CN112004595A - 生物相容性水凝胶组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涵盖包括共价结合的水凝胶反应产物的生物相容性水凝胶组合物、以及所述共价交联的水凝胶反应产物的组合物、制造方法、使用方法、和包括所述共价交联的水凝胶反应产物的试剂盒。所述共价交联的水凝胶反应产物可衍生自聚季铵盐‑10、软骨素4‑硫酸盐、和二乙烯基砜的交联反应。
Description
技术领域
本公开内容总体上涉及生物相容性水凝胶，并且更具体地涉及包括与天然衍生的阴离子型聚合物共价结合的阳离子型纤维素衍生的聚合物的反应产物的生物相容性水凝胶组合物以及其用途和制造方法。
背景技术
骨关节炎是涉及关节体(joint)的整个关节(articulation)的疾病。在关节结构损伤中，可观察到滑膜液性质的变化。已经尝试了从膳食补充剂到使用可植入的类皮质激素和聚合物的粘弹性补充疗法和甚至手术程序的数种治疗骨关节炎的方法。然而，每种所尝试的治疗都具有使对进一步改进的需要成为必要的缺点。
植入生物相容性聚合物材料和凝胶以治疗该病况经常由于所植入材料的快速分解而导致需要随时间推移而反复和频繁注入。像骨关节炎一样，通过生物相容性聚合物凝胶的注入而治疗其它病况。在各情况下，生物相容性聚合物凝胶的快速分解限制了治疗的功效并且有时需要反复注入以产生显著的结果。实际上，生物相容性聚合物凝胶可用于各种各样的应用中，但是在许多此类情况下，生物相容性聚合物凝胶的稳定性的不足限制了其实用性和功效。
因此，需要可解决当前可用材料中的缺陷的一个或多个的生物相容性聚合物材料或者凝胶。
题为“Cationic Cellulose And Its Interaction With ChondroitinSulfate.Rheological Properties of the Polyelectrolyte Complex”的论文描述了“在聚季铵盐纤维素(聚季铵盐-10)和软骨素4-硫酸盐(C-4S)之间的聚电解质复合作用…该复合物随着所述聚阴离子的浓度增加而显示出不同的行为。最初，聚季铵盐-10/C-4S相互作用形成可溶性的、半透明的水凝胶，该水凝胶在低于1的硫酸根羧酸根/季铵摩尔比下达到最大粘度。之后，该复合物开始聚集，直至完全沉淀，并且最后，在更高的C-4S浓度下，观察到该聚集体的再悬浮。聚季铵盐-10的进一步添加引发新的沉淀/再悬浮循环达至少七次。C-4S含有能够与聚季铵盐-10的季铵相互作用的硫酸根和羧酸根”。
美国专利No.4,582,865涉及透明质酸的交联凝胶(单独或者与其它亲水性聚合物混合并且含有多种物质或者共价结合的低分子量物质)以及其制备工艺。
美国专利No.4,767,463和4,913,743涉及葡糖胺多糖和某些阳离子型聚合物的组合以提供改进的葡糖胺多糖性质，并且可提供在个人护理或医疗应用中有用的对角质材料的直染性(substantivity)、相容性、稳定性、保湿性、流变学和其它性质。
美国专利申请No.2003/0086899 A1涉及粘弹性组合物以及使用其治疗关节体、尤其是关于创伤和骨关节炎的方法。
欧洲专利No.22272297涉及部分地N脱乙酰化的透明质酸的交联衍生物，其包括至少一个具有下式的重复单元：其中R1为H或C1-C20取代或未取代的部分，脂族、芳族、芳脂族、环脂族、杂环系列的醛的衍生物；R2为取代或未取代的脂族、芳族、芳脂族、环脂族或杂环基团；R为OH，o-，脂族、芳族、芳脂族系列、环脂族、杂环的醇基团，或者脂族、芳族、芳脂族、环脂族、杂环系列的氨基；各R3基团彼此相同或不同，并且为H，SO3 -，或者琥珀酸的半酯的残基或者琥珀酸半酯的重金属盐的残基；和其中各R4基团彼此相同或不同，并且为COR基团、或CH2 OR3基团。
美国专利申请No.2005/0069572 A1涉及多层组织构建物(construct)，其包括：包括第一水凝胶的第一层；和包括第二水凝胶的第二层，其中所述第一层在第一过渡区处连接至所述第二层并且其中所述第一层和所述第二层的至少一个进一步包括选自细胞和生物活性物质的组分。另一多层组织构建物包括：包括第一水凝胶的第一层；包括第一类型的细胞的第二层，其中所述第二层设置在所述第一层上；和包括第二水凝胶并且任选地包括包封在所述第二水凝胶中的所述第一类型的细胞的第三层，其中所述第三层设置在所述第二层上。还描述了用于制造这些多层组织构建物的方法。
美国专利No.8,574,620 B2涉及生物相容性复合材料以及使用其修复组织缺陷(包括软骨中的缺陷)的方法。所述生物相容性复合材料包括纤维状聚合物组分和能够在组织缺陷的部位处原位形成所述生物相容性复合材料的能聚合的试剂。在实施方式中，可将所述生物相容性复合材料所要施加至的修复部位用启动剂(priming agent，引发剂)治疗，从而允许所述能聚合的试剂聚合至位于修复部位处的组织。
美国专利No.9,050,392 B2涉及制备用于注入的交联的无菌且均匀的水凝胶的方法，特征在于其包括以下步骤：(a)制备含有衍生自纤维素的聚合物和至少一种水溶性聚合物的水溶液，总聚合物含量范围为0.5-5重量％、优选地从1至4重量％和更优选地从1.5至3重量％；(b)任选地添加固体颗粒；(c)将具有任选的固体颗粒的所得液体混合物倾倒到容器中并且使用水密和气密体系密封该容器；和(d)将含有所述液体和所述任选的固体颗粒的所述容器暴露于在5和50kGy之间、优选地在20和30kGy之间、和更优选地约25kGy的辐射剂量。还公开了根据以上方法获得的水凝胶以及其在医疗应用中的用途。
美国专利申请No.2016/0303281 A1涉及蛋白质和基于蛋白质的大分子的水不溶性但是水溶胀性且可变形的交联的PEG化的微凝胶颗粒，其是假塑性(剪切变稀)的并且在水性介质中在剪切下流动并且可被注射或者使得流动，其中在除去剪切力时，所述微凝胶颗粒可再形成为一堆(duster)微凝胶颗粒。所述微凝胶颗粒充当基质以支持细胞生长、存活力、和增殖。
题为“Chitosan-Chondroitin Sulfate And Chitosan-HylanuratePolyelectolyte Complexes.Physico-Chemical Aspects”的论文描述了“完全脱乙酰化的壳聚糖……在溶液中与软骨素硫酸盐和透明质酸接触……形成了纯的聚电解质复合物”。
题为“Divinylsulphone-Activated Agarose Formation Of Stable And Non-leaking Affinity Matrices By Immobilization Of Immunoglobulins And OtherProteins”的论文描述了“二乙烯基砜活化的琼脂糖是通常使用的若干活化载体的有吸引力的替代物”。
题为“Ellipsometry Studies Of The Mucoadhesion Of CelluloseDerivative”描述了“通过原位椭圆偏振测量术研究了三种不同的纤维素衍生物即乙基(羟乙基)纤维素(EHEC)、疏水性改性的羟乙基纤维素(h-HEC)和阳离子型纤维素衍生物(ammo纤维素)的粘膜粘附”。
题为“Interactions Of Ibuprofen With Cationic Polysaccharides InAqueous Dispersions And Hydrogels Rheological And Diffusional Implications”的论文描述了“布洛芬钠与阳离子型纤维素(
H-100(PQ-4)和SC-230M(聚季铵盐-10))和阳离子型瓜尔豆胶(
261-S和14-S)的缔合过程以及它们对水性分散体和交联的水凝胶的性质的影响”。
题为“Cationic Cellulose Hydrogels:Kinetichondroitin 4-sulfate Of TheCross-linking Process And Characterization As pH-/ion-sensitive Drug DeliverySystems”的论文描述了“对具有不同羟乙基和铵基团含量的两种阳离子型羟乙基纤维素即聚季铵盐-4(PQ-4)以及聚季铵盐-10(聚季铵盐-10)与乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)的交联过程通过形成着的网络的流变分析而进行表征和优化。研究了NaOH浓度、温度、和EGDE浓度对交联速率的影响”。
题为“Effect Of The Counterion Behavior On The Frictional-CompressiveProperties Of Chondroitin Sulfate Solutions”的论文描述了“使用超越平均场(MF)近似水平的最新发展的场理论法，软骨素硫酸盐水溶液对单体和所添加盐浓度的变化的热力学响应”。
题为“New Cationic Hydrophilic And Amphilic PolysaccharidesSynthesized By One Pot Procedure”的论文描述了“携带各种化学结构的季铵基团的阳离子型多糖的合成…通过涉及将中性多糖(葡聚糖、支链淀粉)用等摩尔等摩尔混合物环氧氯丙烷/叔胺在水性介质中改性的一锅法进行”。
题为“Efficacy And Safety Of A Single Intra-articular Injection Of 2％Hyaluronic Acid And Mannitol In Knee Osteoarthritits Over A 6-month Period”的论文描述了对在症状性膝盖骨关节炎(KOA)中单次关节内注入2％透明质酸(HA)和甘露醇的评价。
题为“Ocular Biocompatibility Of Polyquaternium 10 Gel:Functional AndMorphological Results”的论文描述了“阳离子型羟乙基纤维素聚季铵盐10(聚季铵盐-10)的外用(topical，局部)和眼内生物相容性和毒性的研究。其还评价了凝胶的流变性质”。
发明内容
本公开内容涵盖包括共价交联的水凝胶反应产物的生物相容性水凝胶组合物。本公开内容涵盖包括如下的组合物：包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在65％至85％范围内的凝胶含量。在所述组合物的另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在70％至80％范围内的凝胶含量。在所述组合物的一个进一步方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
在所述组合物的还另一方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.1％(w/v)至1.2％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。在所述组合物的又一个进一步方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。在所述组合物的又另一方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的1％(w/v)至4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。在所述组合物的另一方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。在所述组合物的还一个进一步方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％(w/w)至4％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。在所述组合物的还另一方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。在所述组合物的一个进一步方面中，所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的重量计的10:1至10:3的重量比的范围内的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐。
