KR20220134270A - 메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 - Google Patents

메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은 간단한 공정을 통해 체내 흡수율이 높은 저분자 진세노사이드 함량을 증가시킬 수 있으며, 무균상태에서 조직 배양한 산삼배양근을 사용함으로써 건강식품 소재로 적용함에 있어 안정성이 높다.

Description

메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법{Method for producing fermentative product of cultured mountain ginseng extract with increased small molecule ginsenoside content through methyl jasmonate treatment}
본 발명은 메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법에 관한 것이다.
산삼(山蔘)은 고려인삼의 시조로서 두릅나무과(Araliaceae), 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 음지성 초본식물로서, 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)이 야생상태에서 자연 발아하여 성장한 삼(蔘)을 일컬으며 우리나라에서는 오래전부터 약용으로 사용되어 왔다. 특히 천연산삼은 발견되는 것이 더욱 희박해지고 있으며, 소수의 심마니들에 의해서 발견되는 신비의 양약으로 알려져있다. 산삼은 천종, 지종, 인종, 장뇌삼의 4가지로 분류되는데 천종, 지종, 인종은 야생삼으로 조류가 종자를 먹은 뒤 산 속에 배설하여 자생한 것을 말한다. 장뇌산삼은 산삼의 종자를 야생에서 인위적으로 재배한 것을 말한다.
산삼은 사포닌(saponin), 항산화물질, 펩타이드, 다당류, 지방산, 알콜, 비타민 등을 함유하고 있으며, 이 중 트리테르페노이드(triterpenoid) 계열의 화합물인 진세노사이드(ginsenoside)는 주요 생리활성물질로 보고되었다. 트리테르페노이드는 올레아난(oleanane)과 다마란(dammarane)계 사포닌으로 구분되며, 진세노사이드의 대부분은 다마란계 사포닌으로써 구조적 특징으로 구분되는데, 3, 12 및 20번 탄소에 수산기(hydroxyl group)가 있는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol, PPD) 타입의 사포닌과 6, 12 및 20번 탄소에 수산기가 있는 프로토파낙사트리올(portpanaxatriol, PPT) 타입의 사포닌으로 구분된다. 프로토파낙사디올(PPD)계 진세노사이드로는 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등이 있고, 프로토파낙사트리올(PPT)계 진세노사이드로는 Rh1, Rg2, Rg1 및 Re 등이 있으며, PPD계는 중추신경 진정에 효과가 있고, PPT계는 혈중 콜레스테롤 수치 감소에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 진세노사이드는, 삼에 함유된 채로 존재하는 상태에서는 당이 진세노사이드 기본골격에 붙어 있어서 다당류의 형태를 취하고, 이는 곧바로 체내 흡수가 되기 어려우며, 장내에서 다당류가 단당류로 가수분해된 후, 즉 고분자에서 저분자로 전환된 후에 비로소 흡수된다. 대표적인 저분자 진세노사이드로는 Rg3, Rk1, Rg5, Compound K 등이 있으며, Rg3는 혈압저하, 항암 효과를 지니며 Rk1 및 Rg5는 치매 예방, 아토피, 골다공증 예방 등의 효과가 보고되었으며, Compound K는 항염 및 간보호 효과 등이 보고되었다. 따라서, 체내의 흡수율을 높이기 위해서는, 진세노사이드의 저분자화가 선행될 필요가 있음이 알려져 있다.
최근에는 약용식물을 기내에서 대량배양하는 조직배양 기술이 발전하고 있는데, 희귀약용식물의 보급을 위한 기내도입, 순화를 통한 육묘배양, LED와 생장조절제 처리를 통한 식물의 특정부위 및 캘러스 배양 기술 등이 실용화되고 있다. 기내 배양은 생물배양기(bioreactor)를 이용하여 병충해, 계절변화, 토지조성 등에 영향을 받지 않으면서 재배가 어려운 약용식물의 조직이나 세포를 연중 안정적으로 생산할 수 있고, 유용성분의 표준화가 가능하다는 큰 장점이 있다. 산삼의 모세포를 기내도입한 후 부정근(adventitious root) 배양을 이용한 산삼배양근 진세노사이드 생산기술은 인삼 모상근 배양에 비하여 유전적 안전성과 높은 유용성 물질 생산성을 가지고 있어 기능성 식품 개발에 활용되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1564487호에는 발효효소와 알코올발효균주를 이용한 '저분자 진세노사이드의 제조방법'이 기재되어 있고, 한국등록특허 제1467522호에는 '감압 재순환 고속 증숙 공정장치를 이용한 인삼의 저분자 진세노사이드 함량 증진 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 메틸 자스모네이트 처리를 통한 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 자스모네이트가 처리된 배지에서 배양된 산삼배양근과 에탄올을 혼합하여 추출물을 제조한 후 감압농축하여 농축물을 제조하였다. 그 후 상기 농축물을 증류수에 희석하고, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주를 접종하여 발효시킨 다음 산삼배양근 추출물의 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과, 발효 처리하지 않은 산삼배양근 추출물에 비해 고분자 진세노사이드 함량은 감소하고 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 산삼배양근 배양 배지에서 기내배양한 산삼배양근에 엘리시터(elicitor)를 처리한 후 산삼배양근을 추가로 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 추출용매를 첨가하여 추출물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 추출물과 물을 혼합한 후 발효 균주를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, Rg3, Rg5 및 Rk1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물을 제공한다.
