KR20220127250A - 인간화 항-당단백질 ib알파(gpibalpha) 항체 - Google Patents

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Abstract

다가 항-혈소판 당단백질 I(b)알파 항체는 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 본 개시는 당단백질 I(b)알파를 특이적으로 인식하고 Fc 부분이 결여되어 Fc 수용체와 상호작용하지 않는 인간화 항체를 제공한다. 인간화 항체는 혈소판 활성화 및 응집을 방지하고 혈전 크기/성장을 감소시키고 혈관 폐색을 방지할 수 있다. 이들 항체는 또한 혈소판-종양 세포 상호작용을 감소시키고 종양 전이를 감소시키는 데 매우 유용할 수 있다. 치료 용량에서, 인간화 항체는 혈소판 활성화를 유도하고, 혈소판 감소증을 유도하고/하거나 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여되어 있다.

Description

인간화 항-당단백질 IB 알파(GPIBALPHA) 항체
관련 출원에 대한 상호 참조 및 서열 목록 설명
본 출원은 2019년 12월 10일에 출원되고 그 전문이 본 명세서에 통합된 미국 가출원 제62/946,086호에 대한 우선권을 주장한다. 본 출원과 관련된 서열목록은 텍스트 형식으로 제공되며 본 명세서에 참조로 통합된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 PCT_-_Sequence_listing_as_filed이다. 텍스트 파일은 81.2 Ko이며, 2020년 12월 9일에 생성되었으며, 전자적으로 제출된 것이다.
기술 분야
본 개시는 혈소판 당단백질 I(b)α(GPIbα)를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 인간화 항체를 비롯하여 이를 포함하는 단백질 구축물, 및 이와 관련된 치료 용도에 관한 것이다.
배경
관상 동맥 또는 대뇌 동맥의 죽상경화성 파열 부위에서의 혈소판 부착 및 응집은 일반적으로 급성 혈전증에서 중요한 사건이다. 따라서, 항-혈소판 치료법은 심혈관 사망을 줄이는 핵심 치료 요법(regimens) 중 하나이며, (i) 아스피린과 같은 사이클로옥시게나제 억제제; (ii) 클로피도그렐, 프라수그렐 및 티카그렐러(ticagrelor)와 같은 혈소판 P2Y12 수용체 길항제; (iii) 압식시맙, 엡티피바타이드 및 티로피반과 같은 αIIbβ3 길항제; 및 (iv) 보라팍사(vorapaxar) 등과 같은 PAR1 길항제를 포함한다. 그러나 혈소판 기능의 느린 개시/약한/저조한 억제, 과도한 출혈 합병증, 혈소판감소증(thrombocytopenia) 및 예상치 못한 혈소판 활성화와 같은, 현재 항-혈소판 치료법의 한계는 치료적 발전을 주도하는 주요 관심사이다. 특히, 급성 허혈성 뇌졸중과 관련하여, 현재 항-혈전/혈전용해 약물의 두개내 출혈 및/또는 잠재적인 신경독성(예를 들어, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA))에 관한 위험을 비롯한, 정맥내 혈전 용해의 창(window)을 통과한 환자에 대한 위험 때문에, 이용가능한 치료가 없는 경우 치료가 매우 제한된다.
혈소판 GPIb-IX-V 복합체는 유망한 항-혈소판 표적으로 부상하였다. GPIb-IX-V 복합체는 특히 고전단에서 손상된 혈관벽으로의 혈소판 부착 및 전위를 개시하는 주요 혈소판 수용체이다. 내피하층(subendothelium)으로의 혈소판 부착/전위는 손상된 혈관 벽에 고착/고정된 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 GPIbα 서브유닛의 결합에 의해 매개된다. VWF는 활성화된 내피 세포와 혈소판에서 분비되는 다량체 접착 혈액 단백질이다. 그런 다음 GPIbα-VWF 결합은 트롬복산 A2 및 ADP와 같은 혈소판 아고니스트(agonists)의 방출을 유도하는 신호 전달 과정과 피브리노겐, VWF 등에 대한 αIIbβ3 결합에 의해 매개되는 혈소판 응집을 초래하는 혈소판 αIIbβ3 인테그린의 활성화를 촉발할 수 있다. 고전단 조건에서, GPIbα-VWF 상호작용은 벽 전단율이 10,000-40,000 s-1를 초과할 수 있는 혈류가 흐르는 동맥 협착 부위에서 폐색성 혈전(혈소판 부착 및 혈소판 응집(aggregation/agglutination) 둘 다)의 병리학적 성장에 필요한 반면, 저전단 조건(예컨대, 대부분의 지혈의 경우)에서, 혈소판 부착은 αIIbβ3-피브리노겐/피브린 및 α2β1/GPVI-콜라겐 상호작용 등에 의해 직접 매개될 수 있다. 그러므로, GPIbα의 약리학적 억제는 고전단에서 특별히 혈전증을 표적으로 하지 않는 다른 항혈소판 약물에 비해 전신 출혈의 위험을 낮추고 안전성을 향상시킬 수 있다. 또한 GPIbα는 급성 허혈성 뇌졸중과 같은, 혈전-염증 상태에서 백혈구 모집에 중요한 것으로 드러났다. 더욱이, 이전에 저산소 뇌 영역의 허혈-재관류(예를 들어, 혈전 용해 또는 혈전 절제술에 의한 것)는 GPIbα를 통해 혈소판의 전염증 기능을 증가시킬 수 있으며, 이는 혈전-염증성 신경 손상 및 경색증 성장을 더욱 촉진할 수 있다. 또한, GPIbα는 혈소판 및 거핵구에서만 독점적으로 발현되는 것으로 간주되었다. 따라서, 직접적인 혈소판 GPIbα 안타고니스트(antagonists)는 심장마비 및 뇌졸중과 같은 급성 혈전성 사건의 치료를 위한 효과적이고 안전한 항-혈소판 약물로 개발될 큰 잠재력을 가지고 있다.
특히, GPIbα-VWF 상호작용을 표적으로 하는 새로운 항-혈소판 전략은 후천성 혈전성 혈소판감소성 자반병(aTTP; acquired thrombotic thrombocytopenic purpura), 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy) 및 치료하지 않을 경우 사망률이 높은 생명을 위협하는 병태를 치료하는 데 효과적인 치료법으로 입증되었다. VWF의 다량체 크기를 절단/감소시키는 VWF-절단 프로테아제인 ADAMTS13(A 디스인테그린 및 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 메탈로프로테이나제, 구성원 13)에 대한 자가항체는 ADAMTS13 활성의 심각한 결핍을 초래한다. 이러한 초대형 VWF는 과접착성이므로 혈관에 혈소판(GPIbα)-VWF 미세혈전의 형성을 유발하며, 이는 말단-기관 허혈 및 경색, 낮은 혈소판 수 및 적혈구 파괴를 야기한다. 따라서, VWF와 혈소판 GPIbα 간의 상호작용을 차단하면 혈소판 수의 더 빠른 정상화를 달성하고 혈전색전증 사건을 감소시켜 급성 TTP의 발병을 방지할 수 있다.
VWF A1 도메인을 표적으로 하는 나노바디 카플라시주맙은 매일 PEX를 중단한 후 최소 30일 동안 혈장 교환(PEX) 및 면역억제와 함께, 급성 aTTP 에피소드를 경험하는 성인의 치료에 대해 승인되었다. 그러나, 출혈 관련 부작용은 카플라시주맙에서 더 흔했으며(65% 대 48%), 심각한 출혈 사건(11% 대 1%)도 마찬가지였다. 카플라시주맙의 또 다른 장벽은 이 약물의 막대한 비용이었다. 2020년 기준 카플라시주맙의 현재 가격은 ADAMTS13 활성이 회복될 때까지 연장된 치료의 가능성과 함께 마지막 혈장 교환 후 30일 동안 매일 투여를 권장하는 치료 요법으로 용량당 US$8,000 이상이었다. VWF가 활성화된 내피세포(endothelium)에서 지속적으로 방출되기 때문에, 인간에서 7-10일의 짧은 수명을 갖는, 상대적으로 안정적인 수준의 혈소판 상의 GPIbα는 TTP 치료를 위한 더 매력적이고/강력한 표적인 것으로 보인다.
특허 CN103263662는 백보사(Deinagkistrodon acutus) 뱀의 독에서 정제된 GPIbα-결합 뱀 C-형 렉틴(snaclec) 항-혈소판 트롬볼리신을 기술하고 있다. 항-혈소판 트롬볼리신은 출혈 시간이나 응고를 크게 변화시키지 않으면서 GPIb-VWF 상호작용을 차단함으로써 리스토세틴-유도된 인간 혈소판 응집 및 혈전증을 억제했다. 항-혈소판 트롬볼리신은 현재 후천성 혈전성 혈소판감소성 자반병 및 ST 분절 상승 심근경색증 환자에서 임상 II 상 시험중이다. 그러나, 외래 뱀 단백질은 약물을 중화시키고 치료 효능을 제거할 수 있는 항-약물 항체를 생성하는 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 항체는 신장이나 관절(관절염)을 손상시킬 수 있는 알레르기 반응 또는 면역 복합체 형성을 유발할 수 있다. 또한, 재투여의 필요성은 기억 면역 세포를 자극하여 이러한 면역 반응 및 면역 작용(immune reactions)을 증가시킬 수 있다.
미국 특허 제7,049,128호는 프롤린을 통해 인간 IgG1의 Fc 단편에 연결된 돌연변이 GPIbα N-말단 세포외 290개 아미노산(G233V 및 M239V)을 함유하는 가용성 키메라 단백질인, 재조합 GPG-290 또는 GPIb-290/2V-면역글로블린(Ig) 융합 폴리펩티드를 기술하고 있다. GPG-290은 VWF에 결합하기 위해 혈소판 GPIbα와 경쟁했으며, 야생형 GPIbα와 비교하여 VWF에 대한 친화도는 14배였다. 동물 모델에서 GPG-290은 용량 의존적으로 관상동맥 폐쇄까지의 시간을 연장하고, 50-100㎍/kg 범위의 용량에서 출혈 시간을 연장시키지 않으면서 혈소판 응집, 혈전증 및 재발성 관상 순환 혈류 감소를 억제했다. 그러나, 테스트된 더 높은 용량(500㎍/kg)은 출혈 시간의 3 내지 4배 증가를 유도했으며, 이는 알파-트롬빈을 지혈에 사용할 수 없도록 하는 높은 친화도로 알파-트롬빈에 결합하는 GPG-290 때문일 가능성이 있다.
미국 특허 제7,727,535호는 알파-트롬빈에 대한 제한된/낮은 친화도 결합을 나타내고, GPG-290와 대비하여 반복적 관상동맥 혈전증 억제(즉, 재발성 관상동맥 순환 혈류 감소 억제)에서, 그리고 Platelet Function Analyzer-100 (PFA-100)에 의해 평가된 꼬리 출혈 시간 연장시 및 ADP 폐쇄 시간 증가시 효능(potency)의 50% 감소를 나타내는, GPIb-290/2V/FFF-Ig 변이체 융합 단백질(Y276F, Y278F 및/또는 Y279F)을 추가로 기술하고 있다. 그러나, 이러한 GPIb-Ig 융합 단백질은 고분자량 키메라 단백질(~130kDa)이며, 주로 고전단 속도에서 내피하 고정된 VWF 또는 혈장 VWF를 표적으로 한다. 그러므로, 이러한 융합 단백질의 양과 접근성은 예측하기 어렵고 주입되어야 하는 제품의 양이 많다는 것이 잠재적인 제한이 될 수 있다. 또 다른 제약으로는 항-약물 항체 생성 위험이 있을 수 있다. GPIb-Ig 융합 단백질은 생체조작된 키메라 단백질이다. GPIbα 폴리펩타이드와 Fc 단편은 모두 인간 유전자에서 유래하여, 이들의 항원성은 최소화될 수 있지만, GPIbα 변이체 돌연변이와 GPIbα 및 Fc 부분 사이의 조인트 영역은 면역 반응을 유도할 수 있는 네오에피토프(neoepitopes)를 생성할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 항-약물 항체 생산을 유도하는 일부 형태적 네오에피토프를 생성할 수 있다.
인간 GPIbα(항-GPIbα mAb)에 대한 중화 모노클로날 항체도 당업계에 기술되어 있다. 그러나, 현재까지 이용가능한 대다수의 항-GPIbα mAb는 뮤린 기원이며, 따라서 임상 사용에서 인간 항-마우스 반응을 유발할 수 있다. 또한, 온전한(intact) 항-GPIbα mAb는 종종 혈소판 활성화를 유발하는데, 이는 온전한 mAb의 결합이 혈소판 GPIbα-매개 신호 전달을 유도하여, 예기치 않게 혈소판 응집 및 혈전증을 악화시킬 수 있음에 기인할 수 있다. 또한, 혈소판에 결합하는 온전한 항-GPIbα mAb는 Fc 의존적 및 Fc 비의존적 혈소판 제거를 모두 촉발하여, 혈소판 감소증(즉, 적은 혈소판 수)을 야기할 수 있다. 그러므로, 온전한 항-GPIbα mAb는 매우 제한된 치료 잠재력을 나타낸다.
CN102988983은 시험관 내에서 용량 의존적 방식으로 리스토세틴-유도 혈소판 응집을 억제하는, 인간 GPIbα에 대한 키메라 mAb인 키메라 항체 chSZ2의 Fab 단편을 기술하고 있다. 그러나, 마우스 항체의 가변영역은 그대로 유지하고 불변영역은 인간의 것으로 대체한 키메라 항체이기 때문에, 면역원성은 여전히 주요 관심사이다. 중요하게도, 혈전성 질환을 예방/치료하기 위한 chSZ2의 생체내(in vivo) 기능은 당업계에 잘 알려진 다른 동물 종의 GPIbα를 인식하지 못할 수 있기 때문에 동물 모델의 제약으로 인해 입증된 적이 없다.
미국 특허 제7,332,162호는 정제된 인간 GPIbα에 대해 생성된 뮤린 mAb인 인간화 6B4(h6B4-Fab)의 또 다른 Fab 단편을 기술하고 있다. h6B4-Fab은 개코원숭이(baboons)에서 협착된 대퇴 동맥의 순환 흐름 감소를 줄이거나 완전히 폐지시켰다. 그러나 h6B4-Fab의 항혈전 효과는 출혈 시간의 연장을 동반하였다. 더욱이, 이들 항-GPIbα 항체 및 이에 상응하는 Fab 단편은 마우스 GPIbα를 인식할 수 없는(마우스와 인간 GPIbα는 상당한 정도의 상동성을 가지고 있기 때문임) 통상적인 기술(즉, 인간 GPIbα에 의해 면역화됨)을 사용하여 야생형 마우스에서 생성되었으며, 인간 GPIbα에는 존재하고 마우스 GPIbα에는 없는 에피토프에 대해 생산된 항체의 레퍼토리는 제한적이다. 따라서, 이러한 mAb는 중요한 전임상 약리학, 독성학 및 약동학 연구를 위해 설치류 또는 기타 동물 종에서 특성화되고 평가될 수 없다. h6B4-Fab의 전구체인 mAb 6B4가 혈소판 활성화 및 심각한 혈소판감소증을 분명히 유발할 수 있기 때문에, h6B4-Fab이 혈소판 활성화를 유발할 수 있는지 여부도 관심사이다.
