KR20230003098A - 약제학적 활성제를 전달하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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로널드 제임스 크리스티
모르간 오드리 유렐로
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메디뮨 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 화학식 I의 변형된 리신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 전달 시스템, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 요법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure pct00039

Description

약제학적 활성제를 전달하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 4월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/017,281호에 대해 미국 특허법(35 USC 119(e)) 하에 우선권의 유익을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 명세서는 변형된 리신, 이들 변형된 리신을 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제, 특히 유전자 물질을 세포에 전달하기 위한 이들 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 명세서는 추가로 요법에서의 이들 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료는 질환을 치료하기 위해 환자 세포에 (외래) 유전자 물질(예컨대, DNA 및 RNA)을 치료적으로 전달하는 것에 중점을 둔 의학 분야이다. 지금까지, Luxturna®(RPE65 돌연변이-유발 실명) 및 Kymriah®(키메라 항원 수용체 T 세포 요법)을 비롯한 여러 유전자 치료는 다수의 상이한 의학적 병태용으로 규제기관의 승인을 받았다.
유전자 전달은 세포에 유전자 물질을 도입하기 위해 사용되는 과정이다. 성공적으로 되기 위해, 유전자 물질은 수송 동안에 안정하게 남아있어야 하고, 궁극적으로는 표적화된 세포에 내재화되어야 한다. 유전자 물질이 DNA일 때, 이는 표적화된 세포에 내재화되고 핵에 전달되어야 한다. 유전자 전달은 벡터를 필요로 하며, 적합한 벡터는 일반적으로 2가지 범주(바이러스 및 비바이러스) 벡터에 속한다.
바이러스 매개 유전자 전달은 숙주 세포 내부로 바이러스의 DNA를 주입하는 바이러스의 능력을 이용한다. 유전자 물질은 바이러스 벡터를 형성하기 위해 복제-결함 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 바이러스 방법은 고도로 효율적이지만, 면역 반응을 유발할 수 있다. 더 나아가, 이들은 유전자 물질의 매우 작은 조각만을 세포에 전달할 수 있어서, 이를 생산하는 것은 노동 집약적이며, 무작위 삽입 부위, 세포변성 효과 및 돌연변이유발 위험이 존재한다.
합성 벡터는 구조적 범용성(versatility) 및 확장성에 관해 유전자 전달 적용분야에 대해 바이러스 이상으로 여러 이점을 제공하며; 이들은 하나의 원하는 목적을 달성하기 위해 단독으로 그리고 구체적으로 설계될 수 있다. 이들 물질은 세포 흡수, 세포질에의 수송, 및 (원하는 경우) 핵으로의 전달과 연관된 생물학적 장벽을 극복하도록 조작된 나노입자 또는 소포에 유전자 물질을 패키징하도록 설계될 수 있다. 통상적인 접근은 음이온성 핵산과 회합되는 양전하를 포함하는 중합체, 펩티드 또는 지질과 같은 물질과의 다중 분자 조립체에 유전자 물질을 패키징하는 것이다. 양전하와 음전하 사이의 정전기적 상호작용은 자가 조립체를 나노- 또는 마이크로입자 구조로 유도하고, 이들 입자의 크기 및 형상은 물질 유형 및 축합 조건에 의해 제어될 수 있다(Park et al. Adv Drug Del Rev, 2006, 58(4):467-86).
예를 들어, 나노입자와 같은 적합한 벡터로의 DNA의 제형화는 비제형화된 DNA의 흡수와 비교할 때 DNA의 세포 흡수를 유의미하게 개선시킨다. DNA는 순음전하를 갖고, 전형적으로는 그 자체가 세포(또한 순음전하를 가짐)에 내재화되지 않는다. 비제형화된 DNA는 또한 면역 반응을 촉발하여 이의 분해를 유발하는 경향이 있다. 적합한 벡터로의 DNA의 제형화는 이의 음전하를 중화시킬 수 있고, 세포외 공간에서의 분해로부터 이를 보호한다.
벡터가 효과적으로 내재화되기 위해서는 내포작용으로 불리는 과정을 통해 세포에 수송되어야 한다. 이 과정 동안에, 벡터는 세포막 영역으로 둘러싸이고, 이어서, 세포 내부로 갈라져서 엔도솜을 형성한다. 벡터는 이 과정이 일어나도록 설계되어야 하지만, 이어서, 리소좀 포획, 즉, 산성 막-결합 리소좀 구획으로의 격리 가능성을 완화한다. 이를 달성하는 한 방법은 리소좀 수송이 일어나기 전에 엔도솜 파열을 보장하는 것이다. 이는 얻어진 삼투 구배가 엔도솜을 파열시키고 유전자 물질을 전사/번역에 사용 가능한 세포질로 방출할 때까지 엔도솜 pH를 완충시키는 벡터에 의해 달성될 수 있다(엔도솜은 세포 흡수 후에 점점 더 산성이 됨). 엔도솜 완충 범위(pH 7.4 내지 pH 5.0) 이상으로 효율적인 완충 능력을 갖는 적합한 벡터 물질은 양성자를 수용함으로써 엔도솜의 산성화를 늦출 수 있고, 이는 세포질로부터의 추가적인 양성자 및 반대이온의 유입을 야기한다.
현재의 합성 유전자 전달 시스템은 유전자 물질의 낮은 안정성, 높은 독성 및 비효율적인 세포질 유입에 의해 생체내에서 제한된다. 높은 전달 효율을 유지하면서 제형 특성(크기, 전하 등), 안정성, 완충 능력과 독성 간의 최적의 균형을 달성하는 유전자 전달에 적합한 다기능성 물질을 조작하는 것은 어렵고 복잡한 것으로 판명되었지만, 얻어진 제형을 유의미하게 단순화시킬 것이다.
폴리리신(PL)은 음으로 하전된 핵산과 상호작용할 수 있고 정전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성하는 유리 아민 측부 아암(arm)을 보유하는 선형 폴리펩티드이다. 이런 이유로, PL과 이의 공중합체는 비바이러스 유전자 전달에서의 벡터로서 연구실에서 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들어, PL-기반 DNA 나노입자는 형질감염 보조제, 예컨대, 클로로퀸과 결합될 때(Yamauchi et al. Biomaterials, 2003 24(24): 4495-4506) 그리고 블록 공중합체 또는 혼성체 시스템의 바이탈 성분으로서(Incani et al. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2009, 1(4): 841-848) 다중 세포주에서의 고효율 형질감염이 입증되었다. PL은 또한 생분해성이며 이는 생체내 적용에 유리하다. 그러나, PL 형질감염 효율은 DNA의 유사한 세포 흡수 수준을 용이하게 함에도 불구하고, 다른 양이온성 중합체 형질감염제(예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI))보다 훨씬 더 낮다. 이런 비효율적인 형질감염은 얻어진 DNA 나노입자가 엔도솜 pH를 완충시키는 것의 불능으로 인해 이들이 엔도솜을 잠재적으로 탈출하는 것의 불능과 연관되었다(Hwang et al. Biomacro., 2014, 15(10):2577-86).
pKa가 6.5 미만인 양성자화 가능한 기, 예컨대, 이미다졸 또는 히스티딘의 혼입은 PL 나노입자 형질감염을 향상시키는 것으로 나타났지만(문헌[Roufai et al. Bioconjug. Chem., 2001 12(1): 92-99], 및 문헌[Hwang et al. Biomacro., 2014, 15(10):2577-86]); 그러나, 중성 pH에서 나노입자 안정성을 보장하기 위해, pKa가 7.4 초과인 양성자화 가능한 기와 pKa가 7.4 미만인 양성자화 가능한 기 사이의 바이탈 균형이 맞아야 한다. 예를 들어, 이전의 연구(Benns et al. Bioconjug. Chem., 2000, 11(5):637-45)는 PL 완충제를 개선시키기 위해 작용기로서 아미노산 히스티딘(pKa = 6)을 연구하였다. 폴리리신 상에 접합된 히스티딘은 PL에 비해 최대 3.5배까지 완충 능력을 증가시키는 것으로 나타났다. Benns는 또한 다른 중합체 상에 폴리히스티딘을 접합시켰고, 형질감염에서의 극적인 개선과 함께 완충에서의 훨씬 더 큰 향상을 보고하였다(대략 4.5배)(Hwang et al. Biomacro., 2014, 15(10):2577-86).
본 출원은 비변형 PL과 비교할 때 유전자 물질의 전달 효율이 증가된 변형된 PL을 형성하는 데 사용될 수 있는 특정 변형된 리신을 기재한다. 이들 변형된 PL은 엔도솜 완충만을 용이하게 하는 히스티딘 변형과 달리 이들이 다기능성이라는 점에서 독특하다. 이들 변형된 PL은: i) 세포 내재화 및 리소좀 수송 동안 발생된 pH 전이 동안 양성자화를 가능하게 하도록 조정된 향상된 완충 특성을 보유하고, ii) 정전기적 및 비정전기적(예를 들어, 파이-파이 스태킹) 상호작용을 통해 증가된 핵산 결합으로 인해 더 안정하게 되고/되거나, iii) 자연적으로 발생하며 독성 또는 면역원성일 가능성이 적은 대사물질-기반 코어 단위가 사용될 때 생체 적합성이 증가되었다. 이들 변형된 PL은 비변형 PL(대략 100 ㎚, 구체, 막대 및 환상체)로 형성된 것과 유사한, 플라스미드 DNA를 갖는 나노입자를 형성하며, 연관된 독성 없이 마우스에서의 정맥내 주사 후 더 높은 혈청 안정성 및 연장된 혈액 순환을 입증한다. 이들은 쉽게 해리되지 않음으로써 캡슐화된 유전자 물질을 보호하고, 순환에 더 길게 남아있다.
