｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）を含む疾患を処置するために、ＫＩＦ１８Ａタンパク質単独又は微小管（ＭＴ）との結合複合体を調整するのに有用な何れかの化合物を意味する。本明細書中で開示されるＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物は、ＭＴに基づくＫＩＦ１８Ａ調節性の活性及び特にＫＩＦ１８Ａ阻害活性を有する。この目的のために、本開示は、癌を含むが限定されないＫＩＦ１８Ａ介在性疾患及び障害の治療的、予防的、急性又は慢性処置のための医薬組成物又は薬剤の調製及び製造における、これらの化合物並びに薬学的に許容可能なその塩の使用も提供する。従って、本開示の化合物は、抗癌薬の製造において有用である。
様々な態様では、「ＫＩＦ１８Ａ阻害剤」という用語は、ＫＩＦ１８Ａを標的とし、ＫＩＦ１８Ａ活性を低下させるか又は阻害する何れかの化合物又は分子を意味する。ＫＩＦ１８Ａ遺伝子は、キネシン－８サブファミリーに属し、プラス末端指向性モーターである。ＫＩＦ１８Ａは、正しい染色体の位置決め及び紡錘体張力を調節する、キネトコア微小管のプラス末端における動態に影響を及ぼすと考えられる。ヒトＫＩＦ１８Ａの枯渇により、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞において、より長い紡錘体、分裂中期における染色体オシレーションの増加及び有糸分裂紡錘体形成チェックポイントの活性化がもたらされる（ＭＩ Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７，４８８－９８，２００７）。ＫＩＦ１８Ａは、結腸、乳房、肺、膵臓、前立腺、膀胱、頭部、首、子宮頸部及び卵巣の癌を含むが限定されない各種のタイプの癌において過剰発現されている。ＫＩＦ１８Ａの過剰発現は、姉妹染色分体変動を弱め、その結果、堅固な分裂中期プレートが生じる。ＫＩＦ１８Ａノックアウトマウスにおけるか又はＫＩＦ１８Ａｇｃｄ２／ｇｃｄ２マウス（モータードメインにおけるミスセンス突然変異（Ｒ３０８Ｋ））における変異原性エチルメタノスルホナート（ＥＭＳ）処理によるＫＩＦ１８Ａモーター機能の不活性化の結果、明らかな精巣萎縮及び生殖不能を除き主要臓器において肉眼的異常がない生存可能なマウスが得られる（Ｊ Ｓｔｕｍｐｆｆ ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ．２００８；１４：２５２－２６２；Ｊ Ｓｔｕｍｐｆｆ ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ．２０１２；２２：１０１７－１０２９；ＸＳ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１：２６－３９；ＣＬ Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１９；１－１６；Ａ Ｃｚｅｃｈａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；４０２：２５３－２６２．Ｏ Ｒａｔｈ，Ｆ Ｋｏｚｉｅｌｓｋｉ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１１２：５２７－５３９）。正常なヒト及びマウスＫＩＦ１８Ａ欠失体細胞は、有糸分裂進行が比較的正常であるが染色体整列が正確ではない細胞分裂を完了し、その結果、正常な核型を有する娘細胞が生じ、有糸分裂からの出口におけるいくつかの欠陥が正常細胞のサブセットで認められ、その結果、より遅い増殖において微小核形成が起こる（ＣＬ Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１９；１－１６）。これらの遺伝学的試験から、正常な生殖細胞及び体細胞は染色体整列のための要件に対する依存性が異なることが示唆され、ＫＩＦ１８Ａが正常な正倍数性体細胞分裂においては不要であり得ることが示される（ＸＳ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１：２６－３９；Ａ Ｃｚｅｃｈａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；４０２：２５３－２６２）。正常なヒト組織において、ＫＩＦ１８Ａの発現は、活発に周期を回す細胞がある組織で上昇しており、精巣で発現が最大である（ＧＴＥｘ Ｐｏｒｔａｌ，ＧＴＥｘ Ｐｏｒｔａｌ，Ｊ Ｌｏｎｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３：２９；４５：５８０）。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。例えば、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＭＴ－ＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、基底ＡＴＰａｓｅ活性を阻害しない。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤により提供される低減又は阻害は、１００％の又は完全な阻害又は抑止又は低減でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する低減又は阻害の様々な程度が存在する。この点において、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａタンパク質を何れかの量又はレベルまで阻害し得る。代表的な実施形態では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤によって提供される低減又は阻害は、少なくとも若しくは約１０％の低減若しくは阻害（例えば、少なくとも若しくは約２０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約３０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約４０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約５０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約６０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約７０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約８０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９５％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９８％の低減若しくは阻害）である。
代表的な実施形態では、本開示の方法で使用され得るＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物は、式（Ｉ）の低分子化合物：
Figure 2023521802000002
 又は何らかの薬学的に許容可能なその塩である（式中、
Ｘ１はＮ又は－ＣＲ６であり、
Ｘ２は、Ｎ又は－ＣＲ５であり；
Ｘ３は、Ｎ又は－ＣＲ３であり；
Ｘ４は、Ｎ又は－ＣＲ９であり；
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち０、１又は２個がＮであり、
Ｒ１は、－ＣＮ又は、基－Ｚ－Ｒ１２であり、式中、Ｚは、－Ｃ０～４アルク－、－ＮＲ１１－、－ＮＲ１１ＳＯ２－、
－ＳＯ２ＮＲ１１－、－ＮＲ１１－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－ＳＯ２－、Ｃ０～４アルク－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、
－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１１－、－Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）－又は－ＮＲ１１（Ｃ＝Ｏ）であるか；又は
基－Ｚ－Ｒ１２は、－Ｎ＝Ｓ（＝Ｏ）－（Ｒ１２）２であり、ここで、２個のＲ１２の対が、或いは、それらそれぞれに結合される硫黄原子と組み合わさって、０、１、２又は３個のＮ原子及びＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する、飽和若しくは部分的飽和３員、４員、５員又は６員の単環式環を形成し得；
Ｒ２はハロ又は基－Ｙ－Ｒ１３であり、式中、Ｙは、－Ｃ０～４アルク－、－Ｎ（Ｃ０～１アルク）－Ｃ０～４アルク－、
－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ（Ｃ１～４アルク）、－Ｏ－Ｃ０～４アルク－、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）２、－ＳＯ２ＮＲ１３又は－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－であり、
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、Ｒ４ａ又はＲ４ｂであり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ６は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－Ｏ－Ｃ１～８アルク又は－Ｏ－Ｒ６ａであり；ここで、Ｒ６ａは、０、１、２又は３個のＮ原子及び、Ｏ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する飽和又は部分飽和の３、４、５又は６員単環式環であり；
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ８はＨ、ハロ、Ｃ１～８アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８ａ又は－Ｏ－Ｒ８ｂであり、
Ｒ９は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒｘは、
Figure 2023521802000003
 からなる群から選択され；
Ｒ１０ａ、Ｒ１０ｂ、Ｒ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊのそれぞれは、Ｈ、ハロ、Ｒ１０ｋ又はＲ１０ｌであるか；
又は或いは、Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対、Ｒ１０ｃ及びＲ１０ｄの対、Ｒ１０ｅ及びＲ１０ｆの対、Ｒ１０ｇ及びＲ１０ｈの対、又はＲ１０ｉ及びＲ１０ｊの対のそれぞれは、独立して、これらのそれぞれに結合した炭素原子と組み合わさって、Ｒｘ環に対するスピロである飽和又は部分飽和の３、４、５、６員単環式環を形成し得、ここでこの３、４、５、６員単環式環は、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有し、さらに、この３、４、５、６員単環式環は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－ＮＲａＲａ又はオキソから選択される０、１、２、又は３個の基によって置換され；
Ｒｙは、Ｈ、Ｃ１～４アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ１１は、Ｈ、Ｒ１１ａ又はＲ１１ｂであり；
Ｒ１２は、Ｈ、Ｒ１２ａ又はＲ１２ｂであり；
Ｒ１３は、Ｒ１３ａ又はＲ１３ｂであり；
Ｒ４ａ、Ｒ８ａ、Ｒ１０ｋ、Ｒ１１ａ、Ｒ１２ａ及びＲ１３ａは、独立して、各例において、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する飽和、部分飽和又は不飽和の３－、４－、５－、６－又は７員単環又は４－、５－、６－、７－、８－、９－、１０－、１１－又は１２－員二環式環からなる群から選択され、これは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、
－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＯＲａ、－ＳＲａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ
－ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、
－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮＲａＲａ、
－Ｃ１～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｒ１４及びオキソから選択される０、１、２又は３個の基により置換され；
Ｒ４ｂ、Ｒ８ｂ、Ｒ１０ｌ、Ｒ１１ｂ、Ｒ１２ｂ及びＲ１３ｂは、独立して、各例において、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク又はＣＮから選択される０、１、２、３、４又は５個の基によって置換されるＣ１～６アルクからなる群から選択され、
Ｒ１４は、独立して、各例において、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０又は１個の原子を含有する飽和、部分飽和又は不飽和の３、４、５、６若しくは７員単環式又は４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２員二環式環からなる群から選択され、これは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＯＲａ、－ＳＲａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ
－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、
－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ
－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＯＲａ及びオキソから選択される、０、１、２又は３個の基によって置換され；
Ｒａは、独立して、各例において、Ｈ又はＲｂであり；
Ｒｂは、独立して、各例において、Ｃ１～６アルク、フェニル又はベンジルであり、ここで、このＣ１～６アルクは、ハロ、
－ＯＨ、－ＯＣ１～４アルク、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１～４アルク、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１～４アルク又は－Ｎ（Ｃ１～４アルク）Ｃ１～４アルクから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；フェニル又はベンジルは、ハロ、Ｃ１～４アルク、Ｃ１～３ハロアルク、
－ＯＨ、－ＯＣ１～４アルク、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１～４アルク、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１～４アルク又は－Ｎ（Ｃ１～４アルク）Ｃ１～４アルクから選択される０、１、２又は３個の置換基によって置換される）。
式（Ｉ）の化合物の調製は、それぞれ２０１８年１２月２０日に提出された、以前提出された米国仮特許出願第６２／７８３，０６１号明細書及び同第６２／７８３，０６９号明細書；及びそれぞれ２０１９年８月２日に提出された同第６２／８８２，２５５号明細書及び同第６２／８８２，２６８号明細書で見出され得る。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち０個がＮである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち１個がＮである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち２個がＮである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１及びＸ３のそれぞれがＮであり；Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ４が
－ＣＲ９であり；式（Ｉａ）：
Figure 2023521802000004
 を有する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１は－ＣＲ６であり；Ｘ２は－ＣＲ５であり；Ｘ３はＮであり；Ｘ４は－ＣＲ９であり；式（Ｉｂ）：
Figure 2023521802000005
 を有する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１はＮであり；Ｘ２は－ＣＲ５であり；Ｘ３は－ＣＲ３であり；Ｘ４は－ＣＲ９であり；式（Ｉｃ）：
Figure 2023521802000006
 を有する
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１は－ＣＲ６であり；Ｘ２は－ＣＲ５であり；Ｘ３は－ＣＲ３であり；Ｘ４は
－ＣＲ９であり；式（Ｉｄ）：
Figure 2023521802000007
 を有する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１は－ＣＲ６であり；Ｘ２は－ＣＲ５であり；Ｘ３は－ＣＲ３であり；Ｘ４は
－Ｎであり；式（Ｉｅ）：
Figure 2023521802000008
 を有する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、ＲｙはＨ又はメチルである。別のサブ実施形態では、ＲｙはＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊは、Ｈ、ハロ、Ｃ１～６アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対のそれぞれが、これらのそれぞれに結合した炭素原子と組み合わさって、Ｒｘ環に対するスピロである飽和３、４又は５員単環式環を形成し；上記の環は、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、ここでＲ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊは、Ｈ、メチル又はエチルであり；Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対のそれぞれが、これらのそれぞれに結合している炭素原子と組み合わさって、Ｒｘの環に対してスピロであるシクロプロピル、シクロブチル又はシクロペンチル環を形成する。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩であり、基
Figure 2023521802000009
 は
Figure 2023521802000010
 である。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１は、基－Ｚ－Ｒ１２であり；ここでＺは、
－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－、－ＮＨＳＯ２－、－ＳＯ２－、－ＳＯ２ＮＨ－又は－ＮＨ－であり；Ｒ１２は、シクロプロピル、－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－ＯＨ、－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－ＯＨ、メチルオキセタニル又はｔｅｒｔ－ブチルである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１は、基－Ｚ－Ｒ１２；ここでＺは、－ＮＨＳＯ２であり－又は－ＮＨ－であり；Ｒ１２は、－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－ＯＨ又は－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－ＯＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１は、基－Ｚ－Ｒ１２であり；ここでＺは、－ＮＨＳＯ２－であり、Ｒ１２は、－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり；式中、Ｒ２は、基－Ｙ－Ｒ１３；ここでＹは－Ｃ０～４アルク－であり、－Ｏ－Ｃ０～４アルク－、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）２又は－ＳＯ２ＮＨ－であり；－Ｒ１３は４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル；－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＦ３、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロペンチル又は２－メチルモルホリニルである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ２は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、メチル若しくはＣＦ３から選択される１、２又は３個の基により置換されたピペリジニル又はモルホリニルであるか；又はＲ２は－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＦ３、－ＳＯ２ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）３又は－ＳＯ２－シクロペンチルである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ２は、基－Ｙ－Ｒ１３であり；ここでＹは、－Ｃ０～４アルク－であり；－Ｒ１３は、４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル又は２－メチルモルホリニルである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ４はＨ又はメチルである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ５はＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ６はＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ７はＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ８はＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ９はＨである。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、この化合物は、次のものからなる群から選択される：
Figure 2023521802000011
Figure 2023521802000012
Figure 2023521802000013
Figure 2023521802000014
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩などであり、この化合物は、
Figure 2023521802000015
 であり、これは、２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｒ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｒ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩などであり、この化合物は、
Figure 2023521802000016
 であり、
２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｓ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｓ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000017
 であり；
４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－Ｎ－（６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－Ｎ－（６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000018
 であり；
Ｎ－（６－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドである。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（６－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000019
 であり；
（Ｒ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、（Ｒ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000020
 であり、
（Ｓ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、（Ｓ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000021
 であり、
これは、Ｎ－（３－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－５－メチルフェニル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（３－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－５－メチルフェニル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000022
 であり、
これは、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000023
 であり、
これは、４－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）－Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、４－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）－Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れかの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000024
 であり、
これは、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000025
 であり；
これは、４－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）－Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（３－（シクロペンチルスルホニル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000026
 であり、
これは、（Ｒ）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－Ｎ－（６－（２－メチルモルホリノ）ピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、（Ｒ）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－Ｎ－（６－（２－メチルモルホリノ）ピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ここでＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000027
 であり、
これは、（Ｓ）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－Ｎ－（６－（２－メチルモルホリノ）ピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、（Ｓ）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－Ｎ－（６－（２－メチルモルホリノ）ピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の何れか１つの方法を提供し、ＫＩＦ１８Ａ又は薬学的に許容可能なその塩、例えば硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩であり、この化合物は、
Figure 2023521802000028
 であり、
これは、Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドと名付けられる。サブ実施形態では、塩はＨＣｌ塩であり、この化合物は、Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド塩酸塩と名付けられる。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物が、全ての薬学的に許容可能な、同位元素標識された本発明の化合物を含み、ここで、１つ以上の原子が、同じ原子番号ではあるが、天然では多数を占めている原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子により置き換えられることが企図される。
本発明の化合物の中に組み入れるのに適した同位元素の例としては、水素の同位元素、例えば２Ｈ及び３Ｈ、炭素、例えば１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ、塩素、例えば３８Ｃｌ、フッ素、例えば１８Ｆ、ヨウ素、例えば１２３Ｉ及び１２５Ｉ、窒素、例えば１３Ｎ及び１５Ｎ、酸素、例えば１５Ｏ、１７Ｏ及び１８Ｏ、リン、例えば３２Ｐ並びに硫黄、例えば３５Ｓが挙げられるが限定されない。
本発明の特定の同位体標識化合物、例えば、放射性同位体を組み込んだものは、薬剤及び／又は基質組織分布の研究において有用である。放射性同位体のトリチウム、即ち３Ｈ及び炭素－１４、即ち１４Ｃは、取り込みの容易さ及び検出手段の準備ができている点でこの目的に特に有用である。
重水素、即ち２Ｈなどのより重い同位体での置換により、代謝安定性が高まることから生じる、例えばインビボ半減期の延長又は必要投与量の減少などの特定の治療上の利点を得ることができるため、一部の状況では好ましいものであり得る。
１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎなどの陽電子放出同位体での置換は、基質の受容体占有率を調べるための陽電子放出断層撮像法（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
本発明の同位体標識化合物は、一般に、当業者にとって公知の従来技術によって、又は以前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して、付帯の実施例及び調製に記載されているものと類似の工程によって調製され得る。
本発明による薬学的に許容可能な溶媒和物としては、結晶化の溶媒が同位体により置換され得、例えば、Ｄ２Ｏ、ｄ６－アセトン、ｄ６－ＤＭＳＯであり得る。
本発明の具体的実施形態としては、下記の実施例に例示される化合物並びに薬学的に許容可能なその塩、複合体、溶媒和物、多形体、立体異性体、代謝産物、プロドラッグ及び他の誘導体が挙げられる。
別段の指示がない限り、以下の定義は本明細書及び特許請求の範囲中に見出される用語に適用される。
「Ｃα～βアルク」は、分岐鎖若しくは直鎖関係、又は３つの任意の組み合わせで最小限のα及び最大限のβ炭素原子を含み、α及びβは整数を表す、アルキル基を意味する。本項に記載されるアルキル基は、１個又は２個の二重又は三重結合も含有し得る。Ｃ０アルクの表記は、直接結合を指す。Ｃ１～６アルキルの例としては、以下のものが挙げられるが限定されない：
Figure 2023521802000029
「オキソ」及び「チオキソ」という用語は、それぞれ、＝Ｏ（カルボニルにおける場合）及び＝Ｓ（チオカルボニルにおける場合）の基を表す。
「ハロ」又は「ハロゲン」はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲン原子を意味する。
「Ｃα～βハロアルク」とは、アルク鎖に結合した任意の数（少なくとも１つ）の水素原子が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩによって置換される上記のようなアルク基を意味する。
基Ｎ（Ｒａ）Ｒａなどとしては、２つのＲａ基が共に、任意選択的にＮ、Ｏ又はＳ原子を含む環を形成する置換基が挙げられ、これとしては、
Figure 2023521802000030
 などの基が挙げられる。
基Ｎ（Ｃα～βアルク）Ｃα～βアルク（式中α及びβは上記で定義される通りである）としては、２つのＣα～βアルク基が共に、任意選択的にＮ、Ｏ又はＳ原子を含む環を形成する置換基が挙げられ、これとしては、
Figure 2023521802000031
 などの基が挙げられる。
「二環式」構造は、２つの結合した環を特徴とする基を意味する。二環式環は、炭素環（環原子全てが炭素である）であっても、又は複素環（その環の原子が、炭素原子に加えて、例えば１、２又は３個のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ又はＳなどからなる）であってもよい。２つの環は両方とも、脂肪族（例えばデカリン及びノルボルナン）であってもよく、若しくは芳香族（例えばナフタレン）であってもよく、又は脂肪族と芳香族との組み合わせ（例えばテトラリン）であってもよい。二環式環としては、（ａ）スピロ環化合物が挙げられ、ここで２つの環は、通常は四級炭素である１つのみの単一の原子、即ちスピロ原子を共有する。スピロ環化合物の例としては次のものが挙げられるが限定されない；
Figure 2023521802000032
 。
（ｂ）２つの環が２つの隣接する原子を共有する縮合二環式化合物。換言すると、環は１つの共有結合を共有し、即ち、橋頭原子は直接連結される（例えばα－ツジェン及びデカリン）。縮合二環式環の例としては、次のものが挙げられるが限定されない：
Figure 2023521802000033
；及び（ｃ）２個の環が、３個以上の原子を共有して、少なくとも１個の原子を含有する架橋によって２個の橋頭原子を分離している、架橋された二環式化合物。例えば、ノルボルナンは、ビシクロ［２．２．１］ヘプタンとしても知られ、１対のシクロペンタン環がそれぞれ、それらの５個の炭素原子のうち３個を共有していると考えられ得る。架橋二環式環の例としては、
Figure 2023521802000034
 が挙げられるが限定されない。
「炭素環」又は「炭素環式」とは、それ自体で、又は他の用語との組み合わせで、別段明記されない限り、「Ｃα～βアルク」の環状バージョンを含む環を意味する。炭素環の例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロブチレン、シクロヘキシレンなどが挙げられる。
「薬学的に許容可能な塩」は、慣用される手段により調製された塩を意味し、当業者にとって周知である。「薬理学的に許容可能な塩」としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸などが挙げられるが限定されない、無機及び有機酸の塩基性塩が挙げられる。本発明の化合物が、カルボキシ基などの酸性官能基を含む場合、カルボキシ基にとって好適な薬学的に許容可能な陽イオン対は、当業者にとって周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、四級アンモニウム陽イオンなどが挙げられる。「薬理学的に許容可能な塩」のさらなる例は、以下、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１（１９７７）を参照のこと。
「飽和、部分飽和又は不飽和」は、水素で飽和した置換基、水素で完全に飽和されない置換基及び水素で部分的に飽和した置換基を含む。
注目すべきこととして、本発明の化合物には、互変異性体の形態、例えば環状及び非環状のアミジン及びグアニジン基、ヘテロ原子で置換されたヘテロアリール基（Ｙ’＝Ｏ、Ｓ、ＮＲ）などの形態で存在し得る基を含有し得、これらは次の例で例示され：
Figure 2023521802000035
 本明細書では１つの形態が命名、記載、表示及び／又は請求されるが、全ての互変異性体の形態が、こうした命名、記載、表示及び／又は請求に本質的に含まれるものとする。
本発明の化合物のプロドラッグもまた、本発明の方法で使用されることが企図される。プロドラッグとは、そのプロドラッグを患者に投与した後で、インビボの生理的な作用、例えば加水分解、代謝などを通じて化学的に修飾され、本発明の化合物となる、活性又は非活性な化合物である。プロドラッグの製造及び使用に関与する適合性及び技術は当業者にとって周知である。エステルを含むプロドラッグの全般的な考察については、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｔｕｎｅｋ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６５（１９８８）及びＢｕｎｄｇａａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５）を参照されたい。マスクされたカルボン酸陰イオンの例としては、アルキル（例えばメチル、エチル）、シクロアルキル（例えばシクロヘキシル）、アラルキル（例えばベンジル、ｐ－メトキシベンジル）及びアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ピバロイルオキシメチル）などの種々のエステルが挙げられる。アミンは、インビボでエステラーゼにより開裂され、遊離薬物及びホルムアルデヒドを放出するアリールカルボニルオキシメチル置換誘導体としてマスクされている（Ｂｕｎｇａａｒｄ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５０３（１９８９））。また、イミダゾール、イミド、インドールなどの酸性ＮＨ基を含有する薬物は、Ｎ－アシルオキシメチル基でマスクされている（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５））。ヒドロキシ基はエステル及びエーテルとしてマスクされている。欧州特許第０３９，０５１号明細書（Ｓｌｏａｎ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ，４／１１／８１）は、マンニッヒ塩基ヒドロキサム酸プロドラッグ、それらの調製及び使用を開示する。
本明細書及び特許請求の範囲は、「．．．及び．．．から選択される」及び「．．．又は．．．である」の表現を用いる、種の列挙を含有する（マーカッシュグループと称される場合もある）。この用語が本願で使用される場合、別段明記されない限り、群全体、若しくはその何らかの単一メンバー又はその何らかのサブグループを含むことが意図される。この表現の使用は、単に省略表現目的であり、必要に応じて、個別の要素又はサブグループの除外を決して制限するものではない。
様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、大きな分子化合物、例えば核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質である。様々な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａをコードする核酸を標的とする及び／又はそれに結合する分子である。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａをコードする核酸は、ヒトＫＩＦ１８Ａ遺伝子配列（配列番号３０として本明細書中で提供される）又はヒトＫＩＦ１８Ａ ｍＲＮＡ配列（配列番号３１として本明細書中で提供される）であり、コードされるＫＩＦ１８Ａタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａをコードする核酸、任意選択的に配列番号３０又は３１を標的とする及び／又はそれに結合する核酸を含む。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａをコードする核酸（例えば配列番号３０又は３１）の一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａ遺伝子のエクソン３、エクソン４又はエクソン７の一部に結合するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
「核酸」は、本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ若しくはＲＮＡのポリマー又はその修飾形態を意味し、これは、一本鎖又は二本鎖であり、合成され得るか又は天然起源から獲得（例えば単離及び／又は精製）され得、これは、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見られるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然又は改変ヌクレオチド間結合、例えばホスホロアミダート結合又はホスホロチオエート結合などを含有し得る。核酸は、様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａをコードする核酸を標的とする及び／又はそれに結合する何らかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、挿入、欠失、反転及び／又は置換を全く含まない。他の実施形態では、核酸は、１つ以上の挿入、欠失、反転及び／又は置換を含む。いくつかの態様での核酸は、当技術分野で公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素によるライゲーション反応に基づいて構築される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；及びＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。例えば、核酸は、天然のヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を向上させるために又はハイブリッド形成時に形成される二重鎖の物理的安定性を向上させるために設計される様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成させるために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアンモメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｔｉｌ）、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが限定されない。或いは、本開示の核酸の１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）などの会社から購入され得る。
様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａの発現を低下させる。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａの発現を低下させる非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａ遺伝子及び／又はその遺伝子産物（例えばＫＩＦ１８Ａ ｍＲＮＡ、ＫＩＦ１８Ａタンパク質）の発現を低下させる。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤によりもたらされるＫＩＦ１８Ａ遺伝子及び／又はその遺伝子産物（例えばＫＩＦ１８Ａ ｍＲＮＡ、ＫＩＦ１８Ａタンパク質）の発現の低下は、１００％又は完全な低下若しくは阻害若しくは抑止でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する低下の様々な程度がある。この点において、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、何れかの量又はレベルまでＫＩＦ１８Ａ遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現を低下させ得る。代表的な実施形態では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤によって提供される低下は、少なくとも若しくは約１０％の低下（例えば、少なくとも若しくは約２０％の低下、少なくとも若しくは約３０％の低下、少なくとも若しくは約４０％の低下、少なくとも若しくは約５０％の低下、少なくとも若しくは約６０％の低下、少なくとも若しくは約７０％の低下、少なくとも若しくは約８０％の低下、少なくとも若しくは約９０％の低下、少なくとも若しくは約９５％の低下、少なくとも若しくは約９８％の低下）である。核酸（例えば、ＫＩＦ１８Ａ遺伝子、ＫＩＦ１８Ａ ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）の発現レベルを決定する適切な方法は、当技術分野で公知であり、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ））、ＲＮＡｓｅｑ及びノーザンブロッティングを含むが限定されない。遺伝子発現を測定するための技術は、例えば遺伝子チップの使用を伴うか又は伴わない遺伝子発現アッセイを含み、又は遺伝子発現マイクロアッセイは、Ｏｎｋｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｄｉａｇ １２（４）：４６１－４６８（２０１０）；及びＫｉｒｂｙ ｅｔ．ａｌ．，Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４４：２４７－２９２（２００７）に記載されている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ及びＲＮＡチップ及び遺伝子発現アッセイキット（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）などの会社からも市販されている。タンパク質の発現レベルを決定する適切な方法は当技術分野で公知であり、免疫アッセイ（例えばウエスタンブロッティング、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学アッセイ及び免疫組織化学アッセイ）又はビーズに基づく多重アッセイ、例えばＤｊｏｂａ Ｓｉａｗａｙａ ＪＦ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｔ，Ｂａｂｂ Ｃ，Ｂｌａｃｋ Ｇ，Ｇｏｌａｋａｉ ＨＪ，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｅａｄ－Ｂａｓｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（７）：ｅ２５３５に記載のものが挙げられる。
様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、タンパク質に翻訳されないｎｃＲＮＡである。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、短いｎｃＲＮＡであり、例えば約３０ヌクレオチド未満を含む。代替的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含むが限定されない、例えば約２００ヌクレオチド超を含む長いｎｃＲＮＡである。任意選択的に、短いｎｃＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＰＩＷＩ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。様々な態様では、ｎｃＲＮＡは、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）又はＣａｊａｌ小体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）である。例えば、Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：８６１－８７４（２０１１）を参照のこと。
代表的な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に介在するか又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を惹起する分子である。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＲＮＡｉトリガーである。ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡが配列特異的に分解され得る、植物及び動物における遺伝子制御のユビキタスな機序である（Ｓｅｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １８：４２１－４４６（２０１９）；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，４８５－４９０（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２，２２５－２３２（２００２）；Ｆｉｒｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６－８１１（１９９８）；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３（２０００））。ＲＮＡ分解過程は、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼダイサーが介在し、長いｄｓＲＮＡ前駆体から、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；短干渉ＲＮＡとしても知られる）と称される２１～２５ヌクレオチド長の二本鎖断片への切断を促進する（Ｚａｍｏｒｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０１，２５－３３（２０００）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８－２００（２００１）；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３－２９６（２０００）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３－３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識及び切断する大きなタンパク質複合体へと組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９－３２１（２００１））。細胞でのｓｉＲＮＡの成熟におけるダイサーの必要性は、様々な哺乳動物細胞における遺伝子移入された及び内因性の遺伝子の発現を阻害する、合成２１－ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖を導入することによって回避され得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１））。
ｓｉＲＮＡは、エンドサイトーシスを通じて細胞に侵入し、細胞質においてＲＮＡｉ酵素、ダイサー及びＴＡＲ ＲＮＡ－結合タンパク質（ＴＲＢＰ）と直接相互作用してＲＩＳＣローディング複合体（ＲＬＣ）を形成し、鎖選択を受けて成熟ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を生成させるために、改変及び／又は合成され得る。成熟ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、ｍＲＮＡセクエストレーション（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を細胞質体に誘導し、ｍＲＮＡ分解を促進し、転写遺伝子サイレンシングを指示することによって遺伝子発現を制御する。ｓｉＲＮＡは通常、強力で狭く標的化された遺伝子サイレンシングを誘導するために単一の標的ｍＲＮＡに対する完全な相補性を有する。
代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＲＮＡｉを媒介し、様々な例において、これは、ＫＩＦ１８Ａタンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）の発現の阻害に特異的なｓｉＲＮＡ分子である。本明細書中で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉを指示又は仲介可能である、約１０～約５０個のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（又はＲＮＡ類似体）を指す。代表的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約３０個のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）又は約１８～約２５個のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）、例えば１９～２１個のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。ｓｉＲＮＡは二本鎖又は一本鎖であり得る。