따라서, 혈소판 활성화, 혈소판 파괴, 혈소판감소증뿐 아니라, 심각한 출혈 합병증을 일으키지 않는 혈소판 GPIb-IX-V 복합체를 표적으로 하는 개선된 치료제가 필요하다.
간단한 요약
본 개시는 당단백질 I(b)α(GPIbα)를 특이적으로 인식하는 인간화 항체 및 이를 포함하는 단백질 구축물(construct) 뿐만 아니라 이와 관련된 치료적 용도에 관한 것이다. 인간화 항체는 혈소판 활성화, 응집, 혈전 성장(특히 고전단에서)을 방지할 수 있고, 혈소판을 활성화하는 활성이 결여되어 있고(예를 들어, 혈소판을 활성화하지 않음), 혈소판감소증을 유도하는 활성이 결여되어 있고/있거나, 치료적 용량에서, 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여되어 있다.
제1 측면에서, 본 개시는 당단백질 I(b)α(GPIbα)를 특이적으로 인식하는 인간화 항체를 제공한다. 인간화 항체는 Fc 수용체 모이어티가 결여되어 있다. 인간화 항체는 혈소판 활성화, 응집 및/또는 혈전 성장을 방지할 수 있으며; 혈소판을 활성화하는 활성이 결여되어 있고; 혈소판감소증을 유도하는 활성이 결여되어 있고/있거나, 치료 용량에서 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 인간화 항체는 인간 GPIbα, 마우스 GPIbα, 개 GPIbα, 래트 GPIbα, 토끼 GPIbα 및/또는 원숭이 GPIbα를 인식할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 항체 단편이다. 일 예에서, 항체는 F(ab)2 단편일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab 항체 단편일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 항체 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv)일 수 있다. 한 실시형태에서, 인간화 항체는 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 중쇄는 GFTFSSFAMS(서열번호: 37)의 아미노산 서열을 갖는 제1 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; SITSAGTPYYPDSVLG(서열번호: 38)의 아미노산 서열을 갖는 제2 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및/또는 SRGYEDYFDY(서열번호: 39)의 아미노산 서열을 갖는 제3 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편. 또 다른 추가 실시형태에서, 중쇄는 인간 IgG1 항체의 CH1 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 서열번호: 40, 47, 54 또는 61의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는다. 한 실시형태에서, 중쇄는 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체는 경쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 경쇄는 KSSQSLLNSRNQKNYLA(서열번호: 65)의 아미노산 서열을 갖는 제1 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; FTSTRES(서열번호: 66)의 아미노산 서열을 갖는 제2 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및/또는 QQHYSSPWT(서열번호: 67)의 아미노산 서열을 갖는 제3 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쇄는 인간 IgG1 항체의 카파 쇄 C 영역을 추가로 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 카파 쇄 C 영역은 서열번호: 68, 75, 82 또는 89의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는다. 추가 실시형태에서, 경쇄는 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 또는 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는다.
제2 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 인간화 항체 및 담체 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다.
제3 양태에서, 본 개시는 (i) 본 명세서에 기술된 인간화 항체 또는 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 및 (ii) 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 양태에서, 본 개시는 혈소판에 존재하는 당단백질 I(b)α(GPIbα)와 GPIbα 리간드(예를 들어, 폰 빌레브란트 인자(VWF), 트롬빈, 키니노겐, P-셀렉틴, 트롬보스폰딘 등) 간의 상호작용을 방지 또는 제한하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기술된 인간화 항체, 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물을 혈소판과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혈소판 활성화를 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 한 실시형태에서, GPIbα 리간드는 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및/또는 트롬빈이다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 GPIbα 리간드가 혈소판과 접촉되기 전에, 접촉과 동시에 또는 접촉된 후에 혈소판과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체내(in vivo) 상호작용을 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 형성 또는 성장을 방지하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 크기 또는 혈전의 수를 감소시키기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 혈전의 존재, 위치 및/또는 크기를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 병리학적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura), 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증(atherothrombosis), 말초혈관 질환, 심부정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관성 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 감소 또는 제한하기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 종양 전이는 간 종양 전이이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 대상체에서 종양 전이의 존재, 위치 및/또는 크기를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
제5 양태에서, 본 개시는 혈소판에 존재하는 당단백질 I(b)α(GPIbα)와 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및/또는 트롬빈 및 기타 GPIbα 리간드 간의 상호작용을 방지하거나 제한하기 위해 본 명세서에 기술된 인간화 항체, 본 명세서에 기술된 키메라 단백질을 사용하는 것을 제공한다. 본 개시는 또한 혈소판에 존재하는 당단백질 I(b)α(GPIbα)와 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및/또는 트롬빈 사이의 상호작용을 방지 또는 제한하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 인간화 항체, 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물을 사용하는 것을 제공한다. 접촉 단계는 낮거나 고전단 속도에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 혈소판 활성화를 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 VWF 및/또는 트롬빈 뿐만 아니라 다른 GPIbα 리간드가 혈소판과 접촉하기 전, 동시에 또는 후에 혈소판과 접촉하기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체내(in vivo) 상호작용을 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 형성 또는 성장을 방지하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 크기 또는 혈전의 수를 감소시키기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 혈전의 존재, 위치 및/또는 크기는 대상체에서 미리 결정되었다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 병리학적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관성 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 감소 또는 제한하기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 종양 전이는 간 종양 전이이다. 또 다른 실시형태에서, 종양 전이의 존재, 위치 및/또는 크기는 대상체에서 이전에 결정된 적이 있다.
제6 양태에서, 본 개시는 혈소판에 존재하는 당단백질 I(b)α(GPIbα)와 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및/또는 트롬빈 사이의 상호작용을 방지하거나 제한하기 위한 본 명세서에 기술된 인간화 항체, 본 명세서에 기술된 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 혈소판 활성화를 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 VWF 및/또는 트롬빈 뿐만 아니라 다른 GPIbα 리간드가 혈소판과 접촉하기 전, 동시에 또는 후에 혈소판과 접촉하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 낮은 또는 고전단 속도로 혈소판과 접촉하기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체내 상호작용을 방지하거나 제한하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 형성 또는 성장을 방지하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈전의 크기 또는 혈전의 수를 감소시키기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 혈전의 존재, 위치 및/또는 크기는 대상체에서 미리 결정되었다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 병리학적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관성 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 및 모노클로날 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 감소 또는 제한하기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 종양 전이는 간 종양 전이이다. 또 다른 실시형태에서, 종양 전이의 존재, 위치 및/또는 크기는 대상체에서 이전에 결정된 적이 있다.
본 발명의 특성을 일반적으로 설명하였으므로, 이제 본 발명의 바람직한 실시형태를 예시로서 보여주는 첨부 도면을 참조할 것이다.
도 1은 비-환원 조건하의 상청액에서 인간화 Fab의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 중쇄 및 경쇄의 다양한 조합이 겔 위에 제시되어 있다. 분자량 래더(KDa 단위)는 왼쪽에 나타나있다. 화살표는 인간화된 Fab를 가리킨다. 대조군으로 소혈청알부민(BSA)을 사용하였다.
도 2는 비-환원 조건에서 인간화 Fab의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 약 20 μL의 상청액을 각 레인에 로딩하였다. 분자량 래더(KDa 단위)는 왼쪽에 나타나 있다. 중쇄 전용(HCAb) 항체를 대조군으로 사용하였다.
도 3A 내지 H는 (도 3A) VH1 및 VL2 쇄, (도 3B) VH1 및 VL3 쇄, (도 3C) VH2 및 VL1 쇄, (도 3D) VH3 및 VL2 쇄, (도 3E) VH3 및 VL3 쇄, (도 3F) VH4 및 VL1 쇄, (도 3G) VH4 및 VL2 사슬 및 (도 3H) VH4 및 VL3 쇄를 포함하는 정제된 Fab에 대한 비-환원("N"으로 표시) 및 환원 조건("R"으로 표시) 하에서 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 4A 및 B는 인간화 Fab H001 내지 H008이 (도 4A) 야생형 마우스 혈소판에 결합하지만 (도 4B) GPIbα-/- 마우스 혈소판(5 ㎍/㎖)에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 도 4b에 표시된 "*"는 대조군 신호를 나타낸다.
도 5A 내지 E는 정제된 Fab H001(▲) 및 H002(▼)가 (도 5A) 마우스, (도 5B) 개, (도 5C) 인간, (도 5D) 래트 및 (도 5E) 토끼 혈소판에 결합함을 나타낸다. 혈소판에 결합하는 인간화 Fab를 유세포분석기(flow cytometry) 분석에 의해 시험관내에서(in vitro) 테스트하였다.
도 6은 정제된 Fab H001 및 H002가 원숭이 혈소판에 결합하는 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 7은 정제된 Fab H001 항체가 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에서 재조합 GPIbα에 결합함을 보여준다. (도 7A) 500, 100, 50 및 10 nM의 H001 25 μL 주입의 SPR 데이터를 동역학 결합 모델에 핏팅(fitting)시켰으며 다음을 생성했다: ka(결합 속도(on rate)) = 2.61 x 107 s-1; kd(해리 속도(off rate)) = 1.1 x 10-1 s-1; 및 Kd(해리 또는 결합 상수) = 4.4 nM. (도 7B) 리간드 농도에 대해 플롯팅된 500, 100, 50 및 10 nM의 정제된 Fab H001 25 ㎕ 주입의 SPR 반응에 대한 용량 반응 곡선. 곡선을 1-자리(one-site) 리간드 결합 모델에 핏팅시켰으며 핏트(fit) R2 = 0.9929 및 Kd = 8.0 ± 2.1 nM을 생성하였다.
도 8A 내지 D는 정제된 (도 8A) Fab H001, (도 8B) H002, (도 8C) H005 및 (도 8D) H008이 혈소판-풍부 혈장에서 혈소판 활성화를 유도하지 않았음을 나타내는 표준 응집측정(aggregometry) 자취(traces)를 나타낸다.
도 9A 내지 D는 정제된 (도 9A 및 9D) Fab H001 및 (도 9B, 9C 및 9D) H002가 리스토세틴(A, B 및 D) 또는 저용량 트롬빈(C)에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제시켰음을 나타내는 표준 응집측정 자취를 나타낸다. 혈소판은 건강한 지원자(A 내지 C) 또는 말초혈관 질환이 있는 환자(D)로부터 얻었다.
도 10A 내지 D는 인간화 Fab H001(도 10A 및 10B) 및 H002(도 10C 및 10D) 항체가 저전단 속도(300 s-, 도 10A 및 10C) 및 고전단 속도(1800 s-, 도 10b 및 10d) 조건 둘 다에서 인간 전혈로부터의 혈전 형성을 억제함을 보여준다. (도 10A) 저전단(300초) 조건에서 대조군 PBS 완충액(상단 패널) 및 인간화 Fab H001 항체(5㎍/㎖, 하단 패널)로 처리한, 헤파린 처치된 인간 전혈을 1분, 2분 및 3분 동안 관류한 후 혈소판 혈전 형성을 보여주는 대표적인 사진. (도 10B) 고전단(1800s-) 조건에서 대조군 PBS 완충액(상부 패널) 및 인간화 Fab H001 항체(2.5 ㎍/㎖, 중간 패널 및 5 ㎍/㎖, 하부 패널)로 처리한, 헤파린 처치된 인간 전혈을 1분, 2분 및 3분 동안 관류한 후 혈소판 혈전 형성을 나타내는 대표적인 사진. (도 10C) 저전단(300 s-) 조건에서 대조군 PBS 완충액(상단 패널) 및 인간화 Fab H002 항체(5 ㎍/㎖, 하단 패널)로 처리한, 헤파린 처치된 인간 전혈을 1분, 2분 및 3분 동안 관류한 후 혈소판 혈전 형성을 나타내는 대표적인 사진. (도 10D) 고전단(1800 s-) 조건에서 대조군 PBS 완충액(상부 패널) 및 인간화 Fab H002 항체(2.5 ㎍/㎖, 중간 패널 및 5 ㎍/㎖, 하부 패널)로 처리한, 헤파린 처치된 인간 전혈을 1분, 2분 및 3분 동안 관류한 후 혈소판 혈전 형성을 나타내는 대표적인 사진.
도 11A 및 B는 인간화 Fab H001 및 H002 항체가 생체내에서(in vivo) FeCl3-유도된 장간막 세동맥 혈전증 모델에서 혈관 폐색 시간을 연장시킴을 보여준다. (도 11A) 항체 또는 사용된 용량의 기능에서 폐색까지의 시간(분)을 보여주는 히스토그램. (도 11B) FeCl3에 의해 유발된 혈관 손상 후 표시된 상이한 시점에서의 대조군(상단 패널), 인간화 Fab H001 항체(5 ㎍/마우스, 중간 패널), 인간화 Fab H002 항체(5 ㎍/마우스, 하단 패널)로 처리한 세동맥의 대표적인 사진. * P<0.05, ** P<0.01.
도 12A 내지 C는 인간화 Fab H001 및 H002 항체가 생체내에서(in vivo) 레이저-유도된 크레마스터 세동맥 혈전증 모델에서 혈전 형성을 억제함을 보여준다. (도 12A) 동물이 대조군 처리(상부) 또는 H001 항체(하부, 5 ㎍의 용량)를 제공받았을 때 레이저 손상 시 시간의 함수로 혈소판 평균 형광 강도(MFI; 그림자 부분은 SD로 표시)를 보여주는 히스토그램. (도 12B) 동물이 대조군 처리(상부) 또는 H002 항체(하부, 5 ㎍의 용량)를 받았을 때 레이저 손상 시 시간의 함수로 혈소판 평균 형광 강도(MFI)를 보여주는 히스토그램. (도 12C) 레이저 손상 시 시간에 따른 혈소판 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 히스토그램. 동물은 손상 24시간 전에 대조군 처리(상단) 또는 H002 항체(하단, 10 ㎍의 용량)를 제공받았다.
도 13A 내지 C는 주입된 인간화 Fab H001이 생체내에서(in vivo) 혈소판에 결합할 수 있지만, P-셀렉틴 또는 포스파티딜세린(PS)의 발현을 증가시키지 않았음을 보여준다. 결과는 (도 13A) 혈소판, (도 13B) P-셀렉틴, 및 (도 13C) 포스파티딜세린에 대한 유세포 분석 결과로 나타낸다.