在所述组合物的另一方面中，所述组合物进一步包括异丁基苯丙酸。在所述组合物的一个进一步方面中，所述组合物进一步包括2-[2-(2,6-二氯苯胺基)苯基]乙酸钠。在所述组合物的又另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在3000Pa至33000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。在所述组合物的还另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在10000至24000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。在所述组合物的又一个进一步方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在15000至20000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。在所述组合物的还另一方面中，所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)的二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
本公开内容还涵盖制造本文中描述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物；向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物；使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；中和所述中间反应产物；用缓冲溶液洗涤所述中间反应产物；过滤所述中间反应产物；和调节所述中间反应产物的pH以形成以上组合物的共价交联的水凝胶反应产物。在所述方法的另一方面中，所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的0.6％(w/v)至8.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。在所述方法的一个进一步方面中，所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。在所述方法的还另一方面中，所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。在所述方法的又一个进一步方面中，所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的1.4％(w/v)至5.7％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。在所述方法的又另一方面中，所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的3.7％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。在所述方法的还一个进一步方面中，所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。在所述方法的另一方面中，所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。在所述方法的一个进一步方面中，所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2％(w/v)至4％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。在所述方法的还另一方面中，所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。在所述方法的一个进一步方面中，所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)的二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
本公开内容还涵盖治疗对象(subject，受试者)的关节体的方法，其包括：将本文中描述的组合物注入到所述关节体中。在治疗关节体的方法的另一方面中，将如上所述的组合物以在1ml至10ml的范围内的量注入到所述关节体中。
本公开内容还涵盖用于治疗关节体的试剂盒(套件，kit)，其包括：如本文中描述的组合物，和用于将如本文中描述的组合物注入到关节体中的注射器。在所述试剂盒的另一方面中，所述试剂盒进一步包括针头。
本公开内容还涵盖包括如下的组合物：包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜，其中在所述共价交联的水凝胶反应产物中软骨素4-硫酸盐、聚季铵盐-10、和二乙烯基砜共价交联，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。在所述组合物的另一方面中，所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括约46.2重量％C、约10.5重量％H、约40.3重量％O、约1.6重量％N、和约1.4重量％S。
本公开内容还涵盖制造如本文中描述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，和其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10；向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜；使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；中和所述中间反应产物以形成经中和的中间反应产物；用缓冲溶液洗涤该经中和的中间反应产物以形成经洗涤的经中和的中间反应产物；过滤该经洗涤的经中和的中间反应产物以形成经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物；和调节该经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物的pH以形成本文中描述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物。
本公开内容还涵盖治疗对象的关节体的方法，其包括：将如本文中描述的组合物注入到所述关节体中。
本公开内容还涵盖用于治疗关节体的试剂盒，其包括：如本文中描述的组合物，和用于将所述组合物注入到关节体中的注射器。
以下更详细地阐述本公开内容的这些和其它方面。
附图说明
图1显示与参照软骨素硫酸盐相比的软骨素4-硫酸盐的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图2显示涵盖本公开内容的方面的生物相容性水凝胶组合物，其中将所述生物相容性水凝胶组合物在通过21号针头和27号针头挤出之后用亚甲基蓝着色。
图3显示说明离子强度对两种不同的聚季铵盐-10/软骨素4-硫酸盐复合物的稳定性的影响的图，其中聚季铵盐-10对软骨素4-硫酸盐的摩尔比为1:1.4的聚季铵盐-10/软骨素4-硫酸盐复合物未共价交联，并且聚季铵盐-10对软骨素4-硫酸盐的摩尔比为1:0.5的另一聚季铵盐-10/软骨素4-硫酸盐/二乙烯基砜复合物共价交联成水凝胶。
图4显示说明如下复合物在400nm处的浊度测量结果的图：共价交联的聚季铵盐-10/软骨素4-硫酸盐/二乙烯基砜复合物，其用空心圆示出；和以不同的电荷摩尔比静电结合的三种不同的聚季铵盐-10/软骨素4-硫酸盐复合物，其分别用实心正方形、实心圆、和空心三角形示出，其中第1个和第3个循环包括恒定的聚季铵盐-10和渐增的软骨素4-硫酸盐，并且第2个循环包括恒定的软骨素4-硫酸盐和渐增的聚季铵盐-10。
图5显示经预填充的注射器的辐射不透明性，其中注射器(1)包括包含与衍生自聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的水凝胶混合的BaCl2的混合物；注射器(2)包括包含与衍生自聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的水凝胶混合的(15％(w/w))MnO2的混合物；注射器(3)包括包含与衍生自聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的水凝胶混合的(20％-40％(w/w))triyosom的混合物；和注射器(4)包括衍生自聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的水凝胶。
图6显示植入有包括衍生自聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的水凝胶和(40％(w/w))的triyosom的混合物的水凝胶的猪膝盖的射线照片以及将所述水凝胶植入到所述膝盖中所用的针头和注射器的相对位置。
图7显示说明涵盖本公开内容的方面的水凝胶的热重分析(TGA)温谱图的图，其中结果是在约23℃至约600℃的温度范围内示出的。
图8显示说明样品C和D的差式扫描量热法(DSC)温谱图的图，其显示三个扫描(加热/冷却/加热)。
图9显示说明涵盖本公开内容的方面的样品D的差式扫描量热法(DSC)温谱图的图。
具体实施方式
本公开内容涉及生物相容性水凝胶组合物，其包括包含如下的反应混合物的共价交联的水凝胶反应产物：交联剂二乙烯基砜、动物来源的天然聚合物软骨素4-硫酸盐、和通过引入季铵基团而改性的植物来源的天然聚合物聚季铵盐-10，其中软骨素4-硫酸盐与聚季铵盐-10以及二乙烯基砜共价交联，从而形成构成水凝胶的无定形复合物。所述共价交联的水凝胶反应产物和包括所述产物的组合物可为无色的和/或透明的。本公开内容的组合物可包括形成三维结构的由两种独立的交联的天然衍生的聚合物即软骨素硫酸盐和改性的纤维素衍生物制成的聚电解质复合物互穿水凝胶。本公开内容还涉及制造所述生物相容性水凝胶组合物的方法，所述生物相容性水凝胶组合物的使用方法，包括治疗对象的方法，和包括所述组合物的试剂盒。
如本文中使用的，单数形式的“一个(种)(a，an)”和“该(所述)”涵盖其复数形式，除非另有说明。如本文中使用的,短语“至少一个(种)”包括一以及更大的所有数。本文中使用的范围包括落在所陈述范围内的所有值(包括落在整个值的中间的值)，并且包括最小值和最大值。如本文中使用的,术语“和/或”指所列举要素的一个或全部或者所列举要素的任意两个或更多个的组合。如本文中使用的，被描述为“％(w/w)”的值是基于所详述组合物的重量和所详述组分的重量、或者所详述组分的重量和其它所详述组分的组合重量计算的。如本文中使用的，被描述为“％(w/v)”的值是基于所详述组分的重量和含有所详述组分的所详述组合物的体积计算的。如本文中使用的，“C”意指碳，“O”意指氧，“H”意指氢，“N”意指氮，并且“S”意指硫。
如本文中使用的，软骨素4-硫酸盐是硫酸化的由交替的糖(N-乙酰基半乳糖胺和葡萄糖醛酸)的链组成的葡糖胺多糖，并且分子量取决于其来源。软骨素硫酸盐也称作(2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-2,5-二羟基-6-磺基氧基四氢吡喃-4-基]氧基-3,4,5-三羟基四氢吡喃-2-羧酸。软骨素硫酸盐可具有C13H2NO15S的分子式。软骨素4-硫酸盐链由约100个单糖形成，所述单糖可以可变的量和在不同位置处被硫酸化。软骨素4-硫酸盐是软骨的必要结构组分并且提供抗压缩性。软骨中的软骨素4-硫酸盐流失是骨关节炎疾病的主要原因之一。如本文中使用的术语软骨素4-硫酸盐意指在可具有如下所示的结构的分子结构(C-4S)的4位处具有硫酸根基团的钠盐形式的软骨素硫酸盐。
如本文中使用的，聚季铵盐-10，有时称作PQ-10，为被季胺基团取代的羟乙基纤维素，并且也称作氯化[3-[2[(2R,3R,4S,5S,6R)-2,4-二羟基-5-[(3R,4R,5R,6R)-3-羟基-4,5-二(2-羟基乙氧基)-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基-6-(羟基甲氧基甲基)四氢吡喃-3-基]氧基乙氧基]-2-羟基丙基]-三甲基铵。聚季铵盐-10可具有C25H50CINO16的分子式。含有季铵基团的多糖呈现出在水性介质中的溶解性、生物相容性、和粘膜粘附性质。聚季铵盐-10可具有以下分子结构：
如本文中使用的，二乙烯基砜指的是这样的交联剂：其有时也称作1-乙烯基磺酰基乙烯并且具有C4H6O2S的分子式。如本文中使用的，“共价交联反应”意指在不同分子或聚合物的链之间导致化学共价键的交联反应。如本文中使用的，“凝胶含量”意指由ASTMD2765-11中描述的索氏提取方法得到的不溶性残留物的质量除以试验样品的初始质量的比率。