代替的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現の阻害に特異的な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。本明細書中で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、一本鎖ＲＮＡが部分的に回文塩基配列を含有し、そこに二本鎖構造（つまりヘアピン構造）を形成する、約２０以上の塩基対の分子を指す。ｓｈＲＮＡは、折り畳まれてヘアピン構造になるｓｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ類似体）であり得る。ｓｈＲＮＡは、典型的には約４５～約６０ヌクレオチドを含み、これは、ヘアピンのおよそ２１のヌクレオチドアンチセンス及びセンス部分、約２～約６ヌクレオチド長の非ループ側上の任意選択的オーバーハング並びに例えば約３～１０ヌクレオチド長であり得るループ部分を含む。ｓｈＲＮＡは、化学合成され得る。或いは、ｓｈＲＮＡは、逆方向のＤＮＡ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結し、鋳型としてＤＮＡを用いてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼでインビトロでＲＮＡを合成することによって作製され得る。如何なる理論又は機序にも束縛されることを望むものではないが、ｓｈＲＮＡが細胞に導入された後、ｓｈＲＮＡは、約２０塩基以上の長さ（例えば、典型的には２１、２２、２３塩基）に分解し、ＲＮＡｉを生じさせ、阻害作用をもたらすものと考えられる。従って、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘発し、従って本開示の有効成分として使用され得る。ｓｈＲＮＡは好ましくは、３’－突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に制限されないが、好ましくは約１０個以上のヌクレオチド、より好ましくは約２０個以上のヌクレオチドである。ここで、３’－突出末端は、好ましくはＤＮＡ、より好ましくは、少なくとも２ヌクレオチド長のＤＮＡ、さらにより好ましくは２～４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ分子と塩基対形成し、翻訳抑制又は標的分解を介して遺伝子発現を抑制する、小さな（例えば、１５～２２ヌクレオチド）非コーティングＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡ及びその治療可能性は当技術分野で記述されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，２０１１；Ｂａｄｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｍｅｒｓ，“Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ”Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ５２－５５（Ｍａｒｃｈ ２０１１）を参照のこと。
様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、完全に塩基対形成したｄｓＲＮＡ又は全長が１５～３０ｂｐの範囲の低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であるＲＮＡトリガーである。様々な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、切断及びＲＬＣへの引き継ぎのためにＲＮＡｉ経路酵素ダイサーと相互作用するより大きな（＞２１ ｂｐ）ＲＮＡ二本鎖である。代替的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ダイサー切断を迂回し、ＴＲＢＰが介在する相互作用を介してＲＩＳＣに入ることが可能であるより短い（＜２１ ｂｐ）ｓｉＲＮＡ又はその類似体である。この第２の経路は、ダイサーの非存在下で依然として機能し得る。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、Ｓｅｔｔｅｎら、前出、２０１９に記載のように、ｓｓ－ｓｉＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡ、ｓｉｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ＥＳＣ）、ｓｉＲＮＮ、ＧａｌＸＣ、ＤｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。ＫＩＦ１８Ａ遺伝子発現低下を引き起こすため又はＫＩＦ１８Ａ遺伝子機能の完全な排除、例えば遺伝子ノックアウト、を引き起こすためにゲノム編集に介在する代表的なＫＩＦ１８Ａ阻害剤は本明細書中に記載されている。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、配列番号１２～１８の配列を含む。
医薬組成物、投与及び投与経路
様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、医薬組成物の一部として提供される。従って、例えば希釈剤又は担体などの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に本明細書中で開示されるような化合物を含む医薬組成物が本開示により提供される。本発明での使用に好適な化合物及び医薬組成物としては、化合物がその意図された目的を達成するのに有効な量で投与され得るものが挙げられる。化合物の投与について、以下でより詳細に説明する。
適切な医薬製剤は、投与経路及び所望の投与量に応じて当業者により決定され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４３５－７１２（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）を参照のこと。製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。投与経路に依存して、好適な用量は、体重、体表面積又は器官サイズに応じて算出され得る。適切な治療用量を決定するために必要である計算のさらなる微調整は、特に、本明細書中で開示した投与量情報及びアッセイ並びに動物又はヒトの臨床試験を通じて得ることが可能な薬物動態データに照らして、必要以上の実験を行わずに当業者によって日常的に行われる。
「薬学的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」という句は、動物又はヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような賦形剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が治療用組成物と適合しない場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分も組成物に組み込まれ得る。代表的な実施形態では、製剤は、コーンシロップ固形分、高オレインベニバナ油、ココナッツ油、大豆油、Ｌ－ロイシン、第三リン酸カルシウム、Ｌ－チロシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－リジンアセテート、ＤＡＴＥＭ（乳化剤）、Ｌ－グルタミン、Ｌ－バリン、第二リン酸カリウム、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－アスパラギン一水和物、Ｌ－セリン、クエン酸カリウム、Ｌ－スレオニン、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン酸、塩化コリン、タウリン、ｍ－イノシトール、硫酸第一鉄、パルミチン酸アスコルビル、硫酸亜鉛、Ｌ－カルニチン、アルファ－トコフェリルアセテート、塩化ナトリウム、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン塩化物塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、硫酸マンガン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、ベータ－カロテン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミンを含み得る。
本化合物は、薬学的に許容可能な塩として医薬組成物中に存在し得る。本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容可能な塩」には、例えば、塩基付加塩及び酸付加塩が含まれる。
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属又は有機アミンなどの金属又はアミンとともに形成され得る。化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な陽イオンとともにも調製され得る。好適な薬学的に許容可能な陽イオンは、当業者にとって周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び第四級アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩又は炭酸水素塩も可能である。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄などである。好適なアミンの例としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン及びプロカインが挙げられる。
薬学的に許容可能な酸付加塩としては、無機酸又は有機酸の塩が挙げられる。好適な酸塩の例としては、塩酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、リン酸塩が挙げられる。他の好適な薬学的に許容可能な塩は、当業者にとって周知であり、例えばギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸を伴う；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸若しくはホスホ酸又はＮ－置換スルファミン酸、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、２－フェノキシ安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、エンボニン酸、ニコチン酸若しくはイソニコチン酸を伴う；及び天然でのタンパク質の合成に関与する２０個のアルファアミノ酸、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸などのアミノ酸を伴う及びまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、トルエンスルホン酸（トシル酸）、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン１，２－ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシル酸）、４－メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン２－スルホン酸、ナフタレン１，５－ジスルホン酸、２－若しくは３－ホスホグリセリン酸、グルコース６－リン酸、Ｎ－シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）又はアスコルビン酸などの他の酸有機化合物を伴うものが挙げられる。
本明細書で開示される化合物を含有する医薬組成物は、従来法において、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥工程によって製造され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
経口投与のために、好適な組成物は、本明細書中で開示された化合物を当技術分野で周知の担体などの薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。このような賦形剤及び担体は、処置しようとする患者による経口摂取のために、本発明の化合物が錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、本明細書中で開示される化合物を固体賦形剤とともに添加し、任意選択的に、得られた混合物を粉砕し、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、必要に応じて好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理することにより得ることができる。好適な賦形剤としては、例えば、注入剤及びセルロース調製物が挙げられる。必要に応じて崩壊剤を添加し得る。薬学的に許容可能な成分は、様々なタイプの製剤のために周知であり、例えば結合剤（例えば、天然又は合成ポリマー）、滑沢剤、界面活性剤、甘味料及び香味剤、コーティング剤、保存剤、顔料、増粘剤、アジュバント、抗微生物剤、抗酸化剤並びに様々な製剤タイプのための担体であり得る。
治療的有効量の本明細書で開示される化合物が経口投与される場合、本組成物は、典型的には、固体製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末若しくはトローチ剤）又は液体製剤（例えば、水性懸濁剤、液剤、エリキシル剤若しくはシロップ剤）の形態である。
錠剤形態で投与される場合、本組成物は、ゼラチン又はアジュバントなどの機能性固体及び／又は機能性固体担体をさらに含有し得る。錠剤、カプセル剤及び粉末剤は、約１～約９５％の化合物、好ましくは約１５～約９０％の化合物を含有し得る。
液体又は懸濁液の形態で投与される場合、水、石油又は動物若しくは植物起源の油などの機能性液体及び／又は機能性液体担体を添加し得る。本組成物の液体形態は、生理食塩水溶液、糖アルコール溶液、デキストロース若しくは他の糖類溶液又はグリコールをさらに含有し得る。液体又は懸濁液の形態で投与される場合、本組成物は、約０．５～約９０重量％の本明細書で開示される化合物及び好ましくは約１～約５０％の本明細書で開示される化合物を含有し得る。企図される一実施形態では、液体担体は、非水性又は実質的に非水性である。液体形態での投与のために、本組成物は、投与の直前に溶解又は懸濁のための迅速溶解性固体製剤として供給され得る。
治療有効量の本明細書で開示される化合物を静脈、皮膚又は皮下注射によって投与する場合、本組成物は、パイロジェン不含の非経口的に許容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを十分に考慮した、このような非経口的に許容可能な溶液の調製は、当技術分野の範囲内である。静脈、皮膚又は皮下注射のための好ましい組成物は、典型的には、本明細書中で開示される化合物に加えて等張性ビヒクルを含有する。このような組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中の遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩の溶液として投与するために調製され得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中並びに油中で分散液を調製し得る。保存及び使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために任意選択的に保存剤を含有し得る。
注射用組成物は、無菌の注射用溶液、懸濁液又は分散液を即時に調製するための無菌の水溶液、懸濁液又は分散液及び無菌の粉末を含み得る。全ての実施形態では、形態は、無菌でなければならず、且つ容易な通針性が存在する程度までの流動性がなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、任意選択的に保存剤を含めることにより、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に耐性がなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。企図される一実施形態では、担体は、非水性又は実質的に非水性である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の実施形態における必要とされる化合物の粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサールなどによってもたらされ得る。多くの実施形態では、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
無菌の注射溶液は、上で列記した種々の必要な他の成分とともに、必要量の活性化合物を適当な溶媒に組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び上で列挙した成分からの必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに、滅菌された様々な有効成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射溶液を調製するための無菌の粉末の実施形態では、好ましい調製方法は、有効成分に何らかのさらなる所望の成分を加えた粉末が予め滅菌ろ過したその溶液から得られる、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
徐放性又は持続放出性製剤は、ＧＩ管内の体液と接触している活性化合物の制御放出を行うため、及び血漿中の活性化合物の実質的に一定且つ有効なレベルを提供するためにも調製され得る。例えば、放出は、溶解、分散及びイオン交換の１つ以上によって制御され得る。さらに、徐放性アプローチは、ＧＩ管内の飽和性経路又は制限経路を介した吸収を促進し得る。例えば、本化合物は、この目的のために、生分解性ポリマー、水溶性ポリマー又は両方の混合物及び任意選択的に好適な界面活性剤のポリマーマトリクスに包埋され得る。これに関連して、包埋とは、ポリマーのマトリクス中に微粒子を組み込むことを意味し得る。制御放出製剤はまた、既知の分散液又はエマルションコーティング技術を介した分散微粒子又は乳化微小液滴のカプセル化を通じて得られる。
吸入による投与の場合、本発明の化合物は、好適な噴射剤を使用して、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提供の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの実施形態では、投与量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。インヘラー又は吸入器で使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、本化合物と、ラクトース又はデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化され得る。
本明細書中で開示される化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射又は連続注入による）非経口投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、保存剤を添加した単位剤形（例えば、アンプル又は多用量容器において）で提供され得る。本組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルションなどの形態を取り得、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有し得る。
非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態の化合物の水溶液が含まれる。さらに、本化合物の懸濁剤は、適切な油性注射懸濁剤として調製され得る。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油又は合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。任意選択的に、懸濁液は、化合物の溶解度を増加させ、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする好適な安定剤又は薬剤も含有し得る。代わりに、本発明の組成物は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン不含水）との構成のための粉末形態であり得る。
本明細書中で開示される化合物は、坐薬又は停留浣腸（例えば、従来の坐薬基剤を含有する）などの直腸用組成物中で製剤化され得る。先述した製剤に加えて、本化合物はまた、デポ剤として製剤化され得る。このような長時間作用の製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、本化合物は、好適なポリマー性若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて製剤化され得るか、又は、難溶性誘導体、例えば難溶性の塩として製剤化され得る。
特に、本明細書で開示される化合物は、デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で、又は単独で若しくは賦形剤との混合物の何れかでの、カプセル剤若しくはオビュール剤において、又は香味剤若しくは着色剤を含有するエリキシル剤若しくは懸濁液の形態で、経口、頬側又は舌下投与され得る。このような液体製剤は、懸濁化剤などの薬学的に許容可能な添加物とともに調製され得る。本化合物はまた、非経口的に、例えば静脈内、筋肉内、皮下又は冠動脈内に注射し得る。非経口投与の場合、本化合物は、溶液を血液と等張にするために、他の物質、例えば塩又はマンニトール若しくはグルコースなどの糖アルコールを含有し得る無菌水溶液の形態で最もよく使用される。
獣医学的使用の場合、本明細書中で開示される化合物は、通常の獣医学的な実践に従い、適切に許容可能な製剤として投与される。獣医は、特定の動物に最も適している投与計画及び投与経路を容易に決定し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示した化合物を単独で、又はＫＩＦ１８Ａ関連障害のような疾患の処置のために従来使用される別の薬剤若しくは介入と組み合わせて使用するＫＩＦ１８Ａ関連障害の処置に対する必要な成分は全て、キットにパッケージ化し得る。具体的には、本発明は、本明細書中で開示される化合物、並びに前記薬剤の送達可能な形態を調製するための緩衝液及び他の成分を含む薬剤、及び／又はそのような薬剤を送達するための器具、及び／又は本明細書中で開示される化合物との併用療法で使用される何らかの薬剤、及び／又は薬剤と共にパッケージ化された疾患の処置のための説明書のパッケージ化されたセットを含む、疾患の治療介入で使用するためのキットを提供する。説明書は、印刷された紙又はコンピュータ可読の磁気若しくは光学媒体などの何らかの有形媒体に固定され得るか、又はインターネットを介してアクセス可能なワールドワイドウェブのページなどの遠隔コンピュータのデータソースを参照する説明書であり得る。
「治療的有効量」は、処置される対象の現存する症状を処置するか、又は進行を防止するか、又は軽減するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、「治療的有効用量」は、所望の効果をもたらす化合物の量を指す。例えば、好ましい一実施形態では、治療的有効量の本明細書で開示される化合物は、対照と比較してＫＩＦ１８Ａ活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％低下させる。
投与される化合物の量は、処置される対象、対象の年齢、健康、性別及び体重、同時処置の種類（存在する場合）、疾患の重症度、所望の効果の性質、処置の方式及び頻度並びに処方する医師の判断に依存し得る。投与の頻度は、動脈の酸素圧力に対する薬力学的効果にも依存し得る。個々の必要性が変動する一方、本化合物の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。このような用量は、単一用量で投与され得るか又は複数回用量に分割され得る。
不活性化された遺伝子、増幅された遺伝子及び発現レベルに対するアッセイ
本開示の方法の様々な実施形態では、本方法は、不活性化された遺伝子（例えば不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ）について試料をアッセイすることを含む。本明細書中で使用される場合、遺伝子に関して「不活性化された」という用語は、遺伝子又は遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下又は喪失を指す。遺伝子の不活性化は、１つ以上の公知の機序によって引き起こされ得る。例えば、遺伝子の不活性化は、対応する野生型遺伝子、ＲＮＡ若しくはタンパク質と比較した、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又はタンパク質配列の変動（例えば喪失を含む）により引き起こされ得るか、又は遺伝子のＤＮＡ配列における何れの変更も含まないエピジェネティックな変動により引き起こされ得る。
様々な態様では、アッセイする段階は、遺伝子又は遺伝子によりコードされる遺伝子産物における変動又は異常の存在を検出することを含み、この変動又は異常は対応する野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較したものであり、変動の存在は、遺伝子のサイレンシング、遺伝子若しくは遺伝子によりコードされる遺伝子産物の発現の低下若しくは喪失、遺伝子若しくは遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下若しくは喪失又はそれらの組み合わせにつながるか又はそれと関連する。様々な例では、遺伝子産物は、ＲＮＡ転写産物又はタンパク質である。様々な例では、この変動は、少なくとも、遺伝子又は遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下又は喪失につながる。様々な例では、変動は、少なくとも、ＴＰ５３遺伝子又はＴＰ５３遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下又は喪失につながる。様々な例では、変動は、少なくとも、Ｒｂ１遺伝子又はＲｂ１遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下又は喪失につながる。様々な例では、変動は、少なくとも、ＢＲＣＡ遺伝子又はＢＲＣＡ遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能の低下又は喪失につながる。
遺伝子における変動は、遺伝子中のあらゆる場所に、例えばイントロン又はエクソン内、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）又は３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）内に存在し得る。変動は、遺伝子によりコードされる転写産物（例えば、ＲＮＡ転写産物、一次転写産物、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の何れかの部分内又はそこに存在し得るか、又は遺伝子によりコードされるタンパク質の何れかの部分内又はそこに存在し得る。
様々な態様では、変動は、対応する野生型遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質と比較した、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又はタンパク質配列における相違である。様々な態様では、試料は、遺伝子のヌクレオチド配列を分析するか、遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列を分析するか、又は遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を分析し、遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質の対応する野生型ヒト配列に対して試料の遺伝子の配列を比較することにより、不活性化された遺伝子についてアッセイされる。代表的な態様では、この変動は、対応する野生型遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質と比較した、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換、タンパク質配列における１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。代表的な態様では、この変動は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の遺伝子コピー数増加又は増幅を結果として生じ得る、対応する野生型の遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質と比較した、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列における１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換、タンパク質配列における１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。様々な態様では、アッセイすることは、遺伝子における遺伝子突然変異の存在を検出することを含む。様々な態様では、アッセイすることは、遺伝子における遺伝子突然変異の存在又は遺伝子におけるヌクレオチドの喪失を検出することを含む。代表的な例では、遺伝子突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、重複、フレームシフト突然変異、短縮化又は反復拡大である。様々な例では、不活性化されたＴＰ５３遺伝子は、突然変異、欠失又は短縮化を含み、不活性化されたＲｂ１遺伝子は、突然変異、欠失又は短縮化を含み、及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子は、突然変異、欠失又は短縮化を含む。本明細書中で使用される場合、「ＢＲＣＡ遺伝子」という用語は、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２遺伝子を指す。代表的な例では、ＢＲＣＡ遺伝子はＢＲＣＡ１である。代表的な態様では、ＢＲＣＡ遺伝子はＢＲＣＡ２である。
様々な例では、変動は、エピジェネティックであり、遺伝子のＤＮＡ配列の変化を全く含まない。代表的な態様では、不活性化された遺伝子は、エピジェネティックにサイレンシングされ、任意選択的にＤＮＡ又はヒストンタンパク質の共有結合修飾を含む。ＤＮＡの共有結合修飾は、例えばシトシンメチル化又はヒドロキシメチル化であり得る。ヒストンタンパク質の共有結合修飾は、例えばリジンアセチル化、リジン若しくはアルギニンメチル化、セリン若しくはスレオニンリン酸化又はリジンユビキチン化又はＳＵＭＯ化であり得る。遺伝子サイレンシングの機序は転写又は翻訳中に起こり得る。遺伝子サイレンシングの代表的な機序としては、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられるが限定されない。様々な態様では、不活性化された遺伝子は、エピジェネティックにサイレンシングされたプロモーターを有する、エピジェネティックにサイレンシングされた遺伝子である。任意選択的に、不活性化されたＴＰ５３遺伝子は、エピジェネティックにサイレンシングされたＴＰ５３プロモーターを有するか、又は不活性化されたＲｂ１遺伝子は、エピジェネティックにサイレンシングされたＲｂ１プロモーターを有するか、又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子は、エピジェネティックにサイレンシングされたＢＲＣＡプロモーターを有する。エピジェネティックなサイレンシングについてアッセイするための適切な技術としては、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ－ｏｎ ｃｈｉｐ、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、メチル化感受性制限酵素、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ同定（ＤａｍＩＤ）及びバイサルファイトシーケンシングが挙げられるが限定されない。例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ２３：２２３－２３３（２０１４）を参照のこと。
様々な態様では、不活性化された遺伝子は、ウイルス誘導型遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）により不活性化される。様々な例では、不活性化されたＴＰ５３遺伝子は、ウイルスタンパク質、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質により不活性化される。任意選択的に、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質は、ＴＰ５３遺伝子によりコードされるｐ５３タンパク質と相互作用し、ｐ５３タンパク質を不活性にする。様々な例では、不活性化されたＲｂ１遺伝子は、ウイルスタンパク質、例えばＨＰＶ Ｅ７タンパク質により不活性化される。任意選択的に、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、Ｒｂ１遺伝子によりコードされるＲｂタンパク質と相互作用し、Ｒｂタンパク質を不活性にする。このようなサイレンシング方式は当技術分野で公知である。例えば、Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｎｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：６０４１－６０４８（２００２）を参照されたい。
本開示の方法の様々な実施形態では、本方法は、遺伝子増幅、例えばＣＣＮＥ１増幅又は遺伝子のコピー数の増加、例えば遺伝子の遺伝子コピー数増加について試料をアッセイすることを含む。様々な例では、ＤＮＡ－又はＲＮＡに基づく技術（遺伝子発現分析［比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＲＮＡに基づくハイブリダイゼーション］、ＮＧＳ、ＰＣＲ又はサザンブロット）によって、又は分子細胞遺伝学的技術（遺伝子特異的プローブを用いたＦＩＳＨ２、ＣＩＳＨ（発色インシトゥハイブリダイゼーション））によって増加又は増幅遺伝子について試料をアッセイする。様々な態様では、遺伝子増幅又は遺伝子コピー数増加を検出するために、競合的又は定量的ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイに対するゲノムハイブリダイゼーション及びＲＮＡに対する遺伝子プローブの定量を行う。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ３：１６３－１６８（１９９３）；Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（４）：７９９－８０２（２０００）を参照のこと。様々な例では、本方法は、ＭＤＭ２遺伝子の遺伝子コピー数増加又は増幅及び／又はＦＢＸＷ７遺伝子の遺伝子コピー数増加又は増幅又は突然変異について試料をアッセイすることを含む。代表的な態様では、本方法は、ＭＤＭ２遺伝子の遺伝子コピー数増加又は増幅及びｐ５３タンパク質レベルの低下について試料をアッセイすることを含む。代表的な態様では、本方法は、ＦＢＸＷ７遺伝子の突然変異及びＣＣＮＥ１遺伝子によりコードされる遺伝子産物の過剰発現について試料をアッセイすることを含む。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）も、遺伝子コピー数増加若しくは減少又は遺伝子増幅を検出するための方法として使用され得、それにより、遺伝子領域がシーケンシングされ、関心対象の遺伝子の増加又は喪失を推定するためにシーケンシングリードを他の遺伝子と比較する。
代表的な態様では、不活性化されたＴＰ５３遺伝子は、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＴＰ５３プロモーターを含むか、（ｉｉ）ウイルスタンパク質によるか又はＭＤＭ２遺伝子の遺伝子増幅を介して不活性化されるか、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせである。任意選択的に、ウイルスタンパク質は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質である。代表的な態様では、不活性化されたＲｂ１遺伝子は、（ｉ）Ｒｂ１遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＲｂ１プロモーターを含むか、（ｉｉ）ウイルスタンパク質により不活性化されるか、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせである。任意選択的に、ウイルスタンパク質は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質である。代表的な態様では、不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子は、（ｉ）ＢＲＣＡ遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＢＲＣＡプロモーターを含む。任意選択的に、ＢＲＣＡ遺伝子はＢＲＣＡ１遺伝子である。或いは、ＢＲＣＡ遺伝子はＢＲＣＡ２遺伝子である。
様々な態様では、不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子コピー数増加又は増幅及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子は、新生物疾患（例えば癌）の生殖系列細胞に存在する。様々な態様では、不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子コピー数増加又は増幅及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子は、新生物疾患（例えば癌）の生殖系列細胞に存在し、新生物疾患（例えば癌）の体細胞には存在しない。任意選択的に、新生物疾患の体細胞突然変異ゆえに、新生物疾患の体細胞は、野生型の遺伝子型に復帰しており、従って不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子コピー数増加又は増幅及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子を示さないが、新生物疾患の生殖系列細胞は依然として、不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子コピー数増加又は増幅及び／又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子を示す。例えば、新生物疾患は、ＰＡＲＰ阻害剤耐性の癌であり得、癌の生殖系列細胞のみが不活性化されたＢＲＣＡ１遺伝子を有し、一方でその癌の体細胞はＢＲＣＡ１コード領域及び機能の回復を示す。
代表的な例では、アッセイ段階は、不活性化されたか又は増幅された遺伝子又は遺伝子コピー数増加、例えば不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子の存在を検出するための、細胞遺伝学的な方法及び／又は分子的な方法を含む。代表的な態様では、アッセイ段階は、直接的なＤＮＡシーケンシング、ＤＮＡハイブリダイゼーション及び／又は制限酵素消化を含む。任意選択的に、細胞遺伝学的方法は、核型分析、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）又はそれらの組み合わせを含む。様々な例では、分子的方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅抵抗性突然変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチの化学切断（ＣＣＭ）、タンパク質短縮化試験（ＰＴＴ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）又はそれらの組み合わせを含む。任意選択的に、ＰＣＲは、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ又はリアルタイム定量ＰＣＲである。様々な態様では、アッセイ段階は、ＴＰ５３遺伝子、Ｒｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子及び／又はＢＲＣＡ遺伝子によりコードされるＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルをアッセイすることを含む。様々な態様では、アッセイ段階は、ＡＲＭＳ、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ又はＮＧＳを含む。このような技術は、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：１２１（２０１７）及びＨｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２７（２４）：３００４－３０１４（２０１６）に記載されている。様々な例では、アッセイ段階は、全エクソームシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを含む。代表的な態様では、アッセイは液体生検を含む。液体生検は、当技術分野で詳細に記載されている。例えば、Ｐｏｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ ６３（６）：４４９－４５５ （２０１９），Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（１）：３４（２０１９）を参照のこと。
様々な態様では、遺伝子コピー数増加又は増幅は、遺伝子によりコードされる遺伝子産物（例えばＲＮＡ及び／又はタンパク質）レベルの過剰発現又は上昇につながる。ＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルの上昇を検出する方法は当技術分野で公知である。代表的な態様では、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又は増幅は、ＣＣＮＥ１遺伝子によりコードされる遺伝子産物の過剰発現又はレベル上昇につながる。代表的な態様では、ＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現は、ＦＢＸＷ７遺伝子における突然変異により引き起こされる。様々な態様では、試料は、ＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現及びＦＢＸＷ７遺伝子における突然変異について陽性である。
様々な例では、本開示の方法は、対象から得られた試料（例えば組織又は血液を含む試料）中の、ＲＮＡ転写産物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はタンパク質を介して遺伝子の発現レベルを測定することを含む。ここで開示される方法の代表的な態様では、本方法は、ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＢＲＣＡ、ＣＣＮＥ１又は遺伝子によりコードされる何れかの遺伝子産物又はそれらの何らかの組み合わせの発現のレベルを測定することを含む。核酸（例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定する適切な方法は、当技術分野で公知であり、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ））、ＲＮＡｓｅｑ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ及びノーザンブロッティングが挙げられるが限定されない。遺伝子発現を測定するための技術は、例えば遺伝子チップを使用するか若しくは使用しない遺伝子発現アッセイも含むか、又は遺伝子発現マイクロアレイは、Ｏｎｋｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｄｉａｇ １２（４）：４６１－４６８（２０１０）；及びＫｉｒｂｙ ｅｔ．ａｌ．，Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４４：２４７－２９２（２００７）に記載されている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ及びＲＮＡチップ及び遺伝子発現アッセイキット（例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ）も、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（Ｇｅｉｓｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３１７－３２５（２００８））などの会社から市販されている。タンパク質の発現レベルを決定する適切な方法は当技術分野で公知であり、免疫アッセイ（例えばウエスタンブロッティング、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学アッセイ）又はビーズに基づく多重アッセイ、例えばＤｊｏｂａ Ｓｉａｗａｙａ ＪＦ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｔ，Ｂａｂｂ Ｃ，Ｂｌａｃｋ Ｇ，Ｇｏｌａｋａｉ ＨＪ，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｅａｄ－Ｂａｓｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（７）：ｅ２５３５に記載のものを含む。系統的な同定であるプロテオミクス解析及び特定の生物学的系のタンパク質の定量は公知である。質量分析は一般的に、この目的のために使用される技術である。
代表的な態様では、本方法は、前記遺伝子によりコードされるＲＮＡに基づいて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のレベルを測定することを含む。簡潔に述べると、本方法は、試料から（例えば試料の腫瘍細胞から）ＲＮＡを抽出又は単離すること及び試料から単離されるＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを合成することを含む。或いは又はさらに、いくつかの態様では、発現レベルの測定は、試料からＲＮＡを単離し、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成させ、ｃＤＮＡを増幅し、遺伝子発現マイクロアレイに対してｃＤＮＡをハイブリダイゼーションすることを含む。従って、いくつかの態様では、発現レベルの測定は、試料からＲＮＡを単離し、ＲＮＡ－ＳｅｑによりＲＮＡを定量することを含む。代替的又はさらなる態様では、発現レベルは、免疫組織化学アッセイを介して決定される。代表的な態様では、発現レベルの測定は、ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＢＲＣＡ若しくはＣＣＮＥ１又はその遺伝子産物又はそれらの組み合わせに対する結合剤と試料を接触させることを含む。いくつかの態様では、結合剤は、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、結合剤は、ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＢＲＣＡ又はＣＣＮＥ１又はそのＲＮＡ転写産物又はその相補体に特異的な核酸プローブである。
ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＢＲＣＡ若しくはＣＣＮＥ１又はその遺伝子産物の発現レベルを対象から得られた試料から測定したら、測定された発現レベルを参照レベルと比較し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、数学的に変換し得る。代表的な例では、ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＢＲＣＡ若しくはＣＣＮＥ１又はその遺伝子産物の測定された発現レベルをセンタリングし、スケーリングする。生物学的データをセンタリングし、スケーリングする適切な技術は当技術分野で公知である。例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ．ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７：１４２（２００６）を参照のこと。
野生型ＴＰ５３、Ｒｂ１、ＣＣＮＥ１及びＢＲＣＡ遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるＲＮＡ及びタンパク質は当技術分野で公知である。それぞれの代表的な配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）に対するウェブサイトで入手可能であり、本明細書とともに提出された配列リストで提供される。
Figure 2023521802000036
代表的な実施形態では、本方法は、表Ａで列挙されないさらなる遺伝子、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を測定することを含む。代表的な実施形態では、本方法は、少なくとも１つのさらなる遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定することを含む。代表的な例では、本方法は、試料中で、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超えるさらなる遺伝子、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超えるさらなるＲＮＡ及び／又は少なくとも２、３、４、５個又はそれを超えるさらなるタンパク質の発現レベルを測定することを含む。代表的な例では、本方法は、試料中の少なくとも１０、１５、２０個又はそれを超えるさらなる遺伝子、少なくとも１０、１５、２０個又はそれを超えるさらなるＲＮＡ及び／又は少なくとも１０、１５、２０個又はそれを超えるさらなるタンパク質の発現レベルを測定することを含む。代表的な例では、本方法は、試料中の少なくとも５０、１００、２００個又はそれを超えるさらなる遺伝子、少なくとも５０、１００、２００個又はそれを超えるさらなるＲＮＡ及び／又は少なくとも５０、１００、２００個又はそれを超えるさらなるタンパク質の発現レベルを測定することを含む。代表的な例では、本方法は、表Ａで列挙される１つ以上のものに加えて、複数の異なる遺伝子、複数のＲＮＡ及び／又は複数のタンパク質の発現レベルを測定することを含む。代表的な態様では、本方法は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＢＡＲＤ１、ＢＬＭ、ＢＲＩＰ１、ＣＤＫ１２、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４Ｌ及びＲＰＡ１を含むが限定されない１つ以上の相同組み換え修復欠損（ＨＲＤ）遺伝子の発現を測定することを含む（ＤＲ Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１８；１１９：１４０１－９；ＡＬ Ｈｅｅｋｅ ｅｔ ａｌ ＪＣＯ Ｐｒｅｃｉｓ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；２：１－３）。代表的な態様では、本方法は、１つ以上のキネシン遺伝子、ＡＢＣ輸送体遺伝子、ＳＡＣ遺伝子、キネトコア遺伝子、ＥＭＴ遺伝子、ＰＡＭ５０シグネチャー（Ｂ Ｗａｌｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５；８（１）：５４）、ＣＩＮ２５／７０遺伝子シグネチャーの遺伝子（ＳＬ Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００６；３８（９）：１０４３－８）又はそれらの組み合わせの発現を測定することを含む。
アッセイ段階は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて、試料を「陽性」又は「陰性」として同定することを可能にする。本明細書中で使用される場合、試料に関連した「陽性」という用語は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つが試料中に存在することを意味する。本明細書中で使用される場合、試料に関連した「陰性」という用語は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つが試料に存在しない、例えば試料が不活性化されたＴＰ５３遺伝子を有さず、及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つが試料中に存在することを意味する。
反応性、感受性及び耐性
本開示は、薬物、例えばＫＩＦ１８Ａ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する、反応性、感受性及び／又は耐性に関する。本開示は、本明細書中で提供されるＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に感受性又は反応性があるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法を提供する。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する新生物疾患の感受性を判定すること又はＣＤＫ４／６阻害剤に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む、新生物疾患がある対象に対する処置を決定する方法が本明細書中で開示される。本開示は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性である新生物疾患がある対象を処置する方法にも関する。
本明細書中で使用される場合、「感受性」とは、新生物疾患（例えば癌、腫瘍）が薬物／化合物、例えばＫＩＦ１８Ａ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤に反応する方法を指す。代表的な態様では、「感受性」とは、「処置に対して反応性である」ことを意味し、「感受性」及び「反応性」の概念は、薬物／化合物処置に対して反応性の新生物疾患（例えば腫瘍又は癌細胞）が、その薬物に対して感受性であると言われることにおいて正の関連を示す。代表的な場合における「感受性」は、Ｐｅｌｉｋａｎ，Ｅｄｗａｒｄ，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｔｅｒｍｓ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｓ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ａｔ Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、に従って、特定の薬物用量に対して定性的に通常の方法で反応するための、他の能力と比較した集団、個体又は組織の能力として定義される。効果をもたらすのに必要な用量が少ないほど、反応系は、より感受性が高い。「感受性」は、用量効果曲線と横座標値の軸又はこれに平行な線との交点を基準にして定量的に測定又は説明され得、こうした点は、所与の効果の程度をもたらすのにまさに必要な用量に対応する。これと同様に、測定系の「感受性」は、所与の出力（効果）の程度をもたらすのに必要な最低入力（最小量）として定義される。代表的な態様では、「感受性」は、「耐性」とは反対であり、「耐性」の概念は、「感受性」と負の関連を示す。例えば、薬物処置に対して耐性のある腫瘍は、その薬物に感受性でも反応性でもないか、又はその薬物に対して最初に感受性であり、耐性獲得すると感受性でなくなり；薬物がその腫瘍又は癌細胞に関して有効な処置ではなくなる。