도 14A 및 B는 인간화 Fab H001 및 H002 항체가 생체내 FeCl3-유도 경동맥 혈전증 모델에서 혈관 폐색을 방지하거나 연장하였음을 보여준다. (도 14A) 동물이 손상 전 5분에 대조군 처리(상단 패널), 또는 Fab H001 항체(중간 패널, 10 ㎍의 용량) 처리, 또는 Fab H002 항체(하단 패널, 10 ㎍의 용량) 처치를 받았을 때 마우스의 경동맥류(㎖/min)를 나타내는 대표적인 사진. 화살표는 혈관 폐색 시간을 나타낸다. (도 14B) 항체 또는 사용된 용량의 함수로 혈관 폐색까지의 시간(분 단위)을 보여주는 히스토그램. * P<0.05, # P<0.05, ** P<0.01.
도 15A 내지 C는 인간화 Fab H001 및 H002가 대뇌 허혈 및 재관류 손상 마우스 모델(일시적 중간 대뇌 동맥 폐색(tMCAO) 모델)에서 뇌내 출혈의 위험을 증가시키지 않으면서 허혈성 뇌의 경색 크기를 극적으로 감소시켰음을 보여준다. (도 15A) tMCAO 유도 직후에 사용된 항체 또는 용량의 함수로 허혈성 뇌경색 영역을 나타낸 히스토그램. (도 15B) tMCAO 1시간 후 인간화 Fab H002(100 ㎍의 용량) 처리의 함수로 허혈성 뇌경색 영역을 나타내는 히스토그램. (도 15C) tMCAO 직후, 샴 그룹(필라멘트 삽입 없음), 또는 PBS 대조군(200 ㎕)으로 처치된 대조군에서, 또는 각각 인간화 Fab H001 항체(100 ㎍/마우스) 또는 H002 항체(100 ㎍/마우스 및 50 ㎍/마우스)로 처치된 처치군에서 tMCAO 유도 24시간 후 전체 뇌에서 절단된 복수의 2mm-두께 관상 뇌 절편의 대표적인 사진. 흰색 영역은 경색 뇌를 나타낸다. * P<0.05, ** P<0.01.
도 16A 내지 B는 인간화 Fab H001 또는 인간 알부민과 융합된 인간화 C100-scFv(C100-scFv-HSA)을 사용한 ADAMTS13-/- 마우스의 예방적 치료가 TTP의 마우스 모델에서 이오노포어-유발된(ionophore-provoked) VWF-매개 미세혈관 혈전증을 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다. (도 16A) H001 또는 C100-scFv-HSA 처치가 있거나 없는 ADAMTS13-/- 마우스에서 혈소판 혈전 축적을 보여주는 대표적인 사진. ADAMTS13-/- 마우스에 동일한 유전자형의 마우스로부터의 형광 표지된 혈소판을 주입하고, 이후 이들의 장간막 혈관을 노출시키고 칼슘 이오노포어로 처리하여 VWF 분비를 유도했다. 혈관 내 혈소판 축적을 현미경으로 모니터링했다. ADAMTS13-/- 마우스(대조군)에 칼슘 이오노포어를 적용한 후 또는 H001 또는 C100-scFv-HSA를 예방적으로 처치한 후 표시된 시간에 촬영한 연속 이미지. (도 16B) TTP의 마우스 모델에서 이오노포어-유발된 ULVWF-매개 미세혈관 혈전증에서 색전의 수(직경 20 ㎛보다 큰 혈소판 혈전)를 보여주는 히스토그램. (도 16C) 항체 또는 사용된 용량의 함수로 정상적인 혈류를 회복하는 데 걸리는 시간을 나타낸 히스토그램. * P<0.05, ** P<0.01.
도 17은 인간화 Fab H001 및 H002 항체가 혈소판 감소증을 유도하지 않았음을 보여준다. 결과는 시간(시간) 및 항체 처리의 함수로 혈소판 수의 변화(%)로 제시된다: IVIG(○), NIT-B1(◆), H001(△) 또는 H002(▼).
도 18은 인간화 Fab H001 및 H002 항체가 출혈 시간을 연장시키지 않은 반면, 뮤린 NIT-B는 출혈 시간을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여준다. 결과는 (X 축 아래에 표시된 대로) 치료 및 용량의 함수로 출혈 시간(분 단위)으로 제시된다.
도 19A 내지 D는 인간화 C100-scFv 및 인간 알부민(C100-scFv-HSA)과 융합된 인간화 C100-scFv가 (도 19A) 야생형 마우스 혈소판에 결합하지만, (도 19B) GPIbα-/- 마우스 혈소판에는 결합하지 않을 뿐 아니라, (도 19C) 지시된 용량에서 인간 혈소판에 결합한다는 것을 보여준다. 도 19A 및 도 19C에 나타낸 "*"는 대조군 신호를 나타낸다.
도 20은 인간화 C100-scFv가 리스토세틴에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제함을 나타내는 표준 응집측정 자취를 보여준다.
도 21은 인간화 C100-scFv가 혈소판-풍부 혈장에서 혈소판 활성화를 유도하지 않았음을 나타내는 표준 응집측정 자취를 보여준다.
도 22는 인간화 C100-scFv-HSA가 고전단(1200 s-) 속도 조건에서 인간 전혈로부터 혈전 형성을 억제했음을 보여준다. 헤파린-처치된 인간 전혈을 1, 2, 3분 동안 관류시킨 후 혈소판 혈전 형성을 보여주는 대표적인 사진이며, 상기 전혈은 고전단(1200 s-) 조건에서 대조군 PBS 완충액(상단 패널) 및 인간화 C100-scFv-HSA(10 ㎍/㎖, 바닥 패널)로 처치되었다.
항-GPIbα 항체
미국 특허 제8,323,652호는 GPIbα-결핍 BALB/c 마우스를 야생형 혈소판으로 면역화하여 생성된 뮤린 NIT mAb(NIT-A1, NIT-B1 및 NIT-F1)가 인간과 마우스의 GPIbα 둘 다를 특이적으로 인식할 수 있었고, 리스토세틴-유도된 혈소판 응집과 혈전 형성을 현저하게 억제했음을 기술하고 있다. 그러나, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이러한 온전한 mAb는 심각한 혈소판 감소증을 유발할 수 있다. 또한, 이들은 마우스 기원이기 때문에, 인간에서 면역원성이다.
본 개시는 GPIbα 폴리펩티드에 대한 특이적 항체를 제공한다. 이들 항체는 다른 폴리펩티드(예를 들어, 다른 혈소판 표면 폴리펩티드)에 비해 GPIbα 폴리펩티드에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문에, 이들 항체는 GPIbα 폴리펩티드에 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 개시 항체는 인간 GPIbα 폴리펩티드(유전자 ID: 2811로 기재된 바와 같음), 마우스 GPIbα 폴리펩티드(유전자 ID: 110331805 및 유전자 ID: 110304274로 기재된 바와 같음), 래트 GPIbα 폴리펩티드(유전자 ID: 691992에 기재된 바와 같음), 원숭이 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 721584), 개 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 403638) 및/또는 토끼 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 100349951)를 인식하고 이에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 개시의 항체는 인간 GPIbα 폴리펩티드(유전자 ID: 2811에 기재된 바와 같음), 마우스 GPIbα 폴리펩티드(유전자 ID: 110331805 및 유전자 ID: 110304274에 기재된 바와 같음), 래트 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 691992에 기재된 바와 같음), 원숭이 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 721584), 개 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 403638) 및/또는 토끼 GPIbα 폴리펩타이드(유전자 ID: 100349951)를 인지하고 이에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 개시의 인간화 항체는 10 ㎛, 10 nM, 10 pM 또는 그 이하의 인간 GP1bα와의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간 GP1bα를 갖는 인간화 항체의 해리 상수(KD)는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ㎛ 또는 그 이하이다. 일부 실시형태에서, 인간 GP1bα를 갖는 인간화 항체의 해리 상수(KD)는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nM 또는 그 이하이다. 일부 실시형태에서, 인간 GP1bα를 갖는 인간화 항체의 해리 상수(KD)는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM 또는 그 이하이다.
본 개시의 항체는 인간 항체 또는 면역글로불린으로부터 유래된 영역 및 비-인간 항체 또는 면역글로불린으로부터 유래된 영역을 모두 포함하기 때문에 "인간화(humanized)" 항체이다. 항체를 인간화하는 작업은 비-인간 항체의 일부를 인간 항체의 상응하는 부분으로 대체하는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 인간화 항체는 GPIbα를 특이적으로 인식할 수 있는 비-인간 기원 가변 영역(예를 들어, 뮤린(예를 들어, 마우스) 항체로부터 유래된 영역) 및 인간 항체로부터 유래된 인간 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 인간화 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 경쇄는 GPIbα 폴리펩티드에 결합하는 비-인간 기원의 항체로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 영역(또는 CDR) 및 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 프레임워크 영역(또는 FR)을 포함하고, 중쇄는 GPIbα 폴리펩타이드에 결합하는 비-인간 기원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역 및 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 프레임워크 영역을 포함한다. "상보적 결정 영역(complementary determining region)" 또는 "CDR"은 폴리펩티드의 가변 부분에 위치하고 에피토프에 특이적으로 결합하는 데 관여하는 면역글로불린의 영역을 지칭한다. CDR의 조합은 항체의 파라토프(paratope)를 구성한다.
인간화 항체의 인간 영역은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD 이소타입(isotype)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체의 인간 영역은 IgG 이소타입, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스로부터 유래될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 인간화 항체의 인간 영역은 IgG1 서브클래스로부터 유래될 수 있다. 아래 나타낸 바와 같이, 인간화 항체는 또한 1가(monovalent) 항체이기 때문에, 인간화 항체의 인간 영역은 CH1 영역 및/또는 VH 영역(CDR 제외)에서 유래된 중쇄를 포함할 수 있으며 CH2 및/또는 CH3 지역을 제외한다. 인간화 항체의 인간 영역은 CL 영역 및/또는 VL 영역(CDR 제외)으로부터 유래된 경쇄를 포함할 수 있다. 인간화 항체의 인간 영역은 카파 또는 람다 유형일 수 있는 경쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체의 인간 영역은 카파 유형에서 유래된 경쇄를 포함한다.
본 개시의 인간화 항체는 Fc 모이어티를 포함하지 않는다(예를 들어, 결여되어 있다). 예를 들어, 인간화 항체 모이어티는 다가 항체의 단편 항원 결합 영역 F(ab)2이다. F(ab)2 단편은 2개의 분자 엔티티(경쇄 단편 및 중쇄 단편)의 이량체이며, 단일 항원-결합 부위로 구성되며, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 항체의 각 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함한다. F(ab)2의 각 쇄는 3개의 VL 및 3개의 VH 도메인을 포함한다. F(ab)2 항체 모이어티는 그것이 유래될 수 있는 모 다가 항체와 비교할 때 완전히 또는 부분적으로 글리코실화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 "1가" 항체이다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, "1가" 항체는 단일 항원 결합 부위를 함유한다. 1가 항체 모이어티는 결합된(공유적으로 또는 비공유적으로) 1개 이하의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 1개 이하의 상응하는 가변 중쇄 도메인(VH)을 갖는다. 이는 적어도 2개의 항원 결합 부위 및 1개 이상의 VH 및 1개 이상의 VL 도메인을 포함하는 다가 전체-길이(full-length) 항체와 상이하다. 1가 항체 모이어티는 그것이 유래될 수 있는 모 다가 항체와 비교할 때 완전히 또는 부분적으로 글리코실화될 수 있다. 일부 경우에, 1가 항체 모이어티는 글리코실화되지 않는다. 1가 항체 모이어티는 상응하는 다가 항체(예를 들어, 일부 실시형태에서 NIT-B1)에 의해 인식되는 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있다. 1가 항체 모이어티는 그것이 유래된 다가 항체의 결정화가능한 단편(Fc 단편)을 포함하지 않는다.
일부 경우에, 1가 항체는 하나 이상의 다가 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. scFv는 단일 항원 결합 영역으로 구성되고 링커(예를 들어, 일반적으로 짧은 펩티드 링커)와 연결된 다가 항체로부터의 1개 이하의 VH 및 1개 이하의 VL 도메인을 갖는 단일 분자 엔티티(융합 단백질)이다. 이와 같이, scFv는 단일 항원 결합 영역으로 구성되고 1개의 VH 및 1개의 VL 도메인을 포함한다. scFv는, 예를 들어, scFv의 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 scFv의 합성 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 본 개시의 scFv는, 예를 들어, VH 및 VL 도메인 사이에 하나 이상의 GGGGS(서열번호: 92) 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, VL 도메인의 카복시 말단은 VH 도메인의 아미노 말단에 연결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, VH 도메인의 카복시 말단은 VL 도메인의 아미노 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 scFv는 일단 scFv가 정제되면 제거될 수 있는 정제 태그(예를 들어, 6 X His 태그)를 포함할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, scFv는 담체 단백질과 (공유적으로) 회합되어 키메라 단백질을 형성할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 담체 단백질은 scFv의 아미노 말단 또는 카복시 말단에서 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, scFv는 정제 태그를 포함하지 않거나 가공되어 정제 태그가 제거되었다.
다른 경우에, 1가 항체는 다가(및 일부 실시형태에서는 모노클로날) 항체의 단편 항원-결합 영역(Fab)이다. Fab 단편은 2개의 분자 엔티티(경쇄 단편 및 중쇄 단편)를 포함하고, 단일 항원 결합 부위로 구성되며, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 항체의 각 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함한다. Fab는 단일 VL 및 단일 VH 도메인을 포함한다.
추가의 경우에, 1가 항체는 단일 도메인 항체 또는 나노바디이다. 단일 도메인 항체는 적어도 3개의 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 포함한다. 단일 도메인 항체는 낙타과(예를 들어, VHH 항체), 어류(예를 들어, VNAR 항체) 또는 파지 디스플레이에서 얻을 수 있다. 단일 도메인 항체는 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체는 인간화될 수 있다.
본 개시의 항체는 혈소판 활성화 및 응집을 방지할 수 있다. "혈소판 활성화 및 응집을 방지할 수 있는"이라는 표현은, 혈소판 및 혈소판 효능제의 존재 하에, 혈소판 활성화 및 혈소판 응집을 회피하는, 본 개시의 인간화 항체의 능력을 지칭한다. 혈소판 활성화는 주로 지혈 또는 혈전증이 시작되는 동안 발생한다. 활성화되면, 혈소판은 모양이 바뀌고 과립의 내용물을 방출한다. 활성화된 혈소판은 막 단백질(예를 들어, P-셀렉틴), 지질(예를 들어, 포스파티딜세린) 및 혈소판 응집을 초래하는 혈소판 αIIbβ3 인테그린의 구조적 변화를 조절한다. 혈소판 활성화 및 응집은, 예를 들어, 혈소판의 모양, 혈소판 응집 수준(예를 들어, 응집측정기를 사용함), 표면 단백질 또는 지질 발현 등을 결정하여 측정할 수 있다. 혈소판은 다음 아고니스트(활성화제), 트롬빈, ADP, 콜라겐 및 기타로 활성화될 수 있다. 리스토세틴은 또한 폰 빌레브란트 인자가 혈소판 수용체 GPIbα에 결합하도록 할 수 있다. 인간화 항체가 혈소판 활성화 및 응집을 방지하는지 확인하기 위해, 혈소판(예를 들어, 혈소판이 풍부한 혈장 또는 겔 여과 혈소판의 형태로 얻을 수 있음)을 먼저 인간화 항체와 접촉된 다음, 아고니스트와 접촉되도록 위치시킬 수 있다. 그런 다음, 혈소판이 활성화/응집되었는지 여부를 당업계에 공지된 방법에 의해 결정해야 한다. 혈소판 활성화 및 응집을 방지하는 항체는 본 개시의 항체로 간주된다.