본 발명에 따른 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은 간단한 공정을 통해 체내 흡수율이 높은 저분자 진세노사이드 함량을 증가시킬 수 있으며, 무균상태에서 조직 배양한 산삼배양근을 사용함으로써 건강식품 소재로 적용함에 있어 안정성이 높다.
도 1은 다양한 메틸 자스모네이트(MJ)의 농도(62.5 μM, 125 μM, 250 μM 또는 500 μM) 및 처리 기간 조건에 따라 배양된 산삼배양근의 생체중을 측정한 결과이다. 가로축에서 'MJ 농도-' 다음으로 기재된 숫자(1~7)는 총 8주의 산삼배양근 배양 기간 중에서 메틸 자스모네이트가 배양 몇 주째에 처리된 것인지를 의미한다. CON: 대조군(엘리시터가 처리되지 않은 산삼배양근), MJ: 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), *: Duncan's Multiple Range Test(DMRT, p<0.05).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 산삼배양근 배양 배지에서 기내배양한 산삼배양근에 엘리시터(elicitor)를 처리한 후 산삼배양근을 추가로 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 추출용매를 첨가하여 추출물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 추출물과 물을 혼합한 후 발효 균주를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 엘리시터는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 피루브산(pyruvic acid), 스쿠알렌(squalene) 또는 β-시토스테롤(sitosterol)일 수 있고, 바람직하게는 메틸 자스모네이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 메틸 자스모네이트 처리는 배양 배지 기준 150~500 μM 농도, 더 더욱 바람직하게는 200~300 μM 농도, 가장 바람직하게는 250 μM 농도의 메틸 자스모네이트를 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 메틸 자스모네이트 처리는 산삼배양근 배양 배지에서 4~6주 동안 기내배양한 산삼배양근에 처리할 수 있으며, 바람직하게는 산삼배양근 배양 배지에서 5주 동안 기내배양한 산삼배양근에 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 산삼배양근 배양 배지는 SH 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 발효는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 이용하여 발효하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기탁균주는 한국등록특허공보 제1816596호에 개시된 균주이다. 상기 균주의 접종 농도는 3,000~3,300ppm일 수 있으며, 바람직하게는 3,100~3,150ppm일 수 있으며, 가장 바람직하게는 3,125ppm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 발효는 115~125℃에서 190~230분 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 118~122℃에서 200~220분 동안 수행할 수 있으며, 가장 바람직하게는 120℃에서 210분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 저분자 진세노사이드는 바람직하게는 Rg3, Rg5 및 Rk1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은, 구체적으로는
(a) 산삼배양근 배양 배지에서 4~6주 동안 기내배양한 산삼배양근에 150~500 μM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 처리한 후 산삼배양근을 2~4주 동안 추가로 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 에탄올 추출물과 물을 혼합한 후 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하고 115~125℃에서 190~230분 동안 발효하는 단계;를 포함할 수 있고,
보다 구체적으로는
(a) 산삼배양근 배양 배지에서 4.5~5.5주 동안 기내배양한 산삼배양근에 200~300 μM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 처리한 후 산삼배양근을 2.5~3.5주 동안 추가로 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 에탄올 추출물과 물을 혼합한 후 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하고 118~122℃에서 200~220분 동안 발효하는 단계;를 포함할 수 있고,
더욱 구체적으로는
(a) 산삼배양근 배양 배지인 SH 배지에서 5주 동안 기내배양한 산삼배양근에 250 μM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 처리한 후 산삼배양근을 3주 동안 추가로 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 에탄올 추출물과 물을 혼합한 후 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하고 120℃에서 210분 동안 발효하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 이어서, 상기 (b) 단계에서 제조된 산삼배양근의 에탄올 추출물은 여과하고 농축하여 사용할 수 있다. 상기 여과 및 농축은 당업계에 공지된 임의의 여과 및 농축 공정을 통하여 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된, Rg3, Rg5 및 Rk1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물을 제공한다.
