JP2020533022A - ヒトトロンビン受容体par4に対する結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で引用または参照される全ての文書、及び本明細書で引用される文書内で引用または参照される全ての文書は、本明細書で言及される任意の製品に対するまたは本明細書での参照により組み込まれる任意の文書内での任意の製造業者の指示、記述、製品仕様、及び製品シートと共に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、ヒトプロテアーゼ活性化受容体4(PAR4)結合タンパク質(例えば、抗体)を対象とする。詳細には、ヒトPAR4のアンタゴニストである抗PAR4結合タンパク質、ならびにその方法及び使用を対象とする。
(i)配列番号11に示される配列を含むVH及び配列番号12に示される配列を含むVLを含む前述の5A.RC3抗体;
(ii)配列番号45に示される配列を含むVH及び配列番号46に示される配列を含むVLを含む5I.RG1;
(iii)配列番号22に示される配列を含むVH及び配列番号23に示される配列を含むVLを含む5F.RF3;
(iv)配列番号53に示される配列を含むVH及び配列番号54に示される配列を含むVLを含む5G.RA1;
(v)配列番号89に示される配列を含むVH及び配列番号90に示される配列を含むVLを含む5D.RH4;
(vi)配列番号91に示される配列を含むVH及び配列番号92に示される配列を含むVLを含む5H.RH4;
(vii)配列番号93に示される配列を含むVH及び配列番号94に示される配列を含むVLを含む5G.RF6;
(viii)配列番号95に示される配列を含むVH及び配列番号96に示される配列を含むVLを含む5G.RD6;
(ix)配列番号97に示される配列を含むVH及び配列番号98に示される配列を含むVLを含む5H.RA3;
(x)配列番号99に示される配列を含むVH及び配列番号100に示される配列を含むVLを含む5G.RG1;
(xi)配列番号103に示される配列を含むVH及び配列番号104に示される配列を含むVLを含む5H.RG4;
(xii)配列番号103に示される配列を含むVH及び配列番号104に示される配列を含むVLを含む5G.RC5;
(xiii)配列番号105に示される配列を含むVH及び配列番号106に示される配列を含むVLを含む5F.RE6;または
(xiv)配列番号107に示される配列を含むVH及び配列番号108に示される配列を含むVLを含む5H.RF2が、配列番号2、配列番号4、もしくは配列番号7に示される配列を含むもしくはそれからなるペプチド、またはヒトPAR4(例えば、配列番号19)。
(i)配列番号11に示される配列を含むVH及び配列番号12に示される配列を含むVLを含む前述の5A.RC3抗体;
(ii)配列番号45に示される配列を含むVH及び配列番号46に示される配列を含むVLを含む5I.RG1;
(iii)配列番号22に示される配列を含むVH及び配列番号23に示される配列を含むVLを含む5F.RF3;
(iv)配列番号53に示される配列を含むVH及び配列番号54に示される配列を含むVLを含む5G.RA1;
(v)配列番号89に示される配列を含むVH及び配列番号90に示される配列を含むVLを含む5D.RH4;
(vi)配列番号91に示される配列を含むVH及び配列番号92に示される配列を含むVLを含む5H.RH4;
(vii)配列番号93に示される配列を含むVH及び配列番号94に示される配列を含むVLを含む5G.RF6;
(viii)配列番号95に示される配列を含むVH及び配列番号96に示される配列を含むVLを含む5G.RD6;
(ix)配列番号97に示される配列を含むVH及び配列番号98に示される配列を含むVLを含む5H.RA3;
(x)配列番号99に示される配列を含むVH及び配列番号100に示される配列を含むVLを含む5G.RG1;
(xi)配列番号103に示される配列を含むVH及び配列番号104に示される配列を含むVLを含む5H.RG4;
(xii)配列番号103に示される配列を含むVH及び配列番号104に示される配列を含むVLを含む5G.RC5;
(xiii)配列番号105に示される配列を含むVH及び配列番号106に示される配列を含むVLを含む5F.RE6;または
(xiv)配列番号107に示される配列を含むVHを含む5H.RF2。
(配列中、
X1はVまたはIであり、
X2はAまたはVであり、
X3はTまたはAであり、
X4はLまたはFであり、
X5はNまたはSであり、
X6はYまたはDであり、
X7はSまたはAであり、;
X8はYまたはFであり、
X9はSまたはRであり、
X10はNまたはSであり、
X11はKまたはRであり、
X12はHまたはYであり、
X13はA、L、またはTであり、
X14はKまたはRであり、
X15はTまたはDであり、
