KR20220133871A

KR20220133871A - 재생 의료용 겔 재료

Info

Publication number: KR20220133871A
Application number: KR1020227023708A
Authority: KR
Inventors: 타카마사 사카이; 히로노리 호죠; 쇼이치로 타니; 코스케 마스이; 신이치 나리타
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠; 제리크루 가부시키가이샤
Priority date: 2020-01-28
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2022-10-05
Also published as: CA3168506A1; AU2021212885A1; WO2021153489A1; JPWO2021153489A1; EP4098285A1; US20230293778A1; EP4098285A4; CN115379865A

Abstract

[과제] μm 스케일의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔 재료를 적합하게 적용할 수 있는 신규 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결 수단] 친수성의 폴리머 유니트가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔을 포함하는 재생 의료용 겔 재료에 있어서, 상기 고분자 겔이, 용매로서의 물을 함유하고, 상기 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역을 가지는 3차원 망목 구조를 가지고, 상기 제1 영역에 의해 구성되는 망목 사이즈가, 1 ~ 500μm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료.

Description

재생 의료용 겔 재료

본 발명은, 친수성 폴리머 성분의 농후 상과 희박 상의 2개의 영역으로 이루어지는 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 포함하는 재생 의료용 겔 재료, 및 해당 겔 재료를 제작하기 위한 키트에 관한 것이다.

근년, 망상 구조를 가지는 고분자 겔은, 그 뛰어난 수분 유지 능력 및 생체 적합성 등의 특성을 가지는 것으로부터, 인공 조직이나 재생 의료용 재료, 실링, 유착 방지, 드러그 딜리버리(delivery), 콘택트 렌즈 등의 의료 목적뿐 만이 아니라, 센서나 표면 코팅 등의 다양한 용도에의 응용이 기대되고 있는 재료이다(예를 들면, 비 특허 문헌 1). 특히, 이러한 용도에 있어서는, μm 스케일의 크기의 다공체 구조를 가지는 고분자 재료의 개발이 기대되고 있다.

그렇지만, 종래, μm 스케일의 다공체 구조를 얻기 위해서는, 미리 제작된 겔이나 폴리머 구조체를 석판 인쇄 등에 의해 미세 가공하는 등의 탑 다운 적인 수법을 이용하든가, 혹은, 용매에 불용인 폴리머 원료를 이용해서 고분자 재료를 제작할 필요가 있었다. 한편, 친용매성의 폴리머 원료를 이용하는 경우에는, 원래 재료 자체가 용매에 용해해 버리든지, 혹은 nm 스케일의 작은 다공체 구조의 겔 밖에 제조할 수 없었다. 또, 해당 다공체 구조의 겔 재료를 생체 조직의 재생이나 수복에 적용한 예는, 지금까지 보고되어 있지 않았다.

Sakai 등, Macromolecules, 41, 5379－5384, 2008

이에, 본 발명은, μm 스케일의 다공체 구조를 가지는 친용매성 고분자로부터 구성되는 겔 재료를 제공하는 것, 나아가, 그러한 겔 재료를 적합하게 적용할 수 있는 신규 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 열심히 검토한 결과, 친수성의 폴리머 원료를 특정 조건하에서 가교하는 것에 의해 얻어지는 고분자 겔이, 마치 빈 용매성의 고분자에 있어서의 상 분리와 같이 거동하여, 폴리머 성분이 조밀하게 존재하는 농후 영역과 드문드문하게 존재하는 희박 영역으로 이루어지는 스펀지 상의 3차원 망목 구조(μm 스케일의 다공체 구조)를 형성한다고 하는, 종래의 고분자 겔에서는 볼 수 없는 특이한 구조를 가지는 것, 나아가, 뼈 등의 생체 조직의 재생이나 수복에 있어서, 해당 고분자 겔을 포함하는 겔 재료를 환부에 적용하는 것에 의해, 생체 조직의 재생이나 수복을 촉진할 수 있는 것을 발견했다. 이러한 지견에 기초해, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

즉, 본 발명은, 한 태양에 있어서,

＜1＞ 친수성의 폴리머 유니트가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔을 포함하는 재생 의료용 겔 재료로서, 상기 고분자 겔이, 용매로서의 물을 함유하고, 상기 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역을 가지는 3차원 망목 구조를 가지고, 상기 제1 영역에 의해 구성되는 망목 사이즈가, 1 ~ 500μm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료

를 제공하는 것이다.

또, 본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 관한 바람직한 태양으로서,

＜2＞ 겔화 전의 폴리머 유니트의 투과율보다 낮은 투과율을 가지는 상기 ＜1＞에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜3＞ 겔화 전의 폴리머 유니트의 침투압에 대해서 1/5 ~ 1/2의 범위의 침투압을 가지는, 상기 ＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜4＞ 겔화로부터 일정시간 경과 후에 있어서의 침투압(Π_os)과 탄성압(Π_el)이, Π_el＞Π_os의 관계성을 가지는, 상기 ＜1＞ ~ ＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜5＞ 상기 제1 영역의 고분자 농도가 10 ~ 99중량%이며, 상기 제2 영역의 고분자 농도가 0 ~ 1중량%인, 상기 ＜1＞ ~ ＜4＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜6＞ 5중량% 이하의 고분자 함유량인, 상기 ＜1＞ ~ ＜5＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜7＞ 상기 폴리머 유니트가, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머인, 상기 ＜1＞ ~ ＜6＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜8＞ 상기 폴리머 유니트가, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머 유니트와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머 유니트로 이루어지는, 상기 ＜1＞ ~ ＜7＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜9＞ 상기 구핵성 관능기가, 티올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 구전자성 관능기가, 말레이미딜기, N－하이드록시숙신이미딜(NHS)기, 설포숙신이미딜기, 프탈이미딜기, 이미다조일기, 아크릴로일기, 니트로페닐기, 및 -CO₂PhNO₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 ＜8＞에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜10＞ 조직의 재생을 위해서 이용되는, 상기 ＜1＞ ~ ＜9＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료;

＜11＞ 상기 조직이 뼈, 연골, 피부, 또는 신경인, 상기 ＜10＞에 기재된 재생 의료용 겔 재료; 및

＜12＞ 상기 ＜1＞ ~ ＜11＞ 중 어느 하나에 기재된 재생 의료용 겔 재료를 이용하는, 치료 방법

을 제공하는 것이다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은, 상기 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트에 관련되며,

＜13＞ 이하의 (A)와 (B)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트로서, (A) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제1의 원료 폴리머를 포함하는 수용액; (B) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제2의 원료 폴리머를 포함하는 수용액; 상기 (A) 및/또는 (B)의 용액 중에, 상기 원료 폴리머와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 비 반응성 폴리머를 더 포함하고, 상기 (A) 및 (B)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔로서, 상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역으로 구성되는 구조를 가지는, 키트; 및

＜14＞ 이하의 (A＇)와 (B＇)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트로서, (A＇) 제1의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제1의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어진 것으로서, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 용액; (B＇) 제2의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제2의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어진 것으로서, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 용액; 상기 (A＇) 및/또는 (B＇)의 용액 중에 가교제를 더 포함하고, 상기 (A＇) 및 (B＇)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔로서, 상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역에 의해 구성되는 구조를 가지는, 키트

를 제공하는 것이다.

본 발명의 키트에 관한 바람직한 태양으로서,

＜15＞ 상기 원료 폴리머가, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머인, 상기 ＜13＞ 또는 ＜14＞에 기재된 키트;

＜16＞ 상기 원료 폴리머가, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머로 이루어지는, 상기 ＜13＞ ~ ＜15＞ 중 어느 하나에 기재된 키트;

＜17＞ 상기 구핵성 관능기가, 티올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 구전자성 관능기가, 말레이미딜기, N－하이드록시숙신이미딜(NHS)기, 설포숙신이미딜기, 프탈이미딜기, 이미다조일기, 아크릴로일기, 니트로페닐기, 및 -CO₂PhNO₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 ＜16＞에 기재된 키트;

＜18＞ 상기 비 반응성 폴리머가, 가교 반응기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 또는 셀룰로오스인, 상기 ＜13＞에 기재된 키트;

＜19＞ 상기 제1의 겔 전구체와 상기 제2의 겔 전구체는, 모두 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머로부터 이루어지고, 상기 제1의 겔 전구체는, 제1의 폴리머의 함유량이 제2의 폴리머의 함유량보다 많고, 상기 제2의 겔 전구체는, 제2의 폴리머의 함유량이 제1의 폴리머의 함유량보다 많은, 상기 ＜14＞에 기재된 키트;

＜20＞ 상기 겔 전구체가, 10 ~ 1000nm의 범위의 직경을 가지는, 상기 ＜14＞에 기재된 키트;

＜21＞ 상기 ＜13＞ ~ ＜20＞ 중 어느 하나에 기재된 키트를 이용해서, 생체 내에 있어서 재생 의료용 겔 재료를 제작하는 방법； 및

＜22＞ 조직 재생의 치료에 있어서의, 상기 ＜13＞ ~ ＜20＞ 중 어느 하나에 기재된 키트의 사용

을 제공하는 것이다.