「反応性」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ （ＲＥＣＩＳＴ）又は他の同様の基準に従う、薬物／化合物（例えばＫＩＦ１８Ａ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤）又は他の処置（例えば放射線療法）に対する癌細胞又は腫瘍の治療反応又は反応性の程度を指す。ＲＥＣＩＳＴは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒによって共同で作成された、腫瘍及び／又は癌細胞の進行、安定化又は反応性を評価するための一連の判定基準である。ＲＥＣＩＳＴによれば、薬物（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）での処置後に比較するためのベースラインを提供するために、特定の腫瘍が、評価（例えば臨床治験）の開始時に測定される。腫瘍に対する反応評価及び評価基準は、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４５：２２８－２４７（２００９）及びＬｉｔｉｅｒｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７（１３）：１１０２－１１１０ （２０１９） ＤＯＩ：１０．１２００／ＪＣＯ．１８．０１１００で公開されている。簡潔に述べると、前出のＥｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，２００９のセクション４．３は、標的病変に対する客観的腫瘍反応を判定するために使用しようとする反応基準を以下のように教示する。
Figure 2023521802000037
理想の場合において、薬物又は他の処置の結果、耐久性のある奏効期間（ＤＯＲ）で最良総合効果としてＣＲ又はＰＲとなる。いくつかの態様でのＤＯＲが短いＳＤ又はＰＤの反応は、薬物が癌に対する効果的な処置ではないこと、又は腫瘍が処置に対する反応を停止したことを示すために用いられる。
代表的な態様では、反応性は、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）又は安定状態（ＳＤ）＞１６週間及び２４週間として最良総合効果が決定される患者の割合として定義される臨床的有用率（ＣＢＲ）の主要因であるか又はそれに基づく。任意選択的に、ＣＢＲは、最良総合効果が完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）又は安定状態（ＳＤ）＞１６週間及び２４週間として決定される患者の割合に関し、ここで患者は難治性又は再発性乳癌又は卵巣癌を有する。
当業者により認識されるように、こうした腫瘍又は癌細胞は、処置に対する感受性を失ったもの及び／又は処置に対して耐性となったものとして理解される。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性又は反応性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法が、本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイすることを含み、試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、対象がＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に感受性があるものとして同定される。代表的な実施形態では、本方法は、ＣＤＫ４／６での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性ではない場合、新生物疾患は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して感受性であるものとみなされる。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して感受性又は反応性であるものとして新生物疾患がある対象を同定する方法が提供される。代表的な態様では、本方法は、ＫＩＡ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む。様々な態様では、新生物疾患がＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して感受性ではない場合、新生物疾患はＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性であるものとみなされる。様々な態様では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置時に完全奏効を達成すると思われる者として対象を同定する。様々な態様では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置時に少なくとも部分奏効を達成すると思われる者として対象を同定する。様々な態様では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置時に安定疾患又は進行性疾患を示さないと思われる者として対象を同定する。
何らかの特定の理論に縛られるものではないが、代表的な実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性又は反応性がある新生物疾患は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する感受性又は反応性がなく、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する感受性又は反応性がある新生物疾患は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性又は反応性がない。従って、本開示は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含む、新生物疾患がある対象に対する処置を決定する方法を提供する。様々な態様では、新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、対象に対する処置はＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む処置として決定され、新生物疾患がＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して非感受性である場合、対象に対する処置はＣＤＫ４／６阻害剤を含む処置として決定される。従って、本開示は、患者を処置するためにＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含む、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性がある新生物疾患がある対象を処置する方法及び、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む、ＣＤＫ４／６阻害剤で処置されるか又は処置されたことがある対象において新生物疾患を処置する方法を提供し、任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤と同時投与される。また、本開示は、患者を処置するためにＣＤＫ４／６阻害剤を投与することを含む、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して耐性がある新生物疾患がある対象を処置する方法及び、ＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与することを含む、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置されるか又は処置されたことがある対象において新生物疾患を処置する方法を提供し、任意選択的にＣＤＫ４／６阻害剤はＫＩＦ１８Ａ阻害剤と同時投与される。ＣＤＫ４／６阻害剤及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む医薬の組み合わせが提供される。
ここで開示される方法の様々な例では、本方法は、ＣＤＫ４／６に対する感受性を判定すること又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する感受性を判定することをさらに含む。様々な例では、本方法は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性についてアッセイすることを含む。様々な態様では、感受性のアッセイは、横軸の値又はそれに平行な線と用量－効果曲線の交差する点に関して定量的に測定又は記載することを含み；この点は、ある効果の程度を生じさせるためにちょうど必要とされる用量に対応する。様々な態様では、感受性のアッセイは、核カウントアッセイ、中心体カウントアッセイ、成長アッセイ及び／又は腫瘍退縮アッセイ、例えば本明細書中に記載のものなどのうち１つ以上を行うことを含む。例えば、実施例１～４を参照されたい。
ここで開示される方法の様々な例では、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性は、（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせがないことについて対象から得られた試料をアッセイすることにより判定される。
対象においてＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を維持する方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。様々な態様では、処置に対する感受性の少なくとも５０％が維持される。任意選択的に、処置に対する感受性の、少なくとも若しくは約５０％の上昇、少なくとも若しくは約６０％の上昇、少なくとも若しくは約７０％の上昇、少なくとも若しくは約８０％の上昇、少なくとも若しくは約９０％の上昇、少なくとも若しくは約９５％の上昇又は少なくとも若しくは約９８％の上昇、少なくとも若しくは約１００％の上昇が維持される。
さらなる段階
本発明の方法に関して、本方法は、さらなる段階を含み得る。例えば、本方法は、本方法の列挙される段階のうち１つ以上を反復することを含み得る。従って、代表的な態様では、本方法は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて、対象から得られた第２の試料をアッセイすることを含み、この第２の試料は、第１の試料が対象から得られた時間と比較して、異なる時点で対象から得られる。代表的な態様では、本方法は、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎又は６ヶ月毎～１２ヶ月毎に対象から得られた試料をアッセイすることを含み、アッセイは、同じ対象から得られた異なる試料に基づく。
代表的な態様では、ここで開示される方法は、対象から試料を得ることをさらに含む。様々な態様では、試料は、採血、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、生検によるか又は畜尿により得られる。
代表的な態様では、本方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が必要と判定されたらＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することをさらに含む。対象にＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与する方法は、ここで開示される医薬の組み合わせを投与する方法の何れかと同じ又は類似のものであり得る。
様々な態様では、本方法は、紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）活性化、中心体異常、多極性紡錘体又はそれらの組み合わせについて試料をアッセイすることをさらに含む。これらの特徴／特性に対して試料をアッセイする適切な方法は本明細書中に記載されている。実施例５～１０を参照のこと。
本発明の方法の目的のために、本明細書中に記載の段階のありとあらゆる可能な組み合わせが企図される。
医薬の組み合わせ
代表的な実施形態では、本明細書中に記載のＫＩＦ１８Ａ阻害剤は単独で投与され、代替的な実施形態では、本明細書中に記載のＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、別の治療剤、例えば別のＫＩＦ１８Ａ阻害剤、しかし異なるタイプ（例えば構造）又はＫＩＦ１８Ａを阻害しない別の治療剤と組み合わせて投与される。代表的な態様では、他の治療剤は、新生物疾患を処置又は予防することを目的とする。代表的な態様では、他の治療剤はＣＤＫ４／６阻害剤である。従って、本開示は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む医薬の組み合わせを提供する。この医薬の組み合わせは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及び別の活性剤を含む。代表的な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、他の活性剤とともに処方され、２つの活性剤が同時に投与される。代表的な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は他の活性剤とともに処方されず、２つの活性剤は、個別に又は一緒に投与され得る。様々な態様では、２つの活性剤は、対象に連続的に投与される。
代表的な実施形態では、本医薬の組み合わせは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤を含む。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤とは別個に処方される。
様々な態様では、本医薬の組み合わせ又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤は、例えば酸性化剤、添加物、吸着剤、エアロゾル噴霧剤、エア・ディスプレースメント剤（ａｉｒ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）、アルカリ化剤、凝固阻止剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、消毒薬、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、皮膚軟化剤、乳化剤、エマルション安定化剤、注入剤、フィルム形成剤、調味料、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、トローチ基剤、顔料、可塑剤、光沢剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味料、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘性増加剤、水分吸収剤、水混和共溶媒、軟水化剤又は湿潤剤を含む、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とともに処方される。
様々な態様では、本医薬の組み合わせ又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与又は全身若しくは非経口投与（例えば静脈内、皮下、筋肉内投与）のために処方される。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、経口投与のために処方される。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与のために処方される。
ＣＤＫ４／６阻害剤
本明細書で使用する場合、「ＣＤＫ４／６阻害剤」という用語は、サイクリン依存性キナーゼであるＣＤＫ４及びＣＤＫ６を標的化し、これらの酵素活性、例えばキナーゼ活性を低減又は阻害する何らかの化合物又は分子を指す。代表的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６において作用して、細胞周期停止を誘発する。細胞周期の進行中、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６は、成長抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）をリン酸化のために標的化し、Ｒｂタンパク質は、リン酸化されると不活性化される。ＣＤＫ４及びＣＤＫ６がＣＤＫ４／６阻害剤によって阻害されていると、Ｒｂは、リン酸化されず（又はリン酸化が低減し）、その結果、Ｒｂは、その成長抑制機能を自由に実行できる。代表的な実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ阻害剤又は両方である。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を阻害する。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＹＰ４５０３Ａの機能を阻害する。
ＣＤＫ４／６阻害剤により提供される低減又は阻害は、１００％の又は完全な阻害若しくは抑止又は低減でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する低減又は阻害の様々な程度が存在する。この点において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６タンパク質を任意の量又はレベルまで阻害し得る。代表的な実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤によって提供される低減又は阻害は、少なくとも若しくは約１０％の低減若しくは阻害（例えば、少なくとも若しくは約２０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約３０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約４０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約５０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約６０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約７０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約８０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９０％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９５％の低減若しくは阻害、少なくとも若しくは約９８％の低減若しくは阻害）である。
代表的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造：
Figure 2023521802000038
 である。
様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩの構造を含み、且つＡ－Ｂの構造を更に含み、ここで、Ａは、二環式構造を含み、Ｂは、単環式構造を含む。代表的な態様では、Ａ－Ｂは、構造ＩＩＩ又は構造ＩＶ又は構造Ｖ：
Figure 2023521802000039
 の構造を含む。
代表的な態様では、構造ＩＩＩ又はＩＶのＢは、シクロペンタンである。代表的な態様では、構造ＶのＢは、ピリミジンを含む。
様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、
Figure 2023521802000040
 又はその薬学的に許容可能なその塩の構造を含む。
様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、
Figure 2023521802000041
 又はその薬学的に許容可能なその塩の構造を含む。
様々な例では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、
Figure 2023521802000042
 又はその薬学的に許容可能なその塩の構造を含む。
処置の方法
さらに対象において新生物疾患を処置する方法が本明細書中で提供される。
本明細書において使用される場合、「処置」という用語並びにそれに関連する語は、１００％の処置又は完全な処置を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する処置には様々な程度がある。これに関して、本開示の新生物疾患を処置する方法は、何れかの量又は何れかのレベルの処置を提供し得る。さらに、本開示の方法によって提供される処置は、処置される新生物疾患の１つ以上の状態又は症状又は兆候の処置を含み得る。また、本開示の方法によって提供される処置は、新生物疾患の進行を遅らせることを包含し得る。例えば、本方法は、新生物疾患に対するＴ細胞活性若しくは免疫反応を増強すること、腫瘍若しくは癌の成長若しくは腫瘍量を低減すること、腫瘍細胞の転移を低減すること、腫瘍若しくは癌細胞の細胞死を増加させること又は腫瘍退縮を向上させることなどにより、新生物疾患を処置し得る。上記に従い、対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低下させるか、又は腫瘍退縮を向上させる方法が本明細書で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、任意選択的にＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。代表的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ４／６で処置されるか又は処置されたことがあり、本方法は、対象にＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含む。「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、療法（ｔｈｅｒａｐｙ）を指していて、治療的療法、予防療法及び予防的療法が含まれるが、これらに限定されない。予防処置は、一般的に、個体において、障害全体の発症を防止すること、又は障害の臨床的に明白となる前の段階の発症を遅延させること、の何れかを構成する。
様々な態様では、本方法は、新生物疾患の発症又は再発を少なくとも１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年又はそれを超えて遅らせる目的で処置する。様々な態様では、本方法は、対象の生存を上昇させる目的で処置する。代表的な態様では、本開示の方法は、転移の発生又は発症を遅延させる目的で処置を提供する。様々な例では、本方法は、新規転移の発生又は発症を遅延させる目的で処置を提供する。従って、癌を患う対象における転移の発生又は発症を遅延させる方法が本明細書で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、任意選択的にＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。
代表的な例では、提供される処置は、臨床治験の観点から説明されるか、又は臨床治験から得られたデータによって裏付けられ得、治験のエンドポイントは、無進行生存期間（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）又はＥａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ （ＥＣＯＧ）の一般状態の悪化までの時間である。様々な態様では、本開示は、新生物疾患を患う対象における、ＰＦＳ、ＯＳ又はＥＣＯＧ一般状態の悪化までの時間を延長させる方法を提供する。代表的な実施形態では、新生物疾患は、ＣＤＫ４／６に対して耐性を有するか、又はそれに対する感受性が低下しており、本方法は、任意選択的にＣＤＫ４／６と組み合わせてＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。本明細書中で使用する場合、「無進行生存期間」又は「ＰＦＳ」という用語は、処置された患者が癌の悪化なく経験する時間（悪化を測定するために用いられているどのような指標によっても）を意味する。「全生存」という用語は、患者が処置後にどの程度の期間生存したかを意味する。ＥＣＯＧ一般状態は、患者の疾患を評価し（例えば、どのように疾患が進行／退縮するか、どのように疾患が患者の日常的生活能力に影響を及ぼすか）、適切な処置及び予後を決定するために医師及び研究者によって用いられるスケールに従うグレード又はスコアである。ＥＣＯＧ一般状態は、以下の基準に従って決定される：
Figure 2023521802000043
代表的な実施形態では、新生物疾患に対して対象を処置する方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含み、この対象は、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含み、この方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。
代表的な実施形態では、新生物疾患がある対象を処置する方法は、（Ａ）（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイし、（Ｂ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である対象にＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含む。
代表的な実施形態では、新生物疾患は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性であり、新生物疾患などがある対象を処置する方法は、患者を処置するためにＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含む。
代表的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ４／６阻害剤で処置されるか又は処置されたことがあり、このような対象を処置する方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含み、任意選択的にＫＩＦ１８Ａ阻害剤はＣＤＫ４／６阻害剤と同時投与される。
代表的な実施形態では、対象において新生物疾患を処置する方法は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む本明細書で開示される医薬の組み合わせを対象に投与することを含む。代表的な例では、本医薬の組み合わせは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤を含む。
様々な態様では、癌は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又は過剰発現ＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む。
代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、週に３回、週に２回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、２週毎、３週毎、毎月又は２ヶ月に１回対象に投与される。様々な例では、ＣＤＫ阻害剤は、１日１回対象に投与される。任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は１日１回経口投与される。
腫瘍がある対象において腫瘍退縮を誘導するか又は向上させる方法がさらに本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、本方法は、腫瘍退縮を誘導するか又は向上させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。本開示は、対象において腫瘍成長又は癌の成長を低減させる方法も提供する。代表的な実施形態では、本方法は、腫瘍又は癌の成長を低減させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。対象における腫瘍細胞又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させる方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態における方法は、腫瘍細胞又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含む。様々な態様では、新生物疾患は、癌、任意選択的に乳癌、卵巣癌又は前立腺癌である。様々な例では、新生物疾患は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳癌又は高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である。代表的な態様では、新生物疾患は、子宮内膜癌、任意選択的に漿液性子宮内膜癌である。任意選択的に、癌は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は、不活性化されたＲｂ遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は過剰発現されたＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む。いくつかの態様では、癌は、突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性である細胞を含む。様々な例では、癌は、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、発現抑制されたＢＲＣＡ１遺伝子、欠失Ｒｂ１遺伝子又はそれらの組み合わせについて陽性である細胞を含む。任意選択的に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、経口投与のために、任意選択的に１日１回投与される。代表的な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量は、対照と比較して、少なくとも５０％又は少なくとも７５％（例えば少なくとも８０％又は８５％又は少なくとも９０％又は９５％）の腫瘍退縮を効果的に誘導する。
代表的な実施形態では、本開示の方法は有利に、新生物疾患の細胞に非常に特異的である。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、対象の正常な体細胞への毒性が僅かであるか又は毒性なく、効果的に新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させるか、腫瘍又は癌の成長を低減させるか、又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導するか若しくは増加させる。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、対象の正常な体細胞の増殖の実質的な低下なく、新生物疾患を処置する、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する感受性を維持する、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させる、腫瘍若しくは癌の成長を低減させる、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導若しくは増加させるために有効な量で投与される。代表的な例では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、正常な体細胞のアポトーシスの実質的な増加なく、新生物疾患を処置する、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する感受性を維持する、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させる、腫瘍若しくは癌の成長を低減させる、腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導若しくは増加させるために有効な量で投与される。本明細書中で使用される場合、「正常」という用語は、細胞に関して、新生物ではない、及び／又は病的ではない細胞を意味する。様々な態様では、正常な体細胞はヒト骨髄単核細胞である。様々な例では、正常な体細胞は、ＴＰ５３ＭＵＴとして遺伝学的に特徴付けされないか又はＴＰ５３ＷＴとして遺伝学的に特徴付けられる。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、正常な体細胞のアポトーシスの２５％を超えない上昇を引き起こす。様々な態様では、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、対象における正常な体細胞の増殖の２５％を超えない低下を引き起こす。任意選択的に、正常な体細胞のアポトーシスの増加又は正常な体細胞の増殖の低下は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満である。正常な体細胞の増殖及び／又は正常な体細胞のアポトーシスを測定する方法は本明細書中に記載されている。
新生物疾患
本明細書中で使用される場合、「新生物疾患」という用語は、腫瘍の成長を引き起こす何らかの状態を指す。代表的な態様では、腫瘍は良性腫瘍である。代表的な態様では、腫瘍は悪性腫瘍である。様々な態様では、新生物疾患は癌である。様々な態様での癌は、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳腫瘍、乳癌、肛門、肛門管若しくは肛門直腸の癌、眼球の癌、肝内胆管癌、関節の癌、頸部、胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻、鼻腔若しくは中耳の癌、口腔癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管のカルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌及び膀胱癌である。特定の態様では、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、泌尿器膀胱癌、食道癌、膵臓癌、消化管癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、膀胱癌、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は気管支肺胞上皮癌である。特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎臓癌、トリプルネガティブ乳癌又は胃癌である。代表的な態様では、対象は、腫瘍（例えば固形腫瘍、血液悪性腫瘍又はリンパ性悪性腫瘍）を有し、本医薬組成物は、対象において腫瘍を処置するのに有効な量で対象に投与される。他の代表的な態様では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、前立腺癌、胃癌、リンパ腫又は白血病であり、本医薬組成物は、対象において腫瘍を処置するのに有効な量で対象に投与される。
「癌」又は「癌性」という用語は、本明細書で使用する場合、典型的には、無制御の細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的条件を指すか、又は記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病が挙げられるが限定されない。こうした癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌及び頭頸部癌、卵巣癌及び子宮内膜癌が挙げられる。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、如何なる疾患の一具体的形態にも限定されないが、本発明の方法は、無制御のレベルのＫＩＦ１８Ａを伴うこと、又は適切な染色体分離及び哺乳動物における生存に関してＫＩＦ１８Ａに依存することが判明している癌に特に効果的であるものと思われる。
様々な態様では、癌は転移性であるか、腫瘍は切除不能であるか、又はそれらの組み合わせである。様々な態様では、新生物疾患は、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子の遺伝子コピー数増加又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である。様々な態様では、新生物疾患は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳癌（例えば基底様間葉系）又は高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である。様々な態様では、新生物疾患は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性であるか又は感受性がない（非感受性である）。様々な態様では、新生物疾患は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性であるか又は感受性がなく（非感受性である）、Ｒｂ１プロフィシェントである（対Ｒｂ１欠失）。様々な態様では、新生物疾患は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して耐性がある。様々な態様では、新生物疾患は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して耐性があり、Ｒｂ１欠失である（対Ｒｂ１プロフィシェント）。
代表的な態様では、新生物疾患は、乳癌、任意選択的にルミナル乳癌又はＴＮＢＣである。様々な態様では、乳癌は、（ａ）転移性又は局所的再発性のエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性（例えば免疫組織化学［ＩＨＣ］により＜１％が組織学的に又は細胞学的確認されており、（ｂ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（例えば＜１％ＩＨＣ）であり、（ｃ）ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）陰性（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ定義に従い、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション［ＦＩＳＨ］陰性、ＩＨＣにより０若しくは１＋又はＩＨＣ２＋及びＦＩＳＨ陰性の何れか）である。代表的な態様では、新生物疾患は再発し、及び／又は転移性の設定において少なくとも１つの一連の全身的化学療法に対して難治性であるか、又は新生物疾患に対する臨床的な有益性をもたらすことが知られている既存の治療に不耐性である。代表的な例では、癌は、免疫チェックポイント阻害剤で処置されたことがある。様々な例では、乳癌は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性及び／又はＨＥＲ２陰性である。様々な態様では、乳癌は、進行性乳癌及び／又は転移性乳癌である。様々な態様では、乳癌は、内分泌療法後に進行したＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌である。いくつかの態様では、乳癌は、以前に、癌が拡散／転移した後に内分泌療法及び化学療法で処置された、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）／ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２－）の進行性又は転移性乳癌である。様々な例では、癌は、ホルモン療法（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（化学名：アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（化学名：エキセメスタン）及びＦｅｍａｒａ（化学名：レトロゾール）で処置されたことがないＨＲ＋／ＨＥＲ２－の進行性又は転移性乳癌である。様々な例では、乳癌は、ホルモン療法で処置された後に成長したＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌である。様々な例では、乳癌は、表２のＨＥＲ２－陽性乳癌細胞と同様であるものを含むが限定されないＨＥＲ２－陽性乳癌である。任意選択的に、乳癌は、ＨＥＲ２－陽性、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性乳癌である。様々な態様では、新生物疾患は、卵巣癌、任意選択的に高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である。任意選択的に、卵巣癌は、白金耐性ＨＧＳＯＣである。代表的な態様では、卵巣癌は、原発性腹膜癌又は卵管癌である。様々な態様では、新生物疾患は、白金含有レジメン中又はその６ヶ月以内の進行として定義される白金耐性がある、転移性又は切除不能ＨＧＳＯＣである。様々な態様では、卵巣癌は、白金耐性再発治療で処置されたことがあるか又は処置されている。様々な態様では、新生物疾患は、漿液性子宮内膜癌である。任意選択的に、新生物疾患は、転移性又は再発性の漿液性子宮内膜癌である。様々な例では、子宮内膜癌は再発性であり、及び／又は転移性／再発の設定での少なくとも１ラインの全身療法に対して難治性であるか、又は新生物疾患に対して臨床的有益性を提供することが知られている既存の治療に不耐性である。様々な例では、新生物疾患は、切除不能であり、再発性及び／又は少なくとも１ラインの全身化学療法に対して難治性であるか又は不耐性である、進行性又は転移性の固形腫瘍である。任意選択的に、進行性又は転移性固形腫瘍はＴＰ５３ＭＵＴである。
様々な例では、新生物疾患は、１つ以上の薬物での処置に対して耐性がある。様々な態様では、新生物疾患は、１つ以上の薬物での処置に対する感受性低下を示す。任意選択的に、新生物疾患は、多剤耐性の新生物疾患である。代表的な例では、（例えば新生物疾患の）腫瘍又は癌細胞は、多剤耐性の腫瘍又は癌細胞であり、及び／又は多剤耐性１（ＭＤＲ－１）遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現上昇を示す。代表的な例では、（例えば新生物疾患の）腫瘍又は癌細胞は、ＭＤＲ－１遺伝子によりコードされるＰ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の発現上昇を示す。様々な態様では、新生物疾患は、抗有糸分裂阻害剤又はアントラサイクリン抗生物質、任意選択的にパクリタキセル又はドキソルビシンでの処置に対する感受性低下又は耐性を示す。様々な態様では、腫瘍又は癌細胞（例えば新生物疾患の）は、チューブリン遺伝子における突然変異、チューブリンの過剰発現、チューブリン増幅及び／又はアイソタイプスイッチしたチューブリン発現を示す。様々な態様では、α－又はβ－チューブリンにおける突然変異は、微小管上の正しい場所へのタキサンの結合を阻害し、それによりタキサンが無効になる。代表的な態様では、新生物疾患は、白金剤アントラサイクリン、標的化された治療（例えばＴＫＩ、ＰＡＲＰ阻害剤）の何れか１つ以上での処置に対する感受性低下又は耐性を示す。
様々な態様では、新生物疾患は、１つ以上の全ゲノム重複又は全ゲノム倍加（ＷＧＤ）事象を含む癌である。癌に関連するＷＧＤは、Ｌｅｎｓ ａｎｄ Ｈｅｍｄｅｍａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １９：３２－４５（２０１９）；Ｇａｎｅｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１７，１５７－１６２及びＤａｖｏｌｉ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７，５８５－６１０で考察される。
対象
本開示の代表的な実施形態では、対象は、マウス及びハムスターなどの齧歯目の哺乳動物及びウサギなどのウサギ目の哺乳動物、ネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物、ウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物又はウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物が挙げられるが限定されない哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）目（長尾小型のサル（ｍｏｎｋｅｙ））又は真猿亜目（ヒト及び短尾大型のサル（ａｐｅ））の哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。様々な態様では、対象は、新生物疾患、例えば本明細書中に記載のものの何れか１つを有する。「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」又は「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む、何れの「患者」、「被験者」又は「哺乳動物」も指す。本発明の一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
代表的な態様では、対象は、転移癌、切除不可能な腫瘍又はこれらの組み合わせを含む癌を有する。様々な態様では、癌又は腫瘍は、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する耐性又は感受性低下を示すか又は示したことがある。代表的な態様では、対象は、乳癌、任意選択的にルミナル乳癌又はトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有する。様々な態様では、乳癌は、（ａ）組織学的に又は細胞学的に確認されている転移性又は局所的に再発性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性（例えば免疫組織化学［ＩＨＣ］により＜１％）、（ｂ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（例えば＜１％ＩＨＣ）及び（ｃ）ヒト上皮増殖細胞受容体２（Ｈｅｒ２）陰性（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ定義に従い、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション［ＦＩＳＨ］陰性、ＩＨＣにより０若しくは１＋又はＩＨＣ２＋及びＦＩＳＨ陰性の何れか）になっている。代表的な態様では、対象は、再発性であり、及び／又は転移性の設定において少なくとも１ラインの全身的な化学療法に対して難治性又は、それらの状態に対して臨床的な有益性を提供することが知られている既存の治療に不耐性である。代表的な例では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤に以前に曝露されている。様々な例では、乳癌は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性及び／又はＨＥＲ２陰性である。様々な態様では、乳癌は、進行性乳癌及び／又は転移性乳癌である。様々な態様では、対象は、内分泌療法を受けた後に進行したＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。いくつかの態様では、対象は、過去に癌が拡散／転移した後に内分泌療法及び化学療法で治療された、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）／ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２－）進行性又は転移性乳癌の患者である。様々な例では、対象は、閉経後の女性において過去にホルモン療法（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（化学名：アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（化学名：エキセメスタン）及びＦｅｍａｒａ（化学名：レトロゾール）で処置されたことがないＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。様々な例では、対象は、ホルモン療法での処置後に成長したＨＲ＋／ＨＥＲ２－の進行性又は転移性乳癌の閉経後の女性である。特定の態様では、対象は、ＨＲ＋、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性の進行性又は転移性乳癌を患う閉経前／閉経期又は閉経後の女性であり、内分泌に基づく治療を受けたことがある。任意選択的に、対象は、ＨＲ＋、ＨＥＲ２－の進行性又は転移性乳癌の閉経後の女性であり、初回の内分泌に基づく治療を受けたか、又は内分泌療法での処置時に疾患進行がある。様々な態様では、対象は、卵巣癌、任意選択的に高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）を有する。任意選択的に、卵巣癌は、白金耐性のＨＧＳＯＣである。代表的な態様では、対象は、原発性の腹膜癌及び／又は卵管癌を有する。様々な態様では、対象は、白金含有レジメンの６ヶ月の間又はその６ヶ月以内に進行性として定義される白金耐性がある、転移性又は切除不能ＨＧＳＯＣの組織学的に又は細胞学的に確定された診断を有する。様々な態様では、対象は、卵巣癌を有し、白金耐性再発治療を受けたことがあるか又は受けている。様々な態様では、対象は漿液性子宮内膜癌を有する。任意選択的に、対象は、転移性又は再発性の漿液性子宮内膜癌の組織学的に又は細胞学的に確定された診断を有する。様々な例では、対象は、再発性であるか及び／又は転移性／再発性の状況において少なくとも１ラインの全身療法に対して難治性であるか、又はそれらの状態に対して臨床的な有益性をもたらすことが知られている既存の治療に不耐性である。様々な例では、対象は、切除不能であり、再発性であり、及び／又は少なくとも１ラインの全身療法に対して難治性であるか又は不耐性である、進行した又は転移性の固形腫瘍を有する。任意選択的に、進行した又は転移性の固形腫瘍はＴＰ５３ＭＵＴである。
代表的な態様では、対象は、次の何れも有さない：（ａ）活動性の脳転移、（ｂ）原発性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、血液悪性腫瘍又はリンパ腫、（ｃ）制御されない胸水、心膜液貯留又は腹水、（ｄ）経口投薬が不可能になる胃腸（ＧＩ）管疾患。
試料
本明細書中で開示される方法に関しては、試料は、対象から得られた、血液、血漿、血清、リンパ液、母乳、唾液、粘液、精液、膣分泌物、細胞抽出物、炎症性の液体、脳脊髄液、糞便、硝子体液、骨髄吸引液、腹膜腔液（例えば悪性腹水）又は尿を含むが限定されない体液を含む。代表的な態様では、試料は、前述の試料のうち少なくとも２つの複合パネルである。いくつかの態様では、試料は、血液試料、血漿試料、血清試料及び尿試料のうち少なくとも２つの複合パネルである。代表的な態様では、試料は、血液又はその分画（例えば、血漿、血清、白血球フェレーシスを介して得られる分画）を含む。様々な態様では、試料は、癌細胞、腫瘍細胞、非腫瘍細胞、血液、血液細胞又は血漿を含む。代表的な例では、試料は、細胞不含ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。代表的な例では、試料は、新生物疾患（例えば癌）の生殖系列細胞を含む。代表的な例では、試料は、新生物疾患（例えば癌）の体細胞を含む。
対照
本明細書中に記載の方法では、決定されるレベルは、対照レベル若しくはカットオフレベル若しくは閾値レベルと同じであり得るか、又は対照レベル若しくはカットオフレベル若しくは閾値レベルと比較して上昇若しくは低下し得る。いくつかの態様では、対照対象は、同じ種、性別、人種、年齢群、喫煙状況、ＢＭＩ、最新の治療レジメン状態、病歴又はそれらの組み合わせの一致した対照であるが、対照が問題となっている疾患に罹患していないか又は疾患に対するリスクがないということにおいて診断されている対象とは異なる。
対照レベルと比較して、決定されるレベルはレベル上昇であり得る。本明細書中で使用される場合、「上昇する」という用語は、レベル（例えば発現レベル、生物学的活性レベル）に関して、対照レベルを上回る何れかの％上昇を指す。レベル上昇は、対照レベルと比較して、少なくとも若しくは約５％の上昇、少なくとも若しくは約１０％の上昇、少なくとも若しくは約１５％の上昇、少なくとも若しくは約２０％の上昇、少なくとも若しくは約２５％の上昇、少なくとも若しくは約３０％の上昇、少なくとも若しくは約３５％の上昇、少なくとも若しくは約４０％の上昇、少なくとも若しくは約４５％の上昇、少なくとも若しくは約５０％の上昇、少なくとも若しくは約５５％の上昇、少なくとも若しくは約６０％の上昇、少なくとも若しくは約６５％の上昇、少なくとも若しくは約７０％の上昇、少なくとも若しくは約７５％の上昇、少なくとも若しくは約８０％の上昇、少なくとも若しくは約８５％の上昇、少なくとも若しくは約９０％の上昇、少なくとも若しくは約９５％の上昇であり得る。
対照レベルと比較して、決定されるレベルはレベル低下であり得る。本明細書中で使用される場合、「低下する」という用語は、レベル（例えば発現レベル、生物学的活性レベル）に関して、対照レベルを下回る何れかの％の低下を指す。レベル低下は、対照レベルと比較して、少なくとも若しくは約５％の低下、少なくとも若しくは約１０％の低下、少なくとも若しくは約１５％の低下、少なくとも若しくは約２０％の低下、少なくとも若しくは約２５％の低下、少なくとも若しくは約３０％の低下、少なくとも若しくは約３５％の低下、少なくとも若しくは約４０％の低下、少なくとも若しくは約４５％の低下、少なくとも若しくは約５０％の低下、少なくとも若しくは約５５％の低下、少なくとも若しくは約６０％の低下、少なくとも若しくは約６５％の低下、少なくとも若しくは約７０％の低下、少なくとも若しくは約７５％の低下、少なくとも若しくは約８０％の低下、少なくとも若しくは約８５％の低下、少なくとも若しくは約９０％の低下、少なくとも若しくは約９５％の低下であり得る。
代表的な実施形態
本発明の代表的な実施形態は次のことを含むが限定されない：
Ｅ１．新生物疾患を有する対象に対する処置を決定する方法であって、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイすることを含むか、それから基本的になるか又はそれらからなり、前記試料が不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、前記対象に対して決定された処置が、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ２．新生物疾患を有する対象を処置する方法であって、（Ａ）（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイすること及び（Ｂ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である対象に対してＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、任意選択的に、前記対象から試料を得ることをさらに含む、方法。