X16はNまたはTであり、
X17はLまたはQであり、
X18はYまたはFであり、
X19はSまたはIであり、
X20はSまたはTであり、
X21はI、S、またはAであり、
X22はV、I、M、またはLであり、
X23はE、S、V、またはIであり、
X24はV、T、R、またはGであり、
X25はL、R、またはGであり、
X26はPまたはVである)
(配列中、
X1はKまたはEであり、
X2はVまたはAであり、
X3はRまたはGであり、
X4はAまたはTであり、
X5はRまたはSであり、
X6はVまたはIであり、
X7はNまたはSであり、
X8はNまたはSであり、
X9はFまたはYであり、
X10はFまたはLであり、
X11はIまたはTであり、
X12はIまたはTであり、
X13はFまたはLであり、
X14はSまたはTであり、
X15はVまたはLであり、
X16はN、R、またはSである)
(i)GFTLSNYG(配列番号13);
(ii)GFTFSSDG(配列番号59);
(iii)GFTFSNYG(配列番号68);
(iv)GFTFSSYG(配列番号55);
(v)GFAFSSYG(配列番号70);及び
(vi)GFTLSSYG(配列番号75)。
(i)IWYDGSNK(配列番号14);
(ii)IWFDGRNK(配列番号60);
(iii)IWYDGSNR(配列番号71);及び
(iv)IWYDGSSK(配列番号76)。
(i)ARESIVEVLPPFDY(配列番号15);
(ii)ARESSISTRPPFDY(配列番号61);
(iii)ARETIMVRGVPFD(配列番号69);
(iv)ARETALVRGVPFDY(配列番号56);
(v)ARETAMVRGVPFDY(配列番号72);及び
(vi)ARETILIGGVPFDY(配列番号77)。
(i)QRVRNNY(配列番号16);
(ii)QSVRSSY(配列番号57);及び
(iii)QSIRSNY(配列番号78)。
(i)QQYGNSYT(配列番号18);
(ii)QQYGRSYT(配列番号62);及び
(iii)QQYGSSYT(配列番号58)。
(配列中、
X1はAまたはSであり、
X2はTまたはAであり、
X3はVまたはIであり、
X4はYまたはSであり、
X5はGまたはSであり、
X6はLまたはFであり、
X7はN、D、またはTであり、
X8はYまたはFであり、
X9はSまたはRであり、
X10はRまたはHであり、
X11はNまたはIであり、
X12はSまたはTであり、
X13はTまたはSであり、
X14はNまたはTであり、
X15はKまたはNであり、
X16はFまたはLであり、
X17はKまたはNであり、
X18はAまたはKであり、
X19はI、F、またはVであり、
X20はYまたはHであり、
X21はNまたはSであり、
X22はR、G、またはSであり、
X23はVまたはHである)
(配列中、
X1はVまたはAであり、
X2はVまたはIであり、
X3はSまたはTであり、
X4はS、Y、またはNであり、
X5はKまたはIであり、
X6はNまたはKであり、
X7はRまたはSであり、
X8はRまたはQであり、
X9はTまたはAであり、
X10はTまたはSであり、
X11はQまたはRであり、
X12はT、S、またはNであり、
X13はNまたはNであり、
X14はEまたはGである)
(i)GGSLSDYY(配列番号86);
(iii)SGSFSTYF(配列番号47);及び
(iv)GGSFSNYY(配列番号66)。
(i)INHSGTT(配列番号87);
(ii)IIHTGST(配列番号64);または
(iii)INHSGST(配列番号48)。
(i)AIEYSNSRGYYYGMDV(配列番号88);
(ii)AFEYSSSGGYYYGMDV(配列番号49);及び
(iii)KVEHSSSSGHYYYGMDV(配列番号65)。
(i)QTISNY(配列番号109);
(ii)QSISSY(配列番号50);及び
(iii)QTISYY(配列番号66)。
(i)RQNYNTPLT(配列番号85);
(iii)QQTYSTPLT(配列番号52);または
(iv)QQSYSTPLT(配列番号67)。
(i)配列番号13、配列番号14、及び配列番号15;
(ii)配列番号47、配列番号48、及び配列番号49;
(iii)配列番号24、配列番号25、及び配列番号26;
(iv)配列番号55、配列番号14、及び配列番号56;
(v)配列番号59、配列番号60、及び配列番号61;
(vi)配列番号63、配列番号64、及び配列番号65;
(vii)配列番号68、配列番号14、及び配列番号69;
(viii)配列番号70、配列番号71、及び配列番号72;
(ix)配列番号55、配列番号73、及び配列番号74;
(x)配列番号75、配列番号76、及び配列番号77;
(xi)配列番号79、配列番号80、及び配列番号81;
(xii)配列番号82、配列番号80、及び配列番号83;