본 명세서에 기재된 변형된 리신은 벡터에 혼입될 수 있는 다기능성 단위이며, 높은 생체 적합성을 유지하면서 합성 유전자 전달 시스템의 형질감염을 개선시킨다.
본 명세서는, 부분적으로는, 하기 화학식 I의 변형된 리신을 기재한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중,
A는 결합, C1-6알킬렌, 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴이되; 상기 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RA로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있으며;
Q는 결합, 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴이되; 상기 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RB로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이되; 상기 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RC로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있으며;
R 1 , R 2 및 R 3 은 각각 독립적으로 할로, 니트로, 사이아노, 하이드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 아미노, 카복시, 카바모일, 머캅토, 설파모일, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 아세틸, 아세톡시, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, N-메틸-N-에틸아미노, 아세틸아미노, N-메틸카바모일, N-에틸카바모일, N,N-디메틸카바모일, N,N-디에틸카바모일, N-메틸-N-에틸카바모일, 메틸티오, 에틸티오, 메틸설피닐, 에틸설피닐, 메실, 에틸설포닐, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, N-메틸설파모일, N-에틸설파모일, N,N-디메틸설파모일, N,N-디에틸설파모일 및 N-메틸-N-에틸설파모일로부터 선택되고;
n은 0 내지 4이며;
R A , R B 및 R C 는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 아세틸, 메실, 에틸설포닐, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡시카보닐, 카바모일, N-메틸카바모일, N-에틸카바모일, N,N-디메틸카바모일, N,N-디에틸카바모일 및 N-메틸-N-에틸카바모일로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 기재한다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 약제학적 전달 시스템으로서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 기재한다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물을 기재한다.
본 명세서는 또한, 부분적으로는, 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 정온동물, 예컨대, 인간에서의 치료 방법을 기재한다.
본 발명의 다수의 실시형태는 본 명세서 전체적으로 상세하게 설명되어 있고, 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 임의의 열거된 실시형태로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
"단수"는 "적어도 하나"를 의미한다. 주어진 물질 또는 구성요소를 의미하기 위해 단수가 사용된 임의의 실시형태에서, 단수는 하나를 의미할 수 있다.
"포함하는"은 주어진 물질 또는 구성요소가 다른 물질 또는 구성요소를 함유할 수 있다는 것을 의미한다. "포함하는"이 언급되는 임의의 실시형태에서, 주어진 물질 또는 구성요소가 적어도 10% w/w, 적어도 20% w/w, 적어도 30% w/w 또는 적어도 40% w/w의 물질 또는 구성요소로 형성될 수 있다. "포함하는"이 언급되는 임의의 실시형태에서, "포함하는"은 또한 주어진 물질 또는 요소로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"을 의미할 수 있다.
"이루어진" 또는 "이루어지다"는 주어진 물질 또는 구성요소가 전체적으로 물질 또는 구성요소로 형성된다는 것을 의미한다. "이루어진" 또는 "이루어지다"가 언급된 임의의 실시형태에서, 주어진 물질 또는 구성요소는 100% w/w의 물질 또는 구성요소로 형성될 수 있다.
"본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 주어진 물질 또는 구성요소가 거의 전체적으로 해당 물질 또는 구성요소로 이루어진다는 것을 의미한다. "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"가 언급된 임의의 실시형태에서, 주어진 물질 또는 구성요소는 적어도 50% w/w, 적어도 60% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 80% w/w, 적어도 90% w/w, 적어도 95% w/w 또는 적어도 99% w/w의 물질 또는 구성요소로 형성될 수 있다.
"이다" 또는 "일 수 있다"가 물질 또는 구성요소를 정의하는 데 사용되는 임의의 실시형태에서, "이다" 또는 "일 수 있다"는 물질 또는 구성요소가 물질들 또는 구성요소들"로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"을 의미할 수 있다.
"약"이 언급된 명세서의 임의의 실시형태에서, "약"은 인용된 수치의 +/- 0(즉, 분산 없음), +/- 0.01, +/- 0.05, +/- 0.1, +/- 0.5, +/- 1, +/- 2, +/-5, +/- 10 또는 +/- 20%를 의미할 수 있다. 수치가 인용되는 경우, 추가 실시형태에서, 이는 추가로 약 인용된 수치를 지칭한다.
청구범위는 실시형태이다.
하기 화학식 I의 변형된 리신이 본 명세서에 개시된다:
[화학식 I]
Figure pct00002
식 중, A, Q, B, R1 및 n은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
일 실시형태에서, A는 결합이다.
일 실시형태에서, A는 C1-6알킬렌이다.
일 실시형태에서, A는 메틸렌이다.
일 실시형태에서, A는 카보사이클릴이되; 상기 카보사이클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, A는 헤테로사이클릴이되; 상기 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RA로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, A는 헤테로사이클릴이다.
일 실시형태에서, A는 피리딜이다.
일 실시형태에서, A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로사이클릴이다.
일 실시형태에서, A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이다.
일 실시형태에서, Q는 결합이다.
일 실시형태에서, Q는 카보사이클릴이되; 상기 카보사이클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, Q는 헤테로사이클릴이되; 상기 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RB로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, 고리 B는 모르폴리닐이다.
일 실시형태에서, 고리 B는 모르폴리닐이되; 상기 모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RC로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, 고리 B는 티오모르폴리닐이다.
일 실시형태에서, 고리 B는 티오모르폴리닐이되; 상기 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RC로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, R1은 할로이다.
일 실시형태에서, n은 0이다.
일 실시형태에서, n은 1이다.
일 실시형태에서, n은 2이다.
일 실시형태에서, n은 3이다.
일 실시형태에서, n은 4이다.
일 실시형태에서, 화학식 I의 변형된 리신이 제공되며,
A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로사이클릴이고;
Q는 결합이며;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고; 그리고
n은 0이다.
일 실시형태에서, 화학식 I의 변형된 리신이 제공되며,
A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이고;
Q는 결합이며;
고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고; 그리고
n은 0이다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은 하기 화학식 IA의 변형된 리신이다:
[화학식 IA]
Figure pct00003
식 중, A, Q, B, R1 및 n은 본 명세서에 기재된 바와 같다. 화학식 IA의 변형된 리신은 또한 변형된 D-리신으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은 하기 화학식 IB의 변형된 리신이다:
[화학식 IB]
Figure pct00004
식 중, A, Q, B, R1 및 n은 본 명세서에 기재된 바와 같다. 화학식 IB의 변형된 리신은 또한 변형된 L-리신으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
(R)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
(R)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
(R)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
(S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
(S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
(S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
염 형태의
2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
염 형태의
(R)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
(R)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
(R)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 화학식 I의 변형된 리신은:
염 형태의
(S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
(S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
(S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치환된"은, 화학기를 지칭할 때, 화학기가, 제거되고 치환체로 대체되는 하나 이상의 수소 원자를 갖는다는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치환체"는 당업계에 알려진 보통의 의미를 갖고, 모 기에 공유 부착된 화학적 모이어티를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "선택적으로 치환된"은 화학기가 치환체를 갖지 않을 수도 있거나(즉, 비치환이거나) 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다(즉, 치환됨)는 것을 의미한다. 주어진 원자에서의 치환은 원자가로 제한된다는 것이 이해될 것이다. 선택적 치환체가 기의 목록으로부터 선택되는 경우, 이 정의는 특정된 기 중 하나로부터 선택되는 모든 치환체 또는 특정된 기 중 둘 이상으로부터 선택되는 치환체를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 동일한 치환체, 예를 들어, R2 중 하나 초과가 있을 수 있는 경우에, 본 정의는 또한 구체화된 기 중 하나로부터 선택되는 모든 이러한 치환체 또는 구체화된 기 중 둘 이상으로부터 선택되는 치환체를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "Ci-j"는 탄소 원자 수의 범위를 나타내되, i 및 j는 정수이고, 탄소 원자 수의 범위는 종점(즉, i 및 j)과 그 사이의 각 정수 지점을 포함하고, j는 i보다 크다. 예를 들어, C1-6은 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 및 6개의 탄소 원자를 포함하는, 1 내지 6개의 탄소 원자 범위를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 용어 "C1-6"은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2개의 탄소 원자를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "알킬"은 다른 용어의 일부로서 사용되든 독립적으로 사용되든, 포화 탄화수소쇄를 지칭한다. 상기 언급한 탄화수소쇄는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 용어 "Ci-j알킬"은 i 내지 j개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 지칭한다. C1-6알킬의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸; 보다 고차의 상동체, 예컨대, 2-메틸-1-부틸, n-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 1,2,2-트리메틸프로필 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "부틸"과 같은 기에 대한 언급은 추가 단서 없이, 모든 형태의 부틸, 예를 들어, n-부틸 및 tert-부틸 등을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "알킬렌"은 다른 용어의 일부로서 사용되든 독립적으로 사용되든, 포화 탄화수소쇄를 지칭한다. 상기 언급한 탄화수소쇄는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 용어 "Ci-j알킬렌"은 i 내지 j개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 지칭한다. C1-6알킬렌의 예는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-), 프로필렌(-CH2-CH2-CH2-) 및 부틸렌(-CH2-CH2-CH2-CH2- 및 -CH2-CH(CH3)-CH2- 등) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다.