Ｅ３．新生物疾患を有する対象を処置する方法であって、前記対象が、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含み、前記方法が、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ４．ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であるものとして新生物疾患を有する対象を同定する方法であって、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて対象から得られた試料をアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、前記試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、前記対象がＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に感受性があるものとして同定される、方法。
Ｅ５．不活性化されたＴＰ５３遺伝子が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＴＰ５３プロモーターを含むか、（ｉｉ）ウイルスタンパク質によって、又はＭＤＭ２遺伝子の増幅を介して不活性化されるか、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせである、実施形態Ｅ１～Ｅ４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６．前記ウイルスタンパク質がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質である、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．不活性化されたＲｂ１遺伝子が、（ｉ）Ｒｂ１遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＲｂ１プロモーターを含むか、（ｉｉ）ウイルスタンパク質によって不活性化されるか、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせである、実施形態Ｅ１～Ｅ６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８．前記ウイルスタンパク質がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質である、実施形態Ｅ７に記載の方法。
Ｅ９．前記ＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現が、ＦＢＸｗ７遺伝子における突然変異により引き起こされる、実施形態Ｅ１～Ｅ８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０．前記不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子が、（ｉ）ＢＲＣＡ遺伝子突然変異、欠失、短縮化及び／又はエピジェネックにサイレンシングされたＢＲＣＡプロモーターを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１．前記ＢＲＣＡ遺伝子がＢＲＣＡ１遺伝子である、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１２．前記ＢＲＣＡ遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子である、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１３．前記試料の細胞のＣＤＫ４／６阻害剤への感受性を判定すること、任意選択的にＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性についてアッセイすることをさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１４．前記アッセイする段階が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現又は不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子の存在を検出するための細胞遺伝学的方法及び／又は分子的方法を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１５．前記アッセイする段階が、直接シーケンシング、ＤＮＡハイブリダイゼーション及び／又は制限酵素消化を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１６．前記細胞遺伝学方法が、核型分析、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｅ１４に記載の方法。
Ｅ１７．前記分子的方法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅抵抗性突然変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチの化学切断（ＣＣＭ）、タンパク質短縮化試験（ＰＴＴ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｅ１４に記載の方法。
Ｅ１８．前記ＰＣＲが、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲである、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．前記アッセイする段階が、ＴＰ５３遺伝子、Ｒｂ１遺伝子、ＣＣＮＥ１遺伝子及び／又はＢＲＣＡ遺伝子によりコードされるＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルをアッセイすることを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ２０．新生物疾患を有する対象に対する処置を決定する方法であって、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する前記新生物疾患の感受性を判定することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、前記新生物疾患が前記ＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象に対する処置がＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む処置として決定される、方法。
Ｅ２１．新生物疾患を有する対象に対する処置を決定する方法であって、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する前記新生物疾患の感受性を判定することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、前記新生物疾患が前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象に対する処置がＣＤＫ４／６阻害剤を含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる処置として決定される、方法。
Ｅ２２．ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して耐性がある新生物疾患を有する対象を処置する方法であって、前記患者を処置するために、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ２３．ＣＤＫ４／６阻害剤で処置されるか又は処置されたことがある対象において新生物疾患を処置する方法であって、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、任意選択的に前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤がＣＤＫ４／６阻害剤と同時投与される、方法。
Ｅ２４．対象においてＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を維持する方法であって、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ２５．ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして癌を有する対象を同定する方法であって、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を判定することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなり、試料の癌細胞がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象がＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性であるものとして同定される、方法。
Ｅ２６．ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性が、（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせがないことについて対象から得られた試料をアッセイすることにより判定される、実施形態Ｅ２０～Ｅ２５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ２７．前記試料が、癌細胞、腫瘍細胞、非腫瘍細胞、血液、血液細胞又は血漿を含み、任意選択的に前記試料が生殖系列癌細胞又は体細胞癌細胞を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ２８．前記試料が細胞不含（ｃｆＤＮＡ）を含む、実施形態Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２９．ＣＤＫ４／６阻害剤及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、医薬の組み合わせ。
Ｅ３０．前記ＣＤＫ４／６阻害剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ及び／又はアベマシクリブである、実施形態Ｅ２０～Ｅ２９の何れか１つに記載の方法又は医薬の組み合わせ。
Ｅ３１．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及び前記ＣＤＫ４／６阻害剤が前記対象に個別に投与される、実施形態Ｅ２３、Ｅ２７、Ｅ２８及びＥ３０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ３２．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が処方され、及び／又は前記ＣＤＫ４／６阻害剤から個別にパッケージングされる、実施形態Ｅ２３、Ｅ２７、Ｅ２８、Ｅ３０及びＥ３１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ３３．前記新生物疾患が癌であり、任意選択的に乳癌である、実施形態Ｅ１～Ｅ３２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ３４．前記癌が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は過剰発現されたＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む、実施形態Ｅ３３に記載の方法。
Ｅ３５．前記新生物疾患が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳癌又は高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である、実施形態Ｅ１～Ｅ３４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ３６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が経口投与のために、任意選択的に１日１回投与される、実施形態Ｅ１～Ｅ３５の何れか１つに記載の方法又は医薬の組み合わせ。
Ｅ３７．新生物疾患を有する対象を処置する方法であって、前記新生物疾患を処置するために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ３８．腫瘍がある対象において腫瘍退縮を誘導するか又は向上させる方法であって、腫瘍退縮を誘導するか又は向上させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ３９．腫瘍がある対象において腫瘍又は癌の成長を低減させる方法であって、腫瘍又は癌の成長を低減させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ４０．対象において腫瘍又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させる方法であって、腫瘍又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させるために有効な量でＫＩＦ１８Ａ阻害剤を前記対象に投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ４１．前記新生物疾患が、癌、任意選択的に乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌又は前立腺癌である、実施形態Ｅ１～Ｅ４０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ４２．前記新生物疾患が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳癌又は高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）である、実施形態Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４３．前記新生物疾患がＴＮＢＣである、実施形態Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４４．前記新生物疾患が非ルミナル乳癌である、実施形態Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４５．前記新生物疾患がＨＧＳＯＣである、実施形態Ｅ４２に記載の方法。
Ｅ４６．前記新生物疾患が、子宮内膜癌、任意選択的に漿液性子宮内膜癌である、実施形態Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４７．前記癌が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性であり、及び／又は、不活性化されたＲｂ遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は過剰発現されたＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む、実施形態Ｅ４１～Ｅ４６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ４８．前記癌が、突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性である細胞を含む、実施形態Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ４９．前記癌が、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、発現抑制されたＢＲＣＡ１遺伝子、欠失Ｒｂ１遺伝子又はそれらの組み合わせについて陽性である細胞を含む、実施形態Ｅ４７又はＥ４８に記載の方法。
Ｅ５０．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、経口投与のために、任意選択的に１日１回投与される、実施形態Ｅ１～Ｅ４９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５１．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量が、対照と比較して少なくとも５０％の腫瘍退縮を誘導するのに有効である、実施形態Ｅ１～Ｅ５０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５２．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量が、対照と比較して少なくとも７５％の腫瘍退縮を誘導するのに有効である、実施形態Ｅ１～Ｅ５１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５３．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量が、対照と比較して少なくとも８０％又は８５％の腫瘍退縮を誘導するのに有効である、実施形態Ｅ１～Ｅ５２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５４．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の量が、対照と比較して少なくとも９０％又は９５％の腫瘍退縮を誘導するのに有効である、実施形態Ｅ１～Ｅ５３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５５．実施形態Ｅ１～Ｅ５４の何れか１つに記載の方法であって、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2023521802000044
 又は何れかの薬学的に許容可能なその塩（式中：
Ｘ１は、Ｎ又は－ＣＲ６であり、
Ｘ２は、Ｎ又は－ＣＲ５であり；
Ｘ３は、Ｎ又は－ＣＲ３であり；
Ｘ４は、Ｎ又は－ＣＲ９であり；
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち０、１又は２個がＮであり；
Ｒ１は、－ＣＮ又は基－Ｚ－Ｒ１２であり、式中、Ｚは－Ｃ０～４アルク－、－ＮＲ１１－、－ＮＲ１１ＳＯ２－、－ＳＯ２ＮＲ１１－、－ＮＲ１１－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－ＳＯ２－、Ｃ０～４アルク－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１１－、－Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）－又はＮＲ１１（Ｃ＝Ｏ）であるか；又は
前記基－Ｚ－Ｒ１２は、－Ｎ＝Ｓ（＝Ｏ）－（Ｒ１２）２であり、ここで、２個のＲ１２対は、或いは、それらのそれぞれに連結される硫黄原子と組み合わさって、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する、飽和若しくは部分飽和の３、４、５又は６員の単環式環を形成し得；
Ｒ２は、ハロ又は基－Ｙ－Ｒ１３であり、式中Ｙは－Ｃ０～４アルク－、－Ｎ（Ｃ０～１アルク）－Ｃ０～４アルク－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ（Ｃ１～４アルク）、－Ｏ－Ｃ０～４アルク－、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）２、－ＳＯ２ＮＲ１３又は－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－であり、
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、Ｒ４ａ又はＲ４ｂであり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ６は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－Ｏ－Ｃ１～８アルク又は－Ｏ－Ｒ６ａであり、式中、Ｒ６ａは、０、１、２又は３個のＮ原子、並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する飽和又は部分飽和の３、４、５又は６員単環式環であり、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８ａ又は－Ｏ－Ｒ８ｂであり、
Ｒ９は、Ｈ、ハロ、Ｃ１～８アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒｘは、次のものからなる群から選択され、
Figure 2023521802000045
 Ｒ１０ａ、Ｒ１０ｂ、Ｒ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊのそれぞれが、Ｈ、ハロ、Ｒ１０ｋ又はＲ１０ｌであるか；
又は或いは、Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対、Ｒ１０ｃ及びＲ１０ｄの対、Ｒ１０ｅ及びＲ１０ｆの対、Ｒ１０ｇ及びＲ１０ｈの対又はＲ１０ｉ及びＲ１０ｊの対のそれぞれは、独立して、これらのそれぞれに連結された炭素原子と組み合わさって、前記Ｒｘ環に対するスピロである飽和又は部分飽和の３、４、５、６員単環式環を形成し得、前記３、４、５、６員単環式環は、０、１、２又は３個のＮ原子、並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有し、さらに、前記３、４、５、６員単環式環は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－ＮＲａＲａ又はオキソから選択される０、１、２又は３個の基によって置換され；
Ｒｙは、Ｈ、Ｃ１～４アルク又はＣ１～４ハロアルクであり；
Ｒ１１は、Ｈ、Ｒ１１ａ又はＲ１１ｂであり、
Ｒ１２は、Ｈ、Ｒ１２ａ又はＲ１２ｂであり；
Ｒ１３は、Ｒ１３ａ又はＲ１３ｂであり；
Ｒ４ａ、Ｒ８ａ、Ｒ１０ｋ、Ｒ１１ａ、Ｒ１２ａ及びＲ１３ａは、独立して、各例において、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する飽和、部分飽和又は不飽和の３－、４－、５－、６－又は７員単環式環又は４－、５－、６－、７－、８－、９－、１０－、１１－又は１２－員二環式環からなる群から選択され、これは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＯＲａ、－ＳＲａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ－ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｒ１４及びオキソから選択される０、１、２又は３個の基により置換され；
Ｒ４ｂ、Ｒ８ｂ、Ｒ１０ｌ、Ｒ１１ｂ、Ｒ１２ｂ及びＲ１３ｂは、独立して、各例において、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク又はＣＮから選択される０、１、２、３、４又は５個の基によって置換されるＣ１～６アルクからなる群から選択され、
Ｒ１４は、独立して、各例において、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０又は１個の原子を含有する飽和、部分飽和若しくは不飽和の３、４、５、６若しくは７員単環式環又は４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２員二環式環からなる群から選択され、これは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１～６アルク、Ｃ１～４ハロアルク、－ＯＲａ、－ＯＣ１～４ハロアルク、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＯＣ２～６アルクＯＲａ、－ＳＲａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、－Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＮＲａＲａ、－ＮＲａＣ２～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＯＲａ、－Ｃ１～６アルクＮ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、－Ｃ１～６アルクＣ（＝Ｏ）ＯＲａ及びオキソから選択される、０、１、２又は３個の基によって置換され；
Ｒａは、独立して、各例において、Ｈ又はＲｂであり；
Ｒｂは、独立して、各例において、Ｃ１～６アルク、フェニル又はベンジルであり、ここでＣ１～６アルクは、ハロ、－ＯＨ、－ＯＣ１～４アルク、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１～４アルク、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１～４アルク又は－Ｎ（Ｃ１～４アルク）Ｃ１～４アルクから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；フェニル又はベンジルは、ハロ、Ｃ１～４アルク、Ｃ１～３ハロアルク、－ＯＨ、－ＯＣ１～４アルク、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１～４アルク、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１～４アルク又は－Ｎ（Ｃ１～４アルク）Ｃ１～４アルクから選択される０、１、２又は３個の置換基によって置換される）
である、方法。
Ｅ５６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち０個がＮである、実施形態Ｅ１～Ｅ５５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５７．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち１個がＮである、実施形態Ｅ１～Ｅ５６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５８．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち２個がＮである、実施形態Ｅ１～Ｅ５７の何れか１つに記載の方法。
Ｅ５９．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、Ｘ１及びＸ３のそれぞれがＮであり；Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ４が－ＣＲ９であり；式（Ｉａ）：
Figure 2023521802000046
 を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ５８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６０．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１が－ＣＲ６であり；
Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ３がＮであり；Ｘ４が－ＣＲ９であり；式（Ｉｂ）：
Figure 2023521802000047
 を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ５９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６１．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１がＮであり；
Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ３が－ＣＲ３であり；Ｘ４が－ＣＲ９であり；式（Ｉｃ）：
Figure 2023521802000048
 を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ６０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６２．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１が－ＣＲ６であり；
Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ３が－ＣＲ３であり；Ｘ４が－ＣＲ９であり；式（Ｉｄ）：
Figure 2023521802000049
 を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ６１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６３．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｘ１が－ＣＲ６であり；
Ｘ２が－ＣＲ５であり；Ｘ３が－ＣＲ３であり；Ｘ４が－Ｎであり；式（Ｉｅ）：
Figure 2023521802000050
 を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ６２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６４．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、ＲｙがＨ又はメチルである、実施形態Ｅ１～Ｅ６３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６５．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊのそれぞれが、Ｈ、ハロ、Ｃ１～６アルク又はＣ１～４ハロアルクであり、Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対のそれぞれが、これらのそれぞれに連結された炭素原子と組み合わさって、Ｒｘ環に対するスピロである飽和３、４又は５員単環式環を形成し；前記環が、０、１、２又は３個のＮ原子並びにＯ及びＳから選択される０、１又は２個の原子を含有する、実施形態Ｅ１～Ｅ６４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１０ｃ、Ｒ１０ｄ、Ｒ１０ｅ、Ｒ１０ｆ、Ｒ１０ｇ、Ｒ１０ｈ、Ｒ１０ｉ及びＲ１０ｊのそれぞれが、Ｈ、メチル又はエチルであり；Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの対のそれぞれが、これらのそれぞれに連結された炭素原子と組み合わさって、Ｒｘ環に対するスピロであるシクロプロピル、シクロブチル又はシクロペンチル環を形成する、実施形態Ｅ１～Ｅ６５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６７．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、基
Figure 2023521802000051
 が
Figure 2023521802000052
 である、実施形態Ｅ１～Ｅ６６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６８．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１が、基－Ｚ－Ｒ１２；式中、Ｚが、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＨ）－、－ＮＨＳＯ２－、－ＳＯ２－、－ＳＯ２ＮＨ－又は－ＮＨ－であり；Ｒ１２がシクロプロピル、－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－ＯＨ、－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－ＯＨ、メチルオキセタニル又はｔｅｒｔ－ブチルである、実施形態Ｅ１～Ｅ６７の何れか１つに記載の方法。
Ｅ６９．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１が、基－Ｚ－Ｒ１２；式中、Ｚが－ＮＨＳＯ２－又は－ＮＨ－であり；Ｒ１２が－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－ＯＨ又は－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－ＯＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ６８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７０．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ１が、基－Ｚ－Ｒ１２であり；式中、Ｚが－ＮＨＳＯ２－であり、Ｒ１２が－ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ６９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７１．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ２が、基－Ｙ－Ｒ１３であり；式中、Ｙが－Ｃ０～４アルク－、－Ｏ－Ｃ０～４アルク－、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）２又は－ＳＯ２ＮＨ－であり；－Ｒ１３が４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル；－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＦ３、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロペンチル又は２－メチルモルホリニルである、実施形態Ｅ１～Ｅ７０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７２．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ２が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、メチル又はＣＦ３から選択される１、２又は３個の基により置換されるピペリジニル又はモルホリニルであるか；又はＲ２が、－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＦ３、－ＳＯ２ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）３又は－ＳＯ２－シクロペンチルである、実施形態Ｅ１～Ｅ７１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７３．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ２が、基－Ｙ－Ｒ１３であり、式中、Ｙが－Ｃ０～４アルク－であり；－Ｒ１３が４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル又は２－メチルモルホリニルである、実施形態Ｅ１～Ｅ７２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７４．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ４がＨ又はメチルである、実施形態Ｅ１～Ｅ７３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７５．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ５がＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ７４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ６がＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ７５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７７．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ７がＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ７６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７８．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ８がＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ７７の何れか１つに記載の方法。
Ｅ７９．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、式中、Ｒ９がＨである、実施形態Ｅ１～Ｅ７８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８０．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、前記化合物が、
Figure 2023521802000053
Figure 2023521802000054
Figure 2023521802000055
からなる群から選択される、実施形態Ｅ１～Ｅ７９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８１．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩であり、前記化合物が、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３若しくはＣ１４の何れか１つ又は薬学的に許容可能なその塩である、実施形態Ｅ１～Ｅ８０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８２．前記塩が、硫酸塩、ＨＣｌ、メシル酸塩、トシル酸塩又はベシル酸塩である、実施形態Ｅ８１に記載の方法。
Ｅ８３．前記塩がＨＣｌ塩である、実施形態Ｅ８２に記載の方法。
Ｅ８４．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が新生物疾患を選択的に処置し、腫瘍退縮を選択的に誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を選択的に低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を選択的に誘導するか若しくは増加させ、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が正常な体細胞に対して毒性がない、実施形態Ｅ１～Ｅ８３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８５．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導するか若しくは増加させ、前記対象における正常な体細胞の増殖が、対照対象の正常な体細胞の増殖と実質的に同じである、実施形態Ｅ１～Ｅ８４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくは癌の成長を低減させ、及び／又は腫瘍若しくは癌細胞の死を誘導するか若しくは増加させ、正常な体細胞のアポトーシスのレベルが、対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと比較して、前記対象において上昇せず、任意選択的に前記正常な体細胞のアポトーシスのレベルが対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと実質的に同じである、実施形態Ｅ１～Ｅ８５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８７．前記正常な体細胞が、ヒト骨髄単核細胞、ヒト哺乳動物上皮細胞又はヒト包皮線維芽細胞である、実施形態Ｅ８４～Ｅ８６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８８．前記正常な体細胞がＴＰ５３ＭＵＴではないか又は正常な体細胞がＴＰ５３ＷＴである、実施形態Ｅ８４～Ｅ８７の何れか１つに記載の方法。
Ｅ８９．前記新生物疾患が多剤耐性の新生物疾患である、実施形態Ｅ１～Ｅ８８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ９０．前記腫瘍又は癌細胞が多剤耐性腫瘍又は癌細胞であり、及び／又は多剤耐性１（ＭＤＲ－１）遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現上昇を示す、実施形態Ｅ１～Ｅ８９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ９１．前記腫瘍又は癌細胞がＰ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の発現上昇を示す、実施形態Ｅ９９に記載の方法。
Ｅ９２．前記新生物疾患が、抗有糸分裂剤又はアントラサイクリン抗生物質、任意選択的にパクリタキセル又はドキソルビシンでの処置に対して耐性である、実施形態Ｅ１～Ｅ９１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ９３．抗有糸分裂剤又はアントラサイクリン抗生物質で処置するか又は処置されたことがある対象において新生物疾患を処置する方法であって、前記対象にＫＩＦ１８Ａ阻害剤を投与することを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、方法。
Ｅ９４．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、ＫＩＦ１８Ａ遺伝子及び／又はＫＩＦ１８Ａ遺伝子産物の発現を低下させる、実施形態Ｅ１～Ｅ９３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ９５．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、非コードＲＮＡである、実施形態Ｅ９４に記載の方法。
Ｅ９６．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤がＲＮＡｉに介在する、実施形態Ｅ９５に記載の方法。
Ｅ９７．前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤がｓｉＲＮＡである、実施形態Ｅ１～Ｅ９６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ９８．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１２～１８のうち何れか１つの配列を含む、実施形態Ｅ９７に記載の方法。
Ｅ９９．不活性化されたＴＰ５３遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ９８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１００．不活性化されたＲｂ１遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ９９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０１．増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現をアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１００の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０２．不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０３．不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び不活性化されたＲｂ１遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０４．不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０３の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０５．不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０４の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０６．不活性化されたＲｂ１遺伝子及び増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０５の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０７．不活性化されたＲｂ１遺伝子及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０６の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０８．増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０７の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１０９．不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子及び増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０８の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１０．不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１０９の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１１．不活性されたＴＰ５３遺伝子、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１１０の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１２．不活性化されたＲｂ１遺伝子、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１１１の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１３．不活性化されたＴＰ５３遺伝子、不活性化されたＲｂ１遺伝子、増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現及び不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子についてアッセイすることを含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ１１２の何れか１つに記載の方法。
Ｅ１１４．前記新生物疾患が、１つ以上の全ゲノム重複又は全ゲノム倍加（ＷＧＤ）事象を含む癌である、実施形態Ｅ１～Ｅ１１３の何れか１つに記載の方法。
以下の実施例は本発明を単に例証するために示され、その範囲を決して制限するものではない。
実施例１
この実施例は、ＣＤＫ４／６阻害剤及びＥｇ５阻害剤と比較した、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する感受性についての癌細胞株の分析を記載する。
乳癌細胞株、卵巣癌細胞株及び前立腺癌細胞株を含む癌細胞株のパネルを使用して、４日の画像に基づく核カウントアッセイ（ＮＣＡ）において、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤、化合物Ｃ１４を評価した。細胞傷害性対照としてＥｇ５モーター阻害剤（イスピネシブ）を使用した。インタクトなＲｂ経路を有する細胞株において活性である対照薬としてＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）を使用した。（Ｔ ＶａｎＡｒｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１５；１；２１：２９０５－２９１０）。
ヒト癌細胞株及びその細胞株のための細胞培養方法の説明を図１Ａの表１Ａで提供する。ヒト癌細胞株は全て、別段の指定がない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。乳癌細胞株ＣＡＬ－５１は、ＤＳＭＺ（ＧｍｂＨ）から得た。Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）及びＯＶＣＡＲ－５を発現するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－８＿ＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳは、Ａｍｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから得た。ＭＡＸ４０１ＮＬＰＤＸ細胞株は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。この報告で使用される細胞株は、元はＮＣＩからＡＣＢにより得られたＯＶＣＡＲ－５癌細胞株を除き、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）法を使用してＡＴＣＣにより認証されており、ＯＶＣＡＲ－５細胞に対してＡＴＣＣから得られたＳＴＲプロファイルは、ＥｘＰａｓｙデータベースに対して検索し、ＯＶＣＡＲ－５との１００％一致を示した。細胞株培養は全て、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で維持した。
癌細胞株をＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＦｌａｔ Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｂｌａｃｋポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において１００μＬの適性な完全培地中において適切な密度で播種し、２４時間増殖させた ＮＣＡ試験で使用した細胞株播種密度の説明は、図１Ｂの表１Ｂで提供する。
１セットの実験において、細胞処理のための調製で、ＢＲＡＶＯを使用して［最終２０点、濃度範囲、１０μＭ～０．０００３μＭ（化合物Ｃ１４又はパルボシクリブに対して）及びスタガードドーズ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）アプローチを使用して１μＭ～０．００００３μＭ（イスピネシブ）］次のうち１つの２Ｘ濃度：化合物Ｃ１４、パブロシクリブ（ＣＤＫ４／６阻害剤）又はイスピネシブ（Ｅｇ５阻害剤）を１００μＬの完全培地中に連続希釈した。０．５％ＤＭＳＯを含有する細胞培地中２００μＬの最終体積でこの化合物を細胞に添加した。
第２のセットの実験において、細胞処置のための調製で、化合物Ｃ１４、オラパリブ（ＰＡＲＰ阻害剤）、パクリタキセル（タキサン）、ドキソルビシン（アントラサイクリン）及びカルボプラチン（白金）のうち１つの２Ｘ濃度は、ＢＲＡＶＯを使用して１００μＬの完全培地中に連続希釈した［最終２０点、濃度範囲、１０μＭ～０．０００３μＭ（化合物Ｃ１４）、１００μＭ～０．００３μＭ（オラパリブ、カルボプラチン）、１μＭ～０．００００３μＭ（パクリタキセル）及び２μＭ～０．００００６μＭ（ドキソルビシン）、スタガードドーズ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）アプローチを使用］。０．５％ＤＭＳＯを含有する完全培地中で２００μＬの最終体積で化合物を細胞に添加した。
処置の４日（９６時間）又は６日（１４４時間）後、１００μＬの完全培地を各ウェルから取り出し、それを１００μＬの２ｘホルムアルデヒド（最終４％）で置き換え、プレートを室温で１５分間温置することによって細胞を固定した。固定後、細胞を透過処理し、２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ＤＮＡ色素を含有する２００μＬの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘ ＰＢＳ）中で染色した。プレートを密封し、暗所にて室温で１時間温置した。データ捕捉まで、細胞を暗所にて４℃で保管した。Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ４ Ａｓｓａｙプロトコール（１０Ｘ対物レンズを使用してＶｅ ６．６．０（Ｂｕｉｌｄ ８１５３）、ウェルあたり１６視野で回収）を用いて、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（ＳＮ０３０９０７４５Ｆ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でイメージングデータを取得した。ＤＭＳＯ処理対照の±３ＳＤ内であったＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核対象物の特性（チャンネル１において、面積、総強度及び可変強度）を使用して、有効対象物カウントを決定した。 次の式を使用して総有効対象物カウントをカウントＰＯＣ（ＤＭＳＯ対照のパーセンテージ）として表した：
カウントＰＯＣ＝（処理したウェル中の総有効対象物カウント）÷（ＤＭＳＯ処理ウェル中の総有効対象物カウント） ｘ１００
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用して、化合物濃度及びカウントＰＯＣ値をプロットし、４－パラメーター式（可変勾配）で曲線フィッティングを行った。濃度反応曲線及び標準偏差は、２つ組で２回行った独立した実験に相当する。
表１Ｃ（図１Ｃ）は、各細胞株に対する平均カウントＥＣ５０値及びスパン（ＰＯＣ最大－最小）を示し、スパンが＞５０％を超えなかった場合、細胞株を非感受性とみなした。全ての感受性細胞株にわたる平均カウントＥＣ５０値（±ＳＤ）を各試験剤に対して決定した。