또한, 본 개시의 인간화 항체는 혈소판 활성화를 유도하는 활성이 결여된 거일 수 있다. "혈소판 활성화를 유도하는 활성 결여"라는 표현은 본 개시의 인간화 항체의 특성 중 하나, 즉 이들이 공지된 혈소판 아고니트스의 부재 하에 혈소판을 활성화하지 않는다는 것을 지칭한다. 인간화 항체가 혈소판 활성화를 유도하는 활성이 결여된 것인지 확인하기 위해, 혈소판(예를 들어, 혈소판이 풍부한 혈장 또는 겔 여과된 혈소판의 형태로 얻을 수 있음)을 항체(공지된 혈소판 아고니스트의 부재하)와 접촉되도록 위치시킨 다음, 당업계에 공지된 방법에 따라 혈소판이 활성화되었는지 여부를 결정해야 한다. 혈소판 활성화를 유도하지 못하는 항체는 본 개시의 항체로 간주된다.
본 개시의 항체는 혈소판 감소증을 유도하는 활성이 결여된 것일 수 있다. "혈소판 감소증을 유도하는 활성 결여"라는 표현은 본 개시의 인간화 항체의 특성 중 하나, 즉 총 혈소판 수에서 실질적이고 병리학적인 결핍을 일으키지 않는다는 것을 지칭한다. 인간에서, 응급 치료가 필요한 혈소판 감소증은 혈액 ㎕당 50,000개 미만의 혈소판 수이다. 인간화 항체가 혈소판 감소증을 유도하는 활성이 결여된 것인지 여부를 결정하기 위해, 이를 시험 대상체(예를 들어, 마우스)에게 투여하고 항체가 혈소판 수의 감소(와 만일 그렇다면 혈소판 수의 실질적 또는 병리학적 감소)를 유발하는지 여부를 결정하기 위해 당업계에 공지된 기술을 사용하여 혈소판 수준을 모니터링한다. 혈소판 감소증을 유도하지 못한 항체는 본 개시의 항체로 간주된다.
본 개시의 항체는 (치료 용량에서) 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여된 것일 수 있다. "출혈 시간을 연장하는 활성 결여"라는 표현은 본 개시의 인간화 항체의 특성 중 하나, 즉 이들이 출혈을 멈추는 데 걸리는 시간을 실질적이고 병리학적으로 증가시키지 않는다는 것을 지칭한다. 인간화 항체가 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여된 것인지 확인하기 위해, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)의 꼬리에 절단(표준화된 너비와 깊이)을 하고, 출혈이 멈출 때까지 걸리는 시간(예를 들어, 최소한의 시간 동안 혈류의 중단)을 당업계에 공지된 기술(일부 실시형태에서는 Ivy 방법 또는 Duke 방법)을 사용하여 결정하고 항체가 출혈 시간의 증가(그리고 만일 그렇다면 실질적인 증가)를 유발하는지 확인하기 위해 표준과 비교한다. 지시된 용량에서 출혈 시간을 연장하지 못하는 항체는 본 개시의 항체로 간주된다.
본 개시의 항체는 또한 GPIbα 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항할 수 있다. GPIbα 폴리펩타이드는 폰 빌레브란트 인자(VWF), 트롬빈뿐만 아니라 기타 리간드에 대한 수용체 역할을 하는 혈소판 표면 막 당단백질이다. 생물학적 활성을 길항함으로써, 본 개시의 항체는 (특히 고전단 조건하에서) 혈소판 활성화 및 응집을 제한하거나 방지하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 항체는 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. GPIbα 폴리펩타이드의 단일 에피토프에 특이적인 항체는 단일클론 항체(mAb라고도 함)로 간주된다. 일부 실시형태에서, 단일클론 항체는 면역 세포의 단일 클론으로부터 생산된다. 모노클로날 항체는 GPIbα 폴리펩타이드의 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된 대상체(예컨대, 마우스 또는 인간)로부터의 비장 세포에 골수종 세포를 융합함으로써 세포 배양을 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 GPIbα 폴리펩티드의 에피토프를 포함하는 항원을 사용하여 모노클로날 항체의 라이브러리를 스크리닝함으로써 파지 디스플레이를 수득할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위한 추가 기술에는 단일 B 세포 배양, B 세포 집단으로부터의 단일 세포 증폭이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시의 모노클로날 항체는 다양한 기원(예를 들어, 마우스 또는 인간)으로부터 유래할 수 있고 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 쇄는 3개의 CDR을 포함한다. 모노클로날 항체는 면역글로불린 A(IgA), IgD, IgE, IgG(아형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 포함) 또는 IgM을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 이소형으로부터 유래할 수 있다. 모노클로날 항체는, 한 실시형태에서, IgG 이소형으로부터 유래할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66 또는 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 갖는다. 본 개시의 맥락에서, 특히 CDR의 아미노산 서열을 언급할 때, "본질적으로 구성된"이라는 표현은 CDR이 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67을 반드시 포함하지만, 추가의 비-필수 아미노산 잔기가 (이들 아미노산 잔기가 GPIbα 폴리펩티드에 대한 항체의 친화도 또는 GPIbα 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항하는 활성을 실질적으로 변형시키지 않는 한) 해당 서열의 아미노 또는 카복실 말단에 추가될 수 있음을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 2개의 상보적 결정 영역을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 3개 이상의 상보적 결정 영역을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 4개의 상보적 결정 영역을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 5개의 상보적 결정 영역을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66 및 67의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 상보적 결정 영역을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38 및 39(변이체 및 단편 포함)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 상보적 결정 영역 뿐만 아니라 서열번호: 65, 66 또는 67(변이체 및 단편 포함)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38 및 39(변이체 및 단편 포함)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 상보적 결정 영역 뿐만 아니라 서열번호: 65, 66 또는 67(변이체 및 단편 포함)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 2개의 상보적 결정 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 65, 66 또는 67(변이체 및 단편 포함)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 상보적 결정 영역 뿐만 아니라 서열번호: 37, 38 및 39(변이체 및 단편 포함)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 65, 66 및 67(변이체 및 단편 포함)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 상보적 결정 영역 뿐만 아니라 서열번호: 37, 38 또는 39(변이체 및 단편 포함)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 2개의 상보적 결정 영역을 갖는다.
본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66 또는 67의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 변이체 CDR은 CDR의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 변이체는 항체의 생물학적 기능에 부정적인 영향을 미치지 않는(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는) 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항체의 전체 전하, 구조 또는 소수성-친수성 특성은 생물학적 활성에 악영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다. 따라서, CDR의 아미노산 서열은, 예를 들어, 항체의 생물학적 활성에 악영향을 미치지 않으면서 항체를 더욱 소수성 또는 친수성으로 만들기 위해 변경될 수 있다. CDR 변이체는 본 명세서에 기술된 CDR에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성 백분율(percent identity)"은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 동일성의 수준은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 식별은 다음 문헌에 설명된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지의 방법으로 쉽게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). 동일성을 결정하기 위해 선호되는 방법은 테스트된 서열 간에 최상의 일치를 제공하도록 설계되었다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용가능한 컴퓨터 프로그램에 codified 성문화되어 있다. LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 제품군(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)의 Megalign 프로그램을 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 본 명세서에 개시된 서열의 다중 정렬은 기본 파라미터(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY= 10)를 사용하여 Clustal 정렬 방법(Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153)을 사용하여 수행되었다. Clustal 방법을 사용한 페어와이즈(pairwise) 정렬의 기본 파라미터는 KTUPLB 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이었다.
CDR 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존 아미노산 잔기)로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩된 것이거나 아닐 수 있는 것이거나, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것일 수 있다. CDR의 "변이체"는 보존적 변이체 또는 대립유전자 변이체일 수 있다.
본 개시의 항체는 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 기능적 단편을 포함할 수 있다. CDR의 단편은 CDR의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 적은 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 단편은 서열번호: 37, 38, 39, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열의 CDR의 일부 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 단편은 본 명세서에 기술된 CDR에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시의 항체는 중쇄를 포함하고 중쇄는 서열번호: 37, 38 또는 39의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 추가 실시형태에서, 중쇄는, 각각이 다음의 것으로부터의 별개의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 2개의 CDR을 포함한다: 서열번호: 37, 38 또는 39, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편. 또 다른 추가 실시형태에서, 중쇄는, 각각이 다음의 것으로부터의 별개의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 3개의 CDR을 포함한다: 서열번호: 37, 38 및 39, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편.
또 다른 실시형태에서, 중쇄는 인간 IgG1 항체의 CH1 영역을 포함하고 서열번호: 40, 47, 54 또는 61의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 뿐만 아니라 이의 기능적 단편을 포함한다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 인간 IgG1 항체의 CH1 영역의 기능적 변이체는 항체의 생물학적 기능에 악영향을 미치지 않는(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는) 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 한 실시형태에서, 인간 IgG1 항체의 CH1 영역의 기능적 변이체는 본 명세서에 기술된 CH1 영역(예컨대, 예를 들어, 서열번호: 40, 47, 54 또는 61의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 중쇄는 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 본 개시의 맥락에서, 특히 중쇄의 아미노산 서열을 언급할 때, "본질적으로 구성된"이라는 표현은 중쇄가 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 반드시 포함하지만, 추가의 비필수 아미노산 잔기가 (이러한 아미노산 잔기가 GPIbα 폴리펩티드에 대한 항체의 친화도 또는 GPIbα 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항하는 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한) 해당 서열의 아미노 또는 카복실 말단에 추가될 수 있다는 것을 의미한다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 중쇄 항체의 기능적 변이체는 항체의 생물학적 기능에 악영향을 미치지 않는(예를 들어, GPIbα 폴리펩티드에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는) 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 일 실시형태에서, 중쇄의 기능적 변이체는 본 명세서에 기술된 중쇄(예를 들어, 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 본 개시의 맥락에서 또한 사용되는 바와 같이, 중쇄의 기능적 단편은 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화도 제공)에 악영향을 미치지 않는 중쇄의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄의 기능적 단편은 본 명세서에 기술된 중쇄(예를 들어, 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 경쇄를 포함하고, 경쇄는 서열번호: 65, 66 또는 67의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 추가 실시형태에서, 경쇄는 각각이 다음의 것으로부터의 별개의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 적어도 2개의 CDR을 포함한다: 서열번호: 65, 66 또는 67, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편. 또 다른 추가 실시형태에서, 경쇄는 각각이 다음의 것으로부터의 별개의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 구성된 3개의 CDR을 포함한다: 서열번호: 65, 66 및 67, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편.
또 다른 실시형태에서, 경쇄는, 예를 들어, 서열번호: 68, 75, 82 또는 89의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있는 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역을 포함한다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역의 기능적 변이체는 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩티드에 대한 특이성 및 친화성을 제공)에 악영향을 미치지 않는 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역의 기능적 변이체는 본 명세서에 기술된 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역(예를 들어, 서열번호: 68, 75, 82 또는 89의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 본 개시의 맥락에서 또한 사용되는 바와 같이, 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역의 기능적 단편은 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역의 아미노산 서열과 비교하여 항체의 생물학적 기능다(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화도 제공)에 악영향을 미치지 않는 적어도 1개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 IgG1 카파 쇄 C 영역의 기능적 단편은 본원에 기재된 CH1 영역(예컨대, 예를 들어, 서열번호: 68, 75, 82 또는 89의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 경쇄는 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 및 이그의 기능적 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 본 개시의 맥락에서, 특히 경쇄의 아미노산 서열을 언급할 때, "본질적으로 이루어진"이라는 표현은 경쇄가 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열을 반드시 포함하지만, 추가의 비필수 아미노산 잔기가 (이러한 아미노산 잔기가 GPIbα 폴리펩티드에 대한 항체의 친화도 또는 GPIbα 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항하는 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한) 해당 서열의 아미노 또는 카복실 말단에 추가될 수 있다는 것을 의미한다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 경쇄 항체의 기능적 변이체는 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩티드에 대한 특이성 및 친화성을 제공)에 악영향을 미치지 않는 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 일 실시형태에서, 경쇄의 기능적 변이체는 본 명세서에 기술된 경쇄(예를 들어, 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 본 개시의 맥락에서 또한 사용되는 바와 같이, 경쇄의 기능적 단편은 중쇄의 아미노산 서열과 비교하여 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화도 제공)에 악영향을 미치지 않는 적어도 1개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 경쇄의 기능적 단편은 본 명세서에 기술된 경쇄(예를 들어, 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 중쇄는 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열, 이의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 본 개시의 맥락에서, 특히 중쇄의 아미노산 서열을 언급할 때, "본질적으로 구성된"이라는 표현은 CDR이 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 반드시 포함하지만, 추가의 비필수 아미노산 잔기가 (이러한 아미노산 잔기가 GPIbα 폴리펩티드에 대한 항체의 친화도 또는 GPIbα 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항하는 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한) 해당 서열의 아미노 또는 카복실 말단에 추가될 수 있다는 것을 의미한다. 본 개시의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 중쇄 항체의 기능적 변이체는 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩티드에 대한 특이성 및 친화성을 제공)에 악영향을 미치지 않는 아미노산 서열의 변경을 지칭한다. 일 실시형태예에서, 중쇄의 기능적 변이체는 본 명세서에 기술된 중쇄(예를 들어, 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 본 개시의 맥락에서 또한 사용되는 바와 같이, 중쇄의 기능적 단편은 중쇄의 아미노산 서열과 비교하여 항체의 생물학적 기능(예를 들어, GPIbα 폴리펩타이드에 대한 특이성 및 친화도 제공)에 악영향을 미치지 않는 적어도 1개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄의 기능적 단편은 본 명세서에 기술된 중쇄(예를 들어, 서열번호: 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열을 갖는 것들)에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 한 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 추가 실시형태에서, 인간화 항체는 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편을 가질 수 있다.