본 발명의 산삼배양근 추출물의 발효물은 메틸 자스모네이트가 처리된 배지에서 배양된 산삼배양근의 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스 HLJG0702 균주를 접종한 후 120℃에서 210분 동안 스팀을 가하며 발효시켜 제조된 것으로, 대조군(메틸 자스모네이트가 처리되지 않은 산삼배양근의 추출물)에 비해 저분자 진세노사이드인 Rg3, Rg5 및 Rk1 함량이 현저히 증가된 발효물이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료 및 발효 균주
실험에 사용된 산삼배양근을 배양하기 위해 강원도 양구군 비무장지대에서 채집한 야생 산삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 수세(상수) 및 소독(에탄올, 치아염소산나트륨)한 후 기내도입하였다. 기내도입된 세포조직을 캘러스 또는 체세포배 유도배지에 치상하여 1차 생장유도를 실시하였으며, 캘러스 또는 체세포배가 유도된 세포조직을 부정근 유도배지에 치상하여 2차 생장유도를 실시하였다. 부정근이 유기된 산삼세포 중 우량조직을 선별하고, 분리배양하여 대량배양 seed로 사용하였다. 상기 산삼배양근의 배양 방법은 한국등록특허 제1850421호에 개시된 것과 동일하다.
발효 균주는 김치에서 유래된 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)(기탁번호: KACC81017BP)를 (주)화진바이오코스메틱에서 배양하여 사용하였다.
식물 배양에 사용된 배지 조성물은 하기 표 1과 같으며, 배지 조성물 중 SH(Schenk & Hildebrandt) 배지는 Duchefa Biochemie(네덜란드), 수크로스(sucrose)는 Q1(Samyang Co., 한국), IBA(indole-3-butyric acid)와 MRS(De Man, Rogosa and Sharpe) 배지는 기산바이오텍(한국)에서 구입하여 사용하였다. 또한, 엘리시터(elicitor)인 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 피루브산(pyruvic acid), 스쿠알렌(squalene) 및 β-시토스테롤(sitosterol)과 진세노사이드 표준품은 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하였고, 증류수, 아세토나이트릴(acetonitrile), 메탄올(MeOH)은 Thermo Fisher Scientific(미국)에서 구입하여 사용하였다.
Figure pat00001
2. 엘리시터 물질 선별 및 처리 조건 확인
산삼배양근의 진세노사이드 함량을 효과적으로 증진시킬 수 있는 최적의 엘리시터 물질을 선별하기 위해서, SH 배지 64.5 g, 수크로오스 450 g 및 IBA 30 ㎎를 정제수 15 L에 혼합하고, 메틸 자스모네이트, 피루브산, 스쿠알렌 또는 β-시토스테롤을 62.5, 125 또는 250 μM 농도로 각각 처리한 후 pH 5.75±0.10으로 보정하고 18L 생물반응기(Bio-reactor)에 투입하여 배지를 제조하였다. 상기 제조된 배지를 고온· 고압(127℃, 60분, 0.12 mPa)에서 멸균하여 냉각시킨 후, 냉각된 배지에 계대배양 중인 산삼 모세포를 접종하여 8주간 배양한 다음 생체중 및 진세노사이드 함량을 측정하여 비교하였다.
또한, 최종 선별된 메틸 자스모네이트의 처리 조건을 확인하기 위해 배양 배지에 62.5 μM, 125 μM, 250 μM 또는 500 μM 농도의 메틸 자스모네이트를 처리하였고, 이때 메틸 자스모네이트는 총 8주의 배양기간 중 1~7주 동안 각 주차별로 처리하였다.
3. 생체중 측정
8주간 배양된 산삼배양근을 수확하고, 생체표면에 뭍은 수분을 드라이오븐에서 건조(45℃, 10 min)하여 제거한 후 생체중을 측정하였다.
4. 진세노사이드 분석
산삼배양근 건조물과 70% 에탄올을 20배(v/w) 비율로 혼합하여 추출 및 동결건조하여 수분을 완전히 제거한 후, 100% 메탄올에 용해하고 여과하여 시료를 준비하였다. 진세노사이드 분석은 HPLC-UVD UltiMate 3000 HPLC Systems(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)을 사용하여 수행하였고, HPLC 분석 조건은 표 2와 같다.