본 발명의 재생 의료용 겔 재료는, 뼈 등의 생체 조직의 재생이나 수복에 있어서, 해당 겔 재료를 환부에 적용하는 것에 의해, 생체 조직의 재생이나 수복을 촉진할 수 있다. 구체적으로는, 실시예에 나타내듯이, 뼈 결손부에 본 발명의 재생의료용 겔 재료를 충전하는 것에 의해, 해당 뼈 결손부에 있어서의 뼈 유합 및 신생 뼈의 성장이 양호해진다고 하는 효과를 얻을 수 있다.

또, 본 발명의 키트를 이용하는 것으로, 생체 내에 있어서 in situ로 재생 의료용 겔 재료를 형성시키는 것이 가능하기 때문에, 생체내의 폐쇄 강이나 반 폐쇄 강에 주입가능한 겔 재료로서 이용할 수 있다.

도 1은 실시예 2로 제작한 본 발명의 고분자 겔에 있어서의 겔화 반응의 타임스케일을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 겔화 공정에 있어서의 투과율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 겔 전구체를 거치지 않는 비교예 겔의 투과율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 고분자 겔의 팽윤도의 시간 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 고분자 겔의 침투압(Π_os)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 고분자 겔(오른쪽) 및 비교예 겔(왼쪽)의 형광 현미경 이미지이다.
도 7의 A는, 뼈 결손 제작 2, 3, 4주일 후에 있어서의, 고분자 겔 비 충전(a ~ c)과 고분자 겔 충전(d ~ f)의 래트 경골 부위에 있어서의 마이크로 CT화상이다. 도 7의 B는, 뼈 결손 제작 4주일 후에 있어서의, 고분자 겔 비 충전(g 및 h)과 고분자 겔 충전(i 및 j)의 래트 경골 부위의 H. E. 염색 화상이다 (흑색 바：5mm；g 및 h의 화상 중의 파선 사각 부위의 확대 도화 각각 i 및 j이다).
도 8은 뼈 결손 제작 2, 4, 8주 후의, sham(NTC; negatiｖe control), 비교예 겔 충전(‘Tetra－PEG gel’), 및 본 발명의 고분자 겔 충전(‘Tetra－PEG sponge’)의 마이크로 CT화상이다.
도 9는 본 발명의 고분자 겔(‘Oligo－Tetra PEG 겔’및 비교예 겔(Tetra－PEG 겔)을, 래트 피하에 매식 했을 경우의 화상이다.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 설명한다. 본 발명의 범위는 이러한 설명에 구속될 것은 없고, 이하의 예시 이외에, 본 발명의 취지를 해치지 않는 범위에서 적당히 변경해 실시할 수 있다.

1. 본 발명의 재생 의료용 겔 재료: 본 발명의 재생 의료용 겔 재료는, μm 스케일의 스펀지 상의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 명세서에 있어서, ‘재생 의료’란, 넓게, 선천적으로, 혹은 병이나 상처, 사고, 가령 등의 요인에 의해, 결손, 손상, 기능 저하한 생체 조직을 재생 혹은 수복하고, 그 기능을 회복시키는 치료를 의미한다. 따라서, 자기 혹은 타인으로부터 채취한 체질간 세포 혹은 iPS 세포 등의 다능성간세포, 또는 그것들 세포로부터 얻어진 조직 등을 이식하는 치료(‘협의의 재생 의료’)에 한정되는 것은 아니다.

또, 본 명세서에 있어서, 재생 의료의 대상이 되는 ‘조직’은, 그 재생이나 수복이 필요하게 되는 생체 조직이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 뼈, 연골, 피부, 신경, 장기 등을 들 수 있다.

이하, 재생 의료용 겔 재료의 주성분인 고분자 겔 및 그 제조 방법의 상세한 것에 대하여 설명한다.

(1) 고분자 겔

본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 포함되는 고분자 겔은, 친수성의 폴리머 유니트가 서로 가교해 형성되어 겔화하고 있어 용매로서 물을 함유하는, 이른바 하이드로 겔이며,

i) 상기 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과 상기 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역을 가지는 3차원 망목 구조를 가지고,

ii) 상기 제1 영역에 의해 구성되는 망목 사이즈가, 1 ~ 500μm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 것이다.

즉, 본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 친용매성의 폴리머 유니트로부터 형성되어 있는 것에도 불구하고, 마치 빈 용매성의 고분자가 용매 중에서 상 분리한 상태와 같이 거동하여, 겔 중에 폴리머 성분이 조밀하게 존재하는 농후 상(제1 영역)과 드문드문하게 존재하는 희박 상(제2 영역)이라고 하는 폴리머 농도가 다른 2개의 영역을 형성한 구조를 가진다. 그리고, 해당 고분자 겔은, 이 상 분리에 의해 스펀지와 같은 3차원 망목 구조·다공체 구조를 형성하고 있어(이하, 이 구조를 ‘스펀지 상의 다공체 구조’라고 부르는 경우가 있다.), 그 망목 사이즈는, 종래의 겔로 얻을 수 있는 nm 오더보다 훨씬 더 큰μm 오더인 것도 특징이다. 여기서, 제1 영역은, 그 영역에 존재하는 폴리머 유니트의 농도(밀도)가, 제2 영역에 있어서의 밀도와 비교해 크다고 하는 상대적인 의미에 있어서 ‘농후 상’이라고 부르는 것이다. 바람직하게는, 제1 영역은, 제2 영역의 약 100배 정도의 농도(밀도)를 가진다.

본 명세서 중에 있어서, ‘겔’이란, 일반적으로, 고 점도로 유동성을 잃은 고분자의 분산 계이며, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇≥G"의 관계성을 가지는 상태를 말한다.

본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 위에서 설명한 바와 같이, μm 오더의 다공체 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 제1 영역에 의해 구성되는 망목 사이즈가, 1 ~ 500μm의 크기일 수 있고, 바람직하게는, 10 ~ 100μm이다. 해당 망목 사이즈는, 농후 상인 제1 영역에 의해 외주가 형성되는 망목 단위(즉, 구멍)에 있어서의 장변의 길이를 의미한다. 혹은, 해당 망목 단위가 약 원형의 경우에는, 그 직경의 길이로 할 수도 있다. 이 망목 단위의 내부에는, 희박 상인 제2 영역 및/또는 용매가 존재한다.

전형적으로는, 농후 상인 제1 영역은, 용매를 포함하는 겔 전체에 기초해, 10 ~ 99중량%의 고분자 농도를 가지고, 희박 상인 제2 영역은, 0 ~ 1중량%의 고분자 농도를 가진다. 바람직하게는, 제1 영역은 40 ~ 80중량%, 제2 영역은 0.01 ~ 0.1중량%의 고분자 농도를 가진다.

또, 본 발명에 있어서의 고분자 겔 전체에 있어서의 고분자 함유량은, 5중량% 이하, 바람직하게는 4중량% 이하, 보다 바람직하게는, 1.5 ~ 3.0중량%이다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 있어서의 고분자 겔 중에 포함되는 용매로서는, 물이 이용된다. 이 경우, 이 물을 함유하는 고분자 겔은 하이드로 겔이 된다.

다만, 경우에 따라서는, 에탄올 등의 알코올 류, DMSO등의 유기용매를 더 포함하는 것일 수도 있다.

이하에서는, 본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 이용되는 고분자 겔을 구성하는 폴리머 유니트, 및 해당 고분자 겔이 가리키는 특징적인 물성에 대해 설명한다.

1－a. 폴리머 유니트

본 발명에 있어서의 고분자 겔을 형성하기 위해서 이용되는 폴리머 유니트는, 친용매성, 즉, 겔에 포함되는 용매에 대해서 가용성의 폴리머이다. 즉, 겔이 용매로서 물을 함유하는 하이드로 겔에 있어서는, 해당 폴리머 유니트는 친수성 폴리머이다. 해당 폴리머 유니트는, 용액중에서의 겔화 반응(가교 반응 등)에 의해 겔을 형성할 수 있는 것이면, 해당 기술 분야에 있어서 공지의 것을 최종적인 겔의 용도나 형상 등에 따라서 이용할 수 있다. 보다 상세하게는, 최종적인 겔에 있어서, 폴리머 유니트가 서로 가교로 하는 것에 의해 망목 구조, 특히, 3차원 망목 구조를 형성할 수 있는 폴리머 유니트가 바람직하다.

해당 폴리머 유니트로서 이용되는 친수성 폴리머로서는, 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머일 수 있다. 폴리에틸렌글리콜 골격을 가지는 폴리머로서는, 대표적으로는, 복수의 폴리에틸렌글리콜 골격의 분지를 가지는 폴리머 종을 들 수 있고, 특히, 4개의 폴리에틸렌글리콜 골격의 분지를 가지는 폴리머 종이 바람직하다. 이러한 4 분지 형의 폴리에틸렌글리콜 골격으로 이루어지는 겔은, 일반적으로, Tetra－PEG 겔로서 알려져 있어 각각 말단에 활성 에스테르 구조 등의 구전자성의 관능기와 아미노기등의 구핵성의 관능기를 가지는 2종의 4 분지 고분자 간의 AB형 크로스 엔드 커플링 반응에 의해 망목 구조 네트워크가 구축된다(Matsunaga등, Macromolecules, Vol. 42, No. 4, pp. 1344－1351, 2009). 또, Tetra－PEG 겔은 각 고분자 용액의 단순한 2액 혼합으로 간편하게 그 자리에서 제작 가능하고, 겔 조제 시의 pH나 이온 농도를 조절하는 것으로 겔화 시간을 제어하는 것도 가능하다. 그리고, 이 겔은 PEG를 주성분으로 하고 있기 때문에, 생체 적합성에도 우수하다.

