KR20230010240A - 변형된 pbmc 및 면역접합체를 이용한 병용 요법 - Google Patents

변형된 pbmc 및 면역접합체를 이용한 병용 요법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230010240A
KR20230010240A KR1020227043333A KR20227043333A KR20230010240A KR 20230010240 A KR20230010240 A KR 20230010240A KR 1020227043333 A KR1020227043333 A KR 1020227043333A KR 20227043333 A KR20227043333 A KR 20227043333A KR 20230010240 A KR20230010240 A KR 20230010240A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
polypeptide
immunoconjugate
cells
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020227043333A
Other languages
English (en)
Inventor
파블로 우마나
크리스티안 클라인
크리스틴 트럼프헬러
발레리아 지. 니콜리니
로라 코다리 덱
스캇 로프헤드
매튜 부티
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20230010240A publication Critical patent/KR20230010240A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 출원은 변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 투여하는 것과 함께, 세포내 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포(예를 들면, PBMC)의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공한다. 변이체 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 감소된 친화성을 나타낸다. 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 또는 T 세포를 표적으로 한다.

Description

변형된 PBMC 및 면역접합체를 이용한 병용 요법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 5월 11일 자 제출된 U.S. 가출원 번호 63/023,193 및 2020년 10월 23일 자 제출된 63/105,135에 우선권을 주장하고, 이들은 각각 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
ASCII 텍스트 파일 형태에서 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 형태로 제출된 다음의 내용물은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다: 서열 목록 (파일 명칭: 202902000140SEQLIST.TXT, 기록된 일자: 2021년 5월 6일, 크기: 72.6 KB)의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF).
발명의 배경
면역요법은 2가지 주요 유형의 개입 (수동 또는 능동 중 어느 한 가지)으로 나눠질 수 있다. 수동 프로토콜은 미리 활성화된 및/또는 조작된 세포, 질환 특이적 치료 항체 및/또는 사이토킨의 투여를 포함한다. 능동 면역요법 전략은 생체내에서 면역계 효과기 기능을 자극하는 방향으로 지향된다. 여러 현재 능동 프로토콜은 질환 연관 펩티드, 용해물, 또는 동종이계 전체 세포를 이용한 예방접종 전략, 종양 항원 전달을 위한 운반제로서 자가 DC의 주입, 그리고 면역 관문 조절인자의 주입을 포함한다. 참조: Papaioannou, Nikos E., et al. Annals of translational medicine 4.14 (2016).
질환 연관 항원에 의해 자극된 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 CD4+ 보조 T (Th) 세포는 병든 세포를 표적화하고 파괴하는 잠재력을 갖는다; 하지만, 내인성 T 세포 반응을 유도하기 위한 현재 방법은 과제에 직면하였다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 이용하는 접근법은 PCT/US2020/020194에서 설명된다.
T 세포 성장 인자 (TCGF)로서 또한 알려져 있는 인터류킨-2 (IL-2)는 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 수행하는 15.5 kDa 구형 당단백질이다. IL-2는 활성화된 T 세포, 특히 CD4+ 보조 T 세포에 의해 주로 합성된다. 이것은 T 세포의 증식과 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구 (CTL)의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포로의 분화를 유도하고, T 세포에 의한 사이토킨 및 세포용해 분자 발현을 증진하고, B 세포의 증식과 분화 및 B 세포에 의한 면역글로불린의 합성을 용이하게 하고, 그리고 자연 킬러 (NK) 세포의 생성, 증식과 활성화를 자극한다 (예를 들면 Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009); Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)에서 검토됨).
생체내에서 림프구 모집단을 확장하고 이들 세포의 효과기 기능을 증가시키는 능력은 항종양 효과를 IL-2에 부여하여, IL-2 면역요법을 일정한 전이성 암에 대한 매력적인 치료 옵션으로 만든다. 결과적으로, 높은 용량 IL-2 치료가 전이성 신장-세포 암종 및 악성 흑색종을 겪는 환자에서 이용을 위해 승인되었다.
다른 한편으로, IL-2는 이것이 효과기 세포의 확대와 활성을 매개할 뿐만 아니라, 말초 면역 관용을 유지하는 데 결정적으로 관련된다는 점에서, 면역 반응에서 이중 기능을 갖는다. 이런 이유로, IL-2는 종양 성장을 저해하는 데 최적이 아닌데, 그 이유는 IL-2의 존재에서, 생성된 CTL이 종양을 자가로서 인식하고 AICD를 겪을지도 모르거나, 또는 면역 반응이 IL-2 의존성 Treg 세포에 의해 저해될지도 모르기 때문이다. IL-2 면역요법에 관하여 추가 우려 사항은 재조합 인간 IL-2 치료에 의해 발생되는 부작용이다. 높은 용량 IL-2 치료를 제공받는 환자는 중증 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장관, 신경학적, 피부, 혈액학적 및 전신 부작용을 빈번하게 경험하는데, 이들은 집중적인 모니터링 및 입원 환자 관리를 필요로 한다. 이들 부작용 중 대부분은 복수의 장기에서 유체 혈관외유출 (예를 들면 폐와 피부 부종 및 간 세포 손상을 유발), 그리고 혈관내 유체 고갈 (혈압에서 하락 및 심박수에서 보상적 증가를 유발)을 야기하는 혈관 투과성에서 병리학적 증가인 이른바 혈관 (또는 모세관) 누출 증후군 (VLS)의 발달에 의해 설명될 수 있다.
IL-2 면역요법과 연관된 전술된 문제 (VLS의 유도에 의해 유발된 독성, AICD의 유도에 의해 유발된 종양 내성, 그리고 Treg 세포의 활성화에 의해 유발된 면역억제)를 극복하도록 설계된 특정 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 WO 2012/107417에서 설명된다. IL-2의 위치 42에서 페닐알라닌 잔기의 알라닌에 의한 치환, 위치 45에서 티로신 잔기의 알라닌에 의한 치환 및 위치 72에서 류신 잔기의 글리신에 의한 치환은 IL-2 수용체의 α 아단위 (CD25)에 대한 이러한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 결합을 본질적으로 전폐한다.
전술된 접근법에 덧붙여, IL-2 면역요법은 예를 들면 종양 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체의 형태에서, IL-2를 종양으로 선택적으로 표적화함으로써 향상될 수 있다. 여러 이런 면역접합체가 설명되었다 (참조: 예를 들면 Ko et al., J Immunother (2004) 27, 232-239; Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6(3), e1277306).
종양은 하지만, 항체의 표적 항원을 벗겨 내거나, 돌연변이시키거나 또는 하향조절함으로써 이런 표적화를 탈출할 수 있다. 게다가, 종양 표적화 IL-2는 림프구를 능동적으로 배제하는 종양 미세환경에서, 효과기 세포 예컨대 세포독성 T 림프구 (CTL)와 최적으로 접촉할 수 없다. 따라서, IL-2 면역요법을 더욱 향상시키는 것이 여전히 요구된다. 종양 표적화의 문제점을 회피할 수 있는 접근법은 IL-2를 효과기 세포, 특히 CTL에 직접적으로 표적화하는 것이다. IL-2 및 PD-1 항원 결합 단백질의 융합 단백질은 WO 2018/184964 A1에서 설명된다.
효과적인 내인성 T 세포 반응을 유도하기 위한 향상된 방법에 대한 높은 요구가 여전히 충족되지 않고 있다.
특허 출원 및 간행물을 비롯하여, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 온전히 참조로서 편입된다.
발명의 간단한 요약
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 유핵 세포 기반 면역요법을 증강하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역접합체의 효과량을 유핵 세포 기반 면역요법과 함께 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 상기 질환과 연관된 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 예방접종이 필요한 개체를 예방접종하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 개체는 예방접종에 반응성인 질환을 겪는다. 일부 구체예에서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는 (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 2개의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 질환 연관 항원이다. 일부 구체예에서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계; b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.5 μm이다. 일부 구체예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 7909이다. 일부 구체예에서, 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다. 일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21이다. 일부 구체예에서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는다. 일부 구체예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 여러 번 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물 및/또는 면역접합체는 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다. 일부 구체예에서, 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 병용되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다. 일부 구체예에서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 면역접합체는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 병용된다. 일부 구체예에서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 면역접합체의 용도를 제공하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 여기서 상기 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 유핵 세포는 외인성 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물 이전에, 상기 조성물과 동시에, 또는 상기 조성물 이후에 투여된다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 조성물의 용도를 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하고; 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 함께 투여용으로 조제되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
일부 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 임의의 방법에서 이용을 위한 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물 및 면역접합체를 포함하는 키트를 제공하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 여기서 상기 조성물 및 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 병용하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 포함하는 키트를 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 것이고; 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 면역접합체를 포함하는 키트를 제공하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 여기서 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 상기 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 이용하기 위한 것이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 이용하기 위한 면역접합체를 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역접합체를 생산하기 위한 조건하에 이러한 면역접합체를 인코딩하는 핵산을 세포에서 발현하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 상기 면역접합체가 유핵 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 함께 이용하기 위한 것이고, 여기서 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 융합 단백질이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 유핵 세포를 포함하는 조성물을 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 외인성 항원을 세포내에서 유핵 세포의 모집단에 도입하되; 상기 조성물이 면역접합체의 투여와 함께 이용하기 위한 것이고; 여기서 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 TC1 생쥐 종양 모형에서 시간의 추이에서 종양 용적을 보여주는 그래프이다. 생쥐는 PD1-IL2v 단독으로 치료되거나, 3회 용량의 세포에서 SQZ-PBMC (세포내 전달되는 HPV 항원을 포함하는 SQZ-PBMC)로 1회 치료되거나, 또는 PD1-IL2v가 단회 용량 범위에서 3회 제공되었다. SQZ-PBMC의 투여는 "SQZ 초회감작"으로서 표시된다. PD1-IL2v의 투여 기간은 회색 막대에 의해 표시된다.
도 2a-2f는 치료되지 않음과 비교하여 SQZ-PBMC 단독으로 치료된 (도 2a-2c), 또는 치료되지 않음과 비교하여 고정된 용량의 PD1-IL2v와 병용 치료된 (도 2d-2f) TC1 생쥐 모형에서 종양 용적을 보여주는 그래프이다. SQZ-PBMC의 용량은 0.25 x 106 (도 2a 및 2d), 1.0 x 106 (도 2b 및 2e), 또는 4.0 x 106 (도 2c 및 2f)이었다. SQZ-PBMC의 투여는 수직 점선에 의해 표시된다. PD1-IL2v의 투여 기간은 회색 막대에 의해 표시된다.
도 3a 및 3b는 FAP-IL-2v (도 3a) 및 PD-1-IL-2v (도 3b)와 병용으로 SQZ-PBMC로 치료된 생쥐의 TC1 생쥐 종양 모형에서 종양 용적을 보여주는 그래프이다. SQZ-PBMC 및 면역접합체 투여는 수직 점선에 의해 표시된다.
도 4a-4e는 치료되지 않음과 비교하여 SQZ-PBMC 단독으로 치료된 (도 4a), 치료되지 않음과 비교하여 FAP-IL2v 단독으로 치료된 (도 4b), 치료되지 않음과 비교하여 PD-1-IL-2v 단독으로 치료된 (도 4c), 치료되지 않음과 비교하여 SQZ-PBMC와 병용으로 FAP-IL2v로 치료된 (도 4d), 또는 치료되지 않음과 비교하여 SQZ-PBMC와 병용으로 PD-1-IL-2v로 치료된 (도 4e) TC1 생쥐 모형에서 종양 용적을 보여주는 거미 플롯 그래프이다. SQZ-PBMC 및 면역접합체의 투여는 수직 점선에 의해 표시된다.
도 5는 PD-1-IL-2v로 치료되거나, SQZ-PBMC로 치료되거나, 또는 PD-1-IL-2v 및 SQZ-PBMC로 병용 치료된 생쥐의 TC1 생쥐 종양 모형에서 종양 용적을 보여주는 그래프이다. SQZ-PBMC 및 면역접합체 투여는 수직 점선에 의해 표시된다.
도 6은 최초 종양의 치료 이후에 재공격을 보여주는 그래프이다. 생쥐의 오른쪽 옆구리에서 확립된 TC1 종양은 0.25x106, 1x106 또는 4x106 SQZ-PBMC, 그리고 PD1-IL2v 단독으로 치료되었다. 생쥐는 왼쪽 옆구리에서 TC1 종양으로 재공격되었다.
도 7a-7d는 SQZ-PBMC 및 PD-1-IL2v를 이용한 치료 이후에 종양에서 종양 침윤 백혈구 (TIL)의 분석을 보여주는 그래프이다. 도 7a는 %Ki-67+ 세포에 의해 계측될 때 종양에서 T 세포의 증식을 보여준다. 도 7b는 그랜자임 B 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 계측될 때 세포독성을 보여준다. 도 7c는 E7 자극된 샘플 및 자극되지 않은 샘플에서 IFNγ 생산을 보여주고 도 7d는 TNFα 생산을 보여준다. 치료되지 않음은 Untr로서 표시되고, PD-1-IL2v 단독은 PD-1-IL2v로서 표시되고, SQZ-PBMC 단독은 SQZ로서 표시되고, 그리고 SQZ-PBMC 및 PD-1-IL2v의 병용은 콤보로서 표시된다. 모든 그래프에 대해, 통계학적 유의성은 ** p<0.01, *** p<.001에 의해 표시된다.
도 8a-8h는 TC1 생쥐 종양 모형에서 치료 이후에 24 일째 (도 8a-8d) 및 28 일째 (도 8e-8h)에 종양의 면역 침윤을 보여주는 일련의 그래프이다. 제시된 파라미터는 종양 용적 (도 8a 및 8e), CD45+ 세포의 수 (도 8b 및 8f), CD8+ T 세포의 수 (도 8c 및 8g), 그리고 E7 특이적 CD8+ 세포의 수 (도 8d 및 8h)를 포함한다. 치료되지 않음은 Untr로서 표시되고, PD-1-IL2v 단독은 PD-1-IL2v로서 표시되고, SQZ-PBMC 단독은 SQZ로서 표시되고, 그리고 SQZ-PBMC 및 PD-1-IL2v의 병용은 콤보로서 표시된다. 모든 그래프에 대해, 통계학적 유의성은 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<.001에 의해 표시된다.
도 9a-9d는 치료 이후에 생쥐의 종양 및 비장 내에 면역 세포의 수를 보여준다. 도 9a는 종양에서 CD8+ T 세포의 수를 보여준다. 도 9b는 종양에서 E7 특이적 CD8+ T 세포의 수를 보여준다. 도 9c는 비장에서 CD8+ T 세포의 수를 보여준다. 도 9d는 비장에서 E7 특이적 CD8+ T 세포의 수를 보여준다. 치료되지 않음은 Untr로서 표시되고, PD-1-IL2v 단독은 PD-1-IL2v로서 표시되고, SQZ-PBMC 단독은 SQZ로서 표시되고, 그리고 SQZ-PBMC 및 PD-1-IL2v의 병용은 콤보로서 표시된다. 모든 그래프에 대해, 통계학적 유의성은 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<.001에 의해 표시된다. 선택된 값 사이의 배수적 차이 또한 표시된다.
도 10a-10d는 종양에서 조절 T 세포 (Treg) 및 NK 세포에 대한 치료의 효과를 보여준다. 도 10a는 종양의 mg당 CD4+FOXP3+CD25+ 세포의 수에 의해 계측될 때 Treg의 수를 보여준다. 도 10b는 CD8+ 세포 대 Treg 세포의 비율을 보여준다. 도 10c는 종양에서 NK1.1+ 세포의 수를 보여주고, 그리고 도 10d는 비장에서 NK1.1+ 세포의 수를 보여준다. 치료되지 않음은 Untr로서 표시되고, PD-1-IL2v 단독은 PD-1-IL2v로서 표시되고, SQZ-PBMC 단독은 SQZ로서 표시되고, 그리고 SQZ-PBMC 및 PD-1-IL2v의 병용은 콤보로서 표시된다. 모든 그래프에 대해, 통계학적 유의성은 ** p<0.01, *** p<.001, 그리고 **** p<0.0001에 의해 표시된다.
도 11a-11c는 TC1 생쥐 종양 모형에서 펩티드 백신 및 면역접합체 치료의 병용의 효과를 보여준다. 생쥐는 펩티드 백신 단독 (VAX, 도 11a), FAP-IL2v과 함께 상기 백신 (도 11b), 또는 PD1-IL2v와 함께 상기 백신 (도 11c)으로 치료되었다.
도 12는 SQZ-PBMC 면역화 후 PD1-IL2v의 투여가 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 부양한다는 것을 보여준다.
발명의 상세한 설명
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명은 유핵 세포 기반 면역요법을 증강하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역접합체의 효과량을 유핵 세포 기반 면역요법과 함께 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 상기 질환과 연관된 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명은 예방접종이 필요한 개체를 예방접종하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 상기 양상의 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 양상의 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 병용하기 위한 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 병용하기 위한, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 전술된 조성물 및 면역접합체의 용도 및 키트 또한 예기된다.
일반적인 기술
본원에서 설명되거나 또는 언급된 기술과 절차는 일반적으로, 당업자에 의해 전통적인 방법론, 예컨대 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)에서 설명된 폭넓게 활용된 방법론을 이용하여, 충분히 이해되고 통상적으로 이용된다.
정의
본 명세서를 해석하는 목적으로, 하기의 정의가 적용될 것이고, 그리고 적합할 때는 언제든지, 단수로 이용된 용어는 복수를 또한 포함할 것이며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 아래에 진술된 임의의 정의가 본원에서 참조로서 편입되는 임의의 문서와 모순되는 경우에, 진술된 정의가 우선할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 별도로 표시되지 않으면, 복수 참고대상을 포함한다.
본원에서 설명된 발명의 양상과 구체예는 "포함하는", "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는" 양상과 구체예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에게 쉽게 공지된 개별 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관계하는 구체예를 포함한다 (및 설명한다).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-2" 또는 "IL-2"는 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 IL-2를 지칭한다. 상기 용어는 처리되지 않은 IL-2뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 IL-2의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, IL-2의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-2의 아미노산 서열은 서열 번호: 19에서 도시된다. 처리되지 않은 인간 IL-2는 성숙 IL-2 분자에서 부재하는, 서열 번호: 59의 서열을 갖는 N 말단 20개 아미노산 신호 펩티드를 부가적으로 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "IL-2 돌연변이체" 또는 "돌연변이체 IL-2 폴리펩티드"는 전장 IL-2, IL-2의 절두된 형태 및 IL-2가 예컨대 융합 또는 화학적 접합에 의해 다른 분자에 연결되는 형태를 비롯한 다양한 형태의 IL-2 분자의 임의의 돌연변이체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. IL-2와 관련하여 이용될 때 "전장"은 성숙, 자연 길이 IL-2 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 전장 인간 IL-2는 133개의 아미노산을 갖는 분자 (참조: 예를 들면 서열 번호: 19)를 지칭한다. 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체는 IL-2의 CD25와의 상호작용에 영향을 주는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는 것으로 특징화된다. 이러한 돌연변이는 상기 위치에서 정상적으로 위치되는 야생형 아미노산 잔기의 치환, 결실, 절두 또는 변형을 수반할 수 있다. 아미노산 치환에 의해 획득된 돌연변이체가 선호된다. 별도로 표시되지 않으면, IL-2 돌연변이체는 본원에서 돌연변이체 IL-2 펩티드 서열, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 돌연변이체 IL-2 단백질 또는 돌연변이체 IL-2 유사체로서 지칭될 수 있다.
다양한 형태의 IL-2의 지정은 본원에서 서열 번호: 19에서 도시된 서열에 대해 이루어진다. 다양한 지정은 동일한 돌연변이를 표시하기 위해 본원에서 이용될 수 있다. 예를 들면 위치 42에서 페닐알라닌에서 알라닌으로의 돌연변이는 42A, A42, A42, F42A, 또는 Phe42Ala로서 표시될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "인간 IL-2 분자"는 서열 번호: 19의 인간 IL-2 서열과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 분자인 것으로 의미된다. 특히, 서열 동일성은 적어도 약 95%, 더욱 특히 적어도 약 96%이다. 특정한 구체예에서, 인간 IL-2 분자는 전장 IL-2 분자이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 것으로 의미된다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들면, CD25에 감소된 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 서열 결실과 삽입은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복시 말단 결실과 삽입을 포함한다. 말단 결실의 실례는 전장 인간 IL-2의 위치 1에서 알라닌 잔기의 결실이다. 바람직한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면 IL-2 폴리펩티드의 결합 특징을 변경하는 목적으로, 비보존성 아미노산 치환, 다시 말하면, 한 가지 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 아미노산 치환은 소수성 아미노산을 친수성 아미노산에 의해 대체하는 것을 포함한다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체 (예를 들면 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록실리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에서 널리 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 유전학적 방법은 특정 부위 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전공학 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법 또한 유용할 수 있는 것으로 예기된다.