表１Ｃに対するコンセンサス情報。次のオンラインデータベース（Ｃａｎｃｅｒ ＤｅｐＭａｐ及びＣＣＬＥ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／ｄｅｐｍａｐ），Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ Ｐａｓｓｐｏｒｔｓ （ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｍｏｄｅｌｐａｓｓｐｏｒｔｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐａｓｓｐｏｒｔｓ），Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩＡＲＣ （ｈｔｔｐ：／／ｐ５３．ｉａｒｃ．ｆｒ／ＯｔｈｅｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ．ａｓｐｘ），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）及び参考文献（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１８；Ｋｏｎｅｃｎｙ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｔｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９０；Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ，２０１８）から細胞株の特徴（組織タイプ、腫瘍サブタイプ、ＴＰ５３突然変異の状況、Ｒｂ経路状況）を得た。
表１Ｃに対する略語。ミスセンス突然変異（ＭＭ）、ナンセンス突然変異（ＮＭ）、フレームシフト欠失（ＦＳＤ）、フレームシフト挿入（ＦＳＩ）、停止コドン（＊）、フレームシフト（ｆｓ）、増幅（ＡＭＰ）、プロフィシェント（ＰＲＯＦ）、欠失（ＤＥＦ）、アミノ酸（Ａ．Ａ．）、陽性（ＰＯＳ）、陰性（ＮＥＧ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３ ＨＥＲ－２増幅状況に対する状況が不明（？）。
表１Ｃに対する参考文献：
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｎ，Ｃｏｎｋｌｉｎ Ｄ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｒ，Ｌｕｏ Ｔ，Ｃｈａｕ Ｋ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１８；１７（５）：８９７－９０７．
Ｋｏｎｅｃｎｙ ＧＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ１６ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＤＫ４／６ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１ Ｍａｒ １５；１７（６）：１５９１－１６０２．
Ｆｉｎｎ ＲＳ ｅｔ ａｌ．ＰＤ ０３３２９９１，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ ｋｉｎａｓｅ ４／６ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｍｉｎａｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００９；１１（５）：Ｒ７７．
Ｄａｉ Ｘ，Ｃｈｅｎｇ Ｈ，Ｂａｉ Ｚ，Ｌｉ Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；８（１６）：３１３１．
Ｔｉｌｌｅｙ ＷＤ，Ｗｉｌｓｏｎ ＣＭ，Ｍａｒｃｅｌｌｉ Ｍ，ＭｃＰｈａｕｌ ＭＪ．Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９０；５０（１７）：５３８２－５３８６．
Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ ＡＫ，Ｃｈｕｎｇ Ｓ，Ｂｒｏｕｇｈ Ｒ，Ｖａｉｌ Ｐ，Ｆｒａｎｃｏ Ｊ，Ｌｏｒｄ ＣＪ，Ｋｎｕｄｓｅｎ ＥＳ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＲＢ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｌｏｓｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８；２２（５）：１１８５－１１９９．
図１Ｃの表１Ｃで示されるように、ＫＩＡ１８Ａ阻害剤に対する感受性を示した全細胞株は、突然変異体ＴＰ５３癌細胞株であった。１２の細胞株のうち７つを「感受性」としてスコア化し、同様の４日平均数ＥＣ５０値（０．０５６３μＭ±ＳＤ０．００８）を示した。４つのＴＰ５３ＷＴ株（ＣＡＬ－５１、ＺＲ－７５－１、ＭＣＦ－７、ＯＶＣＡＲ－５）及び１つのＴＰ５３ＮＵＬＬ株（ＭＤＡ－ＭＢ－４５３）を含む５つのＲｂ－プロフィシェント癌細胞株は、パルボシクリブ感受性であり、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に非感受性であった。全てのＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性細胞株において、１つ（ＨＣＣ－１９３７ ＢＲＣＡ１突然変異体）を除いて、細胞株はＣＣＮＥ１増幅又はＲｂＤＥＦ状況の何れかを有した。まとめると、これらのデータは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及びパルボシクリブが別個であり大部分が非重複性の感受性プロファイルを有することを示し、このことから、Ｒｂ経路の状況がセグメント化バイオマーカー（例えばＲＢ１喪失及びＣＣＥ１増幅）として働き得ることが示唆される。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性プロファイルは、イスピネシブの細胞傷害性効果とは明らかに異なり、局限的な感受性プロファイルから、癌細胞株の一部のみが有糸分裂特異的な脆弱性及びＫＩＦ１８Ａ依存性の増強を示すことが示唆される。
図２Ａ～２Ｆは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてプロットされた６つの試験細胞株に対するカウントＰＯＣ値のグラフである。図２Ａ～２Ｆの６つの細胞株は、ＢＴ－５４９（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＲＢＤＥＦとして特徴付けられるＴＮＢＣ）、ＯＶＣＡＲ－３（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＣＣＮＥ１ＡＭＰとして特徴付けられるＨＧＳＯＣ）、ＤＵ－１４５（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＲＢＤＥＦとして特徴付けられるＣＲ－ＰＣ）、ＣＡＬ－５１（ＴＰ５３ＷＴ及びＲＢＰＲＯＦとして特徴付けられるＴＮＢＣ）、ＯＶＣＡＲ－５（ＴＰ５３ＷＴ及びＲＢＰＲＯＦとして特徴付けられるＨＧＳＯＣ）及びＺＲ－７５（ＴＰ５３ＷＴ及びＲＢＰＲＯＦとして特徴付けられるルミナル乳癌）であった。図２Ａ～２Ｆの濃度反応フィッティング曲線は、エラーバー（ＳＤ）付きの対照（ＤＭＳＯ）のパーセンテージに基づく平均カウントとして表す。２回の独立した実験において２つ組でアッセイを行った。興味深いことに、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に感受性があったこれらの細胞株は、ＣＤＫ４－６阻害剤、パルボシクリブに対して感受性ではなく、また逆も成り立った。これらのデータは、ＣＤＫ４／６阻害剤癌細胞感受性が、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する癌細胞感受性に対する負の予想因子となり得ること及びＲｂ経路不活性化（例えばＲＢ１喪失及びＣＣＥ１増幅）がＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対する潜在的反応バイオマーカーとなり得ることを示唆する。
図３Ａ～３Ｄは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度の関数としてプロットした４つの試験細胞株に対するカウントＰＯＣ値の一連のグラフに相当する。図３Ａ～３Ｄの４つの細胞株は、ＯＶＣＡＲ－８（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＢＲＣＡ１Ｓｉｌｅｎｃｅｄとして特徴付けられるＨＧＳＯＣ）、ＭＸ－１（トリプルネガティブ乳癌（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＢＲＣＡ１ＭＵＴとして特徴付けられるＴＮＢＣ）、ＭＡＸ４０１ＮＬ ＰＤＸ（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＢＲＣＡ１ＭＵＴとして特徴付けられるＴＮＢＣ）及びＨＣＣ－１９３７（ＴＰ５３ＭＵＴ及びＢＲＣＡ１ＭＵＴとして特徴付けられるＴＮＢＣ）であった。図３Ａ～３Ｄの各グラフで示されるように、ＴＰ５３ＭＵＴ及びＢＲＣＡ１－欠失癌細胞株は、０．０５１～０．０８２μＭの範囲のカウントＥＣ５０値で、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する感受性を示した。
図３Ｅは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、パクリタキセル、ドキソルビシン又はカルボプラチンの濃度の関数としてプロットされたＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ－ＡＤＲ ＲＥＳサブラインに対するカウントＰＯＣ値のグラフである。図３Ｅで示されるように、この細胞株は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対する最大の感受性を示した。ＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ－ＡＤＲ ＲＥＳ細胞は、抗癌剤に対する多剤耐性を誘導することが知られる薬物ポンプＭＤＲ１又はＡＢＣＢ１遺伝子（Ｐ－糖タンパク質をコードする）を過剰発現し（Ａ Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８：１１；２２１－３７）、このデータから、薬物排出ゆえにＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性がオラパリブ、パクリタキセル及びドキソルビシンと比較して、穏やかにしか影響しないことが示唆される。さらに、多重ＡＢＣＢ１転写融合が、化学療法耐性の再発性卵巣癌において報告されている（ＥＬ Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１９：２０；１０：１－１０）。
実施例２
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９に対する感受性についての癌細胞株の分析を示す。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９に対する癌細胞株の感受性プロファイルを同定するために、分析を行った。この分析において、４日又は６日癌細胞株増殖アッセイスクリーニングの何れかで、異なるヒト乳癌及び卵巣癌細胞株のパネル（図４Ａの表２及び図４Ｂの表３）を使用した。
４日増殖アッセイスクリーニングにおいて、予め最適化された播種密度で癌細胞株を９６ウェル組織培養プレートにおいて処理した。増殖培地条件は、ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により決定された。２４時間後、生存細胞の指標としてのＡＴＰの定量に基づく４日細胞増殖アッセイにおいて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ ２．０読み取り（ＣＴＧ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９；最終１０点、濃度範囲２．０μＭ～０．０００１μＭの範囲、３倍希釈）で細胞を処理した。各細胞株に対してＣＴＧアッセイを２つ組で行った。発光プレートリーダーを使用して検出を行い、ＰＯＣ（ＤＭＳＯ対照のパーセンテージ）に基づく相対発光単位（ＲＬＵ）として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用した４－パラメーター式（可変勾配）による曲線フィッティング分析のために生データがＡｍｇｅｎに提供された。濃度反応曲線及び標準偏差をグラフ化した（図４Ｃ及び４Ｄで代表的曲線を示す）。各癌細胞株に対するＥＣ５０（ＩＰ）及びスパン（フィットさせた点に対する最大反応と最小反応との間の差）に対する値を報告し、ＥＣ５０値＜０．１μＭ及びスパン≧４０である場合にＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物に対して感受性として分類した。
６日増殖アッセイを使用して拡大したスクリーニングを行い、細胞５００～１５００個／ウェルで黒色３８４ウェル組織培養プレートにおいて癌細胞株を処理した。増殖培地条件は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）により決定された。２４時間後、６日細胞増殖アッセイにおいて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ ２．０読み取り（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生存細胞の指標としてＡＴＰの定量に基づき、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９；最終１１点、濃度範囲２．０μＭ～０．００００３３９μＭ、３倍希釈）で細胞を処理した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を検出し、ＰＯＣ（対照のパーセンテージ）に基づき相対発光単位（ＲＬＵ）として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用した４－パラメーター式（可変勾配）による曲線フィッティング分析のために生データがＡｍｇｅｎに提供された。濃度反応曲線及び標準偏差をグラフ化した（図４Ｅ～４Ｆで代表的曲線を示す）。Ｈｏｒｉｚｏｎ’の専売ソフトウェアを使用して曲線フィッティング分析も行った。Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙは、各癌細胞株に対するＥＣ５０（ＩＰ）及び最大反応（実測）に対する値を報告し、ＥＣ５０値＜０．１μＭ及び最大反応≧５９．５の場合に、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物に対して感受性であるものとして細胞株を分類した。
さらに、次のように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を用いて細胞カウント細胞株増殖アッセイスクリーニングを行った：イメージングに基づく核カウントアッセイ（ＮＣＡ）を使用して上記のようにＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９を用いて乳癌及び卵巣癌細胞株のサブセットをスクリーニングした。４日又は６日ＮＣＡの何れかの内部データＫＩＦ１８Ａ阻害剤。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用してＡｍｇｅｎにおいて曲線フィッティングが行われた。報告される値：各癌細胞株に対するＥＣ５０値（ＩＰ）及びスパン（フィッティング点に対する最大反応と最小反応との間の差）を報告し、ＩＣ５０値＜０．１μＭ及びスパン≧４０の場合にＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物対して感受性があるものとして細胞株を分類。
細胞カウントアッセイの結果を表２及び表３及び図４Ｃ～４Ｆで示す。表２は、ヒト乳癌細胞株のパネルに対する分析のまとめであり、表３は、ヒト卵巣癌細胞株のパネルに対する分析のまとめである。
表２及び３において、「？」は、第１のスクリーニングと第２のスクリーニングとの間の感受性コールに相違があったことを意味し、「ＮＤ」は決定されなかったことを意味する。第１のスクリーニング又は第２のスクリーニングの何れかを通じてスクリーニングを行った。第１のスクリーニング（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ，ＣＰ）は４日ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（ＣＴＧ）アッセイであった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して曲線フィッティングを行った。表２及び３での報告値は：ＥＣ５０値（ＩＰ）及びスパン又は最大反応（フィットさせた点に対する最大反応と最小反応との差）である。第１のスクリーニング感受性スコア化［感受性のある細胞株群は、ＥＣ５０値が＜０．１μＭでありスパン≧４０として定められる］。第２のスクリーニング（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＨＲ）は、６日ＣＴＧアッセイであった。ＨＲによって曲線フィッティングを行った。表２及び３での報告値は：ＥＣ５０値（ＩＰ）及び最大反応（実測）である。第２のスクリーニング感受性スコア化［感受性のある細胞株群は、ＥＣ５０値が＜０．１μＭであり、スパン≧５９．５として定められる］。第３のスクリーニング（Ａｍｇｅｎ，ＡＭ）を行い、これは４日又は６日核カウントアッセイ（ＮＣＡ）の何れかであった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して曲線フィッティングを行った。表２及び３での報告値は：ＥＣ５０値（ＩＰ）及びスパン（フィットさせた点に対する最大反応と最小反応との差）である。第３のスクリーニング感受性スコア化［感受性のある細胞株群は、ＥＣ５０値が＜０．１μＭでありスパン≧４０として定められる］。
図４Ａ～４Ｆに対するコンセンサス情報。細胞株の特徴（組織タイプ、腫瘍サブタイプ、ＴＰ５３突然変異の状況、ＴＰ５３変異体タイプ、ｐ５３タンパク質の変化）を次のオンラインデータベース（Ｃａｎｃｅｒ ＤｅｐＭａｐ及びＣＣＬＥ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／ｄｅｐｍａｐ）、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ Ｐａｓｓｐｏｒｔｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｍｏｄｅｌｐａｓｓｐｏｒｔｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐａｓｓｐｏｒｔｓ）、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＩＡＲＣ（ｈｔｔｐ：／／ｐ５３．ｉａｒｃ．ｆｒ／ＯｔｈｅｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ．ａｓｐｘ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）及び参考文献（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１７；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２０１８；Ｄｏｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３）から得た。
表２及び表３に対する略語。ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ ｓｃｒｅｅｎ（ＣＰ）、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙスクリーニング（ＨＲ）、Ａｍｇｅｎスクリーニング（ＡＭ）、決定せず（ＮＤ）、（ＴＮＢＣ）、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、陰性（ＮＥＧ）、陽性（ＰＯＳ）、ＨＥＲ２受容体陽性（ＨＥＲ２）、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）、突然変異体（ＭＵＴ）、野生型（ＷＴ）、発現喪失（ＬＯＥ）、ミスセンス突然変異（ＭＭ）、ナンセンス突然変異（ＮＭ）、フレームシフト欠失（ＦＳＤ）、フレームシフト挿入（ＦＳＩ）、停止コドン（＊）、フレームシフト（ＦＳ）、スプライシング部位（ＳＳ）、インフレーム欠失（ＩＦＤ）、インフレーム挿入（ＩＦＩ）、サイレント（Ｓ）、アミノ酸（Ａ．Ａ．）、ＣＰとＨＲスクリーニングとの間のコールの感受性カラム差（？）及び腫瘍サブタイプ及びＴＰ５３コンセンサスカラムコール不明（？）。
腫瘍サブタイプ：Ｓｏｕｒｃｅ ＸＤａｉ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ＿２０１７，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．＿２０１８ （Ｂｒｅａｓｔ），Ｄｏｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ＿Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ ２０１３ （Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ）。ＴＮＢＣ＝トリプルネガティブ乳癌、ＨＧＳＯＣ＝高悪性度漿液性卵巣癌、ＥＲ＝エストロゲン受容体、ＮＥＧ＝陰性、ＰＯＳ＝陽性、ＨＥＲ２＝ ＨＥＲ２受容体陽性、ＬｕｍＡ＝ルミナルＡ、ＬｕｍＢ＝ルミナルＢ、？＝サブタイプ不明。
ＴＰ５３状況：Ｓｏｕｒｃｅ ＣＣＬＥ／Ｓａｎｇｅｒ／ＩＡＲＣコール：コンセンサスコールが不明だった場合、文献又はリストの何れかにおいて不明（？）として見られる。ＭＵＴ（突然変異体）、ＷＴ（野生型）、ＬＯＥ（発現喪失）。変異体分類。ＭＭ（ミスセンス＿突然変異）、ＮＭ（ナンセンス＿突然変異）、ＳＳ（スプライシング＿部位）、ＩＦＤ（イン＿フレーム＿欠失）、ＦＳＩ（フレーム＿シフト＿挿入）、ＦＳＤ（フレーム＿シフト＿欠失）、ＮＵＬＬ、ＩＦＩ（イン＿フレーム＿挿入）、サイレント。
表２及び表３に対する参考文献
Ｄａｉ Ｘ，Ｃｈｅｎｇ Ｈ，Ｂａｉ Ｚ，Ｌｉ Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；８（１６）：３１３１．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｎ，Ｃｏｎｋｌｉｎ Ｄ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｒ，Ｌｕｏ Ｔ，Ｃｈａｕ Ｋ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１８；１７（５）：８９７－９０７．
Ｄｏｍｃｋｅ Ｓ，Ｓｉｎｈａ Ｒ，Ｌｅｖｉｎｅ ＤＡ，Ｓａｎｄｅｒ Ｃ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎ．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｓ ｔｕｍｏｕｒ ｍｏｄｅｌｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１３；４（１）：１－１０．
表２で示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性である乳癌細胞株は突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性であり、これらの多くは、ミスセンス突然変異ゆえに突然変異体ＴＰ５３タンパク質を発現した。９種類のＴＰ５３野生型乳癌細胞株のうち、２つのＴＮＢＣ株（ＣＡＬ－５１、ＤＵ４４７５）を含め、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して感受性であるものはなかった。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であった全ての乳癌細胞株は、陰性のエストロゲン受容体（ＥＲ）状況を有し、これらの細胞株の約４分の３はＨＥＲ２状況も陰性であった。ルミナルＡ又はルミナルＢ乳癌細胞株のうちＫＩＦ１８Ａ阻害剤に感受性であるものはなかった。
表３で示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であった卵巣癌細胞株は、突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性であり、これらの多くは、ミスセンス突然変異ゆえに突然変異体ＴＰ５３タンパク質を発現した。９種類のＴＰ５３野生型卵巣癌細胞株のうち、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して感受性であるものはなかった。これらの癌細胞株の殆どに対して、腫瘍サブタイプは、分子分類に基づき、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）と「思われた」か又は「可能性があった」（Ｓ．Ｄｏｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１３：４：１－１０）。
第１のスクリーニング（図４Ｃ～４Ｄ）及び第２のスクリーニング（図４Ｅ～４Ｆ）からの代表的な濃度反応曲線をそれぞれ図４Ｃ～４Ｆで示す。図４Ｃ～４Ｆで示されるように、乳癌及び卵巣癌細胞株について、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性プロファイルを「感受性あり」（図４Ｃ、４Ｅ）及び「非感受性」（図４Ｄ、４Ｆ）に群分けした。
実施例３
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４が、雌胸腺欠損ヌードマウスでのヒトＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ異種移植モデル（ＴＰ５３ＭＵＴ、ＣＣＮＥ１ＡＭＰ）において腫瘍退縮を誘導することを示す。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が腫瘍退縮に対して有する効果を明らかにするために、ＯＶＣＡＲ－３細胞をインビボで続いて再選択した（ＯＶＣＡＲ－３ＳＱ３）。雌性胸腺欠損ヌードマウスの右側腹部に、０．１ｍＬ中の細胞５ｘ１０６個を皮下注射した。腫瘍が確立された後（１５０ｍｍ３の平均腫瘍体積）、群あたり１０匹で４つの処置群（ビヒクル単独、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＦ１８Ａ阻害剤）に無作為に動物を分け、腫瘍移植後第２５日に開始して、１日１回経口処置（ＰＯ、ＱＤ）した。ＰＲＯ－ＭＡＸ電子デジタルキャリパー（Ｊａｐａｎ Ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ Ｍｆｇ．Ｃｏ．ＬＴＤ）で測定した腫瘍の長さ、幅及び高さから、腫瘍測定を計算した。［ＬｘＷｘＨ］として腫瘍体積を計算し、ｍｍ３で表した。腫瘍体積及び動物体重測定を週に２回決定した（試験開始第２５日、試験終了第４５日）。化合物と無関係と思われる知見である腹部膨張のために１匹のマウスを試験から除外した（ＫＩＦ１８Ａ阻害剤３０ｍｇ／ｋｇ群）。
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）及び腫瘍退縮の式
Figure 2023521802000056
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用してデータをプロットし、腫瘍体積及び体重データを平均プラス又はマイナス平均の標準誤差として表し、時間の関数としてプロットした。ＳＬＡＣＲパッケージ（ｖ．１．０．３）を使用して、成長曲線間の観察される差の統計学的な有意性を計算した。全ての３つのＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置群について有意な腫瘍退縮ｐ値（＊＊＊ｐ≦０．０００１）で、初期及び最終腫瘍体積において対応のあるスチューデントｔ検定によって腫瘍退縮に対する統計学的有意性を実施した。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤用量１０ｍｇ／ｋｇ（８１％退縮、１０例のうち５例が腫瘍なし）、３０ｍｇ／ｋｇ（９８％退縮、９例のうち８例が腫瘍なし）及び１００ｍｇ／ｋｇ（９７％退縮、１０例のうち７例が腫瘍なし）。ビヒクル処置群と比較した動物体重の変化により判定した場合、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置群において、明白な毒性の証拠は観察されなかった。
結果を図５Ａ～５Ｂに示す。図５Ａで示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の連日経口投与によって、ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ腫瘍（ＴＰ５３突然変異体、ＣＣＮＥ１増幅）の成長が顕著に阻害され、全てのこれらの用量で退縮が誘導された。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤休止後の腫瘍再成長能の評価から、耐久性のある腫瘍退縮が示され、明らかな毒性の証拠なく≧５０％の動物で治癒し、このことから、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は忍容性に優れていることが示された。
実施例４
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４が、雌無胸腺ヌードマウスでヒトＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ異種移植モデル（ＴＰ５３ＭＵＴ、ＢＲＣＡ１ｓｉｌｅｎｃｅｄ）において腫瘍退縮を誘導することを示す。
雌胸腺欠損ヌードマウスの右側腹部に、０．１ｍＬ中の５ｘ１０６個のＯＶＣＡＲ－８細胞を皮下注射した。確立された腫瘍がある動物を（平均腫瘍体積～１３４ｍｍ３）群あたり動物１０匹で４つの処置群（ビヒクル単独、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１４）に無作為に分け、腫瘍移植後第２５日に開始して、１日１回経口処置（ＰＯ、ＱＤ）した。腫瘍体積及び動物体重測定を週に２回決定した（試験開始第２５日、試験終了第４７日）。図５Ａ～５Ｂに対して上で記載されるような腫瘍測定、式及び退縮分析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用してデータをプロットし、腫瘍体積及び体重データを平均プラス又はマイナス平均の標準誤差として表し、時間の関数としてプロットした。ＳＬＡＣＲパッケージ（ｖ．１．０．３）を使用して、成長曲線間の観察される差の統計学的な有意性を計算した。ビヒクル群に対するダネットの比較とともにＲＭＡＮＯＶＡにより、化合物Ｃ１４ １０ｍｇ／ｋｇ群（５７％ＴＧＩ、ｐ＝０．００３）について腫瘍成長阻害に対する統計学的有意性を決定した。初期及び最終腫瘍体積に基づいて対応のあるスチューデントｔ検定によって腫瘍退縮に対する統計学的有意性を実施し、化合物Ｃ１４ ３０ｍｇ／ｋｇ（８６％退縮、ｐ≦０．０００１、１０例のうち４例で腫瘍なし）及び化合物Ｃ１４ １００ｍｇ／ｋｇ（９８％退縮、ｐ≦０．０００１、１０例のうち８例で腫瘍なし）となった。ビヒクル処置群と比較した動物体重の変化により決定された場合、化合物Ｃ１４処置群において、明白な毒性の証拠は観察されなかった。
結果を図６Ａ～６Ｂに示す。図６Ａ～６Ｂに示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の連日経口投与により、ＯＶＣＡＲ－８ ＨＧＳＯＣ腫瘍（ＴＰ５３突然変異体、ＢＲＣＡ１ｓｉｌｅｎｃｅｄ）の成長が顕著に阻害され、３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で退縮が誘導され、明らかな毒性の証拠はなく、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が忍容性に優れていることが示された。
実施例５
この実施例は、癌細胞の有糸分裂の表現型におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果を分析するための試験を記載する。
癌細胞の有糸分裂の表現型におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果を分析するために、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤を用いて遂行されるイメージングに基づく中心体カウントアッセイ（ＣＣＡ）を行った。播種のための調製において、単一細胞懸濁液を作製するために１８－Ｇ針付きの１０ｍＬシリンジを通じてＭＤＡ－ＭＢ－１５７ ＴＮＢＣ細胞を７回再懸濁した。ＢＲＡＶＯ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、１００μＬの完全培地中でＣｏｒｎｉｎｇ９６ウェルＦｌａｔ Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｂｌａｃｋポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に細胞３００００個／ウェルの密度で細胞を播種し、２４時間増殖させた。細胞処理のための調製において、ＢＲＡＶＯ（最終２０点、濃度範囲５．０μＭ～０．０００１５μＭ、スタガードドーズ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）アプローチを使用）を使用して、１００μＬの完全培地中でＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４の２Ｘ濃度を連続希釈し、次いで０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度の播種細胞を含有する１００μＬの完全培地に添加した。処理の２４時間後に、１００μＬの完全培地を各ウェルから除去し、残存する１００μＬ完全培地を含有する各ウェルに１００μＬホルムアルデヒド（最終４％）を添加することによって細胞を固定し、室温で２０分間温置した。固定後、液体を除去し、２００μＬの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ＸＰＢＳ）中で細胞を洗浄した。洗浄緩衝液を１００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２滴のウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）／５ｍＬ洗浄緩衝液）で置き換え、４℃で一晩温置した。翌日、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で細胞を洗浄した。室温で２時間、１００μＬ洗浄緩衝液中の抗ｐ－ヒストンＨ３マウス抗体（０．５μｇ／ｍＬ、０５－８０６、ａｋａ ｐＨ３又はｐ－ＨＨ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び抗ペリセントリンウサギ抗体（０．５μｇ／ｍＬ、ａｂ４４４８－１００、Ａｂｃａｍ）で細胞を染色する。２００μＬ洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した。暗所にて室温で２時間、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ＤＮＡ色素（２μｇ／ｍＬ）を含有する洗浄緩衝液中の１μｇ／ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎヤギ抗マウスＩｇＧ－ａｌｅｘａ－６４７（Ａ２１２３６）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ－４８８（Ａ１１０３４）で細胞を染色した。２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した。最後の洗浄後、１５０μＬの１Ｘ ＰＢＳを各ウェルに添加し、プレートを密封した（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。ＳｐｏｔＤｅｔｅｃｔｏｒ．Ｖ４アッセイプロトコール（２０Ｘ対物レンズを使用してＶｅｒ ６．６．０（Ｂｕｉｌｄ ８１５３）、実験＃１ ウェルあたり１００視野を回収；実験＃２ ウェルあたり６７視野を回収）を使用して、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダー（ＳＮ０３０９０７４５Ｆ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でイメージングデータを取得した。最初に、取得した有糸分裂指標データ（ｐ－ヒストンＨ３陽性対象物のパーセンテージ）を上記のように取得した。次に、各有糸分裂対象物に対してペリセントリンスポットの数を数え上げるために、チャンネルスワップ（核対象物の代わりにセグメント化のために主要な対象物としてｐ－ヒストンＨ３陽性対象物を使用）によりバーチャルスキャンを行った。各ウェルに対して＞２個のペリセントリンスポットの有糸分裂対象物のパーセンテージ（中心体数に対する代用）を決定した。ｐ－ヒストンＨ３陽性対象物の最小数をＤＭＳＯ対照に対してウェルあたり２５０対象物に設定した。データ出力は次のものを含む：
（１）有効対象物カウント。これは、総有効核対象物カウント／ウェルを表す（有効対象物に対する範囲を設定するために使用されたＯｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ．Ｃｈ１及びＯｂｊｅｃｔ．ＶａｒＩｎｔｅｎｓｉｔｙ．Ｃｈ１に基づき、この範囲の外側の対象物を却下した）。
（２）選択された対象物カウント、ｐＨＨ３。これは、ａｌｅｘａ－６４７（チャネル３）を使用したセット蛍光強度閾値に基づく総有効ｐ－ヒストンＨ３陽性の有糸分裂対象物カウントを表す。
（３）％選択された対象物ｐＨＨ３。これは、ｐ－ヒストンＨ３陽性対象物のパーセンテージを表す［（選択された対象物カウント、ｐＨＨ３÷有効対象物カウント）ｘ１００］。
（４）％ＨＩＧＨ＿ＯｂｊｅｃｔＳｐｏｔＴｏｔａｌＣｏｕｎｔＣｈ２。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用して各ＫＩＦ１８Ａ阻害剤濃度に対するｐ－ヒストンＨ３陽性有糸分裂対象物のパーセンテージをプロットし、４－パラメーター式（可変勾配）を使用して濃度反応曲線をフィットさせた。２つ組で２回の独立した実験操作から平均ＥＣ５０値及び標準偏差を決定した。
ＤＭＳＯ－及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処置した細胞の代表的な視野レベルの画像を図７Ａで提供する。＞２個のペリセントリンスポットを伴う有糸分裂対象物の平均パーセンテージ又はｐ－ヒストンＨ３陽性対象物の平均パーセンテージを示すＫＩＦ１８Ａ阻害剤濃度反応フィッティング曲線を図７Ｂで提供する。エラーバー（ＳＤ）を示す。ペリセントリンスポット数及びｐ－ヒストンＨ３に対する平均ＥＣ５０を図７Ｃの表に示す。
図７Ａでの黒色の対象物は、ｐ－ヒストンＨ３陽性有糸分裂細胞に相当する。各ｐ－ヒストンＨ３陽性有糸分裂細胞に対する灰色のスポット（ペリセントリン陽性）を数え上げた。図７Ａ～７Ｃで示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処理により、０．０７９４μＭのＥＣ５０値で、ｐ－ヒストンＨ３陽性細胞の増加によって測定したところ、有糸分裂において紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）が活性化される。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ペリセントリンスポッティングの濃度依存的な増加を誘導し（＞２個のスポット／有糸分裂対象物）、ＥＣ５０値０．０５２２μＭはｐ－ヒストンＨ３アッセイＥＣ５０値と同様であり、これにより、これらの有糸分裂表現型がＭＤＡ－ＭＢ－１５７細胞において組み合わせられると思われることが示唆される。まとめると、これらのデータから、ＫＩＦ１８Ａ低分子阻害剤でのＫＩＦ１８Ａ ＡＴＰａｓｅモーター活性の阻害が有糸分裂細胞停止及び過剰なペリセントリンスポッティングにつながることが示唆される。
実施例６
この実施例は、癌細胞の有糸分裂中心体／染色体特性及びアポトーシスに対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果を分析するための試験を記載する。
癌細胞の有糸分裂中心体／染色体特性及びアポトーシスに対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果を分析するために、免疫蛍光イメージング分析によってＣＡＬ－５１及びＭＤＡ－ＭＢ－１５７ ＴＮＢＣ細胞における中心体特性を分析した。２００μＬの完全培地中でＣｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ ９６ウェルポリスチレンプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に細胞を播種し、増殖させた。２４時間後、ＤＭＳＯ（０．０５％）又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１１（０．５μＭ）で２４時間、細胞を処理した。室温にて２０分間、２％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、その後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が入った１Ｘ ＰＢＳ中で室温にて２０分間、透過処理した。２００μＬ洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で細胞を２回洗浄した。２００μＬの洗浄緩衝液中の１００μＬ抗ＣＥＴＮ３マウス抗体（１：２０００、Ｈ００００１０７０－Ｍ０１、Ａｂｎｏｖａ）及び抗ペリセントリンウサギ抗体（１：２０００、ａｂ４４４８－１００、Ａｂｃａｍ）で細胞を染色し、４℃で一晩温置する。２００μＬ洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した。洗浄緩衝液中１００μＬ二次抗体［ヤギ抗マウスＩｇＧ－ａｌｅｘａ－４８８（１：１０００、Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ－６４７（１：１０００、Ａ２１２４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］で室温にて２時間、遮光して、細胞を染色した。細胞を２回洗浄し、それに続いてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ＤＮＡ色素（２μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ洗浄緩衝液を添加した。４０５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、４８８ｎｍ（ａｌｅｘａ－４８８）及び６４７ｎｍ（ａｌｅｘａ－６４７）のレーザー励起波長で、６０ｘ油浸対物レンズを使用して、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ Ｖｏｘデュアルスピニングディスク共焦点顕微鏡上で細胞を画像化した。各処理ウェルからの有糸分裂対象物について代表的な最大投影画像を回収した。画像を図８Ａに示す。
個別の実験において、ウエスタンブロッティング分析を行った。簡潔に述べると、完全培地中でそれぞれ１２５０００及び１５００００個／ウェルの密度でＣＡＬ－５１及びＭＤＡ－ＭＢ－１５７ ＴＮＢＣ細胞株を６ウェルプレートに播種した。翌日、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で３ｍＬの完全培地中で細胞をＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（０．５μＭ）又はＥｇ５阻害剤イスピネシブ（０．０５μＭ）で処理した。４８時間後、各処置群に対して細胞溶解物を調製した（３ウェルからの合わせた培地及び細胞）。細胞を溶解し、基本的に実施例５に記載のようにウエスタンブロッティングを行った。一次抗体は、マウス抗切断ＰＡＲＰ（ｃｌ－ＰＡＲＰ）（＃５１－９０００１７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）、マウス抗サイクリンＢ１（５５４１７９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）及びウサギ抗ＧＡＰＤＨ（２１１８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０，０００）を含んだ。結果を図８Ｂに示す。
図８Ａ及び８Ｂで示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤でのＴＮＢＣ細胞株の処理によって、有糸分裂細胞中心体特性における変化（中心体周辺の物質及び中心小体の 数的な変化及び断片化）及び、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７ ＴＰ５３突然変異体及びＣＣＮＥ１増幅細胞でのみアポトーシスが選択的に誘導され、一方でＣＡＬ－５１ ＴＰ５３野生型細胞は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、中心体特性又はアポトーシスの変化は示さなかった。これらのデータをまとめると、ＴＰ５３突然変異体ＴＮＢＣ細胞が、適正な染色体整列及び分離のためにＫＩＦ１８Ａモーター活性に依存すること及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤がＳＡＣ活性化及び／又は中心体特性逸脱を引き起こし、その結果、多極性紡錘体及びアポトーシスが生じることが示唆される。
実施例７
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理したＨＧＳＯＣ細胞における細胞周期及びアポトーシスタンパク質発現のタイムコース試験を示す。
１０ｍＬの完全増殖培地中１００ｍｍ組織培養プレートに１４０万個の細胞密度でＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ細胞を播種した。翌日、２ｍＭチミジンを含有する完全増殖培地を細胞に添加し、１６時間温置した。１Ｘ ＰＢＳ中で３回細胞を洗浄した後、８時間にわたり完全増殖培地を添加し、その後、２回目の２ｍＭチミジンブロックを１６時間行った。二重チミジンブロックにより、細胞を細胞周期のＧ１／Ｓ期で停止させた。１Ｘ ＰＢＳ中での最初の３回の洗浄によりＧ１／Ｓブロックから細胞を解放し、その後、ＤＭＳＯ又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤（０．５μＭの化合物Ｃ１１）が入った完全増殖培地を添加した。複数の時点（４、８、１０、１２、１４及び２４時間）で細胞溶解物を調製した。対照として、非同調増殖ＯＶＣＡＲ－３細胞をＤＭＳＯ又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤（０．５μＭの化合物Ｃ１１）で処理し、溶解物を２４時間で調製した。一次抗体は、マウス抗切断ＰＡＲＰ（ｃｌ－ＰＡＲＰ）（５１－９０００１７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）、マウス抗サイクリンＢ１（５５４１７９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）、ウサギ抗Ｍｃｌ－１（５４５３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：５００）、マウス抗サイクリンＥ１（ＭＳ－８７０－Ｐ、ＨＥ１２、Ｎｅｏマーカー、１：２０００）、マウス抗ＢｕｂＲ１（６１２５０３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５０００）及びウサギ抗ＫＩＦ１８Ａ（ＨＰＡ０３９４８４、Ｓｉｍｇａ、１：２０００）及びマウス抗β－アクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｍｇａ、１：５０００）を含んだ。結果を図９に示す。
ブロットの画像を図９に示す。図９で示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理細胞は、サイクリンＢ１及びｃｌ－ＰＡＲＰタンパク質レベルの上昇及びＭｃｌ－１及びサイクリンＥ１レベルの低下を示した。また、ＫＩＦ１８Ａ及びＢｕｂＲ１タンパク質レベルの上昇も示す。図９において、「ＦＬ」は全長サイクリンＥ１タンパク質を指し、「ＬＭＷ」は、サイクリンＥ１の低分子量形態を指す。ＢｕｂＲ１タンパク質は、翻訳後修飾、例えばリン酸化された形態及び非修飾の形態に起因するタンパク質ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）としてブロットする。
結果から、ＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ細胞のＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理によって、細胞周期及び有糸分裂の進行（サイクリンＢ１、サイクリンＥ１、ＢｕｂＲ１、ＫＩＦ１８Ａ）及びアポトーシス（Ｍｃｌ－１、ｃｌ－ＰＡＲＰ）を制御するタンパク質の顕著な変化が示されることが示唆され、これらの変化は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性癌における標的結合のマーカーとなり得る。
実施例８
この実施例は、２つのＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理されたＴＮＢＣ細胞（ＴＰ５３突然変異体、ＲＢ１欠失）における有糸分裂、ＤＮＡ損傷及びアポトーシスに対する効果を示す。
有糸分裂における効果を分析するために、４ｍＬの完全増殖培地中で３つの複製ウェルにおいて１００，０００個／ウェルの密度で６ウェルプレートにＢＴ－５４９ ＴＮＢＣ細胞を播種した。翌日、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で４ｍＬの完全培地中でＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤＃１（化合物Ｃ１１、０．５μＭ）又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤＃２（化合物Ｃ９、０．０１μＭ）により細胞を処理した。４８時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓｐｈｏＳｔｏｐ、Ｒｏｃｈｅ）を供給して、ＭｉｎｕｔｅＴＭ総タンパク質抽出キット（ＳＤ－００１、Ｉｎｖｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶解条件を使用して、製造者のプロトコールに従い、各処理群に対して細胞溶解物を調製した（３ウェルから培地及び細胞を合わせた）。一次抗体は、ウサギ抗ｐ－ヒストンＨ３（セリン－１０）（０６－５７０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２０００）、マウス抗γＨ２Ａ．Ｘ（セリン－１３９）（０５－６３６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２０００）、マウス抗切断ＰＡＲＰ（ｃｌ－ＰＡＲＰ）（＃５１－９０００１７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）、マウス抗ＢｕｂＲ１（６１２５０３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５０００）、マウス抗トータルＨＥＣ１（ａｂ３６１３、ＡＢＣＡＭ、１：１０００）、ウサギ抗ｐＨＥＣ１（セリン－５５）（ＧＴＸ７００１７、Ｇｅｎｅｔｅｘ、１：５００）及びウサギ抗ＧＡＰＤＨ（２１１８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０，０００）を含んだ。ウエスタンブロットの画像を図１０Ａに示す。
また、ＢＴ－５４９ ＴＮＢＣ 細胞におけるｃＧＡＳ及びγＨ２Ａ．Ｘ（セリン－１３９）免疫染色を行った。完全増殖培地中で細胞５０，０００個／チャンバーの密度で細胞をＬａｂ－Ｔｅｋ ２－ウェルチャンバースライドに播種し、およそ５０％コンフルエンシーまで２日間増殖させた。２ｍＬの完全培地中でＤＭＳＯ（０．１％）、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９、０．２μＭ）で細胞を４８時間処理した。４％ホルムアルデヒド中で室温にて１５分間、細胞を固定し、続いて氷冷９０％メタノール中、４℃で１０分間２回目の固定を行った。固定後、２ｍＬの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘ ＰＢＳ）中で細胞を洗浄し、１ｍＬのブロッキング緩衝液（２滴のウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）／５ｍＬ洗浄緩衝液）でブロッキングした。１ｍＬの洗浄緩衝液中、室温で２時間、細胞を抗ｃＧＡＳウサギ抗体（１：５００、１５１０２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗γＨ２Ａ．Ｘ（セリン－１３９）マウス抗体（１：１０００、０５－６３６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色する。細胞を２ｍＬ洗浄緩衝液で２回洗浄した。遮光して室温で１時間、ＤＡＰＩ ＤＮＡ色素（１：５０００、２６８２９８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する洗浄緩衝液中で細胞を二次抗体［ヤギ抗マウスＩｇＧ－ａｌｅｘａ－４８８（１：２０００、Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ－５６８（１：２０００、Ａ１１０３６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］により染色した。細胞を２ｍＬで２回洗浄し、チャンバーを除去し、ＰｒｏＬｏｎｇ抗Ｆａｄｅ（Ｐ３６９３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の液滴を添加した後、ガラススライド上にカバースリップを載せた。エレメントソフトウェアを動作させて、正立Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＮＩ－Ｅエピ蛍光顕微鏡上で４０ｘ対物レンズを使用して広視野の画像を取得した。４０ｘ広視野対物レンズで撮影した代表的な画像を図１０Ｂで提供する。
図１０Ａで示されるように、ＴＰ５３突然変異体及びＲＢ１喪失ＴＮＢＣ細胞のＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処理によって、有糸分裂マーカー（ｐ－ヒストンＨ３、ｐ－ＨＥＣ１、ＢｕｂＲ１ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ））、ＤＮＡ損傷マーカー（γＨ２Ａ．Ｘ）及びアポトーシスマーカー（ｃｌ－ＰＡＲＰ）の発現上昇が起こり、このことから、ＫＩＦ１８Ａ阻害がＳＡＣ活性化を引き起こし、その結果、ＤＮＡ損傷及びアポトーシスが増加することが示唆され、これらの変化がＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性癌における標的結合のマーカーとなり得る。