如本文中使用的，术语“水凝胶”指的是彼此共价结合的分子的三维网络。如本文中使用的，术语“治疗”(“treatment”and“treating”)指的是对象中的任意一种或多种病况、疾病、失调、和/或损伤的任何治疗，并且可包括：抑制所述病况、疾病、失调、和/或损伤，(2)缓解所述病况、疾病、失调、和/或损伤、或者其任意一种或多种症状，和/或(3)减轻所述疾病、失调、和/或损伤、或者其任意一种或多种症状。如本文中使用的,术语“对象”指的是治疗可被给予至的任何动物、例如哺乳动物、例如人。如本文中使用的，术语“pH”和“pH值”指的是以十进制形式表示的在溶液中的氢活性的倒数的对数。如本文中使用的,术语“生物相容性的”指的是在体内不诱发显著的有害响应的材料。
本公开内容的共价交联的水凝胶反应产物可由包括如下的反应混合物形成：水溶液、聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜。本公开内容的反应混合物可包括基于所述反应混合物的体积计的约1％(w/v)至约4％(w/v)的聚季铵盐-10。在一个方面中，所述反应混合物中聚季铵盐-10的范围的上限可为基于所述反应混合物的体积计的约3％(w/v)或4％(w/v)。在另一方面中，所述反应混合物中聚季铵盐-10的范围的上限可为基于所述反应混合物的体积计的约3.1％(w/v)、3.2％(w/v)、3.3％(w/v)、3.4％(w/v)、3.5％(w/v)、3.6％(w/v)、3.7％(w/v)、3.8％(w/v)、或3.9％(w/v)。在又另一方面中，所述反应混合物中聚季铵盐-10的范围的下限可为基于所述反应混合物的体积计的约1％(w/v)、2％(w/v)、或3％(w/v)。在还另一方面中，所述反应混合物中聚季铵盐-10的范围的下限可为基于所述反应混合物的体积计的约1.1％(w/v)、1.2％(w/v)、1.3％(w/v)、1.4％(w/v)、1.5％(w/v)、1.6％(w/v)、1.7％(w/v)、1.8％(w/v)、1.9％(w/v)、2.1％(w/v)、2.2％(w/v)、2.3％(w/v)、2.4％(w/v)、2.5％(w/v)、2.6％(w/v)、2.7％(w/v)、2.8％(w/v)、或2.9％(w/v)。在进一步方面中，所述反应混合物可包括基于所述反应混合物的体积计的约3％(w/v)的聚季铵盐-10。
所述反应混合物可包括基于所述反应混合物的体积计的约0.1％(w/v)至约1.2％(w/v)的软骨素4-硫酸盐。在一个方面中，所述反应混合物中软骨素4-硫酸盐的范围的下限可为基于所述反应混合物的体积计的约0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、或0.3％(w/v)。在另一方面中，所述反应混合物中软骨素4-硫酸盐的范围的上限可为基于所述反应混合物的体积计的约0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1.0％(w/v)、1.1％(w/v)、或1.2％(w/v)。在一个进一步的方面中，所述反应混合物可包括基于所述反应混合物的体积计的约0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐。
所述反应混合物可包括基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的约1％(w/w)至约4％(w/w)的二乙烯基砜。在一个方面中，所述反应混合物中二乙烯基砜的范围的下限可为基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的约1％(w/w)、2％(w/w)、或3％(w/w)。在另一方面中，所述反应混合物中二乙烯基砜的范围的下限可为基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的约1.1％(w/w)、1.2％(w/w)、1.3％(w/w)、1.4％(w/w)、1.5％(w/w)、1.6％(w/w)、1.7％(w/w)、1.8％(w/w)、1.9％(w/w)、2.1％(w/w)、2.2％(w/w)、2.3％(w/w)、2.4％(w/w)、2.5％(w/w)、2.6％(w/w)、2.7％(w/w)、2.8％(w/w)、或2.9％(w/w)。在另一方面中，所述反应混合物中二乙烯基砜的范围的上限可为基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的约3.1％(w/w)、3.2％(w/w)、3.3％(w/w)、3.4％(w/w)、3.5％(w/w)、3.6％(w/w)、3.7％(w/w)、3.8％(w/w)、或3.9％(w/w)。在一个进一步的方面中，所述反应混合物可包括基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的约3％(w/w)的二乙烯基砜。
本公开内容的共价交联的水凝胶反应产物所呈现的凝胶含量可在约65％至约85％的范围内，如通过ASTM D2765-11,2006测定的。在一个方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物所呈现的凝胶含量的范围的上限可为约74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、或85％。在另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物所呈现的凝胶含量的范围的下限可为约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、或73％。在一个进一步的方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物可呈现出约74％的凝胶含量。
所述共价交联的水凝胶反应产物的pH值可在约5.5至约7.5的范围内。在另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物的pH值可在约6.0至约7.0的范围内。在还另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物的pH值可在约6.0至约6.5的范围内。在又一个进一步方面中，所述共价交联的反应产物的pH值可为约6.2。
所述共价交联的水凝胶反应产物可呈现出在约3300Pa至约33000Pa的范围内的在0.01s-1下的动态粘度，如通过针对流变特性的测定的ASTM D2084-95,1994，使用可得自美国弗吉尼亚州(Virginia)亚什兰(Ashland)的Anton Paar USA的Physica RheometerRheoplus/32测定的。在另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物可呈现出在约10000Pa至约23000Pa的范围内的在0.01s-1下的动态粘度。在还另一方面中，所述共价交联的水凝胶反应产物可呈现出在约15000Pa至约20000Pa的范围内的在0.01s-1下的动态粘度。在一个方面中，在0.01s-1下的动态粘度的范围的上限可为约20000Pa、21000Pa、22000Pa、23000Pa、24000,Pa、25000Pa、26000Pa、27000Pa、28000Pa、29000Pa、30000Pa、31000Pa、32000Pa、或33000Pa。在另一方面中，在0.01s-1下的动态粘度的范围的下限可为约3000Pa、4000Pa、5000Pa、6000Pa、7000Pa、8000Pa、9000Pa、10000Pa、11000Pa、12000Pa、13000Pa、14000Pa、或15000Pa。
本公开内容涵盖制造共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括制备多糖与葡糖胺多糖的以形成由静电和疏水性相互作用给出的最大稠度的水凝胶的比例的混合物。在一个方面中，所述混合物可包括基于所述反应混合物的体积计的约2％-4％(w/v)的所述聚阳离子和在0.2％-0.4％(w/v)之间的葡糖胺多糖。在另一方面中，关于所述聚阳离子，所述混合物可包括约10％重量。可以基于所述聚合物的初始的组合重量计的不同重量百分比向所述反应混合物添加交联剂二乙烯基砜。在一个方面中，可在基于聚合物聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％-4％(w/w)的范围内添加二乙烯基砜。
本公开内容涵盖制造包括共价交联的水凝胶反应产物的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物；(b)向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；(c)向所述碱性水性混合物添加在第三水溶液中的二乙烯基砜以形成反应混合物；(d)使在所述反应混合物中在预定时间期间发生共价交联反应以获得共价交联的中间水凝胶反应产物；(e)中和所述共价交联的中间水凝胶反应产物以形成经中和的共价交联的水凝胶反应产物；(f)将所述经中和的共价交联的水凝胶反应产物用包括约0.1％(w/v)的甘氨酸的甘氨酸-磷酸盐缓冲溶液洗涤以使未反应的二乙烯基砜结块(block)；(g)过滤经中和的共价交联的水凝胶反应产物和甘氨酸-磷酸盐缓冲溶液的混合物以除去未反应的二乙烯基砜；(h)将步骤(f)和(g)在多个循环中重复以形成经洗涤的、经过滤的、和经中和的共价交联的水凝胶反应产物；和(i)将所述经洗涤的、经过滤的、和经中和的共价交联的水凝胶反应产物的pH调节至适合于预期应用的预定范围的pH以形成共价交联的水凝胶反应产物。
在一个方面中，将所述反应混合物混合以容许交联反应的步骤(d)可在所述反应混合物具有约0℃至约25℃的温度范围的情况下进行。在另一方面中，预期用于形成共价交联的水凝胶反应产物。在一个方面中，将所述反应混合物混合以容许交联反应的步骤(d)可在所述反应混合物具有在约20℃至约25℃的温度范围内的温度的情况下进行。在一个进一步的方面中，步骤(d)期间所述反应混合物的温度范围的下限可为约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、或24℃。在一个进一步的方面中，步骤(d)期间所述反应混合物的温度范围的上限可为约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、或25℃。在又另一方面中，步骤(d)期间所述反应混合物的温度可为约23℃。在一个进一步的方面中，步骤(d)期间所述反应混合物的温度可为约4℃。所述制造包括共价交联的水凝胶反应产物的组合物的方法可在大气压下进行。在一个进一步的方面中，步骤(d)的所述预定时间段为至少12小时。在还另一方面中，步骤(d)的所述预定时间段在约10小时至约14小时的范围内。在另一方面中，在步骤(d)中可将所述反应混合物搅拌。
本公开内容涵盖包括共价交联的水凝胶反应产物的组合物和由以如下比例与阴离子型葡糖胺多糖共价交联的阳离子型多糖制造所述反应产物的方法：其可在一些实施方式中向所述水凝胶反应产物赋予比否则由通过非共价静电和/或疏水性相互作用形成的凝胶所呈现出的更高的稠度。
本公开内容所涵盖的包括共价交联的水凝胶反应产物的组合物的一些是通过在包括重量比为约10:1的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的反应混合物中进行共价交联反应的方法进行的。在使用这样的聚季铵盐-10对软骨素4-硫酸盐的比率的情况下，所得共价交联的水凝胶反应产物可在一些实施方式中呈现出如下水平的粘膜粘附性：其可使包括所述共价交联的水凝胶反应产物的所述组合物适合于某些生物医学应用。不受制于特定理论，所述共价交联的水凝胶反应产物的聚季铵盐-10衍生的部分可呈现出正电荷，所述正电荷能够与倾向于带负电荷的粘膜层相互作用。
将具有14.4-31kg/mol的分子量、具有不小于97％的纯度的软骨素4-硫酸盐以0.1％-0.4％(w/v)的浓度溶解在蒸馏水中以形成第一水溶液。将在1％(w/v)时呈现出粘度700-2100CP的粉末形式的商业聚季铵盐-10以2％-4％(w/v)的浓度溶解在蒸馏水中以形成第二水溶液。将所述第一和第二水溶液在剧烈搅拌下混合在一起以形成水性混合物。然后向所述水性混合物添加包括氢氧化钠(NaOH)的碱性溶液，从而导致具有50mM的NaOH浓度的碱性水性混合物。将包括溶解在蒸馏水中的二乙烯基砜的第三水溶液以基于水性混合物中含有的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％(w/w)至4％(w/w)的比例添加至所述碱性水性混合物，从而形成反应混合物。使在所述反应混合物中发生共价交联反应达预定时间段。在所述反应期间可搅拌所述反应混合物。