"헤테로사이클릴"은 4 내지 12개의 원자를 포함하는 포화, 부분적으로 포화 또는 불포화된, 단환식 또는 이환식 고리이며, 이 중 적어도 하나의 원자는 질소, 황 또는 산소로부터 선택되며, 달리 구체화되지 않는 한, 탄소 또는 질소 연결될 수 있되, -CH2- 기는 선택적으로 -C(O)-로 대체될 수 있고, 고리 황 원자는 선택적으로 산화되어 S-옥사이드를 형성할 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴"의 예 및 적합한 값은 모르폴리노, 피페리딜, 피리딜, 피라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 인돌릴, 퀴놀릴, 티에닐, 1,3-벤조디옥솔릴, 티아디아졸릴, 피페라지닐, 티아졸리디닐, 피롤리디닐, 티오모르폴리노, 피롤리디닐, 호모피페라지닐, 3,5-디옥사피페리디닐, 테트라하이드로피라닐, 이미다졸릴, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐, 이속사졸릴, N-메틸피롤릴, 4-피리돈, 1-이소퀴놀론, 2-피롤리돈 및 4-티아졸리돈이다. 용어 "헤테로사이클릴"의 특정 예는 피리딜이다. 본 발명의 일 양상에서, "헤테로사이클릴"은 5 또는 6개 원자를 포함하는 포화, 부분적 포화 또는 불포화, 단환식 고리이며, 이 중 적어도 하나의 원자는 질소, 황 또는 산소로부터 선택되고, 달리 구체화되지 않는 한, 탄소 또는 질소 연결될 수 있고, -CH2- 기는 -C(O)-로 선택적으로 대체될 수 있으며, 고리 황 원자는 선택적으로 산화되어 S-옥사이드를 형성할 수 있다.
"카보사이클릴"은 3 내지 12개의 원자를 포함하는 포화, 부분적 포화 또는 불포화, 단환식 또는 이환식 탄소 고리이되; -CH2- 기는 -C(O)-로 선택적으로 대체될 수 있다. 일 실시형태에서, "카보사이클릴"은 5 또는 6개 원자를 포함하는 단환식 고리 또는 9 또는 10개 원자를 포함하는 이환식 고리이다. "카보사이클릴"에 대한 적합한 값은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1-옥소사이클로펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 페닐, 나프틸, 테트라리닐, 인다닐 또는 1-옥소인다닐을 포함한다. "카보사이클릴"의 특정 예는 페닐이다.
본 개시내용의 "화합물"은 화합물에서 원자의 모든 동위원소를 포함한다. 원자의 동위원소는 동일한 원자 수이지만 상이한 질량 수를 갖는 원자를 포함한다. 예를 들어, 달리 구체화되지 않는 한, 본 개시내용의 "화합물"에서 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소, 브롬화물 또는 요오드는 하기와 같지만, 이들로 제한되지 않는 이들의 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다: 1H, 2H, 3H, 11C, 12C, 13C, 14C, 14N, 15N, 16O, 17O, 18O, 31P, 32P, 32S, 33S, 34S, 36S, 17F, 19F, 35Cl, 37Cl, 79Br, 81Br, 127I 및 131I. 일부 실시형태에서, 수소는 경수소, 중수소 및 삼중수소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수소는 경수소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 수소는 중수소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 수소는 삼중수소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "중수소로 치환된" 또는 "중수소 치환된"은 화학기에서 수소의 다른 아이소폼(예를 들어, 경수소)을 중수소로 대체한 것. 일부 실시형태에서, 탄소는 12C 및 13C를 포함한다.
잔기
본 명세서에 기재된 폴리펩티드에서 아미노산은 함께 연결되어 α-아미노기와 카복시기 사이의 펩티드 결합을 통해 사슬을 형성한다. 일단 사슬에서 연결되면, 개개 아미노산은 "잔기"로서 지칭된다.
변형된 리신
변형된 리신 또는 변형된 리신 잔기가 언급된 임의의 실시형태에서, 이들은 화학식 I에 따라 변형된 리신 및 이의 실시형태를 지칭한다.
변형된 리신 또는 변형된 리신 잔기가 언급된 임의의 실시형태에서, 이는 변형된 D-리신을 지칭할 수 있다.
변형된 리신 또는 변형된 리신 잔기가 언급된 임의의 실시형태에서, 이는 변형된 L-리신을 지칭할 수 있다.
변형된 리신 또는 변형된 리신 잔기가 언급된 임의의 실시형태에서, 이는 염 형태의 변형된 리신 또는 변형된 리신을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "염 형태"는 본 명세서에 기재된 변형된 리신, 변형된 리신 잔기 또는 폴리펩티드의 유도체를 지칭하되, 모 화합물은 하나 이상의 존재하는 산성 모이어티(예를 들어, 카복실 등) 및/또는 염기 모이어티(예를 들어, 아민, 알칼리 등)를 이의 염 형태로 전환시킴으로써 변형된다. 다수의 경우에, 본 개시내용의 화합물은 아미노 및/또는 카복실기 또는 이와 유사한 기의 존재로 인해 산 및/또는 염기염을 형성할 수 있다. 특정 염 형태는 약제학적으로 허용 가능한 염이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 포유류, 특히 인간에서 사용하기에 안전하고 효과적인 염이다.
본 명세서에 기재된 변형된 리신, 변형된 리신 잔기 또는 폴리펩티드의 적합한 염 형태는, 예를 들어, 무기산(예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등) 또는 유기산(예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 트리메스산, 시트르산, 락트산, 페닐아세트산, 벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 나파디실산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산, 살리실산, 설포살리실산 등)으로부터 유래될 수 있는 산 부가 염을 포함한다. 특정 산 부가 염은 염산이다.
본 명세서에 기재된 변형된 리신, 변형된 리신 잔기 또는 폴리펩티드의 적합한 염 형태는, 예를 들어, 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄염 및 주기율표 I족 내지 XII족으로부터의 금속, 예컨대, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연, 구리 등의 수산화물, 탄산염, 중탄산염) 또는 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민, 자연적으로 발생되는 치환된 아민, 환식 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함하는 치환된 아민)로부터 유래될 수 있는 염기-부가 염을 포함한다. 특정 유기 아민은 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 메글루민, 피페라진 및 트로메타민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 적합한 염의 목록은, 예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)]; 및 문헌["Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)]에서 찾을 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 추가 특성에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 본 명세서에서, 폴리펩티드가 언급되는 경우, 이는 아미노산 잔기의 사슬을 지칭한다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 조성 및 순도에 대해 정확한 제어를 가능하게 하는 기법을 통해 합성된 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 적합한 기법은 고상 펩티드 합성을 포함한다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 중합 반응을 통해 합성된 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 적합한 기법은 첨가 또는 축합 중합을 포함한다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 아미노산 잔기의 연속적이며, 비분지된 사슬을 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 1000개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 10 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 15 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 1000개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 30 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
폴리펩티드가 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리펩티드는 염 형태일 수 있다.
폴리리신
폴리리신은 2개 이상의 변형된 리신 잔기, 또는 리신의 혼합물 및 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드이되, 사슬에서 펩티드 결합은 리신 잔기의 α-카복실과 α-아미노기 및/또는 변형된 리신 잔기 사이에 형성되고, 모든 아미노산 잔기는 변형된 리신 잔기, 또는 리신의 혼합물 및 변형된 리신 잔기로부터 선택된다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리리신을 지칭할 수 있되, 모든 변형된 리신 잔기는 동일하다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 둘 이상의 상이한 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리-D-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리-L-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 라세미 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리-L/D-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 1000개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 10 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 15 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 1000개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 30 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신은 염 형태일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 10% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 20% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 30% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 40% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 50% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 60% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 70% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 80% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 90% 초과는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 10% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 20% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 30% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 40% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 50% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 60% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 70% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 80% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 90% 이하는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 10% 내지 90%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 10% 내지 80%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 10% 내지 70%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 20% 내지 60%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 25% 내지 50%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리리신에서 리신 잔기의 25% 내지 40%는 변형된 리신 잔기일 수 있다.
말단의 아미노기는 선택적으로 변형된 아미노기일 수 있음
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 아미노기는 비변형될 수 있다. 비변형 말단 아미노기는 이것이 -NH2 기라는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 아미노기는 변형된 아미노기일 수 있다.
변형은 전형적으로 화학기 첨가, 새로운 결합의 생성 및 화학기의 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 화학적 변형이다. 변형된 아미노기는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 아세틸화, 데스아미노, N-저급 알킬, N-디 저급 알킬, 제약된(constrained) 알킬(예를 들어, 분지, 환식, 축합, 아다만틸) 및 N-아실 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형된 아미노기는 또한 N-말단(예를 들어, pyroGlu) 보호된 아미노기를 수반하는 내부 아미드 결합 또는 방사성표지, 형광 태그 또는 친화도 태그(예를 들어, 바이오틴)의 부착 또는 세포-표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
세포-표적화 리간드는 세포에 결합하고/하거나 세포 내재화를 용이하게 하는 표적화 모이어티를 지칭한다. 세포-표적화 리간드는 폴리펩티드-계 물질, 예컨대, 환식 RGD, 트랜스페린 수용체 결합 펩티드, 항체 또는 세포 침투성 펩티드, 당 또는 소분자 유사 엽산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
아미노기에 대한 적합한 보호기는, 예를 들어 아실기, 예를 들어 알카노일기, 예컨대 아세틸, 알콕시카보닐 기, 예를 들어, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐 또는 t-부톡시카보닐기, 아릴메톡시카보닐기, 예를 들어 벤질옥시카보닐, 또는 아로일기, 예를 들어 벤조일이다. 특정 변형된 아미노기는 아실아미노이다. 특정 변형된 아미노기는 아세틸아미노이다.
저급 알킬은 t-부틸, 부틸, 프로필, 이소프로필, 에틸 및 메틸을 포함하는, C1-4알킬이다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 아미노기는 선택적으로 연결기를 통한 추가 중합체의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 아미노기는 선택적으로 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 첨가에 의해 변형되어 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 형성할 수 있다.