図１０Ｂで示されるように、ｃＧＡＳ及び／又はγＨ２Ａ．Ｘについて陽性染色される細胞質微小核は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理がＤＮＡ損傷及びｃＧＡＳ陽性微小核の増加を引き起こすことを示唆し、これが免疫賦活細胞質ＤＮＡの源となり得る。
実施例９
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理した癌細胞での有糸分裂におけるＫＩＦ１８Ａタンパク質の局在の効果を分析するための実験を示す。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤で処理した癌細胞でのＫＩＦ１８Ａタンパク質局在の効果を分析するために、ＨｅＬａ細胞においてＫＩＦ１８Ａ及びセントリン－３免疫染色を行った（図１１）。完全増殖培地中で細胞１００，０００個／チャンバーの密度でＬａｂ－Ｔｅｋ ２ウェルチャンバースライドに細胞を播種し、およそ８０％コンフルエンシーまで２日間増殖させた。２ｍＬの完全培地中でＤＭＳＯ、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９、０．０５μＭ）により細胞を６時間処理した。室温で１５分間、細胞を４％ホルムアルデヒド中で固定し、続いて４℃にて１０分間、氷冷９０％メタノール中で２回目の固定を行った。固定後、２ｍＬの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘ ＰＢＳ）中で細胞を洗浄し、１ｍＬのブロッキング緩衝液（２滴のウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）／５ｍＬ洗浄緩衝液）中でブロッキングした。１ｍＬの洗浄緩衝液中で室温にて２時間、抗ＫＩＦ１８Ａウサギ抗体（１：３０００、Ａ３０１－０８０Ａ ０５－８０６、Ｂｅｔｈｙｌ）及び抗ＣＥＴＮ３マウス抗体（１：１０００、Ｈ００００１０７０－Ｍ０１、Ａｂｎｏｖａ）で細胞を染色する。細胞を２ｍＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。ＤＡＰＩ ＤＮＡ色素（１：５０００、２６８２９８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する洗浄緩衝液中の二次抗体［ヤギ抗マウスＩｇＧ－ａｌｅｘａ－４８８（１：２０００、Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ－５６８（１：２０００、Ａ１１０３６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］で室温にて１時間、遮光して細胞を染色した。細胞を２ｍＬで２回洗浄し、チャンバーを取り出し、ＰｒｏＬｏｎｇ抗Ｆａｄｅ（Ｐ３６９３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の液滴を添加し、その後、ガラススライド上にカバースリップを載せた。Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアで動作する正立Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＮＩ－Ｅエピ蛍光顕微鏡上で４０ｘ対物レンズを使用して広視野画像を取得した。免疫染色した有糸分裂細胞の代表的な画像を図１１に提供する。ＫＩＦ１８Ａは赤色で示され、セントリン－３は緑色で示される。
図１１に示すように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理の結果、有糸分裂におけるＫＩＦ１８Ａタンパク質の誤った局在が起こり、ＫＩＦ１８Ａタンパク質局在でのこれらの変化は、癌及び代替の増殖正常組織における標的結合のマーカーとなり得る。
実施例１０
この実施例は、雌無胸腺ヌードマウスでのヒトＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ腫瘍異種移植モデル（ＴＰ５３ＭＵＴ、ＣＣＮＥ１ＡＭＰ）において化合物Ｃ１４がｐ－ヒストンＨ３有糸分裂マーカーを誘導することを示す。
雌無胸腺ヌードマウスの右側腹部に０．１ｍＬ中細胞５×１０６個のＯＶＣＡＲ－３細胞を皮下注入した。腫瘍が確立された後（平均腫瘍体積４５０～７５０ｍｍ３）、群あたり動物３匹で５つの処置群（ビヒクル単独、３、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＦ１８Ａ阻害剤）へと動物を無作為に分けた。処置の２４時間後、薬物動態分析のために腫瘍及び血漿を回収し、薬力学的分析のために腫瘍を回収した。瞬間凍結、微粉砕及び溶解から腫瘍タンパク質溶解物を調製し、ＥｐｉＱｕｉｋ Ｔｏｔａｌ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＯＰ－０００６ Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）プロトコールを使用して処理した。ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（２３２２７，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、タンパク質溶解液濃度を決定した。ホスホ－ヒストンＨ３（セリン－１０）抗体（ｐＨＨ３）を使用したｓｉｎｇｌｅ－ｐｌｅｘ ＭＳＤアッセイのための製造者のプロトコールに従い、ｐＨＨ３ ＭＳＤ分析の処理された溶解緩衝液中（ｉｎ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ａ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｏｆ）、３０μｇ／ウェルでＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光免疫アッセイプレート上にウェルあたりの総タンパク質に対して正規化した溶解物を載せ、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｓ１６０００発光検出リーダー（ＭＳＤ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）上で分析した。溶解物を総タンパク質に対して正規化し、ｐＨＨ３の倍率誘導は、ビヒクル処置群の平均生ＭＳＤ値により除した群平均生ＭＳＤ値を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用してデータをプロットし、カラムグラフは、各処置群に対する平均ＲＵと平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表されるｐＨＨ３シグナルのレベルを示す。ビヒクル群に対する平均ベースラインｐＨＨ３シグナルと比較し、各ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置群に対してｐＨＨ３の倍率誘導を記す。血漿及び腫瘍におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤のマイクロモル濃度を右の垂直軸上で示す。一元ＡＮＯＶＡとそれに続くダネットの事後分析によって、統計学的な有意性を判定した（＊＊＊ｐ＝０．０００２、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の各用量（又はビヒクル対照）に対してｐ－ヒストンＨ３レベルを表す発光のグラフをプロットし、図１２で示す。グラフは、ＳＥＭとともに各処置群に対する平均ＲＵとして表されるｐ－ヒストンＨ３シグナルのレベルを示す。ビヒクル群に対する平均ベースラインｐ－ヒストンシグナルと比較し、各ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置群に対してｐ－ヒストンＨ３の倍率誘導を記す。血漿（▲）及び腫瘍（■）におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤の濃度（μＭ）は右垂直軸上に示す。一元ＡＮＯＶＡとそれに続くダネットの事後分析によって、統計学的な有意性を判定した（＊＊＊ｐ＝０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
図１２で示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、マウスでのＯＶＣＡＲ－３ ＨＧＳＯＣ（ＴＰ５３ＭＵＴ、ＣＣＮＥ１ＡＭＰ）腫瘍異種移植片においてｐ－ヒストンＨ３有糸分裂マーカーレベルの用量依存的な上昇を誘導した。これらのデータから、ｐ－ヒストンＨ３のレベル上昇が用量及び曝露依存的であったことが示唆され、ｐ－ヒストンＨ３が適切な薬力学的マーカーとなることが示され、ここでｐ－ヒストンＨ３シグナルのａ≧４．６倍誘導は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤用量≧１０ｍｇ／ｋｇでの腫瘍退縮と相関した。
実施例１１
この実施例は、本発明の方法で使用され得る代表的なＫＩＦ１８Ａ阻害剤を作製するための代表的な段階を記載する。
この実施例を通じて次の略語が使用され得る：
Figure 2023521802000057
別段の断りがない限り、全ての材料は、市販業者から入手し、さらに精製することなく使用した。別途指示しない限り、全ての部は、重量基準であり、温度は、摂氏温度単位である。全てのマイクロ波補助反応は、ＢｉｏｔａｇｅＴＭからのＳｍｉｔｈ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＴＭを用いて実施した。全ての化合物は、これらの割り当てられた構造に一致するＮＭＲスペクトルを示した。融点はＢｕｃｈｉ機器上で判定し、補正しない。質量スペクトルデータは、エレクトロスプレーイオン化技術により決定した。全ての実施例を、高速液体クロマトグラフィーで判定して＞９０％に精製した。特に明記しない限り、反応は室温で実行した。
本発明の化合物の合成では、特定の離脱基の使用が望ましいことがあり得る。「離脱基」（「ＬＧ」）という用語は、一般に、求核試薬によって置換可能な基を指す。そのような離脱基は、当技術分野において公知である。離脱基の例としては、ハロゲン化物（例えば、Ｉ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ）、スルホン酸塩（例えば、メシル酸塩、トシル酸塩）、スルフィド（例えば、ＳＣＨ３）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが挙げられるが限定されない。求核試薬の例としては、アミン、チオール、アルコール、グリニャール試薬、アニオン種（例えば、アルコキシド、アミド、カルバニオン）などが挙げられるが限定されない。
以下に示す実施例では、本発明の具体的な実施形態を例示する。これらの実施例は代表的なものであることを意味し、如何なる方法においても特許請求の範囲を限定することを意図しない。
パーセント（％）が液体に関して使用される場合、それは溶液に関する体積によるパーセントであることが認められる。固体とともに使用される場合、それは固体組成物に関するパーセントである。市販業者から得た材料は通常、さらに精製せずに使用した。空気又は湿気に感受性の試薬を含む反応は通常、窒素又はアルゴン雰囲気下で実施した。純度は、２５４ｎｍ及び２１５ｎｍでのＵＶ検出を有する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（システムＡ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ８ ４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ中５％から１００％のＣＨ３ＣＮ、１．５ｍＬ／分で１５分間；システムＢ：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ８、４．６ｘ７５ｍｍ、０．１％のギ酸を含むＨ２Ｏ中１０％から９０％のＣＨ３ＣＮ、１．０ｍＬ／分で１２分間）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して測定した。シリカゲルクロマトグラフィーは、一般的には、予め充填されたシリカゲルカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ又はＴｅｌｅｄｙｎｅ－Ｉｓｃｏ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いて実施した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、周囲温度で、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ－４００（４００ ＭＨｚ）分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＶａｒｉａｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）４００ＭＨｚ分光計上で記録した。全ての観察されたプロトンは、指定される適切な溶媒中のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）又は他の内部標準からの百万分率（ｐｐｍ）低磁場として報告される。データを以下の通り報告する：化学シフト、多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｂｒ＝ブロード、ｍ＝多重項）、結合定数及び陽子数。低解像度質量スペクトル（ＭＳ）データは、２５４ｎｍ及び２１５ｎｍでのＵＶ検出並びに低共鳴エレクトロスプレーモード（ＥＳＩ）を有するＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）ＬＣ／ＭＳ上で決定された。
中間体化合物中間体１～１３の調製：
中間体１：２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－アミン
Figure 2023521802000058
 ＮＭＰ（４６０ｍＬ、１０．００ｍＬ／ｇ）中２－クロロ－６－メチルピリミジン－４－アミン（４６ｇ、３２０ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、４，４－ジフルオロピペリジン塩酸塩（７６ｇ、４８１ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＤＩＰＥＡ（１６６ｍＬ、９６１ｍｍｏｌ）の混合物をオートクレーブ（１Ｌ）に入れ、１８０℃で３０時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水（５００ｍＬ）で反応停止させ、酢酸エチル（２ｘ１０００ｍＬ）で抽出した。有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料をシリカゲルのプラグに吸着させ、シリカゲル（６０～１２０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、溶出液としてヘキサン中５０％から１００％Ｅで溶出して、生成物を得た。これを酢酸エチル（５００ｍＬ）に再溶解し、水（２ｘ５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。黄色の固形物をヘキサン（４００ｍＬ）中でもう一度懸濁し、３０分間撹拌した。スラリーをろ過し、ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させ、淡黄色の固体として表題化合物を得た（５８ｇ、収率７９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．３３（ｓ，２Ｈ），５．６３（ｓ，１Ｈ），３．８０ － ３．７８（ｄｄ，Ｊ＝６．８，４．７Ｈｚ，４Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．９５ － １．８５（ｔｔ，Ｊ＝１４．２，５．７Ｈｚ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２２９．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体２：６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－アミン
Figure 2023521802000059
 １，４－ジオキサン（５００ｍＬ）中の６－フルオロピリジン－２－アミン（５０ｇ、４５０ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ）の溶液に窒素雰囲気下で３，３，３－トリフルオロプロパン－１－オール（１０２ｇ、８９２ｍｍｏｌ、Ａｐｏｌｌｏ）を添加し、反応物を０℃に冷却した。０℃でＮａＨ（鉱物油中６０％、４２．８ｇ、１７８０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、得られた混合物を９０℃で２ｈ撹拌した。反応混合物を冷水（５００ｍＬ）で反応停止させ、酢酸エチル（２ｘ１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。その粗製残渣を、ヘキサン中１０％の酢酸エチルを用いた、シリカゲル（６０～１２０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、淡褐色の油状物質として表題化合物（４５ｇ、５０％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．３０ － ７．２６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０２ － ６．００（ｄｄ，Ｊ＝７．８，０．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８９ － ５．８６（ｍ，３Ｈ），４．３６ － ４．３３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７９ － ２．６７（ｑｔ，Ｊ＝１１．５，６．２Ｈｚ，２Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２０７．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体３：６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－アミン
Figure 2023521802000060
 段階１：オートクレーブに、ＮＭＰ（８００ｍＬ）中、２，６－ジクロロ－４－メチルピリジン（８０ｇ、４９０ｍｍｏｌ）、４，４－ジフルオロピペリジン塩酸塩（８６ｇ、５４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３４２ｍＬ、１９８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８０℃で２４時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、１０％水性ＮａＨＣＯ３溶液でｐＨ～９に塩基性化した。その反応混合物を、酢酸エチル（２ｘ１５００ｍＬ）で抽出し、水（１５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。ヘキサン中５～１０％の酢酸エチルを用いて、シリカゲル（６０～１２０メッシュ）上でのカラムクロマトグラフィーによりその粗製物を精製して、２，６－ジクロロ－４－メチルピリジン及び２－クロロ－６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジンの１：３の比率の混合物（１０２ｇ）を淡褐色の油状物質として得た。溶出液として水中６０％のアセトニトリルを使用した逆相クロマトグラフィーによってこの混合物（１０２ｇ）をさらに精製して、２－クロロ－６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン（７０ｇ、５８％収率）を淡褐色の液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ６．７６（ｓ，１Ｈ），６．５７（ｓ，１Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．０３ － １．９１（ｍ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２４７．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階２：１，４－ジオキサン（３００ｍＬ）中の２－クロロ－６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン（３０．０ｇ、１２２ｍｍｏｌ）の溶液に、（４－メトキシフェニル）メタンアミン（２３．８ｍＬ、１８２ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（７９ｇ、２４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を脱気し、窒素で３０分間パージした。ＢＩＮＡＰ（７．５７ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）及び酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．７３ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、１００℃で１６時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通してろ過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮した。ＥｔＯＡｃ（２ｘ５００ｍＬ）を用いて残渣を抽出し、水（５００ｍＬ）、次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル（６０～１２０メッシュ）上、ヘキサン中５～８％の酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィーにより、粗製残渣を精製して、６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）－４－メチルピリジン－２－アミン（４８ｇ、７６％収率）を黄色の油状物質として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．２２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．３１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．９０ － １．８０（ｍ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３４８．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階３：乾燥ジクロロメタン（４８０ｍＬ）中の６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）－４－メチルピリジン－２－アミン（４８．０ｇ、１３８ｍｍｏｌ）の溶液にアニソール（３０．２ｍＬ、２７６ｍｍｏｌ）及びＴＦＡ（２４０ｍＬ、３１２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５５℃で４時間撹拌し、減圧下で濃縮した。水（２００ｍＬ）中で残渣を溶解させ、１０％重炭酸ナトリウム水溶液を用いてｐＨ～８まで塩基性にし、酢酸エチル（２ｘ５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（２００ｍＬ）、次いでブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、減圧下で濃縮した。ヘキサン中２５％～３５％の酢酸エチルを使用して、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより粗製残渣を精製して、６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－アミン（ＬＣＭＳ～約８５％）を褐色の油状物質として得た。水中５０～６０％のアセトニトリルを使用した逆相クロマトグラフィーによりこの物質をさらに精製して、６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－アミン（１６．５ｇ、７２ｍｍｏｌ、５３％収率）を褐色の油状物質として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ５．８６（ｓ，１Ｈ），５．６５（ｓ，１Ｈ），５．４８（ｓ，２Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．９６ － １．８７（ｍ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２２８．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体４：３－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－５－メチルアニリン
Figure 2023521802000061
 段階１：トルエン（５０ｍＬ）中１－ブロモ－３－メチル－５－ニトロベンゼン（５ｇ、２３．１４ｍｍｏｌ）、４，４－ジフルオロピペリジン（４．２１ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（６．６７ｇ、６９．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２．１２ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）及びキサントホス（１．３４ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮し、石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、４，４－ジフルオロ－１－（３－メチル－５－ニトロフェニル）ピペリジン（３．７０ｇ、１４．４４ｍｍｏｌ、収率６２％）を灰色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ｐｐｍ ７．５５（ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．９６ － ２．０４（ｍ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２５７．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階２：ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）及び水（７ｍＬ）中で４，４－ジフルオロ－１－（３－メチル－５－ニトロフェニル）ピペリジン（３．７ｇ、１４．４４ｍｍｏｌ）、鉄粉（８．０６ｇ、１４４ｍｍｏｌ）及び塩化アンモニウム（７．７２ｇ、１４４ｍｍｏｌ）の混合物を７５℃で１６時間撹拌した。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）パッドに通して反応混合物をろ過し、メタノールで洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮し、石油エーテル中３０～４０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、３－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－５－メチルアニリン（２．６ｇ、１１．４９ｍｍｏｌ、収率８０％）を褐色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ｐｐｍ ６．００（ｓ，２Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．１６ － ３．２２（ｍ，４Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），１．９４ － ２．０４（ｍ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２２７．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体５：４－メチル－６－モルホリノピリジン－２－アミン
Figure 2023521802000062
 ２５０ｍＬの加圧管に、６－フルオロ－４－メチルピリジン－２－アミン（１０．０ｇ、７９ｍｍｏｌ、Ｓｉｂｉａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｈｉｎａ）、モルホリン（８．２９ｇ、９５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４１．５ｍＬ、２３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５０℃で１８時間加熱した。反応混合物を水（１００ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（２ｘ２５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルのプラグに粗製残渣を吸収させ、Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐの予め充填したシリカゲルカラム（４０ｇ）に通すフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、ヘキサン中ＥｔＯＡｃを１％から１５％の勾配で溶出して、表題化合物（８．５ｇ、４４．０ｍｍｏｌ、５６％収率）を褐色の半固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ５．７５（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｓ，１Ｈ），５．４４（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），３．３０（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：１９４．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体６：４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸
Figure 2023521802000063
 ＤＭＳＯ（２．１Ｌ）中の２－フルオロ－４－ヨード安息香酸（３００ｇ、１．１３ｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の溶液に、２０℃で６－アザスピロ［２．５］オクタン塩酸塩（２１６ｇ、１．４７ｍｏｌ、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ）を添加した。続いて、Ｋ２ＣＯ３（４６８ｇ、３．３８ｍｏｌ）を添加し、反応溶液を１４０℃にてＮ２下で４８時間撹拌した。反応溶液を氷水（４．２０Ｌ）中にゆっくりと注入し、次いでヘキサン（２Ｌｘ３）で抽出した。水相を分離し、ＨＣｌ（２Ｍ）でｐＨ＝６に調整した。固形物を沈殿させ、回収した。固形物を水（７００ｍＬｘ３）で洗浄し、ろ過した。湿潤固形物を大型の時計皿上に広げ、２５℃の大気中で７２時間乾燥させた。４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸（２８０ｇ、７７７ｍｍｏｌ、６９％収率）を淡黄色の固体として得た。４００ ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６δ ｐｐｍ８．０７（ｓ，１Ｈ），７．７６ －７．６６（ｍ，２Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），１．５５（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．４１（ｓ，４Ｈ）．
中間体７：４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸
Figure 2023521802000064
 段階１：ガラスマイクロ波反応容器（２０ｍＬ）中で、ＤＭＳＯ（１５．０ｍＬ）中の４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸メチル（２．０ｇ、５．３９ｍｍｏｌ、中間体７に対して記載されるものと同様に得られる）の溶液に、ピロ亜硫酸カリウム（２．４０ｇ、１０．７８ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＢ（１．９１ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（０．８１ｇ、１１．８５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．２１２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）、１，１０－フェナントロリン（０．１４６ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）及び酢酸パラジウム（０．０６０ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を脱気し、窒素で１０分間パージした。反応容器を密封し、７０℃で３時間加熱した。反応混合物をＲＴに冷却し、３－ヨードオキセタン（２．３９ｇ、１２．９７ｍｍｏｌ）を添加し、１２０℃で４時間撹拌した。反応混合物を水（１００ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（２ ｘ １００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル（６０～１２０メッシュ）のプラグに粗製残渣を吸着させ、Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐの予め充填されたシリカゲルカラム（４０ｇ）を通すシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、ヘキサン中１％から４０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出して、４－（オキセタン－３－イルスルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸メチル（３６０ｍｇ、収率１５％）を黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ７．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝７．４，６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔｔ，Ｊ＝８．４，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．２２ － ３．１０（ｍ，４Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），０．３８（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３６６．１ ［Ｍ＋１］．
段階２：ＴＨＦ（５ｍＬ）中の４－（オキセタン－３－イルスルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸メチル（３５０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（ヘキサン中１．０Ｍ溶液、１．９２ｍＬ、１．９１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、－７８℃で添加し、１時間撹拌した。ヨードメタン（７１．９μＬ、１．１５ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加し、ＲＴまでゆっくりと温めた。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗製残渣をシリカゲル（６０～１２０メッシュ）のプラグに吸着させ、Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐの予め充填されたシリカゲルカラム（１２ｇ）を通すシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、ヘキサン中１％から５０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出して、４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸メチル（２６０ｍｇ、収率７２％）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ７．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．２４ － ３．１２（ｍ，４Ｈ），１．７０（ｓ，３Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，４Ｈ），０．４０（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３８０．２ ［Ｍ＋１］．
段階３：ＴＨＦ（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）及びメタノール（１ｍＬ）中の４－（（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸メチル（２５０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（６３ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＴで５時間撹拌した。反応混合物を１．５Ｎ ＨＣｌでｐＨ～４に酸性化した。水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ５０ｍＬ）で抽出し、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、４－（（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸（２００ｍｇ、収率８３％）を灰白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １６．０１（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），１．６０ － １．５２（ｍ，７Ｈ），０．４１（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３６６．２ ［Ｍ＋１］．
中間体８：６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチン酸。
Figure 2023521802000065
 段階１：２，６－ジフルオロニコチン酸（１０．６ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）及び塩化チオニル（３５ｍＬ、４８０ｍｍｏｌ）を窒素下で合わせ、穏やかな還流になるように２時間加熱した。溶液を減圧下で濃縮乾固させた。トルエン（１００ｍＬ）を粗製物に添加し、それをもう一度蒸発乾固させた。粗製酸塩化物を窒素下でＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解させ、氷浴中で冷却した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２５ｍＬ、１８０ｍｍｏｌ）及びベンジルアルコール（７．２５ｍｌ、７０．１ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間にわたり滴下し、混合物をｒｔで３０分間撹拌した。次に、０．１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ）を添加し、相を混合し、分離させた。有機相を取り、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させて、ベンジル２，６－ジフルオロニコチネートを得て、それを精製せずに使用した。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：２５０．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階２：窒素下でＴＨＦ（１５ｍＬ）中で４，４－ジメチルオキサゾリジン－２－オン（０．８０ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）を溶解させた。カリウムｔ－ブトキシド（０．７５ｇ、６．６８ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液をＲＴで５分間撹拌した。Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（４０ｍＬ）中のベンジル２，６－ジフルオロニコチナート（１．６０ｇ、６．４２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物をＲＴで１０分間撹拌した。水（７５ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）及び飽和塩化アンモニウム（２５ｍＬ）を添加し、相を混合し、分離させた。有機相を取り、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で蒸発乾固させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタンからＥｔＯＡｃの勾配）による精製により、ベンジル６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－フルオロニコチネート（１．８２ｇ、５．２９ｍｍｏｌ、８２％の収率）を白色の固体として得た。
段階３：ベンジル６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－フルオロニコチネート（１．８１ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍＬ）中で溶解させた。炭酸セシウム（２．００ｇ、６．１４ ｍｍｏｌ）及び６－アザスピロ［２．５］オクタン（０．６０ｇ、５．４０ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで１８時間撹拌した。水（１００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）を添加し、相を混合し、分離させた。有機相を取り、ブラインで洗浄し、減圧下で蒸発乾固させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン中０％～４０％ＥｔＯＡｃ）を用いた精製により、ベンジル６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチナート（１．７７ｇ、４．０６ｍｍｏｌ、７８％の収率）を乳白色の油状物質として得た。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：４３６．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
段階４：ベンジル６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチネート（１．７７ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中で溶解させ、圧力容器に移した。エタノール（６０ｍＬ）を添加した後、５％のパラジウム炭素（乾燥重量、５０％の水、０．２５０ｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を添加した。４０ｐｓｉの水素下で１５分間、懸濁液を撹拌した。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドに通してろ過し、固形物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液を減圧下で蒸発乾固させて、６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチン酸（１．１５ｇ、３．３３ｍｍｏｌ、８２％収率）を白色の固体として得た。ｍ／ｚ （ＥＳＩ）：３４６．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
中間体９：Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000066
 ４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸（１５０．０ｇ、４２０ｍｍｏｌ、中間体６）をアルゴン下でジクロロメタン（１０００ｍＬ）中で懸濁した。１０分間にわたり、触媒ＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加し、続いてジクロロメタン（５００ｍＬ）中の塩化チオニル（５４．６ｇ、２８ｍＬ、４５９ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）溶液を滴下した。周囲温度で３０分間撹拌した後、混合物を減圧下で蒸発乾固させた。アルゴン下で、粗製物をトルエン（２ｘ３００ｍＬ）と共沸させ、ジクロロメタン（３００ｍＬ）中で懸濁した。三塩基性リン酸カリウム（２６７ｇ、１．２６ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、続いてＤＣＭ（３００ｍＬ、５分間にわたり添加）中２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－アミン（１００ｇ、４３８ｍｍｏｌ、中間体４）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００ｍＬ、１．１４ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の溶液を添加した。黄色混合物を周囲温度で３時間撹拌し、続いて減圧下で蒸発乾固させた。粗製固体をジクロロメタン（１Ｌ）中で懸濁し、１０分間撹拌した。混合物をフリットに通してろ過し、固体を追加のジクロロメタン（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。固形物を廃棄し、ろ液を減圧下で蒸発乾固させた。粗製残渣をアセトニトリル（７５０ｍＬ）中で懸濁し、周囲温度で１５分間撹拌した。懸濁液をガラスフリットに通してろ過し、固形物をさらなるアセトニトリル（７５ｍＬ）で洗浄した。固体を窒素流下で乾燥させて、Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドを得た（１８６ｇ、３２８ｍｍｏｌ、収率７８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １３．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）７．７２ － ７．８７（ｍ，３Ｈ）７．３９（ｓ，１Ｈ）３．９１（ｂｒ ｓ，４Ｈ）２．９９ － ３．０６（ｍ，４Ｈ）２．３２（ｓ，３Ｈ）１．９２ － ２．０７（ｍ，４Ｈ）１．６２ － １．８５（ｍ，４Ｈ）０．３８（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５６８．０（Ｍ－Ｈ）＋．
中間体９に対して記載されたものと同様の手順に従い、中間体１０～１３を調製した。
Figure 2023521802000067
実施例Ｃ１及びＣ２：２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｒ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド及び２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｓ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド
Figure 2023521802000068
 段階１：２０ｍＬのマイクロ波容器に、Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（１．００ｇ、１．７６２ｍｍｏｌ、中間体１９）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．１６１ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）及び４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチル－キサンテン（０．１０２ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、続いて１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）を入れた。得られた混合物を撹拌し、窒素で５分間パージした後、窒素下で１，１’－ジメチルトリエチルアミン（０．６１６ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）、続いてシクロプロパンチオール（０．１４２ｍＬ、１．９３９ｍｍｏｌ）を添加した。容器を密封し、マイクロ波条件に供した（１０時間、９０ｏＣ）。粗製混合物をシリカゲルプレカラム上に直接載せ、４０ｇのＩＳＣＯゴールドカラム上でＭｅＯＨ／ＤＣＭで２回溶出する（０％で５分、及び０％から６％で２５分）コンビフラッシュカラムクロマトグラフィーに供して、灰白色の固体として４－（シクロプロピルチオ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（０．９２ｇ、１．７９１ｍｍｏｌ、収率１０２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ジクロロメタン－ｄ２）δ ｐｐｍ １３．３３（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），７．２２－７．３５（ｍ，２Ｈ），３．９１－４．０９（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．１８Ｈｚ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．１７－２．２８（ｍ，１Ｈ），１．６２－２．１０（ｍ，６Ｈ），１．５２（ｓ，２Ｈ），１．１３－１．２１（ｍ，２Ｈ），０．６８－０．７６（ｍ，２Ｈ），０．４０（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５１４．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階２：ＭｅＯＨ（４．５ｍＬ）及びジクロロメタン（９．０ｍＬ）中の４－（シクロプロピルチオ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（０．８９ｇ、１．７３３ｍｍｏｌ）と炭酸アンモニウム（０．２５０ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）との撹拌溶液に、固体として（アセチルオキシ）（フェニル）－ヨーダニルアセテート（１．２８４ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた混合物をｒｔの開放空気中で１８時間撹拌した。得られた混合物をシリカゲルプレカラム（２５ｇ）上に直接載せ、４０ｇのＩＳＣＯゴールドカラム上のコンビフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出して（０％で３分、及び０％から１４％で２５分）、灰白色の固体として４－（シクロプロパンスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドのラセミ混合物（０．９５ｇ、１．７４４ｍｍｏｌ、収率１０１％）を得た。６０ｍＬ／分の流速を用い、５０％液体ＣＯ２及び５０％ＭｅＯＨの移動相でＲｅｇｉｓ（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ－０１（２５０ｘ２１ｍｍ、５ｍｍ）を用いた分取ＳＦＣを介してエナンチオマーを分離し、以下を生成させた：
実施例Ｃ１：２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｒ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド第１溶出ピーク、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ １３．２０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．７３Ｈｚ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ ＝８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝１．４５Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ＝１．６６，８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），４．０３（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝５．２９Ｈｚ，４Ｈ），２．５３－２．６３（ｍ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｓ，３Ｈ），１．９５－２．１０（ｍ，４Ｈ），１．５３－１．８９（ｍ，５Ｈ），１．４５（ｔｄｄ，Ｊ＝５．０８，６．９２，１０．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．２０－１．３０（ｍ，１Ｈ），１．０７－１．１７（ｍ，１Ｈ），０．９３－１．０３（ｍ，１Ｈ），０．４４（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５４５．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例Ｃ２：２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－４－（Ｒ－シクロプロピルスルホンイミドイル）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロ－１－ピペリジニル）－６－メチル－４－ピリミジニル）ベンズアミド。第２溶出ピーク。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ １３．２０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．７３Ｈｚ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝１．４５Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ＝１．６６，８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），４．０３（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝５．２９Ｈｚ，４Ｈ），２．５３－２．６３（ｍ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｓ，３Ｈ），１．９５－２．１０（ｍ，４Ｈ），１．５３－１．８９（ｍ，５Ｈ），１．４５（ｔｄｄ，Ｊ＝５．０８，６．９２，１０．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．２０－１．３０（ｍ，１Ｈ），１．０７－１．１７（ｍ，１Ｈ），０．９３－１．０３（ｍ，１Ｈ），０．４４（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５４５．２（Ｍ＋Ｈ）＋．立体化学の割り当ては任意であった。