덧붙여 서로 가교해 겔화할 수 있는 것이면 폴리에틸렌글리콜 골격 이외의 폴리머도 이용할 수 있고, 예를 들면, 메틸 메타크릴레이트 등의 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머도 이용할 수 있다.

반드시 이것들로 한정되는 것은 아니지만, 최종적인 겔에 있어서, 스펀지 상의 다공체 구조를 형성하기 위해서는, 상기 폴리머 유니트가, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머 유니트와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성 관능기를 가지는 제2의 폴리머 유니트의 2종류의 폴리머 종을 반응시켜 가교시키는 수단이 적합하다. 여기서, 구핵성 관능기와 구전자성 관능기의 합계는, 5 이상인 것이 바람직하다. 이러한 관능기는, 말단에 존재하는 것이 더욱 바람직하다. 또, 제1의 폴리머 유니트의 함유량이 제2의 폴리머 유니트의 함유량보다 많은 조성일 수도 있고, 또는 제2의 폴리머 유니트의 함유량이 제1의 폴리머 유니트의 함유량보다 많은 조성일 수도 있다. 후술과 같이, 바람직한 태양에 있어서, 이러한 조성이 다른 2종류 이상의 겔 전구체를 일단 형성시킨 뒤, 이 겔 전구체를 한층 더 가교시켜 고분자 겔을 얻을 수 있다.

폴리머 유니트에 존재하는 구핵성 관능기로서는, 티올기(－SH), 아미노기 등을 들 수 있고, 당업자이면 공지의 구핵성 관능기를 적당히 이용할 수 있다. 바람직하게는, 구핵성 관능기는 -SH기이다. 구핵성 관능기는, 각각 동일해도, 달라도 무방하지만, 동일한 편이 바람직하다. 관능기가 동일하다는 것에 의해, 가교 결합을 형성하게 되는 구전자성 관능기와의 반응성이 균일하게 되어, 균일한 입체 구조를 가지는 겔을 쉽게 얻게 된다.

폴리머 유니트에 존재하는 구전자성 관능기로서는, 활성 에스테르기를 이용할 수 있다. 이러한 활성 에스테르기로서는, 말레이미딜기, N－하이드록시숙신이미딜(NHS)기, 설포숙신이미딜기, 프탈이미딜기, 이미다조일기, 아크릴로일기, 니트로페닐기, －CO₂PhNO₂(Ph는, o－, m－, 또는 p－페닐렌기를 나타낸다)등을 들 수 있고, 당업자이면 그 외의 공지의 활성 에스테르기를 적당히 이용할 수 있다. 바람직하게는, 구전자성 관능기는 말레이미딜기이다. 구전자성 관능기는, 각각 동일해도, 달라도 무방하지만, 동일한 편이 바람직하다. 관능기가 동일하다는 것에 의해, 가교 결합을 형성하게 되는 구핵성 관능기와의 반응성이 균일하게 되어, 균일한 입체 구조를 가지는 겔을 쉽게 얻게 된다.

말단에 구핵성 관능기를 가지는 폴리머 유니트로서 바람직하고 비한정적인 구체적인 예에는, 예를 들면, 4개의 폴리에틸렌글리콜 골격의 분지를 가지고, 말단에 티올기를 가지는 하기 식(I)으로 나타내는 화합물을 들 수 있다.

n₁₁ ~ n₁₄는, 각각 동일해도 또는 달라도 무방하다. n₁₁ ~ n₁₄의 값이 가까울수록, 균일한 입체 구조를 취할 수 있고, 고강도가 된다. 이 때문에, 고강도의 겔을 얻기 위해서는, 동일한 것이 바람직하다. n₁₁ ~ n₁₄의 값이 너무 높으면 겔의 강도가 약해지고, n₁₁ ~ n₁₄의 값이 너무 낮으면 화합물의 입체 장해에 의해 겔이 형성되기 어렵다. 그 때문에, n₁₁ ~ n₁₄는, 25 ~ 250의 정수치를 들 수 있고, 35 ~ 180이 바람직하고, 50 ~ 115가 더욱 바람직하고, 50 ~ 60이 특히 바람직하다. 그리고, 그 분자량으로서는, 5×10³ ~ 5×10⁴ Da를 들 수 있고, 7.5×10³ ~ 3×10⁴ Da가 바람직하고, 1×10⁴ ~ 2×10⁴ Da가 보다 바람직하다.

상기 식(I) 중, R¹¹ ~ R¹⁴는, 관능기와 코어 부분을 잇는 링커 부위이다. R¹¹ ~ R¹⁴는, 각각 동일해도 달라도 무방하지만, 균일한 입체 구조를 가지는 고강도인 겔을 제조하기 위해서는 동일한 것이 바람직하다. R¹¹ ~ R¹⁴는, C₁－C₇ 알킬렌기, C₂－C₇ 알케닐렌기, －NH－R¹⁵－, －CO－R¹⁵－, －R¹⁶－O－R¹⁷－, －R¹⁶－NH－R¹⁷－, －R¹⁶－CO₂－R¹⁷－, －R¹⁶－CO₂－NH－R¹⁷－, －R¹⁶－CO－R¹⁷－, R¹⁶－NH－CO－R¹⁷－또는 -R¹⁶－CO－NH－R¹⁷－을 나타낸다. 여기서, R¹⁵는 C₁－C₇ 알킬렌기를 나타낸다. R¹⁶은 C₁－C₃ 알킬렌기를 나타낸다. R¹⁷은 C₁－C₅ 알킬렌기를 나타낸다.

여기서, ‘C₁－C₇ 알킬렌기’란, 분지를 가져도 무방한 탄소수가 1 이상 7 이하의 알킬렌기를 의미하고, 직쇄 C₁－C₇ 알킬렌기 또는 1개 또는 2개 이상의 분지를 가지는 C₂－C₇ 알킬렌기(분지를 포함한 탄소수가 2 이상 7 이하)를 의미한다. C₁－C₇ 알킬렌기의 예는, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기이다. C₁－C₇ 알킬렌기의 예는,－CH₂－,－(CH₂)₂－,－(CH₂)₃－,－CH(CH₃)－,－(CH₂)₃－,－(CH(CH₃))₂－,－(CH₂)₂－CH(CH₃)－,－(CH₂)₃－CH(CH₃)－,－(CH₂)₂－CH(C₂H₅)－,－(CH₂)₆－,－(CH₂)₂－C(C₂H₅)₂－, 및 -(CH₂)₃C(CH₃)₂CH₂－등을 들 수 있다.

‘C₂－C₇알케닐렌기’란, 쇄 중에 1개 혹은 2개 이상의 이중 결합을 가지는 상태 또는 분지 쇄상의 탄소 원자수 2 ~ 7개의 알케닐렌기이며, 예를 들면, 상기 알킬렌기로부터 서로 이웃하는 탄소 원자의 수소 원자의 2 ~ 5개를 제외해 얻어지는 이중 결합을 가지는 2가기를 들 수 있다.

한편, 말단에 구전자성 관능기를 가지는 폴리머 유니트로서 바람직한 비한정적인 구체적인 예에는, 예를 들면, 4개의 폴리에틸렌글리콜 골격의 분지를 가지고, 말단에 말레이미딜기를 가지는 하기 식(II)로 나타내는 화합물을 들 수 있다.

상기 식(II) 중, n₂₁ ~ n₂₄는, 각각 동일해도 또는 달라도 무방하다. n₂₁ ~ n₂₄의 값은 가까울수록, 겔은 균일한 입체 구조를 취할 수 있고, 고강도가 되므로 바람직하고, 동일한 편이 바람직하다. n₂₁ ~ n₂₄의 값이 너무 커지면 겔의 강도가 약해지고, n₂₁ ~ n₂₄의 값이 너무 낮으면 화합물의 입체 장해에 의해 겔이 형성되기 어렵다. 그 때문에, n₂₁ ~ n₂₄는, 5 ~ 300의 정수치를 들 수 있고, 20 ~ 250이 바람직하고, 30 ~ 180이 보다 바람직하고, 45 ~ 115가 더욱 바람직하고, 45 ~ 55이면 더욱 바람직하다. 본 발명의 제2의 4 분지 화합물의 분자량으로서는, 5×10³ ~ 5×10⁴ Da를 들 수 있고, 7.5×10³ ~ 3×10⁴ Da가 바람직하고, 1×10⁴ ~ 2×10⁴ Da가 보다 바람직하다.