본원에서 이용된 바와 같이, IL-2의 "야생형" 형태는 이러한 야생형 형태가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 각 아미노산 위치에서 야생형 아미노산을 갖는다는 점을 제외하고, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드와 다른 모든 면에서 동일한 IL-2의 형태이다. 예를 들면, 만약 IL-2 돌연변이체가 전장 IL-2 (다시 말하면 임의의 다른 분자에 융합되거나 또는 접합되지 않은 IL-2)이면, 이러한 돌연변이체의 야생형 형태는 전장 선천적 IL-2이다. 만약 IL-2 돌연변이체가 IL-2 및 IL-2의 하류에 인코딩된 다른 폴리펩티드 (예를 들면 항체 사슬) 사이의 융합이면, 이러한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태는 동일한 하류 폴리펩티드에 융합된 야생형 아미노산 서열을 갖는 IL-2이다. 게다가, 만약 IL-2 돌연변이체가 IL-2의 절두된 형태 (IL-2의 비절두된 부분 내에 돌연변이되거나 또는 변형된 서열)이면, 이러한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태는 야생형 서열을 갖는, 유사하게 절두된 IL-2이다. 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체의 IL-7 수용체 결합 친화성 또는 생물학적 활성을 IL-2의 상응하는 야생형 형태와 비교하는 목적으로, 용어 야생형은 자연 발생, 선천적 IL-2와 비교하여, IL-2 수용체 결합에 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예컨대 예를 들면 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 시스테인의 알라닌으로의 치환를 포함하는 IL-2의 형태를 포괄한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 목적으로 야생형 IL-2는 아미노산 치환 C125A (참조: 서열 번호: 26)를 포함한다. 본원 발명에 따른 일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 비교되는 야생형 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 비교되는 야생형 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CD25" 또는 "IL-2 수용체의 α 아단위"은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 CD25를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD25뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 CD25의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, CD25의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 일정한 구체예에서, CD25는 인간 CD25이다. 인간 CD25의 아미노산 서열은 예를 들면, UniProt 엔트리 번호 P01589 (버전 185)에서 발견된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "높은 친화성 IL-2 수용체"는 수용체 γ 아단위 (통상적인 사이토킨 수용체 γ 아단위, γc, 또는 CD132로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P14784 (버전 192) 참조), 수용체 β 아단위 (CD122 또는 p70으로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P31785 (버전 197) 참조) 및 수용체 α 아단위 (CD25 또는 p55로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P01589 (버전 185) 참조)로 구성되는 IL-2 수용체의 이종삼합체 형태를 지칭한다. 대조적으로 용어 "중간 친화성 IL-2 수용체"는 α 아단위 없이, γ 아단위 및 β 아단위만을 포함하는 IL-2 수용체를 지칭한다. (검토를 위해 예를 들면 Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)을 참조한다).
"친화성"은 분자 (예를 들면, 수용체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항원 결합 모이어티 및 항원, 또는 수용체 및 이의 리간드) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있는데, 이것은 해리와 연관 속도 상수 (각각, k오프 및 k온)의 비율이다. 따라서, 동등한 친화성은 속도 상수의 비율이 동일하게 남아있기만 하면, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 충분히 확립된 방법에 의해 계측될 수 있다. 친화성을 계측하기 위한 특정 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)이다.
다양한 형태의 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 또는 야생형 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용하여, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 WO 2012/107417에서 진술된 방법에 따라서 결정될 수 있고, 그리고 수용체 아단위는 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다 (참조: 예를 들면 Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). 대안으로, 상이한 형태의 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 결합 친화성은 이러한 수용체의 한 가지 또는 다른 이런 형태를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 이용하여 평가될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 아래에 설명된다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 특수한 유형의 CD4+ T 세포인 것으로 의미된다. Treg 세포는 IL-2 수용체 (CD25)의 α-아단위의 발현 및 전사 인자 포크헤드 상자 P3 (FOXP3)에 의해 특징화되고 (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), 그리고 종양에 의해 발현된 것들을 비롯한, 항원에 대한 말초 자기 관용의 유도와 유지에서 결정적인 역할을 수행한다. Treg 세포는 그들의 기능 및 그들의 억제 특징의 발달과 유도를 위해 IL-2를 필요로 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "효과기 세포"는 IL-2의 세포독성 효과를 매개하는 림프구의 모집단을 지칭한다. 효과기 세포는 효과기 T 세포 예컨대 CD8+세포독성 T 세포, NK 세포, 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 및 대식세포/단핵구를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "PD1", "인간 PD1", "PD-1" 또는 "인간 PD-1" (예정된 세포 사멸 단백질 1, 또는 예정된 사멸 1로서 또한 알려져 있음)은 인간 단백질 PD1을 지칭한다. 또한 UniProt 엔트리 번호 Q15116 (버전 156)을 참조한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "PD-1에 결합하는 항체", "PD-1에 특이적으로 결합하는 항체", "PD-1에 결합하는 항체" 또는 "항-PD-1 항체"는 PD-1, 특히 세포 표면 상에서 발현되는 PD-1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체로서, PD-1의 표적화에서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성을 갖는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 관련 없는, 비-PD-1 단백질에 항-PD-1 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 유세포분석 (FACS)에 의해, 또는 바이오센서 시스템 예컨대 Biacore® 시스템을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 계측될 때, PD-1에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, PD-1에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 PD-1에 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 한 구체예에서, 결합 친화성의 KD 값은 인간 PD-1의 세포외 도메인 (ECD) (PD-1-ECD)을 항원으로서 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에서 결정된다.
프로릴 엔도펩티다아제 FAP 또는 세프라제 (EC 3.4.21)로서 또한 알려져 있는 용어 "섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)"은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면 인간), 비인간 영장류 (예를 들면 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면 생쥐 및 쥐)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 FAP를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 FAP뿐만 아니라 세포 내에서 처리로부터 발생하는 FAP의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, FAP의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 한 구체예에서, 본원 발명의 항원 결합 분자는 인간, 생쥐 및/또는 시노몰구스 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt (world wide web.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884 (버전 149), 또는 NCBI (world wide web.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에서 도시된다. 인간 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26부터 760까지 걸친다. 생쥐 FAP의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P97321 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에서 도시된다. 생쥐 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26부터 761까지 걸친다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다. 예시적인 항-FAP 결합 분자는 국제 특허 출원 번호 WO 2012/020006 A2에서 설명된다. 한 구체예에서, 관련 없는, 비-FAP 단백질에 항-FAP 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 유세포분석 (FACS)에 의해, 또는 바이오센서 시스템 예컨대 Biacore® 시스템을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 계측될 때, FAP에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, FAP에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 FAP에 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 한 구체예에서, 결합 친화성의 KD 값은 인간 FAP의 세포외 도메인 (ECD)을 항원으로서 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에서 결정된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단 내에 포함되는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 분리된, 다시 말하면 자연 환경에 있지 않는 것이다. 특정 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 단리된 항체는 선천적 또는 자연 환경으로부터 이전될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 항체는 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나, 분획되거나, 또는 부분적으로 또는 실제적으로 정제된 선천적 또는 재조합 항체가 그러한 것처럼, 본원 발명의 목적으로 단리된 것으로 고려된다. 따라서, 본원 발명의 면역접합체가 단리된다. 일부 구체예에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면 scFv), 그리고 단일 도메인 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
용어 "면역글로불린 분자"는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VH), 그 이후에 중쇄 불변 영역으로 또한 불리는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VL), 그 이후에 경쇄 불변 영역으로 또한 불리는 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 또는 μ (IgM)으로 불리는 5가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예를 들면 γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 구성된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는, 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인 (항체 가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. 참조: 예를 들면, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 이용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 진술된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 중쇄와 경쇄의 모든 불변 영역과 도메인의 아미노산 위치는 본원에서 "Kabat에 따른 넘버링" 또는 "Kabat 넘버링"으로서 지칭되는, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 설명된 Kabat 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된다. 구체적으로 Kabat 넘버링 시스템 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 페이지 647-660을 참조한다)은 카파와 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 이용되고, 그리고 Kabat EU 색인 넘버링 시스템 (페이지 661-723을 참조한다)은 중쇄 불변 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 이용되는데, 이것은 본원에서 이 경우에 있어서 "Kabat EU 색인에 따른 넘버링"을 참조함으로써 더욱 명료해진다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는, 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 그리고 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
별도로 표시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 HVR (예를 들면, CDR)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 이런 가변 도메인은 본원에서 "인간화 가변 영역"으로서 지칭된다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본원 발명에 의해 포괄되는 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여, 본원 발명에 따른 특성을 생성하기 위해 본래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변경된 것이다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다. 일정한 구체예에서, 인간 항체는 비인간 유전자도입 포유동물, 예를 들면 생쥐, 쥐, 또는 토끼로부터 유래된다. 일정한 구체예에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편 역시 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, Cys226부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐있는 것으로 규정된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체 (본원에서 "개열된 변이체 중쇄"로서 또한 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, Kabat EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (K447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 도메인 (또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 별도로 표시되지 않으면, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 조성물, 예컨대 본원에서 설명된 제약학적 조성물은 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함한다. 면역접합체의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 면역접합체의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있고, 여기서 이들 면역접합체 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 개열된 변이체 중쇄를 갖는다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 면역접합체를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 면역접합체를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 이런 조성물은 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자로 구성되는 면역접합체의 모집단을 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다 (또한 상기 참조). 본원에서 이용된 바와 같이, Fc 도메인의 "아단위"는 이합체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 다시 말하면, 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형"은 동종이합체를 형성하는, Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 연관을 감소시키거나 또는 예방하는 펩티드 중추의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 연결을 증진하는 변형은 특히, 연결하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각 (다시 말하면, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 여기서 이들 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 연결을 증진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들면, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 연결을 각각, 입체적으로 또는 정전으로 우호적으로 만들기 위해, 이들 중에서 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, 각각의 아단위 (예를 들면 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수도 있는, 첫 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이합체화가 일어난다. 일부 구체예에서, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 구체예에서, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다.
항체와 관련하여 이용될 때, 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체 매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들면 B 세포 수용체)의 하향조절, 그리고 B 세포 활성화.
항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이들의 유도체가 일반적으로, Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "감소된 ADCC"는 앞서 규정된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 소정의 항체 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 숫자에서 감소 및/또는 ADCC의 기전에 의해, 소정의 시점에 소정의 숫자의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 항체의 농도에서 증가 중 어느 한 가지로서 규정된다. ADCC에서 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 조제 및 저장 방법 (이들은 당업자에게 공지된다)을 이용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC에서 감소는 Fc 도메인 내에 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 당해 분야에서 널리 공지된다 (참조: 예를 들면 PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 인게이지먼트 이후에, 수용체-보유 세포가 효과기 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) 및 FcαRI (CD89)를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작한다, 조작된, 조작"은 펩티드 중추의 임의의 조작, 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 고려된다. 가공은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
"감소된 결합", 예를 들면 Fc 수용체 또는 CD25에 감소된 결합은 예를 들면 SPR에 의해 계측될 때, 개별 상호작용에 대한 친화성에서 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로 (또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화성에서 증가를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 적어도 하나의 IL-2 분자 및 적어도 하나의 항체를 포함하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. IL-2 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 다양한 상호작용에 의해, 그리고 다양한 입체형상에서 항체에 결합될 수 있다. 특정한 구체예에서, IL-2 분자는 펩티드 링커를 통해 항체에 융합된다. 본원 발명에 따른 특정 면역접합체는 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된 하나의 IL-2 분자 및 하나의 항체로 본질적으로 구성된다.
"융합된"은 구성요소 (예를 들면 항체 및 IL-2 분자)가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것으로 의미된다.
본원에서 이용된 바와 같이, Fc 도메인 아단위 등에 대하여 용어 "첫 번째" 및 "두 번째"는 하나 초과의 각 유형의 모이어티가 있을 때 편의상 식별을 위해 이용된다. 이들 용어의 이용은 만약 명시적으로 진술되지 않으면, 면역접합체의 특정한 순서 또는 배향정위를 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 그리고 원치 않는 또는 비특이적 상호작용으로부터 차별될 수 있다는 것으로 의미된다. 특이적 항원 (예를 들면 PD-1 또는 FAP)에 결합하는 항체의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들면 BIAcore 기기에서 분석됨) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 한 구체예에서, 관련 없는 단백질에 항체의 결합의 정도는 예를 들면, SPR에 의해 계측될 때 항원에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다.
본원에서 이용된 바와 같이, "말초혈 단핵 세포" 또는 "PBMC"는 원형 핵을 갖는 혈액 세포의 이질성 모집단을 지칭한다. PBMC의 모집단에서 발견될 수 있는 세포의 실례는 림프구 예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포 (NKT 세포 및 CIK 세포 포함) 및 단핵구 예컨대 대식세포, 그리고 수지상 세포를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "복수의 PBMC"는 혈액 세포의 적어도 2가지 유형의 세포를 포함하는 PBMC의 제조물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중에서 2가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중에서 3가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중에서 4가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다.
PBMC는 당해 분야에서 공지된 수단에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, PBMC는 다른 혈액 세포와 비교하여, PBMC의 밀도에 근거하여 개체말초혈로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 크기 차이 및/또는 세포 밀도 차이 기반 분별 기술을 이용하여 말초혈로부터 유래된다. 일부 구체예에서, PBMC는 피콜 (예를 들면, 피콜 구배)을 이용하여 개체의 말초혈로부터 유래된다. 일부 구체예에서, PBMC는 ELUTRA® 세포 분리 시스템을 이용하여 개체의 말초혈로부터 유래된다.
일부 구체예에서, PBMC의 모집단은 개체로부터 단리된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 PBMC의 자가 모집단이고, 여기서 상기 모집단은 특정 개체로부터 유래되고, 본원에서 설명된 임의의 방법에 의해 조작되고, 특정 개체로 복귀된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 PBMC의 동종이계 모집단이고, 여기서 상기 모집단은 한 개체로부터 유래되고, 본원에서 설명된 임의의 방법에 의해 조작되고, 두 번째 개체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 PBMC의 재구성된 제조물이다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 PBMC의 모집단에서 전형적으로 발견되는 세포를 혼합함으로써; 예를 들면, T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 단핵구 중에서 2가지 이상의 모집단을 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 비장세포의 모집단 내에 세포의 비율이 인간 PBMC의 모집단 프로필을 더 잘 반영하도록 조정된다 (예를 들면, 정교하게 만들어진다). 예를 들면, 인간 PBMC의 모집단을 더 잘 반영하기 위해, B 세포가 비장세포의 모집단으로부터 고갈될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포어"는 물질 내에 홀, 파열, 공동, 구멍, 갈라진 틈, 갭, 또는 천공을 제한 없이 포함하는 개구부를 지칭한다. 일부 실례에서, (표시된 경우에) 상기 용어는 본원 발명의 표면 내에 포어를 지칭한다. 다른 실례에서, (표시된 경우에) 포어는 세포막에서 포어를 지칭할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "막"은 포어를 내포하는 선택적 장벽 또는 시트를 지칭한다. 상기 용어는 경계 또는 내층으로서 작용하는 유연한 시트 유사 구조를 포함한다. 일부 실례에서, 상기 용어는 포어를 내포하는 표면 또는 필터를 지칭한다. 이러한 용어는 용어 "세포막"과 상이하다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "필터"는 포어를 통한 선택적 통과를 가능하게 하는 다공성 물품을 지칭한다. 일부 실례에서, 상기 용어는 포어를 내포하는 표면 또는 막을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이질성"은 구조 또는 조성에서 혼성이거나 또는 균일하지 않은 무언가를 지칭한다. 일부 실례에서, 상기 용어는 소정의 표면 내에서 변화된 크기, 모양 또는 분포를 갖는 포어를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "동질성"은 구조 또는 조성에서 전체적으로 일관되거나 또는 균일한 무언가를 지칭한다. 일부 실례에서, 상기 용어는 소정의 표면 내에서 일관된 크기, 모양 또는 분포를 갖는 포어를 지칭한다.
용어 "이종성"은 이것이 핵산 서열 예컨대 코딩 서열 및 제어 서열에 관계할 때, 정상적으로는 함께 연결되지 않는, 및/또는 특정 세포와 정상적으로는 연결되지 않는 서열을 표시한다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 결합하여 발견되지 않는, 다른 핵산 분자 내에 또는 상기 핵산 분자에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들면, 핵산 작제물의 이종성 영역은 자연에서 코딩 서열과 결합하여 발견되지 않는 서열과 측접된 상기 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열의 다른 실례는 코딩 서열 그 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물 (예를 들면, 선천적 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포 내에 정상적으로는 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 세포는 본원 발명의 목적으로 이종성인 것으로 고려될 것이다. 대립유전자 변동 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 이용된 바와 같이, 이종성 DNA를 발생시키지 않는다.
용어 "이종성"은 이것이 아미노산 서열 예컨대 펩티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 관계할 때, 정상적으로는 함께 연결되지 않는, 및/또는 특정 세포와 정상적으로는 연결되지 않는 서열을 표시한다. 따라서, 펩티드 서열의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 결합하여 발견되지 않는, 다른 아미노산 분자 내에 또는 상기 아미노산 분자에 부착된 아미노산의 분절이다. 예를 들면, 펩티드 작제물의 이종성 영역은 자연에서 펩티드의 아미노산 서열과 결합하여 발견되지 않는 서열과 측접된 상기 펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이종성 펩티드 서열의 다른 실례는 펩티드 서열 그 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물 (예를 들면, 선천적 유전자로부터 코딩된 것과 상이한 아미노산을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포 내에 정상적으로는 존재하지 않는 아미노산 작제물을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포는 본원 발명의 목적으로 이종성인 것으로 고려될 것이다. 대립유전자 변동 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 이용된 바와 같이, 이종성 펩티드를 발생시키지 않는다.
세포에 관계하는 작용제, 예컨대 항원 또는 어쥬번트와 관련하여 이용될 때 용어 "외인성"은 세포 외부로부터 세포 내로 전달되는 작용제를 지칭한다. 세포는 작용제가 이미 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 그리고 외인성 작용제가 전달된 후 작용제를 생산하거나 또는 생산하지 않을 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "저해한다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 차단하는, 감소시키는, 제거하는 또는 만약 그렇지 않으면 길항하는 행위를 지칭할 수 있다. 저해는 부분적인 저해 또는 완전한 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 야기하는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 다른 실례에서, 핵산의 발현의 저해는 핵산의 전사에서 감소, mRNA 존재비 (예를 들면, 침묵 mRNA 전사)의 감소, mRNA의 분해, mRNA 번역의 저해 등을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "억제한다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 줄이는, 감소시키는, 금지하는, 제한하는, 완화하는, 또는 만약 그렇지 않으면 축소하는 행위를 지칭할 수 있다. 억제는 부분적인 억제 또는 완전한 억제를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 억제하는 것은 면역 반응을 줄이는, 감소시키는, 금지하는, 제한하는, 완화하는, 또는 만약 그렇지 않으면 축소하는 것을 야기하는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 다른 실례에서, 핵산의 발현의 억제는 핵산의 전사에서 감소, mRNA 존재비 (예를 들면, 침묵 mRNA 전사)의 감소, mRNA의 분해, mRNA 번역의 저해 등을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "증강한다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 향상시키는, 부양하는, 고조시키는, 또는 만약 그렇지 않으면 증가시키는 행위를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 증강하는 것은 면역 반응을 향상시키는, 부양하는, 고조시키는, 또는 만약 그렇지 않으면 증가시키는 것을 야기하는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 한 가지 예시적인 실례에서, 면역 반응을 증강하는 것은 항원 및/또는 어쥬번트를 이용하여, 면역 반응을 향상시키는, 부양하는, 고조시키는, 또는 만약 그렇지 않으면 증가시키는 것을 지칭할 수 있다. 다른 실례에서, 핵산의 발현을 증강하는 것은 핵산의 전사에서 증가, mRNA 존재비에서 증가 (예를 들면, mRNA 전사의 증가), mRNA의 분해에서 감소, mRNA 번역에서 증가 등을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조정한다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 변화시키는, 변경하는, 변동시키는, 또는 만약 그렇지 않으면 수정하는 행위를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 조정하는 것은 면역 반응을 변화시키는, 변경하는, 변동시키는, 또는 만약 그렇지 않으면 수정하는 것을 야기하는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 다른 실례에서, 핵산의 발현을 조정하는 것은 핵산의 전사에서 변화, mRNA 존재비에서 변화 (예를 들면, mRNA 전사의 증가), mRNA의 분해에서 상응하는 변화, mRNA 번역에서 변화 등을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유도한다"는 결과를 개시하는, 촉발하는, 자극하는, 확립하는, 또는 만약 그렇지 않으면 산출하는 행위를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 유도하는 것은 원하는 면역 반응을 개시하는, 촉발하는, 자극하는, 확립하는, 또는 만약 그렇지 않으면 산출하는 것을 야기하는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 다른 실례에서, 핵산의 발현을 유도하는 것은 핵산의 전사의 개시, mRNA 번역의 개시 등을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "상동성"은 동일한 생물체로부터 유래되는 분자를 지칭한다. 일부 실례에서, 상기 용어는 소정의 생물체 내에서 정상적으로 발견되거나 또는 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 한 가지인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합성 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 복수 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린과 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 다른 자연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-자연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 중추는 당 및 인산염 기 (RNA 또는 DNA에서 전형적으로 발견될 수 있는 바와 같이), 또는 변형되거나 또는 치환된 당 또는 인산염 기를 포함할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드의 중추는 합성 아단위 예컨대 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트 (P-NH2) 또는 혼성 포스포라미데이트- 포스포디에스테르 소중합체일 수 있다. 이에 더하여, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 상보성 가닥을 합성하고 적절한 조건하에 이들 가닥을 어닐링함으로써, 또는 적합한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 이용하여 상보성 가닥을 데노보 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 산물로부터 획득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 교체가능하게 이용되고, 그리고 최소 길이에 한정되지 않는다. 아미노산 잔기의 이런 중합체는 자연 또는 비자연 아미노산 잔기를 내포할 수 있고, 그리고 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이합체, 삼합체 및 다합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이들의 단편 둘 모두 상기 정의에 의해 포괄된다. 상기 용어는 또한, 폴리펩티드의 발현후 변형, 예컨대 글리코실화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 게다가, 본원 발명을 위해, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하기만 하면, 선천적 서열에 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (성질에서 일반적으로 보존성)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 의도적, 예컨대 특정 부위 돌연변이유발을 통해 달성되거나, 또는 우발적, 예컨대 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭에 기인한 오류를 통해 달성될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "어쥬번트"는 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 조정하는 및/또는 발생시키는 물질을 지칭한다. 일반적으로, 어쥬번트는 항원 단독과 비교하여 항원에 대한 면역 반응의 증강을 달성하기 위해 항원과 함께 투여된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 복수의 PBMC를 조건화하는 데 이용된다 (예를 들면, 실시예에서 증명된 바와 같이). 다양한 어쥬번트가 본원에서 설명된다.