말단의 카복시기는 선택적으로 변형된 카복시기일 수 있음
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 카복시기는 비변형된다. 비변형 말단 카복시기는 이것이 -C(O)OH 기라는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 하나의 말단 카복시기는 변형된 카복시기이다.
변형은 전형적으로 화학기 첨가, 새로운 결합의 생성 및 화학기의 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 화학적 변형이다. 변형된 카복시기는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 아미드, 저급 알킬 아미드, 제약된 알킬(예를 들어, 분지, 환식, 축합, 아다만틸), 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형된 카복시기는 또한 보호된 카복시기 또는 방사성표지, 형광 태그 또는 친화도 태그(예를 들어, 바이오틴)의 부착 또는 세포-표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 카복시기에 대한 적합한 보호기는, 예를 들어, 에스테르화기, 예를 들어, 메틸 에틸기, t-부틸기 또는 벤질기이다. 특정 변형된 카복시기는 -CO2NH2이다. 특정 변형된 카복시기는 C-말단의 아미드화이다. 특정 변형된 카복시기는 카복스아미드기이다. 특정 변형된 카복시기는 N-(C1-4알킬)카바모일기이다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 카복시기는 선택적으로 연결기를 통한 추가 중합체의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드의 말단 카복시기는 선택적으로 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 첨가에 의해 변형되어 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 형성할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 -(OCH2CH2)n- 반복 서브유닛으로 이루어진 중합체이며, 여기서, n >3이다. 이는 전형적으로 에틸렌 옥사이드의 고리-열림 중합을 이용하여 합성된다.
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 폴리리신 폴리펩티드를 둘 다 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 하기 화학식 IC의 하위구조를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신일 수 있다:
[화학식 IC]
Figure pct00005
화학식 IC의 특정 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신은, 예를 들어, 하기와 같다:
Figure pct00006
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 하기 화학식 ID의 하위구조를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신일 수 있다:
[화학식 ID]
Figure pct00007
화학식 ID의 특정 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신은, 예를 들어, 하기와 같다:
Figure pct00008
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 하기 화학식 IE의 하위구조를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신일 수 있다:
[화학식 IE]
Figure pct00009
화학식 IE의 특정 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신은, 예를 들어, 하기와 같다:
Figure pct00010
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 하기 화학식 IF의 하위구조를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신일 수 있다:
[화학식 IF]
Figure pct00011
화학식 IF의 특정 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신은, 예를 들어, 하기와 같다:
Figure pct00012
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 말단 단부 중 하나에 변형이 있을 수 있거나, 말단 단부는 수소일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 말단 단부에 대한 적합한 변형은, 예를 들어, C1-4알킬, 예를 들어, 메틸; 또는 C1-4알콕시, 예를 들어, 메톡시이다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, PEG는 폴리리신에 부착되지 않은 말단 단부 상에 반응기를 가질 수 있다. 적합한 반응기는 말레이미드, 아지드, 알킨(예를 들어, C2-6알킨) 및 사이클로펜타디엔을 포함한다. 이런 반응기는 폴리펩티드에 대한 PEG 접합 전 또는 후에 방사성표지, 염료 및 세포 표적화 리간드와 같은 종을 부착시키는 데 사용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 말단 단부에 변형이 있을 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리리신 중합체 사이에 연결기가 있을 수 있다. 적합한 연결기는, 예를 들어, PEG-CH2-CH2-NH-PL 폴리펩티드 또는 PEG-NH-CH2-CH2-PL 폴리펩티드를 형성하는 C1-4알킬아미노, 예를 들어, -CH2-CH2-NH-; 또는, 예를 들어, PEG-CH2-CH2-PL 폴리펩티드를 형성하는 C1-4알킬렌, 예를 들어 -CH2-CH2-이다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 0.5 내지 30 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 2 내지 20 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 4 내지 11 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 1 내지 6 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 약 2 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 약 5 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
PEG가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 분자량 범위가 약 10 kDa인 중합체를 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리에틸렌 글리콜 폴리-D-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리에틸렌 글리콜 폴리-L-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 폴리에틸렌 글리콜 폴리-L/D-리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 1000개의 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 2 내지 1000개의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 10 내지 500개의 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 10 내지 500개의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 100개의 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 100개의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 50개의 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 20 내지 50개의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 40개의 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
폴리리신이 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 25 내지 40개의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리리신을 지칭할 수 있다.
약제학적 활성제
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 약제학적 활성제를 전달하기에 적합하다. 약제학적 활성제는 인간 또는 동물 신체 상에서 약리학적 효과를 발휘하여 치료 결과를 야기할 수 있는 임의의 물질이다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 유전자 물질, 화학적으로 변형된 핵산, 치료 펩티드, 화학치료제, 단백질, 단백질 접합체, 영상화제, CRISPR 기술과 관련된 단백질 핵산 및 천연 바이러스 성분, 예컨대, 캡시드 또는 효소로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 유전자 물질로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 유전자 물질, 예컨대, DNA 또는 RNA로부터 선택될 수 있다.
DNA가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 플라스미드, 선형 DNA, 단일 가닥 DNA, 최소화된 벡터, 예컨대, 미니-서클 및 미니-스트링, 헤어핀 및 십자형 DNA를 비롯한 폴딩된 DNA, 및 바이러스 유래 DNA일 수 있다.
RNA가 언급되는 임의의 실시형태에서, 이는 mRNA 또는 siRNA일 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 DNA로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 RNA로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 화학적으로 변형된 핵산으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 치료 펩티드로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 화학치료제로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 단백질로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 단백질 접합체로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 영상화제로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 CRISPR 기술과 관련된 단백질 핵산으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 천연 바이러스 성분, 예컨대, 캡시드 또는 효소로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 치료 단백질, 예컨대, 단클론성 항체, 예를 들어, 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 인플렉트라, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙 및 우스테키누맙을 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA); 효소, 예를 들어, 아갈시다제 베타, 이미글루세라제, 벨라글루세라제 알파, 탈리글루세라제, 알글루코시다제 알파, 알글루코시다제 알파, 라로니다제, 이두설파제 정맥내 및 갈설파제; 성장인자; 및 사이토카인, 예를 들어, IL-2 및 IFN-α로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 치료 단백질, 예컨대, 단클론성 항체를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA); 효소; 성장인자; 및 사이토카인으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 단클론성 항체를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 인플렉트라, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙 및 우스테키누맙으로부터 선택되는 단클론성 항체를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 효소를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 아갈시다제 베타, 이미글루세라제, 벨라글루세라제 알파, 탈리글루세라제, 알글루코시다제 알파, 알글루코시다제 알파, 라로니다제, 이두설파제 정맥내 및 갈설파제로부터 선택되는 효소를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 성장인자를 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 사이토카인을 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 IL-2 및 IFN-α로부터 선택되는 사이토카인을 암호화하는 핵산(즉, 플라스미드 및 mRNA)으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 siRNA로부터 선택될 수 있다.
약제학적 활성제가 언급되는 임의의 실시형태에서, 약제학적 활성제는 종양유전자, 성장인자 및 사이토카인 발현의 조절을 포함하는 적용분야에서 단백질 발현을 감소시키기 위해 사용되는 siRNA로부터 선택될 수 있다.
제형
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 전달 시스템이 제공된다. 약제학적 전달 시스템은 인간 또는 동물 신체에 약제학적 활성제를 전달하는 데 사용될 수 있는 전달 시스템이다.
일 실시형태에서, 약제학적 전달 시스템에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 약제학적 전달 시스템에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 약제학적 전달 시스템으로서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드가 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 활성제에 대한 전달 시스템이 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 리신 잔기 및 약제학적 활성제를 포함하는 폴리펩티드는 생리적 등장 완충제(예를 들어, 5% 트레할로스 또는 수크로스, 20 mM HEPES 또는 인산염 완충 식염수(PBS))에서 부드럽게 혼합되면서 조합되어 나노입자를 형성할 수 있다. 이들 제형은 즉시 전달될 수 있거나, 4℃에서 저장되거나 또는 장기간 보관을 위해 동결건조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드는 경구 투여용, 예를 들어, 정제 또는 캡슐로서, 비경구 주사용(정맥내, 피하, 진피내, 근육내, 혈관내 또는 주입을 포함), 연고 또는 크림으로서 국소 투여용 또는 좌약으로서 직장 투여용에 적합한 형태로 제조될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드는 주사용, 예를 들어, 정맥내, 피하, 진피내 또는 근육내 주사에 적합한 형태로 제조될 수 있다.
용도
본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드는 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애, 흡수불량 장애를 포함하는 광범위한 질병을 치료하는 데 적합한 약제학적 활성제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 치료 용도는 단백질의 전신 발현(즉, 바이러스 치료를 위한 항체) 또는 표적화된 전달(즉, 전이성 종양, 생체내 CAR-T)을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 전달 시스템이 제공된다.
일 실시형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 활성제에 대한 전달 시스템이 제공된다.
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 전달 시스템이 제공된다.
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 활성제에 대한 전달 시스템이 제공된다.
일 실시형태에서, 유전자 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 활성제에 대한 전달 시스템이 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료하다"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 이들의 하나 이상의 증상의 발병을 반전시키거나, 완화시키거나, 지연시키거나, 진행을 저해하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 증상이 발생된 후에 치료가 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료는 증상이 존재하지 않을 때 수행될 수 있다. 예를 들어, 치료는 (예를 들어, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전자 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 증상 발생 전에 민감한 개체에 대해 수행될 수 있다. 치료는 또한, 예를 들어, 이들의 재발을 나타내거나 지연시키기 위해, 증상이 해결된 후에도 계속될 수 있다.