본 개시의 항체의 중쇄 및 경쇄는 세포로부터 분비될 때 절단되는 리더 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 35의 아미노산 서열은 서열번호: 36의 아미노산 서열 뿐만 아니라 리더 서열로 작용하는 N 말단의 추가적인 아미노산 잔기를 포함한다. 중쇄 및/또는 경쇄에 포함될 수 있는 리더 서열은 서열번호: 91의 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 항체는 무엇보다도 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 키메라 단백질 (담체 단백질 포함)로 추가로 변형되거나 설계될 수 있다. 인간화 항체 모이어티는 임의의 아미노산 잔기(들)에서 담체에 (예를 들어 하나 이상의 GGGGS(서열 번호 92) 링커와 같은 링커와 직접적으로 또는 간접적으로) 결합될 수 있으며, 다만 상기 결합은 인간화 항체 모이어티가 GPIbα에 결합하고 생물학적 활성을 억제하는 것을 방해하지 않는 것을 전제로 한다. 일 실시형태에서, 링커는 GGGGS(서열번호: 92) 링커의 3개 카피를 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 GGGGS(서열번호: 92) 링커의 4개 카피를 포함한다. 일부 경우에, 링커(존재하는 경우) 또는 담체는 GPIbα에 특이적으로 결합하고 이의 생물학적 활성을 억제하는 데 관여하지 않는 인간화 항체 모이어티의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)에 결합된다. 일부 경우에, 링커 또는 담체는 인간화 항체 모이어티의 단일 아미노산 잔기에 결합된다. 링커 또는 담체는, 인간화 항체 모이어티의 아미노-말단 또는 인간화 항체 모이어티의 카복실-말단에 위치한 아미노산 잔기를 포함하는, 인간화 항체 모이어티의 임의의 아미노산 잔기와 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 인간화 항체 모이어티의 상류(카복시 말단에서)에 위치할 수 있다. 링커 및 담체가 또한 단백질성 성질(proteinaceous nature)을 가질 경우, 인간화 항체 모이어티는, 링커 또는 담체의 아미노 말단에 위치한 아미노산 잔기 또는 링커 또는 담체의 카복실 말단에 위치한 아미노산 잔기 포함하는, 링커 또는 담체의 임의의 아미노산 잔기와 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 또는 담체의 아미노-말단에 위치한 아미노산 잔기는 인간화 항체 모이어티의 카복실-말단에 위치한 아미노산 잔기와 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 링커가 존재하고 단백질성 성질을 가질 때, 이의 아미노 말단은 인간화 항체의 카복실 말단과 결합되고 이의 카복실 말단은 담체의 아미노 말단과 결합된다. 한 실시형태에서, 담체 단백질은 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)이다. 한 실시형태에서, 담체는 하나 이상의 추가 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
인간화 항체 모이어티와 담체 사이에 공유 결합이 추구되는 경우, 두 엔티티 사이의 결합은 펩티드 결합일 수 있다. 이러한 실시형태는 적어도 2개의 엔티티가 둘 다 단백질성이고 유전자 재조합 기술을 사용하여 유기체(원핵 또는 진핵)에서 융합 단백질로서 생산되도록 의도된 키메라 단백질에 특히 유용하다. 대안적으로, 2개의 모이어티 사이의 공유 결합은 임의의 다른 유형의 화학적 공유 결합에 의해 매개될 수 있다. 일부 경우에, 키메라 단백질은 일반 순환(예를 들어, 혈장)에서 2개의 모이어티로 절단되기 쉽지 않도록 설계된다.
전술한 바와 같이, 2개의 엔티티(예를 들어, 인간화 항체 모이어티 및 담체 모이어티) 사이의 결합은 비공유적일 수 있다. 예시적인 비공유 결합은 비오틴-스트렙타비딘/아비딘 시스템을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 시스템에서, 표지(비오틴)는 하나의 엔티티/모이어티에 공유적으로 결합되는 반면, 단백질(스트렙타비딘 또는 비오틴)은 다른 엔티티/모이어티와 공유적으로 결합된다. 이러한 실시형태에서, 시스템의 다른 엔티티가 스트렙타비딘 또는 아비딘과 결합되면, 비오틴은 인간화 항체 모이어티 또는 담체에 결합될 수 있다.
비공유 결합의 추가 시스템에서, 제1 엔티티는 의도된 수용자에게 투여될 때에만 제2 엔티티에 비공유 결합되도록 설계된다. 이 실시형태는 담체가 수용자의 혈액에 존재하는 단백질인 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 인간화 항체 모이어티는 의도된 수용자에게 일단 투여되면 담체에 비공유적으로 결합할 수 있는 제2 항체, 렉틴 또는 이의 단편(본 명세서에서 항체-유래 링커로 지칭됨)과 (공유 또는 비공유 방식으로) 결합될 수 있다. 예를 들어, 제2 항체, 렉틴 또는 이의 단편은 의도된 수용자에 존재하는 임의의 혈액/혈장 단백질(예컨대, 예를 들어, 혈청 알부민, 면역글로불린 단편(단, 이들 단편이 활성화 Fc 수용체에 직접 결합하지 않거나 또는 키메라 단백질이 활성화 Fc 수용체 상의 하나 이상의 부위에 동시에 결합하도록 하지 않음), 알파-1-애시드 당단백질, 트랜스페린, 또는 지단백질)에 대해 특이적일 수 있다. 제2 항체, 렉틴 또는 이의 단편은, 인간화 항체 모이어티의 임의의 아미노산 잔기에서, 그러나 바람직하게는 인간화 항체 모이어티의 아미노- 또는 카복실-말단에서 인간화 항체 모이어티와, 바람직하게는 공유 방식으로 결합될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제2 항체, 렉틴 또는 이의 단편은 인간화 항체 모이어티와 담체 사이의 링커와 유사하다. 수용자에 인간화 항체 모이어티의 이러한 실시형태의 투여시, 담체(예를 들어, 혈액 또는 혈장 단백질)는 제2 항체, 렉틴 또는 이의 단편과 결회합하여, 생체내에서(in vivo), 키메라 단백질을 형성한다. 특정 실시형태에서, 제2 항체는 알부민을 특이적으로 인식하는 항체(예컨대, 예를 들어, 인간 알부민을 특이적으로 인식하는 항체)이다.
본 개시는 또한 본 명세서에 기술된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 제공한다. 뉴클레오티드 분자는 단리된 형태로 제공될 수 있고 DNA, cDNA, 합성 DNA, 합성 RNA, 유도체, 모방체 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 서열은 자연 발생 인트론, 유전자 영역, 비-유전자 영역, 및 조절 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 게놈 DNA는 프로모터 영역 또는 폴리(A) 서열과 관련하여 수득될 수 있다. 서열, 게놈 DNA, 또는 상보적 DNA(cDNA)는 여러 가지 방법으로 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적절한 세포로부터 추출 및 정제될 수 있다. 대안적으로, mRNA는 세포로부터 분리될 수 있고 역전사 또는 다른 수단에 의해 cDNA를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드 분자는 숙주 세포, 조직 또는 유기체로의 도입을 통해, RNA, 단백질 또는 폴리펩티드의 생산을 위한 본 개시의 방법의 특정 실시형태에서 사용된다. 일 실시형태에서, 뉴클레오티드 분자는 특정 숙주에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 뉴클레오티드 분자는, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터 서열 및/또는 하나 이상의 종결자 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 분자는 재조합 숙주에서의 발현을 위한 벡터에 포함될 수 있다. 본 개시의 뉴클레오티드 분자는, 일부 실시형태에서, 서열번호: 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83 및/또는 90의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 개시는 서열번호: 41 및 69, 41 및 76, 41 및 83, 또는 41 및 90의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 48 및 69, 48 및 76, 48 및 83, 또는 48 및 90의 핵산 서열을 포함한다. . 본 개시의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 55 및 69, 55 및 76, 55 및 83, 또는 55 및 90의 핵산 서열을 포함한다. 본 개시의 서열은 서열번호: 62 및 69, 62 및 76, 62 및 83, 또는 62 및 90의 핵산 서열을 포함한다.
인간화 항체의 치료 용도
혈소판 GPIbα와 이의 리간드(예컨대 VWF) 상호작용이 다양한 질병의 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되었기 때문에, 인간화 항체는 허혈성 뇌졸중, 급성 심근경색증, 재협착증, 협심증, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 혈관 염증, 정맥 혈전증, 말초혈관 질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 패혈증 및/또는 종양 전이의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 인간화 항체(또는 키메라 단백질의 인간화 항체 모이어티)에 의해 특이적으로 인식되는 혈소판을 갖는 대상체에서 사용될 수 있다. 이와 같이, 인간화 항체는, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 및/또는 개 등과 같은 포유동물 대상체에서 사용될 수 있다.
본 개시는 GPIbα와 이의 동족체 리간드(cognate ligand) 사이의 물리적 상호작용을 방지하거나 제한하는 방법을 제공한다. 이 방법은 인간화 항체/인간화 항체 모이어티와 GPIbα의 결합을 허용하는 조건 하에 인간화 항체, 키메라 단백질 또는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물을 혈소판(이는 이의 표면 상에 GPIbα를 발현함)과 접촉시키는 것을 포함한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 개시의 인간화 항체 및 키메라 단백질은 GPIbα에 결합할 수 있고 저전단 및 고전단 스트레스 하에서 이의 생물학적 활성을 길항할 수 있다. 이와 같이, 본 방법은 적용된 전단 스트레스에 관계없이 GPIbα에 결합하는 데 사용할 수 있다. 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) 사용될 수 있다. 이 방법은 낮거나 고전단 속도에서 사용할 수 있다.
GPIbα와 이의 리간드(예컨대 VWF) 간의 상호작용을 방지하고자 하는 경우 GPIbα와 이의 리간드 사이의 접촉 전에 인간화 항체 또는 키메라 단백질을 사용할 수 있다. 이와 같이, 혈소판은 리간드가 혈소판 부근에 위치하거나 발견되기 전에 먼저 인간화 항체(이는 임의로 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물로 제공됨)와 접촉된다. 이러한 실시형태에서, 본 개시의 인간화 항체의 결합은 GPIbα와 이의 리간드의 물리적 결합을 방지하고, 궁극적으로 혈소판 활성화 및 응집을 방지하거나 제한할 것으로 이해된다.
GPIbα와 이의 리간드(예컨대 VWF) 간의 상호작용을 제한하려는 경우, 인간화 항체를 동시에 또는 GPIbα와 리간드 사이의 접촉이 발생한 후에 사용할 수 있다. 이와 같이, 혈소판은 동시에 또는 이의 리간드가 혈소판 근처에 위치되거나 발견된 후에 인간화 항체(이는 임의로 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물로서 제공됨)와 접촉된다. 이러한 실시형태에서, 본 개시의 인간화 항체의 결합은 GPIbα와 이의 리간드의 물리적 결합을 제한하고, 일부 실시형태에서, 혈소판 활성화 및 응집을 방지하거나 제한할 것으로 이해된다.
인간화 항체(임의로 키메라 형태 또는 약제학적 조성물)는 이를 필요로 하는 대상체에서 병리학적 혈전증과 관련된 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 인간화 항체는 (적어도 하기 실시예에서) 혈소판 활성화 및 응집을 방지할 수 있기 때문에, 이들은 병리학적 혈전증에 민감한 대상체에서 병적 혈전증을 예방하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 개시의 인간화 항체는 (예를 들어, 이들이 유래된 원래의 단일클론 항체에 비해) 혈소판 감소증을 유발하거나 출혈을 지연시키지 않기 때문에 사용하기에 더 안전하다. 본 개시의 맥락에서 사용된 바와 같이, 용어 "병리학적 혈전증(pathological thrombosis)"은 혈관 내에 혈전(혈전)이 형성되어 주변 조직에 손상을 야기하는 상태를 지칭한다. 병리학적 혈전증은 정맥이나 동맥에서 발생할 수 있다. 병리학적 혈전은 해면정맥동, 신정맥, 심부정맥 또는 폐(폐색전증)에서 발생하거나 관찰될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 고전단 스트레스 조건 하에 병리학적 혈전증과 관련된 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 데 사용된다. 폐색되거나 부분적으로 폐색된 혈관 근처에서는, 전단 스트레스가 높고 GPIbα와 VWF 사이의 상호작용이 혈관 폐색에 중요하다.
혈전의 형성 또는 성장을 방지하는 것이 보장되는 실시형태에서, 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 혈전을 형성하거나 성장할 위험이 있는 대상체에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은 항체 투여 전에 대상체가 혈전을 형성하거나 성장할 위험이 있는지 여부를 (당업계에 공지된 방법 및 검정으로) 결정하는 것을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 혈전을 형성하거나 성장할 위험이 있는 것으로 이전에 결정된 대상체에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 인간화 항체 또는 키메라 단백질의 적어도 1회 용량의 투여 후, 대상체가 적어도 하나의 혈전을 갖는지 여부, 일부 추가 실시형태에서 혈전의 크기를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 결정은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 추가 용량을 대상체에게 투여해야 하는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.
복수의 혈전이 있는 대상체에서, 인간화 항체 또는 키메라 단백질을 사용하여 혈전의 크기 및/또는 수를 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은, 항체 투여 전에, 대상체가 하나 이상의 혈전 및 임의로 혈전의 크기를 갖는지 여부를 (당업계에 공지된 방법 및 검정으로) 결정하는 것을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 복수의 혈전을 갖는지 여부 및 임의로 혈전의 크기가 이전에 결정된 적이 있는 대상체에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 인간화 항체 또는 키메라 단백질의 적어도 1회 용량의 투여 후에 혈전의 존재, 수 및 크기를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 결정은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 추가 용량을 대상체에게 투여해야 하는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은 대상체가 병적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 대상체가 병리학적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있음에 대한 양성(positive) 결정은 대상체가 본 개시의 인간화 항체를 받는 것으로부터 이익을 얻을 것이라는 것을 나타낸다. 이와 같이, 본 개시의 방법은 인간화 항체 또는 키메라 단백질을 병적 혈전증을 경험할 위험이 있는 것으로 결정되거나 경험한 적이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 인간화 항체 및 키메라 단백질은 병적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는 것으로 결정된 대상체에서 사용될 수 있다.
일부 추가 실시형태에서, 본 개시의 방법은 대상체가 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 심근경색증, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부 정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는 것으로 결정하는 것을 포함한다. 대상체가 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있음에 대한 양성 결정은 대상체가 본 개시의 인간화 항체를 제공받는 것으로부터 이익을 얻을 것임을 나타낸다. 이와 같이, 본 개시의 방법은 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 심근경색증, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부 정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관 염증을 경험할 위험이 있는 것으로 결정되거나 경험한 적이 있는 대상체에게 인간화 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 인간화 항체는 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 심근경색증, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증, 말초혈관 질환, 심부 정맥 혈전증, 패혈증 및/또는 혈관 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는 것으로 결정된 대상체에서 사용될 수 있다.
GPIbα와 VWF 사이의 상호작용은 종양 전이의 전파에 중요하기 때문에, 본 개시의 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 감소 또는 제한하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 종양 전이의 수 및/또는 종양 전이의 크기를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 종양 전이는 간암(예컨대, 간 암종 또는 선암종)과 연관되고 인간화 항체는 간 종양 전이를 감소 또는 제한하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은 인간화 항체 또는 키메라 단백질의 1회 이상의 용량을 제공하기 전 및/또는 이후에 종양 전이의 존재, 위치 및/또는 크기를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 평가는 대상체에서 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 추가 용량의 인간화 항체를 투여해야 하는지 여부를 결정하는 데 유용할 수 있다.