용어 "CpG 올리고데옥시뉴클레오티드" 및 "CpG ODN"은 인산염에 의해 분리된 시토신 및 구아닌의 디뉴클레오티드 (본원에서 "CpG" 디뉴클레오티드, 또는 "CpG"로서 또한 지칭됨)를 내포하는 DNA 분자를 지칭한다. 본원 발명의 CpG ODN은 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 내포한다. 다시 말하면, CpG 디뉴클레오티드에서 시토신은 메틸화되지 않는다 (다시 말하면, 5-메틸시토신이 아니다). CpG ODN은 부분적인 또는 완전한 포스포로티오에이트 (PS) 중추를 가질 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"는 임상적 결과를 비롯한 유익한 또는 원하는 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본원 발명을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 다음 중에서 한 가지 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 질환으로부터 발생하는 한 가지 이상의 증상을 경감하고, 질환의 정도를 축소하고, 질환을 안정시키고 (예를 들면, 질환을 예방하거나 또는 질환의 악화를 지연시키고), 질환의 확산 (예를 들면, 전이)를 예방하거나 또는 지연시키고, 질환의 재발을 예방하거나 또는 지연시키고, 질환의 진행을 지연시키거나 또는 늦추고, 질환 상태를 개선하고, 질환의 관해 (부분적인 또는 전체)를 제공하고, 질환을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 약제의 용량을 감소시키고, 질환의 진행을 지연시키고, 삶의 질을 증가시키거나 또는 향상시키고, 체중 증가를 증가시키고, 및/또는 생존을 연장한다. 본원 발명의 방법은 치료의 이들 양상 중에서 한 가지 이상을 예기한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "병용 요법"은 첫 번째 작용제가 다른 작용제와 함께 투여되는 것으로 의미된다. "함께"는 동일한 개체에게 다른 치료 양식에 더하여 한 가지 치료 양식의 투여, 예컨대 본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체의 투여에 더하여 본원에서 설명된 바와 같은 유핵 세포의 조성물의 투여를 지칭한다. 따라서, "함께"는 개체에게 다른 치료 양식의 전달 이전, 동안 또는 이후, 한 가지 치료 양식의 투여를 지칭한다.
본원에서 이용된 용어 "효과량"은 특정된 장애, 상태 또는 질환을 치료하는 데, 예컨대 이의 증상 중에서 한 가지 이상을 개선하는, 완화시키는, 줄이는 및/또는 지연시키는 데 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암에 관하여, 효과량은 암에서 종양이 수축하도록 유발하고 및/또는 종양의 성장률을 감소시키거나 (예컨대, 종양 성장을 억제하거나), 또는 다른 원치 않는 세포 증식을 예방하거나 또는 지연시키는 데 충분한 양을 포함한다. 일부 구체예에서, 효과량은 암의 발달을 지연시키는 데 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 효과량은 재발을 예방하거나 또는 지연시키는 데 충분한 양이다. 효과량은 1회 이상의 투여에서 투여될 수 있다. 암의 경우에, 조성물 또는 면역접합체의 효과량은 (i) 암 세포의 숫자를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 감소시키고; (iii) 말초 장기 내로 암 세포 침윤을 저해하고, 지연시키고, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고; (iv) 종양 전이를 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); (v) 종양 성장을 저해하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방하거나 또는 지연시키고; (vii) 암과 연관된 증상 중에서 한 가지 이상을 얼마간 완화시키고; 및/또는 (viii) 암 기질을 교란 (예컨대 파괴)할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "동시 투여"는 병용 요법에서 첫 번째 요법 및 두 번째 요법이 약 15 분 이내, 예컨대 약 10, 5, 또는 1 분 중에서 한 가지 이내의 시간 분리로 투여된다는 것을 의미한다. 첫 번째와 두 번째 요법이 동시에 투여될 때, 첫 번째와 두 번째 요법은 동일한 조성물 (예를 들면, 첫 번째와 두 번째 요법 둘 모두를 포함하는 조성물)에 내포되거나, 또는 별개의 조성물 (예를 들면, 한 조성물에서 첫 번째 요법 및 다른 조성물에 내포된 두 번째 요법)에 내포될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "순차적 투여"는 병용 요법에서 첫 번째 요법 및 두 번째 요법이 약 15 분 초과, 예컨대 약 20, 30, 40, 50, 60분 이상 초과의 시간 분리로 투여된다는 것을 의미한다. 첫 번째 요법 또는 두 번째 요법 중 어느 한 가지가 먼저 투여될 수 있다. 첫 번째와 두 번째 요법은 별개의 조성물에 내포되는데, 이들 조성물은 동일하거나 또는 상이한 포장물 또는 키트에 내포될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "동시발생 투여"는 병용 요법에서 첫 번째 요법의 투여 및 두 번째 요법의 투여가 서로 중첩된다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "예방적 처치"는 개체가 장애를 겪거나 또는 장애를 겪을 위험에 처해 있는 것으로 알려지거나 또는 의심되지만 장애의 증상을 나타내지 않거나 또는 최소한의 증상을 나타내는 치료를 지칭한다. 예방적 처치를 받는 개체는 증상의 개시에 앞서 치료될 수 있다.
작용제, 예를 들면, 제약학적 조성물의 "치료 효과량"은 원하는 치료적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들면 질환의 부정적인 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 예방한다.
작용제, 예를 들면, 제약학적 조성물의 "예방 효과량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 예방 효과량은 예를 들면, 질환을 예방할 수 있다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 특히, 개체 또는 피험자는 인간이다.
용어 "제약학적 조성물"은 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 양립성"은 생물학적으로 또는 다른 모든 면에서 바람직하지 않는 것이 아닌 물질인 것으로 의미된다, 예를 들면, 상기 물질은 임의의 유의미한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 또는 자신이 내포되는 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서, 환자에게 투여되는 제약학적 조성물 내로 통합될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제는 바람직하게는, 독성학적 검사 및 제조 검사의 요구 기준에 부합하고 및/또는 미국 식품의약국에 의해 작성된 비활성 성분 가이드 상에 포함된다.
본원에서 설명된 임의의 구조적 및 기능적 특징에 대하여, 이들 특징을 결정하는 방법은 당해 분야에서 공지된다.
돌연변이체 IL-2 폴리펩티드
본원 발명에 따른 면역접합체는 면역요법에 대한 유리한 특성을 갖는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 독성에 기여하지만 IL-2의 효능을 위해 필수적이지 않는 IL-2의 약리학적 특성이 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드에서 제거된다. 이런 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 WO 2012/107417에서 상세하게 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다. IL-2 수용체의 상이한 형태는 상이한 아단위로 구성되고 IL-2에 대한 상이한 친화성을 나타낸다. β와 γ 수용체 아단위로 구성되는 중간 친화성 IL-2 수용체는 휴면 효과기 세포 상에서 발현되고 IL-2 신호전달에 충분하다. 상기 수용체의 α 아단위 (CD25)를 추가적으로 포함하는 높은 친화성 IL-2 수용체는 주로, 조절 T (Treg) 세포 상에서뿐만 아니라 활성화된 효과기 세포 상에서 발현되는데, 여기서 IL-2에 의한 이의 인게이지먼트는 각각, Treg 세포 매개된 면역억제 또는 활성화 유발 세포 사멸 (AICD)을 증진할 수 있다. 따라서, 이론에 한정됨 없이, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 IL-2의 친화성을 감소시키거나 또는 전폐하는 것은 조절 T 세포에 의한 효과기 세포 기능의 IL-2 유도된 하향조절 및 AICD의 과정에 의한 종양 내성의 발달을 감소시킬 것이다. 다른 한편으로, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 친화성을 유지하는 것은 IL-2에 의한, NK 및 T 세포와 같은 효과기 세포의 증식과 활성화의 유도를 보존할 것이다. 일부 구체예에서, 면역접합체의 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함한다.
CD25에 대한 친화성을 감소시킬 수 있는 인간 IL-2 (hIL-2)의 추가 아미노산 치환은 예를 들면, 아미노산 위치 35, 38 또는 43, 또는 이들의 조합 (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링), 그리고 F42A, Y45A 및 L72G와의 조합에서 생성될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W 및 K43E를 포함한다. 이들 돌연변이체는 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태와 비교하여, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 결합 친화성을 나타내고, 그리고 IL-2 수용체의 α 아단위 및 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 감소된 친화성을 갖는다.
유용한 돌연변이체의 다른 특징은 IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, NK 세포에 의한 이차성 사이토킨으로서 인터페론 (IFN)-γ를 생성하는 능력, 말초혈 단핵 세포 (PBMC)에 의한 이차성 사이토킨 - 특히 IL-10 및 TNF-α -의 정교화를 유도하는 감소된 능력, 조절 T 세포를 활성화하는 감소된 능력, T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 감소된 능력, 그리고 감소된 생체내 독성 프로필을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서 상기 아미노산 돌연변이는 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 적어도 5배, 특이적으로 적어도 10배, 더 특정하게는 적어도 25배 감소시킨다. IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 있는 구체예에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 심지어 적어도 100배 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서 상기 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이의 조합은 결합이 표면 플라스몬 공명에 의해 전혀 검출되지 않도록, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐한다.
중간 친화성 수용체에 대한 실제적으로 유사한 결합, 다시 말하면 상기 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성의 보존은 IL-2 돌연변이체가 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태의 친화성의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. 본원 발명의 IL-2 돌연변이체는 이런 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다.
IL-2의 O-글리코실화의 제거와 조합으로 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 IL-2의 친화성의 감소는 향상된 특성을 갖는 IL-2 단백질을 야기한다. 예를 들면, O-글리코실화 부위의 제거는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 포유류 세포 예컨대 CHO 또는 HEK 세포에서 발현될 때, 더 균질한 산물을 야기한다.
따라서, 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예시적인 아미노산 치환은 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T3A이다.
일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 본질적으로 전장 IL-2 분자이고 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함한다. 일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2 분자이다. 특정한 구체예에서, 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 활성화된 T 림프구 세포에서 증식, 활성화된 T 림프구 세포에서 분화, 세포독성 T 세포 (CTL) 활성, 활성화된 B 세포에서 증식, 활성화된 B 세포에서 분화, 자연 킬러 (NK) 세포에서 증식, NK 세포에서 분화, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토킨 분비, 그리고 NK/림프구 활성화된 킬러 (LAK) 항종양 세포독성으로 구성된 군에서 선택되는 세포 반응 중에서 한 가지 이상을 이끌어 낼 수 있다.
한 구체예에서 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 조절 T 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, T 세포에서 더 적은 활성화 유발 세포 사멸 (AICD)을 유도한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 감소된 생체내 독성 프로필을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 연장된 혈청 반감기를 갖는다.
본원 발명에서 유용한 특정 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3, 42, 45 및 72에 상응하는 위치에서 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 특이적 아미노산 치환은 T3A, F42A, Y45A 및 L72G이다. WO 2012/107417에서 예시된 바와 같이, 상기 사중 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 CD25에 대한 검출 가능한 결합 없음, T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 감소된 능력, Treg 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력, 그리고 감소된 생체내 독성 프로필을 나타낸다. 하지만, 이것은 효과기 세포에서 IL-2 신호전달을 활성화하고, 효과기 세포의 증식을 유도하고, 그리고 NK 세포에 의한 이차성 사이토킨으로서 IFN-γ를 생성하는 능력을 유지한다.
게다가, 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 WO 2012/107417에서 설명된 바와 같은 추가의 유리한 특성, 예컨대 감소된 표면 소수성, 좋은 안정성, 그리고 좋은 발현 수율을 갖는다. 예상치 않게, 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 또한, 야생형 IL-2와 비교하여, 연장된 혈청 반감기를 제공한다.
본원 발명에서 유용한 IL-2 돌연변이체는 IL-2의 CD25 또는 글리코실화 부위와의 인터페이스를 형성하는 IL-2의 영역에서 돌연변이를 갖는 것에 더하여, 이들 영역 외부의 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 또한 가질 수 있다. 인간 IL-2에서 이런 추가 돌연변이는 추가 이점 예컨대 증가된 발현 또는 안정성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 위치 125에서 시스테인은 U.S. 특허 번호 4,518,584에서 설명된 바와 같이, 중성 아미노산 예컨대 세린, 알라닌, 트레오닌 또는 발린으로 대체되어, 각각 C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 또는 C125V IL-2가 생성될 수 있다. 그 안에 설명된 바와 같이, IL-2의 N 말단 알라닌 잔기가 또한 결실되어, des-A1 C125S 또는 des-A1 C125A와 같은 돌연변이체가 생성될 수 있다. 대안으로 또는 결합하여, IL-2 돌연변이체는 야생형 인간 IL-2의 위치 104에서 정상적으로 발생하는 메티오닌이 중성 아미노산 예컨대 알라닌에 의해 대체되는 돌연변이를 포함할 수 있다 (참조: U.S. 특허 번호 5,206,344). 결과의 돌연변이체, 예를 들면, des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2, 또는 M104A C125S IL-2 (이런 저런 돌연변이체는 U.S. 특허 번호 5,116,943에서 및 Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)에서 발견될 수 있다)는 본원 발명의 특정 IL-2 돌연변이와 함께 이용될 수 있다.
따라서, 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 C125A이다.
당업자는 어떤 추가 돌연변이가 본원 발명의 목적으로 추가 이점을 제공할 수 있는지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2의 친화성을 감소시키거나 또는 전폐하는 IL-2 서열에서 아미노산 돌연변이, 예컨대 D20T, N88R 또는 Q126D (참조: 예를 들면 US 2007/0036752)가 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 내에 포함되는 데 적합하지 않을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-2 서열, 예를 들면 서열 번호: 19의 인간 IL-2 서열과 비교하여 12 개 이내, 11 개 이내, 10 개 이내, 9 개 이내, 8 개 이내, 7 개 이내, 6 개 이내, 또는 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-2 서열, 예를 들면 서열 번호: 19의 인간 IL-2 서열과 비교하여, 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 서열로 구성된다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 인터류킨-2 (IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 인터류킨-2 (IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 감소된 친화성을 나타내고 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐하거나 또는 감소시키고 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 인터류킨-2 (IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 인터류킨-2 (IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2는 서열 번호: 20의 서열로 구성되는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 더 낮은 (또는 전폐된) 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 더 높은 (또는 동등한) 친화성을 갖는다.
면역접합체
본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체는 IL-분자 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 면역접합체는 IL-2를 예를 들면 종양 미세환경 내로 직접적으로 표적화함으로써 IL-2 요법의 효능을 유의미하게 증가시킨다. 일부 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항원 결합 모이어티는 전체 항체 또는 면역글로불린, 또는 생물학적 기능 예컨대 항원 특이적 결합 친화성을 갖는 이의 부분 또는 변이체일 수 있다.
일부 구체예에서, 면역접합체 폴리펩티드 내에 포함된 항원 결합 모이어티는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고, 그리고 면역접합체 분자의 종양 부위로의 표적화를 야기한다. 이런 이유로, 높은 농도의 IL-2가 종양 미세환경 내로 전달될 수 있고, 그것에 의하여 접합되지 않은 IL-2의 경우에 요구될 것보다 훨씬 낮은 용량의 면역접합체를 이용하여 본원에서 언급된 다양한 면역 효과기 세포의 활성화와 증식을 야기한다. 게다가, 면역접합체의 형태에서 IL-2의 적용이 사이토킨 그 자체의 더 낮은 용량을 가능하게 하기 때문에, IL-2의 바람직하지 않은 부작용에 대한 가능성이 한정되고, 그리고 면역접합체에 의하여 체내에서 IL-2를 특정한 부위로 표적화하는 것은 또한, 전신 노출의 감소, 따라서 접합되지 않은 IL-2로 획득되는 것보다 더 적은 부작용을 야기할 수 있다. 이에 더하여, 접합되지 않은 IL-2와 비교하여, 면역접합체의 증가된 순환 반감기는 면역접합체의 효능에 기여한다. 하지만, IL-2 면역접합체의 이러한 특징은 IL-2 분자의 잠재적인 부작용을 다시 한 번 악화시킬 수 있다: 접합되지 않은 IL-2에 비하여 혈류 내에서 IL-2 면역접합체의 훨씬 긴 순환 반감기로 인해, 융합 단백질 분자의 IL-2 또는 다른 부분이 혈관구조 내에 일반적으로 존재하는 성분을 활성화할 확률이 증가한다. 순환에서 IL-2의 연장된 반감기를 야기하는 다른 모이어티 예컨대 Fc 또는 알부민에 융합된 IL-2를 내포하는 다른 융합 단백질에 동일한 우려가 적용된다. 이런 이유로, IL-2의 야생형 형태와 비교하여 감소된 독성을 갖는, 본원에서 및 WO 2012/107417에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체가 특히 유리하다.
전술된 바와 같이, IL-2를 종양 세포보다는 면역 효과기 세포로 직접적으로 표적화하는 것이 IL-2 면역요법을 위해 유리할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본원 발명은 전술된 바와 같은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 그리고 PD-1에 결합하는 항원 결합 모이어티를 제공한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 PD-1 항원 결합 모이어티는 융합 단백질을 형성한다, 다시 말하면 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 PD-1 항원 결합 모이어티와 펩티드 결합을 공유한다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 부류 면역글로불린 분자, 더욱 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 중에서 하나와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유한다. 일정한 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 Fab 분자 또는 scFv 분자이다. 한 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 다른 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 scFv 분자이다. 면역접합체는 또한, 하나 초과의 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 하나 초과의 항원 결합 모이어티, 예를 들면 첫 번째와 두 번째 항체가 면역접합체 내에 포함되는 경우에, 각 항체는 다양한 형태의 항체 및 항체 단편에서 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 항체는 Fab 분자일 수 있고, 그리고 두 번째 항체는 scFv 분자일 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 scFv 분자이거나, 또는 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 특정한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 PD-1에 결합한다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 전술된 바와 같은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 그리고 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티를 제공한다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 전술된 바와 같은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 그리고 FAP에 결합하는 항원 결합 모이어티를 제공한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 FAP 항원 결합 모이어티는 융합 단백질을 형성한다, 다시 말하면 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 FAP 항원 결합 모이어티와 펩티드 결합을 공유한다. 일부 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다. 일부 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 부류 면역글로불린 분자, 더욱 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 중에서 하나와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유한다. 일정한 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 Fab 분자 또는 scFv 분자이다. 한 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 다른 구체예에서, FAP 항원 결합 모이어티는 scFv 분자이다. 면역접합체는 또한, 하나 초과의 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 하나 초과의 항원 결합 모이어티, 예를 들면 첫 번째와 두 번째 항체가 면역접합체 내에 포함되는 경우에, 각 항체는 다양한 형태의 항체 및 항체 단편에서 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 항체는 Fab 분자일 수 있고, 그리고 두 번째 항체는 scFv 분자일 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 scFv 분자이거나, 또는 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 특정한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 한 구체예에서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 FAP에 결합한다.
면역접합체 형식
예시적인 면역접합체 형식은 PCT 공개 번호 WO 2018/184964에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다. 특정한 구체예에서, 면역접합체는 본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포에 결합하거나 또는 종양 세포 환경에서 항원에 결합한다.
일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 FAP이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 모이어티는 면역글로불린, 특히 IgG 분자, 더욱 특히 IgG1 분자이다. 한 구체예에서, 면역접합체는 1개 이하의 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 인간이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 인간 불변 영역, 예를 들면 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린은 인간 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 분자와 아미노 또는 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 구체예에서, 면역접합체는 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 더욱 특히 IgG1 분자로 본질적으로 구성된다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 직접적으로, 또는 1개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개의 아미노산을 포함하는 링커 펩티드를 거쳐 항체에 융합될 수 있다. 링커 펩티드는 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다. 적합한, 비면역원성 링커 펩티드는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 링커 펩티드를 포함한다. "n"은 일반적으로, 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 한 구체예에서, 링커 펩티드는 적어도 5개 아미노산, 한 구체예에서 5 내지 100개 아미노산, 추가의 구체예에서 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 특정한 구체예에서, 링커 펩티드는 15개 아미노산의 길이를 갖는다. 한 구체예에서, 링커 펩티드는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G=글리신, S=세린, 그리고 (x=3, n= 3, 4, 5 또는 6 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3)이고, 한 구체예에서 x=4 및 n=2 또는 3이고, 추가의 구체예에서 x=4 및 n=3이다. 특정한 구체예에서, 링커 펩티드는 (G4S)3 (서열 번호: 21)이다. 한 구체예에서, 링커 펩티드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 갖는다 (또는 이것으로 구성된다).
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 분자 및 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 모이어티는 PD-1에 결합하는 면역글로불린 분자, 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자이고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 분자 및 PD-1에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 모이어티는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 분자 및 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 모이어티는 FAP에 결합하는 면역글로불린 분자, 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자이고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 분자 및 FAP에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 모이어티는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 심루카푸스피 알파이다.
PD-1 항원 결합 모이어티
일부 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 PD-1 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 항-PD-1 항체이다.
본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 PD-1 항원 결합 모이어티는 PD-1, 특히 인간 PD-1에 결합하고, 그리고 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 PD-1이 발현되는 표적 부위, 특히 PD-1을 발현하는 T 세포; 예를 들면, 종양과 연관된 T 세포 또는 종양 항원에 결합할 수 있는 T 세포로 지향시킬 수 있다.
본원 발명의 면역접합체에서 이용될 수 있는 적합한 PD-1 항체는 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2016/073248에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
본원 발명의 면역접합체는 동일하거나 또는 상이한 항원에 결합할 수 있는 두 개 이상의 PD-1 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항원 결합 모이어티는 단일특이적이다. 특정한 구체예에서, 면역접합체는 단일, 단일특이적 항체, 특히 단일특이적 면역글로불린 분자를 포함한다.
항원 결합 모이어티는 PD-1, 특히 인간 PD-1에 특이적 결합을 유지하는 임의의 유형의 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체 단편은 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자, 그리고 F(ab')2 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 하지만, 특정한 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 면역글로불린, 특히 IgG 부류, 더욱 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린이다.
일부 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간화 가변 영역이다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간화 가변 영역이다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 상기 PD-1 항원 결합 모이어티는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
특정한 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 구체예에서, PD-1 항원 결합 모이어티는 인간화 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 분자, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인 인간 카파와 람다 CL 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3의 예시적인 서열. 특히, 중쇄 불변 영역은 본원에서 설명된 바와 같이 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
FAP 항원 결합 모이어티
일부 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 FAP 항원 결합 모이어티를 포함한다. 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 FAP, 특히 인간 FAP에 결합하고, 그리고 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 FAP가 발현되는 표적 부위, 예를 들면 FAP를 발현하는 종양 세포로 지향시킬 수 있다. 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 FAP 항원 결합 도메인을 포함하는 면역접합체는 EP3075745B1에서 설명된다.