약제학적 조성물
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 요법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기 및 약제학적 활성제를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 유전자 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 유전자 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
치료 방법
일 실시형태에서, 정온동물, 예컨대, 인간에서의 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 정온동물, 예컨대, 인간에서의 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 치료 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 치료 방법이 제공된다.
약제학적 조성물의 용도
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 대사 장애, 면역학적 장애, 호르몬 장애, 암, 혈액 장애, 유전적 장애, 전염병, 심장병, 뼈 장애, 호흡기 장애, 신경학적 장애, 부가 요법, 눈 장애 또는 흡수불량 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 유전자 치료에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 유전자 치료에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
키트
일 실시형태에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
a) 제1 유닛에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드;
b) 제2 유닛에서 약제학적 활성제; 및
c) 상기 제1 유닛 및 제2 유닛을 포함하기 위한 용기 수단.
일 실시형태에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
a) 제1 유닛에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드;
b) 제2 유닛에서 약제학적 활성제; 및
c) 상기 제1 유닛 및 제2 유닛을 포함하기 위한 용기 수단.
d) 사용 설명서.
[도면 의 간단한 설명]
도 1a: 완충 실험 1a): 산-염기 적정으로부터의 결과를 나타낸다. 용액 중 표시된 중합체의 4.5 내지 6.5의 pH 범위에서의 완충 특성은 그래프에 도시된다.
도 1b: 완충 실험 1b): 리소좀 완충으로부터의 결과를 나타낸다. 생세포에서 확인된 중합체의 완충 특성은 만데르 중복도 계수(Mander's Overlap Coefficient)(0 내지 1): 적색 신호(산성 pH)와 함께 공동국재화된 녹색 신호(중성 pH)/전체 녹색 신호로서 제시된다. 총 복합체에 대해 산성화된 복합체의 비로서 대략적으로 정의될 수 있는 0 내지 1의 척도인 만데르 계수. 완충이 일어나면, 세포는 녹색에 머무르고, 완충이 일어나지 않으면, 세포는 점점 더 적색이 된다.
도 2a. 나노입자 안정성 실험 2a) 음이온성 해리로부터의 결과를 나타낸다. 상이한 농도의 DS에 노출된 나노입자의 DNA 밴드 강도에 의해 정량화되고 겔 전기영동을 통해 분석된 덱스트란 설페이트(DS)에 의한 pDNA의 음이온성 변위를 향한 나노입자의 안정성 평가.
도 2b. 나노입자 안정성 실험 2b) 혈류에서의 나노입자 안정성으로부터의 결과를 나타낸다. 혈관 구조에서의 신호가 NP가 순환에 남아있음을 나타내는 Cy5-pDNA 나노입자의 꼬리 정맥 주사 후 상이한 시점에 획득한 대표적인 생체내 귓불 PK 영상. 축적 바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 3a. 나노입자 형질감염 실험 3) H1299 세포의 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 세포가 OPTI-MEM에서 루시퍼라제를 암호화하는 폴리-L-리신(PLL) 나노입자로 처리된 후의 정규화된 발광.
도 3b. 나노입자 형질감염 실험 3) 혈청 중 H1299 세포의 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 세포를 10% FBS 및 100 nM 클로로퀸으로 보충한 배지에서 루시퍼라제를 암호화하는 PLL 나노입자로 처리한 후의 정규화된 발광.
도 4는 나노입자 형질감염 실험 3) C2C12 Myotube 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 세포를 다음의 조건 하에 루시퍼라제를 암호화하는 PLL 나노입자로 처리한 후의 정규화된 발광: (a) OPTI-MEM, (b) 100 μM 클로로퀸으로 보충한 OPTI-MEM, (c) FBS로 보충한 배지 및 (d) 100 μM 클로로퀸 및 10% FBS로 보충한 배지.
도 5는 근육내 형질감염 실험 5) 마우스 근육내 루시퍼라제 발현으로부터의 결과를 나타낸다. 5 ㎍의 복합체화된 pDNA로 근육내 주사 후 마우스 뒷다리에서의 발광을 IVIS 및 IVIS Perkin Elmer 소프트웨어(n=8)를 통해 평가하였다.
실시예
본 명세서에서 사용된 약어
특정 중합체 또는 나노입자를 나타내기 위해 다음의 약칭을 사용한다:
"P" 또는 "N": "PLL" 또는 "PEG-PLL"(변형) 변형%
예를 들어, "P: PLL(M) 33" 및 "N: PEG-PLL(TM) 30".
기호설명:
Figure pct00013
P: 중합체;
Figure pct00014
N: 나노입자;
Figure pct00015
PLL: 폴리-L-리신은 폴리펩티드임;
Figure pct00016
PEG-PLL: 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 폴리-L-리신 폴리펩티드를 둘 다 포함함;
Figure pct00017
변형: 다음의 기호설명 "M", "MN" 또는 "TM"에 따른 리신의 ε-질소(화학식 I에 도시된 바와 같음)에서의 변형임:
Figure pct00018
; 및
Figure pct00019
변형%는 하기를 지칭함:
Figure pct00020
방법 1
1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온의 합성
Figure pct00021
(모르폴린-4-일)아세트산(1 g, 6.89 m㏖)을 디클로로메탄(DCM)(25 ㎖) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)(872 ㎎, 7.58 m㏖) 중에 용해시키고, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC·HCl)(1.60 g, 8.35 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후에 실리카겔의 2"×3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3×25 ㎖)으로 세척하고, 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온(1.3 g, 78%)을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.75 (d, J=3.6 Hz, 4H), 3.57 (s, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.67 (d, J=4.2 Hz, 4H); MS (ESI) 계산치:242.09, 관측치:243.3 (M+1).
방법 2
1-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온의 합성
Figure pct00022
6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카복실산(350 ㎎, 1.68 m㏖)을 실온에서 교반하면서 DCM(25 ㎖) 중에 용해시켰다. NHS(213 ㎎, 1.85 m㏖)를 첨가한 후에 EDC·HCl(418 ㎎, 2.18 m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서, 실리카겔의 2"×3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3×25 ㎖) 및 에틸 아세테이트(25 ㎖)로 세척하였다. 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 1-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온(325 ㎎, 63%)을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.89 (s, 1H), 8.07 (dd, J = 9.3 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 4.2 Hz, 4H) 3.72 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 2.89 (s, 4H). MS (ESI) 계산치: 305.1, 관측치: 306.3 (M+1).
방법 3
tert-부틸 3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카보닐}티오모르폴린-4-카복실레이트의 합성
Figure pct00023
4-(tert-부톡시카보닐)티오모르폴린-3-카복실산(1 g, 4.04 m㏖)을 교반하면서 실온에서 DCM(25 ㎖) 중에 용해시켰다. NHS(511 ㎎, 4.44 m㏖)를 첨가한 후에 EDC·HCl(1.01 g, 5.25 m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서, 실리카겔의 2"×3" 패드를 통해 여과시켰다. 패드를 DCM(3×25 ㎖)으로 세척하고, 여과액과 세척액을 합하고, 농축시켜 tert-부틸 3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카보닐}티오모르폴린-4-카복실레이트(1.3 g, 93.4%)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.38 (br s, 1H), 4.43-4.22 (m, 1H), 3.46-3.21 (m, 1H), 3.19-3.10 (m, 1 H), 3.06-2.97 (m, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.81-2.62 (m, 1H), 2.61-2.42 (m, 1H), 1.47 (s, 9H). MS (ESI) 계산치: 345.4 (M+1).
방법 4
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-리신의 합성
Figure pct00024
플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드 L-리신(Fmoc-Lys-OH)(15.3 g, 41.53 m㏖, 1.2 eq)를 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 ㎖) 중에 용해시켰다. DCM 중 상기 제조한 에스테르의 용액(방법 2)을 한 번에 첨가하고, DIPEA(10.73 g, 82.99 m㏖, 2.4 eq)를 첨가하였다. 출발 물질(TLC, 2시간)의 소모 후에 반응물을 추가로 실온에서 교반하고, 에틸 아세테이트(EtOAc)(250 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 ㎖)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층을 분리시켰다. 수성층을 EtOAc(2×250 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수(200 ㎖)로 세척하고 나서, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 생성물을 밝은 갈색의 유성 잔사로서 얻었고, 이를 THF 중에 용해시키고, 실리카겔 상에 흡착시키고, 실리카겔 칼럼에 의한 플래시 크로마토그래피(7"×3")로 정제하였다. 칼럼을 헥산 중 50% 에틸 아세테이트 및 100% 에틸 아세테이트로 세척하여 진공 흡인 하에 생성물을 용리시켰다. 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-리신(12.6 g, 65%)을 회백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.26 (br s, 1H), 8.62 (d, J = 1.5Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 2.5, 9Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.53 (dd, J = 4.5, 7.5Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.23 (q, J = 6.5Hz, 2H), 6.59 (t, J = 5Hz, 1H), 6.48 (d, J = 9Hz, 1H), 5.99 (d, J = 8Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 7.5, 12.5Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 12, 18Hz, 2H), 4.15 (d, J = 7Hz, 1H), 3.71 (t, = 4.5Hz, 4H), 3.56-3.32 (m, 6H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.86-1.75 (m, 1H), 1.71-1.57 (m, 2H), 1.56-1.39 (m, 2H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.2, 166.6, 159.9, 156.6, 146.9, 144.1, 143.9, 141.4, 137.7, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 119.5, 106.3, 67.2, 66.6, 53.8, 47.3, 45.3, 39.5, 32.0, 28.9, 22.4 ppm; MS (ESI) C31H34N4O6에 대한 정확한 질량 계산치 [M+H]+: 559.26, 실측치: 559.35.