所述共价交联反应导致形成包括共价交联的水凝胶反应产物的中间反应产物，所述共价交联的水凝胶反应产物由于所述共价交联的水凝胶反应产物的粘度而倾向于防止搅拌机构移动。所述共价交联的水凝胶反应产物可为清亮的(clear)和/或半透明的和/或透明的。使如此形成的所述共价交联的水凝胶反应产物静置预定时间段(其可为至少12小时)，以使所述共价交联反应尽可能完全地发生。所述预定时间段可在约10小时至约14小时的范围内。在该预定时间段之后，将所述中间反应产物通过添加与所述反应混合物的体积相等的体积的50mM氯化氢(HCl)溶液而中和，并且容许中和约一小时。对所述经中和的中间反应产物进行提取并且用含有0.1％(w/v)的甘氨酸的磷酸盐缓冲剂进行对所述水凝胶反应产物的相继的洗涤程序，可每天约两次进行洗涤和通过过滤除去上清液的重复循环达至少一个星期。因此，洗涤和过滤步骤可在三十至五十次的范围内重复。可将所述经中和、经洗涤和经过滤的中间反应产物的pH调节至在约6.5至约7.0的范围内。可将所述包括共价交联的水凝胶反应产物的中间反应产物的温度保持在约4℃至约8℃的温度范围内，直至所述中间反应产物可被灭菌。所述共价交联的水凝胶反应产物可通过在高压釜循环期间暴露于蒸汽而被灭菌，所述高压釜循环在约120℃至约123℃的温度范围内在约15分钟至约20分钟的时间段内发生。
可将由本文中阐述的方法制造的共价交联的水凝胶反应产物冷冻干燥以从其除去基本上所有水并且随后在向其添加水至预定浓度的情况下再水合。此外，可将所述经冷冻干燥的和粉末状的共价交联的水凝胶反应产物在其它合适的溶剂中水合，所述溶剂包括与药物活性分子例如消炎剂、抗凝剂等组合的水性缓冲溶液。
经纯化的由包括3％(w/v)的聚季铵盐-10、0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和基于反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)的二乙烯基砜的反应混合物制造的共价交联的水凝胶反应产物的最终元素组成为约46.2％C、约10.5％H、约40.3％O、约1.6％N、和约1.4％S，如使用元素分析仪CHNSO Series II和EA 2400DataManager(两者均可得自美国马萨诸塞州(Massachusetts)波士顿(Boston)的PerkinElmer)、和来自美国马萨诸塞州米尔福德(Milford)的Unity Scientific的Autoanalyzer SmartChem200测定的。
本公开内容涵盖治疗方法，其包括施用本文中公开的包括生物相容性水凝胶的组合物。在一个方面中，治疗对象的关节体的方法包括向对象施用本文中公开的组合物的任意一种或多种。治疗关节体的方法可包括如下步骤：将包括由包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物制造的共价交联的水凝胶反应产物的组合物施用到所述关节体中。本公开内容还涵盖试剂盒，其包括本文中公开的组合物的一种或多种和可用于将所述组合物给予(给药至)对象的递送装置。所述递送装置可包括：注射器，单独地或者与针头组合；或者用于将本文中公开的组合物给予对象的其它合适的装置。
实施例
用于测定凝胶含量的一般程序
为了测定凝胶含量，依照“American Society for Testing and Materials,Standard Test Methods for Determination of Gel Content and Swell Ratio ofCross-linked Ethylene Plastics,ASTM D2765–11,2006”进行测试。
所进行的程序包括以下：将各样品用蒸馏水洗涤以分离未交联的级分。然后，将剩留的交联的并且因此不溶性的复合物(“凝胶”)在80℃下干燥3天，之后测定其净重量(M2)。不溶性残留物的质量除以所述复合物的所有组分的初始质量(M1)的比率产生了所述方法的度量和“凝胶含量”：
其中M1为所述复合物的所有组分的初始质量，并且M2为相同复合物在干燥过程之后的质量。
用于动态粘度和储能模量测量的一般程序
为了测定动态粘度和储能模量，依照“American Society for Testing andMaterials,Standard Test Methods for Determination of Rubber Property-Vulcanization Using Oscillating Disk Cure Meter,ASTM D2084–95,1994”进行测试。
所进行的程序包括以下：使用5cm锥板测量几何结构。在0.1Pa下在0.1–100rad s-1的频率范围内测定振荡剪切响应(G'或储能模量，和G”或损耗模量)。将样品一式三份在25℃下评价。测试条件在粘弹性性质的线性范围内。
实施例1：通过使用聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE电泳技术测定软骨素4-硫酸盐分子量(MW)。
使用在“Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian staining ofsulphated glycosaminoglycan oligosaccharides”，Mary K.Cowman，Mary F.Slahetka，Daniel M.Hittner，Jiyun Kim，Michael Forino和GeihanGadelrab.Biochem.J.(1984)(221,707-716)中描述的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有30％丙烯酰胺和0.8％NN'-亚甲基二丙烯酰胺的丙烯酰胺溶液并且保护其不受光并且将其在4℃下存储。将也在4℃下保存的pH 8.6的含有1.5M三(羟基甲基)氨基甲烷/氯化氢的浓缓冲剂用于凝胶隔离物。pH 6.8的0.5M三(羟基甲基)氨基甲烷/氯化氢的溶液用于浓缩器凝胶。对于聚合，将50μl和70μl的10％(w/v)过硫酸盐溶液(在用于隔离物凝胶时制备)的溶液用于浓缩器凝胶。此外，对于10ml量的凝胶溶液，添加10μl的浓NNN'N'-四亚甲基二胺(TEMED)溶液和100μl的10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)。在间隔开0.75cm的两玻璃板之间准备各自具有7cm长乘10cm宽的面积的凝胶。通过10齿
丙烯酸类梳形成各自1.5cm深且0.5cm宽的播种区域并且使其在使用之前在室温下过夜聚合。
为了运行电泳测试，将含有10μg和20μg的软骨素4-硫酸盐(来自浓溶液)的样品与1:4体积的由甘油、pH 6.8的0.5M三(羟基甲基)氨基甲烷/氯化氢缓冲剂、8％(w/v)十二烷基硫酸钠、和0.4％(w/v)的溴酚蓝组成的缓冲剂(4X样品缓冲剂)混合。使用低分子量蛋白质的样品作为标记物，并且将其置于单独的泳道中，并且将蛋白质和软骨素4-硫酸盐的混合样品置于另一线路中。用得自阿根廷布宜诺斯艾利斯(Buenos Aires)的Biotech LabS.R.L.的软骨素硫酸盐的参照样品进行相同的过程。
用于运行所述凝胶的缓冲剂为pH 8.3的0.1M三(羟基甲基)氨基甲烷和0.77M甘氨酸的1:4稀释液，然后向其添加0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠。将所述凝胶与电势源在65V下连接1小时，然后在110V下连接2小时。然后将所述凝胶用在2％乙酸中的阿尔新蓝的0.5％溶液染色45分钟，然后在2％乙酸中漂白15分钟。
然后进行用在50％甲醇、40％水、和10％乙酸中的
亮蓝溶液的第二次染色以将所述分子量标记物着色，并且最后将后者用10％乙酸和10％甲醇的溶液漂白。
图1显示对于具有样品加上标记物的两个泳道和具有另一浓度的样品的两个泳道所获得的廓线(profiles)。图1的第一条线显示BIO-
低分子量蛋白质标记物和10μg的软骨素4-硫酸盐。图1的第二条线显示BIO-
低分子量蛋白质标记物和10μg的参照软骨素硫酸盐。图1的第三条线显示20μg的软骨素4-硫酸盐，并且图1的第四条线显示20μg的参照软骨素硫酸盐。大体上，观察到，各带是宽的，从而证明在所分析的软骨素4-硫酸盐中的分散性。基于这些结果，相对于用作标准物的蛋白质标记物，所测试的软骨素4-硫酸盐的表观分子量在14.4和31.0kg/mol之间。
实施例2：聚季铵盐-10粘度的测定。
制备在蒸馏水中的聚季铵盐-10溶液(2％)，从其制得相应的稀释液以获得如下的最终浓度：0.5％(w/v)；1％(w/v)，和1.5％(w/v)。对于这些溶液，使用布鲁克菲尔德粘度计、椎板几何结构(CP52)在20℃下和以不同的旋转速度测定粘度。
表1显示由在不同旋转速度下测试的不同浓度获得的粘度值。
基于这些测试结果，在1％的浓度(w/v)和0.5rpm下的聚季铵盐-10样品具有2083cp的粘度。
实施例3：聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的制备，其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括3％(w/v)的聚季铵盐-10、0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和3％(w/w)(基于聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的总重量计)的二乙烯基砜。
将0.3克的聚季铵盐-10的样品溶解在7ml的蒸馏水中，并且将0.03克的软骨素4-硫酸盐的样品溶解在1.5ml的蒸馏水中。将两溶液在室温下在剧烈搅拌下混合5分钟以容许这两种聚合物之间的静电相互作用。然后添加1ml的0.5M NaOH溶液以达到50mM NaOH的最终浓度和合适的pH。向所述混合物添加330μl量的在蒸馏水中的3％(w/v)二乙烯基砜稀释液，然后添加170μl的蒸馏水以达到10ml的最终体积，从而获得相对于两种组合的聚合物的初始质量计的3％(w/w)的二乙烯基砜交联剂。将该组合的反应混合物剧烈搅拌约一分钟，之后可看到透明的三维水凝胶反应产物的形成。然后使所述反应混合物在4℃下继续反应至少12小时。将所形成的共价交联的水凝胶反应产物转移至10ml的50mM氯化氢溶液，并且使其静置一小时。此时之后，将所述共价交联的水凝胶反应产物用含有0.1％(w/v)的甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次以除去未反应的二乙烯基砜和将所述共价交联的水凝胶反应产物的pH调节至在6.5至7的范围内pH，其与所述共价交联的水凝胶反应产物可用于的生理条件的pH类似。在洗涤步骤之间，使浸没的共价交联的水凝胶反应产物在洗涤溶液中在4℃下静置。在一个星期期间进行所述共价交联的水凝胶反应产物的相继的洗涤。
表2显示用于制造所述共价交联的水凝胶反应产物的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的不同比率。
表2
表注释：
a聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐之间的重量比。
b二乙烯基砜交联剂相对于两种聚合物的总重量的重量百分比。
选择在使用浓度为3％(w/v)的聚季铵盐-10、0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和3％(w/w)(基于聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计)的二乙烯基砜情况下的共价交联的水凝胶反应产物来测试生物相容性和关节内植入。该共价交联的水凝胶反应产物是基于其流变性质选择的。
实施例4：所选择的在实施例3中制造的共价交联的水凝胶反应产物通过21号和27号的针头的可挤出性。
图2显示用亚甲基蓝(用于更好可视化)染色的所选择的共价交联的水凝胶反应产物在通过不同直径的针头(一个针头为21号并且另一个为27号)挤出之后的照片。将所述共价交联的水凝胶反应产物手动地通过两种针头挤出以模拟在关节内注入中的可能使用。观察到，所述共价交联的水凝胶反应产物在通过27号针头挤出时具有约1-2mm的粒度，和在通过21号针头挤出时具有约3-4mm的粒度。
实施例5：实施例3中制造的共价交联的水凝胶反应产物的流变学测试。