일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 IL2v에 융합된 PD-1 결합 모이어티의 중쇄, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 결합 모이어티 중쇄, 그리고 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 PD-1 결합 모이어티 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 IL2v에 융합된 FAP 결합 모이어티의 중쇄, 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 FAP 결합 모이어티 중쇄, 그리고 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 FAP 결합 모이어티 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 심루카푸스피 알파이다.
Fc 도메인
특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G (IgG) 분자의 Fc 도메인은 이합체이며, 이것의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 아단위는 서로 안정되게 연결될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구체예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 위치 S228 (Kabat EU 색인 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이러한 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다 (참조: Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 훨씬 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
이종이합체화를 증진하는 Fc 도메인 변형
본원 발명에 따른 면역접합체는 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 특히 단일 (1개 이하의) 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 아단위가 전형적으로, 2개의 비동일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 차후 이합체화는 이들 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 야기한다. 재조합 생산에서 면역접합체의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 연결을 증진하는 변형을 항체의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 한 구체예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
이종이합체화를 시행하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 이와 같은 모든 접근법에서 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인은 각 CH3 도메인 (또는 이것을 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이합체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이합체를 형성하도록 강제되도록 (첫 번째와 두 번째 CH3 도메인이 이종이합체를 형성하고, 그리고 2개의 첫 번째 또는 2개의 두 번째 CH3 도메인 사이에 어떤 동종이합체도 형성되지 않도록), 둘 모두 상보성 방식으로 조작된다.
특정한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나에서 "노브" 변형 및 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함하는, 이른바 "노브 인투 홀" 변형이다.
노브 인투 홀 기술은 예를 들면 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 증진하고 동종이합체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기 ("노브")를 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서, 그리고 상응하는 공동 ("홀")을 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내에 창출된다.
유핵 세포의 조성물
일부 구체예에서, 본원 발명의 방법은 치료가 필요한 개체에게 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 효과량의 투여와 함께 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 효과량의 투여를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 면역 세포의 조성물이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 복수의 PBMC를 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다.
본원 발명의 특정한 구체예에서, 조성물의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 PBMC이다. 본원에서 이용된 바와 같이, PBMC는 개체로부터 획득된 전혈로부터 백혈구성분채집술에 의해 단리될 수 있다. 동일한 개체 또는 상이한 개체로부터 획득된 PBMC의 상이한 풀을 혼합함으로써 재구성된 PBMC 조성물 역시 제공된다. 다른 실례에서, PBMC는 또한, 생성된 프로필을 갖는 혼성 세포 조성물 내로 상이한 세포 모집단을 혼합함으로써 재구성될 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC를 재구성하는 데 이용되는 세포 모집단은 혼합된 세포 모집단 (예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중에서 한 가지 이상의 혼합물)이다. 일부 구체예에서, PBMC를 재구성하는 데 이용되는 세포 모집단은 정제된 세포 모집단 (예컨대 정제된 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구)이다. 추가 실례에서, PBMC 조성물을 재구성하는 데 이용되는 상이한 세포 모집단은 동일한 개체 (예를 들면 자가)로부터 단리되거나, 또는 상이한 개체 (예를 들면 동종이계 및/또는 이종성)로부터 단리될 수 있다.
이런 이유로, 본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중에서 한 가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 본질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈로부터 백혈구성분채집술 산물에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 본질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 1%, 2%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50% 중에서 한 가지 이하로 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 10% 중에서 한 가지 이하로 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈로부터 백혈구성분채집술 산물에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 1%, 2%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50% 중에서 한 가지 이하로 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 그리고 복수의 PBMC에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율은 전혈로부터 백혈구성분채집술 산물에서 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 대 PBMC 총수의 비율과 10% 중에서 한 가지 이하로 상이하다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75% 중 한 가지는 T 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 25%는 T 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 한 가지는 B 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 2.5%는 B 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 한 가지는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 3.5%는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 중 한 가지는 단핵구이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 4%는 단핵구이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 적어도 약 25 %는 T 세포이고; PBMC 중 적어도 약 2.5 %는 B 세포이고; PBMC 중 적어도 약 3.5%는 NK 세포이고; 그리고 PBMC 중 적어도 약 4%는 단핵구이다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, PBMC 중 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 이하 중 한 가지는 T 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 70% 이하는 T 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하 중 한 가지는 B 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 14 % 이하는 B 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 60% 이하 중 한 가지는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 35% 이하는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하 중 한 가지는 단핵구이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 4% 이하는 단핵구이다. 일부 구체예에서, PBMC 중 약 25 % 이하는 T 세포이고; PBMC 중 약 2.5 % 이하는 B 세포이고; PBMC 중 약 3.5% 이하는 NK 세포이고; 그리고 PBMC 중 약 4% 이하는 단핵구이다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 또는 70% 내지 75% 중 한 가지는 T 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 1% 내지 2.5%, 2.5% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20% 또는 20% 내지 25% 중 한 가지는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 1% 내지 2%, 2% 내지 3.5%, 3.5% 내지 5%, 5% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20% 또는 20% 내지 25% 중 한 가지는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 2% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 또는 35% 내지 40% 중 한 가지는 단핵구이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 4% 내지 약 25%는 단핵구이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC 중 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이고, 변형된 PBMC 중 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이고, 변형된 PBMC 중 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이고, 그리고 변형된 PBMC 중 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에서 이용된 바와 같이, PBMC는 또한, 단핵 혈액 세포 (예컨대 림프구 및 단핵구)의 혼합된 세포 모집단의 조성을 조작한 후 생성될 수 있다. 일부 사례에서, PBMC는 단핵 혈액 세포의 혼합된 세포 모집단 내에서 일정한 하위모집단 (예컨대 B 세포)을 감소시킨 후 (예컨대 고갈시킨 후) 생성된다. 개체에서 단핵 혈액 세포의 혼합된 세포 모집단에서 조성은 세포 모집단을, 동일한 개체에서 전혈로부터 획득된 백혈구성분채집술 산물과 더 유사하도록 만들기 위해 조작될 수 있다. 다른 실례에서, 단핵 혈액 세포 (예를 들면, 생쥐 비장세포)의 혼합된 세포 모집단에서 조성은 또한, 세포 모집단을, 인간 전혈로부터 획득된 백혈구성분채집술 산물로부터 단리된 인간 PBMC와 더 유사하도록 만들기 위해 조작될 수 있다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 PBMC에서 발견되는 세포 모집단이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중에서 한 가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% T 세포 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% B 세포 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% B 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% NK 세포 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% NK 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 단핵구 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% 단핵구를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 수지상 세포 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% 수지상 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% NK-T 세포 중 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% NK-T 세포를 포함한다.
항원
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 질환 연관 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 병든 세포로부터 단리된 펩티드 또는 mRNA로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 비자기 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 용해물, 예컨대 질환 세포의 용해물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 종양 용해물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 종양 항원 또는 종양 관련 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 암과 연관된다. 일부 구체예에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 항문주위암, 항문생식암, 구강암 또는 타액선암이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 두경부암 항원, 자궁경부암 항원, 외음부암 항원, 질암 항원, 음경암 항원, 항문암 항원, 항문주위암 항원, 항문생식암 항원, 구강암 항원, 타액선암 항원, 유방암 항원, 피부암 항원, 방광암 항원, 결장암, 직장암 항원, 자궁내막암 항원, 신장암 항원, 백혈병 항원, 폐암 항원, 흑색종 항원, 비호지킨 림프종 항원, 췌장암 항원, 전립선암 항원, 또는 갑상선암 항원이다, 일부 구체예에서, 암은 고형암이다. 일부 구체예에서, 암은 혈액암이다. 일부 구체예에서, 암은 바이러스 연관 암이다.
일부 구체예에서, 외인성 항원은 HPV 연관 암에서 발견되는 암 항원이다. 일부 구체예에서, 암은 국소암이다. 일부 구체예에서, 암은 전이성 암이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 감염성 질환과 연관된다. 일부 구체예에서, 감염성 질환은 HIV, HPV, EBV, MCV, HBV 또는 HCV와 연관된다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 외인성 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 인코딩되고, 그리고 하나 이상의 핵산, 예컨대 그러나 제한 없이 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 유핵 세포에 들어간다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 인코딩되고 하나 이상의 mRNA의 형태로 유핵 세포에 들어간다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원이다. 유두종 바이러스는 직경에서 ~55 nm의 비리온 크기를 갖는 작은 외피비보유 DNA 바이러스이다. 100개 초과의 HPV 유전자형이 완전히 특징화되고, 그리고 더 많은 수가 존재할 것으로 추정된다. HPV는 자궁경부암뿐만 아니라 일부 외음부암, 질암, 음경암, 구인두암, 항문암 및 직장암의 공지된 원인이다. 비록 대부분의 HPV 감염이 무증상성이고 명백히 자연발생적이긴 하지만, 종양원성 HPV 유형 중에서 한 가지로 지속적인 감염은 전암 또는 암으로 진행할 수 있다. 다른 HPV 연관 질환은 보통 사마귀, 발바닥 사마귀, 편평 사마귀, 항문생식 사마귀, 항문 병변, 표피 형성이상, 국소 상피 과형성, 입 유두종, 사마귀모양 낭포, 후두 유두종증, 편평상피 상피내 병변 (SILs), 자궁경부 상피내 종양 (CIN), 외음부 상피내 종양 (VIN) 및 질 상피내 종양 (VAIN)을 포함할 수 있다. 공지된 인간 유두종 바이러스 (HPV) 유형 중에서 대부분은 양성 병변을 야기하고 부분집합이 종양원성이다. 역학적 관계 및 계통발생적 관계에 근거하여, HPV 유형은 15가지 "높은 위험 유형" (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 및 82) 및 3가지 "개연적 높은 위험 유형" (HPV 26, 53 및 66)으로 분류되는데, 이들은 함께, 낮고 높은 등급 경부 변화와 암뿐만 아니라 다른 항문생식암 예컨대 외음부암, 질암, 음경암, 항문암 및 항문주위암뿐만 아니라 두경부암으로서 현성하는 것으로 알려져 있다. 최근에, 높은 위험 유형 HPV 16 및 18의 유방암과의 연관이 또한 설명되었다. "낮은 위험 유형"으로서 분류되는 11가지 HPV 유형 (HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 및 81)은 양성 낮은 등급 경부 변화, 성기 사마귀 및 재발성 호흡기 유두종증으로서 현성하는 것으로 알려져 있다. 피부 HPV 유형 5, 8 및 92는 피부암과 연관된다. 일부 HPV 연관 암에서, 면역계가 저하되고, 그리고 그에 상응하여 항종양 반응이 현저하게 손상된다. 참조: Suresh and Burtness, Am J Hematol Oncol 13(6):20-27 (2017). 일부 구체예에서, 외인성 항원은 동일한 및 또는 상이한 항원에 대한 반응을 이끌어 내는 복수의 폴리펩티드의 풀이다. 일부 구체예에서, 복수의 항원의 풀에서 한 항원은 복수의 항원의 풀에서 다른 항원을 향해 지향된 면역 반응을 감소시키지 않는다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 항원성 HPV 에피토프 및 하나 이상의 이종성 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 그 자체, 다른 항원, 또는 어쥬번트와 복합체를 형성한다. 일부 구체예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 HLA-A2 특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 HPV E6 항원 또는 HPV E7 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 HLA-A2-한정된 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, HLA-A2-한정된 펩티드는 서열 번호: 50-57 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 50-57 중 하나에 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 50에 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 51에 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 53의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 55의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 56의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, HPV 항원은 서열 번호: 57의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 서열 번호: x 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 서열 번호: 50-57 중 하나의 아미노산 서열 중에서 적어도 하나를 포함하는 복수의 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 서열 번호: 50-57 중 하나의 아미노산 서열 중에서 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개를 포함하는 복수의 항원이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 서열 번호: 51에 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열 및 서열 번호: 55에 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 복수의 항원이다. 바람직한 구체예에서, 외인성 항원은 서열 번호: 51의 아미노산 서열 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 복수의 항원이다. 일부 구체예에서, 복수의 항원은 비공유적으로 연결된 펩티드의 풀 내에 내포된다. 일부 구체예에서, 복수의 항원은 비공유적으로 연결된 펩티드의 풀 내에 내포되고, 여기서 각 펩티드는 단지 하나의 항원만을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 항원은 비공유적으로 연결된 펩티드의 풀 내에 내포되고, 여기서 서열 번호: 51의 아미노산 서열 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열은 별개의 펩티드 내에 내포된다.
본원에서 설명된 방법에 따른 일부 구체예에서, 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)는 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 외인성 항원을 포함한다. 추가의 구체예에서, 개체에게 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 유핵 세포의 투여 이후에, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 개체에서 임의의 다른 면역원성 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 폴리펩티드이고, 그리고 면역원성 에피토프는 면역원성 펩티드 에피토프이다. 일부 구체예에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N 말단 측접 폴리펩티드 및/또는 C 말단 측접 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 면역원성 펩티드 에피토프 및 하나 이상의 이종성 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 N 말단 및/또는 C 말단에서 이종성 펩티드 서열에 의해 측접되는 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 측접하는 이종성 펩티드 서열은 질환 연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 측접하는 이종성 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 구체예에서, 측접하는 이종성 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드 (SLP)로부터 유래된다. 일부 구체예에서, N 말단 측접 폴리펩티드는 서열 번호: 60-65 중 하나의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 C 말단 측접 폴리펩티드는 서열 번호: 66-72 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 MHC 클래스 I-한정된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-한정된 펩티드로 가공될 수 있다.
어쥬번트
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "어쥬번트"는 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 조정하고 및/또는 발생시키는 물질을 지칭할 수 있다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 어쥬번트는 유핵 세포의 모집단 예컨대 PBMC의 모집단을 조건화하는 데 이용된다 (다시 말하면, 이들 세포는 개체에게 투여에 앞서 어쥬번트와 함께 배양된다). 일부 사례에서, 어쥬번트는 외인성 항원 단독과 비교하여, 외인성 항원에 대한 면역 반응의 증강을 달성하기 위해 외인성 항원과 함께 투여된다. 이런 이유로, 어쥬번트는 외인성 항원에 대한 면역 세포 반응 (예를 들면 T 세포 반응)의 유발을 부양하는 데 이용될 수 있다. 예시적인 어쥬번트는 제한 없이, 인터페론 유전자의 자극기 (STING) 효현제, 레티노산-유도성 유전자 I (RIG-I) 효현제, 그리고 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 및/또는 TLR9에 대한 효현제를 포함한다. 예시적인 어쥬번트는 제한 없이, CpG ODN, 인터페론-α (IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산 (polyI:C), 이미퀴모드 (R837), 레시퀴모드 (R848), 또는 지질다당류 (LPS)를 포함한다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG ODN, LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다. 특정한 구체예에서, 어쥬번트는 CpG ODN이다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG ODN이다. 일부 구체예에서, CpG ODN은 부류 A CpG ODN, 부류 B CpG ODN, 또는 부류 C CpG ODN이다. 일부 구체예에서, CpG ODN 어쥬번트는 CpG ODN 1018, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CPG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG ODN 2395, CpG ODN M362, CpG ODN D-SL03의 군으로부터 선택을 포함한다. 일부 구체예에서, CpG ODN 어쥬번트는 CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT (서열 번호: 58)) 또는 CpG ODN 2006 (CpG 7909로서 또한 알려져 있음) (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (서열 번호: 73)) 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 7909이다. 일부 구체예에서, RIG-I 효현제는 폴리이노신산:폴리시티딜산 (polyI:C)을 포함한다. 복수의 어쥬번트 또한, 면역 반응의 유발을 증강하기 위해 외인성 항원과 함께 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 하나 초과의 어쥬번트를 포함한다. 복수의 어쥬번트 또한, 면역 반응의 유발을 증강하기 위해 외인성 항원과 함께 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 하나 초과의 어쥬번트를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 어쥬번트 CpG ODN, LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제의 임의의 조합을 포함한다.
조성물, 제제 및 투여 루트
일부 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에서 이용을 위한, 본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체 및/또는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 면역접합체 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원에서 제공된 외인성 항원을 포함하는 임의의 유핵 세포 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 면역접합체 및/또는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 운반체로 조제하는 것을 제공하는데, 여기서 면역접합체의 제조물은 생체내 투여용으로 조제된다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반체에서 용해되거나 또는 분산된 면역접합체의 치료 효과량을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반체에서 현탁된 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 치료 효과량을 포함한다. 관용구 "제약학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 일반적으로 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인, 다시 말하면, 적절하면 동물, 예컨대 예를 들면, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 부반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 면역접합체 및 임의적으로 추가 활성 성분을 내포하는 제약학적 조성물의 제조는 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본원 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 게다가, 동물 (예를 들면, 인간) 투여의 경우에, 제조물은 FDA 생물 표준 사무국 또는 다른 국가에서 해당 정부 당국에 의해 요구되는 바와 같은 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준에 부합해야 하는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는 운반체"는 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들면, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연 작용제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이들과 유사한 물질 그리고 이들의 조합을 포함한다 (예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329를 참조한다). 임의의 전통적인 운반체가 활성 성분과 양립하지 않는 경우가 아닌 한에 있어서, 치료적 또는 제약학적 조성물에서 이의 이용이 예기된다.
본원 발명의 면역접합체는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 루트에 의할 수 있다, 예를 들면, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 종양내 투여된다. 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 전형적으로 혈관내 투여에 의해 전달된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복막내 주사에 의한 투여용으로 설계된 것들을 포함한다. 주사를 위해, 본원 발명의 면역접합체는 수성 용액에서, 바람직하게는 생리학적으로 양립성 완충액 예컨대 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충액에서 조제될 수 있다. 용액은 조제 작용제 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안으로, 면역접합체는 이용 전, 적합한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원 없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 무균 주사가능 용액은 적합한 용매에서 필요한 양의 본원 발명의 면역접합체를, 필요에 따라, 아래에 열거된 다양한 다른 성분과 통합함으로써 제조된다. 살균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액, 현탁액 또는 유제의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기술인데, 이들 기술은 이전에 무균 여과된 액체 배지로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성한다. 액체 매질은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 그리고 액체 희석제는 주사에 앞서, 충분한 식염수 또는 글루코오스로 먼저 등장성이 되도록 만들어져야 한다. 조성물은 제조와 보관의 조건하에 안정되어야 하고, 그리고 미생물, 예컨대 세균 및 균류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 제약학적으로 허용되는 운반체는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란, 또는 기타 유사한 것을 내포할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한, 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 데 적합한 안정제 또는 작용제를 내포할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반제는 지방유 예컨대 호마유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
본원 발명의 면역접합체를 포함하는 제약학적 조성물은 전통적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의하여 제조될 수 있다. 제약학적 조성물은 이들 단백질의 제약학적으로 이용될 수 있는 제조물로의 처리를 가능하게 하는 한 가지 이상의 생리학적으로 허용가능 운반체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 전통적인 방식으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 루트에 의존한다.
면역접합체는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태에서 조성물로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실제적으로 유지하는 염이다. 이들은 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기로 형성된 것들, 또는 무기 산 예컨대 예를 들면, 염화수소산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 제약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에서 더 가용성인 경향이 있다.
일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 인산염 완충된 식염수에서 조제된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 약 50% (w/w) Cryostor® 10, 약 30% HypoThermasol® 및 약 20% (w/w)의 25% 인간 혈청 알부민에서 조제된다.
치료 방법
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및 b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 항원 또는 종양 세포 환경에서 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 질환 연관 항원이다. 일부 구체예에서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다. 일부 구체예에서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 본원 발명의 면역접합체의 이용을 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위해 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 본원 발명의 면역접합체의 이용을 위한 방법을 제공하는데, 여기서 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 종양 성장을 감소시키기 위해 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 본원 발명의 면역접합체의 이용을 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 세포 기반 면역요법을 증강하기 위해 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 본원 발명의 면역접합체의 이용을 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 예방접종이 필요한 개체를 예방접종하기 위해 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 본원 발명의 면역접합체의 이용을 위한 방법을 제공하는데; 예를 들면 여기서 개체는 예방접종에 반응성인 질환을 겪고; 여기서 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하는 데 이용하기 위한 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고; 여기서 상기 조성물은 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 유핵 세포는 외인성 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하는 데 이용하기 위한 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하고; 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 상에서 에피토프는 PD-1 에피토프이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 항원 또는 종양 세포 환경에서 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 질환 연관 항원이다. 일부 구체예에서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다. 일부 구체예에서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 면역접합체의 용도를 제공하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고; 여기서 상기 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 유핵 세포는 외인성 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 조성물의 용도를 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하고; 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와의 병용 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 상에서 에피토프는 PD-1 에피토프이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 항원 또는 종양 세포 환경에서 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 질환 연관 항원이다. 일부 구체예에서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다. 일부 구체예에서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 외인성 항원을 이들 세포 내로 도입하기 전후에 조건화된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
일부 구체예에서, 조건화 유핵 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 면역접합체는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 여러 번 투여된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 1회 초과, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 10회 초과 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 여러 번 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 1회 초과, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 10회 초과 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 각 투여 후 1회 초과, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 10회 초과 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 1 일, 2 일, 3 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 21 일 중 하나 이상에서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 0 일, 3 일, 7 일, 14 일 또는 21 일 중 하나 이상에서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 동일자, 그리고 3 일 및 7 일째에 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 7 일, 14 일 및 21 일째에 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 후 주 1회 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 전 1 일, 2 일, 3 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 21 일 중 하나 이상에서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 전 0 일, 3 일, 7 일, 14 일 또는 21 일 중 하나 이상에서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 전 동일자, 그리고 3 일 및 7 일째에 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 전 7 일, 14 일 및 21 일째에 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 유핵 세포의 조성물의 투여 전 주 1회 개체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 투여와 함께 약제로서 이용을 위한 본원 발명의 면역접합체가 제공된다. 일부 구체예에서, 면역접합체의 투여와 함께 약제로서 이용을 위한 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물이 제공된다. 추가의 양상에서, 서로 함께 질환을 치료하는 데 이용하기 위한 면역접합체 및 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물이 제공된다. 일정한 구체예에서, 치료 방법에서 이용을 위한 면역접합체 및 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 이용을 위한 면역접합체 및 본원에서 설명된 바와 같은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 치료 효과량을 서로 함께 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 겪는 개체를 치료하는 방법에서 이용을 위한 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서, 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 구체예에서, 본원 발명은 면역계를 자극하는 데 이용하기 위한 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 면역계를 자극하기 위해 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 효과량을 서로 함께 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역계를 자극하는 방법에서 이용을 위한 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물; 예를 들면, 인간이다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 이용하기 위한 약제의 제조 또는 준비에서 본원 발명의 면역접합체의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 면역접합체와 함께 이용하기 위한 약제의 제조 또는 준비에서 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, 약제는 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 것이다. 한 구체예에서, 약제는 질환을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 치료 효과량을 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서, 질환은 암이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 구체예에서, 약제는 면역계를 자극하기 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 개체에서 면역계를 자극하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 면역계를 자극하기 위한 약제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 면역 세포 예컨대 종양 침윤성 림프구 (TIL)에 의한 종양 침윤을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 Treg 세포에 비하여 CD8+ T 세포의 우선적 확대를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 예를 들면, 항원에 대한 후속 노출에 대한 더 빠른 및/또는 더 특이적 반응을 가능하게 하기 위해, 보호 면역 기억을 이끌어 내는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 이런 질환을 겪는 개체에게 면역접합체의 치료 효과량 및 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명의 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 투여와 함께 제약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명의 면역접합체를 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 일정한 구체예에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서, 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역계를 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역계를 자극하기 위해 면역접합체의 효과량 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 면역 세포 예컨대 종양 침윤성 림프구 (TIL)에 의한 종양 침윤을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 Treg 세포에 비하여 CD8+ T 세포의 우선적 확대를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역계의 자극은 예를 들면, 항원에 대한 후속 노출에 대한 더 빠른 및/또는 더 특이적 반응을 가능하게 하기 위해, 보호 면역 기억을 이끌어 내는 것을 포함한다.