실시예 1
(2S)-2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산(N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-리신)의 합성
방법 1:
Figure pct00025
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(6-모르폴리노니코티노일)-L-리신(방법 4)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다.
방법 2:
Figure pct00026
변형된 리신을 700 ㎕의 NMP(15 ㎎, 26.87 μ㏖) 중에 용해시켰다. 300 ㎕의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 ㎖)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 변형된 리신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000 g, 10분, 4℃)를 이용하여 차가운 디에틸 에테르(10 ㎖)에서 3회 세척하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3)를 사용하여 Fmoc 제거를 확인하였다 1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 11.89 (s, 1H), 8.85 (dd, 1H), 7.89 (dd, 1H), 7.34 (dd, 1H), 3.52-3.71(m, 8H), 3.35 (t, 1H), 2.72-2.61 (t, 2H), 2.01-1.57 (m, 6H) ppm. MS (ESI) 정확한 질량 계산치 [M+H2O]+: 352.55, 실측치: 352.04.
방법 5
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카보닐)티오모르폴린-3-카보닐)-L-리신의 합성
Figure pct00027
Fmoc-L-Lys-OH(8.94 g, 24.26 m㏖, 1.2 eq)를 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 ㎖) 중에 용해시켰다. DCM 중 상기 제조한 활성화된 에스테르의 용액(방법 3)을 한 번에 첨가하고, DIPEA(6.27 g, 48.53 m㏖, 2.4 eq)를 첨가하였다. 출발 물질(TLC, 2시간)의 소모 후에 반응물을 추가로 실온에서 교반하고, EtOAc(250 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 ㎖)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층을 분리시켰다. 수성층을 EtOAc(2×250 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 염수(200 ㎖)로 세척하고 나서, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 생성물을 밝은 황색의 유성 잔사로서 얻었고, 이를 DCM 중에 용해시키고, 실리카겔 상에 흡착시키고, 실리카겔 칼럼에 의한 플래시 크로마토그래피(7"×3")로 정제하였다. 칼럼을 헥산 중 50% 내지 70%의 에틸 아세테이트로 세척하여 진공 흡인 하에 생성물을 용리시켰다. 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카보닐)티오모르폴린-3-카보닐)-L-리신(9.1 g, 75%)을 회백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.5Hz, 2H), 7.63-7.51 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.5Hz, 2H), 5.71 (dd, J = 7.5, 23Hz, 1H), 4.97 (br s, 1H), 4.57-4.23 (m, 4H), 4.20 (t, J = 7Hz, 1H), 3.51-3.18 (m, 3H), 3.17-2.96 (br s, 1H), 2.77 (d, J = 12.5Hz, 1H), 2.70-2.58 (m, 1H), 2.38 (d, J = 12.5Hz, 1H), 1.98-1.86 (m, 1H), 1.85-1.73 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 2H), 1.46 (br s, 12H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.0, 156.4, 155.8, 143.9, 141.4, 127.9, 127.3, 125.3, 120.1, 67.3, 60.6, 53.8, 47.3, 39.2, 31.5, 29.1, 28.5, 26.7, 22.3 ppm; MS (ESI) C31H39N3O7S에 대한 정확한 질량 계산치 [M+Na]+: 620.24, 실측치: 620.35.
실시예 2
(2S)-2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산(N6-(티오모르폴린-3-카보닐)-L-리신)의 합성
방법 1:
Figure pct00028
N2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N6-(4-(tert-부톡시카보닐)티오모르폴린-3-카보닐)-L-리신(방법 5)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다. 유사하게, Boc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DCM 중 30% TFA를 이용하여 제거할 수 있다.
방법 2:
Figure pct00029
변형된 리신을 700 ㎕의 NMP(15 ㎎, 25.12 μ㏖) 중에 용해시켰다. 300 ㎕의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 ㎖)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 변형된 리신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000 g, 10분, 4℃)를 이용하여 차가운 디에틸 에테르(10 ㎖)에서 3회 세척하였다. 밤새 공기 건조시킨 후에, 생성물을 50% TFA:DCM(1 ㎖) 중에 용해시키고, 실온에서 15분 동안 교반하였다. 회전 증발기를 이용하여 TFA:DCM 용액을 제거하고, 침전시키고 나서, 차가운 에틸 에테르에서 2회 세척하고, 1H NMR을 이용하여 Fmoc 제거를 확인하였다: δ 11.56-12.04 (1H, br), 7.34 (s, 1H), 3.65-3.76 (dd, 2H), 3.42 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.01-3.15 (m, 2H), 2.70-2.89(m, 2H), 2.55-2.61 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-2.18 (m, 2H), 1.74-1.85 (m, 2H), 1.58-1.64 (q, 2H) 1.05 (1H, s) ppm 및 MS (ESI) 정확한 질량 계산치 [M+H2O]+: 279.22, 실측치: 279.62.
방법 6
N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-리신의 합성
Figure pct00030
다음의 절차를 사용하여 N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-리신, Fmoc-L-Lys-OH 1.2 eq)를 생성하고, 실온에서 기계적 교반 하에 THF-물(1:1, 800 ㎖) 중에 용해시킬 수 있다. DCM 중 상기 제조한 활성화된 에스테르의 용액을 한 번에 첨가하고, DIPEA(2.4 eq)를 첨가할 수 있다. 출발 물질(TLC, 2시간)의 소모 후에 반응물을 추가로 실온에서 교반할 수 있고, EtOAc(250 ㎖)를 첨가할 수 있다. 혼합물을 HCl(1 M, 200 ㎖)로 산성화시키고, 분별 깔때기에 붓고, 층을 분리시킬 수 있다. 수성층을 EtOAc(2×250 ㎖)로 추출할 수 있다. 유기층을 합하고, 염수(200 ㎖)로 세척하고 나서, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시킬 수 있다. 조질의 생성물을 DCM 중에 용해시키고, 실리카겔 상에 흡착시키고, 실리카겔 칼럼에 의한 플래시 크로마토그래피(7"×3")로 정제하였다. 칼럼을 헥산 중 50% 내지 70%의 에틸 아세테이트로 세척하여 진공 흡인 하에 생성물을 용리시킬 수 있다. 필요한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 N2-(N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-리신을 제공할 수 있다.
실시예 3
(2S)-2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산(N6-(2-모르폴리노아세틸)-L-리신)의 합성
방법 1:
Figure pct00031
N2(1-{[(모르폴린-4-일)아세틸]옥시}피롤리딘-2,5-디온)-L-리신(방법 6)의 Fmoc 보호기를 당업계에 공지된 표준 절차에 의해, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용하여, 제거할 수 있다.
방법 2:
Figure pct00032
변형된 리신을 700 ㎕의 NMP(15 ㎎, 25.02 μ㏖) 중에 용해시켰다. 300 ㎕의 피페리딘을 후속적으로, 교반하면서 용액(피페리딘:NMP=7:3; 1 ㎖)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 변형된 리신을 후속적으로 침전시키고, 원심분리(4000 g, 10분, 4℃)를 이용하여 차가운 디에틸 에테르(10 ㎖)에서 3회 세척하였다. H-NMR을 이용하여 Fmoc 제거를 확인하였다: 1H NMR (500 MHz, CDl3) δ 12.01 (br s, 1H), 3.62-3.74 (m, 4H), 3.40 (t, 1H), 3.29 (s, 2H), 3.10 (t, 1H), 2.59-2.70 (m, 4H), 1.88-2.01 (m, 2H), 1.58-1.65 (m, 2H), 및 1.46-1.56 (q, 2H) 및 MS (ESI) 정확한 질량 계산치 [M+H2O]+: 273.17, 실측치: 273.33.
실시예 4
폴리(L-리신) 및 PEG-폴리(L-리신) 폴리펩티드
Figure pct00033
방법 1 내지 3에서 제조한 NHS-에스테르를 대응하는 PLL(MW 5000, Alamanda Polymers Inc., 앨라배마주 헌츠빌 소재) 또는 PEG-PLL(MW 13000, Alamanda Polymers Inc., 앨라배마주 헌츠빌 소재)와 반응시킴으로써 변형된 PEG-PLL 및 PLL을 제조하였다. 모든 중합체에 PLL의 말단 카복시 단부에서 중합 개시제 잔기(본 명세서에서 단순히 PLL로서 지칭됨) 또는 MeO-PEG-(CH2)2-NH- 기(본 명세서에서 PEG-PLL로서 지칭됨)를 공급하였다. PLL(20 ㎎, 2.5 μ㏖) 또는 PEG-PLL(20 ㎎, 1.5 μ㏖)을 새로 제조한 0.1 M 중탄산나트륨, pH 8.0(4 ㎖)에 용해시켰다. 방법 1, 2 또는 3의 40 mM의 화합물을 디메틸아세트아미드(DMAC)(1.5 몰 과량)에서 제조하고, 교반하면서 중합체 용액에 적가하였다. NHS-에스테르의 몰 공급비를 조절함으로써 상이한 변형도를 갖는 일련의 PLL을 제조하였다. 12.5 대 50 몰당량의 NHS 에스테르:중합체에서 변형 반응을 수행하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였고, 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4에서 투석을 통해 비반응기를 후속적으로 제거하고, 이어서, 분자량 컷오프(MWCO)가 3.5 kDa인 투석 카세트를 이용하여 물을 제거하였다. PLL(TM) 및 PEG-PLL(TM)의 경우, 30분 동안 30% 트리플루오로아세트산/DCM 중 동결건조 생성물의 인큐베이션을 통해 선행기술에서 사용된 표준 프로토콜을 이용하여 중간체 생성물(*) 상의 Boc 보호기를 제거하였다. Lys의 β, γ 및 δ-메틸렌 양성자((CH2)3, δ = 1.3 내지 1.9 ppm) 대 모르폴린의 모르폴린 고리(M)(출발물질 방법 1) 및 모르폴리노-나이아신기(출발물질 방법 2)(MN)(CH2)2, 모르폴린 및 모르폴리노-나이아신 및 (CH2)2의 경우 δ = 3.86 및 2.58 ppm, 티오모르폴린(TM)의 경우 δ = 3.11 및 3.56 ppm(출발물질 방법 3)으로부터의 메틸렌 양성자의 최대 강도 합계의 최대 강도 비에 의해 D2O에서 기록된 H-NMR 스펙트럼으로부터의 리신 변형도를 결정하고, 결과를 아래의 표에 나타낸다.