Figure pat00002
정량 방법은 측정된 면적 값을 진세노사이드 표준품 검량선 식에 대입하였고, 단위의 환산은 아래와 같은 식에 대입하여 산출하였다.
진세노사이드 함량 (㎎/g) = C × (a × b)/S × 1/1,000
C: 시험용액 중 개별 진세노사이드 농도 (㎍/㎖)
a: 시험용액의 전량 (㎖)
S: 시료 채취량 (g)
b: 희석배수 1/1,000: 단위 환산 계수
5. 저분자 진세노사이드 함량 증진을 위한 최적의 조건 확인
5-1. 스팀 처리 조건 선별
스팀 처리 시험은 산삼배양근 에탄올 추출물에 스팀 처리하는 방법으로 실시하였다. 구체적으로 산삼배양근의 70% 에탄올 추출물을 동결건조한 후 동결건조 분말 50 g을 증류수 10 ℓ에 희석한 산삼배양근 추출물(5,000 ppm)을 시료로 사용하였고, 온도(100~120℃)와 시간(60~240분) 조건별로 스팀 처리하여 고분자 및 저분자 진세노사이드 함량을 확인하였다.
5-2. 발효 조건 선별
발효 시험은 유산균을 농도별로 처리한 후 상기 스팀 처리 시험에서 확인된 최적 조건으로 발효시킴으로써 수행되었다. 구체적으로, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702(기탁번호: KACC81017BP)의 생균 5.55 g, 6.25 g, 7.14 g, 8.33 g, 10 g, 12.5 g, 25 g 또는 50 g을 증류수 2 ℓ에 각각 희석한 후(표 3), 유산균 희석액 20%(v/v)와 산삼배양근 추출물 80%(v/v)를 혼합하고 pH 값을 측정하였다. 이후, 120℃에서 210분 동안 반응시키고 저분자 진세노사이드 함량 변환을 비교하였다. 생균 1 g 당 페디오코커스 펜토사세우스 HLJG0702의 생균수는 대략 2.0×108~11 cfu 정도이다.
Figure pat00003
6. 통계처리
시험 측정 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 시험 결과와 관련된 통계처리는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, Version 24, IBM, 미국)을 이용하여 분산분석(ANOVA)으로 5% 수준에서 Duncan's Multiple Range Test(DMRT)에 의하여 대조군과 실험군 간의 유의차를 검증하였다(p < 0.05).
실시예 1. 엘리시터(elicitor) 처리 조건별 생체중 및 총 진세노사이드 함량 분석
1-1. 엘리시터의 종류 및 농도별 비교
최적의 엘리시터 물질을 선별하기 위해서, 메틸 자스모네이트(MJ), 피루브산(PA), 스쿠알렌(SA) 또는 β-시토스테롤(BS)이 62.5 μM, 125 μM, 250 μM 또는 500 μM 농도로 각각 처리된 산삼배양근 배지에서 산삼배양근을 배양한 후 진세노사이드 함량을 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비해 엘리시터 처리군에서 고분자 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2, Rb3 및 Rd의 총 함량이 증가하였고, 엘리시터 종류 중 MJ 처리군에서 고분자 진세노사이드 함량이 높은 것을 확인하였다. 특히, MJ 실험군은 처리 농도가 증가할수록 고분자 진세노사이드 함량이 증가하였고, MJ 250 μM 실험군에서 고분자 진세노사이드 함량이 64.0±0.8 ㎎/g으로 가장 높은 값을 나타내었다(표 4). 이를 통해, 메틸 자스모네이트가 산삼배양근 내 고분자 진세노사이드 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있는 최적의 엘리시터 물질임을 알 수 있었다.
Figure pat00004
1-2. 메틸 자스모네이트의 처리 농도 및 처리 기간별 비교
총 8주의 산삼배양근 배양 기간 중에서 1~7주 동안 각 주마다 메틸 자스모네이트를 처리하여, 배양 몇 주차에 메틸 자스모네이트를 처리하면 산삼배양근의 생체중 및 총 진세노사이드 함량을 증가시킬 수 있는지를 분석하였다.