为了测定动态粘度和储能模量，依照“American Society for Testing andMaterials,Standard Test Methods for Determination of Rubber Property-Vulcanization Using Oscillating Disk Cure Meter,ASTM D2084–95,1994”根据上述的“用于动态粘度和储能模量测量的一般程序”进行测试。
在该测试中，对于聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜交联剂的交联反应的不同的共价交联的水凝胶反应产物，使用实施例3中描述的程序和组合，测定动态粘度和储能模量。还对于在不存在二乙烯基砜交联剂的情况下由聚合物聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的相同组合构成的对照样品的情况下测量这些相同的性质。进行与对照样品的比较以观察当进行共价交联反应时发生的流变性质的变化。将样品在用磷酸盐缓冲剂盐溶液洗涤之前进行测量。
表3显示，与没有共价交联反应的相同聚合物的组合相比，阳离子型聚合物与葡糖胺多糖的共价交联反应提供所得共价交联的水凝胶反应产物的动态粘度和储能模量两者的显著增加。
表3
表注释：
a没有交联的对照样品。百分比以(w/v)单位给出。
b太刚性的水凝胶。粘度和模量超过仪器的测量极限。
实施例6：在溶液中的聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物随着离子强度的稳定性。
该实施例使用在不同的氯化钠浓度下的浊度测量结果，描述了具有变化的离子强度的溶液对聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐的静电复合物以及聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的反应的相应的共价交联的水凝胶反应产物的稳定性的影响。未共价交联的复合物的摩尔比保持恒定并且等于1M:1.4M的聚季铵盐-10对软骨素4-硫酸盐的比率，其中氯化钠的浓度在0M和1M之间变化。共价交联的复合物的摩尔比也保持恒定并且等于1M:0.5M的聚季铵盐-10对软骨素4-硫酸盐的摩尔比，再一次地其中氯化钠的浓度在0M和1M之间变化。相对于所述交联复合物而言所述未交联复合物的浊度的变化示于图3中。可看出，所述共价交联的复合物(共价交联的水凝胶反应产物)的浊度未随着氯化钠浓度的变化而变化，而在未共价交联的复合物中，浊度降低并且在使用200mM氯化钠和以上的浓度的情况下，相互作用被完全抑制。不受理论制约，认为该结果是由于如下而发生的：在所述未交联复合物中，两种聚合物之间的静电相互作用因在溶液中存在由过量氯化钠(NaCl)产生的电荷而被弱化；而所述共价交联的复合物(共价交联的水凝胶反应产物)不被离子强度的提高影响并且其稠度保持不变。因此，可以得出结论，所述共价交联的水凝胶反应产物倾向于在具有提高的离子强度的溶液中是稳定的。
这些测试展现了，聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐之间占主导的相互作用是静电并且当含有聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的复合物与二乙烯基砜共价交联时，所得共价交联的水凝胶反应产物不被离子强度的变化所影响。实施例7：共价交联和非共价交联的复合物对于软骨素4-硫酸盐的添加而言的稳定性。
图4显示在不同的总正/负电荷比例下，静电结合的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的复合物相对于与二乙烯基砜共价交联的那些的浊度测量结果的变化。图4说明聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐的复合物在400nm处的浊度测量结果，其中一些复合物是共价交联的，如用空心圆所示的，和其它未共价交联，其用空心三角形显示，其中电荷摩尔比变化。在第一个和第三个循环中，在增加软骨素4-硫酸盐时将聚季铵盐-10保持恒定。而在第二个循环中，在增加聚季铵盐-10时将软骨素4-硫酸盐保持恒定。
对于未共价交联的复合物，观察到，一直到达到正电荷对负电荷的1M:1.4M的摩尔比，软骨素4-硫酸盐的添加都导致复合物的浊度提高，并且发生所述复合物的沉淀。不受理论制约，该结果可由于如下引起：在所述复合物中存在过量的负电荷，从而导致内部包藏有(occluded)季铵基团的结构的变化。软骨素4-硫酸盐的进一步添加产生聚集体的逐渐溶解，直至在正电荷对负电荷的1:6的摩尔比下观察到几乎完全溶解。
之后，通过添加渐增量的聚季铵盐-10和通过将软骨素4-硫酸盐的量保持恒定，研究第二个聚集–溶解循环。在此情况下，观察到，最大浊度出现在1:1的正电荷对负电荷摩尔比处。不受理论制约，该所得值可由于聚季铵盐-10的结构变化而引起，所述结构变化容许对所述聚合物的阳离子部位的更好的可接近性。
最后，对该样品进行第三个循环，在该循环中观察到相同的聚集和溶解现象。按照相同的程序，定性地测试七个循环以探查在第三个循环之后该现象的可逆性。所有这些结果揭示了阳离子–阴离子型聚电解质体系存在有能够通过添加聚阳离子或聚阴离子而在任一方向上发生的可逆的溶解–沉淀–溶解行为。
然而，当用聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的共价交联反应的复合物进行相同鉴定时，观察到所述复合物遍及所述范围相同的吸光度并且观察到所述复合物未沉淀并且未再溶解。因此，聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物呈现出比未共价交联的那些复合物更大的稳定性。
实施例8：凝胶含量的测定
为了测定凝胶含量，依照“American Society for Testing and Materials,Standard Test Methods for Determination of Gel Content and Swell Ratio ofCross-linked Ethylene Plastics,ASTM D2765–11,2006”根据以上描述的“用于测定凝胶含量的一般程序”进行测试。从表4中所示的那些选择6个样品。前三个样品具有固定浓度为1％(w/v)的聚季铵盐-10和0.1％(w/v)的软骨素4-硫酸盐，同时具有基于样品中的聚合物的组合重量计分别为1％(w/w)、3％(w/w)、和5％(w/w)的不同的初始二乙烯基砜浓度。接下来的三个样品具有3％(w/v)的聚季铵盐-10和0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、以及分别为1％(w/w)、3％(w/w)、和4％(w/w)的不同浓度的二乙烯基砜。
对于所选择样品获得的结果示于表4中：
表4：
表注释：
a摘自表2的样品组合。
b使用方程1进行计算。
实施例9：共价交联的水凝胶反应产物的温度稳定性测试
在该实施例中，在将共价交联的水凝胶反应产物在15分钟高压釜灭菌循环中在120℃下灭菌之后评价它们的稳定性。表5显示具有如表2中所示性质的样品在动态粘度、储能模量、和可挤出性方面的变化的百分比以及它们的制备，如在所制备的所有制备中详述的，包括3％(w/v)和4％(w/v)的聚季铵盐-10、0.3％(w/v)和0.4％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和(基于聚合物聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计)1％(w/w)和3％(w/w)的二乙烯基砜的交联的水凝胶反应产物呈现出最大稳定性。
表5
实施例10：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的细胞毒性测试。
使用ISO洗脱方法，对哺乳动物细胞培养物进行体外测试以检测潜在地细胞毒性效应。这些试验由NAMSA认证的实验室(位于美国俄亥俄州(Ohio)诺斯伍德(Northwood))进行。所分析的样品对应于表2的测试样品3-3。所述测试根据ISO 10993-5，“Biologicalevaluation of medical devices-Part 5:In vitro test for cytotoxicity”的指南进行。
所述测试由如下构成：在最低必需培养基(1X MEM)中在37℃下进行样品3-3的单次提取24小时。使用相同的方法对阴性、阳性和试剂对照物进行提取。将L-929小鼠成纤维细胞的单层以一式三份进行鉴定，所述一式三份各自投配有(dosed)所述提取物的每一个，然后在37℃下在CO2(5％)的存在下温育48小时。在温育之后，在显微镜下以100X放大倍数对所述单层进行考察以评价细胞特性和细胞裂解的百分比。
所述样品提取物未显示出导致细胞裂解或毒性的迹象。所述样品提取物符合该测试的要求，因为其呈现出低于等级2的等级(平均反应性)。
实施例11：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的基因毒性测试
对表2的样品3-3评价其在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株TA98、TA100、TA1535、和TA1537的组氨酸位点中或者在大肠杆菌(Eschirichia coli)菌株WP2uvrA的色氨酸位点中引起致突变性变化的可能性。该研究是在存在和不存在S9代谢激活剂两种情况下，基于ISO 10993-3,Biological evaluation of medical devices-Part3:“Test for genotoxicity,carcinogenicity and reproductive toxicity”和OECD 471(用于评价细菌中的化学品、回复突变测试的指南)进行的。这些试验由NAMSA认证的实验室(位于美国俄亥俄州(Ohio)诺斯伍德(Northwood))进行。
所述测试由如下构成：用二甲亚砜(DMSO)和在盐溶液中对样品3-3进行提取。将含有熔融琼脂的管与这五种测试菌株之一的培养物、连同DMSO或盐水提取物一起温育。添加等分试样量的无菌水或大鼠肝脏匀浆S9(代谢激活剂)。然后将混合物转移至三个皮氏培养皿。对于阴性对照物(仅载色剂提取物)和阳性对照物进行平行测试。对于各菌株，将所述样品的平均恢复菌落与阴性对照物的阴性对照物菌落的平均值比较。
在DMSO中和在盐水中的两种提取物都被认为对于测试的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98、TA100、TA1535、和TA1537以及对于测试的WP2uvrA的大肠杆菌菌株是非致突变性的。
实施例12：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的敏化作用测试。
在豚鼠最大化测试中通过真皮接触对表2的样品3-3评价其导致延迟敏化的可能性。该研究在NAMSA认证的实验室(位于美国俄亥俄州(Ohio)诺斯伍德(Northwood))中并且根据ISO 10993-10，“Biological evaluation of medical devices-Part 10:Dermalirritation and sensitization test”的要求进行。
所述测试由如下构成：用0.9％氯化钠USP的溶液和在芝麻油、NF中对样品3-3进行提取。将各提取物皮内注射，之后(对于每种提取物)将封闭型贴片放置到10只豚鼠中。以相同的方式注入所述提取载色剂，并且随后(对于每种提取物)将贴片放置至5只对照豚鼠。在恢复期之后，所述研究和对照动物接受另外的贴片与相应的提取物和对照载色剂。根据在除去贴片之后24和48小时之时观察到的真皮反应而对所有部位进行评分。
来自所述样品的提取物在豚鼠中未显示出对皮肤接触的延迟敏化的迹象。因此，所述样品不被认为是豚鼠最大化测试中的敏化剂。
实施例13：用于将聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的植入可视化的不同射线造影剂的评价。
测试不同的射线造影物质并且将其与聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物混合以评价它们在X-射线研究中的不透明性，以获得对于体内配制物的更好监测而言最佳的反衬(contrasting)配制物。所测试的射线造影物质为triyosom C(商业的三碘化有机化合物)、MnO2、和BaCl2。