(xiii)配列番号55、配列番号73、及び配列番号74;または
(xiv)配列番号86、配列番号87、及び配列番号88。
(i)配列番号16、配列番号17、及び配列番号18;
(ii)配列番号50、配列番号51、及び配列番号52;
(iii)配列番号27、配列番号28、及び配列番号29;
(iv)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(v)配列番号57、配列番号28、及び配列番号62;
(vi)配列番号66、配列番号51、及び配列番号67;
(vii)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(viii)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(ix)配列番号78、配列番号28、及び配列番号62;
(x)配列番号84、配列番号51、及び配列番号85;
(xi)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(xii)配列番号57、配列番号51、及び配列番号58;または
(xiii)配列番号109、配列番号51、及び配列番号85。
(i)配列番号11、配列番号22、配列番号45、配列番号53、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、もしくは配列番号107のうちのいずれか1つに示される配列に対し、少なくとも50%同一である配列を含むVH、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン;及び/または
(ii)配列番号12、配列番号23、配列番号46、配列番号54、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、もしくは配列番号108に示される配列に対し、少なくとも85%同一である配列を含むVL、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン。
(i)配列番号11に示されるVH及び配列番号12に示されるVL;
(ii)配列番号45に示されるVH及び配列番号46に示されるVL;
(iii)配列番号22に示されるVH及び配列番号23に示されるVL;
(iv)配列番号53に示されるVH及び配列番号54に示されるVL;
(v)配列番号89に示されるVH及び配列番号90に示されるVL;
(vi)配列番号91に示されるVH及び配列番号92に示されるVL;
(vii)配列番号93に示されるVH及び配列番号94に示されるVL;
(viii)配列番号95に示されるVH及び配列番号96に示されるVL;
(ix)配列番号97に示されるVH及び配列番号98に示されるVL;
(x)配列番号99に示されるVH及び配列番号100に示されるVL;
(xi)配列番号101に示されるVH及び配列番号102に示されるVL;
(xii)配列番号103に示されるVH及び配列番号104に示されるVL;
(xiii)配列番号105に示されるVH及び配列番号106に示されるVL;または
(xiv)配列番号107に示されるVH及び配列番号108に示されるVL。
(i)1本鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);
(iii)重鎖定常領域またはFcまたは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/またはCH3に結合している(i)及び/または(ii)のうちの少なくとも1つ;または
(iv)血小板に結合するタンパク質(例えば、フォン・ウィルブランド因子(vWF))に連結している(i)及び/または(ii)のうちの少なくとも1つ である。
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;
(iii)テトラボディ;
(iv)Fab;
(v)F(ab′)2;
(vi)Fv;または
(vii)重鎖定常領域またはFcまたは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/またはCH3に連結している(i)〜(vi)のうちの少なくとも1つ;または
(viii)血小板に結合するタンパク質(例えば、vWF)に連結している(i)〜(vi)のうちの少なくとも1つ である。
(i)プロモーター;
(ii)第1のポリペプチドをコードする核酸;
(iii)内部リボソーム進入部位;及び
(iv)第2のポリペプチドをコードする核酸。
(i)(例えば、プロモーターに対し作用可能に連結したVHを含む)ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現コンストラクト、及び