상기 식(II) 중, R²¹ ~ R²⁴는, 관능기와 코어 부분을 잇는 링커 부위이다. R²¹ ~ R²⁴는, 각각 동일해도 달라도 무방하지만, 균일한 입체 구조를 가지는 고강도인 겔을 제조하기 위해서는 동일한 것이 바람직하다. 식(II) 중, R²¹ ~ R²⁴는, 각각 동일 또는 다르고, C₁－C₇ 알킬렌기, C₂－C₇ 알케닐렌기, －NH－R²⁵－, －CO－R²⁵－, －R²⁶－O－R²⁷－, －R²⁶－NH－R²⁷－, －R²⁶－CO₂－R²⁷－, －R²⁶－CO₂－NH－R²⁷－, －R²⁶－CO－R²⁷－, －R²⁶－NH－CO－R²⁷－, 또는 R²⁶－CO－NH－R²⁷－을 나타낸다. 여기서, R²⁵는 C₁－C₇ 알킬렌기를 나타낸다. R²⁶은 C₁－C₃ 알킬렌기를 나타낸다. R²⁷은 C₁－C₅ 알킬렌기를 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 알킬렌기 및 알케닐렌기는 임의의 치환기를 1개 이상 가지고 있어도 무방하다. 해당 치환기로서는, 예를 들면, 알콕시기, 할로겐 원자(불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 또는 요오드 원자의 어느 것이라도 무방하다), 아미노기, 모노 또는 디 치환 아미노기, 치환 실릴기, 아실기, 또는 아릴기 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 알킬기가 2개 이상의 치환기를 가지는 경우에는, 그것들은 동일해도 달라도 무방하다. 알킬 부분을 포함하는 다른 치환기(예를 들면 알킬옥시기나 아랄킬기 등)의 알킬 부분에 대해서도 동일하다.

또, 본 명세서에 있어서, 어느 관능기에 대해 ‘치환기를 가지고 있어도 무방하다’라고 정의되어 있는 경우에는, 치환기의 종류, 치환 위치, 및 치환기의 개수는 특히 한정되지 않고, 2개 이상의 치환기를 가지는 경우에는, 그것들은 동일해도 달라도 무방하다. 치환기로서는, 예를 들면, 알킬기, 알콕시기, 수산기, 카복실기, 할로겐 원자, 설포기, 아미노기, 알콕시카보닐기, 옥소기 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 치환기에는 치환기가 추가로 존재하고 있더라도 무방하다.

1－b. 고분자 겔의 물성

본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 이용되는 고분자 겔은, 위에서 설명한 바와 같이, 겔 중에 농후 상(제1 영역)과 희박 상(제2 영역)에 의해 형성되는μm 오더의 스펀지 상의 다공체 구조를 가지고, 이 구조에 의해 여러 가지의 물성의 면에서 특징적인 성질을 가진다.

본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 겔화 전의 폴리머 유니트의 투과율보다 낮은 투과율을 가진다. 이것은, 해당 고분자 겔에서는, 겔 중에 농후 상(제1 영역)과 희박 상(제2 영역)이라고 하는 폴리머 농도가 다른 2개의 영역을 가지고, 마치 빈 용매성의 고분자가 용매 중에서 상 분리한 상태와 같이 거동하기 때문에, 완전히 투명하지 않고 뽀얗게 흐린 상태(백탁)를 나타내는 것에 의한다. 바람직하게는, 해당 고분자 겔은, 90 ~ 96%의 범위의 투과율을 가진다. 이 투과율의 점에 있어서, 거의 투명한 통상의 고분자 겔과는 완전히 다른 특성을 나타낸다.

본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 겔화 전의 폴리머 유니트의 침투압에 있어서는 1/5 ~ 1/2의 범위의 침투압을 가진다. 또, 같은 폴리머 유니트로부터 형성되는 단일 상의 고분자 겔과 비교해도 낮은 침투압을 가진다.

또, 본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 겔화로부터 일정시간 경과 후에 있어서의 침투압(Π_os)과 탄성압(Π_el)이, Π_el＞Π_os의 관계성을 가진다. 이 Π_el 쪽이 Π_os보다 크다고 하는 관계는, 겔이 수축하는 상태인 것을 나타낸다. 통상의 고분자 겔은, 일반적으로 Π_el＜Π_os의 관계를 가지고, 팽윤하는 경향이 있는 것과는 대조적이다.

반드시 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 이용되는 고분자 겔은, 농후 상과 희박 상이라고 하는 2상 분리와 같은 구조를 가지고 있기 때문에, 희박 상의 침투압(Π_os)이, 통상의 단일 상의 고분자 겔에 비해 저하하는 한편, 탄성압의 증가에 의해 겔이 수축하는 경향이 생기는 것이라고 이해된다. 이러한 점에서, 본 발명에 있어서의 고분자 겔이, 종래의 고분자 겔과는 크게 다른 특징적인 성질을 가지는 것이라고 할 수 있다.

나아가, 위에서 설명한 바와 같이, 농후 상과 희박 상에 있어서 폴리머 유니트의 고분자 밀도가 다르기 때문에, 본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 이들 2개의 영역에 있어서 다른 함수율을 가질 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 상기 제1 영역(농후 상)의 함수율이 10 ~ 99%의 범위이며, 상기 제2 영역(희박 상)의 함수율이 99 ~ 100%의 범위이다.

본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 그 용도에 따라서, 박막 상태 등의 여러 가지의 형상으로 가공할 수 있다. 그러한 가공은, 해당 기술 분야에 있어서 알려져 있는 임의의 수법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 박막의 경우에는, 예를 들면, 겔이 완전히 고체화하기 전의 유동성을 가지는 상태로, 유리 등의 평면 기판상에 도포하는 등의 수법에 의해 박막을 얻을 수 있다.

(2) 고분자 겔의 제조 방법

다음으로, 본 발명의 재생 의료용 겔 재료에 이용되는 고분자 겔의 제조 방법(겔화 공정)에 대해 설명한다. 본 발명에 있어서의 고분자 겔은, 예를 들면, 이하의 제1 태양 및 제2 태양에 나타내는 공정에 의해 제조할 수 있지만, 어느 태양에 있어서도, 친용매성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만의 조건으로 가교시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 이 조건으로 겔화 공정을 실시하는 것에 의해, 종래는 곤란했던 μm 오더의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 친용매성의 폴리머로부터 제조할 수 있다.

2－a. 고분자 겔의 제조 방법의 제1 태양

본 발명에 있어서의 고분자 겔의 제조 방법은, 제1 태양에 있어서, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:

a) 친용매성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시켜 겔 전구체를 형성하는 공정;

b) 상기 겔 전구체를 가교제에 의해 서로 가교시키는 것에 의해 최종 목적물인 고분자 겔을 얻는 공정.

공정 a)는, 최종적으로 고분자 겔을 구성하게 되는 원료 폴리머(폴리머 유니트)를, 일단 겔화의 직전 상태에서 반응시켜, 아직 겔 형성에 이르지 않는 구조를 가지는, 즉 졸 상태의 겔 전구체(폴리머 클러스터)를 형성시키는 공정이다. 게다가, 공정 b)에 있어서, 소망에 의해 적절한 가교제를 첨가하고, 이들 겔 전구체끼리를 한층 더 반응시켜, 서로 3차원적으로 가교시키는 것으로 최종 생성물인 고분자 겔을 얻는다. 여기서, 겔 전구체는, 후술과 같이 반드시 동일 조성의 단일 종인 경우에 한정하지 않고, 다른 조성을 가지는 복수의 겔 전구체를 이용할 수도 있다. 이와 같이, 제1 태양의 제조 방법은, 겔 전구체를, 말하자면 최종적인 겔의 중간체로서 이용한다고 하는 컨셉에 근거하는 것이다.

공정 a)에서는, 원료 폴리머의 초기 농도는, 중첩 농도 미만이며, 한편 임계 겔화 농도 미만의 조건이 이용된다. 해당 원료 폴리머의 초기 농도를 이용하는 것에 의해, 겔화에 이르지 않는 졸 상태, 바람직하게는, 겔화 직전의 구조를 가지는 겔 전구체를 형성시킬 수 있다.

공정 a)에 있어서 원료 폴리머의 초기 농도는, 중첩 농도 C* 미만이며, 바람직하게는 1/3C* 미만이다. 여기서, ‘중첩 농도’(‘상호 중첩 농도’라고도 불린다.)란, 용매 중의 고분자가 공간적으로 서로 접촉하기 시작하는 농도이고, 일반적으로, 중첩 농도 C*는, 이하의 식으로 나타내진다.

(식 중, M_w는, 고분자의 중량 평균 분자량이며；α는, 용매의 비중；N_A는, 아보가드로 정수；R_g는, 고분자의 관성 반경이다.).

중첩 농도 C*의 산출 방법은, 예를 들면, Polymer Physics(M. Rubinstein, R. Colby저)를 참조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 희박 용액의 점도 측정보다, 플로리-폭스의 식을 이용해서 구할 수 있다.

또, 공정 a)에 있어서 원료 폴리머의 초기 농도는, 임계 겔화 농도 미만으로 설정된다. 여기서, ‘임계 겔화 농도’란, 원료 폴리머의 가교에 의해 3차원 구조의 겔을 구축하는 계에 있어서, 해당 겔화를 달성하기 위해서 필요한 원료 폴리머의 최저 농도를 의미하고, 최저 겔화 농도라고도 불린다. 본 발명에 있어서, 임계 겔화 농도라고 하는 용어에는, 예를 들면, 2종 이상의 원료 폴리머가 이용되는 계에서는, 이들 전체의 농도가 겔화에 이르는 농도에 이르지 않는 경우에 더하여, 1종의 원료 폴리머의 농도만이 낮은 경우, 즉 각 원료 폴리머의 비율이 비(非) 당량인 것에 의해 겔화를 일으키지 않는 경우도 포함된다.