일정한 구체예에서, 치료되는 질환은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 무제한적 실례는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피 세포 암종, 골암, 그리고 신장암을 포함한다. 본원 발명의 면역접합체를 이용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비 샘 (부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계 (중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역, 그리고 비뇨생식기계에서 위치된 신생물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이 또한 포함된다. 일정한 구체예에서, 암은 신장암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 전립선암 및 방광암으로 구성된 군에서 선택된다. 당업자는 많은 경우에 서로 함께, 면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물이 치유를 제공할 수 없을 수도 있으며 단지 부분적인 유익성만을 제공할 수도 있다는 것을 쉽게 인식한다. 일부 구체예에서, 일부 유익성을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구체예에서, 생리학적 변화를 제공하는 면역접합체의 양 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"인 것으로 고려된다. 치료가 필요한 개체, 환자, 또는 피험자는 전형적으로 포유동물, 더 특정하게는 인간이다.
면역접합체 및 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 생산하는 방법
일부 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 이용하기 위한 면역접합체를 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역접합체를 생산하기 위한 조건하에 이러한 면역접합체를 인코딩하는 핵산을 세포에서 발현하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고; 상기 면역접합체가 유핵 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 함께 이용하기 위한 것이고, 여기서 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 유핵 세포를 포함하는 조성물을 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 외인성 항원을 세포내에서 유핵 세포의 모집단에 도입하되; 상기 조성물이 면역접합체의 투여와 함께 이용하기 위한 것이고; 여기서 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
면역접합체를 생산하는 방법
본원 발명의 면역접합체는 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성 (예를 들면 Merrifield 고체상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 획득될 수 있다. 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 면역접합체 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 전통적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 적합한 전사/번역 제어 신호와 함께 면역접합체 (단편)의 코딩 서열을 내포하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면, Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)에서 설명된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 면역접합체 (단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (다시 말하면, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 연결되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 부분이다. "종결 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 만약 존재하면 코딩 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있으며, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5'와 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 두 개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 게다가, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 내포할 수 있거나, 또는 두 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면 본원 발명의 벡터는 단백질분해 개열을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 공동번역에서 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본원 발명의 면역접합체, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동 가능한 연결은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 그와 같은 방식으로, 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 하나 이상의 조절 서열과 연결될 때이다. 2개의 DNA 단편 (예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그것과 연결된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 야기하고, 그리고 만약 이들 2개의 DNA 단편 사이의 연쇄의 성격이 유전자 산물의 발현을 주동하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 이러한 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결될 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실제적인 전사를 주동하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 주동하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에서 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 알려져 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절 (예를 들면 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40 (예를 들면 초기 프로모터), 그리고 레트로바이러스 (예컨대 예를 들면 라우스 육종 바이러스)를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터와 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들면 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 알려져 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 그리고 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소 (특히 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES, CITE 서열로서 또한 지칭됨)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 반전 말단 반복 (ITR)을 포함할 수 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 주동하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 연결될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 조면소포체의 전역에서 성장 단백질 사슬의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로, 이러한 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 인식하는데, 신호 펩티드는 번역되는 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태가 생산된다. 예를 들면, 번역된 인간 IL-2는 폴리펩티드의 N 말단에서 20개의 아미노산 신호 서열을 갖고, 이것은 차후에 쪼개져 성숙, 133개 아미노산 인간 IL-2가 생산된다. 일정한 구체예에서, 선천적 신호 펩티드, 예를 들면 IL-2 신호 펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 자신과 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드의 분비를 주동하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나 (예를 들면 히스티딘 태그) 또는 면역접합체의 표지화를 보조하는 데 이용될 수 있었던 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA가 상기 면역접합체 (단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드와 벡터는 각각, 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에서 설명된 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 숙주 세포는 본원 발명의 면역접합체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다 (예를 들면, 이것으로 형질전환되거나 또는 형질감염되었다). 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원 발명의 면역접합체 또는 이의 단편을 산출하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 면역접합체를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 이런 세포는 타당하면, 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입될 수 있고, 그리고 대량의 벡터 내포 세포는 대규모 발효기에 파종되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 면역접합체를 획득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대 대장균 (E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명). 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK), 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포 (예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에서 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포를 포함하지만, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에서 공지된다. 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 한 가지에 융합된 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 돌연변이체 IL-2 융합 산물이 중쇄와 경쇄 둘 모두를 갖는 항체이도록, 이들 항체 사슬 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체를 생산하는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에서 제시된 바와 같은 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 면역접합체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 그리고 임의적으로, 상기 면역접합체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 면역접합체의 추가 화학적 변형이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 및 짧은 반감기의 문제가 실제적으로 직쇄 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)에 접합에 의해 향상될 수 있다 (참조: 예를 들면 WO 87/00056).
본원에서 설명된 바와 같이 제조된 면역접합체는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 기타 등등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 이용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 항체, 리간드, 수용체, 또는 면역접합체가 결합하는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 이용될 수 있다. 본원 발명의 면역접합체의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 이용될 수 있다. 예를 들면, 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 본질적으로 실시예에서 설명된 바와 같이 면역접합체를 단리하는 데 이용될 수 있다. 면역접합체의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯한 임의의 다양한 널리 알려진 분석법에 의해 결정될 수 있다.
외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 생산하는 방법
일부 구체예에서, 본원 발명은 면역 반응을 자극하기 위해 본원 발명의 면역접합체와 함께 이용하기 위한 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 면역 세포; 예를 들면, 복수의 PBMC, 또는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다. 일부 구체예에서, 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달된다. 외인성 항원을 유핵 세포에 도입하는 방법은 당해 분야에서 공지된다.
일부 구체예에서, 외인성 항원은 일시적인 포어가 세포의 막에 도입되고, 그것에 의하여 외인성 항원이 세포에 들어가는 것이 허용되도록, 세포를 협착부를 통해 통과시킴으로써 유핵 세포 내로 도입된다. 화합물의 세포 내로의 협착부 기반 전달의 실례는 WO 2013/059343, WO 2015/023982, WO 2016/070136, WO2017041050, WO2017008063, WO 2017/192785, WO 2017/192786, WO 2019/178005, WO 2019/178006, WO 2020/072833, PCT/US2020/15098 및 PCT/US2020/020194에 의해 제공된다.
일부 구체예에서, 외인성 항원은 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)를 포함하는 세포 현탁액을 협착부를 통해 통과시킴으로써, 유핵 세포 내로 전달되어 본원 발명의 유핵 세포가 생산되고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시키고, 그것에 의하여 외인성 항원이 세포에 들어가도록 이들 세포의 섭동을 야기한다. 일부 구체예에서, 협착부는 미소유체 통로 내에 내포된다. 일부 구체예에서, 복수의 협착부가 미소유체 통로 내에 병렬로 및/또는 직렬로 배치될 수 있다.
일부 구체예에서, 미소유체 통로 내에 협착부는 진입 부분, 중심점 및 출구 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 미소유체 통로 내에 협착부의 길이, 깊이 및 너비는 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 미소유체 통로 내에 협착부의 너비는 유핵 세포의 직경의 함수이다. 유핵 세포의 직경을 결정하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다; 예를 들면, 높은 콘텐츠 영상화, 세포 계수기 또는 유세포분석.
외인성 항원의 유핵 세포로의 협착부 기반 전달의 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 3 μm 내지 약 15 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 3 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm 또는 15 μm 중에서 한 가지이거나 또는 그 미만이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.0 μm, 4.1 μm, 4.2 μm, 4.3 μm, 4.4 μm, 4.5 μm, 4.6 μm, 4.7 μm, 4.8 μm, 4.9 μm, 또는 5.0 μm 중에서 한 가지이거나 또는 그 미만이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 약 4.5 μm이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 조성물은 유핵 세포의 모집단 내에 복수의 유핵 세포 (예를 들면, 복수의 PBMC)를 포함한다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 복수의 투입 PBMC 내에 가장 작은 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단은 림프구의 모집단이고, 여기서 림프구의 모집단의 직경은 약 6 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 구체예에서, 림프구의 모집단의 평균 직경은 약 7 μm이다. 일부 구체예에서, 림프구의 모집단은 T 세포의 모집단이다. 일부 구체예에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 구체예에서, 복수의 투입 PBMC 내에 가장 작은 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단은 T 세포이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 조성물은 유핵 세포의 모집단 내에 복수의 유핵 세포 (예를 들면, 복수의 PBMC)를 포함한다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 최대 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 최대 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 최대 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 5 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 협착부의 너비는 유핵 세포의 모집단 내에 최대 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단의 평균 직경의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 중 한 가지이다. 일부 구체예에서, 복수의 투입 PBMC 내에 가장 큰 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단은 단핵구의 모집단이고, 여기서 단핵구의 모집단의 직경은 약 15 μm 내지 약 25 μm이다. 일부 구체예에서, 단핵구의 모집단의 평균 직경은 약 18 μm이다. 일부 구체예에서, 복수의 투입 PBMC 내에 가장 큰 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 하위모집단은 단핵구이다.
본원에서 설명된 방법에 의해 면역 반응을 자극하기 위해, 다수의 파라미터가 화합물의 유핵 세포로의 전달에 영향을 줄 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 협착부를 통과하기 전, 통과하는 것과 동시에, 통과한 후 화합물과 접촉된다. 유핵 세포가 협착부를 통과한 후, 전달되는 화합물이 세포 현탁액에 첨가될 수 있긴 하지만, 유핵 세포는 상기 화합물을 포함하는 용액에서 현탁된 협착부를 통과할 수 있다. 일부 구체예에서, 전달되는 화합물은 협착부 위에 코팅된다.
화합물의 유핵 세포 내로의 전달에 영향을 줄 수 있는 파라미터의 실례는 협착부의 치수, 협착부의 진입 각도, 협착부의 표면 특성 (예를 들면, 거칠기, 화학적 변형, 친수성, 소수성 등), 작동 흐름 속도 (예를 들면, 협착부를 통한 세포 통과 시간), 세포 농도, 세포 현탁액에서 화합물의 농도, 세포 현탁액에서 완충액을 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 협착부를 통과한 후 유핵 세포가 회수되거나 또는 배양되는 시간의 양이, 전달되는 화합물의 유핵 세포 내로의 통과에 영향을 줄 수 있다. 화합물의 유핵 세포 내로의 전달에 영향을 주는 추가 파라미터는 협착부에서 유핵 세포의 속도, 협착부에서 전단 속도, 세포 현탁액의 점도, 흐름 속도에 직교인 속도 성분, 그리고 협착부에서 시간을 포함할 수 있다. 이에 더하여, 통로를 직렬로 및/또는 병렬로 포함하는 복수의 칩이 유핵 세포로의 전달에 영향을 줄 수 있다. 병렬된 복수의 칩은 처리량을 증강하는 데 유용할 수 있다. 이런 파라미터는 화합물의 전달을 제어하도록 설계될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 농도는 약 10개 내지 적어도 약 1012개 세포/mL의 범위, 또는 이들 사이에 임의의 농도 또는 농도 범위 안에 있다. 일부 구체예에서, 전달 화합물 농도는 약 10 ng/mL 내지 약 1 g/mL의 범위, 또는 이들 사이에 임의의 농도 또는 농도 범위 안에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 전달 화합물 농도는 약 1 pM 내지 적어도 약 2 M의 범위, 또는 이들 사이에 임의의 농도 또는 농도 범위 안에 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 0.01 μM 및 약 10 mM 사이에 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 0.01 μM 및 약 0.1 μM 사이, 약 0.1 μM 및 약 1 μM 사이, 약 1 μM 및 약 10 μM 사이, 약 10 μM 및 약 100 μM 사이, 약 100 μM 및 약 1 mM 사이, 또는 1 mM 및 약 10 mM 사이에 있다. 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 0.1 μM 및 약 1 mM 사이에 있다. 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 약 0.1 μM 및 약 10 μM 사이에 있다. 일부 구체예에서, 유핵 세포와 함께 배양되는 외인성 항원의 농도는 1 μM이다.
일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 1 nM 및 약 1 mM 사이의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 0.1 nM, 약 1 nM, 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 10 mM 초과의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 0.1 nM 내지 약 1 nM 사이, 약 1 nM 내지 약 10 nM 사이, 약 10 nM 내지 약 100 nM 사이, 약 0.1 μM 및 약 1 μM 사이, 약 1 μM 및 약 10 μM 사이, 약 10 μM 및 약 100 μM 사이, 약 100 μM 및 약 1 mM 사이, 또는 1 mM 및 약 10 mM 사이의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 10 nM 및 약 100 nM 사이의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 1 nM 및 약 10 nM 사이의 농도에서 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 약 50 nM의 농도에서 외인성 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 mRNA이다.
세포의 조건화
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서; 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)는 조건화된다. 추가의 구체예에서, 유핵 세포는 성숙된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 협착부 매개 전달 다음에 조건화된다. 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는, 협착부 전달된 외인성 항원을 포함하는 세포가 조건화되는 데 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화 세포의 조성물이 생성된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 협착부 매개 전달 다음에 조건화된다. 일부 구체예에서, 협착부 전달된 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는, 협착부 전달된 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포가 조건화되는 데 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화된 유핵 세포의 조성물이 생성된다. 일부 양상에서, a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 협착부의 너비가 상기 현탁액에서 유핵 세포의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 유핵 세포를 형성하는 단계; b) 외인성 항원이 섭동된 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 변형된 유핵 세포를 생성하는 단계; 및 c) 협착부 전달된 외인성 항원을 포함하는 변형된 유핵 세포를, 협착부 전달된 외인성 항원을 포함하는 변형된 유핵 세포가 조건화되는 데 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화된 유핵 세포의 조성물을 생성하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된, 외인성 항원을 포함하는 조건화된 유핵 세포의 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 과정은 변형된 유핵 세포를 조건화하기 위한 어쥬번트와 함께 배양 전, 외인성 항원을 포함하는 변형된 유핵 세포를 세포 현탁액으로부터 단리하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)는 협착부 매개 전달에 앞서 조건화된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 유핵 세포가 조건화되는 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되고, 그것에 의하여 조건화된 유핵 세포가 생성된다. 일부 구체예에서, a) 유핵 세포를 이들 유핵 세포가 조건화되는 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양하고, 그것에 의하여 조건화된 유핵 세포를 생성하는 단계; b) 조건화된 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 협착부의 너비가 상기 현탁액에서 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 유핵 세포의 섭동을 야기하여 조건화된 섭동된 유핵 세포를 형성하는 단계; 및 c) 외인성 항원이 조건화된 섭동된 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 조건화된 섭동된 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화된 유핵 세포를 생성하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된, 외인성 항원을 포함하는 조건화된 유핵 세포의 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 과정은 조건화된 유핵 세포를 세포 변형 협착부를 통해 통과시키는 전, 조건화된 유핵 세포를 어쥬번트로부터 단리하는 단계를 더욱 포함한다.
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)는 이들 유핵 세포가 조건화되도록, 약 1 내지 약 24 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 유핵 세포가 조건화되도록, 약 2 내지 약 10 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 유핵 세포가 조건화되도록, 약 3 내지 약 6 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 유핵 세포가 조건화되도록, 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 3.5 시간, 4 시간, 4.5 시간, 5 시간, 5.5 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 20 시간, 또는 24 시간 중 한 가지 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포는 이들 유핵 세포가 조건화되도록, 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다.
일부 구체예에서, 외인성 항원을 포함하는 복수의 PBMC를, 이들 PBMC가 조건화되는 데 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성함으로써 제조된, 외인성 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC를, 외인성 항원을 이들 PBMC에 도입하기에 앞서 이들 PBMC가 조건화되도록 충분한 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성함으로써 제조된, 외인성 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다.
본원에서 설명된 임의의 조건화된 복수의 PBMC에 따른 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 이들 PBMC가 조건화되도록, 약 1 내지 약 24 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 이들 PBMC가 조건화되도록, 약 2 내지 약 10 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 이들 PBMC가 조건화되도록, 약 3 내지 약 6 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 이들 PBMC가 조건화되도록, 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 3.5 시간, 4 시간, 4.5 시간, 5 시간, 5.5 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 20 시간, 또는 24 시간 중 한 가지 동안 어쥬번트와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 복수의 PBMC는 이들 PBMC가 조건화되도록, 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다.
본원에서 설명된 임의의 조건화된 복수의 PBMC에 따른 일부 구체예에서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 비조건화된 복수의 변형된 PBMC와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 상향조절된다. 일부 구체예에서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 비조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 세포의 하위모집단과 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 세포의 하위모집단에서 상향조절된다. 일부 구체예에서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 비조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 CD86이다. 일부 구체예에서, CD80 및/또는 CD86은 비조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 상향조절된다. 일부 구체예에서, CD80 및/또는 CD86은 비조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과하여 상향조절된다. 일부 구체예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현이 비조건화된 복수의 변형된 PBMC와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 증가된다. 일부 구체예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현이 비조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 세포의 하위모집단과 비교하여, 조건화된 복수에서 세포의 하위모집단에서 증가된다. 일부 구체예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현이 비조건화된 복수의 변형된 PBMC와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과하여 증가된다. 일부 구체예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현이 비조건화된 복수의 변형된 PBMC와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과하여 증가된다.
외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 추가 변형
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 유핵 세포 (예를 들면, PBMC)의 조성물은 유핵 세포의 생존력 및/또는 기능을 증강하는 작용제를, 이러한 작용제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교하여 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 동결 해동 주기 시에 유핵 세포의 생존력 및/또는 기능을 증강하는 작용제를, 이러한 작용제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교하여 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 작용제는 동결보존제 및/또는 저체온 보존제이다. 일부 구체예에서, 동결보존제 및 저체온 보존제는 임의의 동결 해동 주기 전 이러한 작용제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교하여, 이러한 작용제를 포함하는 유핵 세포의 조성물에서 10% 또는 20% 이하의 세포 사멸을 야기한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포 중 적어도 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 1차, 2차, 3차, 4차, 5차 동결 해동 주기까지 후 생존 가능하다. 일부 구체예에서, 작용제는 세포내섭취를 증강하는 화합물, 안정화제 또는 보조인자이다. 일부 구체예에서, 작용제는 알부민이다. 일부 구체예에서, 알부민은 생쥐, 소, 또는 인간 알부민이다. 일부 구체예에서, 작용제는 인간 알부민이다. 일부 구체예에서, 작용제는 이가 금속 양이온, 글루코오스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로오스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민, 또는 EDTA 중에서 한 가지 이상이다. 일부 구체예에서, 이가 금속 양이온은 Mg2+, Zn2+ 또는 Ca2+ 중에서 한 가지 이상이다. 일부 구체예에서, 작용제는 피루브산나트륨, 아데닌, 트레할로스, 덱스트로스, 만노오스, 수크로오스, 인간 혈청 알부민 (HSA), DMSO, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 이노신, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 나트륨 금속 이온, 칼륨 금속 이온, 마그네슘 금속 이온, 염화물, 아세트산염, 글루코네이트, 수크로오스, 수산화칼륨, 또는 수산화나트륨 중에서 한 가지 이상이다. 일부 구체예에서, 작용제는 피루브산나트륨, 아데닌, Rejuvesol®, 트레할로스, 덱스트로스, 만노오스, 수크로오스, 인간 혈청 알부민 (HSA), PlasmaLyte®, DMSO, Cryostor® CS2, Cryostor® CS5, Cryostor® CS10, Cryostor® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, HypoThermosol® 중에서 한 가지 이상이다.
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 유핵 세포의 조성물은 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는 복수의 변형된 PBMC를 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 증가된 발현을 야기하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 증가된 발현을 야기하는 mRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 T 세포 활성화를 자극하는 Signal 2 효과기이다.
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 IL-2, IL-12, IL-21, 또는 IFNα2 중에서 한 가지 이상이다. 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 증가된 발현 및/또는 분비를 야기하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 T 세포 활성화를 자극하는 Signal 3 효과기이다.