图5显示与没有射线造影物质的水凝胶样品相比，对于各配制物获得的射线照片。具有最佳的辐射不透明性的配制物为水凝胶-triyosom(该图的泳道3)。经预填充的注射器的辐射不透明性：注射器(1)包括与由包括3％(w/v)聚季铵盐-10、0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述聚合物的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜的反应混合物制成的水凝胶混合的BaCl2；注射器(2)包括与由包括3％(w/v)聚季铵盐-10、0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述聚合物的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜的反应混合物制成的水凝胶混合的基于所述水凝胶的重量计的15％(w/w)MnO2；注射器(3)包括与由包括3％(w/v)聚季铵盐-10、0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述聚合物的重量计的3％(w/v)二乙烯基砜的反应混合物制成的水凝胶混合的基于所述水凝胶的总量计的20％(w/w)triyosom；和注射器(4)包括由包括3％(w/v)聚季铵盐-10、0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述聚合物的重量计的3％(w/v)二乙烯基砜的反应混合物制成的水凝胶。
实施例14：在将与triyosom混合的、聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物注入猪膝盖关节体中之后的放射学评价。
图6显示植入有如下的混合物的猪膝盖关节体的射线照片：基于水凝胶的重量计的40％(w/w)triyosom C，和由包括3％(w/v)的聚季铵盐-10、0.3％(w/v)的软骨素4-硫酸盐、和基于所述聚合物的组合重量计的3％(w/v)的二乙烯基砜的反应混合物制成的水凝胶。产生所述射线照片以检测在注入到关节内空间中之后所述水凝胶在关节体中的分布。在所述水凝胶的注入之后，活动膝盖以产生所述水凝胶在关节内空间中的均匀分布。
实施例15：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物在兔子膝盖中的植入，其中兔子膝盖呈现出诱发的骨关节炎。
将表2的样品3-3植入兔子中以评价对于膝盖中的骨关节炎的治疗而言所述物质的安全性。该研究在阿根廷圣菲省(Santa Fe)埃斯佩兰萨(Esperanza)的国立利特瑞尔大学(Universidad Nacional del Littoral)-CONICET的比较医学中心(Center forComparative Medicine)(CMC)的经认证实验室中进行。该研究包括使用通过将新西兰系兔子中的膝盖关节体中的前十字韧带横切而产生的骨关节炎模型进行安全性的评价。使用年轻的雄性和雌性，其中平均重量为雄性3±0.5kg并且雌性3.5±0.5kg。将两个实验组的18只动物设计为对于各组(9只雄性和9只雌性)而言，具有在3、6和12个月处的不同完成点。各测试的事务(transaction)在右膝盖中进行，并且左膝盖未被治疗以充当假手术对照物。在将十字韧带横切之后28天时，在组A中将0.3mL的样品3-3注入到两个膝盖中，并且在组B中将0.3mL的盐水(安慰剂)注入到两个膝盖中。
进行在开始之前、在外科手术之后28天时、以及3、6和12个月时的生物化学变量和血液学变量的研究和放射学研究。在外科手术之后3、6和12个月时进行安乐死和完整的尸体剖检。此外，进行植入和对照部位、腹股淋巴结、肝脏和脾脏的组织学研究。关节体的显微镜检查确定炎症性组分、新生血管、纤维化、坏死和被认为组织学上相关的任何发现的存在。
在进行所述测试之后，发现，未出现对如下的显著影响：性别，或者对重量差异的治疗。此外，在一些血液学变量中观察到与性别有关的效果，但是未发现可归因于治疗的差异。不存在可归因于所述治疗、或者性别、或者这两者的任何相互作用的生物化学变量的差异。另外，在关节囊的组织病理学说研究中，在各采样点处在各组的右膝盖和左膝盖之间在所分析的变量方面未检测到差异。然而，在各组之间比较在各膝盖中分析的变量揭示了与组A相比，在安慰剂组中在血管、成纤维细胞/纤维细胞和滑膜细胞的增殖方面的显著的倾向和差异。此外，在股骨的组织学分析中，在两个膝盖之间，不存在差异。基于所收集的信息，可得出结论，所述配制物是无害的，因为没有生物化学或血液学参数是与所述治疗相联系地被改变的，从而展现了在所使用剂量下体系的安全性。
实施例16：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物在兔子的具有诱发的骨关节炎的膝盖关节体中的植入以及与SYNVISC
(hylan G-F 20)的比较。
在阿根廷圣菲省(Santa Fe)埃斯佩兰萨(Esperanza)的国立利特瑞尔大学(Universidad Nacional del Littoral)-CONICET的比较医学中心(Center forComparative Medicine)(CMC)的经认证的实验室中进行在聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物(表2的样品3-3)和SYNVISC
(hylan G-F 20)之间的对比研究。该研究由如下构成：通过将新西兰系兔子中的膝盖关节体中的前十字韧带横切而产生的骨关节炎模型。使用年轻的雄性和雌性，其中平均重量为雄性3±0.5kg并且磁性3.5±0.5kg，将十二只动物(六只雄性和六只雌性)设计成具有在6和12个月处的不同完成点。事务是在各兔子的两个膝盖关节体中进行的，在横切之后28天时将0.3mL的样品3-3注入到右膝盖中并且将0.3mL的SYNVISC
(hylan G-F 20)注入到左膝盖关节体中。
进行在开始之前、在外科手术之后28天时、以及6和12个月时的生物化学变量和血液学变量的研究以及放射学研究。在外科手术之后6和12个月时进行安乐死和完整的尸体剖检。此外，将进行植入和对照部位、腹股淋巴结、肝脏和脾脏的组织学研究。关节体的显微镜检查确定炎症性组分、新生血管、纤维化、坏死以及被认为组织学上相关的任何发现的存在。
使用Yoshioka M，Coutts RD，Amiel D，Hacker SA，“Characterization of amodel of osteoarthritis in the rabbit knee.Osteoarthritis and Cartilage”(1996年6月；4(2):87-98)描述的印度墨水技术进行和分析软骨损伤的宏观研究。6个月时的终点未揭示显著的倾向或差异。不过，在终点12个月时，揭示了在软骨损伤方面的显著差异。对于植入有SYNVISC
(hylan G-F 20)的膝盖关节体观察到严重的损伤，而使用聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的膝盖关节体仅显示出轻微的软骨损伤。虽然不受制于理论，但是如下是可能的：该结果可归因于这两种材料之间的稳定性的差异。已知SYNVISC
(hylan G-F 20)一旦被植入，即具有6-8个月的稳定性。聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物看起来更稳定，并且因此看起来减缓了软骨损伤的进展。
股骨的组织病理学说评价显示出在右膝盖和左膝盖之间显著的差异。在注入有聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的右膝盖中观察到更少的损伤。
实施例17：尸体研究：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的注入和行为的测定和产物的可用性的研究。
将一定量的单独的表2的样品3-3以及与40％(v/v)的反衬剂triyosom C混合的另一量的样品3-3用于尸体研究中以将水凝胶向关节中的注入可视化并且进行所述产物的可用性。将所述水凝胶材料安装在1ml和10ml容积的聚碳酸酯注射器中并且模拟粘弹性补充疗法技术而注入到尸体标本的膝盖中。通过荧光检查法可视化和指引所述注入。该研究在阿根廷布宜诺斯艾利斯(Buenos Aires)的迈蒙尼德大学(Maimónides University)的外科解剖模拟器培训中心(Surgical Anatomy Training Center by Simulators)(CEAQUS)的经认证实验室中进行。
针对膝盖关节体注入所选择的途径为对于滑膜腔而言阻碍最少且入口最大的路径并且替代地，包括上外侧、上内侧、或前内侧/前外侧注入。膝盖关节体注入部位是根据对象的骨骼解剖而选择的并且在注入之前用可伸缩圆珠笔的笔尖标记。虽然如果在活的对象中进行的话，所述程序可包括使用18-20号针头除去任何滑膜液(泻出)，但是在尸体研究中，滑膜液的泻出不是必要的并且不进行。注入是使用标准技术和使用18-23号的针头进行的。通过荧光检查法跟踪注入的可视化。考虑避免水凝胶的关节外注入、注入到滑膜组织中、注入到脂肪垫或关节体囊中、或者血管内注入。
在所述注入之后，关节的俯屈(flexion)和弯曲在注入之后进行3-6次，以容许所述水凝胶分布到关节中。所述研究根据IEC 62366进行以评价试剂盒(填充有水凝胶的注射器和针头)的可用性。确定，可使用18-23号针头将所述水凝胶有效地手动注入到关节内空间中。当将关节弯曲时，未观察到所述水凝胶从关节囊泻出。
实施例18：通过差式扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)和pH测定来表征聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物。
将一个具有6ml的容积的注射器的水凝胶内容物冷冻干燥48小时。将含有未冷冻干燥的水凝胶的注射器定义为样品C，而将在另一注射器中的经冷冻干燥的水凝胶定义为样品D。将两样品在室温下在封闭容器中存储。
使用
TGA-50热重分析仪经由热重分析(TGA)进行样品的热行为的分析。在使用镍标准物(Curie温度)校准的情况下，将样品在氮气5.0的气氛中以10℃/分钟的速率从23℃的起始温度加热至600℃的最终温度。
图7显示在聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的分析中产生的温谱图。转变的起始温度或开始温度(To)是通过将转变之前和之后的斜坡外推而确定的。如图7中所示，在低于150℃的温度下，观察到与从水凝胶材料除去水有关的45％质量损失(To＝62.5℃)。从该温度至600℃，观察到与所述水凝胶材料的分解有关的热事件。样品C呈现出201.2℃的To以及49.4％的质量损失。对于样品C，在600℃下的总质量损失导致3.0％的残留物。
使用
Pyris 1量热计，经由差式扫描量热法(DSC)进行样品的量热法热分析。在使用印度标准校准和铝胶囊材料的情况下，使所述样品经历氮气气氛。使所述样品经历第一次加热循环，在该第一次加热循环中将它们以10℃/分钟的速率从-35℃的初始温度加热至200℃的最终温度。然后使所述样品经历以10℃/分钟的速率从200℃的初始温度回到-35℃的最终温度的冷却循环。然后使所述样品经历以10℃/分钟的速率从-35℃的初始温度到200℃的最终温度的第二次加热循环。
图8显示与样品C水凝胶和样品D经冷冻干燥的产物的加热/冷却/加热扫描对应的温谱图。图9显示样品D经冷冻干燥的产物的热响应的展开图。
在图8中，两样品均由于水的蒸发而在100℃附近呈现出吸热事件，但是对于样品C水凝胶而言显著得多。样品D中的水的损失指示通过氢键与大分子链强缔合的水的存在。通过该技术研究经冷冻干燥的样品D水凝胶，因为在样品C水凝胶中未观察到玻璃化转变温度(Tg)，这可能是因为大量的水掩盖了大分子的热事件。然而，对于样品D，可在29.9℃处观察到软化温度(Tg)、玻璃化转变温度)。如在图8和9两者中所示，各样品的冷却和第二次加热阶段未显示出任何转变的发生。
聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的样品呈现出质量损失的两个热事件，第一个与水损失有关，并且第二个由于所述材料在大于约150℃的温度附近处开始的降解引起的。样品C水凝胶为无定形的，并且对于经冷冻干燥的样品，仅可观察到玻璃化转变(Tg＝29.9℃)。
实施例19：聚季铵盐-10与软骨素4-硫酸盐以及二乙烯基砜的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物的pH值的测定。
使用Lutron Model 208pH计，经由pH测量法测试样品C水凝胶的pH。将所述pH计用商业缓冲溶液(pH＝4，Anedra，Batch 22426-2和pH＝7，Biopack，Lot 9352013)校准。在MILLI-