일반적으로, 임계 겔화 농도(최저 겔화 농도)는, 이용하는 원료 폴리머의 종류에 의존하지만, 이 농도는 해당 기술 분야에 있어서 공지이거나, 혹은 당업자라면 실험적으로 용이하게 파악할 수 있다. 전형적으로는, 0.5 ~ 5중량%이며, 하한은 중첩 농도의 1/5 정도의 농도이다.

원료 폴리머의 초기 농도를 임계 겔화 농도 미만의 조건에 조절하는 수법으로서 예를 들면, 상기와 같이 구핵성 관능기 또는 구전자성 관능기를 가지는 2종류의 폴리머 유니트를 이용하는 경우에는, 그것들을 당량 포함하지만 전체적으로 겔화에 이르기에는 충분하지 않는 저 농도의 조건을 이용하는 것, 혹은, 1종의 폴리머 유니트의 농도를 저농도로서, 즉 비 당량으로 하는 것에 의해 겔화를 일으키지 않게 하는 조건을 이용할 수 있다.

공정 a)는, 전형적으로는, 2종류의 원료 폴리머를 포함하는 용액을 혼합하는 것 또는 자극을 주는 것에 의해 실시할 수 있다. 또, 래디칼 개시제를 이용한 모노머의 래디칼 중합에 의해도 실시할 수 있다. 각 용액의 농도, 첨가 속도, 혼합 속도, 혼합 비율은 특히 한정되지 않고, 당업자라면 적당히 조정할 수 있다. 또, 3종 이상의 원료 폴리머를 이용하는 경우에서도, 마찬가지로 해서, 대응하는 원료 폴리머를 포함하는 용액을 조제하고, 그것들을 적당히 혼합할 수 있음은 분명할 것이다. 원료 폴리머를 포함하는 용액의 용매로서는, 물, 에탄올 등의 알코올 류, DMSO등을 이용할 수 있다. 해당 용액이 수용액인 경우에는, 인산 완충액 등이 적절한 pH완충액을 이용할 수 있다.

혼합하는 수단으로서는, 예를 들면, 국제 공개 WO2007/083522호 공보에 개시된 것 같은 2액 혼합 시린지를 이용해서 실시할 수 있다. 혼합 시의 2액의 온도는, 특히 한정되지 않고, 전구체 유니트가 각각 용해되어 각각의 액이 유동성을 가지는 상태의 온도이면 좋다. 예를 들면, 혼합할 때의 용액의 온도로서는, 1℃ ~ 100℃의 범위를 들 수 있다. 2액의 온도는 달라도 무방하지만, 온도가 같은 편이, 2액이 혼합되기 쉽기 때문에 바람직하다.

공정 a)에서 얻어진 해당 겔 전구체는, 전구체 유니트가 서로 결합 내지 가교한 구조를 가지지만, 아직 겔화에 이르지 않는 조건으로 형성된 것이다. 그 때문에, 해당 겔 전구체는, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가진다. 일반적으로, 겔화하기 이전의 폴리머에서는 손실 탄성률 G"의 값이 저장 탄성률 G＇보다 크고, 그 후, 겔화와 함께, 이러한 물성치의 대소가 역전해 G＇쪽이 커지는 것이 알려져 있다. 그리고, G＇=G"가 되는 점이, 이른바 겔화점이다. 따라서, 겔 전구체 클러스터가 G＇＜G"인 것은, 그것이 졸 상태이며, 아직 겔화에 이르지 않은 상태인 것을 의미한다. 바람직하게는, 1Hz의 주파수에 있어서 G＇＜G"＜100G＇이다.

바람직하게는, 해당 겔 전구체의 G"는, 1Hz의 주파수에 있어서 0.005 ~ 5Pa의 범위이며, 보다 바람직하게는, 0.01 ~ 1Pa, 더욱 바람직하게는, 0.01 ~ 0.5Pa의 범위이다. 이러한 탄성률은, 레오미터 등의 공지의 측정 기기를 이용해서, 동적 점탄 성 측정 등의 공지의 방법으로 산출할 수 있다.

본 발명에 있어서의 겔 전구체는, 바람직하게는, 10 ~ 1000nm, 보다 바람직하게는, 50 ~ 200nm의 직경을 가진다. 또, 바람직하게는, 그 분포에 있어서, 100nm정도의 직경을 가지는 겔 전구체의 존재 비율이 가장 많은 것이 바람직하다.

겔 전구체 클러스터를 형성하기 위해서 이용되는 원료 폴리머는, 친수성, 즉, 겔에 포함되는 용매인 물에 대해서 가용성의 폴리머이다. 이러한 상세한 설명은, 상술의 본 발명의 고분자 겔에 있어서의 폴리머 유니트에 대해 말했던 대로이다.

다음으로, 공정 b)에서는, 공정 a)에서 얻어진 겔 전구체 끼리를 한층 더 반응시켜, 서로 3차원적으로 가교시키는 것으로 최종 생성물인 고분자 겔을 얻을 수 있다. 상술한 대로, 겔 전구체는, 겔화점 이전 상태가 되도록 형성되어 있기 때문에, 각 겔 전구체에 있어서의 가교에 이용되는 치환기는 미 반응 상태로 잔존하고 있다. 그러므로, 겔 전구체 내의 해당 치환기를 다른 겔 전구체의 잔존 치환기와 반응시켜, 한층 더 가교하는 것에 의해 최종적인 겔을 형성시킬 수 있다.

공정 b)에서 최종적으로 얻어진 고분자 겔은, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역에서 구성되는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 이것에 의해, 친용매성의 원료 폴리머로부터, μm 오더의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 얻을 수 있는 점은, 본 발명과 관련되는 고분자 겔의 설명에 있어서 이미 말했던 대로이다.

바람직하게는, 해당 공정 b)에서는, 겔 전구체를 서로 가교하기 위한 가교제를 첨가하는 것이나 자극을 줄 수 있다. 그러한 가교제로서는, 원료 폴리머 중의 가교기와 같은 치환기를 가지는 것을 이용할 수 있고, 원료 폴리머 자체를 가교제로서 이용해 추가로 첨가할 수도 있다. 예를 들면, 공정 a)에 있어서, 구핵성 관능기 또는 구전자성 관능기를 가지는 2종류의 원료 폴리머를 비 당량으로 반응시켜, 겔 전구체를 얻었을 경우에는, 농도가 보다 적은 편의 관능기를 가지는 가교제를 첨가하는 것에 의해, 겔 전구체 간을 한층 더 가교할 수 있다. 그러한 가교제로서는, 비스(설포숙신이미딜)글루타레이트(BS₂G)나 DL－디티오트레이톨(DTT), 혹은 말단에 티올기를 가지는 합성 펩티드 등을 이용할 수 있다. 또, 가교를 위한 자극으로서는, 예를 들면 광이량화를 일으키는 것 같은 관능기(말레이미드기 등)에 대해서, 자외광을 조사할 수 있다.

또, 바람직한 태양에서는, 공정 b)가, 겔 전구체와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 비 반응성 폴리머의 존재 하에서 행해질 수도 있다. 이 비 반응성 폴리머는, 농후 상과 희박 상이라고 하는 2상 분리와 같은 삼차원 구조를 얻기 위해 적합하다. 그러한 비 반응성 폴리머의 예로서는, 원료 폴리머와 같은 기본 골격이지만 측쇄 또는 말단에 가교 반응기를 가지지 않는 폴리머, 예를 들면, 가교 반응기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다. 혹은, 셀룰로오스나 수식 셀룰로오스 등의 재료를 이용할 수 있다.

공정 b)에 있어서의 다른 반응 용액 조건 등은, 공정 a)와 같다. 바람직하게는, 공정 b)에서는, 2시간 이내의 반응 시간, 바람직하게는 1시간 이내의 반응 시간으로, 최종적인 겔을 얻을 수 있다. 일반적으로, 고분자를 저 농도로 포함하는 겔을 제작하는 경우에는, 반응 시간으로서 장시간을 필요로 하는(계에도 의존하지만, 예를 들면, 고분자 함유량이 1중량% 이하의 경우에 약 8시간) 것에 대해, 상술의 제조 방법에서는, 훨씬 단시간에 겔을 제작할 수 있다.

2－b. 고분자 겔의 제조 방법의 제2 태양

본 발명에 있어서의 고분자 겔의 제조 방법은, 제2 태양에 있어서는, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:

c) 소정 농도의 비 반응성 폴리머의 존재 하에서, 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친용매성의 원료 폴리머를 서로 가교시키는 것에 의해 상기 고분자 겔을 얻는 공정을 포함한다.

즉, 제2의 태양의 제조 방법에서는, 용액 중에 소정 농도의 비 반응성 폴리머를 첨가하는 것에 의해, 제1의 태양과 같이 일단 원료 폴리머로부터 겔 전구체를 거치는 일 없이, 1 스텝으로 본 발명에 있어서의 고분자 겔을 얻을 수 있다. 이 경우에서도, 중첩 농도 미만의 원료 폴리머를 이용하는 것에 의해, 농후 상과 희박 상의 2개의 영역을 가지고, μm 오더의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 얻을 수 있다.