인간화 항체 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 부형제와 함께 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 부형제 또는 "약제학적 부형제(pharmaceutical excipient)"는 하나 이상의 키메라 단백질을 대상체에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제 또는 임의의 다른 약리학적으로 불활성인 비히클이고, 일반적으로 액체이다. 약제학적 부형제는 일반적으로 의도된 투여 방식의 양태에서, 주어진 약제학적 조성물의 성분과 조합될 때 원하는 벌크, 일관성 등을 제공하도록 선택된다. 전형적인 약제학적 부형제는 결합제(예를 들어, 전호화(pregelatinized) 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충전제(예를 들어, 락토스 및 기타 당, 미세결정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘설페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트 등)를 포함하나, 이로만 제한되는 것은 아니다.
인간화 항체 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여를 위해 단위 투여 형태로 또는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물을 피험자에게 투여하기 위한 적절한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 약학적 관행이 사용될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하지만, 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들어, 경구, 비경구, 피하, 근육내, 두개내, 안와내, 안과, 뇌실내, 피막내, 척수강내, 경막외, 수조내, 복강내, 비강내 또는 에어로졸 투여가 사용될 수 있다. 치료 제형은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 제형을 만들기 위한 당업계에 잘 알려진 방법은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed.) ed. A.R. Gennaro AR., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾을 수 있다.
또한, 일부 실시형태에서, 인간화 항체 또는 키메라 단백질은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)" 또는 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 혈전성, 전이성 또는 염증성 상태 또는 장애를 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는데 효과적인 양(용량)을 지칭한다. "약제학적 유효량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 1회 투여량 또는 임의의 투여량 또는 경로로 제공되어, 원하는 치료 효과를 제공하는 양으로 해석될 수 있음을 또한 이해해야 한다.
본 명세서에 개시된 인간화 항체 또는 이를 포함하는 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물의 치료 유효량 또는 투여량은 약 0.001 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있으며, 본 발명의 다른 범위는 약 0.01 내지 25 ㎎/㎏ 체중, 약 0.025 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 약 0.3 내지 20 ㎎/㎏ 체중, 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중, 약 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 2 내지 9 ㎎/㎏ 체중 체중, 3 내지 8 ㎎/㎏ 체중, 4 내지 7 ㎎/㎏ 체중, 5 내지 6 ㎎/㎏ 체중, 20 내지 50 ㎎/㎏ 체중을 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료 유효량 또는 투여량은 총 약 0.001 내지 50 mg의 범위일 수 있으며, 본 발명의 다른 범위는 약 0.01 내지 10 ㎎, 약 0.3 내지 3 ㎎, 약 3 내지 10 ㎎, 약 6 ㎎, 9 ㎎, 약 10 내지 20 ㎎, 약 20 내지 30 ㎎, 약 30 내지 40 ㎎, 및 약 40 내지 50 ㎎일 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라는 약 40 내지 80 ㎎/㎏(예를 들어, 60 ㎎/㎏)의 투여량으로 투여된다.
실시예 I - 뮤린 NIT-B1 항체의 인간화
뮤린 NIT-A1 및 NIT-B1 항체의 가변 도메인(미국 특허 제8,323,652호에 기재되어 있고, 기탁번호 071008-01(NIT A1 클론), 071008-02(NIT B1 클론)로 2008년 10월 7일에 캐나다 국제기탁기관에 각각 기탁됨))을 시퀀싱했다. 뮤린 NIT-A1 항체는 서열번호: 1의 중쇄(서열번호: 3의 CDR1, 서열번호: 4의 CDR2 및 서열번호: 5의 CDR3 포함) 및 서열번호: 11의 경쇄(서열번호: 13의 CDR1, 서열번호: 14의 CDR2 및 서열번호: 15의 CDR3 포함)를 갖는다. 뮤린 NIT-B1 항체는 서열번호: 6의 중쇄(서열번호: 8의 CDR1, 서열번호: 9의 CDR2 및 서열번호: 10의 CDR3 포함) 및 서열번호: 16의 경쇄(서열번호: 18의 CDR1, 서열번호: 19의 CDR2 및 서열번호: 20의 CDR3 포함)를 갖는다.
뮤린 NIT-B1 항체는 NIT-B1 중쇄 가변 도메인(서열번호: 6)과 인간 IgG1 불변 영역 CH1(서열번호: 26; https:// www.uniprot.org/uniprot/P01857)을 융합하고; 뿐만 아니라 NIT-B1 경쇄 가변 도메인(서열번호: 16)과 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역(서열번호: 33; http://www.uniprot.org/uniprot/P01834)을 융합하여 키메라 C100-Fab으로 추가 개발했다.
실시예 II - 인간화 항-GPIBALPHA 항체의 특성화
CDR 이식 방법(Safdari et al., 2013)을 사용하여, 4개의 인간 중쇄(서열번호: 35의 VH1, 서열번호: 42의 VH2, 서열번호: 49의 VH3, 서열번호: 56의 VH4) 및 4개의 인간 경쇄(서열번호: 63의 VL1, 서열번호: 70의 VL2, 서열번호: 77의 VL3, 서열번호: 84의 VL4)를 주석이 달린 CDR이 있는 NCBI 데이터베이스의 인간 서열에 대한 프레임 워크의 상동성(homology))에 기초하여 합성했다.
요약하면, 모 항체의 가변 도메인 서열은 NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)를 사용하여 인간 생식계열(germline)에 대한 데이터베이스에서 검색했다. 각각의 중쇄 및 경쇄에 대해 4개의 다양한 인간 수용체(즉, 모 항체에 대해 높은 상동성을 갖는 인간 가변 도메인)를 선택했다. 인간 수용체의 CDR을 이들의 마우스 대응물로 대체하여, 인간화 가변 도메인 서열을 생성했다.
인간화 단일-쇄 가변 단편(scFv) 및 관련 키메라 단백질. VH1 및 VL2 둘 다를 포함하는 scFv를 제조했다. 이것은 VH1과 VL2 사이에 (GGGGS(서열번호: 92)) x 4개 링커(VH1-(G4S)4-VL2로 배향)를 포함했다. 정제를 용이하게 하기 위해, scFv는 VH1 앞에 6 x His-tag 및 TEV 절단 부위 ENLYFQG를 가졌다. 그러나, 태그를 다른 테스트를 하기 전에 TEV 프로테아제를 사용하여 제거했다. scFv를 또한 인간 혈청 알부민(HSA)과 함께 키메라 단백질(scFv-HSA)에 포함시켰다. 이러한 경우, scFv-HSA는 HSA 앞에 추가 링커 GGGGS(서열번호: 92)를 포함했다. 키메라 scFv-HSA는 안정적인 형태로 생산되었으며 생산 또는 정제 과정에서 응집체를 형성하지 않았다.
크기. 인간화 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 합성하고 pTT5 벡터에 삽입하여 Fab의 발현 플라스미드를 구축했다. 16개의 인간화 Fab를 HEK 293 또는 CHO 3E7 세포 배양물에서 일시적으로 발현시킨 다음, 세포를 원심분리했다. 상층액을 여과하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 평가했다. 인간화 Fab의 분자량은 비-환원 조건에서 약 47kDa이다(도 1 및 2).
그런 다음 8개의 선택된 인간화 Fab의 상청액(표 1 참조)을 Capture select™ Kappa XL Affinity Matrix 수지로 정제했다. 정제된 인간화 Fab를 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 PBS로 완충제-교체했다. 정제된 단백질의 농도와 순도를, 각각, OD280과 SDS-PAGE로 측정했다(각 레인에 약 2 ㎍의 단백질을 로딩함). 도 3에 도시된 바와 같이, 정제된 인간화 Fab는 SDS-PAGE로 비-환원 조건 하에서 ~47 kDa 밴드, 환원 조건 하에서 ~ 24 kDa 및 ~ 23 kDa 밴드로 이동했다.
인간화 Fab에 대한 설명
명칭 중쇄 경쇄
H001 VH1 (서열번호: 35) VL2 (서열번호: 70)
H002 VH1 (서열번호: 35) VL3 (서열번호: 77)
H003 VH2 (서열번호: 42) VL1 (서열번호: 63)
H004 VH3 (서열번호: 49) VL2 (서열번호: 70)
H005 VH3 (서열번호: 49) VL3 (서열번호: 77)
H006 VH4 (서열번호: 56) VL1 (서열번호: 63)
H007 VH4 (서열번호: 56) VL2 (서열번호: 70)
H008 VH4 (서열번호: 56) VL3 (서열번호: 77)
특이성. 인간 및 마우스 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 300g로 7분 동안 원심분리하여 준비하고 200 ㎕ PRP를 10 ㎖ PBS로 옮겨 세척한 다음 10분 동안 800g로 원심분리했다. 그런 다음 상층액을 제거하고 혈소판을 200 ㎕ PBS에 재현탁했다. 세척된 혈소판(10 ㎕)을 200 ㎕ 시스템에서 실온에서 30분 동안 다른 항체(2.5-5 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션하고 FITC 표지된 항-인간-Fab 항체로 검출했다. 이들 8개의 선택된 인간화 Fab H001-H008, scFv 및 키메라 단백질은 모두 인간 및 야생형 마우스 혈소판 둘 다에 결합했지만, GPIbα 결핍 마우스 혈소판에는 결합하지 않았으며, 이는 혈소판 GPIbα에 대한 인간화 Fab의 특이성을 나타낸다(도 4 및 19).
마우스, 개, 인간, 래트 및 토끼 PRP의 혈소판(2x105)을 일련의 농도의 50, 16.7, 5.6, 1.8, 0.6, 0.2 nM(마우스 및 개의 경우), 200, 200, 67, 22, 7.4, 2.5, 0.8, 0.3, 0.1 nM(인간 및 쥐의 경우), 및 500, 100, 20, 4, 0.8 nM(토끼의 경우)의 Fab H001 또는 H002를 함유하는 200 ㎕ PBS로 옮겼다. 30분 인큐베이션 후, 검출 항체(FITC-표지된 항-인간 카파 쇄, 1:200)를 첨가하고 어둠 속에서 15분 동안 인큐베이션했다. BD LSR Fortessa™ X-20을 사용하여 유세포 분석을 수행했다. H001 및 H002는 또한 마우스, 개 및 토끼 혈소판에 결합했다(도 5).
SEC-FPLC 크로마토그래피에 의한 2차 정제를 포함(정제된 H001/H002, 5 ㎍/㎖) 및 불포함(비정제된 H001/H002, 5 ㎍/㎖)하는 인간화 Fab를 30분 동안 사이노몰구스 원숭이 세척 혈소판(2 x 106)과 인큐베이션했다. FITC-표지된 항-인간 카파 쇄 2차 항체(Ab)를 30분 동안 인큐베이션했다. 원숭이 혈소판에 결합하는 인간화 Fab를 유세포 분석으로 검출했다. 도 6은 원숭이 혈소판에 결합된 Fab H001 및 H002 항체를 보여준다.
H001과 재조합 GPIbα 사이의 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석으로 측정했다. SPR 바이오센서의 제조를 위해, SPR 베어 골드 코팅 바이오센서(Biosensing Instrument Inc., AZ, USA)를 1:1 무수 에탄올:ddH2O에 용해된 0.5M 소듐 보로하이드라이드 용액에서 2시간 동안 세척했다. 바이오센서를 다량의 무수 에탄올로 헹군 후 디메틸포름아미드 중 1 mM 머캅토프로피온산 용액에서 16시간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, SPR 바이오센서를 다량의 디메틸포름아미드에 이어 무수 에탄올 및 최종적으로 ddH2O로 헹구었다. 그런 다음, 바이오센서를 40 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 및 ddH2O에 용해된 20 mM N-히드록시숙신이미드에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 센서를 다량의 ddH2O로 헹군 다음, 100 mM Nα,Nα-비스(카복시메틸)-L-리신 수화물과 함께 4시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 바이오센싱 표면을 ddH2O로 헹구었다. SPR 실험 이전의 마지막 단계에서는 기능화된 바이오센싱 표면을 100 mM NiCl2로 1시간 동안 노출시켰다.
SPR 실험을 Biosensing Instrument 4000 SPR에서 수행했다. 기능화된 바이오센서를 기기에 장착하고 바이오센서를 40 ㎕/min의 유속으로 전개 완충액(10 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 140 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 pH = 7.4)으로 평형화했다. 결합 측정을 위해, 25 ㎕의 500nM 헥사-히스티딘 태그 GPIbα를 바이오센싱 표면 위에 주입하여 GPIbα를 SPR 센서 표면에 고정시켰다. 기준선이 평형을 이루도록 한 다음, 이어서 원하는 농도의 리간드(Fab H001 또는 대조군) 25 ㎕를 주입했다. 바이오센싱 표면은 전개 버퍼에 100 ㎕의 500 mM 이미다졸을 주입한 다음, 이어서 100 mM NiCl2를 100 ㎕ 주입하여 리간드 주입 사이에 재생성시켰다. 생성된 데이터를 SPR 분석 소프트웨어가 포함된 기기를 이용하여 분석했다.
GPIbα가 고정된 SPR 바이오센서를 500, 100, 50 및 10 nM의 Fab H001 항체 및 100 nM의 대조군 항체(PSI E1, GPIIbIIIa에 대한 항체)에 노출시켰다. 대조군은 고정된 GPIbα에 결합하지 않았고, 주입이 끝나기 전에 바이오센서로부터 완전히 분리되었다(데이터 미제시). 대조적으로 Fab H001 항체는 주입 종료 후 부분적으로만 해리되면서 GPIbα에 명확하게 결합되어 명확한 SPR 이동(shift)을 나타냈다(도 7A). SPR 이동을 동역학 결합 모델에 핏팅시켰으며 2.61 x 107 s-1의 결합 속도(on rate)(ka), 해리 속도(off rate)(kd) = 1.1 x 10-1 s-1 및 4.4 nM의 해리 상수(Kd)를 초래했다(도 7B). 해리 상수를 확인하기 위해, SPR 이동의 크기를 Fab H001 항체 농도에 대해 플롯팅하고 1자리 결합 모델에 핏팅시켰으며 0.9929의 핏트(fit) R2 및 8.0 ± 2.1 nM의 해리 상수(Kd)를 생성했다. 데이터는 Fab H001 항체가 재조합 GPIbα에 낮은 나노몰 해리 상수 및 빠른 결합 속도로 단단히 결합되었음을 분명히 보여준다.
아고니스트-유도된 혈소판 응집의 시험관내 억제. 인간화 Fab가 비정상적인 혈소판 활성화를 유도할 수 있는지 여부와 혈소판 응집에서의 역할을 평가하기 위해 시험관 내 혈소판 응집 분석을 수행했다. 건강한 지원자와 말초혈관 질환 환자의 인간 PRP는 300g에서 7분 동안 원심분리하여 소듐-시트레이트 항-응고 전혈에서 준비했다. PRP에서 혈소판 응집을 5 ㎍/㎖ 인간화 Fab 클론의 첨가로 유도하였고 컴퓨터화된 크로노-로그 응집측정기(Chrono-Log Corporation, USA)로 모니터링했다. PRP에서 혈소판 응집을 리스토세틴(1 mg/㎖)으로 유도하였고, 겔(gel)-여과된 혈소판에서는 인간화 Fab와 함께 또는 없이 트롬빈(0.05 U/㎖)으로 유도하였으며 컴퓨터화된 크로노-로그 응집측정기(Chrono-Log Corporation, USA)를 사용했다.