생체중을 측정한 결과, MJ 62.5 μM의 1주차 처리군(MJ 62.5-1) 내지 7주차 처리군(MJ 62.5-7)과, MJ 125 μM의 5주차 처리군(MJ 125-5) 내지 7주차 처리군(MJ 125-7)은 대조군과 비교하여 유의적으로 증가되거나 감소되지 않은 반면, MJ 125 μM의 1주차 처리군(MJ 125-1) 내지 4주차 처리군(MJ 125-4), MJ 250 μM의 1주차 처리군(MJ 250-1) 내지 7주차 처리군(MJ 250-7), 및 500 μM의 1주차 처리군(MJ 500-1) 내지 7주차 처리군(MJ 500-7)에서는 대조군에 비해 생체중이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 1).
또한, 총 진세노사이드 함량을 측정한 결과, MJ 500-1 내지 MJ 500-4 실험군을 제외한 나머지 메틸 자스모네이트 처리군은 대조군에 비해 총 진세노사이드 함량이 증가하였고, 특히 MJ 250-5 처리군에서 188.1 ㎎/g으로 가장 높은 값을 나타내어 대조군에 비해 약 4.8배 증가한 것을 확인하였다(표 5). 이를 통해, 250 μM 농도의 메틸 자스모네이트를 산삼배양근 배양 5주차에 처리할 경우 총 진세노사이드 함량 증진 효과가 가장 우수함을 알 수 있었다.
Figure pat00005
실시예 2. 발효 조건별 총 진세노사이드 함량 분석
산삼배양근 내 저분자 진세노사이드를 증가시키기 위한 발효 조건을 확인하기 위해서, 배양 5주차에 250 μM 농도의 메틸 자스모네이트가 처리된 산삼배양근을 70% 에탄올로 추출한 후 상기 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 다양한 농도(표 3)로 처리하고, 스팀을 가하여 발효시킨 다음 고분자 및 저분자 진세노사이드 함량을 측정하였다.
먼저, 유산균 농도 조건을 확인하기 전에 산삼배양근 내 저분자 진세노사이드를 효과적으로 증가시킬 수 있는 스팀 처리 조건을 선별하였다. 구체적으로, 산삼배양근 에탄올 추출물을 다양한 온도(100℃, 110℃, 120℃)와 시간 조건(60분, 150분, 210분, 270분)으로 스팀 처리한 결과, 120℃에서 210분의 스팀 처리 조건에서 저분자 진세노사이드 함량이 가장 높고, 120℃에서 270분 동안 스팀 처리하면 오히려 저분자 진세노사이드 함량이 감소함을 확인하였다(표 6).
Figure pat00006
그 다음, 유산균 농도 조건을 확인한 결과, 3,125 ppm 농도(생균 6.25 g/2 L)의 유산균 처리군이 대조군(산삼배양근 추출물)과 유산균이 처리되지 않은 실험군(스팀만 처리)에 비해 저분자 진세노사이드 함량을 증진시키는 효과가 가장 우수함을 확인하였다(표 7).
Figure pat00007
상기 결과를 종합하면, SH 배지에서 배양한 산삼배양근의 배양 5주차에 250 μM 농도의 메틸 자스모네이트를 처리하여 추가로 3주 동안 배양하고, 70% 에탄올을 가하여 추출 및 농축한 후 페디오코커스 펜토사세우스 HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 3,125 ppm 농도로 접종하고, 120℃에서 210분 동안 스팀을 가하여 발효시키는 것이 산삼배양근 추출물의 발효물 내 저분자 진세노사이드 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있는 최적의 조건임을 알 수 있었다.
농업생명공학연구원 KACC81017BP 20160309

Claims (7)

  1. (a) 산삼배양근 배양 배지에서 기내배양한 산삼배양근에 엘리시터(elicitor)를 처리한 후 산삼배양근을 추가로 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 추출용매를 첨가하여 추출물을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 추출물과 물을 혼합한 후 발효 균주를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 엘리시터 처리는 산삼배양근 배양 배지에서 4~6주 동안 기내배양한 산삼배양근에 150~500 μM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 처리하는 것을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 발효는 115~125℃에서 190~230분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 발효 균주는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)인 것을 특징으로 하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 저분자 진세노사이드는 Rg3, Rg5 및 Rk1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 산삼배양근 배양 배지에서 4~6주 동안 기내배양한 산삼배양근에 150~500 μM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 처리한 후 산삼배양근을 2~4주 동안 추가로 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 추가로 배양한 산삼배양근에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 에탄올 추출물과 물을 혼합한 후 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하고 115~125℃에서 190~230분 동안 발효하는 단계;를 포함하는, Rg3, Rg5 및 Rk1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, Rg3, Rg5 및 Rk1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물.
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