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 복수의 변형된 PBMC에서 적어도 하나의 세포는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 MHC 클래스 I 발현을 조정하기 위한 추가 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 HLA-A02 MHC 클래스 I의 발현을 조정하기 위한 추가 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC는 MHC 클래스 II 발현을 조정하기 위한 추가 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 동종이계 상황에서, 변형된 PBMC의 투여에 대한 반응으로 개체에서 시작되는 선천성 면역 반응은 동종이계 상황에서, 추가 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 투여에 대한 반응으로 개체에서 시작되는 선천성 면역 반응과 비교하여 감소된다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는 추가 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여 증가된다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는 추가 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여, 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 이상 증가된다. 일부 구체예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는 추가 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 본질적으로 동일하다.
본원에서 설명된 방법 중 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 상기 과정은 추가 배양 단계 없이 제조된 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 유핵 세포의 생존력 및/또는 기능을 증강하는 작용제와 함께 유핵 세포의 조성물을 배양하는 단계를 더욱 포함한다.
시스템 및 키트
일부 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역 반응을 조정하는 데 이용하기 위한 키트 또는 제조 물품을 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물, 그리고 면역접합체를 포함하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고; 여기서 상기 조성물 및 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 병용하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 포함하는데, 여기서 상기 조성물은 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 것이고, 그리고 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 면역접합체를 포함하는데, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드는 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있고; 여기서 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 외인성 항원을 포함하는 세포의 조성물과 함께 이용하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 적합한 포장 내에 본원에서 설명된 성분 (예를 들면 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물 및/또는 면역접합체)을 포함한다. 적합한 포장 재료는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예를 들면, 바이알 (예컨대 밀봉된 바이알), 용기, 앰풀, 병, 항아리, 유연 포장 (예를 들면, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 더욱 살균되고 및/또는 밀봉될 수 있다.
본원 발명은 또한, 본원에서 설명된 방법의 성분을 포함하는 키트를 제공하고, 그리고 개체에서 면역 반응을 조정하기 위해 상기 방법을 수행하기 위한 사용설명서 및/또는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 수 있다. 본원에서 설명된 키트는 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주입기, 그리고 본원에서 설명된 임의의 방법을 수행하기 위한 사용설명서; 예를 들면, 개체에서 면역 반응을 조정하기 위한 사용설명서 또는 외인성 항원을 내포하도록 유핵 세포를 변형하기 위한 사용설명서를 갖는 포장 삽입물을 비롯한, 다른 재료를 더욱 포함할 수 있다.
예시적인 구체예
본원 발명은 하기 열거된 구체예를 제공한다.
1. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법, 상기 방법은
a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
2. 개체에서 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법, 상기 방법은
a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및
b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
3. 유핵 세포 기반 면역요법을 증강하기 위한 방법, 상기 방법은 면역접합체의 효과량을 유핵 세포 기반 면역요법과 함께 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
4. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법, 상기 방법은
a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 상기 질환과 연관된 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
5. 예방접종이 필요한 개체를 예방접종하는 방법, 상기 방법은
a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
6. 구체예 5의 방법, 여기서 개체는 예방접종에 반응성인 질환을 겪는다.
7. 구체예 4 내지 6 중 어느 하나의 방법, 여기서 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
8. 개체에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법, 상기 방법은
a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및
b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함한다.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 방법, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합한다.
10. 구체예 11의 방법, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합한다.
11. 구체예 10의 방법, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
12. 구체예 11의 방법, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
13. 구체예 11 또는 12의 방법, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
14. 구체예 11 내지 13 중 어느 하나의 방법, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
15. 구체예 11 내지 14 중 어느 하나의 방법, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
16. 구체예 11 내지 15 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 22의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
17. 구체예 11 내지 16 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 2개의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
18. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 방법, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
19. 구체예 18의 방법, 여기서 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다.
20. 구체예 1 내지 8 및 18 내지 19 중 어느 하나의 방법 , 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다.
21. 구체예 19 또는 20의 방법, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
22. 구체예 21의 방법, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
23. 구체예 21 또는 22의 방법, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
24. 구체예 21 내지 23 중 어느 하나의 방법, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
25. 구체예 21 내지 24 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
26. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 방법, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함한다.
27. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 방법, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타낸다.
28. 구체예 1 내지 27 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
29. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포는 면역 세포이다.
30. 구체예 1 내지 29 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다.
31. 구체예 30의 방법, 여기서 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함한다.
32. 구체예 1 내지 31 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다.
33. 구체예 1 내지 32 중 어느 하나의 방법, 여기서 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달된다.
34. 구체예 1 내지 33 중 어느 하나의 방법, 여기서 외인성 항원은 질환 연관 항원이다.
35. 구체예 34의 방법, 여기서 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다.
36. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나의 방법, 여기서 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원이다.
37. 구체예 1 내지 36 중 어느 하나의 방법, 여기서 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함한다.
38. 구체예 37의 방법, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
39. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 방법, 여기서 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다:
a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
40. 구체예 39의 방법, 여기서 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다.
41. 구체예 39 또는 40의 방법, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다.
42. 구체예 39 내지 41 중 어느 하나의 방법, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다.
43. 구체예 39 내지 42 중 어느 하나의 방법, 여기서 협착부의 너비는 약 4.5 μm이다.
44. 구체예 39 내지 43 중 어느 하나의 방법, 여기서 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다.
45. 구체예 39 내지 44 중 어느 하나의 방법, 여기서 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재한다.
46. 구체예 1 내지 45 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화된다.
47. 구체예 46의 방법, 여기서 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다.
48. 구체예 46 또는 47의 방법, 여기서 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화된다.
49. 구체예 46 내지 48 중 어느 하나의 방법, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
50. 구체예 46 내지 49 중 어느 하나의 방법, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다.
51. 구체예 46 내지 50 중 어느 하나의 방법, 여기서 어쥬번트는 CpG 7909이다.
52. 구체예 46 내지 51 중 어느 하나의 방법, 여기서 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC이다.
53. 구체예 52의 방법, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
54. 구체예 53의 방법, 여기서 동시자극성 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다.
55. 구체예 52 내지 54 중 어느 하나의 방법, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
56. 구체예 55의 방법, 여기서 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21이다.
57. 구체예 52 내지 56 중 어느 하나의 방법, 여기서 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86이다.
58. 구체예 52 내지 57 중 어느 하나의 방법, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는다.
59. 구체예 58의 방법, 여기서 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가된다.
60. 구체예 1 내지 59 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다.
61. 구체예 1 내지 60 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포를 포함하는 조성물은 여러 번 투여된다.
62. 구체예 1 내지 61 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여된다.
63. 구체예 1 내지 62 중 어느 하나의 방법, 여기서 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여된다.
64. 구체예 1 내지 63 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여된다.
65. 구체예 64의 방법, 여기서 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여된다.
66. 구체예 1 내지 65 중 어느 하나의 방법, 여기서 개체는 인간이다.
67. 구체예 1 내지 66 중 어느 하나의 방법, 여기서 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
68. 구체예 1 내지 67 중 어느 하나의 방법, 여기서 유핵 세포의 조성물 및/또는 면역접합체는 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다.
69. 구체예 68의 방법, 여기서 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법이다.
70. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물, 여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 병용되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다.
71. 구체예 70의 조성물, 여기서 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
72. 구체예 70 또는 71의 조성물, 여기서 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
73. 구체예 70 내지 72 중 어느 하나의 조성물, 여기서 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여된다.
74. 구체예 70 내지 73 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합한다.
75. 구체예 70 내지 74 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합한다.
76. 구체예 70 내지 75 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
77. 구체예 76의 조성물, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
78. 구체예 76 또는 77의 조성물, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
79. 구체예 76 내지 78 중 어느 하나의 조성물, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
80. 구체예 76 내지 79 중 어느 하나의 조성물, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
81. 구체예 70 내지 80 중 어느 하나의 조성물, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
82. 구체예 70 내지 81 중 어느 하나의 조성물, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
83. 구체예 70 내지 73 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
84. 구체예 83의 조성물, 여기서 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다.
85. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 84 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다.
86. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 85 중 어느 하나의 조성물, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
87. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 86 중 어느 하나의 조성물, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
88. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 87 중 어느 하나의 조성물, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
89. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 88 중 어느 하나의 조성물, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
90. 구체예 70 내지 73 및 83 내지 89 중 어느 하나의 조성물, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
91. 구체예 70 내지 90 중 어느 하나의 조성물, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함한다.
92. 구체예 70 내지 91 중 어느 하나의 조성물, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타낸다.
93. 구체예 70 내지 92 중 어느 하나의 조성물, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
94. 구체예 70 내지 93 중 어느 하나의 조성물, 여기서 유핵 세포는 면역 세포이다.
95. 구체예 70 내지 94 중 어느 하나의 조성물, 여기서 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다.
96. 구체예 95의 조성물, 여기서 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함한다.
97. 구체예 70 내지 94 중 어느 하나의 조성물, 여기서 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다.
98. 구체예 70 내지 97 중 어느 하나의 조성물, 여기서 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달된다.
99. 구체예 70 내지 98 중 어느 하나의 조성물, 여기서 외인성 항원은 질환 연관 항원이다.
100. 구체예 70 내지 99 중 어느 하나의 조성물, 여기서 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다.
101. 구체예 70 내지 100 중 어느 하나의 조성물, 여기서 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원이다.
102. 구체예 70 내지 101 중 어느 하나의 조성물, 여기서 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함한다.
103. 구체예 102의 조성물, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
104. 구체예 70 내지 103 중 어느 하나의 조성물, 여기서 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다:
a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
105. 구체예 104의 조성물, 여기서 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다.
106. 구체예 104 또는 105의 조성물, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다.
107. 구체예 104 내지 106 중 어느 하나의 조성물, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다.
108. 구체예 104 내지 107 중 어느 하나의 조성물, 여기서 협착부의 너비는 약 4.5 μm이다.
109. 구체예 104 내지 108 중 어느 하나의 조성물, 여기서 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다.
110. 구체예 104 내지 109 중 어느 하나의 조성물, 여기서 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재한다.
111. 구체예 70 내지 110 중 어느 하나의 조성물, 여기서 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화된다.
112. 구체예 111의 조성물, 여기서 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다.
113. 구체예 111 또는 112의 조성물, 여기서 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화된다.
114. 구체예 111 내지 113 중 어느 하나의 조성물, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
115. 구체예 111 내지 114 중 어느 하나의 조성물, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다.
116. 구체예 111 내지 115 중 어느 하나의 조성물, 여기서 어쥬번트는 CpG 7909이다.
117. 구체예 111 내지 116 중 어느 하나의 조성물, 여기서 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC이다.
118. 구체예 117의 조성물, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
119. 구체예 118의 조성물, 여기서 동시자극성 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다.
120. 구체예 117 내지 119 중 어느 하나의 조성물, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
121. 구체예 120의 조성물, 여기서 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21이다.
122. 구체예 117 내지 123 중 어느 하나의 조성물, 여기서 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86이다.
123. 구체예 117 내지 124 중 어느 하나의 조성물, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는다.
124. 구체예 117 내지 123 중 어느 하나의 조성물, 여기서 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가된다.
125. 구체예 70 내지 124 중 어느 하나의 조성물, 여기서 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여된다.
126. 구체예 70 내지 125 중 어느 하나의 조성물, 여기서 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여된다.
127. 구체예 126의 조성물, 여기서 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여된다.
128. 구체예 70 내지 127 중 어느 하나의 조성물, 여기서 개체는 인간이다.
129. 구체예 70 내지 128 중 어느 하나의 조성물, 여기서 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
130. 구체예 70 내지 129 중 어느 하나의 조성물, 여기서 조성물은 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다.
131. 구체예 130의 조성물, 여기서 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법이다.
132. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체, 여기서 상기 면역접합체는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 병용된다.
133. 구체예 132의 면역접합체, 여기서 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환이다.
134. 구체예 132 또는 133의 면역접합체, 여기서 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
135. 구체예 132 내지 134 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여된다.
136. 구체예 132 내지 135 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합한다.
137. 구체예 132 내지 136 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합한다.
138. 구체예 132 내지 137 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
139. 구체예 138의 면역접합체, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
140. 구체예 138 또는 139의 면역접합체, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
141. 구체예 138 내지 140 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
142. 구체예 138 내지 141 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
143. 구체예 132 내지 142 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 22의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
144. 구체예 132 내지 143 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
145. 구체예 132 내지 135 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
146. 구체예 132 내지 135 및 145 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 테나신-C의 A1 도메인 (TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인 (TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B (EDB), 암배아 항원 (CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP)으로 구성된 군에서 선택된다.
147. 구체예 132 내지 135 및 145 내지 146 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합한다.
148. 구체예 132 내지 135 및 145 내지 147 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티이다.
149. 구체예 148의 면역접합체, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
150. 구체예 148 또는 149의 면역접합체, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
151. 구체예 148 내지 150 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
152. 구체예 132 내지 135 및 145 내지 151 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
153. 구체예 132 내지 152 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함한다.
154. 구체예 132 내지 153 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타낸다.
155. 구체예 132 내지 154 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
156. 구체예 132 내지 155 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 면역 세포이다.
157. 구체예 132 내지 156 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다.
158. 구체예 157의 면역접합체, 여기서 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함한다.
159. 구체예 132 내지 156 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상이다.
160. 구체예 132 내지 159 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달된다.
161. 구체예 132 내지 160 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 외인성 항원은 질환 연관 항원이다.
162. 구체예 132 내지 161 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원이다.
163. 구체예 132 내지 162 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원이다.
164. 구체예 132 내지 163 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함한다.
165. 구체예 164의 면역접합체, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
166. 구체예 132 내지 165 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다:
a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
167. 구체예 166의 면역접합체, 여기서 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다.
168. 구체예 166 또는 167의 면역접합체, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다.
169. 구체예 166 내지 168 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다.
170. 구체예 166 내지 169 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 협착부의 너비는 약 4.5 μm이다.
171. 구체예 166 내지 170 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다.
172. 구체예 166 내지 171 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재한다.
173. 구체예 132 내지 172 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화된다.
174. 구체예 173의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양된다.
175. 구체예 173 또는 174의 면역접합체, 여기서 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화된다.
176. 구체예 173 내지 175 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제이다.
177. 구체예 173 내지 176 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)이다.
178. 구체예 173 내지 177 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 어쥬번트는 CpG 7909이다.
179. 구체예 173 내지 178 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC이다.
180. 구체예 179의 면역접합체, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
181. 구체예 180의 면역접합체, 여기서 동시자극성 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다.
182. 구체예 179 내지 181 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형된다.
183. 구체예 182의 면역접합체, 여기서 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21이다.
184. 구체예 179 내지 183 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86이다.
185. 구체예 179 내지 184 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는다.
186. 구체예 179 내지 185 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가된다.
187. 구체예 132 내지 186 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여된다.
188. 구체예 132 내지 186 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여된다.
189. 구체예 188의 면역접합체, 여기서 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여된다.
190. 구체예 132 내지 189 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 개체는 인간이다.
191. 구체예 132 내지 190 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는다.
192. 구체예 132 내지 191 중 어느 하나의 면역접합체, 여기서 조성물은 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여된다.
193. 구체예 192의 면역접합체, 여기서 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법이다.
194. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 면역접합체의 용도, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
여기서 상기 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 유핵 세포는 외인성 항원을 포함한다.
195. 구체예 194의 용도, 여기서 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물 이전에, 상기 조성물과 동시에, 또는 상기 조성물 이후에 투여된다.
196. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 조성물의 용도, 여기서 상기 조성물은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하고;
여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 함께 투여용으로 조제되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다.
197. 구체예 196의 조성물, 여기서 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여된다.
198. 구체예 1 내지 69 중 어느 하나의 방법에서 이용을 위한 키트.
199. 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물 및 면역접합체를 포함하는 키트, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 여기서 상기 조성물 및 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 병용하기 위한 것이다.
200. 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 포함하는 키트, 여기서 상기 조성물은 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 것이고;
여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다.
201. 면역접합체를 포함하는 키트, 여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
여기서 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 상기 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 이용하기 위한 것이다.
202. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 이용하기 위한 면역접합체를 생산하기 위한 방법, 상기 방법은 면역접합체를 생산하기 위한 조건하에 이러한 면역접합체를 인코딩하는 핵산을 세포에서 발현하되,
상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
상기 면역접합체가 유핵 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 함께 이용하기 위한 것이고, 여기서 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계를 포함한다.
203. 구체예 202의 방법, 여기서 면역접합체는 융합 단백질이다.
204. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 유핵 세포를 포함하는 조성물을 생산하기 위한 방법, 상기 방법은 외인성 항원을 세포내에서 유핵 세포의 모집단에 도입하되;
상기 조성물이 면역접합체의 투여와 함께 이용하기 위한 것이고;
여기서 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G (인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인 단계를 포함한다.
실시예
당업자는 본원 발명의 범위 및 사상 안에서 여러 구체예가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본원 발명은 이제, 하기 무제한적 실시예를 참조하여 더 상세하게 설명될 것이다. 하기 실시예는 본원 발명을 더욱 예증하지만, 당연히, 어떤 방식으로든 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
하기 실시예에서, SQZ-PBMC는 본원에서 설명된 바와 같은 SQZ 기술을 이용하여 세포내 전달되는 HPV16 E7(43-77) SLP (서열 번호: 56)인 외인성 항원을 포함하는 조건화된 PCMC의 조성물을 지칭한다. PD1-IL2v는 변이체 IL-2 폴리펩티드 및 PD-1 항원 결합 모이어티를 포함하는 면역접합체를 지칭한다. FAP-IL2v는 변이체 IL-2 폴리펩티드 및 FAP 항원 결합 모이어티를 포함하는 면역접합체를 지칭한다.
실시예 1. PD1-IL2v와 병용으로 SQZ-PBMC 치료는 모든 세포 용량에서 상승적 유익성을 갖는다
TC1 세포 (고맙게도, Prof TC Wu, Johns Hopkins University, Baltimore, MD에 의해 제공됨)가 100 μL HBBS에서 5 x 105개 세포의 농도로 C57BL/6NCrl 생쥐 (Charles River로부터 구입됨)의 옆구리에 피하 이식되었다. 종양 성장이 공식 V=W2Lπ/6을 이용하여 캘리퍼스로 계측되었다. 동물 실험은 승인된 허가증 VD3142 하에 수행되었다.
TC1 종양 이식물을 내포하는 생쥐가 세포내 전달되는 E7 HPV 항원을 포함하는 SQZ-PBMC 및 PD1-IL2v의 병용 요법의 유용성을 검사하는 데 이용되었다. 병용 치료가 7일, 10일 및 13일 자 TC1 세포 이식에서 생쥐에게 정맥내 투여되었다. 종양 용적이 종양 성장 개시 후 10-60 일 사이에 대략 주 2-3회 규칙적인 간격에서 계측되었다. 생존이 매일 모니터링되었고, 그리고 종양 성장이 주 2회 계측되었다. 종양 길이 (mm) 및 너비 (mm)가 캘리퍼스로 계측되었고, 그리고 종양 용적 (mm3)이 종양 길이 (mm) x 너비 (mm) x 너비 (mm)의 결과물로서 계산되었다. 각 생쥐의 체중이 주 2회 계측되었고, 그리고 종양 이식에 앞서 시작 체중과 비교되었다. 생쥐의 각 군은 아래의 표 1에서 설명된 바와 같이, SQZ-PBMC 치료의 생쥐 대용품의 고정된 용량을 제공받았다. SQZ-PBMC의 병용 요법을 제공받는 생쥐는 고정된 용량의 PD1-IL2v와 함께 동일한 용량의 세포가 제공되었다.
표 1. 치료군 및 치료제의 용량
대조 치료 없음
PD1-IL2v 0.5 mg/kg PD1-IL2v
SQZ-PMBC 0.25 x 106 SQZ-PBMC 세포
SQZ-PMBC 1 x 106 SQZ-PBMC 세포
SQZ-PMBC 4 x 106 SQZ- PBMC 세포
SQZ-PMBC + PD1-IL2v 0.25 x 106 SQZ-PBMC 세포 + 0.5 mg/kg PD1-IL2v
SQZ-PMBC + PD1-IL2v 1 x 106 SQZ- PBMC 세포 + 0.5 mg/kg PD1-IL2v
SQZ-PMBC + PD1-IL2v 4 x 106 SQZ- PBMC 세포 + 0.5 mg/kg PD1-IL2v
도 1에 따르면, PD1-IL2v 치료 또는 낮은 농도의 SQZ-PBMC는 투여후 약 27 일 이후에 치료 없음에 비하여 종양 용적을 감소시키는 데 효과적이었다. SQZ-PBMC 단독의 유용성은 세포 용량에 비례하여 증가하였다.
생쥐는 종양 이식후 14 일째에 SQZ-PBMC가 제공되었고, 그 이후에 종양 이식후 21, 24 및 27일 자에 PD1-IL2v의 3회 투여가 뒤따랐다. 가장 강한 종양 감소 용적은 SQZ-PBMC를 PD1-IL2v와 병용하는 요법에서 목격되었다 (도 1). SQZ-PBMC 단독의 용량을 제공받는 생쥐는 종양 용적에서 즉각적인 감소를 보여주었다. PD1-IL2v와 병용될 때, 10마리의 생쥐 중 6마리는 4x106 SQZ-PBMC 세포 용량에서 12 주째에 종양이 없었다 (도 1, 도 2f). 추가적으로, 10마리의 생쥐 중 3마리 및 10마리의 생쥐 중 1마리는 1x106 (도 1, 도 2e) 및 0.25x106 (도 1, 도 2d) SQZ 통합 세포 용량, 각각에서 종양이 없었다.