去离子水中在平衡条件下研究样品C。所述测量在25±2℃下一式三份地进行。MILLI-
去离子水的pH值为6.29，而对于样品C所获得的值为6.15±0.08的pH。因此，在所研究的条件下，所述水凝胶样品在水性介质的pH值方面未产生显著的变化。
在下文中，参照编号的条款[paragraphs]描述本公开内容的各个方面。
1.组合物，其包括：
包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTMD2765-11,2006测定的在65％至85％范围内的凝胶含量。
2.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在70％至80％范围内的凝胶含量。
3.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
4.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.1％(w/v)至1.2％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
5.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
6.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的1％(w/v)至4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
7.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
8.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％(w/w)至4％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
9.如条款7所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
10.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的重量计的10:1至10:3的重量比的范围内的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐。
11.如条款1所述的组合物，其进一步包括异丁基苯丙酸。
12.如条款1所述的组合物，其进一步包括2-[2-(2,6-二氯苯胺基)苯基]乙酸钠。
13.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在3000Pa至33000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
14.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在10000至24000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
15.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在15000至20000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
16.如条款1所述的组合物，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
17.制造如条款1所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物；
向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；
向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物；
使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；
中和所述中间反应产物；
用缓冲溶液洗涤所述中间反应产物；
过滤所述中间反应产物；和，
调节所述中间反应产物的pH以形成如权利要求1所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物。
18.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的0.6％(w/v)至8.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
19.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
20.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
21.如条款17所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的1.4％(w/v)至5.7％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
22.如条款17所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的3.7％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
23.如条款17所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
24.如条款17所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
25.如条款17所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2％(w/v)至4％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
26.如条款17所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
27.如条款17所述的方法，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
28.治疗对象的关节体的方法，其包括：
将如条款1所述的组合物注入到所述关节体中。
29.如条款28所述的方法，其中将如权利要求1所述的组合物以在1ml至10ml的范围内的量注入到所述关节体中。
30.用于治疗关节体的试剂盒，其包括：
如条款1所述的组合物，和用于将如权利要求1所述的组合物注入到关节体中的注射器。
31.如条款所述的试剂盒30，其进一步包括针头。
32.组合物，其包括：
包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜，其中在所述共价交联的水凝胶反应产物中软骨素4-硫酸盐、聚季铵盐-10、和二乙烯基砜共价交联，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
33.如条款32所述的组合物，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
34.制造如条款32所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，和其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10；
向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；
向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜；
使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；
中和所述中间反应产物以形成经中和的中间反应产物；
用缓冲溶液洗涤该经中和的中间反应产物以形成经洗涤的经中和的中间反应产物；
过滤该经洗涤的经中和的中间反应产物以形成经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物；和，
调节该经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物的pH以形成如权利要求32所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物。
35.治疗对象的关节体的方法，其包括：
将如条款32所述的组合物注入到所述关节体中。
36.用于治疗关节体的试剂盒，其包括：
如条款32所述的组合物，和用于将如权利要求32所述的组合物注入到关节体中的注射器。
在下文中，参照编号的条款描述本公开内容的各个方面。
1.组合物，其包括：
包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTMD2765-11,2006测定的在65％至85％范围内的凝胶含量。
2.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在70％至80％范围内的凝胶含量。
3.如条款1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
4.如条款1-3任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.1％(w/v)至1.2％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
5.如条款1-3任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
6.如条款1-5任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的1％(w/v)至4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
7.如条款1-5任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
8.如条款1-7任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％(w/w)至4％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
9.如条款1-7任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
10.如条款1-9任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的重量计的10:1至10:3的重量比的范围内的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐。
11.如条款1-10任一项所述的组合物，其进一步包括异丁基苯丙酸。
12.如条款1-11任一项所述的组合物，其进一步包括2-[2-(2,6-二氯苯胺基)苯基]乙酸钠。
13.如条款1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在3000Pa至33000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
14.如条款1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在10000至24000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
15.如条款1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在15000至20000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
16.如条款1-15任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
17.制造如条款1-16任一项所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物；
向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；