Figure pct00034
실시예 5
유전자 물질을 이용하는 나노입자의 제조 및 특성규명
중성 완충제 중 폴리펩티드와 핵산 용액을 혼합함으로써 나노입자를 제조하였다. 나노입자 형성을 확인하기 위해 동적 광산란(DLS), 투과전자현미경법(TEM) 및 브로민화에티듐 배제 분석을 포함하는 표준 기법을 이용하여 나노입자를 평가하였다.
a) 나노입자 제조
DNA(Gwiz 루시퍼라제; Genlantis, 캘리포니아주 샌디에이고)(66.6 ㎍/㎖) 및 중합체 용액을 20 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 완충제, pH 7.0에서 제조하였다. 중합체 용액을 PLL(50 단위, Alamanda Polymers, Inc., 앨라배마주 헌츠빌), PEG(5K)-PLL(50 단위)(Alamanda Polymers, Inc., 앨라배마주 헌츠빌) 및 "P: PLL(M) 29", "P: PLL(MN) 31", "P: PLL(TM) 28", "P: PEG-PLL(M) 33", "P: PEG-PLL(MN) 31" 및 "P: PEG-PLL(TM) 30"에 의해 제조하였다(모두 실시예 4와 유사한 절차에 의해 제조함). 중합체 용액을 또한 HEPES에서 제조하였고, 따라서, 중합체의 아민(N) 대 DNA 골격의 포스페이트(P) 비(N:P 비)는 0.5 내지 10일 것이다. 후속적으로 균질한 입자를 보장하기 위해 DNA 용액을 부드럽게 교반하면서 중합체 용액에 적가하였다. DNA/중합체 나노입자가 실온에서 30분 동안 형성되게 하였다. 나노입자 용액에서 DNA의 최종 농도는 33.3 ㎍/㎖였다. 초기에, 상이한 N:P 비(0.5 내지 10)로 복합체를 제조하고, 핵산 축합에 필요한 비를 결정하기 위해 DNA 겔 전기영동을 사용하였다.
b) 동적 광산란(DLS)
입사빔으로서 녹색 레이저(λ =532 ㎚)를 이용하는 ZetaSizer Nano ZS 기기(Malvern Instruments Ltd., 영국 우스터 소재)를 이용하여 DLS 데이터를 수집하였다. 25℃에서 173°의 검출 각도에서 모든 측정을 수행하였다. 33.3 ㎍의 복합체 pDNA/㎖에서 20 mM HEPES 완충제(pH 7.4) 중 상기 기재한 바와 같이 제조한 나노입자 샘플을 저용적 ZEN2112 석영 큐벳(12.5 ㎕)에 장입하였다. 누율 적합 분석(cumulant fit analysis)을 이용하여 유체역학적 직경 및 다분산성 지수(PDI)를 유도하였다. 정확성을 위해 자동 감쇠기 조절 및 다중 스캔(15 내지 20)을 이용하여 모든 측정을 수행하였다. 모든 데이터 지점은 3회 이상 개별적으로 제조된 샘플의 평균을 나타낸다.
Figure pct00035
결과
실험 1
a) 완충
산성 용액의 첨가 시 pH를 유지하는 완충 능력을 평가하기 위해 중합체 용액의 산-염기 적정을 수행하였고, 세포내 리소좀 완충 연구를 수행하여 물질 완충 능력을 추가로 평가하였다.
a) 산-염기 적정
중합체 PEG(5K)-PLL(50 단위)(Alamada Polymers), PEI(25K, Polysciences Inc), "P: PEG-PLL(M) 35"(중합체 12), "P: PEG-PLL(MN) 39"(중합체 15) 및 "P: PEG-PLL(TM) 33"(중합체 18) 용액(3 ㎖)을 150 mM NaCl 중 1 ㎎/㎖로 제조하고 1 M NaOH의 첨가에 의해 pH 11까지 적정하였다. 교반하면서, 5 ㎕ 증분으로 0.1 M HCl을 이용하여 중합체 용액을 pH 4.5까지 적정하였다. 완충 능력은 중합체 용액 pH를 0.5만큼 변화시키는 데 필요한 평균 용적(㎕)으로서 보고하였다. pH를 7.4에서 4.5로 변화시키기 위해 첨가한 HCl의 몰을 용액당 아민의 총 몰로 나누어서 세포외 중성 pH 7.4와 엔도솜 산성 pH 4.5(Δα7.4 내지 4.5) 사이의 양성자화 정도 변화를 계산하였다. 모든 적정 실험을 3회 수행하였다. 결과를 도 1a에 나타낸다.
b) 리소좀 완충
동일 픽셀에서 공동국재화된 녹색:적색 형광비를 측정함으로써 pH 추정을 가능하게 하기 위해 Gwiz 루시퍼라제(Genlantis, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 2개의 형광단, 즉, pH-둔감 녹색 염료 및 pH 민감 적색 염료로 표지하였다. 처음에, MFP488 LabelIT® 핵산 키트(Mirus Bio LLC, 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 DNA를 표지하고, 이어서, 제조업자의 제안 프로토콜을 이용하여 Amine LabelIT® 핵산 키트(Mirus Bio LLC, 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 아민-작용기화하였다. 에탄올 침전을 사용하여 비반응 염료를 제거하였다. 후속적으로, DNA를 NHS 에스테르 pHRODO 레드(Thermo Fischer, 매사추세츠주 월섬 소재)로 표지하고, 에탄올 침전을 통해 정제하였다. 상이한 형광단(플라스미드당 대략 40가지 염료)을 이용하여 DNA의 변형을 확인하고 정량화하기 위해 분광측광을 사용하였다. 이어서, MFP-488 및 pHRODO 레드 이중-표지 DNA를 사용하여 아래에 기재하는 바와 같이 나노입자를 제조하였다. 세포 연구를 위해, 96-웰 플레이트에서 H1299 세포를 웰당 10,000개의 세포로 파종하였고, 10% FBS 및 1% P/S로 보충한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지에서 24시간 동안 부착시켰다. 다음에, 세포를 100 ㎕의 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕의 OPTI-MEM으로 1회 세척하였다. 상기 기재한 바와 같이 5의 아민 대 포스페이트 비(33.3 ㎍/㎖의 최종 DNA 농도)로 20 mM HEPES에서 DNA(66.6 ㎍/㎖)와 중합체 용액을 혼합함으로써 PEI, PEG-PLL, "P: PEG-PLL(M) 35"(중합체 12), "P: PEG-PLL(MN) 39"(중합체(15) 및 "P: PEG-PLL(TM) 33"(중합체 18))에 의해 DNA 나노입자를 제조하였다. 이어서, OPTI-MEM(1:10 희석)에서 웰당 0.1 ㎍의 DNA로 NP를 세포에 첨가하였다. 4시간의 기간 후에, 세포를 훽스트 염색(Hoechst stain)(5분 동안 PBS 중 5 ㎍/㎖ 저장액)으로 처리하고, EVOS Cell Imaging System(Thermo Fischer, 매사추세츠주 월섬 소재)을 갖는 형광 현미경을 이용하여 영상화하였다. 산성, 중성 및 염기성 완충제에서 나노입자의 처리 후에 고정, 투과된 세포를 영상화함으로써 세포내 pH에 근사하는 척도 바를 생성하였다. 이 분석에서, pH가 증가함에 따라 pHRODO 적색 신호는 극적으로 증가되는 한편, MFP488은 pH 둔감성이며, 따라서, 산성 소포는 적색 또는 오렌지색을 나타내고, 중성 소포는 녹색을 나타낸다. 결과를 도 1b에 나타낸다.