종양 제거에 대한 PD1-IL2v의 유익한 효과는 PD1을 표적화하는 분자에 한정되지 않았다. FAP-IL2v를 이용한 치료에 의해, 그리고 유사한 방법을 이용하여 결과의 종양 용적을 계측함으로써 추가 검사가 수행되었다. 실험이 다른 코호트를 이용하여 실행되었다 (표 2). 실험의 이러한 세트에서, 12마리의 생쥐가 모든 치료군에 대해 이용되었는데, 이들은 치료 없음, SQZ-PBMC (1.0 x 106개 세포), SQZ + FAP-IL2v (1.0 x 106개 세포 + 2 mg/kg), FAP-IL2v (2 mg/kg), SQZ + PD1-IL2v (1.0 x 106개 세포 + 1 mg/kg), 그리고 PD1-IL2v (1 mg/kg)를 포함한다. SQZ 치료를 제공받는 생쥐는 14일 자에 I.V. 주사를 제공받았고, 그리고 FAP-IL2v 또는 PD1-IL2v의 추가 I.V. 주사가 병용 투약군에 대해 21, 28 및 35일 자에 수행되었다.
표 2. 병용 치료군
군 SQZ-PBMC 병용 투약 생쥐 수
치료 없음 --- --- 12
SQZ-PBMC 1.0 x 106개 세포 --- 12
SQZ-PBMC + FAP-IL2v 1.0 x 106개 세포 2 mg/kg 12
FAP-IL2v --- 2 mg/kg 12
SQZ-PBMC + PD1-IL2v 1.0 x 106개 세포 1 mg/kg 11
PD1-IL2v --- 1 mg/kg 12
양쪽 치료군에서, FAP-IL2v 또는 PD1-IL2v 단독은 어떤 형태의 치료도 제공받지 않은 대조에 비하여, 생쥐에서 종양 용적에 대한 중간 정도의 효과를 갖거나 또는 효과가 없었다 (도 3a-b). SQZ-PBMC 단독을 이용한 치료는 양쪽 도면에서 플로팅되는데, 이들은 PBMC 그 자체가 치료 이후에 여러 주의 코스에 걸쳐 종양 용적을 감소시키는 데 효과적이라는 것을 보여준다. SQZ-PBMC의 FAP-IL2v 또는 PD1-IL2v 중 어느 하나와의 병용이 전달될 때, 종양 용적이 치료 이후에 극적으로 감소되었고, 그리고 억제 효과가 수개월의 시간 척도에서 존속하였다. SQZ-PBMC + FAP-IL2v의 병용으로 치료된 모든 생쥐 중 75%가 실험의 49일 자에 종양이 없고, 그리고 SQZ-PBMC + PD1-IL2v로 치료된 모든 생쥐 중 100%가 실험의 동일한 시점에서 종양이 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, SQZ-PBMC 치료만을 제공받는 생쥐 중 17%가 실험의 종료 시점에서 종양이 없었다. 개별 생쥐에 대한 종양 용적을 보여주는 거미 플롯이 도 4에서 도시되는데, 이것은 개별 생쥐 전체에 대하여 일관된 종양 용적 치수를 부각시킨다. SQZ-PBMC 및 SQZ-PBMC + PD1-IL2v의 병용 요법을 제공받는 생쥐 둘 모두 대략 24일 자에 종양 용적에서 감소를 보여주었고, 그리고 종양 용적이 28일 자까지 실험의 지속 기간 동안 지속적으로 감소하였다 (도 5).
마지막으로, 종양을 생쥐 내로 재도입함으로써, 종양 형성에 대한 장기 효과가 사정되었다. 종양이 없는 생쥐는 일차 종양 이식 후 12 주째에 왼쪽 옆구리 종양으로 재공격되었다. 치료를 제공받지 않거나, 또는 0.25x106, 1x106 또는 4x106 SQZ-PBMC의 0.5 mg/kg PD1-IL2v와의 병용 치료를 제공받는 생쥐에 대한 TC-1 종양 재공격 이후에, 왼쪽 옆구리 종양의 종양 용적이 사정되었다. 생쥐는 SQZ-PBMC 및 PD1-IL2v를 이용한 치료 이후에 종양 재공격에 대해 내성이었다 (도 6).
실시예 2. TIL 분석을 이용한, SQZ-PBMC 치료에 대한 PD1-IL2v의 영향
SQZ-PBMC 치료 효능에 대한 PD1-IL2v의 영향을 결정하기 위해, 종양 침윤 백혈구 (TIL) 분석이 종양 샘플에서 수행되었다. 생쥐가 대조 (치료를 제공받지 않음), PD1-IL2v 단독 치료군 (0.5 mg/kg의 PD1-IL2v를 제공받음), SQZ 단독 치료군 (1x106으로 투약된 SQZ-PBMC를 제공받음), 그리고 SQZ-PBMC + PD1-IL2v의 병용 치료군 (0.5 mg/kg PD1-IL2v와 함께 1x106 SQZ-PBMC를 제공받음)을 포함하는 4가지 치료군으로 나눠졌다.
SQZ-PBMC가 14일 자에 투여되었고, 그리고 PDL1-IL2v가 21, 24 및 27일 자에 투여되었다. 치료 이후에, E7-사합체 세포 내에서 Ki67+ 발현의 백분율이 종양 내에서 T 세포 증식을 정량하는 데 이용되었다. Ki67+ 발현의 총 백분율은 SQZ-PBMC 단독을 이용한 치료와 비교하여, SQZ-PBMC + PDL1-IL2v의 병용을 이용한 치료 이후에 훨씬 컸다 (도 7a). 종양 샘플 내에 총 그랜자임 B 평균 형광 강도 (MFI)를 사정함으로써 세포독성이 정량되었다. 그랜자임 B는 면역 반응 동안 NK 세포 및 T 세포에 의해 분비되고, 그리고 높은 수준의 그랜자임 B는 면역 반응의 유도에 관련된다. SQZ-PBMC + PD1-IL2v를 이용한 병용 치료는 모든 치료군과 비교하여, 가장 큰 그랜자임 B MFI를 야기하였다. PD1-IL2v 및 SQZ-PBMC 치료 단독은 치료되지 않은 대조와 비교하여, 그랜자임 B MFI에서 약간 증가를 유도하였다 (도 7b). 그 다음, CD8+ 세포 상에서 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 발현의 백분율을 정량함으로써 사이토킨 생산이 계측되었다. 사이토킨-발현 CD8+ T 세포의 백분율이 자극되지 않은 에피토프 및 E7 자극된 에피토프에서 모든 치료군 전체에 대하여 정량되었다. 사이토킨 생산은 병용 치료 이후에, 자극되지 않은 샘플에 비하여 E7 에피토프 종양 샘플에서 유의미하게 증가되었다 (도 7c-7d). 이것은 표적화된 세포독성 T 세포가 종양으로 특이적으로 모집된다는 것을 암시한다. 모든 다른 조건에서는 사이토킨 수준이 낮았다.
종양 덩어리가 24일 자 (도 8a) 및 28일 자 (도 8e)에 정량되었다. 24일 자 및 28일 자까지, 종양은 단독으로 또는 PD1-IL2v와 병용으로 SQZ-PBMC를 제공받는 군에 대해 크기에서 비슷하였다 (도 8a, 8e). 28일 자는 SQZ-PBMC 및 PD1-IL2v와의 병용 요법 사이의 차이를 목격하기에는 너무 이르다는 것은 언급할 만한 가치가 있다. SQZ-PBMC 및 SQZ-PBMC의 PD1과의 병용 요법은 생쥐에서 종양 덩어리의 가장 큰 감소를 야기하였다. 추가적으로, PD1-IL2v는 SQZ-PBMC 단독과 대비하여, 종양내 E7 특이적 CD8+ T 세포를 3배 초과하여 증가시켰다 (도 8c, 8g).
종양의 mg당 CD45+ 세포 및 CD8+ 세포의 수 또한, 유세포분석을 이용하여 치료군 전체에 대하여 정량되었다. 면역 세포의 마커인 CD45가 소정의 조직에서 면역 침윤의 정도를 사정하는 데 이용될 수 있다. SQZ-PBMC의 PD1-IL2v와의 병용 요법은 다른 치료군과 비교하여, 종양당 CD45+ 세포의 가장 큰 밀도를 야기하였다 (도 8b, 8f). 생쥐에서 병용 요법이 진행된 종양 내에서 CD45+ 세포의 증가는 상기 요법이 종양을 인식하고 제거하는 면역성을 인게이징하는 데 보조한다는 것을 암시한다.
그 다음, 종양당 CD8+ 세포가 치료군 전체에 대하여 정량되었다. 앞서와 같이, SQZ-PBMC의 PD1-IL2v와의 병용 치료는 종양당 CD8+ 세포의 최대량을 야기하였다 (도 8c, g). 치료되지 않은 군 및 PD1-IL2v 치료군은 종양당 CD8+ 세포가 거의 제로이었는데, 이것은 PD1-IL2v 단독이 CD8+ 세포의 종양 내로의 모집을 야기하지 않는다는 것을 암시한다. SQZ-PBMC 치료 단독은 치료되지 않은 군 및 PD1-IL2v 치료군에 비하여 CD8+ 발현에서 실제적인 증가를 나타냈다. 이들 결과는 SQZ-PBMC가 CD8+ 세포를 모집하는 데 효과적이지만, SQZ-PBMC의 PD1-IL2v와의 병용이 CD8+ 세포를 종양으로 모집하는 데 가장 효과적이었다는 것을 암시한다 (도 8c, g). 마지막으로, 유세포분석을 통해 E7 사합체 세포 발현을 정량함으로써, 24일 자 및 28일 자에 모든 치료군에 대해 종양 덩어리당 E7 사합체+ 세포가 정량되었다. 치료되지 않은 생쥐 및 PD1-IL2v 치료된 생쥐는 정량된 E7 특이적 CD8 T 세포가 제로이었다. SQZ-PBMC 치료된 생쥐는 치료되지 않은 생쥐 및 PD1-IL2v 치료된 생쥐보다 훨씬 많은 E7 특이적 세포를 나타냈다. SQZ-PBMC의 PD1-IL2v와의 병용 요법은 임의의 다른 치료군보다 훨씬 큰, E7 특이적 CD8+ T 세포의 증가를 야기하였다 (도 8d, h). 이것은 SQZ-PBMC의 PD1-IL2v와의 병용 요법이 생쥐 내에 종양에서 E7 특이적 CD8 T 세포를 모집하는 데 가장 효과적이고 면역 반응이 항원 특이적이라는 것을 암시한다.
실시예 3. PD1-IL2v 치료의 영향은 항원 특이적 및 비특이적 CD8 T-세포에 대해 동등한 것으로 보인다
면역 세포의 총량이 모든 치료군 전체에 대하여 생쥐의 종양 및 비장 내에서 정량되었다. 정상적인 조건하에, 종양은 전형적으로 면역 세포를 갖지 않는 반면, 비장은 기준선 양의 면역 세포를 갖는다. 종양 세포 환경 내에서 면역 세포의 총량을 증가시키는 방향으로 병용 요법의 효능을 결정하기 위한 방식으로서, CD8+ 세포 및 E7 사합체 특이적 T 세포가 치료되지 않은 생쥐, PD1-IL2v 치료된 생쥐, SQZ-PBMC 치료된 생쥐, 그리고 병용 PD1-IL2v 치료된 생쥐 및 SQZ-PBMC 치료된 생쥐를 비롯한, 모든 치료군 전체에 대하여 생쥐의 종양 및 비장 내에서 비교되었다. 예상한 바와 같이, 치료되지 않은 생쥐는 종양에서 검출 가능한 수준의 CD8+이 없었고 (도 9a, 9b), 반면 비장은 치료되지 않은 군에서 계측 가능한 양의 CD8+ 세포를 갖지만 (도 9c), E7 사합체 특이적 CD8+ T 세포를 갖지 않았다 (도 9d).
유사하게, PD1-IL2v 치료 단독의 이용은 종양 내에서 CD8+ (도 9a) 또는 E7 특이적 CD8+ T 세포 (도 9c)의 모집을 야기하지 않았다. 비장은 치료되지 않은 생쥐에서보다 PD1-IL2v 치료된 생쥐에서 3.2x 더 많은 CD8+ T 세포를 가졌는데 (도 9c), 이것은 PD1-IL2v 치료 단독이 순환성 전신 면역 세포를 증가시킬 수 있다는 것을 암시한다. 종합하면, 상기 데이터는 PD1-IL2v 단독이 면역 세포의 총량을 증가시킬 수 있긴 하지만, 이것만으로는 종양 내에서 E7 사합체 특이적 CD8+ T 세포를 증가시키는 데 충분하지 않다는 것을 암시한다. 비장에서, PD1 치료는 또한, E7 사합체 특이적 T 세포의 증가에 기여하지 않았는데, 이것은 생쥐가 이러한 단일 치료 섭생에서는 HPV 특이적 면역 세포를 발달시키지 않는다는 것을 암시한다 (도 9d). PD1-IL2v 및 SQZ-PBMC의 병용 치료의 놀라운 상승 효과는 종양에서 가장 두드러지게 목격된다. 도 9b에 따르면, 병용 치료는 SQZ-PBMC 치료 단독과 비교하여, 종양에서 3x 더 많은 CD8+ 세포 (도 9a) 및 3.1x 더 많은 E7 특이적 T 세포 (도 9b)를 야기하였다. 증가된 양의 T 세포 또한, 비장에서 목격되었는데, 여기서 병용 요법은 SQZ-PBMC 치료 단독과 비교하여, 3.2x 더 많은 CD8+ 세포 (도 9c) 및 2.1x 더 많은 E7 특이적 T 세포 (도 9d)를 야기하였다. 이것은 병용 요법이 면역 세포, 특이적으로 E7-사합체 특이적 CD8+ T 세포의 종양 내로 및/또는 종양으로의 표적화된 모집을 향상시켰다는 것을 암시한다. 면역 세포의 증가는 동일한 생쥐 내에 비장에서 계측될 때, 전체 면역 세포 수에서 전신적 증가에 의해 반영되었다.
실시예 4. 선천성 면역 반응의 조절 T 세포 (Treg) 및 NK 세포에 대한 치료 효과
조절 T 세포는 이들 T 세포의 기능을 뒷받침하는 데 도움을 주는 CD4, FOXP3 및 CD25 단백질을 공동발현한다. 치료되지 않음, PD1-IL2v 단일요법, SQZ-PBMC 단일요법 및 PD1-IL2v와 SQZ-PBMC의 병용 요법 전체에 대하여 CD4, FOXP3 및 CD25+ 세포를 정량함으로써, 종양 내에 존재하는 면역양성 마커의 수가 계측되었다. 계측은 종양 이식 이후에 24일 자 또는 28일 자에 수행되었고, 그리고 면역형광 발현이 유세포분석을 이용하여 정량되었다. 검사된 모든 치료군 전체에 대하여 면역양성 마커의 총량 사이에 어떤 유의미한 차이도 없었다 (도 10a). 대조적으로, FOXP3+ 및 CD25+ 세포의 통합 발현에 비하여 CD8+ 세포의 비율이 정량될 때, 병용 치료는 치료되지 않는 조건 및 PD1-IL2v 단일요법 조건과 비교하여, 면역 세포 비율에서 유의미한 증가를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 병용 요법 군에서, HPV 종양을 능동적으로 표적화하기 위해 모집된 강화된 양의 CD8+ 세포독성 T 세포가 있는 반면, T-조절 세포는 생쥐의 전체 면역계를 유지하는 데 정상적으로 기능하였다는 것을 암시한다 (도 10b). Treg는 양쪽 PD1-IL2v 치료군의 종양 내에서 확대되고, 그리고 침윤성 CD8+ 세포의 확대는 SQZ-PBMC + PD1-IL2v 병용 군에서 Treg의 확대보다 크다.
그 다음, NK1.1+ 세포의 총수가 모든 치료군 전체에 대하여 종양에서 정량되었다. 도 10c에 따르면, PD1-IL2v 단일요법은 치료되지 않은 생쥐와 비교하여, 종양 내에 NK 세포의 유의미한 증가를 야기하였다. 대조적으로, SQZ-PBMC 단일요법은 종양 내에 NK 세포의 총수에 대해 어떤 효과도 나타내지 않았다. PD1-IL2v 및 SQZ-PBMC의 병용 요법 시에 NK 세포의 총수가 더욱 증가되었다. 유사하게, CD45+의 NK1.1+ 세포의 백분율이 비장에서 PD1-IL2v 단일요법 및 PD1-IL2v의 SQZ-PBMC와의 병용 요법에 의해 유의미하게 증가되었다 (도 10d). 전반적으로, SQZ-PBMC와 PD1-IL2v 병용 요법은 종양 침윤 NK 세포의 유의미한 증가를 야기한다; 하지만, 비장에서 병용 요법에 의한 NK1.1+ 세포의 증가는 PD1-IL2v 단일요법과 유사하다.
실시예 5. 펩티드 백신 및 면역접합체의 병용
펩티드 백신 접근법과 병용되는 PD1-IL2v의 치료 효능을 평가하기 위해, TC1 종양 보유 생쥐가 단독으로 또는 PD1-IL2v 이중특이적 분자와 병용으로, E7 긴 펩티드 (E7-LP) 및 CpG로 구성되는 펩티드 백신으로 치료되었다. TC1 세포 (고맙게도, Prof TC Wu, Johns Hopkins University, Baltimore, MD에 의해 제공됨)가 100μl HBBS에서 5 x 105개 세포의 농도로 C57BL/6NCrl 생쥐 (Charles River로부터 구입됨)의 옆구리에 피하 이식되었다. 종양 성장이 공식 V=W2Lπ/6을 이용하여 캘리퍼스로 계측되었다. 동물 실험은 승인된 허가증 VD3142 하에 수행되었다.
CpG-B 1826 올리고뉴클레오티드 (포스포로티오에이트화된 DNA 염기로서 5′-TCCATGAGCTTCCTGACGTT-3′; 서열 번호: 58)가 Microsynth로부터 구입되었다. HPV16 E7 긴 펩티드 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR (E7-LP, 아미노산 43-77, > 90%의 순도; 서열 번호: 56)이 Proimmune으로부터 구입되었다.
종양 보유 생쥐가 종양 용적에 근거하여 상이한 군으로 무작위배정되었다. TC1 세포 이식후 11일 자에 평균 시작 종양 용적은 180mm3이었다. 생쥐가 15μg E7-LP 및 20μg CpG로 면역화되었다. 생쥐의 면역화가 4개의 다리에서 피하에 수행되었다. PD1-IL2v가 4 주의 지속 기간 동안 주 1회, 1mg/kg으로 11일 자에 i.p. 투여되었다.
종양 용적의 분석은 PD1-IL2v의 첨가가 E7 백신의 효능을 증강시킨다는 것을 드러냈다 (VAX, 도 11a, 11b). 치료에 대한 반응이 상대적 종양 용적을 계산함으로써 추정되었고, 그리고 TC1 세포 이식후 29일 자에 2보다 작은 상대적 종양 용적은 반응으로서 고려되었다. 이러한 기준을 이용함으로써, VAX 단독 생쥐 중 50%가 치료에 반응하였고, 반면 VAX+PD1-IL2v 치료된 생쥐에서는 반응률이 75%이었다. 장기 생존 분석은 VAX 단독 군과 비교하여, VAX+PD1-IL2v 치료군에서 생쥐의 생존에서 근소한 증가를 보여주었다 (도 11).
실시예 6. SQZ-PBMC 면역화 후 PD1-IL2v의 투여는 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 부양한다
C57BL6 생쥐 (7-주령)가 The Jackson Laboratories로부터 구입되었다. 공여자 생쥐로부터 비장이 수확되고 단일 세포 현탁액으로 가공되었다. B 세포가 고갈되었고, 그리고 난백알부민 (OVA)이 SQZ Biotechnologies Cell Squeeze® 기술을 이용함으로써 전달되었다. 압착된 비장세포가 CpG (1μM)에서 4 시간 동안 조건화되고, PBS에서 재현탁되고, 그리고 수용자 C57BL6 생쥐에서 안와후로 투여되었다. PD1-IL2v가 표 3에 따라서, 적합한 일자에 1.5 mg/kg에서 단회 용량으로서 안와후로 투여되었다.
표 3. 치료군 및 생쥐 수
SQZ 면역화
(5x10 6 개 세포/생쥐) 		PD1-IL2v 투여의 일자
(1.5mg/kg) 		생쥐 수
SQZ-PBMC 없음 5
SQZ-PBMC-OVA 없음 5
SQZ-PBMC-OVA 2일 자 5
SQZ-PBMC-OVA 3일 자 5
SQZ-PBMC-OVA 4일 자 4
면역화 후 14일째에, 생쥐가 안락사되고, 비장이 단리되고, 세포 현탁액으로 가공되고, 그리고 α-CD28 (2 μg/mL)의 존재에서 OVA 펩티드 (SIINFEKL, 1μg/mL)로 탈체에서 재자극되고, 그 이후에 IFN- γ 세포내 사이토킨 염색이 뒤따랐다. 이러한 검정에서 IFN-γ 생산은 OVA 항원 (OVA) 특이적 CD8+ T 세포에 대한 프록시로서 이용된다.
SQZ-PBMC-OVA 및 PD1-IL2v의 병용은 IFN-γ를 발현하는 CD8+ 세포의 총수에서 증가를 야기한다 (도 12). 이것은 PD1-IL2v가 SQZ-PBMC 면역화 후 항원 특이적 CD8+ T 세포를 확장한다는 것을 암시한다.