Fab H001, H002, H005 및 H008 항체와 scFv 항체는 혈소판 활성화를 유도하지 않았다. 더욱이, H001과 H002는 PRP에서 리스토세틴-유도된 인간 혈소판 응집을 유의하게 억제했고, 겔-여과된 혈소판에서 저용량 트롬빈-유도 혈소판 응집을 유의하게 억제했다(도 8, 9, 20 및 21).
저전단 및 고전단 속도에서 혈전 형성 억제. 다양한 전단 속도에서 혈소판 부착, 응집 및 혈전 형성을 측정하기 위해, 30명의 건강한 지원자의 헤파린-처치된 전혈을 실시간 형광 현미경으로 생체외(ex vivo) 관류 챔버 시스템을 사용하여 I형 콜라겐-코팅 표면에 관류했다. 요약하면, 직사각형 미세모세관(ibidi channel slides, ibidi GmbH)을 Horm 콜라겐(100 ㎍/㎖, 밤새, 4℃; Nycomed Linz, Austria)으로 코팅했다. 건강한 기증자의 항-응고(헤파린 15 U/㎖) 전혈을 DiOC6(1 ㎛, 10분, 37℃, Sigma)으로 형광 표지했다. 그런 다음, 대조군 또는 인간화 Fab 또는 scFv-HSA 처치된 전혈을 주사기 펌프(Harvard Apparatus, USA)를 사용하여 3분 동안 300 s-1, 1 200 s-1 및 1 800 s-1의 전단 속도로 콜라겐 코팅 표면에 관류했다. 혈소판 축적 및 혈전 형성은 Zeiss Axiovert 135-도립 형광 현미경(60x/0.90 NA 물 대물렌즈) 하에 실시간으로 기록되었다. SlideBook 소프트웨어를 사용하여 혈소판 동력학의 정량적 형광 강도를 획득했다.
인간화 Fab H001 및 H002는, 각각, 세정맥/대동맥 및 세동맥의 혈류에 해당하는 300 s-1 및 1 800 s-1 벽 전단 속도(비록 바람직하게는 1 800 s-1 벽 전단 속도) 둘 다에서 혈전 형성을 현저하게 억제했다(도 10). 키메라 단백질은 1 200 s-1 벽 전단 속도에서 혈전 형성을 현저하게 억제한다(도 22). 이러한 생체외(ex vivo) 결과는 인간화 C100-Fab, scFv 및 키메라 단백질이 저전단 및 고전단 조건 모두에서 혈전증의 상당한 억제제임을 시사한다.
혈전 성장 및 혈관 폐색의 생체내 억제. 인간화 Fab가 생체내(in vivo) 혈전 성장에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 2개의 상보적인 생체(intravital) 현미경 혈전증 모델 및 대동맥 혈전증 모델을 사용했다.
장간막 세동맥의 혈전 형성을 3-4주령 C57BL/6 야생형 마우스에서 모니터링했다. 마우스에 도너-매칭된 형광 표지된 혈소판을 주입하고, Zeiss Axiovert 135 반전 형광 현미경(Zeiss, Germany)으로 시각화했다. 요약하면, 혈액을 도너-매칭된 마우스로부터 애시드 시트레이트 덱스트로스 용액(ACD; 항응고제로서)에 수집했다. 겔-여과된 혈소판을 준비하고 실온에서 20분 동안 칼세인(Calcein) AM(1 mg/㎖, Invitrogen, Canada)으로 표지했다. 그런 다음 혈소판을 대조군 식염수 완충액, Fab H001 또는 H002(2.5 또는 5 ㎍/마우스)와 함께 꼬리 정맥을 통해 실험 마우스에 주사했다. 그런 다음 마우스를 마취하고 장간막을 적출했다. 100-120 ㎛ 직경의 단일 장간막 세동맥을 선택하고 30 ㎕의 250 mM 페릭 클로라이드를 국소 도포하여 손상을 유도했다. 혈관 폐색이 완료되는 시간을 기록했다. 혈전 형성 및 용해의 이미지를 형광 현미경으로 시각화했다. 도 11 및 표 2에 나타낸 바와 같이, FeCl3 손상에 의해 유도된 혈전 성장 및 혈관 폐색은 (대조 식염수 주사와 비교할 때) 인간화 Fab H001 및 H002 항체의 주사에 의해 유의하게 억제되었다.
제공받은 처치의 함수로 나타낸 폐색되지 않은 마우스의 수.
대조군 0
H002 - 5 ㎍ 4 중 1
H001 - 5 ㎍ 4 중 3
H001 - 2.5 ㎍ 0
레이저-유도 크레마스터 세동맥 혈전증 모델의 경우, C57B/6 야생형 마우스(수컷, 6-8주령)를 마취시키고 호흡을 용이하게 하기 위해 기관 튜브를 삽입했다. 복횡근(cremaster muscle)을 해부 현미경 아래에 준비하고 실험 전체에 걸쳐 예열된 바이카보네이트-완충 식염수를 뿌렸다. 혈소판 항체, 대조군(식염수 완충액), 인간화 및 1가 H001 및 H002 항체(5 또는 10 ㎍/마우스)를 경정맥 캐뉼러로 표시된 곳에 투여하였다. 혈소판은 래트 항-마우스 CD41 항체(Leo.A1; EMFRET Analytics, Germany; 0.1 ㎍/g) 주사로 표지했다. 펄스된 질소 염료 레이저가 있는 Olympus BX51WI 현미경을 사용하여 복횡근 세동맥(cremaster arteriole)에 복수의 독립적인 상류 손상을 유도했다. 성장하는 혈전 내에 형광 표지된 혈소판의 동적 축적을 Slidebook 소프트웨어를 사용하여 캡처하고 분석했다. 이 복횡근 세동맥 생체내 현미경 혈전증 모델(레이저로 가벼운 혈관 손상을 유도하므로 산화 스트레스를 포함하지 않음)에서, 혈전 성장은 인간화 및 1가 H001 및 H002 항체의 정맥내 주입 후 거의 완전히 폐지되었다(도 12). 이러한 발견은 인간화 Fab가 혈전 성장을 억제하고 혈전 용해를 촉진할 수 있으며, 따라서 새로운 항-혈전제로 개발될 가능성이 크다는 것을 시사한다.
생체내 현미경 혈전증 모델 실험 전후에 마우스 혈액을 채취하고 혈소판을 분리하고 유세포 분석 및 FITC-표지된 마우스 항-인간 CD62P 항체 및 Annexin V-Alexa Fluor® 647을 사용하여 특성화했다. 인간화 및 1가 H001 항체는 혈소판 P-셀렉틴 발현 또는 포스파티딜 세린(PS) 노출을 초래하지 않았기 때문에 생체내에서(in vivo) 혈소판 이상 활성화를 유도하지 않았다는 것이 도 13에 나타나 있다. 인간화 Fab H002 항체를 사용하여 유사한 결과를 얻었다(데이터 미제시).
페릭 클로라이드-유도 큰 경동맥 혈전증 모델에서, C57BL/6J 야생형 마우스(양쪽 성별, >8주령, 25-30g)를 마취하고 동맥 손상을 유도하기 5분 전에 Fab H001 또는 H002 항체(5, 10 또는 20 ㎍/마우스) 또는 동일한 부피(200 ㎕)의 PBS를 정맥내로 주입했다. 왼쪽 총경동맥을 해부하고 소형 도플러 플로우 프로브(TS420 경과-시간 혈관주위 유량계, Transonic Systems Inc., USA)로 고정했다. 기준 혈류 속도를 30초 동안 측정했다. 그런 다음 3분 동안 7.5% 페릭 클로라이드로 포화된 Whatman 여과지 스트립으로 경동맥 손상을 유도했다. 완전한 혈관 폐색이 관찰될 때까지 혈류를 모니터링했다. Fabs H001 및 H002 항체는 혈전 성장을 유의하게 감소시키고 안정적인 혈관 폐색을 방지했다(도 14).
뇌내 출혈의 위험을 증가시키지 않으면서 허혈성 뇌의 경색 크기의 생체내 감소. 허혈성 뇌졸중에서 항체의 치료 가능성을 조사하기 위해, 뇌허혈 및 재관류 손상 모델(일시적 중간 뇌동맥 폐색(tMCAO))을 수행했다. 수컷 마우스(25g)를 흡입된 이소플루오란으로 마취시켰다. 목 정중선 절개를 수행하고 연조직을 분리했다. 좌측 총경동맥(LCCA)을 주변 신경으로부터 조심스럽게 절개하고(미주 신경을 손상시키지 않고) 5.0 스트링을 사용하여 결찰시켰다. 그런 다음 왼쪽 외경동맥(LECA)을 분리하고 두 번째 매듭을 만들었다. 다음으로, 좌내경동맥(LICA)을 분리하여 6.0 필라멘트로 매듭을 만들었다. 좌내경동맥(LICA)과 좌익구개동맥(LPA; left pterygopalatine artery)에 대한 양질의 관찰을 얻은 후, 미세혈관 클립을 이용하여 양쪽 동맥을 클리핑했다. LECA와 LICA로 분기되기 전에 LCCA 내에 작은 구멍을 냈다. 표준화된 실리콘 고무-코팅된 6.0 나일론 모노필라멘트(6021; Doccol Corp, Redlands, CA)가 클립에서 멈출 때까지 LICA에 도입했다. 필라멘트를 LICA에 삽입하여 윌리스(Willis) 원에서 LMCA의 기점을 폐색하는 동안 클리핑된 동맥을 개방했다. LICA 상의 세 번째 매듭을 닫아 필라멘트를 제자리에 고정했다. 1시간 후 세 번째 매듭을 풀고 필라멘트를 빼냈다. 필라멘트가 삽입된 직후에; 또는 필라멘트를 빼낸 다음 1시간 후 항체를 정맥내 투여했다.
뇌경색 부피를 측정하기 위해 tMCAO 유도 24시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 뇌경색을 시각화하기 위해 전체 뇌에서 절단된 여러 2 ㎜ 두께의 관상 뇌 절편을 2% 2,3,5-트리페닐-테트라졸륨 클로라이드(TTC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)로 염색했다. 뇌출혈의 존재를 육안으로 평가했다. tMCAO 유도 24시간 후 신경 기능을 측정하기 위해, 마우스를 변형된 베더슨(Bederson) 테스트와 그립(grip) 테스트에 적용하여 전체 신경 및 운동 기능을 각각 평가했다. 결과는 인간화 Fab H001 및 H002 항체 및 scFv-HSA에 의한 GPIbα의 차단이 뇌내 경색 크기를 유의하게 감소시켰고 뇌내 출혈의 위험을 증가시키지 않으면서 tMCAO 후 기능적 결과를 개선함을 나타냈다(도 15).
TTP의 생체내 보호. TTP에서 항체의 치료 효과를 테스트하기 위해, 이오노포어-유발 초대형 VWF(ULVWF)-매개 미세혈관 혈전증 모델을 사용했다. ADAMTS13-/- 마우스를 마취하고 동일한 유전자형의 도너 마우스에서 정제한 형광 표지된 혈소판을 정맥 주사하고, 장간막 정맥에서 이오노포어-유발 미세혈관 혈전증을 생체(intravital) 현미경으로 실시간으로 모니터링했다. 혈소판 준비를 위해, 마우스(6~8주)에 케타민/자일라진(각각, 100 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏ 체중)을 복강내 주사하여 마취하고, 헤파린-코팅된 유리 모세관을 사용하여 안와-후방 신경총(retro-orbital plexus)에서 전혈을 수집했다. 시트레이트-덱스트로스 용액(38 mmol/L 시트르산, 75 mmol/L 트리소듐시트레이트, 100 mmol/L 덱스트로스)을 함유하는 튜브에 혈액을 수집했다. 전혈을 300g에서 7분 동안 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장을 얻었다. 그런 다음 겔-여과된 혈소판을 PIPES 완충액(PIPES 5 mmol/L, NaCl 1.37 mmol/L, KCl 4 mmol/L 및 포도당 0.1%, pH 7.0) 중의 세파로스 2B 컬럼을 사용하여 혈소판-풍부 혈장에서 분리했다. Hemovet(HV950, Drew Scientific)을 사용하여 혈소판 수를 확인했다. 겔-여과된 혈소판의 형광 표지는 혈소판을 실온에서 15분 동안 칼세인-아세톡시메틸 에스테르(1 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이팅하여 달성되었다. 혈소판의 형광 표지의 효능은 생체내(in vivo) 이미지화에 사용하기 전에 형광 현미경으로 확인했다.
생체내 현미경 이미지화를 위해, 4주령 마우스를 마취시키고 형광 표지된 혈소판(동일 유전자형의 마우스로부터 1.25 x 106 혈소판/g)을 주입했다. 장간막 혈관을 외과적으로 준비하고 25x 오일 대물 렌즈(Zeiss)를 사용하여 도립 형광 현미경(Zeiss Axio Observer Z1 Advanced Marianas Microscope) 하에서 모니터링했다. 장간막 세정맥(직경 100 내지 150 ㎛ol/L)의 ~2.5mm 절편을 10 ㎕의 10 ㎛ol/L 칼슘 이오노포어로 국소 처리하여 내피에서 ULVWF의 Weibel-Palade 체내 분비를 유도하였으며, 이는 형광 표지된 혈소판의 즉각적인 부착 및 혈관 벽에 고정된 혈소판 혈전 형성을 초래했다. 각 마우스에 대해, 사전 기록에 추가하여 혈전증의 진행 및 혈전의 분해를 20분 동안 모니터링하고 기록했다. Fab H001 또는 scFv-HSA 키메라 단백질은 ADAMTS13-/-의 장간막 미세혈관에서 칼슘 이오노포어 자극에 의한 (예방적) 혈전증의 발생 10분 전에 꼬리 정맥 카테터를 통해 투여했다. 선택된 혈관 세그먼트에서 혈소판 축적의 동역학을 (1) 색전의 수(직경 20 ㎛보다 큰 혈소판 혈전), 및 (2) 정상 혈류를 회복하는 데 걸리는 시간(국소 도포 후 혈소판 형광이 기준선 근처로 복귀하는 데 필요한 시간으로 정의함)에 의해 정량적으로 분석했다.