実施例Ｃ３：４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－Ｎ－（６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000069
 ２－ヒドロキシエタン－１－スルホンアミド（０．７４１ｇ、５．９２ｍｍｏｌ、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ）、サルコシン（０．１７２ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．２４１ｇ、１．２６ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、炭酸カリウム（２．７８ｇ、２０．１ｍｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－Ｎ－（６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－イル）ベンズアミド（２．７４ｇ、５．０２ｍｍｏｌ、中間体３８）をアルゴン下で、脱気した乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中で合わせ、５０分間１３０ｏＣに加熱した。反応物を周囲温度まで冷却し、水（１００ｍＬ）及び酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、相を混合し、分離させた。有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１：８、２ ｘ ７５ ｍＬ）で洗浄し、減圧下で蒸発乾固させた。粗製生成物をトルエン（３０ｍＬ）中で懸濁し、９０ｏＣに１５分間加熱した。混合物を周囲温度に冷却し、固形物をろ別し、窒素気流下で乾燥させた。白色の固形物を水（１００ｍＬ）中で懸濁し、２０分間、９０ｏＣに加熱した。混合物を冷却して周囲温度とし、固形物を窒素気流下に乾燥させて、４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）－Ｎ－（６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリジン－２－イル）ベンズアミド（２．４１ｇ、４．４４ｍｍｏｌ、８８％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １３．１８（ｓ，１Ｈ），１０．１９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．７２Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．９６Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝１．９９Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０７，８．６４Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝７．９６Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．５２（ｔ，Ｊ＝６．１２Ｈｚ，２Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝６．４３Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．４３Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．７４Ｈｚ，４Ｈ），２．８０－２．８７（ｍ，２Ｈ），１．７４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．３９（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５４３．２．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例Ｃ４：Ｎ－（６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000070
 ＤＭＦ（２０ｍＬ）の中の、４－ブロモ－Ｎ－（６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ、中間体２７）、２－スルファモイル酢酸メチル（０．３６１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ）、リン酸カリウム（１．２３ｇ、５．７８ｍｍｏｌ）、（１Ｒ，２Ｒ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．１３７ｇ、０．９６３ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（０．１８３ｇ、０．９６３ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で１６ｈ加熱した。次に、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のプラグに通して反応混合物をろ過した。ＥｔＯＡｃを用いてろ液を希釈し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、石油エーテル中０％から４０％の勾配のＥｔＯＡｃで溶出させて、Ｎ－（６－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－４－メチルピリジン－２－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（０．５８０ｇ、１．０２ｍｍｏｌ、５３％収率）を灰白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １２．８５（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ），３．７４（ｄｔ，Ｊ＝１２．５，６．２Ｈｚ，６Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），１．９９（ｔｔ，Ｊ＝１３．６，５．４Ｈｚ，３Ｈ），１．７９（ｓ，４Ｈ），１．６０（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．３８（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５６４．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例Ｃ５及びＣ６：（Ｒ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド及び（Ｓ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000071
 段階１：ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のエチル２－スルファモイルプロパノアート（１．４４ｇ、７．９３ｍｍｏｌ、中間体２２）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．５０３ｇ、２．６４ｍｍｏｌ、Ｓｔｒｅｍ）、サルコシン（０．４７ｇ、５．２９ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びリン酸カリウム（４．４９ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下に置き、５分間かけて５０ｏＣに昇温させた。Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（３．０ｇ、５．２９ｍｍｏｌ、中間体１９）を添加し、混合物を３時間１００ｏＣに加熱し、続いて室温に冷却した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、ＩＰＡ（５ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を添加し、混合物を５分間激しく撹拌した。得られた二相混合物を分液漏斗に移して層を分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、次に、合わせた抽出物を水（２ｘ５０ｍＬ）、９：１ＮＨ４Ｃｌ／ＮＨ４ＯＨ（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮して油状物質を得た。Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐの予め充填されたシリカゲルカラム（８０ｇ）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗製油状物質を精製し、０から５０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン勾配で溶出して、白色の固体としてエチル２－（Ｎ－（４－（（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）カルバモイル）－３－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）フェニル）スルファモイル）プロパノアートを得た（２．７６ｇ、４．４５ｍｍｏｌ、収率８４％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １３．３５（ｓ，１Ｈ）１０．６９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）８．０７（ｄ，Ｊ＝８．７１Ｈｚ，１Ｈ）７．４０（ｓ，１Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝１．８７Ｈｚ，１Ｈ）７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．６０，１．９７Ｈｚ，１Ｈ）４．０６（ｑｄ，Ｊ＝７．０８，４．８７Ｈｚ，２Ｈ）３．９２（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．４９Ｈｚ，４Ｈ）２．９８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，４Ｈ）２．３２（ｓ，３Ｈ）１．８５ － ２．０６（ｍ，５Ｈ）１．７３（ｂｒ ｓ，４Ｈ）１．４８（ｄ，Ｊ＝６．８４Ｈｚ，３Ｈ）１．１４（ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ，３Ｈ）０．３９（ｓ，４Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ －９４．７５（ｓ，１ Ｆ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：６２１．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
段階２：２５０ｍＬの丸底フラスコに、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のエチル２－（Ｎ－（４－（（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）カルバモイル）－３－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）フェニル）スルファモイル）プロパノアート（１０．３９ｇ、１６．７４ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素リチウム溶液（ＴＨＦ中２．０Ｍ、１６．７ｍＬ、３３．５ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加した。メタノール（４．２９ｍＬ、１３４ｍｍｏｌ）を５分間かけてゆっくりと添加し、得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ（２０ｍＬ）をゆっくりと添加し、次にＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を添加して、得られた二相混合物を分液漏斗に移して相を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（１ｘ２５ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ５０ｍＬ）、ブライン（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、８．９ｇのラセミ混合物を得た。この材料を、１５０ｍＬ／分の流速を使用して、０．２％のＴＥＡ入りの８５％液体ＣＯ２及び１５％ＭｅＯＨの移動相を用いて、Ｃｈｉｒａｌ Ｔｅｃｈ ＡＤカラム（２５０ｘ３０ｍｍ、５ｍｍ）をした分取ＳＦＣによって分離し、以下を得た：
実施例Ｃ５：（Ｒ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド。第１溶出ピーク（３．５０ｇ、６．０５ｍｍｏｌ、収率３６．１％、＞９９％ｅｅ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １３．３６（ｓ，１Ｈ）８．０５（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，１Ｈ）７．４０（ｓ，１Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝１．８７Ｈｚ，１Ｈ）７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．７１，２．０７Ｈｚ，１Ｈ）３．８８ － ３．９７（ｍ，４Ｈ）３．８４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９９，４．３５Ｈｚ，１Ｈ）３．３７ － ３．５４（ｍ，１Ｈ）３．２５ － ３．３０（ｍ，１Ｈ）２．９７（ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，４Ｈ）２．３２（ｓ，３Ｈ）１．８４ －２．０６（ｍ，４Ｈ）１．５７ － １．８４（ｂｒ ｓ，４Ｈ）１．３０（ｄ，Ｊ＝６．８４Ｈｚ，３Ｈ）０．３９（ｓ，４Ｈ）．２個の交換可能なプロトンは観察されなかった。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ －９４．７４（ｓ，１ Ｆ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５７９．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例Ｃ６：（Ｓ）－Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシ－１－メチルエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド。第２溶出ピーク（２．６６ｇ、４．６０ｍｍｏｌ、収率２７．５％、９８．９％ｅｅ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １３．３５（ｓ，１Ｈ）８．０５（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，１Ｈ）７．４０（ｓ，１Ｈ）７．３１（ｄ，Ｊ＝２．０７Ｈｚ，１Ｈ）７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．６０，１．９７Ｈｚ，１Ｈ）３．８８ － ３．９７（ｍ，４Ｈ）３．８４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９９，４．３５Ｈｚ，１Ｈ）３．５０（ｄｄ，Ｊ＝１０．９９，７．４６Ｈｚ，１Ｈ）３．２５ － ３．３２（ｍ，１Ｈ）２．９７（ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，４Ｈ）２．３１（ｓ，３Ｈ）１．８３ － ２．０６（ｍ，４Ｈ）１．７３（ｂｒ ｓ，４Ｈ）１．３０（ｄ，Ｊ＝６．８４Ｈｚ，３Ｈ）０．３９（ｓ，４Ｈ）．２個の交換可能な陽子は観察されなかった。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ －９４．７５（ｓ，１ Ｆ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５７９．２（Ｍ＋Ｈ）＋．立体化学を任意に割り当てた。
実施例Ｃ７：Ｎ－（３－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－５－メチルフェニル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000072
 ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４－ブロモ－Ｎ－（３－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－５－メチルフェニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（０．５ｇ、０．９６ｍｍｏｌ、中間体２０）、リン酸カリウム（０．６１４ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、２－ヒドロキシエタン－１－スルホンアミド（０．１８１ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、（１Ｒ，２Ｒ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．０６９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（０．０９２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を氷水で反応停止させ、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）ベッドに通してろ過し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮し、石油エーテル中４０％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ－（３－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－５－メチルフェニル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（０．３１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ、収率５６％）を灰白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ｐｐｍ １１．５５（ｓ，１Ｈ），１０．０９（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１２ － ７．１６（ｍ，３Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｓ，１Ｈ），４．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３０ － ３．３４（ｍ，６Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，４Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．００ － ２．１０（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．３６（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５６３．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例Ｃ８：Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000073
 ＤＭＦ（２ｍＬ）中の４－（（３－メチルオキセタン－３－イル）スルホニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）安息香酸（１２０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、中間体１５）の溶液に、ＨＡＴＵ（１８７ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１４３μＬ、０．８２１ｍｍｏｌ）をＲＴで添加し、１０分間撹拌した。この反応混合物に、３－アミノ－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）ベンゼンスルホンアミド（８２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＴで１２時間撹拌した。反応混合物を水（２０ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（３ｘ２５ｍＬ）により抽出した。合わせた有機抽出物をブライン溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗製残渣を精製して、表題化合物（１１０ｍｇ、収率５８％）を灰白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ １２．３３（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０６ － ７．９５（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｓ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ），１．７３（ｓ，３Ｈ），１．７０ － １．６０（ｂ ｓ，３Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ），０．４８（ｓ，４Ｈ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５７６．２ ［Ｍ＋１］．
実施例Ｃ９は、上記実施例Ｃ８の調製と同様に調製した：
Figure 2023521802000074
実施例Ｃ１０：Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド。
Figure 2023521802000075
 段階１：１００ｍＬの丸底フラスコに、６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチン酸（５４９ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ、中間体１１）及びＤＣＭ（８ｍＬ）を入れた。ＲＴで反応混合物に二塩化オキサリル（１．４３ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ、ＤＣＭ中２Ｍ）を添加した後、数滴のＤＭＦを添加した。混合物をｒｔで１時間撹拌し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解させ、３－アミノ－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）ベンゼンスルホンアミド（０．３８ｍＬ、１．６７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．３９ｍＬ、７．９５ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物をＲＴで１８時間撹拌し、その後、それを水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによって濃縮物を精製し、ヘプタン中０％から６０％のＥｔＯＡｃで溶出して、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド（７０３ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、８０％収率）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ，陽イオン）ｍ／ｚ：５５６．１［Ｍ＋１］．
段階２：ガラスバイアルに、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（４，４－ジメチル－２－オキソオキサゾリジン－３－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド（７０３ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）及び水酸化ナトリウム（１．２６ｍＬ、６．３３ｍｍｏｌ、５Ｎ）を入れた。７０℃で１時間撹拌し、ＲＴに冷却し、溶媒を真空下で除去した。半飽和ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）との間で残渣を分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗製物をシリカゲルのプラグに吸収させ、Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐプレパックシリカゲルカラムを通したクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中０％から６０％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出して、Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミド（４８５ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、７２％収率）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １１．２１（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｔ，Ｊ＝１．４５Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄｔ，Ｊ＝７．８８，１．４５Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．７１Ｈｚ，１Ｈ），７．５０ － ７．５７（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｄｔ，Ｊ＝７．８８，１．４５Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｔ，Ｊ＝５．７０Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝５．８１Ｈｚ，２Ｈ），３．１１ － ３．１７（ｍ，４Ｈ），１．４４ － １．５１（ｍ，４Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ），１．１２（ｓ，９Ｈ），０．３１（ｓ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ，陽イオン）ｍ／ｚ：５３０．２ ［Ｍ＋１］．
実施例Ｃ１１：実施例Ｃ１０の調製と同様に調製した：
Figure 2023521802000076
実施例Ｃ１２～Ｃ１３：実施例Ｃ３の調製と同様に調製した：
Figure 2023521802000077
実施例Ｃ１４：Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド
Figure 2023521802000078
 １００ｍＬの丸底フラスコ中の２－ヒドロキシエタン－１－スルホンアミド（１．２８ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．４９ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、三塩基性リン酸カリウム（５．４４ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）及びサルコシン（０．４８ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下に置いた。無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）を添加し、混合物を５分間かけて５０ｏＣに昇温させた。固体としてＮ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－ヨード－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（２．９１ｇ、５．１３ｍｍｏｌ、中間体１９）を添加し、混合物を１００ｏＣに加熱し、２時間撹拌し、続いて室温まで冷却した。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）を添加し、得られた二相混合物を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出した。次に合わせた有機抽出物を水（２ｘ）、９：１ＮＨ４Ｃｌ／ＮＨ４ＯＨ（ａｑ）、ブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空濃縮して油状物質を得た。シリカゲルクロマトグラフィーによって油状物質を精製し、０％から５０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン勾配、続いて５０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン定組成溶出液で溶出して、灰白色の固体を得た。この固体をメタノール中で懸濁し、ろ過し、乾燥させて、白色の固体を得た。次に水中でこの固体を懸濁し、２４時間撹拌し、ろ過し、真空下で乾燥させて、白色の固体としてＮ－（２－（４，４－ジフルオロピペリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミド（１．５５ｇ、２．７５ｍｍｏｌ、収率５４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １３．３７（ｓ，１Ｈ）１０．０３ － １０．５２（ｍ，１Ｈ）８．０６（ｄ，Ｊ＝８．７１Ｈｚ，１Ｈ）７．４１（ｓ，１Ｈ）７．２８（ｄ，Ｊ＝１．８７Ｈｚ，１Ｈ）７．１５（ｄｄ，Ｊ＝８．７１，１．８７Ｈｚ，１Ｈ）４．７３ － ５．１４（ｍ，１Ｈ）３．９２（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．３９Ｈｚ，４Ｈ）３．７７（ｔ，Ｊ＝６．４３Ｈｚ，２Ｈ）３．３４ － ３．４０（ｍ，２Ｈ）２．９８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．５６Ｈｚ，４Ｈ）２．３２（ｓ，３Ｈ）１．９３ － ２．０７（ｍ，４Ｈ）１．５８ － １．８５（ｍ，４Ｈ）０．４０（ｓ，４Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ －９４．７４（ｓ，１ Ｆ）．ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５６５．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
当業者は、当技術分野で公知の従来からの技術を使用することにより、本発明の化合物を、それらの対応する薬学的に許容可能なその塩に変換し得ることを理解する。例えば、代表的な化合物Ｃ－１～Ｃ－１４をそれらの対応するＨＣｌ塩に変換するために、当業者は、適正な当量の塩酸を使用し、任意選択的に結晶化段階及び乾燥段階を行い、ＨＣｌ塩を単離することを理解する。
実施例１２
本発明の方法において使用され得る代表的なＫＩＦ１８Ａ化合物を試験することにおいて、続くアッセイを使用した。下記の手順に従って試験されるそれらの実施例に対するデータは、下の表４において提示される。
ＫＩＦ１８Ａ酵素アッセイ：微小管刺激ＡＴＰａｓｅ活性アッセイを使用して、化合物で処理した後のＫＩＦ１８Ａ酵素活性を測定した。化合物は、２２点濃度範囲にわたって、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ）中で連続２倍希釈した。バキュロウイルス系を用いて組み換えヒトＫＩＦ１８Ａ（１－４６７ Ｈｉｓタグ付き）タンパク質を発現させ、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃによる親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＡＤＰ－ＧｌｏＴＭキナーゼ／ＡＴＰａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ）を用いて、反応中のＫＩＦ１８Ａタンパク質、微小管（ＭＴ）及びＡＴＰの濃度を標準化均質酵素アッセイに最適化した。アッセイは、ＡＴＰａｓｅ反応から形成されたＡＤＰを測定する。反応緩衝液を調製する［（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＪＴ Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ）、０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）、１μＭタキソール（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ Ｉｎｃ）及び３０μｇ／ｍＬブタ微小管（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ Ｉｎｃ）］。調製した反応緩衝液に化合物及びＫＩＦ１８Ａタンパク質（３０ｎＭ）を添加し、ＲＴで１５分間温置し、次にＡＴＰ（Ｋｍで７５μＭ）を反応混合物に添加し、ＲＴでさらに１５分間温置する。５μｌのＡＤＰ－ＧｌｏＴＭ試薬及び２．５μｌの反応混合物を混合し、ＲＴで４０分間温置する。１０μｌのＡＤＰ－ＧｌｏＴＭ検出試薬を添加し、ＲＴで４０分間温置する。ウルトラ－ルミネセンスモジュール（ｕｌｔｒａ－ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｄｕｌｅ）を備えたＥｎＶＪｉｓｉｏｎマイクロリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ）を使用して発光を読み取る。４パラメーターロジスティック回帰適合モデルを備えたＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｔａｎｄａｒｄ １５．０．１，Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｉｎｃ）を用いて濃度反応曲線フィッティング及びＩＣ５０決定を実施した。
表４は、本発明の方法で使用され得る代表的なＫＩＦ１８Ａ化合物として本願において例示される化合物に対するデータを次のように提供する：化合物名及び生物学的データ（入手可能な場合はｕＭでのＩＣ５０。Ｅｘ．＃は実施例番号を指す）。
Figure 2023521802000079
実施例１３
この実施例は、多剤耐性ＴＰ５３ＭＵＴＨＧＳＯＣ細胞におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤活性を示す。
抗有糸分裂阻害剤、例えばタキサンに対する耐性は、首尾よい癌の処置に対する複雑な要因であり、ＭＤＲ－１によりコードされる遺伝子及びその産物、Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の発現上昇と関連することが多い。実施例１で示されるように、ＫＩＡ１８Ａ阻害剤に対する感受性を示した全ての細胞株が、突然変異体ＴＰ５３癌細胞株であった。ここで、ＴＰ５３ＭＵＴ癌細胞株における多剤耐性の存在下又は非存在下でＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置に対する感受性を評価する。
Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の阻害剤、エラクリダル（ＧＦ１２０９１８）あり又はなしで処理したＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ／ＡＤＲ細胞を使用したことを除き、実施例１に基本的に記載のように４日間の画像に基づく核カウントアッセイ（ＮＣＡ）においてＫＩＦ１８Ａ阻害剤、化合物Ｃ１４を評価した。ＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ－ＡＤＲ細胞は、抗癌剤に対する多剤耐性を誘導することが知られている薬物ポンプＭＤＲ１又はＡＢＣＢ１遺伝子（Ｐ－糖タンパク質をコードする）を過剰発現する（Ａ Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８：１１；２２１－３７）。比較目的のために、化合物Ｃ１４ ＮＣＡと並んで、同じＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ／ＡＤＲ細胞におけるパクリタキセルの４日間の画像に基づくＮＣＡを行った。簡潔に述べると、Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＦｌａｔ Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｂｌａｃｋポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において１００μＬの適切な完全培地中、適切な密度でＯＶＣＡＲ－８細胞を２つ組で播種し、２４時間増殖させた。１セットのプレートにおいて、化合物Ｃ１４又はパクリタキセル単独の濃度を１００μＬの完全培地中に連続希釈し、次いで０．５％ＤＭＳＯを含有する完全培地中２００μＬの最終体積で細胞に添加した。第２のセットのプレートにおいて、１００μＬの完全培地中に連続希釈した化合物Ｃ１４又はパクリタキセル単独の濃度とともに培地にＰ－ｇｐ阻害剤ＧＦ１２０９１８（１μＭ）を添加し、次いで細胞に０．５％ＤＭＳＯを含有する完全培地中の２００μＬの最終体積で細胞に添加した。処置の４日（９６時間）後、１００μＬの完全培地を各ウェルから除去し、それを１００μＬの２ｘホルムアルデヒド（最終４％）で置き換え、室温で１５分間プレートを温置することにより、細胞を固定した。固定後、細胞を透過処理し、２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ＤＮＡ色素を含有する２００μＬの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘ ＰＢＳ）中で染色した。プレートを密封し、暗所にて室温で１時間温置した。データ取得まで細胞を暗所にて４℃で保管した。Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ４ アッセイプロトコール（１０Ｘ対物レンズを使用してＶｅ６．６．０（Ｂｕｉｌｄ ８１５３）、ウェルあたり１６視野を回収）を使用して、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳ リーダー（ＳＮ０３０９０７４５Ｆ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でイメージングデータを取得した。ＤＭＳＯで処置した対照の±３ＳＤ内であったＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核対象物特性（チャンネル１での、面積、総強度及び可変強度）を使用して、有効対象物カウントを決定した。総有効対象物カウントは、次の式を使用して、カウントＰＯＣ（ＤＭＳＯ対照のパーセンテージ）として表した：
カウントＰＯＣ＝（処理したウェルにおける総有効対象物カウント）÷（ＤＭＳＯ処理したウェルにおける総有効対象物カウント）ｘ１００
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用して化合物濃度及びカウントＰＯＣ値をプロットし、４－パラメーター式（可変勾配）を用いて曲線フィッティングを行った。濃度反応曲線及び標準偏差は、２つ組で行った２回の独立した実験に相当する。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤ＮＣＡ及びパクリタキセルＮＣＡの結果を図１３Ａ及び１３Ｂでそれぞれ示す。Ｐ－ｇｐ阻害剤の非存在下で、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤のＥＣ５０は、Ｐ－ｇｐ阻害剤存在下でのＫＩＦ１８Ａ阻害剤のＥＣ５０よりも約１０倍高く、一方でＰ－ｇｐ阻害剤の非存在下でのパクリタキセルのＥＣ５０は１μＭよりも高く、Ｐ－ｇｐ阻害剤の存在下でのパクリタキセルのＥＣ５０はかなり低かった（０．００１７μＭ）。Ｐ－ｇｐ阻害剤の存在下対Ｐ－ｇｐ阻害剤の非存在下でのＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４の効力の倍率変化は１０未満であり、一方で、Ｐ－ｇｐ阻害剤の存在下対Ｐ－ｇｐ阻害剤の非存在下でのパクリタキセルの効力の倍率変化は５００より大きかった。これらの結果は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が癌細胞を、多剤耐性癌細胞でさえも、効果的に処置可能であることを示唆する。
実施例１４
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置が正常な体細胞に対して最小効果を有することを示す。
ＢｒｄＵ、ヌクレオシドチミジンの類似体が増殖する細胞を同定するために使用される５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイを介して、ヒト骨髄単核細胞（ＨＢＭＮＣ）、初代ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＳＦ）及びヒト乳腺上皮細胞の増殖をアッセイすることによって、正常な体細胞（例えば新生物細胞ではない）の増殖におけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置の効果を試験した（Ｐａｙｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１７（１２）：２５７５－８５（２０１８））。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上で細胞を分析し、ＦＳＣ－Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ）を使用して取得後のデータ分析を行った。積み上げＤＮＡ含量ヒストグラムにおけるＢｒｄＵ陽性ゲート事象（ｇａｔｅｄ ｅｖｅｎｔ）のパーセンテージを報告した。
代表的なフローサイトメトリーの結果を図１４Ａに示す。図１４Ａで示されるように、化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１の何れかに対する細胞周期ＤＮＡ含量プロファイルは、Ｓｕｂ－Ｇ１（＜２Ｎ）集団の増加（細胞死を示す）を含め、細胞周期ＤＮＡ含量プロファイルに対する顕著な効果を全てが示したイスピネシブ（Ｅｇ５）、抗有糸分裂剤（パクリタキセル）又はＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）で処理された細胞とは反対に、ＤＭＳＯ処理された細胞と同様である。
ＨＢＭＮＣに対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理の効果をさらに調べるために、ＢｒｄＵと連結された細胞周期アッセイ及び細胞カウントアッセイ（９６時間）を使用して、２つの正常なドナーを評価した。図１４Ｂに示されるように、最初のドナーからの細胞で見られる増殖に対する効果が、第２のドナーからの細胞において反復された。特に、イスピネシブ、パクリタキセル又はＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）で処理されたＢｒｄＵ染色された増殖する細胞の量は、ビヒクル対照で処理されたＢｒｄＵ染色細胞の量よりもかなり少なかった。その一方で、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤、化合物Ｃ９又は化合物Ｃ１１の何れかで処理された細胞に組み込まれたＢｒｄＵの量は、ビヒクル対照で処理されたＢｒｄＵ染色細胞とほぼ同じであった。生存細胞カウントに対する影響についてもＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理を分析した。９６時間後、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって生細胞をカウントした。図１４Ｃに示されるように、イスピネシブ（Ｅｇ５）、抗有糸分裂剤（パクリタキセル）又はＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）で処理された細胞は、ビヒクル対照で処理された細胞と比較して、より少ない細胞数となったが、一方でＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９、化合物Ｃ１１）で処理された細胞は、正常な細胞カウントにあまり又は全く影響がなかった。図１４Ｄ及び１４Ｅで示されるように、ｈＦＳＦ及びヒト乳腺上皮（ＨＭＥＣ）細胞におけるＢｒｄＵ取り込みに対する効果は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、濃度＜１０μＭ ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ１１）で影響を受けなかった。対照的に、イスピネシブ（Ｅｇ５）、又はＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）で処理した細胞においてＢｒｄＵ取り込みの減少が観察された。これらの結果から、他の抗癌剤とは異なり、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性癌細胞に対して効果的な濃度で正常な体細胞において増殖に影響を与えないことが示唆される。
正常な体細胞に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置の影響を判定するために、イメージングアッセイも行った。下記のようにヒトＦＳＦ細胞を用いてＡｒｒａｙｓｃａｎ ＶＴｉ 多重イメージングアッセイを行った。簡潔に述べると、９６ウェルイメージングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において細胞６０００個／ウェルで正常ヒト包皮線維芽細胞を播種し、一晩培養した。翌日、ＤＭＳＯ又は、１０μＭ（ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１１、ヌトリン－３ａ）、１μＭ（ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９、ＢＩ－２５３６、イスピネシブ、パクリタキセル）又は５μＭ（パルボシクリブ、ＧＳＫ９２３２９５）の最大濃度での３倍希釈を使用した９点の濃度範囲にわたる試験薬物のパネルを用いて、２つの複製９６ウェルプレートを処理した。処置の４８時間後、固定前に１枚のプレートにＢｒｄＵ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３時間一時的に適用した。９６ウェルプレートの両方を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で固定し、洗浄緩衝液［ＰＢＳ、１％ＢＳＡ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）］で２回洗浄した。酸洗浄を使用してＢｒｄＵエピトープ検出のために第１の９６ウェルプレートを処理し、ウマ血清（４滴の血清／１０ｍＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を加えた洗浄緩衝液中で４ｏＣにて一晩ブロッキングし、抗ＢｒｄＵ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（Ｂ３５１４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、マウス、３μｇ／ｍＬ）及び抗ｐ２１（１２Ｄ１）（２９４７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギ、１：４００）抗体で室温にて２時間染色した。細胞を洗浄緩衝液中で２回洗浄し、二次抗体［抗ウサギ－ＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８（Ａ１１０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）］で染色し、１時間にわたり室温で温置した。第２の９６ウェルプレートに対して、ウマ血清（４滴の血清／１０ｍＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を加えた洗浄緩衝液中で４ｏＣにて一晩ブロッキング処理を行い、抗ｃｌ－ＰＡＲＰ（２１４／２１５）（４４－６９８６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウサギ、１：１５００）及び抗γＨ２ＡＸ（０５－６３６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マウス、１：１０００）抗体で室温にて２時間染色した。細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、二次抗体［抗ウサギ－ＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（Ａ２１２４５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）、抗マウス－ＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８（Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）］で染色し、１時間にわたり室温で温置した。両方の９６ウェルプレートを２回洗浄し、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）核色素で対比染色した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での広視野イメージングによって、２０Ｘ対物レンズを使用して、６４視野／ウェルからイメージングデータを回収した。各ウェルに対して有効核対象物カウントを決定し、並びに各試験剤の濃度及びＤＭＳＯ対照に対してＢｒｄＵ、ｐ２１、ｃｌ－ＰＡＲＰ及びγＨ２ＡＸ陽性対象物のパーセンテージを決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖ７．０．４）を使用して、濃度反応ヒートマップを作成した。
結果を図１５Ａ～１４Ｅに示す。図１５Ａ～１５Ｂに示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ１１又は化合物Ｃ９）で処理された細胞は、総対象物カウント及びＢｒｄＵ取り込みに関して、ビヒクル対照処理細胞のように挙動し、これにより、細胞増殖に対する最小効果が示された。図１５Ｃ～１５Ｅで示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ１１又は化合物Ｃ９）で処理した細胞は、ｃｌ－ＰＡＲＰ発現により測定されるアポトーシスの誘導を示さなかったか（図１５Ｃ）、ｐ２１タンパク質発現の誘導により測定される細胞周期抑止を示さなかったか（図１５Ｄ）、又はγＨＨ２Ｘ発現の上昇により測定されるＤＮＡ損傷の誘導を示した（図１５Ｅ）。全ての比較物薬剤が、ＤＭＳＯ対照に対してこれらのマーカーの１つ以上を誘導した。これらの結果は、他の抗癌剤とは異なり、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が正常な体細胞において増殖に影響を与えないことを示唆する。
まとめると、これらの結果は、対象における正常な体細胞の増殖の実質的な低下がないこと及び／又は正常な体細胞のアポトーシスの実質的な増加がないことにより判定されるように、正常な体細胞において毒性を示すことなく、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果が癌細胞特異的であり、正常な体細胞において又は正常な体細胞上では毒性が殆どないか又は全くないこと及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置が、新生物疾患を処置するため、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する感受性を維持するため、腫瘍退縮を誘導するか又は向上させるため、腫瘍又は癌の成長を低減させるため、及び／又は腫瘍又は癌細胞の死を誘導するか又は増加させるために有効であることを示唆する。
実施例１５
この実施例は、ＫＩＦ１８Ａ遺伝子発現を低下させるＲＮＡに基づくＫＩＦ１８Ａ阻害剤を示す。
この試験での使用のために３つの異なるベンダー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ａｍｂｉｏｎ）から一連の７つのＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡを得た。それぞれ陰性対照及び陽性対象とするために、非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡ及びＥｇ５（ｈＫＩＦ１１）ｓｉＲＮＡも得た。ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を表５で挙げる。
Figure 2023521802000080