여기서, 비 반응성 폴리머는, 원료 폴리머와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 폴리머이며, 원료 폴리머와 같은 기본 골격이지만 측쇄 또는 말단에 가교 반응기를 가지지 않는 폴리머, 예를 들면, 가교 반응기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다. 혹은, 셀룰로오스나 수식 셀룰로오스 등의 재료를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 비 반응성 폴리머의 농도는, 원료 폴리머 농도의 1/10 ~ 10의 범위이며, 보다 바람직하게는 1/5 ~ 2의 범위이다.

또, 제2의 태양에 있어서의 원료 폴리머의 초기 농도는, 중첩 농도 미만인 점은 제1의 태양과 같다. 한편, 제2의 태양에서는, 원료 폴리머의 초기 농도가 임계 겔화 농도 이상으로 하고, 1 스텝으로 겔화를 실시하는 점에서 제1의 태양과는 상이하다.

그 외, 반응 용액 조건이나 혼합 수법 등은, 제1의 태양과 같다.

2. 본 발명의 키트

다른 태양에 있어서, 본 발명은, 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트에 관한다. 해당 키트는, 상술한 한 고분자 겔의 제조 방법에 근거하는 것이다.

구체적으로는, 상술의 고분자 겔의 제조 방법의 태양에 입각해서, 이하에 나타내는 제1의 태양 및 제2의 태양의 키트를 들 수 있다(차례가 전후하지만, 이들 키트의 바람직한 태양은, 각각, 상술의 제조 방법에 관한 제2의 태양 및 제1의 태양에 대응하는 것이다). 다만, 이것들 키트를 이용하지 않고서도, 재생 의료용 겔 재료에 이용되는 고분자 겔을 제작할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

제1의 태양에 있어서, 본 발명의 키트는, 이하의 (A)와 (B)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 한다:

(A) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제1의 원료 폴리머를 포함하는 수용액;

(B) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제2의 원료 폴리머를 포함하는 수용액.

추가로, 해당 제1의 태양에서는, 본 발명의 키트는, 상기 (A) 및/또는 (B)의 용액중에, 상기 원료 폴리머와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 비 반응성 폴리머를 더 포함한다.

그리고, 이러한 본 발명의 키트를 이용해서 얻을 수 있는 고분자 겔은, 위에서 설명한 바와 같이, 이하의 구조적 특징을 가지는 것이다. 즉, 상기 (A) 및 (B)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔이며, 상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역에서 구성되는 구조를 가진다.

또, 본 발명의 키트에 있어서의 제2의 태양(제조 방법의 제1의 태양에 대응)에서는, 해당 키트는, 이하의 (A＇)와 (B＇)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 한다:

(A＇) 제1의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제1의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어진 것이며, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 해당 용액;

(B＇) 제2의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제2의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어지는 것이며, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 해당 용액.

추가로, 이러한 제2의 태양에서는, 본 발명의 키트는, 상기 (A＇) 및/또는 (B＇)의 용액중에, 상기 원료 폴리머와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 비 반응성 폴리머를 더 포함한다.

또, 상기 제1의 태양과 마찬가지로, 이러한 본 발명의 키트를 이용해서 얻을 수 있는 고분자 겔은, 이하의 구조적 특징을 가진다. 즉, 상기 (A＇) 및 (B＇)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔이며, 상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역에 의해 구성되는 구조를 가진다.

본 발명의 키트에 있어서 이용되는 원료 폴리머의 바람직한 태양은, 상술의 폴리머 유니트와 같다. 예를 들면, 바람직하게는, 본 발명의 키트에 있어서의 원료 폴리머는, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머이다. 마찬가지로, 본 발명의 키트에 있어서, 바람직하게는, 원료 폴리머는, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성 관능기를 가지는 제2의 폴리머로부터 이루어진다. 여기서, 구핵성 관능기 및 구전자성 관능기의 종류에 대해서도 상술한 대로이다.

본 발명의 키트의 상기 제2의 태양에서는, 바람직하게는, 상기 제1의 겔 전구체와 상기 제2의 겔 전구체는, 모두 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머로부터 이루어지고, 상기 제1의 겔 전구체는, 제1의 폴리머의 함유량이 제2의 폴리머의 함유량보다 많고, 상기 제2의 겔 전구체는, 제2의 폴리머의 함유량이 제1의 폴리머의 함유량보다 많다. 또, 상기 겔 전구체는, 바람직하게는, 10 ~ 1000nm의 범위, 보다 바람직하게는, 50 ~ 200nm의 직경을 가진다.

또, 본 발명의 키트에 포함되는 비 반응성 폴리머는, 예를 들면, 가교 반응기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 또는 셀룰로오스일 수 있다.

본 발명의 키트에 있어서의 용액 (A), (B), (A＇) 및 (B＇)는, 그 외의 성분으로서 인산 완충액 등이 적절한 pH완충액 등을 포함할 수 있다.

3. 본 발명의 치료 방법 등

본 발명의 재생 의료용 겔 재료는, 위에서 설명한 바와 같이, 재생 의료의 용도에 있어서 이용할 수 있고, 바람직하게는, 조직의 재생을 위해서 적합하다. 따라서, 본 발명은, 해당 재생 의료용 겔 재료를 이용하는 치료 방법(혹은 조직 재생 방법)에도 관한 것이다.

본 발명의 치료 방법(혹은 조직 재생 방법)의 대상이 되는 ‘조직’은, 그 재생이나 수복이 필요하게 되는 생체 조직이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 뼈, 연골, 피부, 신경, 장기 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료 방법은, 바람직하게는, 뼈, 연골, 피부, 또는 신경을 재생, 보다 바람직하게는, 뼈의 재생을 대상으로 한다.

본 발명의 치료 방법(혹은 조직 재생 방법)에서는, 구체적으로는, 재생 또는 수복이 필요한 환부에 재생 의료용 겔 재료를 투여, 주입 또는 도포하는 것(이하, '투여 등'이라고 한다.)으로, 해당 환부를 해당 재생 의료용 겔 재료로 피복 하는 것이 바람직하다. 혹은, 해당 재생 의료용 겔 재료에 의해 환부에 있어서의 공간(재생이나 수복해야 할 부분)을 충전할 수도 있다. 예를 들면, 뼈나 신경의 손상이나 단열(斷裂)의 치료에 있어서는, 해당 단열 또는 손상한 부분을 재접합 등의 시술을 실시한 환부에, 재생 의료용 겔 재료를 투여 등 하는 것이 상정된다. 또, 경우에 따라서는, 해당 투여 등에 의해, 환부의 주변 영역에 재생 의료용 겔 재료가 존재하는 환경을 만들어 내는 일도 포함한다.

본 발명의 치료 방법(혹은 조직 재생 방법)에 있어서, 재생 의료용 겔 재료를 투여 등 할 때에는, 그것이 필요한 환부 또는 그 주변에 있어서 in　situ로(생체 내에서) 재생 의료용 겔 재료를 제작할 수 있다. 이 경우에는, 상기 본 발명의 키트를 이용해서, 상술의 고분자 겔의 제조 방법에 기초해, 환부 또는 그 주변에 있어서 2종의 폴리머 용액(예를 들면, (A)와 (B)의 용액, 또는 (A＇)와 (B＇)의 용액)를 혼합하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명은, 상기 키트를 이용해서, 생체 내에 있어서 재생 의료용 겔 재료를 제작하는 방법을 제공하는 것이다. 또, 다른 관점에서는, 본 발명은, 조직 재생의 치료에 있어서의 상기 키트의 사용을 제공하는 것이기도 하다.

덧붙여 환부 또는 그 주변에 있어서 in　situ로(생체 내에서) 재생 의료용 겔 재료를 제작하는 경우, 겔화 시간은, 바람직하게는 1시간 이내, 보다 바람직하게는 10분 이내, 더욱 바람직하게는 1분 이내일 수 있다. 이러한 겔화 시간은, 위에서 설명한 바와 같이, 키트에 포함되는 폴리머 용액에 있어서의 폴리머 농도나 pH, 이온 강도를 적당히 설정하는 것으로 조절하는 것이 가능하다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들에 의해 한정되는 것은 아니다. 이하의 실험에서는, ¹H　NMR 스펙트럼은, 일본 전자의 JNM－ECS400(400 MHz)를 이용해서 해석했다. 중수소화 클로로포름을 용매로서 이용해 테트라메틸실란을 내부 표준으로 했다. 분자량은 브루커 달토닉스의 질량 분석계 Ultraflex　III의 리니어 포지티브 이온 모드를 이용해서 결정했다. 덧붙여 이하의 실시예에 있어서, 폴리머 농도의 g/L의 단위를 이용하지만, 1g/L=약 0.1중량%에 상당한다.

실시예 1

겔 전구체의 합성［ SHPEG ＋ MAPEG ］

겔화 반응에 있어서의 전구체가 되는 겔 전구체를, 말단에 -SH기를 가지는 SHPEG(테트라티올-폴리에틸렌글리콜) 및 말단에 말레이미딜기를 가지는 MAPEG(테트라말레이미딜-폴리에틸렌글리콜)를 이용해서 이하대로 합성했다. 이들 원료 폴리머 SHPEG 및 MAPEG는, 각각 일유(日油) 주식회사로부터 시판되고 있는 것을 이용했다(분자량은 모두 10,000).