도 16에 나타난 바와 같이, 식염수(대조군), Fab H001 항체, 또는 scFv-HSA 키메라 단백질로 처리한 모든 ADAMTS13-/- 마우스에서 이오노포어의 적용 전에 장간막 혈관 벽에 대한 혈소판 부착이 생체내 현미경으로 검출되지 않았다. 대조군 ADAMTS13-/- 마우스에서 장간막 혈관에 칼슘 이오노포어를 국소 적용한 직후, 혈소판 부착이 장간막 정맥에서 관찰되었으며, 혈류 방향으로 내피에 부착된 단일 혈소판 스트링 형성으로 나타났다. 1분 이내에, 복수의 큰 혈전(직경 > 20 ㎛)이 형성되었고, 일부는 이오노포어-처치된 용기 지름의 최대 50%까지 자랐다. 혈소판 스트링과 혈전은 눈에 띄게 느슨해졌으며 혈관벽과 색전에서 하류로 쉽게 분리되었다. 대조군 마우스에서 혈관벽에 대한 혈소판 부착 및 색전성 혈전증은 최대 10분 이상 지속되었지만 시간이 지남에 따라 감소했고 궁극적으로 혈관의 영향받은 부분에서 정상적인 혈류를 회복했다. ADAMTS13-/- 마우스에서 혈전 반응은 Fab H001 항체 또는 scFv-HSA 키메라 단백질 모두의 예방적 처리에 의해 극적으로 억제되었다(도 16). 혈관벽에 대한 혈소판 부착 및 큰 혈전 형성은 Fab H001 항체 또는 scFv-HSA 키메라 단백질 처리에 의해 강력하게 억제되었다(도 16). 큰 색전 혈전의 수는 대조군과 비교할 때 Fab H001 항체 또는 scFv-HSA 키메라 단백질 처치군 둘 다에서 유의하게 더 적었고 장간막 정맥에서 정상적인 혈류를 회복하는데 걸리는 시간이 더 짧았다(도 16). 이러한 결과는 Fab H001 항체 또는 scFv-HSA 키메라 단백질을 사용한 ADAMTS13-/- 마우스의 예방적 치료가 이오노포어-유발 VWF-매개 미세혈관 혈전증을 효과적으로 억제하여, TTP에서 새로 방출된 내피-결합 ULVWF에 대한 혈소판 축적을 모방함을 입증했다.
혈소판 감소증의 억제. C57BL/6 마우스에 정맥 면역글로불린(IVIg), 인간화 Fab H001 또는 H002 항체(10 ㎍/마우스, n=3 각 그룹) 또는 NIT-B1 항체(5 ㎍/마우스, n=2)를 정맥 주사했다. 다양한 시점(0, 30분, 1, 2, 4, 8시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7일)에서 일련의 혈액 샘플을 마우스 내측 복재 정맥(medial saphenous vein)에서 수집했다. 각 시점에서 10 ㎕ 혈액 샘플을 수집하고 240 ㎕ 1% PBS-EDTA(pH 7.4)에 첨가하여 응고를 방지했다. 혈소판 계수를 위해, 50 ㎕ 혈액 샘플(PBS-EDTA 중)을 10 mL 희석제(Isoton II, Coulter Corporation)로 옮기고 Coulter 계수기(Beckman Z2, Coulter Corporation)를 사용하여 혈소판 수를 측정했다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 인간화 및 1가 H001 또는 H002 항체는 이들의 투여 후 처음 24시간 동안 혈소판 수에서 유의한 손실을 유도하지 않았으며, 이는 NIT-B1 항체와 분명한 대조를 이룬다.
출혈 시간. BALB/c 마우스에 PBS(n=4), Fab H001 또는 H002 항체(5-10 ㎍/마우스, n=3)를 손상 120분 전에 정맥내 주사했다. 마우스를 2.5% 아베르틴(18 ㎖/㎏ 체중, 복강내)으로 마취하고 37℃ 가열 패드에서 유지했다. 꼬리 끝(2 ㎜)을 날카로운 메스로 자르고 티슈 페이퍼를 사용하여 15초마다 상처를 두드렸다. 출혈 시간은 혈류가 멈출 때까지의 시간(출혈이 >10초 동안 멈춤)으로 기록했다. 꼬리에서 여전히 출혈이 있는 경우, 15분 후에 분석을 종료했다. 도 18에 나타난 바와 같이, H001 또는 H002 항체의 투여는 출혈 시간을 연장시키지 않았다.
참고문헌
Yaghoub Safdari, Safar Farajnia, Mohammad Asgharzadeh & Masoumeh Khalili (2013) Antibody humanization methods - a review and update, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 29:2, 175-186
본 발명이 특정 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 청구범위의 범위는 실시예에 기재된 바람직한 실시형태에 의해 제한되어서는 안 되며, 전체로서 해당 설명과 부합되는 가장 넓은 해석이 이루어져야 한다는 것이 이해될 것이다. 전부의.
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acttcaccag cacacgagag 240 tccggagtgc cagacagatt ctctggcagt gggtcaggaa cagattttac tctgaccatt 300 agctccctgc aggccgaaga cgtggctgtc tactattgtc agcagcatta ctcatcaccc 360 tggaccttcg gggggggcac taaactggaa atcaaacgca ccgtcgccgc cccctccgtc 420 ttcatcttcc ccccctccga cgagcagctc aagtccggca ccgcctccgt cgtctgcctc 480 ctcaacaact tctacccccg cgaggccaag gtccagtgga aggtcgacaa cgccctccag 540 tccggcaact cccaggagtc cgtcaccgag caggactcca aggactccac ctactccctc 600 tcctccaccc tcaccctctc caaggccgac tacgagaagc acaaggtcta cgcctgcgag 660 gtcacccacc agggcctctc ctcccccgtc accaagtcct tcaaccgcgg cgagtgctga 720 <210> 70 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 light chain of humanized C100-Fab with leader sequence <400> 70 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 71 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 light chain of humanized C100-Fab without leader sequence <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 light chain of humanized C100-Fab CDR1 <400> 72 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 light chain of humanized C100-Fab CDR2 <400> 73 Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 light chain of humanized C100-Fab CDR3 <400> 74 Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 75 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Ig kappa chain C region found in SEQ ID NO: 70 and 71 <400> 75 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 76 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 70 <400> 76 atgggctggt cctgcatcat cctcttcctc gtcgccaccg ccaccggcgt ccactccgac 60 atccagatga cccagagccc aagtagcctg agcgccagcg tcggagatag agtgaccatt 120 acctgcaaga gtagccagtc cctgctgaac agcaggaatc agaaaaacta cctggcctgg 180 tatcagcaga agcccggcaa agctcctaag ctgctgatct acttcaccag cacacgggag 240 tccggggtgc catctagatt ctctggcagt gggtcaggaa cagactttac tctgaccatt 300 agctccctgc agcccgaaga ttttgccacc tactattgtc agcagcatta ttcatcacct 360 tggaccttcg ggcagggaac aaaagtggaa atcaaacgca ccgtcgccgc cccctccgtc 420 ttcatcttcc ccccctccga cgagcagctc aagtccggca ccgcctccgt cgtctgcctc 480 ctcaacaact tctacccccg cgaggccaag gtccagtgga aggtcgacaa cgccctccag 540 tccggcaact cccaggagtc cgtcaccgag caggactcca aggactccac ctactccctc 600 tcctccaccc tcaccctctc caaggccgac tacgagaagc acaaggtcta cgcctgcgag 660 gtcacccacc agggcctctc ctcccccgtc accaagtcct tcaaccgcgg cgagtgctga 720 <210> 77 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 light chain of humanized C100-Fab with leader sequence <400> 77 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 78 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 light chain of humanized C100-Fab without leader sequence <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 light chain of humanized C100-Fab CDR1 <400> 79 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 light chain of humanized C100-Fab CDR2 <400> 80 Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 light chain of humanized C100-Fab CDR3 <400> 81 Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Ig kappa chain C region found in SEQ ID NO: 77 and 78 <400> 82 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 83 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 77 <400> 83 atgggctggt cctgcatcat cctcttcctc gtcgccaccg ccaccggcgt ccactccgac 60 attgtgatga cccagagccc cctgagcctg ccagtgaccc ccggagagcc tgctagtatt 120 tcctgtaagt ccagccagtc cctgctgaac agcaggaatc agaagaacta cctggcctgg 180 tatctgcaga aacccggcca gtcccctcag ctgctgatct acttcaccag tacacgggag 240 tcaggagtgc cagacagatt cagcggatcc ggatctggaa ctgattttac cctgaagatt 300 agtcgggtcg aggctgaaga cgtgggcgtc tactattgcc agcagcatta ctcatcacct 360 tggaccttcg gacagggaac aaaagtggaa atcaaacgca ccgtcgccgc cccctccgtc 420 ttcatcttcc ccccctccga cgagcagctc aagtccggca ccgcctccgt cgtctgcctc 480 ctcaacaact tctacccccg cgaggccaag gtccagtgga aggtcgacaa cgccctccag 540 tccggcaact cccaggagtc cgtcaccgag caggactcca aggactccac ctactccctc 600 tcctccaccc tcaccctctc caaggccgac tacgagaagc acaaggtcta cgcctgcgag 660 gtcacccacc agggcctctc ctcccccgtc accaagtcct tcaaccgcgg cgagtgctga 720 <210> 84 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL4 light chain of humanized C100-Fab with leader sequence <400> 84 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 85 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL4 light chain of humanized C100-Fab without leader sequence <400> 85 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL4 light chain of humanized C100-Fab CDR1 <400> 86 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL4 light chain of humanized C100-Fab CDR2 <400> 87 Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL4 light chain of humanized C100-Fab CDR3 <400> 88 Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Ig kappa chain C region found in SEQ ID NO: 56 and 57 <400> 89 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 90 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 56 <400> 90 atgggctggt cctgcatcat cctcttcctc gtcgccaccg ccaccggcgt ccactccgac 60 gtcgtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc tgggacagcc tgcctcaatc 120 tcctgtaaaa gtagccagag cctgctgaac agccgaaatc agaagaacta cctggcctgg 180 ttccagcaga gaccaggaca gtcccctcga agactgatct attttaccag tacaagggag 240 tcaggagtgc cagaccgctt cagcggatcc ggatctggaa ctgattttac cctgaaaatt 300 agtcgggtcg aggctgaaga cgtgggcgtc tactattgtc agcagcacta ttcatcacct 360 tggaccttcg ggcagggaac aaaactggaa atcaaacgca ccgtcgccgc cccctccgtc 420 ttcatcttcc ccccctccga cgagcagctc aagtccggca ccgcctccgt cgtctgcctc 480 ctcaacaact tctacccccg cgaggccaag gtccagtgga aggtcgacaa cgccctccag 540 tccggcaact cccaggagtc cgtcaccgag caggactcca aggactccac ctactccctc 600 tcctccaccc tcaccctctc caaggccgac tacgagaagc acaaggtcta cgcctgcgag 660 gtcacccacc agggcctctc ctcccccgtc accaagtcct tcaaccgcgg cgagtgctga 720 <210> 91 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence <400> 91 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <400> 92 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (33)

  1. 혈소판 당단백질 I(b)α(GPIbα)를 특이적으로 인식하는 인간화 항체로서, 상기 인간화 항체는 Fc 모이어티가 결여되어 있고,
    - 혈소판 활성화, 응집, 및/또는 혈전 성장을 방지할 수 있고,
    - 혈소판을 활성화하는 활성이 결여되어 있고,
    - 혈소판감소증을 유도하는 활성이 결여되어 있고/있거나,
    - 치료 용량에서, 출혈 시간을 연장하는 활성이 결여되어 있는,
    인간화 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    인간 GPIbα, 마우스 GPIbα, 개 GPIbα, 래트 GPIbα, 토끼 GPIbα 및/또는 원숭이 GPIbα를 인식할 수 있는 것인, 인간화 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항체 단편인, 인간화 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    F(ab)2 단편인, 인간화 항체.
  5. 제3항에 있어서,
    항체가 1가 항체인, 인간화 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    Fab 항체 단편인, 인간화 항체.
  7. 제5항에 있어서,
    단일 쇄 가변 단편(scFv)인, 인간화 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄를 갖는 것인, 인간화 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    중쇄가
    - GFTFSSFAMS(서열번호: 37)의 아미노산 서열을 갖는 제1 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - SITSAGTPYYPDSVLG(서열번호: 38)의 아미노산 서열을 갖는 제2 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및/또는
    - SRGYEDYFDY(서열번호: 39)의 아미노산 서열을 갖는 제3 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편,
    을 포함하는 것인, 인간화 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    중쇄가 인간 IgG1 항체의 CH1 영역을 추가로 포함하는 것인, 인간화 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    인간 IgG1 항체의 CH1 영역이 서열번호: 40, 47, 54 또는 61의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는 것인, 인간화 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    중쇄가 서열번:호 36, 43, 50 또는 57의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는 것인, 인간화 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄를 갖는 것인, 인간화 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    경쇄가
    - KSSQSLLNSRNQKNYLA(서열번호: 65)의 아미노산 서열을 갖는 제1 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - FTSTRES(서열번호: 66)의 아미노산 서열을 갖는 제2 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및/또는
    - QQHYSSPWT(서열번호: 67)의 아미노산 서열을 갖는 제3 CDR, 이의 변이체 또는 이의 단편,
    을 포함하는 것인, 인간화 항체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    경쇄가 인간 IgG1 항체의 카파 쇄 C 영역을 추가로 포함하는, 인간화 항체.
  16. 제15항에 있어서,
    카파 쇄 C 영역이 서열번호: 68, 75, 82, 또는 89의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는 것인, 인간화 항체.
  17. 제16항에 있어서,
    경쇄가 서열번호: 64, 71, 78 또는 85의 아미노산 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편을 갖는 것인, 인간화 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 36의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 43의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 50의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 64의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 71의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편;
    - 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 78의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편; 또는
    - 서열번호: 57의 중쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편 및 서열번호: 85의 경쇄, 이의 변이체 또는 이의 단편,
    을 갖는 것인, 인간화 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항체 및 담체 단백질을 포함하는 키메라 단백질.
  20. (i) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 제19항의 키메라 단백질 및 (ii) 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 혈소판 상에 존재하는 당단백질 I(b)α(GPIbα)와 GPIbα 리간드 사이의 상호작용을 방지 또는 제한하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항체, 또는 제19항의 키메라 단백질 또는 제20항의 약제학적 조성물과 상기 혈소판을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    혈소판 활성화를 방지 또는 제한하기 위한, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    GPIbα 리간드가 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및/또는 트롬빈인, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    접촉이 저전단 또는 고전단 속도 하에 일어나는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체, 키메라 단백질 또는 약제학적 조성물이 GPIbα 리간드가 혈소판과 접촉되기 전, 동시 또는 후에 혈소판과 접촉되는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    필요로 하는 대상체에서 생체내(in vivo) 상호작용을 방지하거나 제한하기 위한, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    필요로 하는 대상체에서 혈전의 형성 또는 성장을 방지하기 위한, 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    필요로 하는 대상체에서 혈전의 크기 또는 혈전의 수를 감소시키는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 혈전의 존재, 위치 및/또는 크기를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 병리학적 혈전증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는, 방법.
  31. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 허혈성 뇌졸중, 혈전성 혈소판감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura), 심근경색증, 급성 관상동맥 증후군, 죽상혈전증(atherothrombosis), 말초혈관 질환, 심부 정맥 혈전증, 패혈증, 및/또는 혈관 염증을 경험할 위험이 있거나 경험한 적이 있는, 방법.
  32. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 감소 또는 제한하기 위한, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    대상체에서 종양 전이의 존재, 위치 및/또는 크기를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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