실험 2
나노입자 안정성
음이온성 해리 및 생체내 약물동태학(PK) 연구에서 나노입자 안정성을 평가하였다.
a) 음이온성 해리
2 ㎍의 Gwiz 루시퍼라제 DNA(Genlantis, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)와 함께 5의 N:P에서 PEG-PLL 및 중합체 12, 15 및 19로 실시예 5에서 상기 기재한 바와 같이 나노입자를 제조하였다. 20 mM HEPES 완충제 및 덱스트란 설페이트(DS)(Sigma-Aldrich, 20 mM HEPES 완충제 중 5 g/㎖) 용액을 각 나노입자 샘플에 첨가하고, 따라서 최종 pDNA 농도는 일정하게 남아있었고, DS 농도는 0 내지 200 ㎎/㎖에서 변하였다. 37℃에서 30분의 처리 기간 후에, 15 ㎕의 각 제형을 브로민화에티듐과 함께 2% 전기영동법 겔(Thermo Fischer Scientific)에 첨가하고 표준 E- 겔 프로토콜을 이용하여 10분 동안 실행하였다. 결과를 도 2a에 나타낸다.
b) 혈류에서의 나노입자 안정성
혈류에서의 나노입자 안정성을 마우스 귓불에서 혈관의 다중-광자 공초점 형광 현미경 영상화에 의해 결정하였다. 나노입자 용액을 5% 트레할로스 용액 중 100 ㎍의 DNA/㎖(N:P =5)에서 Cy5-표지 pDNA(20 염료/플라스미드)를 이용하여 PEG-PLL 및 중합체 12, 15 및 19와 함께 실시예 5에 기재한 바와 같이 제조하였다. 후속적으로 Balb/c 마우스를 유도 챔버에서 이소플루란으로 마취시킨 후에 현미경 스테이지에 위치된 노즈콘(nose cone)에 전달하였다. 이어서, 마우스의 귀를 놓고, 맞춤 슬라이드 홀더 및 유리 슬라이드를 이용하여 납작하게 만들어서 Leica SP8 DIVE 다중-광자 현미경에 의한 영상화를 가능하게 하였다. 나노입자의 영상화를 위해 M32 백 애퍼처(back aperture)가 있는 25×1.0 NA 침수형 대물렌즈(water immersion objective)를 사용하였다. Spectra-Physics X3 레이저의 1220 nM 선을 이용하여 Cy5 염료를 여기시켰다. 영상화를 위해 DIVE 시스템의 2개의 논-디스캔(non-descanned) 검출기를 사용하였다. 2차 고조파(harmonics) 영상화를 위해 1개의 DIVE HyD 검출기를 605 내지 615 nM로 조정하였다. Cy5 방출 검출을 위해 두 번째 검출기를 635 내지 775 nM로 조정하였다. 2차 고조파를 사용하여 정맥 및 동맥이 있는 시야를 찾았고, 이후에 마우스에 200 ㎕(20 ㎍의 pDNA)의 꼬리 정맥 주사를 통해 나노입자 제형을 I.V.로 투여하였다. 혈관내 신호가 주변 조직에서 또는 2시간 동안 동일하게 될 때까지 마우스를 영상화하였다. 각 구체화된 시점 동안 1s 기간에 걸쳐 수집된 영상의 최대 강도 투영을 생성하기 위해 ImageJ를 사용하였다. 최소 3마리의 마우스에서 각 제형을 시험하였다. 결과를 도 2b에 나타낸다.
실험 3
나노입자 형질감염
음이온성 해리 및 순환에서 나노입자 안정성을 평가하였다.
H1299 및 C2C12 세포를 RPMI 배지에서 10,000개의 세포/웰로 또는 10% 소태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S)으로 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 20,000개의 세포/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 형질감염 전에, 최소 7일 동안 2%의 말 혈청을 보충한 DMEM에서의 인큐베이션을 통해 C2C12 근육모세포가 근관세포로 분화되는 동안, H1299 세포에 24시간의 회복 기간이 허용되었다. 후속적으로, 세포를 100 ㎕의 PBS로 2회 세척하고, 배양 배지 또는 변형된 이글 최소 배지(OPTI-MEM)로 1회 세척하였다. PEI, PLL, "PLL(M) 37"(중합체 2), "PLL(MN) 33"(중합체 5), "PLL(TM) 39"(중합체 8), PEG-PLL, "PEG-PLL(M) 35"(중합체 12), "PEG-PLL(MN) 39"(중합체 15), "PEG-PLL(TM) 33"(중합체 18)을 이용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 나노입자를 제조하였다. 비변형 PEI, PLL 및 PEG-PLL 나노입자를 3의 N:P로 1 ㎍의 DNA로 제조하고, 변형된 PLL 나노입자를 5의 N:P로 제조하였다. 복합체화 후에, NP를 OPTI-MEM(1:10 희석) 또는 배양 배지 중 하나에서 웰당 0.1 ㎍의 DNA로 세포에 첨가하였다. 16시간의 기간 후에, 나노입자 보충 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하였다. Incucyte (Essen BioScience, 미시간주 앤아버 소재)를 이용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 영상화하고, ONE-Glo™ + Tox 루시퍼라제 수용체(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 및 PHERAstarFSX 기기(BMG Lab Tech, 노스캐롤라이나주 캐리 소재)에 대한 표준 프로토콜을 이용하여 루시퍼라제/생존도를 정량화하였다. 결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.
4) 독성
생사 분석을 이용하여 물질 독성을 평가하였다.
96-웰 플레이트(10000개/웰)에서 H1299 세포를 파종하였다. 24시간의 회복 기간 후에, 세포를 0.1 내지 2 ㎍의 PEI(25K, Polyscience, Inc., 펜실베이니아주 필라델피아 소재), PLL(Alamanda Polymers, Inc., 앨라배마주 헌츠빌 소재, 5 kDa), 및 OPTI-MEM에서 제조한 P: PLL(M) 33, P: PLL(MN) 33, 및 P: PLL(TM) 33"으로 처리하였다. 16시간의 노출 후에, 생/사 염색 또는 대사 분석을 이용하여 세포를 분석하였다. 생/사 분석을 위해, 10 ㎕의 칼세인 AM(DMSO 중 2 mM) 및 5 ㎕의 요오드화프로피듐(2 mM DMSO) 저장 용액을 5 ㎖의 PBS 중에 용해시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 염색 용액을 첨가하였다(100 ㎕/웰). 37℃에서 30분 인큐베이션 기간 후에, IncuCyte 플레이트 판독기(Sartorius)를 이용하여 세포를 영상화하였다. 대안적으로, 제조업자 표준 프로토콜을 이용하여 CellTiter-Glo® 발광 분석을 이용하여 대사 분석을 수행하였다. PHERAStar 플레이트 판독기(BMG LabTech)를 이용하여 발광 측정을 수집하였고, Microsoft excel에서 데이터를 적합화시킴으로써 IC50 용량을 도출하였다.
Figure pct00036
5) 근육내 형질감염
근육내 주사 후 리포터 단백질 루시퍼라제 발현의 모니터링을 통해 생체내에서의 나노입자 형질감염 효율을 평가하였다.
누드(nu/nu) 마우스에 뒷다리마다 50 ㎕의 5% 트레할로스 용액(마우스당 n=2)에서 PEI, PEG-PLL 또는 P: PEG-PLL(MN) 39(중합체(15))와 복합체화된 5 ㎍의 DNA를 근육내로 주사하였다. IVIS(Perkin Elmer)를 이용하여 발현을 매일/매주 평가하였고, 그 결과 마우스에 150 ㎕의 RediJect(30 ㎎/㎖ 루시페린-D)를 IP 주사로 투여하였다. 발광을 4회 수집하였고, 평균 +/- 표준 편차로서 제시하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 I의 변형된 리신:
    [화학식 I]
    Figure pct00037

    [식 중,
    A는 결합, C1-6알킬렌, 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴이되; 상기 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R2에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RA로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있으며;
    Q는 결합, 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴이되; 상기 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴은 하나 이상의 R3에 의해 탄소 상에서 선택적으로 치환될 수 있고; 상기 헤테로사이클릴이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RB로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있고;
    고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이되; 상기 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이 -NH- 모이어티를 포함한다면, 질소는 RC로부터 선택된 기로 선택적으로 치환될 수 있으며;
    R 1 , R 2 및 R 3 은 각각 독립적으로 할로, 니트로, 사이아노, 하이드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 아미노, 카복시, 카바모일, 머캅토, 설파모일, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 아세틸, 아세톡시, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, N-메틸-N-에틸아미노, 아세틸아미노, N-메틸카바모일, N-에틸카바모일, N,N-디메틸카바모일, N,N-디에틸카바모일, N-메틸-N-에틸카바모일, 메틸티오, 에틸티오, 메틸설피닐, 에틸설피닐, 메실, 에틸설포닐, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, N-메틸설파모일, N-에틸설파모일, N,N-디메틸설파모일, N,N-디에틸설파모일 및 N-메틸-N-에틸설파모일로부터 선택되고;
    n은 0 내지 4이며;
    R A , R B 및 R C 는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 아세틸, 메실, 에틸설포닐, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡시카보닐, 카바모일, N-메틸카바모일, N-에틸카바모일, N,N-디메틸카바모일, N,N-디에틸카바모일 및 N-메틸-N-에틸카바모일로부터 독립적으로 선택된다].
  2. 제1항에 있어서, A는 결합, C1-6알킬렌 또는 헤테로사이클릴인, 변형된 리신.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Q는 결합인, 변형된 리신.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n은 0인, 변형된 리신.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 모르폴리닐인, 변형된 리신.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 티오모르폴리닐인, 변형된 리신.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    A는 결합, 메틸렌 또는 피리딜이고;
    Q는 결합이며;
    고리 B는 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이고;
    n은 0인, 변형된 리신.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 IB의 변형된 리신인, 변형된 리신:
    [화학식 IB]
    Figure pct00038
    .
  9. 제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    2-아미노-6-{[6-(모르폴린-4-일)피리딘-3-카보닐]아미노}헥산산;
    2-아미노-6-[(티오모르폴린-3-카보닐)아미노]헥산산; 및
    2-아미노-6-[2-(모르폴린-4-일)아세트아미도]헥산산
    으로부터 선택되는, 변형된 리신.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 20 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 50% 미만은 변형된 리신 잔기인, 폴리펩티드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 50% 미만은 변형된 리신 잔기이고, 나머지는 비변형된 리신 잔기인, 폴리펩티드.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 더 포함하는, 폴리펩티드.
  15. 약제학적 전달 시스템으로서 사용하기 위한 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드.
  16. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드 및 약제학적 활성제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약제학적 활성제는 유전자 물질인, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유전자 물질은 DNA인, 약제학적 조성물.
  19. 유효량의 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 정온동물, 예컨대, 인간에서의 유전자 치료 방법.
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