서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG; SQZ Biotechnologies Company <120> COMBINATION THERAPY WITH MODIFIED PBMCS AND AN IMMUNOCONJUGATE <130> 20290-20001.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/105,135 <151> 2020-10-23 <150> US 63/023,193 <151> 2020-05-11 <160> 73 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Ser Ser Tyr Thr 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gly Arg Val Tyr Phe 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Thr Ser Asp Asn Ser Phe 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asn Tyr Asp Val Pro Trp 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Arg Asp Asn 1 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Gly Gly Arg 1 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Ser Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Arg Ser Ser 1 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Asn Tyr Asp Val Pro Trp 1 5 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 20 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 465 470 475 480 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 485 490 495 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 500 505 510 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 515 520 525 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 530 535 540 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 545 550 555 560 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 565 570 575 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 580 585 590 Ile Ser Thr Leu Thr 595 <210> 23 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 24 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 25 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 26 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln 130 135 140 Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly 145 150 155 160 Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys 165 170 175 Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu 180 185 190 Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser 195 200 205 Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val 210 215 220 Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr 225 230 235 240 Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr 245 250 255 Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 260 265 <210> 27 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala 450 455 460 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 465 470 475 480 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 485 490 495 Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr 500 505 510 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 515 520 525 Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 530 535 540 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 545 550 555 560 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 565 570 575 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr 580 585 590 Leu Thr <210> 39 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 42 <211> 593 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser 450 455 460 Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 465 470 475 480 Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu 485 490 495 Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 500 505 510 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu 515 520 525 Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp 530 535 540 Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 545 550 555 560 Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu 565 570 575 Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 580 585 590 Thr <210> 43 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 44 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala 450 455 460 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 465 470 475 480 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 485 490 495 Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr 500 505 510 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 515 520 525 Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 530 535 540 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 545 550 555 560 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 565 570 575 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr 580 585 590 Leu Thr <210> 45 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 50 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile 1 5 10 15 Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr 20 25 30 Asp Phe Ala Phe 35 <210> 51 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 1 5 10 15 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu 20 25 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp 1 5 10 15 Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn 20 25 <210> 53 <211> 35 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala 1 5 10 15 Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val 20 25 30 Ser Asp Lys 35 <210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu 35 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu 1 5 10 15 Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu 20 25 <210> 56 <211> 35 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 1 5 10 15 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 20 25 30 Asp Ile Arg 35 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser 1 5 10 15 Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val 20 25 30 Asp Ile Arg 35 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 tccatgagct tcctgacgtt 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 62 Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 63 Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu 1 5 10 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 65 Gly Gln Ala Glu Pro Asp 1 5 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe 1 5 10 15 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 68 Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn 1 5 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu 1 5 10 15 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His 1 5 10 15 Val Asp Ile Arg 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His 1 5 10 15 Val Asp Ile Arg 20 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

Claims (204)

  1. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
    b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 개체에서 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및
    b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 유핵 세포 기반 면역요법을 증강하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 면역접합체의 효과량을 유핵 세포 기반 면역요법과 함께 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 상기 질환과 연관된 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
    b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 예방접종이 필요한 개체를 예방접종하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계; 및
    b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 제5항에 있어서, 개체는 예방접종에 반응성인 질환을 겪는, 방법.
  7. 청구항 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환인, 방법.
  8. 개체에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 유핵 세포를 포함하는 조성물의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 유핵 세포가 외인성 종양 항원을 포함하는 단계; 및
    b) 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하되, 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고, 그리고 여기서 상기 두 번째 폴리펩티드가 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합하는, 방법.
  10. 청구항 제11항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합하는, 방법.
  11. 청구항 제10항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 방법.
  12. 청구항 제11항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
    (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 제11항 또는 제12항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  15. 청구항 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
  19. 청구항 제18항에 있어서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아 항원(CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  20. 청구항 제1항 내지 제8항 및 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합하는, 방법.
  21. 청구항 제19항 또는 제20항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 방법.
  22. 청구항 제21항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 제21항 또는 제22항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함하는, 방법.
  27. 청구항 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타내는, 방법.
  28. 청구항 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는, 면역접합체.
  29. 청구항 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 방법.
  30. 청구항 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
  31. 청구항 제30항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상인, 방법.
  33. 청구항 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달되는, 방법.
  34. 청구항 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 질환 연관 항원인, 방법.
  35. 청구항 제34항에 있어서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원인, 방법.
  36. 청구항 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원인, 방법.
  37. 청구항 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함하는, 방법.
  38. 청구항 제37항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 방법.
  39. 청구항 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는, 방법:
    a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
    b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
  40. 청구항 제39항에 있어서, 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
  41. 청구항 제39항 또는 제40항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
  42. 청구항 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm인, 방법.
  43. 청구항 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.5 μm인, 방법.
  44. 청구항 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는, 방법.
  45. 청구항 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재하는, 방법.
  46. 청구항 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화되는, 방법.
  47. 청구항 제46항에 있어서, 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되는, 방법.
  48. 청구항 제46항 또는 제47항에 있어서, 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화되는, 방법.
  49. 청구항 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 방법.
  50. 청구항 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 방법.
  51. 청구항 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 7909인, 방법.
  52. 청구항 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC인, 방법.
  53. 청구항 제52항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 방법.
  54. 청구항 제53항에 있어서, 동시자극성 분자는 B7-H2(ICOSL), B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 방법.
  55. 청구항 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 방법.
  56. 청구항 제55항에 있어서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21인, 방법.
  57. 청구항 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 방법.
  58. 청구항 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는, 방법.
  59. 청구항 제58항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가되는, 방법.
  60. 청구항 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여되는, 방법.
  61. 청구항 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 여러 번 투여되는, 방법.
  62. 청구항 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여되는, 방법.
  63. 청구항 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여되는, 방법.
  64. 청구항 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여되는, 방법.
  65. 청구항 제64항에 있어서, 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여되는, 방법.
  66. 청구항 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 방법.
  67. 청구항 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는, 방법.
  68. 청구항 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포의 조성물 및/또는 면역접합체는 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여되는, 방법.
  69. 청구항 제68항에 있어서, 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법인, 방법.
  70. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 병용되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인, 조성물.
  71. 청구항 제70항에 있어서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환인, 조성물.
  72. 청구항 제70항 또는 제71항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여되는, 조성물.
  73. 청구항 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여되는, 조성물.
  74. 청구항 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합하는, 조성물.
  75. 청구항 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합하는, 조성물.
  76. 청구항 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 조성물.
  77. 청구항 제76항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
    (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 조성물.
  78. 청구항 제76항 또는 제77항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 조성물.
  79. 청구항 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 조성물.
  80. 청구항 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 조성물.
  81. 청구항 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 조성물.
  82. 청구항 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 조성물.
  83. 청구항 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  84. 청구항 제83항에 있어서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아 항원(CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  85. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합하는, 조성물.
  86. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 조성물.
  87. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 조성물.
  88. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 조성물.
  89. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 조성물.
  90. 청구항 제70항 내지 제73항 및 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 조성물.
  91. 청구항 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함하는, 조성물.
  92. 청구항 제70항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타내는, 조성물.
  93. 청구항 제70항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  94. 청구항 제70항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 조성물.
  95. 청구항 제70항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포(PBMC)인, 조성물.
  96. 청구항 제95항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함하는, 조성물.
  97. 청구항 제70항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상인, 조성물.
  98. 청구항 제70항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달되는, 조성물.
  99. 청구항 제70항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 질환 연관 항원인, 조성물.
  100. 청구항 제70항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원인, 조성물.
  101. 청구항 제70항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원인, 조성물.
  102. 청구항 제70항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함하는, 조성물.
  103. 청구항 제102항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 조성물.
  104. 청구항 제70항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는, 조성물:
    a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
    b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
  105. 청구항 제104항에 있어서, 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 조성물.
  106. 청구항 제104항 또는 제105항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 조성물.
  107. 청구항 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm인, 조성물.
  108. 청구항 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.5 μm인, 조성물.
  109. 청구항 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는, 조성물.
  110. 청구항 제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재하는, 조성물.
  111. 청구항 제70항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화되는, 조성물.
  112. 청구항 제111항에 있어서, 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되는, 조성물.
  113. 청구항 제111항 또는 제112항에 있어서, 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화되는, 조성물.
  114. 청구항 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 조성물.
  115. 청구항 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 조성물.
  116. 청구항 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 7909인, 조성물.
  117. 청구항 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC인, 조성물.
  118. 청구항 제117항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 조성물.
  119. 청구항 제118항에 있어서, 동시자극성 분자는 B7-H2(ICOSL), B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 조성물.
  120. 청구항 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 조성물.
  121. 청구항 제120항에 있어서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21인, 조성물.
  122. 청구항 제117항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 조성물.
  123. 청구항 제117항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는, 조성물.
  124. 청구항 제117항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가되는, 조성물.
  125. 청구항 제70항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여되는, 조성물.
  126. 청구항 제70항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여되는, 조성물.
  127. 청구항 제126항에 있어서, 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여되는, 조성물.
  128. 청구항 제70항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 조성물.
  129. 청구항 제70항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는, 조성물.
  130. 청구항 제70항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여되는, 조성물.
  131. 청구항 제130항에 있어서, 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법인, 조성물.
  132. 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법에서 이용을 위한, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체에 있어서, 상기 면역접합체는 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 병용되는, 면역접합체.
  133. 청구항 제132항에 있어서, 질환은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환인, 면역접합체.
  134. 청구항 제132항 또는 제133항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여되는, 면역접합체.
  135. 청구항 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 여러 번 투여되는, 면역접합체.
  136. 청구항 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포에 결합하는, 면역접합체.
  137. 청구항 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합하는, 면역접합체.
  138. 청구항 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 면역접합체.
  139. 청구항 제138항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는
    (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  140. 청구항 제138항 또는 제139항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  141. 청구항 제138항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  142. 청구항 제138항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항원 결합 모이어티는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  143. 청구항 제132항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 24의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 서열 번호: 25의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 면역접합체.
  144. 청구항 제132항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 22의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 24의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 25의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 면역접합체.
  145. 청구항 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경에서 제시된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 면역접합체.
  146. 청구항 제132항 내지 제135항 및 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 섬유결합소의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아 항원(CEA) 및 흑색종 연관 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택되는, 면역접합체.
  147. 청구항 제132항 내지 제135항 및 제145항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 결합하는, 면역접합체.
  148. 청구항 제132항 내지 제135항 및 제145항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티인, 면역접합체.
  149. 청구항 제148항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 29의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 28의 경쇄 가변 영역 서열; (ii) 서열 번호: 31의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 30의 경쇄 가변 영역 서열; (iii) 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열; (iv) 서열 번호: 35의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 34의 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (v) 서열 번호: 37의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 36의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 면역접합체.
  150. 청구항 제148항 또는 제149항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 (i) 서열 번호: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; (ii) 서열 번호: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 231과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열; 또는 (iii) 서열 번호: 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 45와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 면역접합체.
  151. 청구항 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열 번호: 33의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 32의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 면역접합체.
  152. 청구항 제132항 내지 제135항 및 제145항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 서열 번호: 38의 폴리펩티드 서열, 서열 번호: 39의 폴리펩티드 서열, 그리고 서열 번호: 40의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 면역접합체.
  153. 청구항 제132항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 더욱 포함하는, 면역접합체.
  154. 청구항 제132항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타내는, 면역접합체.
  155. 청구항 제132항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는, 면역접합체.
  156. 청구항 제132항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 면역접합체.
  157. 청구항 제132항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초혈 단핵 세포(PBMC)인, 면역접합체.
  158. 청구항 제157항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중에서 두 가지 이상을 포함하는, 면역접합체.
  159. 청구항 제132항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 NK-T 세포 중에서 한 가지 이상인, 면역접합체.
  160. 청구항 제132항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 세포내에서 유핵 세포로 전달되는, 면역접합체.
  161. 청구항 제132항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 질환 연관 항원인, 면역접합체.
  162. 청구항 제132항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 연관 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원, 또는 바이러스 연관 질환 항원인, 면역접합체.
  163. 청구항 제132항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원인, 면역접합체.
  164. 청구항 제132항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 어쥬번트를 더욱 포함하는, 면역접합체.
  165. 청구항 제164항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 면역접합체.
  166. 청구항 제132항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는, 면역접합체:
    a) 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통해 통과시키되, 상기 협착부의 직경이 상기 현탁액에서 투입 유핵 세포의 직경의 함수이고, 그것에 의하여 외인성 항원이 통과할 만큼 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 야기하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계;
    b) 외인성 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 데 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 외인성 항원과 함께 배양하고, 그것에 의하여 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
  167. 청구항 제166항에 있어서, 협착부의 너비는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 면역접합체.
  168. 청구항 제166항 또는 제167항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 면역접합체.
  169. 청구항 제166항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm인, 면역접합체.
  170. 청구항 제166항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 너비는 약 4.5 μm인, 면역접합체.
  171. 청구항 제166항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 복수의 협착부에 통과되고, 여기서 이들 복수의 협착부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는, 면역접합체.
  172. 청구항 제166항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 항원은 이러한 외인성 항원과 함께, 섭동된 투입 유핵 세포의 배양 이후에 유핵 세포 중 적어도 약 70% 내에 존재하는, 면역접합체.
  173. 청구항 제132항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 조건화 세포를 형성하기 위해 어쥬번트로 조건화되는, 면역접합체.
  174. 청구항 제173항에 있어서, 유핵 세포는 이들 세포가 조건화되도록 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 4 시간 동안 어쥬번트와 함께 배양되는, 면역접합체.
  175. 청구항 제173항 또는 제174항에 있어서, 유핵 세포는 외인성 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전후에 조건화되는, 면역접합체.
  176. 청구항 제173항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 효현제, RIG-I 효현제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효현제, TLR4 효현제 또는 TLR 9 효현제인, 면역접합체.
  177. 청구항 제173항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 면역접합체.
  178. 청구항 제173항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트는 CpG 7909인, 면역접합체.
  179. 청구항 제173항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화 세포는 조건화된 복수의 변형된 PBMC인, 면역접합체.
  180. 청구항 제179항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 동시자극성 분자의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 면역접합체.
  181. 청구항 제180항에 있어서, 동시자극성 분자는 B7-H2(ICOSL), B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 면역접합체.
  182. 청구항 제179항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 한 가지 이상의 사이토킨의 발현을 증가시키기 위해 더욱 변형되는, 면역접합체.
  183. 청구항 제182항에 있어서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21인, 면역접합체.
  184. 청구항 제179항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 한 가지 이상의 동시자극성 분자가 복수의 비변형된 PBMC에서 B 세포와 비교하여, 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 상기 동시자극성 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 면역접합체.
  185. 청구항 제179항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC는 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 증가된 발현을 갖는, 면역접합체.
  186. 청구항 제179항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중에서 한 가지 이상의 발현은 복수의 비조건화 PBMC와 비교하여, 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과하여, 또는 10배 초과하여 증가되는, 면역접합체.
  187. 청구항 제132항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 및/또는 면역접합체는 정맥내 투여되는, 면역접합체.
  188. 청구항 제132항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 피하 또는 종양내 투여되는, 면역접합체.
  189. 청구항 제188항에 있어서, 면역접합체는 히알루론산분해효소와 병용으로 피하 투여되는, 면역접합체.
  190. 청구항 제132항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 면역접합체.
  191. 청구항 제132항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 겪는, 면역접합체.
  192. 청구항 제132항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 다른 요법의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여되는, 면역접합체.
  193. 청구항 제192항에 있어서, 다른 요법은 화학요법 또는 방사선요법인, 면역접합체.
  194. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 면역접합체의 용도에 있어서, 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
    여기서 상기 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 투여용으로 조제되고, 여기서 상기 유핵 세포는 외인성 항원을 포함하는, 용도.
  195. 청구항 제194항에 있어서, 면역접합체는 유핵 세포를 포함하는 조성물 이전에, 상기 조성물과 동시에, 또는 상기 조성물 이후에 투여되는, 용도.
  196. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 효과량의 조성물의 용도에 있어서, 상기 조성물은 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하고;
    여기서 상기 조성물은 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체와 함께 투여용으로 조제되고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인, 용도.
  197. 청구항 제196항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역접합체 이전에, 면역접합체와 동시에, 또는 면역접합체 이후에 투여되는, 조성물.
  198. 청구항 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 방법에서 이용을 위한 키트.
  199. 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물 및 면역접합체를 포함하는 키트에 있어서, 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고; 여기서 상기 조성물 및 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 병용하기 위한 것인, 키트.
  200. 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 포함하는 키트에 있어서, 상기 조성물은 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 것이고;
    여기서 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인, 키트.
  201. 면역접합체를 포함하는 키트에 있어서, 상기 면역접합체는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
    여기서 상기 면역접합체는 개체에서 외인성 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 상기 외인성 항원을 포함하는 유핵 세포의 조성물과 함께 이용하기 위한 것인, 키트.
  202. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 유핵 세포를 포함하는 조성물과 함께 이용하기 위한 면역접합체를 생산하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 면역접합체를 생산하기 위한 조건하에 이러한 면역접합체를 인코딩하는 핵산을 세포에서 발현하되,
    상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
    상기 면역접합체가 유핵 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 함께 이용하기 위한 것이고, 여기서 상기 유핵 세포가 외인성 항원을 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  203. 청구항 제202항에 있어서, 면역접합체는 융합 단백질인, 방법.
  204. 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 면역접합체와 함께 이용하기 위한 유핵 세포를 포함하는 조성물을 생산하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 외인성 항원을 세포내에서 유핵 세포의 모집단에 도입하되;
    상기 조성물이 면역접합체의 투여와 함께 이용하기 위한 것이고;
    여기서 상기 면역접합체가 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 T 세포, 종양 세포, 또는 종양 세포 환경에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하고; 그리고 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열 번호: 19에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인 단계를 포함하는, 방법.
KR1020227043333A 2020-05-11 2021-05-10 변형된 pbmc 및 면역접합체를 이용한 병용 요법 KR20230010240A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063023193P 2020-05-11 2020-05-11
US63/023,193 2020-05-11
US202063105135P 2020-10-23 2020-10-23
US63/105,135 2020-10-23
PCT/US2021/031542 WO2021231278A1 (en) 2020-05-11 2021-05-10 Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230010240A true KR20230010240A (ko) 2023-01-18

Family

ID=76523433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227043333A KR20230010240A (ko) 2020-05-11 2021-05-10 변형된 pbmc 및 면역접합체를 이용한 병용 요법

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20230181712A1 (ko)
EP (1) EP4149524A1 (ko)
JP (1) JP2023527690A (ko)
KR (1) KR20230010240A (ko)
CN (1) CN115551540A (ko)
AU (1) AU2021272340A1 (ko)
BR (1) BR112022022614A2 (ko)
CA (1) CA3177288A1 (ko)
CL (1) CL2022003130A1 (ko)
CR (1) CR20220576A (ko)
IL (1) IL298038A (ko)
MX (1) MX2022014134A (ko)
PE (1) PE20230387A1 (ko)
TW (1) TW202207975A (ko)
WO (1) WO2021231278A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024068705A1 (en) * 2022-09-29 2024-04-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated polypeptides

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
WO2003048334A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
SI1871805T1 (sl) 2005-02-07 2020-02-28 Roche Glycart Ag Antigen vezavne molekule, ki vežejo EGFR, vektorji, ki te kodirajo in uporabe le-teh
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PL2519543T3 (pl) 2009-12-29 2016-12-30 Białka wiążące heterodimery i ich zastosowania
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
NZ703653A (en) 2010-08-13 2016-09-30 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
UA117294C2 (uk) 2011-02-10 2018-07-10 Рош Глікарт Аг Імунокон'югат
ES2692268T3 (es) 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
LT2768942T (lt) 2011-10-17 2020-04-10 Massachusetts Institute Of Technology Pristatymas į ląstelės vidų
EP2794905B1 (en) 2011-12-20 2020-04-01 MedImmune, LLC Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
KR102304167B1 (ko) 2013-08-16 2021-09-24 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포로의 선택적 물질 전달
RU2020139190A (ru) 2014-10-31 2021-01-26 Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи Доставка биомолекул в клетки иммунной системы
JP6925984B2 (ja) 2015-07-09 2021-08-25 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 無核細胞への物質の送達
US20190382796A1 (en) 2015-09-04 2019-12-19 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores
SG11201809437TA (en) 2016-05-03 2018-11-29 Sqz Biotechnologies Co Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance
RU2747878C2 (ru) 2016-05-03 2021-05-17 ЭсКьюЗед БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ КОМПАНИ Внутриклеточная доставка биомолекул для индукции толерантности
RS63663B1 (sr) 2017-04-03 2022-11-30 Hoffmann La Roche Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15
SG11202008864VA (en) 2018-03-12 2020-10-29 Sqz Biotechnologies Co Intracellular delivery of biomolecules to modify immune response
WO2019178005A2 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Sqz Biotechnologies Company Methods for treating hpv-associated diseases
KR20210070338A (ko) 2018-10-04 2021-06-14 에스큐지 바이오테크놀로지스 컴퍼니 항원 제시 세포 기능을 증진시키기 위한 생체분자의 세포내 전달
BR112021016903A2 (pt) * 2019-02-28 2021-11-03 Sqz Biotechnologies Co Administração de biomoléculas a pbmcs para modificação de uma resposta imune

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021272340A1 (en) 2022-12-08
IL298038A (en) 2023-01-01
US20230181712A1 (en) 2023-06-15
JP2023527690A (ja) 2023-06-30
CN115551540A (zh) 2022-12-30
WO2021231278A1 (en) 2021-11-18
MX2022014134A (es) 2022-11-30
CA3177288A1 (en) 2021-11-18
CL2022003130A1 (es) 2023-05-19
PE20230387A1 (es) 2023-03-06
TW202207975A (zh) 2022-03-01
EP4149524A1 (en) 2023-03-22
BR112022022614A2 (pt) 2023-02-07
CR20220576A (es) 2022-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12023368B2 (en) Immunoconjugates
US20230071733A1 (en) Immunoconjugates
US7745215B2 (en) Methods and compositions for expanding T regulatory cells
KR20040098048A (ko) 4-1ｂｂ 및/또는 ｃｄ40의 생체내 격발을 통한 항종양ｃｔｌ 면역성 유발
TW202115115A (zh) 免疫結合物
US20220073630A1 (en) A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
JP2023554097A (ja) 二機能性抗ｐｄ１／ｉｌ－７分子
US20230181712A1 (en) Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
CN115916831A (zh) 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途
KR20240019135A (ko) 작제물과 면역자극 화합물의 공동발현
WO2022148853A1 (en) Immunoconjugates
CN117916261A (zh) 与靶向fap的cd40激动剂的组合疗法
CN114685684A (zh) MUC1-Tn嵌合抗原受体修饰的Vγ9Vδ2T细胞及其应用
CN114765980A (zh) 用于治疗癌症的嵌合抗原受体及相关方法和组合物
CN118043066A (zh) 构建体和免疫刺激性化合物的共表达
CN118772289A (zh) 含抗pd-1抗体和细胞因子的融合蛋白
JP2021523892A (ja) Ｏｃａ−ｂペプチドコンジュゲート及び処置方法