SHPEG 및 MAPEG를 각각 용해시킨, 50mM구연산-인산 버퍼 수용액을 따로따로 조제했다(물질량비를 SHPEG/MAPEG=1/1, 전체의 폴리머 농도를 20g/L). 얻어진 2개의 용액을 다른 용기로 혼합시켜, 자전·공전 믹서에 의해 탈포·교반했다. 그 후, 혼합액을 재빠르게 팔콘 튜브로 옮겨, 건조를 막기 위해서 캡을 한 다음, 실온에서 12시간 정치했다. 이 때, SHPEG：MAPEG가 0.78：0.22 및 0.22：0.78의 몰 비가 되도록, 어느 쪽이 과잉으로 포함되는 2종의 겔 전구체를 포함하는 복수의 샘플을 조제했다.

레오미터를 이용해서 해당 반응 공정에 있어서의 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"의 시간 변화를 관측했다(25℃, 1Hz). 반응의 종점에 있어서, 얻어진 겔 전구체가, G＇＜G"의 관계성을 가지고 있고, 아직 겔 형성에 이르지 않는 졸 상태의 폴리머 클러스터인 것을 확인했다.

실시예 2

고분자 겔의 합성

실시예 1에서 합성한 겔 전구체를 이용해서, 고분자 겔(Oligo－TetraPEG 겔)을 이하대로 합성했다.

실시예 1로 얻어진 r=0.78의 겔 전구체 용액 A, 및 r=0.22의 겔 전구체 용액 B를, 각각 10g/L(또는 20g/L)가 되도록 물로 희석했다. 용액 중의 미 반응의 SH기량을 산출하고, 그것과 등량이 되도록 가교제(Bis-(sulfosuccinimidyl) glutarate(BS₂G))를 첨가하고, 자전·공전 믹서에 의해 탈포(脫泡)·교반했다. 그 후, 혼합액을 재빠르게 팔콘 튜브로 옮겨, 건조를 막기 위해서 캡을 한 다음, 실온에서 5시간 정치했다. 레오미터에 의한 관측(25℃, 1Hz)을 실시하고, 반응의 종점에 있어서, G＇＞G"의 관계성을 가지고 있고, 겔 전구체가 가교하는 것에 의해 고분자 겔이 형성된 것을 확인했다(도 1).

실시예 3

고분자 겔의 투과율

실시예 2의 겔화 공정에 있어서의 투과율의 변화를 도 2에 나타낸다. 투과율은, 겔 전구체의 2액을 혼합 후, 셀 내에 주입하고, 25℃, 파장 400nm에 있어서의 흡광도의 시간 변화로부터 산출했다. 덧붙여 도 중에서는, 아울러 G＇와 G"의 변화도 나타내고 있어, G＇=G"가 되는 지점이 겔화점이다.

또, 비교예로서 겔 전구체를 거치는 일 없이, 각각 60g/L의 SHPEG 용액 및 MAPEG 용액의 2액을 혼합해 얻은 단일 상의 고분자 겔에 대한 투과율 변화 및 G＇와 G"변화를 도 3에 나타낸다.

도 2로 도 3의 비교로부터, 겔 전구체를 거치지 않는 통상의 겔(도 3)에서는, 겔화 전후에 있어서 투과율의 변화는 거의 볼 수 없는데 대해(T=98%근방), 실시예 2의 고분자 겔(도 2)에서는, 겔화와 함께 투과율 T가 약 99%로부터 약 94%까지 크게 감소하고, 백탁하는 것을 알았다. 이것은, 본 발명의 고분자 겔에서는, 겔화에 수반해 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 농후 상과 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 희박 상의 2개의 영역이 생겨 상 분리가 생겼기 때문이다.

실시예 4

고분자 겔의 팽윤 시험

본 발명의 고분자 겔(a, b)과 비교예의 겔(c)의 3 종류에 대해, 팽윤 시험을 실시했다. 겔 a 및 b는 실시예 2에 따라 합성한 것이다.

(a) Oligo－Tetra－PEG 겔(10g/L):

실시예 2에 따라, 20g/L, r=0.78；20g/L, r=0.22에서 2종의 겔 전구체를 제작. 각각의 겔 전구체 용액을 10g/L로 희석하고, 2액을 혼합해서 겔화.

(b) Oligo－Tetra－PEG 겔(20g/L):

실시예 2에 따라, 20g/L, r=0.78, 20g/L, r=0.22에서 2종의 겔 전구체를 제작. 각각의 겔 전구체 용액을, 그대로 혼합해 겔화.

(c) Tetra－PEG 겔(비교예):

60g/L의 SHPEG 용액과 MAPEG 용액의 2액을 혼합해 겔화.

원통형의 샘플(높이 7mm, 직경 15mm)을 제작하고, 충분히 겔화 반응이 종료한 후(1일), 순수한 물에 담궈, 25℃에서 팽윤도의 시간 변화를 측정했다. 얻어진 결과를 도 4에 나타낸다.

겔 전구체를 거치지 않는 통상의 겔 c에서는, 시간 경과와 함께 겔의 팽윤을 볼 수 있었다. 이것에 대해, 본 발명의 고분자 겔에서는 긴 완화를 가지고 수축한다고 하는 특징적인 성질을 나타냈다.

실시예 5

고분자 겔의 침투압 시험

실시예 2에 따라 제작한 본 발명의 고분자 겔에 대해 침투압(Π_os)과 탄성압(Π_el)을 측정했다. 비교예로서 겔화 전의 원료 폴리머 및 겔 전구체를 거치지 않는 통상의 겔에 대해서도 마찬가지로 측정을 실시했다.

본 발명의 고분자 겔:

실시예 2에 따라, 겔 전구체 용액의 농도를 10, 12.5, 15, 17.5, 20g/L의 복수의 조건으로 제작한 겔을 이용했다.

·원료 폴리머:

10, 20, 30, 40, 50, 60g/L의 각 MAPEG 용액을 이용했다.

·비교예 겔:

각각 10, 20, 30, 40, 50, 60g/L의 SHPEG 용액과 MAPEG 용액의 2액을 혼합해 겔화시킨 것을 이용했다.

투석막중에 샘플을 제작, PVP 용액(29 k, 5 ~ 120g/L)에 대해 투석을 실시하고, 초기 상태로부터 팽윤하지 않는 PVP의 농도를 구했다. 그 점에서는, 겔의 팽윤압(Π_os-Π_el)과 PVP의 침투압(Π_PVP)이 조화를 이루고 있다. 별도, 탄성압(Π_el=G＇)을 레오미터에서 측정하고, 이하의 식을 이용해서 Π_os를 구했다.

각 겔화 농도(C)에 있어서 얻어진 침투압(Π_os)의 플롯을 도 5에 나타낸다. 그 결과, 본 발명의 고분자 겔은, 상호 중첩 농도(C*) 이하에 있어서, 동(同) 농도의 원료 폴리머 및 비교예 겔의 어느 쪽에 대해서도, 낮은 침투압을 가지는 것을 알았다.

실시예 6

고분자 겔의 형광 현미경 화상

2 광자 레이저 현미경(Zeiss)을 이용해서, 본 발명의 겔(a) 및 비교예 겔(b)의 구조를 관측했다.

(a) Oligo－Tetra－PEG 겔(10g/L):

(b) Tetra－PEG 겔(비교예):

60g/L의 SHPEG 용액과 MAPEG 용액의 2액을 혼합해서 겔화.

상기 (a) 및 (b)의 겔 시료를 조제 후, 수중에서 7일 정치한 것을 이용했다.

1차 염색: anti-PEG 용액(0.04g/L)에 담궈, 1시간 정치, 15분 세정의 세정을 3회 실시했다.

2차 염색: antibody-AlexaFloar488(0.04g/L)에 담궈, 1시간 정치, 15분 세정의 세정을 3회 실시했다.

얻어진 형광 현미경 이미지를 도 6에 나타낸다. 비교예의 Tetra－PEG 겔(좌도)에서는, nm 오더의 망목 구조인데 대해, 본 발명의 고분자 겔(우도)에서는, 분자 구조로부터 예측되는 구조보다 훨씬 더 큰μm 오더의 망목 구조(다공체 구조)를 가지는 것을 알았다. 덧붙여 해당μm 오더의 망목 구조는, 폴리머가 조밀하게 존재하는 농후 상에 의해 외주가 형성된 것이고, 그 내부는 희박 상 또는 용매이다.

실시예 7

고분자 겔의 세포 접착성

실시예 2로 제작한 본 발명의 고분자 겔에 대한 세포의 접착성에 대해서도 평가를 실시했다. 그 결과, 본 발명의 고분자 겔은, 겔 전구체를 거치지 않는 통상의 Tetra－PEG 겔(비교예)에 비해, ATDC5(체세포형 만능 세포)를 효율적으로 접착할 수 있는 것을 확인했다.

실시예 8

뼈 재생에의 적용

(1) 래트 경골의 뼈 결손 모델에서의 검증

래트 경골의 뼈 결손 모델을 이용해서, 본 발명의 스펀지 상의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔의 뼈 재생에 대한 효과를 검증했다. 성체 래트 경골에 9mm의 뼈 결손을 제작 후, 뼈 결손 부위에 실시예 2의 수법에 의해 고분자 겔(Oligo－Tetra PEG 겔)을 충전했다. 구체적으로는, SHPEG 및 MAPEG를 각각 포함하는 폴리머 용액을 뼈 결손 부위에 주입·혼합하고, 그 자리에서 겔화시켰다.