ＢＴ－５４９及びＨＭＥＣ細胞におけるウエスタン分析によって、各ｓｉＲＮＡのＫＩＦ１８Ａノックダウン効率を試験した。簡潔に述べると、ウェルあたり細胞２．０ｘ１０５個で６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＢＴ－５４９及びＨＭＥＣ細胞を播種し、一晩培養した。翌日、１０ｎＭの個々のＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ（ｎ＝７）又はＮＴＣ ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ＿２）を用いて、製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ＲＮＡｉＭａｘ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、細胞をＲＮＡ－脂質複合体で処理した。４８時間後、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して細胞溶解物を調製し、ウエスタン分析のために処理した。各レーンで等しいタンパク質負荷量を示すために、β－アクチンのレベルをアッセイした。有糸分裂フラクション陽性対照としてノコダゾールで一晩処理したＨｅＬａ細胞を使用し、アポトーシス陽性対照としてスタウロスポリンで処理したＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。
図１６で示されるように、各ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ（ＫＩＦ１８Ａ＿１～ＫＩＦ１８Ａ＿７）は、ＨＭＥＣ及びＢＴ－５４９細胞においてＫＩＦ１８Ａタンパク質発現を効果的に枯渇させ、一方で対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ＿２）を遺伝子移入した細胞はベースラインのＫＩＦ１８Ａ発現を示し、予想されるとおり、ＨｅＬａ細胞有糸分裂フラクションは、高レベルのＫＩＦ１８Ａ発現を示した。これらのデータは、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤、例えばＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡなどが、正常体細胞（非癌性）乳腺上皮細胞でのアポトーシスの証拠なく、ＢＴ－５４９乳癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
実施例１６
この実施例は、癌細胞におけるＲＮＡに基づくＫＩＦ１８Ａ阻害剤の効果を探索する。
ｓｉＲＮＡ介在性のＫＩＦ１８Ａ枯渇により誘導される感受性及び表現型のパターンを決定するために、８種類の癌細胞株（７種類の乳房、１種類の卵巣）並びに１種類の正常ヒト乳腺上皮細胞株（ＨＭＥＣ）のパネルを構築した。腫瘍サブタイプ及び遺伝学的背景（ＴＰ５３、ＲＢ１、ＣＣＮＥ１）に基づいて癌細胞株を選択した。
イメージングに基づく核カウントアッセイを使用して、４日間処理した細胞において、非標的化対照（ＮＴＣ、ｎ＝９）及び細胞傷害性対照（ＫＩＦ１１（Ｅｇ５）、ｎ＝２）の効果と比較して、ＫＩＦ１８Ａに対する個々のｓｉＲＮＡの抗増殖効果を決定するために、パネルを使用した（ｎ＝７）。＞５０％の細胞増殖阻害が観察された場合、細胞をＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ感受性があるものとしてみなした。図１７Ａ～１７Ｂで示されるように、全ての３種類のＣＣＮＥ１増幅株、ＨＣＣ－１８０６（ＴＮＢＣ）、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７（ＴＮＢＣ）、ＯＶＣＡＲ－３（ＨＧＳＯＣ）において、及びＲＢ１欠失ＢＴ－５４９ＴＮＢＣ株において、ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ感受性が観察された。ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ非感受性の乳癌細胞株は、ＴＰ５３野生型（４つのうち３）、ＲＢ１プロフィシェント（４つのうち４）、エストロゲン受容体の状況（４つのうち２つがＥＲ陽性）及び（４つのうち２つがＥＲ陰性）であった。ほぼ正常の核型であるＴＰ５３野生型ＣＡＬ－５１ ＴＮＢＣ細胞は、ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡに対して非感受性であり、並びに正常ＨＭＥＣ株も非感受性であり、これは不死化ヒト網膜色素上皮細胞株（ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ１）での知見と一致する。対照的に、及び予想されるように、Ｅｇ５ ｓｉＲＮＡは、細胞株パネルにわたり細胞傷害性であり、それにより、体細胞分裂に対するその不可欠性が示される（図１７Ａ）。ＮＴＣ対照と比較したＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡの結果は、図１７Ａで提供し、表（図１７Ｂ）で要約し、まとめの表は、細胞株情報、遺伝学的背景及びＫＩＦ１８Ａ対ＮＴＣ ｓｉＲＮＡ群の統計学的評価（ｔ－検定）及び細胞増殖の低下のレベルを含有する。ＫＩＦ１８Ａタンパク質発現は細胞株のパネルにわたり変動し、感受性との直接的な相関は示されなかった（図１７Ｃ）。
まとめると、これらの結果は、ＫＩＦ１８Ａ発現を枯渇させるＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡが、ＴＰ５３、ＣＣＮＥ１及びＲＢ１に関しては特定の遺伝学的背景の癌細胞において選択的な抗増殖活性を示し、その結果がより早期の観察と一致することを示す（例えば実施例１～１０）。これらの結果は、ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡが、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖を阻害することが可能であることも裏付ける。
実施例１７
この実施例は、実施例１５及び１６で用いられた材料及び方法を記載する。
細胞株。全てのヒト癌細胞株は、別段の指定がない限り、ＡＴＣＣ又はＤＳＭＺ（ＧｍｂＨ）から得た。細胞株は、短い縦列反復（ＳＴＲ）ＤＮＡ分析を使用してＡＴＣＣにより確認され、ＡＴＣＣ又はＥｘＰａｓｙ ＳＴＲデータベースに対して参照された。正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）はＬｏｎｚａ Ｉｎｃ．から購入した。全ての細胞株培養物は、５％ＣＯ２の雰囲気下で３７ｏＣにて維持した。
イメージングアッセイ
ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴｉ核カウントアッセイ（ｓｉＲＮＡ）。ｌｏｇ相細胞増殖について個々に最適化された密度で９６ウェルイメージングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において細胞株（ＨＣＣ－１８０６、ＢＴ－５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７、ＯＶＣＡＲ－３、ＭＣＦ－７、ＣＡＬ－５１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－１、ＨＭＥＣ）のパネルを播種した。翌日、製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、１０ｎＭの個々のｓｉＲＮＡ［ＫＩＦ１８Ａ（ｎ＝７）、Ｅｇ５（ｎ＝２）、ＮＴＣ（ｎ＝９）、（表５）で詳述するｓｉＲＮＡ］及び０．３μＬ ＲＮＡｉＭａｘ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＮＡ－脂質複合体で細胞を処理した。４日後、４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で細胞を固定し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、洗浄緩衝液［ＰＢＳ、１％ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）］中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）核色素で染色した。Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１０Ｘ対物レンズを備えたＣｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、有効核対象物（対照ウェルに対する平均核対象物面積の３ＳＤ内）を数え上げ、ウェルあたり１６カ所の画像視野に対して有効な核対象物カウントデータを回収した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してグラフ描出及び統計学的分析を行った。データは、２つ組で行った２回の独立した実験からの、集計された個々のｓｉＲＮＡカウントデータからの平均核カウント及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す［ＫＩＦ１８Ａ（ｎ＝２８）、Ｅｇ５（ｎ＝８）、ＮＴＣ（ｎ＝３６）］。ＮＴＣ及びＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ群と比較して独立ｔ－検定を使用して有意性を計算した。
ウエスタン分析：
ウエスタン分析法。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤のカクテル（Ｒｏｃｈｅ）が添加されたＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）又はＭｉｎｕｔｅＴＭ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の何れかを使用して、非接着及び接着細胞フラクションを組み合わせることによって、細胞溶解液を調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素結合法（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して総タンパク質濃度を決定し、溶解物を－８０℃で保管した。タンパク質サイズに基づいてＴｒｉｓ－グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質を分離し、ＰＤＶＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。オービタル振盪機上で室温にて６０分間、タンパク質膜を１０ｍＬのブロッキング緩衝液［洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０）、５％粉乳（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎｓ）、３滴のウマ血清（マウス抗体に対して、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）又はヤギ血清（ウサギ抗体に対して、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）］中で温置した。一次抗体をブロッキング緩衝液に添加し、オービタル振盪機上で４℃にて一晩温置した。膜を３回洗浄し（各１５分）、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ（ＰＫ－４００２（マウス）、ＰＫ－４００１（ウサギ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して二次抗体処理を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてタンパク質検出を行い、その後、フィルム（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で膜を発色させた。
ウエスタン分析抗体。抗切断型ＰＡＲＰ（ｃｌ－ＰＡＲＰ）（５１－９０００１７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、マウス、１：５００）、抗βアクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ、マウス、１：５０００）、抗ＫＩＦ１８Ａ（ＨＰＡ０３９４８４、Ｓｉｇｍａ、ウサギ、１：２０００）。
ベースラインＫＩＦ１８Ａ及びＣｙｃｌｉｎ Ｅ１発現の評価。ｌｏｇ相細胞増殖について個々に最適化された密度で６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞株のパネルを播種した。およそ８０％コンフルエンシーで細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して細胞溶解液を調製し、上記のようにウエスタン分析のために処理した。
ＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡノックダウン効率の評価。６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において細胞２．０ ｘ １０５個／ウェルでＨＭＥＣ及びＢＴ－５４９細胞を播種し、一晩培養した。翌日、１０ｎＭの個々のＫＩＦ１８Ａ ｓｉＲＮＡ（ｎ＝７）又はＮＴＣ ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ＿２）を用い、製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ＲＮＡｉＭａｘ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＲＮＡ－脂質複合体で細胞を処理した。個々のｓｉＲＮＡにおける情報を表５で示す。４８時間後、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して細胞溶解液を調製し、上記のようにウエスタン分析のために処理した。０．１μｇ／ｍＬのノコタゾール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で一晩処理したＨｅＬａ細胞を有糸分裂フラクション陽性対照として使用した。ｃｌ－ＰＡＲＰ陽性対照としてＪｕｒｋａｔ細胞を１ｕＭのスタウロスポリンで２４時間処理した。
実施例１８
この実施例は、１つ以上の全ゲノム倍加（ＷＧＤ）事象を含むＴＰ５３ＭＵＴヒト乳癌及び卵巣癌株がＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理に対する強化と相関することを示す。
５９種類の乳癌及び卵巣癌細胞株を含んだＰＲＩＳＭ分子バーコード化癌細胞株パネルを使用して、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９をスクリーニングした（Ｃｈａｎｎｉｎｇ Ｙｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１６ Ａｐｒ；３４（４）：４１９－２３，Ｓｔｅｖｅｎ Ｍ Ｃｏｒｓｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０ Ｆｅｂ；１（２）：２３５－２４８）。簡潔に述べると、５日間、化合物Ｃ９（８点、２．５μＭ～０．００１μＭ）でプールバーコード化細胞株を処理した。曲線フィッティング分析を行い、曲線下面積（ＡＵＣ）生存率の値を各細胞株に対して計算した。各癌細胞株に対するＷＧＤ状況のコールをＱｕｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ ＢｉｏＲｘｉｖ，２０２０．０６．１８．１５９０９５；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０６．１８．１５９０９５から得た。前出のＱｕｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０に従い、０、１又は２のＷＧＤスコアを各細胞株に対して割り当てた。この相関分析において、癌細胞株を２つの群：ＷＧＤ陰性（ＷＧＤ事象が０）又はＷＧＤ陽性（１又は２つのＷＧＤ事象）のうち１つに割り当てた。各癌細胞株に対するＴＰ５３状況コールをＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｍａｐ（ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＤｅｐＭａｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ２０Ｑ２）から得た。「ＴＰ５３ホットスポット」状況コールは、細胞株がＴＰ５３突然変異を有することを示し、「ＴＰ５３他」の状況コールは、細胞株が野生型状況を有することを示した。次に、各細胞株に対するＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９のＡＵＣ値を４つの群：（１）ＴＰ５３他ＷＧＤ（－）、（２）ＴＰ５３他ＷＧＤ（＋）、（３）ＴＰ５３ホットスポットＷＧＤ（－）及び（４）ＴＰ５３ホットスポットＷＧＤ（＋）にグラフ化した。化合物Ｃ９ ＡＵＣ 生存率の値が低いほど、細胞株はＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理に対して感受性が高かった。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性を示すために、＜０．６５のＡＵＣ閾値を設定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データ及び統計学的検定（独立ｔ－検定、ＴＰ５３ホットスポットＷＧＤ（－）対ＷＧＤ（＋））のグラフを作成した。結果を図１８に示す。
図１８に示されるように、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性は、ＴＰ５３ＭＵＴ癌細胞においてＷＧＤ陽性事象と統計学的に有意に相関し（ｐ－値＝０．０００４４）、このことから、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、１つ以上のＷＧＤ事象を含むＴＰ５３ＭＵＴ癌細胞の増殖を低下させ、及び／又はアポトーシスを誘導することが示唆される。これらのデータは、ＴＰ５３ＭＵＴプラス１つ以上のＷＧＤ事象があるヒト癌がＫＩＦ１８Ａ阻害剤療法に反応性があると思われることを裏付ける。
実施例１９
この実施例は、３種類のＫＩ１８Ａ阻害剤の特徴付けを記載する。
３種類のＫＩＦ１８Ａ阻害剤（化合物Ｃ９、化合物Ｃ１１及び化合物Ｃ１２）を合成し、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤活性についてインビトロで試験した。図１９Ａは、ＫＩＦ１８Ａモーター活性のＡＤＰ－Ｇｌｏ濃度反応プロファイルを示す（ＤＭＳＯ対照と比較したＭＴ－ＡＴＰａｓｅ発光シグナルとして表される（ＰＯＣ））。値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。図１９Ａに示されるように、３種類のＫＩＦ１８Ａ阻害剤Ｃ９、Ｃ１１及びＣ１２は全て、強力なヒトＫＩＦ１８Ａ阻害剤活性を示した。Ｃ９、Ｃ１１及びＣ１２に対するＩＣ５０はそれぞれ０．１８０μＭ、０．０７μＭ及び０．０４μＭであった。マウスにおけるインビボ試験を計画したので、化合物Ｃ９及びＣ１２のマウスＫＩＦ１８Ａ阻害剤効果をアッセイした。マウスにおける化合物Ｃ９及びＣ１２に対するＩＣ５０はそれぞれ０．２３２μＭ及び０．０３９μＭであり、従って、Ｃ９及びＣ１２のＫＩＦ１８Ａ阻害効果はマウス及びヒトＫＩＦ１８Ａモーターに対して基本的に同等であることが示された。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９及びＣ１１に対して、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤の癌細胞株感受性プロファイルを決定した。様々な癌細胞株の細胞をＤＭＳＯ又はＣ９若しくはＣ１１の漸増濃度で９６時間処理した。Ｃ９に対する癌細胞株の代表的な濃度反応プロファイルを図４Ｃ～４Ｆで提供する。Ｃ１１に対するいくつかの癌細胞株（例えばＢＴ－５４９、ＯＶＣＡＲ－３を含む）の濃度反応プロファイルは同様であった。ＫＩＦ１８Ａ阻害剤感受性細胞（例えばＯＶＣＡＲ－３及びＢＴ－５４９）におけるＣ９及びＣ１１に対する平均カウントＥＣ５０値は、それぞれ０．０２１μＭ及び０．０４７μＭであった。癌細胞株ＣＡＬ－５１、ＭＤＡ－ＭＧ－４５３及びＯＶＣＡＲ－５は、Ｃ９及びＣ１１に対して非感受性であった。興味深いことに、Ｃ９及びＣ１１に対する感受性プロファイルは、ＣＤＫ４／６阻害剤と逆であった：ＫＩＦ１８Ａ阻害剤Ｃ９及びＣ１１に対して感受性であった癌細胞株は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性であり、一方でＫＩＦ１８Ａ阻害剤Ｃ９及びＣ１１に対して非感受性であった癌細胞株は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性であった。
化合物Ｃ９、Ｃ１１及びＣ１２のＫＩＦ１８Ａ阻害活性が細胞状況へ変換されるか否かを調べるために、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７細胞におけるｐＨ３及びＰＣＭスポットＥＣ５０値を決定し、その結果から、有糸分裂のエンドポイント間でのほぼ完璧な効力アライメント（ｐｏｔｅｎｃｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が示された。実際に、対照化合物と比較して、化合物Ｃ１１（＞７０倍）、化合物Ｃ９（＞４５０倍）及び化合物Ｃ１２（＞１２０倍）について細胞能力が劇的に向上した。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置後の反応の耐久性をより詳細に理解するために、６日間の細胞増殖アッセイにおいて、全ての５種類のＫＩＦ１８Ａ阻害剤に感受性がある癌細胞株をＤＭＳＯ又は化合物Ｃ１１で処理し、生存している細胞を洗浄し、回収し、カウントし、薬物不含培地中で再播種し、さらに７～９日間培養した。細胞分裂停止の比較基準としてＣＤＫ４／６阻害剤で処理したＭＣＦ－７細胞を含めた。予想されるように、化合物Ｃ１１での処理は、細胞増殖及びコロニー形成の顕著な減少を示し、特に、化合物Ｃ１１に予め曝露された細胞は、ＤＭＳＯ対照と比較して顕著な細胞増殖能低下を示し、ＣＤＫ４／６阻害剤とは異なった。ＨＣＣ－１８０６及びＢＴ－５４９細胞がＫＩＦ１８Ａ阻害剤中止後に他の細胞株と比較して、より高い再増殖能を示したことに注目されたい。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤がこの正常な細胞傷害性障壁を回避し得るか否かを調べるために、発明者らは、周期を回す正常な体細胞タイプのパネルに対する化合物Ｃ９及びＣ１１の影響を調べた。最初に、発明者らは、４８時間（細胞周期）又は９６時間（細胞増殖）にわたり、２名の正常ドナー由来のヒト骨髄単球細胞（ＨＢＭＮＣ）をＤＭＳＯ、１μＭの化合物Ｃ９及びＣ１１、０．０５μＭのイスピネシブ、０．０５μＭのパクリタキセル又は１μＭのパルボシクリブ処理した。注目すべきこととして、細胞周期分析から、明らかに細胞傷害性であった３種類の比較薬剤、イスピネシブ及びパクリタキセルとは異なり、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処理は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＢｒｄＵ取り込み（ＤＮＡ合成の直接的な目安）の減少が最小であったことが明らかになり、一方でＣＤＫ４／６阻害剤は細胞分裂阻害性が高かった。９６時間での細胞増殖分析は、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤及びＤＭＳＯ対照の両方について同等の細胞カウントを示し、一方でイスピネシブ及びパクリタキセルについては細胞増殖の明らかな低下が観察され（約８８％低下）、パルボシクリブではその程度が比較的小さかった（６８％低下）。
両方のＫＩＦ１８Ａ阻害剤による観察される腫瘍ＰＤ効果の結果、腫瘍有効性が得られるか否かを確立するために、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍（１３０ｍｍ３、ｎ＝１０）があるヌードマウスにビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ９又は２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｃ１２を連続１８日にわたり１日１回ＩＰ投与した。際立って、Ｃ９及びＣ１２の両方が、それぞれ７３％及び４６％の腫瘍退縮を誘導した（ｐ＜０．０００１）（図１９Ｂ）。Ｃ９及びＣ１２処置は、マウスにおいて忍容性に優れ、体重減少又は血球数（好中球、網状赤血球、リンパ球、単球、赤血球及び白血球）の変化の証拠はなく、Ｃ１２での単球の減少が予想された（ｐ＝０．０４３）。終末ＰＫ分析から、それぞれ１３０及び５３μＭ．ｈのＣ９及びＣ１２血漿ＡＵＣ値が明らかになった。
ほぼ二倍体の腫瘍モデルにおいてＫＩＦ１８Ａ阻害剤の抗腫瘍活性を評価するために、ＣＡＬ－５１腫瘍（１４０ｍｍ３、ｎ＝１０）を有するヌードマウスにビヒクル単独、１００ｍｇ／ｋｇのＣ９又は２５ｍｇ／ｋｇのＣ１２を連続１８日間にわたり１日１回、ＩＰ投与した。ＣＡＬ－５１は、Ｃ９及びＣ１１に対して非感受性としてインビトロで示された癌細胞株であった。両方のＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、ビヒクル対照と比較して、ＣＡＬ－５１腫瘍増殖に対して観察可能な影響を示さなかった（図１９Ｃ）。ＯＶＣＡＲ－３試験と一致して、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤処置は、マウスにおいて忍容性に優れ、体重減少（図１９Ｂ）の証拠はなく、終末ＰＫ分析から、試験間の同等な血漿濃度－時間プロファイルが示された。
インビボでＨＧＳＯＣにおけるＫＩＦ１８Ａ阻害剤活性をさらに調べるために、ＯＶＣＡＲ－８腫瘍（１４５ｍｍ３、ｎ＝１０）があるマウスにビヒクル単独、５０若しくは１００ｍｇ／ｋｇのＣ９又は２５若しくは５０ ｍｇ／ｋｇのＣ１２を連続１８日間にわたり１日１回、ＩＰ投与した。図１９Ｄで示されるように、Ｃ９又はＣ１２での処置の結果、それぞれ、５０及び１００ｍｇ／ｋｇで１６％及び７３％の腫瘍退縮（ｐ＜０．０００１）が起こったか、又は２５及び５０ｍｇ／ｋｇで１９％及び７５％の腫瘍退縮（ｐ＜０．０００１）が起こった。以前のように、ＫＩＦ１８Ａ活性の阻害はマウスにおいて忍容性に優れ、体重減少の証拠はなかった（図１９Ｄ）。一致した用量では、血漿ＡＵＣ値は、他の有効性試験と比較して、ＯＶＣＡＲ－８試験においてＣ１２については２．８倍高く、一方でＣ９のＰＫプロファイルは試験にわたり同等であった。
まとめると、これらのインビボデータから、忍容性に優れた用量でのロバストな腫瘍ＰＤ反応及び顕著な腫瘍退縮を伴う、ＫＩＦ１８Ａの低分子量阻害剤での抗癌活性の最初の証拠が提供される。
実施例２０
実施例１９の試験において次の材料及び方法を使用した。
細胞株。別段の指定がない限り、ＡＴＣＣ又はＤＳＭＺ（ＧｍｂＨ）から全てのヒト細胞株を作製した。細胞株は、短い縦列反復（ＳＴＲ）ＤＮＡ分析を使用してＡＴＣＣにより確認され、ＡＴＣＣ又はＥｘＰａｓｙ Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓ（Ｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ ２０２０）ＳＴＲデータベースに対して参照された。ＯＶＣＡＲ－５、ＯＶＣＡＲ－８及びＯＶＣＡＲ－８ ＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳ（ＡＤＲＲＥＳ）（Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１８）細胞株はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。ヒト骨髄単核細胞（ＨＢＭＮＣ）及びヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、Ｌｏｎｚａ Ｉｎｃ．から得た。ＨｅｍａＣａｒｅ Ｉｎｃ．から得られたＬｅｕｋｏｐａｋｓから、ヒトＴ細胞を単離し、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７ Ｃａｓ９細胞株は、Ｃｅｌｌｅｃｔａ Ｉｎｃ．から得た。α－チューブリン－ＥＧＦＰ及びＨ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現するＫｙｏｔｏ ＨｅＬａ細胞株は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙ Ｉｎｃ．から得た。細胞株培養は全て、５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃にて維持した。インビボ試験のために使用されたＯＶＣＡＲ－３、ＣＡＬ－５１及びＯＶＣＡＲ－８細胞株は、マイコプラズマ及び一連のマウスウイルス病原体の混入がないと判定された。相互参照した公開データソース（ＤｅｐＭａｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ Ｐａｓｓｐｏｒｔ，Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＣＣＬＥ，ＡＴＣＣ，ＤＳＭＺ）及び公開された試験（Ｄｏｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｄａｉ ｅｔ ａｌ ２０１７，Ｑｕｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０２０）に基づく、腫瘍組織タイプ、腫瘍サブタイプ、ＴＰ５３ 突然変異状況、ＲＢ１及びＣＣＮＥ１状況及び全ゲノム倍加（ＷＧＤ）状況についての細胞株情報。
化学。分子構造が化合物ＢＩ－２５３６（Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２００７）、ＢＴＢ－１（Ｃａｔａｒｉｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ ２００９）、ドキソルビシン（Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ ２００９）、ゲムシタビン（Ｐｏｕｒｑｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２００２）、ＧＦ１２０９１８（Ｈｙａｆｉｌ ｅｔ ａｌ １９９３）、ＧＳＫ９２３２９５及びイスピネシブ（Ｒａｔｈ ａｎｄ Ｋｏｚｉｅｌｓｋｉ ２０１２）、ヌトリン－３ａ（Ｖａｓｓｉｌｅｖ ２００４）、パクリタキセル及びドセタキセル（Ｐｅｒｅｚ ２００９）、パルボシクリブ（Ｏ’Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１６）に対して開示されており、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物はＡｍｇｅｎにより合成された。
ＫＩＦ１８Ａ阻害剤活性
３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、ＤＭＳＯにおいて２２点の濃度範囲にわたりＫＩＦ１８Ａ化合物Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１２を２倍連続希釈した。組み換え短縮型キネシンモータータンパク質（ヒトＫＩＦ１８Ａ（残基１～４６７、４ｎＭ）、マウスＫＩＦ１８Ａ（残基１～４６７、４ｎＭ））を発現させ、精製した。ＭＴ－ＡＴＰａｓｅモーター活性を測定するために、ＡＤＰ－Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ブタ脳ＭＴは、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ Ｉｎｃ．から購入した。上で指定される濃度のモータータンパク質とともに反応緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、２％ＤＭＳＯ、１μＭパクリタキセル、３０μｇ／ｍＬ ＭＴ）中で化合物を＜３０分間、予め温置し、室温（ＲＴ）で１５分間、酵素反応を開始させるために３０μＭ ＡＴＰを添加した 製造者のプロトコールに従い、ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、存在するＡＤＰと比例する発光強度を測定した。生の発光シグナルデータをＰＯＣ（陽性対照のパーセンテージ）に対して正規化し、次いで活性（％）を計算した［ＰＯＣ＝１００ｘ（試料シグナル－陰性対照シグナル）÷（陽性対照シグナル－陰性対照シグナル）。活性（％）＝ＰＯＣ－１００］。陽性対照（酵素＋基質）及び陰性対照（基質単独）は、等しい濃度のＤＭＳＯを有した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、４－パラメーター非線形回帰式（可変勾配）により、曲線フィッティング及びＩＣ５０値を決定した。
細胞増殖アッセイ。９６時間の細胞増殖に対して最適化された密度で、細胞株のパネル（ＨＣＣ－１８０６、ＨＣＣ－１９３７、ＢＴ－５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７、ＭＣＦ－７、ＣＡＬ－５１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－１、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－５）を９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＤＭＳＯ又は次の化合物のうち１つで細胞を処理した：スタガードドーズ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）法を使用して、６μＭの最大濃度（１９点の濃度範囲）でＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９及びＣ１１又はパルボシクリブ。９６時間後、上記のように、細胞を固定し、染色し、イメージングし、分析した。各ウェルに対して有効核対象物カウントを決定し、次の式［カウントＰＯＣ＝（処理したウェル中の有効核対象物カウント）÷（ＤＭＳＯ処理したウェル中の有効核対象物カウント）ｘ１００］を使用してカウントＰＯＣ値を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０５を使用して、４－パラメーター非線形回帰式によって濃度反応曲線フィッティングを行った。２つ組で行った２回の独立した試験から各細胞株について平均カウントＥＣ５０値を計算した。最大濃度で＞５０％の最大反応に到達しなかった場合、６μＭのカウントＥＣ５０値を細胞株に割り当て、非感受性とみなした。各試験薬剤に対して感受性がある細胞株にわたり、平均カウントＥＣ５０値を計算した。
ＢｒｄＵ及び細胞周期分析。前に記載のとおり定められた培地中で２名の正常ドナー（＃３７６１２，＃３７５３４）由来のヒト骨髄単核細胞（ＨＢＭＮＣ）を８日間培養した（Ｐａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。２つ組プレートにおいて、細胞１．２ｘ１０６個／ウェルで２４ウェルプレートにおいてＨＢＭＮＣを播種した。ＤＭＳＯ、化合物Ｃ９（１μＭ）、化合物Ｃ１１（１μＭ）、イスピネシブ（０．０５μＭ）、パクリタキセル（０．１μＭ）又はパルボキシルブ（１μＭ）で細胞を処理した。４８時間（細胞周期）及び９６時間（細胞増殖）で細胞を回収した。第１のセットのプレートにＢｒｄＵを２時間、一時適用し、前に記載のようにＢｒｄＵ細胞周期分析のために処理した（Ｐａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを動作させるＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上で細胞を分析し、ＦＳＣ－Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、取得後のデータ分析を行った。ＢｒｄＵ及びｓｕｂＧ１のパーセンテージについてデータを報告した。第２のセットのプレートを回収し、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞をカウントした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０５を使用して各ドナーに対してグラフ化を行った。
ＯＶＣＡＲ－３腫瘍異種移植片有効性試験
マウスの右側腹部にヒトＯＶＣＡＲ－３細胞（５．０ｘ１０６）を皮下注入した。１３０ｍｍ３の平均腫瘍体積で、確立された腫瘍がある動物を４つの群（ｎ＝１０匹／群）に無作為に分けた。ビヒクル単独を毎日、Ｃ９（１００ｍｇ／ｋｇ）を毎日又はＣ１２（２５ｍｇ／ｋｇ）を毎日、動物にＩＰ投与した。腫瘍移植後第２４日に処置を開始し、第４２日に処置を終了した。デジタルノギス及び分析用ラボスケールをそれぞれ使用して、腫瘍体積及び体重を週に２回記録した。第４２日の最終投与後、完全血球数分析（ｎ＝６匹／処置群）がＩＤＥＸＸ Ｉｎｃ．により行われた。標準的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって、２、４、８、１６及び２４時間（ｎ＝２匹／時間点）でＣ９及びＣ１２に対して血漿薬物動態分析を行った。ビヒクル対照と比較して％ＴＧＩとして、腫瘍増殖阻害のパーセンテージ（％ＴＧＩ）を計算した：％ＴＧＩ＝１００－［（処置－初期体積）／（対照－初期体積）Ｘ１００］。最初の腫瘍体積と最終腫瘍体積を比較した％ＴＲとして腫瘍退縮のパーセンテージ（％ＴＲ）を計算した：％ＴＲ＝１００－［（最終体積）／（初期体積）Ｘ１００］。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０５を使用してデータをグラフ化した。それぞれ反復測定ＡＮＯＶＡ及び一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、続いてダネットの多重比較検定を使用して、腫瘍成長及び血球数について処置群に対して統計学的分析を行った。
ＣＡＬ－５１腫瘍異種移植片有効性試験
マウスの右側腹部にＣＡＬ－５１細胞（５．０ｘ１０６）を皮下注入した。１４０ｍｍ３の平均腫瘍体積で、確立された腫瘍がある動物を４つの群（ｎ＝１０匹／群）に無作為に分けた。ビヒクル単独を毎日、Ｃ９（１００ｍｇ／ｋｇ）を毎日又はＣ１２（２５ｍｇ／ｋｇ）を毎日、動物にＩＰ投与した。腫瘍移植後第１８日に処置を開始し、第３６日に処置を終了した。腫瘍体積及び体重評価を上記のように行った。第３６日の最終投与後、血漿薬物動態分析を上記のように行った。全てのデータ分析を上記のように行った。
ＯＶＣＡＲ－８腫瘍異種移植片有効性試験
マウスの右側腹部にヒトＯＶＣＡＲ－８細胞（５．０ｘ１０６個）を皮下注入した。１４５ｍｍ３の平均腫瘍体積で、確立された腫瘍がある動物を４つの群（ｎ＝１０匹／群）に無作為に分けた。ビヒクル単独、Ｃ９（５０又は１００ｍｇ／ｋｇ）又はＣ１２（２５又は５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日、動物にＩＰ投与した。腫瘍移植後第２８日に処置を開始し、第４６日に処置を終了した。腫瘍体積及び体重評価を上記のように行った。第４６日の最終投与後、後眼窩採血法によって採血したことを除き、上記のように血漿薬物動態分析を行った。
参考文献
以下の参考文献をこの実施例で引用する：
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本明細書中で引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各々の参考文献があたかも、個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示されているかのごとく、且つ本明細書においてその全体が記載されているかのごとく同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の指定がない限り、指定の成分を含むが他の要素を排除しないことを含む、制約のない用語として解釈される（即ち「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する）。
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書中で別段の指定がない限り、範囲内にあるそれぞれ別々の値及びそれぞれの終点を個々に言及する速記法としての役割を果たすことが単に意図され、本明細書中であたかも個々に記載されるように、それぞれ別々の値及び終点が本明細書に組み込まれる。
本明細書中で説明されている方法は全て、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中で提供されるありとあらゆる例又は代表的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の如何なる言語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。
本明細書中で、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読めば当業者にとって明らかになろう。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、発明者らは、本明細書中で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用される法により認められる通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。

Claims (25)

  1. 新生物疾患を有する対象に対する処置を決定する方法であって、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて前記対象から得られた試料をアッセイすることを含み、前記試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化Ｒｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、前記対象に対して決定される前記処置がＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む、方法。
  2. 新生物疾患を有する対象を処置することにおける使用のためのＫＩＦ１８Ａ阻害剤であって、前記対象が、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  3. ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であるものとして新生物疾患を有する対象を同定する方法であって、（ａ）不活性化されたＴＰ５３遺伝子及び／又は（ｂ）（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて前記対象から得られた試料をアッセイすることを含み、前記試料が、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である場合、前記対象がＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対して感受性であるものとして同定される、方法。
  4. 新生物疾患を有する対象に対する処置を決定する方法であって、ＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を決定することを含み、前記新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象に対する前記処置がＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む処置として決定されるか、又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する前記新生物疾患の感受性を決定することを含み、前記新生物疾患が前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象に対する前記処置がＣＤＫ４／６阻害剤を含む処置として決定される、方法。
  5. ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性があるものとしてがんを有する対象を同定する方法であって、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に対する新生物疾患の感受性を決定することを含み、試料のがん細胞が前記ＣＤＫ４／６阻害剤に対して非感受性である場合、前記対象がＫＩＦ１８Ａ阻害剤での処置に反応性があるものとして同定される、方法。
  6. （Ａ）新生物疾患を有する対象を処置することにおける使用のためのＫＩＦ１８Ａ阻害剤であって、前記新生物疾患がＣＤＫ４／６阻害剤での処置に耐性であるか又は前記対象がＣＤＫ４／６阻害剤で処置されるか又は処置されたことがある、又は（Ｂ）対象においてＣＤＫ４／６阻害剤での処置に対して新生物疾患の感受性を維持することにおける使用のためのＫＩＦ１８Ａ阻害剤であって、任意選択的に前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が前記ＣＤＫ４／６阻害剤と一緒に使用するためである、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  7. 感受性の決定が、（ｉ）不活性化されたＲｂ１遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又はＣＣＮＥ１遺伝子産物の過剰発現又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせがないことについて前記対象から得られた試料をアッセイすることを含む、請求項４～６の何れか１項に記載の方法。
  8. 前記試料が、がん細胞、腫瘍細胞、非腫瘍細胞、血液、血液細胞又は血漿を含み、任意選択的に前記試料が、生殖系列がん細胞又は体細胞がん細胞を含む、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
  9. ＣＤＫ４／６阻害剤及びＫＩＦ１８Ａ阻害剤を含む、医薬の組み合わせ。
  10. 前記ＣＤＫ４／６阻害剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ及び／又はアベマシクリブである、請求項４～９の何れか１項に記載の方法又は医薬の組み合わせ。
  11. 新生物疾患を有する対象の処置、腫瘍がある対象における腫瘍退縮の誘導若しくは向上、腫瘍がある対象における腫瘍若しくはがんの成長の低減及び／又は対象における腫瘍若しくはがん細胞の死の誘導若しくは増加での使用のための、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  12. 前記新生物疾患が、がん、任意選択的に乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん又は前立腺がんである、請求項１～１１の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  13. 前記新生物疾患が、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、非ルミナル乳がん又は高悪性度漿液性卵巣がん（ＨＧＳＯＣ）又は子宮内膜がん、任意選択的に漿液性子宮内膜がんである、請求項１２に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  14. 前記がんが、不活性化されたＴＰ５３遺伝子について陽性及び／又は不活性化されたＲｂ遺伝子、（ｉｉ）増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子又は過剰発現されたＣＣＮＥ１遺伝子産物、（ｉｉｉ）不活性化されたＢＲＣＡ遺伝子又は（ｉｖ）それらの組み合わせのうち少なくとも１つについて陽性である細胞を含む、請求項１～１３の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  15. 前記がんが、突然変異体ＴＰ５３遺伝子について陽性である細胞を含み、及び／又は増幅されたＣＣＮＥ１遺伝子、発現抑制されたＢＲＣＡ１遺伝子、欠失Ｒｂ１遺伝子又はそれらの組み合わせについて陽性である細胞を含む、請求項１４に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  16. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、前記新生物疾患を処置し、腫瘍退縮を誘導するか若しくは向上させ、腫瘍若しくはがんの成長を低減させ、及び／又は腫瘍若しくはがん細胞の死を誘導するか若しくは増加させ、（Ａ）前記対象における正常な体細胞の増殖が対照対象の正常な体細胞の増殖と実質的に同じであり、及び／又は（Ｂ）前記正常な体細胞のアポトーシスのレベルが、対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと比較して前記対象において増加しておらず、任意選択的に前記正常な体細胞のアポトーシスのレベルが、対照対象の正常な体細胞のアポトーシスのレベルと実質的に同じである、請求項１～１５の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  17. 前記正常な体細胞が、ヒト骨髄単核細胞、ヒト乳腺上皮細胞又はヒト包皮線維芽細胞であり、及び／又は前記正常な体細胞がＴＰ５３ＭＵＴではないか、又は前記正常な体細胞がＴＰ５３ＷＴである、請求項１６に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  18. （ｉ）前記新生物疾患が多剤耐性新生物疾患である、（ｉｉ）前記腫瘍又はがん細胞が多剤耐性腫瘍又はがん細胞である、（ｉｉｉ）前記腫瘍又はがん細胞が多剤耐性１（ＭＤＲ－１）遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現上昇を示す、（ｉｖ）前記腫瘍又はがん細胞がＰ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の発現上昇を示す、又は（ｖ）それらの何れかの組み合わせである、請求項１～１７の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  19. 前記新生物疾患が抗有糸分裂剤又はアントラサイクリン抗生物質での処置に対して耐性であり、任意選択的に、前記抗有糸分裂剤又はアントラサイクリン抗生物質がパクリタキセル又はドキソルビシンである、請求項１～１８の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  20. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、経口投与のために、任意選択的に１日１回投与される、請求項１～１９の何れか１項に記載の使用のための方法若しくはＫＩＦ１８Ａ阻害剤又は医薬の組み合わせ。
  21. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、構造：
    Figure 2023521802000081
     を有する、４－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）－Ｎ－（３－（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチル）スルファモイル）フェニル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドとしても知られるＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ９；又は何れかの薬学的に許容可能なその塩である、請求項１～２０の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  22. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、構造：
    Figure 2023521802000082
     を有する、Ｎ－（３－（シクロペンチルスルホニル）フェニル）－６－（（１－ヒドロキシ－２－メチルプロパン－２－イル）アミノ）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ニコチンアミドとしても知られるＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１１；又は何れかの薬学的に許容可能なその塩である、請求項１～２１の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  23. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、構造：
    Figure 2023521802000083
     を有する、（Ｒ）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－Ｎ－（６－（２－メチルモルホリノ）ピリジン－２－イル）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドとしても知られるＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１２；又は何れかの薬学的に許容可能なその塩である、請求項１～２２の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  24. 前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が、構造：
    Figure 2023521802000084
     を有する、Ｎ－（２－（４，４－ジフルオロピぺリジン－１－イル）－６－メチルピリミジン－４－イル）－４－（（２－ヒドロキシエチル）スルホンアミド）－２－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－イル）ベンズアミドとしても知られるＫＩＦ１８Ａ阻害剤化合物Ｃ１４；又は何れかの薬学的に許容可能なその塩である、請求項１～２３の何れか１項に記載の使用のための方法又はＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
  25. 抗有糸分裂剤又はアントラサイクリン抗生物質で処置されるか又は処置されたことがある対象における新生物疾患の処置での使用のためのＫＩＦ１８Ａ阻害剤であって、任意選択的に前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤が（Ａ）ＫＩＦ１８Ａ遺伝子の発現を低下させ、及び／又はＫＩＦ１８Ａ遺伝子産物が、（Ｂ）非コードＲＮＡであり、任意選択的に、前記ＫＩＦ１８Ａ阻害剤がＲＮＡｉに介在し、及び／又は（Ｃ）任意選択的に配列番号１２～１８の何れか１項に記載の配列を含むｓｉＲＮＡである、ＫＩＦ１８Ａ阻害剤。
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