向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物；
使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；
中和所述中间反应产物；
用缓冲溶液洗涤所述中间反应产物；
过滤所述中间反应产物；和，
调节所述中间反应产物的pH以形成所述共价交联的水凝胶反应产物。
18.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的0.6％(w/v)至8.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
19.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
20.如条款17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
21.如条款17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的1.4％(w/v)至5.7％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
22.如条款17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的3.7％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
23.如条款17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
24.如条款17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
25.如条款17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2％(w/v)至4％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
26.如条款17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
27.如条款17-26任一项所述的方法，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
28.如条款1-16任一项所述的组合物，其用于骨关节炎的治疗。
29.如条款28所述的用途用组合物，其中所述组合物为通过注入到对象的关节体中而给予的形式。
30.如条款29所述的用途用组合物，其中所述组合物为通过以在1ml至10ml的范围内的量注入到关节体中而给予的形式。
31.试剂盒，其包括：
如条款1-16任一项所述的组合物，和用于将所述组合物注入到关节体中的注射器。
32.如条款31所述的试剂盒，其进一步包括针头。
33.组合物，其包括：
包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜，其中在所述共价交联的水凝胶反应产物中软骨素4-硫酸盐、聚季铵盐-10、和二乙烯基砜共价交联，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
34.如条款33所述的组合物，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
35.制造如条款33或34任一项所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐，和其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10；
向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；
向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜；
使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；
中和所述中间反应产物以形成经中和的中间反应产物；
用缓冲溶液洗涤该经中和的中间反应产物以形成经洗涤的经中和的中间反应产物；
过滤该经洗涤的经中和的中间反应产物以形成经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物；和，
调节该经过滤的经洗涤的经中和的中间反应产物的pH以形成所述共价交联的水凝胶反应产物。
36.如条款33或34任一项所述的组合物，其用于骨关节炎的治疗。
37.如条款36所述的用途用组合物，其中所述组合物为通过注入到对象的关节体中而给予的形式。
38.试剂盒，其包括：
如权利要求33或34所述的组合物，和用于将所述组合物注入到关节体中的注射器。
本领域技术人员将明晰，可对本文中阐述的组合物、水凝胶、水凝胶反应产物、制造方法、使用方法、试剂盒、和体系进行多种改动和变型并且所述改动和变型被本公开内容所考虑。
Claims (32)
1.组合物，其包括：
包括聚季铵盐-10、软骨素4-硫酸盐、和二乙烯基砜的反应混合物的交联反应的共价交联的水凝胶反应产物，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在65％至85％范围内的凝胶含量。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在70％至80％范围内的凝胶含量。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2765-11,2006测定的在72％至78％范围内的凝胶含量。
4.如权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.1％(w/v)至1.2％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
5.如权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的0.2％(w/v)至0.3％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的1％(w/v)至4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
7.如权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物的体积计的2％(w/v)至3％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
8.如权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的1％(w/w)至4％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
9.如权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的2％(w/w)至3％(w/w)的范围内的二乙烯基砜。
10.如权利要求1-9任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括在基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的重量计的10:1至10:3的重量比的范围内的聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐。
11.如权利要求1-10任一项所述的组合物，其进一步包括异丁基苯丙酸。
12.如权利要求1-11任一项所述的组合物，其进一步包括2-[2-(2,6-二氯苯胺基)苯基]乙酸钠。
13.如权利要求1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在3000Pa至33000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
14.如权利要求1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在10000至24000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
15.如权利要求1-12任一项所述的组合物，其中所述共价交联的水凝胶反应产物呈现出如通过ASTM D2084-95,1994测定的在15000至20000Pa的范围内的在0.01/s的剪切速率下的动态粘度。
16.如权利要求1-15任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
17.制造如权利要求1-16任一项所述的组合物的共价交联的水凝胶反应产物的方法，其包括：
将包括软骨素4-硫酸盐的第一水溶液与包括聚季铵盐-10的第二水溶液组合以形成水性混合物；
向所述水性混合物添加碱性溶液以形成碱性水性混合物；
向所述碱性水性混合物添加包括二乙烯基砜的第三水溶液以形成反应混合物；
使在所述反应混合物中发生共价交联反应以形成中间反应产物；
中和所述中间反应产物；
用缓冲溶液洗涤所述中间反应产物；
过滤所述中间反应产物；和，
调节所述中间反应产物的pH以形成所述共价交联的水凝胶反应产物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的0.6％(w/v)至8.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述第一水溶液包括在基于所述第一水溶液的体积计的1.6％(w/v)至2.0％(w/v)的范围内的软骨素4-硫酸盐。
21.如权利要求17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的1.4％(w/v)至5.7％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
22.如权利要求17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的3.7％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
23.如权利要求17-20任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括在基于所述第二水溶液的体积计的4.2％(w/v)至4.4％(w/v)的范围内的聚季铵盐-10。
24.如权利要求17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的1.2％(w/v)至4.8％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
25.如权利要求17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2％(w/v)至4％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
26.如权利要求17-23任一项所述的方法，其中所述第三水溶液包括在基于所述第三水溶液的体积计的2.8％(w/v)至3.2％(w/v)的范围内的二乙烯基砜。
27.如权利要求17-26任一项所述的方法，其中所述反应混合物包括基于所述反应混合物的体积计的3％(w/v)的聚季铵盐-10、基于所述反应混合物的体积计的0.3％(w/v)软骨素4-硫酸盐、和基于所述反应混合物中聚季铵盐-10和软骨素4-硫酸盐的组合重量计的3％(w/w)二乙烯基砜，和其中所述共价交联的水凝胶反应产物包括46.2重量％C、10.5重量％H、40.3重量％O、1.6重量％N、和1.4重量％S。
28.如权利要求1-16任一项所述的组合物，其用于骨关节炎的治疗。
29.如权利要求28所述的用途用组合物，其中所述组合物为通过注入到对象的关节体中而给予的形式。
30.如权利要求29所述的用途用组合物，其中所述组合物为通过以在1ml至10ml的范围内的量注入到所述关节体中而给予的形式。
31.试剂盒，其包括：
如权利要求1-16任一项所述的组合物，和用于将所述组合物注入到关节体中的注射器。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其进一步包括针头。
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