그 후, 결손부 주위 조직을 봉합하고, 뼈 결손부에 있어서의 뼈 재생 효과를 경시적으로 관찰했다(도 7). 마이크로 CT해석의 결과, 뼈 결손 경과 4주 후에 있어서, 고분자 겔 비 충전군(대조군)에서는 뼈 재생은 불완전하고, 뼈 결손부 단부에서의 뼈 유합(癒合)은 인정되지 않았다(도 7A의 a ~ c). 한편, 고분자 겔 충전군에서는, 뼈 결손 제작 2주간에 뼈 결손부 단부(斷端)에서의 뼈 유합이 인정되고, 4주 후에는 대부분의 뼈 결손 부위는 신생 뼈에 의해 치환되었다(도 7A의 d ~ f). 뼈 결손 제작 4주 후의 뼈 결손 부위의 조직학적 해석의 결과, 대조군에서는 뼈 결손 부위에 있어서 섬유 계 세포의 침윤이 인정되고, 결손된 골 단부는 유합하지 않고, 뼈 재생은 충분하지 않았다(도 7B의 g 및 h). 한편, 고분자 겔 충전군에서는, 결손 부위는 거의 신생 뼈로 치환되었고, 골 단부의 유합이 인정되었다(도 7B의 i 및 j).

(2) 마우스 두개골 뼈 결손 모델에서의 검증

다음으로, 성체 마우스 두개골에 직경 4mm의 뼈 결손을 제작 후, 상기 (1)와 마찬가지로, 고분자 겔(Oligo－Tetra PEG 겔)의 효과를 검증했다. 본 해석에 있어서는, 뼈 결손을 제작해 결손부 주위 조직을 봉합한 1일 후에, SHPEG 및 MAPEG를 각각 포함하는 폴리머 용액 2액 혼합에 의해 고분자 겔을 결손 부위에 충전했다. 비교 대상으로서, sham군(음성 대조군; NTC)에 더해, 비교예 겔(실시예 4의 ‘c) Tetra－PEG 겔’)을 이용했다. 그 결과, 도 8에 나타내듯이, 마이크로 CT해석의 결과, sham군, 비교예 겔군에 있어서는, 뼈 결손 후 12주간에서, 뼈 재생은 거의 인정되지 않았는데 대해, 본 발명의 Oligo－Tetra PEG 겔군(도 8 중의 ‘Tetra－PEG　sponge’의 군)에 있어서는, 현저한 뼈 재생 효과가 인정되었다.

실시예 9

피하에의 적용

본 발명의 겔(a)과 비교예의 겔(b)의 2종류에 대해서, 래트 피하에의 매식(埋植) 시험을 실시했다.

(a) Oligo－Tetra PEG 겔:

(b) TetraPEG 겔 (비교예):

20g/L의 SHPEG 용액과 MAPEG 용액의 2액을 혼합해서 겔화

마취 하에서 래트 등쪽을 제모하고, 좌우에 합계 2개소의 절개선을 넣어 피하에 포켓을 제작했다. 우측에 본 발명의 겔(a), 좌측에 비교예 겔(b)을 충전했다. 구체적으로는, SHPEG 및 MAPEG를 각각 포함하는 폴리머 용액을 해당 부위에 주입·혼합하고, 그 자리에서 겔화시켰다.

그 후, 창면(創面)의 피부를 봉합했다. 처치의 2주 후, 래트를 희생사시켜, 매입물을 적출하고, 육안으로 평가했다(도 9). 본 발명의 겔(a)에서는, 연 조직이 겔 안에 형성되는 것을 알 수 있었다. 한편, 비교예 겔(b)에서는, 신생 조직 형성은 인정되지 않았다.

이상의 결과는, 본 발명의 스펀지 상의 다공체 구조를 가지는 고분자 겔을 포함하는 재생 의료용 겔 재료를 환부에 적용하는 것에 의해, 생체 조직의 재생이나 수복을 촉진할 수 있다는 것을 실증하는 것이다.

Claims

친수성의 폴리머 유니트가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔을 포함하는 재생 의료용 겔 재료로서,
상기 고분자 겔이,
용매로서의 물을 함유하고,
상기 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역을 가지는 3차원 망목 구조를 가지고,
상기 제1 영역에 의해 구성되는 망목 사이즈가, 1 ~ 500μm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료.
제1항에 있어서,
겔화 전의 폴리머 유니트의 투과율보다 낮은 투과율을 가지는, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
겔화 전의 폴리머 유니트의 침투압에 대해서 1/5 ~ 1/2의 범위의 침투압을 가지는, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
겔화로부터 일정시간 경과 후에 있어서의 침투압(Π_os)과 탄성압(Π_el)이, Π_el＞Π_os의 관계성을 가지는, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 영역의 고분자 농도가 10 ~ 99중량%이며, 상기 제2 영역의 고분자 농도가 0 ~ 1중량%인, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
5중량% 이하의 고분자 함유량인, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리머 유니트가, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머인, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리머 유니트가, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머 유니트와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머 유니트로 이루어지는, 재생 의료용 겔 재료.
제8항에 있어서,
상기 구핵성 관능기가, 티올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 구전자성 관능기가, 말레이미딜기, N－하이드록시숙신이미딜(NHS)기, 설포숙신이미딜기, 프탈이미딜기, 이미다조일기, 아크릴로일기, 니트로페닐기, 및 -CO₂PhNO₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
조직의 재생을 위해서 이용되는, 재생 의료용 겔 재료.
제10항에 있어서,
상기 조직이 뼈, 연골, 피부, 또는 신경인, 재생 의료용 겔 재료.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 재생 의료용 겔 재료를 이용하는, 치료 방법.
이하의 (A)와 (B)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트로서,
(A) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제1의 원료 폴리머를 포함하는 수용액;
(B) 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 이상의 친수성의 제2의 원료 폴리머를 포함하는 수용액;
상기 (A) 및/또는 (B)의 용액 중에, 상기 원료 폴리머와 가교 반응을 할 수 있는 관능기를 분자 내에 가지지 않는 비 반응성 폴리머를 더 포함하고,
상기 (A) 및 (B)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔로서,
상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역으로 구성되는 구조를 가지는,
키트.
이하의 (A＇)와 (B＇)의 2종류의 용액이 서로 혼합되는 일 없이 수납되어 있는 것을 특징으로 하는, 재생 의료용 겔 재료를 제작하기 위한 키트로서,
(A＇) 제1의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제1의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어진 것으로서, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 용액;
(B＇) 제2의 겔 전구체를 포함하는 수용액으로서, 상기 제2의 겔 전구체는, 친수성의 원료 폴리머를 중첩 농도 미만 또한 임계 겔화 농도 미만의 조건하에서 가교시키는 것으로 얻어진 것으로서, 저장 탄성률 G＇와 손실 탄성률 G"에 있어서 G＇＜G"의 관계성을 가지는, 용액;
상기 (A＇) 및/또는 (B＇)의 용액 중에 가교제를 더 포함하고,
상기 (A＇) 및 (B＇)의 용액을 혼합하는 것으로 얻어지는 고분자 겔이, 상기 제1의 원료 폴리머 및 상기 제2의 원료 폴리머가 서로 가교해서 이루어지는 고분자 겔로서,
상기 고분자 겔이, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 조밀하게 존재하는 제1 영역과, 상기 원료 폴리머에 유래하는 폴리머 유니트가 드문드문하게 존재하는 제2 영역의 2개의 영역에 의해 구성되는 구조를 가지는,
키트.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 원료 폴리머가, 폴리에틸렌글리콜 골격 또는 폴리비닐 골격을 가지는 폴리머인, 키트.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 원료 폴리머가, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머로 이루어지는, 키트.
제16항에 있어서,
상기 구핵성 관능기가, 티올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 구전자성 관능기가, 말레이미딜기, N－하이드록시숙신이미딜(NHS)기, 설포숙신이미딜기, 프탈이미딜기, 이미다조일기, 아크릴로일기, 니트로페닐기, 및 -CO₂PhNO₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 키트.
제13항에 있어서,
상기 비 반응성 폴리머가, 가교 반응기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 또는 셀룰로오스인, 키트.
제14항에 있어서,
상기 제1의 겔 전구체와 상기 제2의 겔 전구체는, 모두 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구핵성 관능기를 가지는 제1의 폴리머와, 측쇄 또는 말단에 1 이상의 구전자성의 관능기를 가지는 제2의 폴리머로부터 이루어지고,
상기 제1의 겔 전구체는, 제1의 폴리머의 함유량이 제2의 폴리머의 함유량보다 많고, 상기 제2의 겔 전구체는, 제2의 폴리머의 함유량이 제1의 폴리머의 함유량보다 많은, 키트.
제14항에 있어서,
상기 겔 전구체가, 10 ~ 1000nm의 범위의 직경을 가지는, 키트.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키트를 이용해서, 생체 내에 있어서 재생 의료용 겔 재료를 제작하는 방법.
조직 재생의 치료에 있어서의, 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키트의 사용.