(ii)(例えば、プロモーターに対し作用可能に連結したVLを含む)ポリペプチドをコードする核酸を含む第2の発現コンストラクト
を含む組成物であって、第1及び第2のポリペプチドが会合して本開示のPAR4結合タンパク質を形成する、組成物も提供する。
(i)プロモーターに対し作用可能に連結した(例えば、VHを含む)ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現コンストラクト、及び
(ii)プロモーターに対し作用可能に連結した(例えば、VLを含む)ポリペプチドをコードする核酸を含む第2の発現コンストラクト
であって、第1及び第2のポリペプチドが会合して本開示のPAR4結合タンパク質を形成する、第1の発現コンストラクト及び第2の発現コンストラクトを含む。
(i)配列番号32に示される配列に対し少なくとも50%同一である配列を含むVH、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン;及び/または
(ii)配列番号33に示される配列に対し少なくとも85%同一である配列を含むVL、またはそのヒト化、キメラ、または脱免疫化バージョン。
配列番号1:PAR4のエピトープ配列
配列番号2:hPAR4の配列(裸)
配列番号3:mPAR4の配列(裸)
配列番号4:免疫原として使用したhPAR4(KLH)の配列
配列番号5:免疫原として使用したmPAR4(KLH)の配列
配列番号6:mPAR4(ビオチン)の配列
配列番号7:hPAR4(ビオチン)の配列
配列番号8:hPAR3(ビオチン)の配列
配列番号9:hPAR2(ビオチン)の配列
配列番号10:hPAR1(ビオチン)の配列
配列番号11:5A.RC3 VHのアミノ酸配列
配列番号12:5A.RC3 VLのアミノ酸配列
配列番号13:5A.RC3 VH CDR1の配列
配列番号14:5A.RC3 VH CDR2の配列
配列番号15:5A.RC3 VH CDR3の配列
配列番号16:5A.RC3 VL CDR1の配列
配列番号17:5A.RC3 VL CDR2の配列
配列番号18:5A.RC3 VL CDR3の配列
配列番号19:ヒトPAR4の配列
配列番号20:5A.RC3 VHの核酸配列
配列番号21:5A.RC3 VLの核酸配列
配列番号22:5A.RC3 VHのアミノ酸配列
配列番号23:5F.RF3 VLのアミノ酸配列(5F.RF3)
配列番号24:5F.RF3 VH CDR1の配列
配列番号25:5F.RF3 VH CDR2の配列
配列番号26:5F.RF3 VH CDR3の配列
配列番号27:5F.RF3 VL CDR1の配列
配列番号28:5F.RF3 VL CDR2の配列
配列番号29:5F.RF3 VL CDR3の配列
配列番号30:5F.RF3 VHの核酸配列
配列番号31:5F.RF3 VLの核酸配列
配列番号32:5H.RD2 VHのアミノ酸配列
配列番号33:5H.RD2 VLのアミノ酸配列
配列番号34:5H.RD2 VH CDR1の配列
配列番号35:5H.RD2 VH CDR2の配列
配列番号36:5H.RD2 VH CDR3の配列
配列番号37:5H.RD2 VL CDR1の配列
配列番号38:5H.RD2 VL CDR2の配列
配列番号39:5H.RD2 VL CDR3の配列
配列番号40:5H.RD2 VHの核酸配列
配列番号41:5H.RD2 VLの核酸配列
配列番号42:エピトープ配列
配列番号43:エピトープ配列
配列番号44:エピトープ配列
配列番号45:5I.RG1 VHのアミノ酸配列
配列番号46:5I.RG1 VLのアミノ酸配列
配列番号47:5I.RG1 VH CDR1の配列
配列番号48:5I.RG1 VH CDR2の配列
配列番号49:5I.RG1 VH CDR3の配列
配列番号50:5I.RG1 VL CDR1の配列
配列番号51:5I.RG1 VL CDR2の配列
配列番号52:5I.RG1 VL CDR3の配列
配列番号53:5G.RA1 VHのアミノ酸配列
配列番号54:5G.RA1 VLのアミノ酸配列
配列番号55:5G.RA1 VH CDR1の配列
配列番号14:5G.RA1 VH CDR2の配列
配列番号56:5G.RA1 VH CDR3の配列
配列番号57:5G.RA1 VL CDR1の配列
配列番号28:5G.RA1 VL CDR2の配列
配列番号58:5G.RA1 VL CDR3の配列
配列番号89:5D.RH4 VHのアミノ酸配列
配列番号90:5D.RH4 VLのアミノ酸配列
配列番号59:5D.RH4 VH CDR1の配列
配列番号60:5D.RH4 VH CDR2の配列
配列番号61:5D.RH4 VH CDR3の配列
配列番号57:5D.RH4 VL CDR1の配列
配列番号28:5D.RH4 VL CDR2の配列
配列番号62:5D.RH4 VL CDR3の配列
配列番号91:5H.RH4 VHのアミノ酸配列
配列番号92:5H.RH4 VLのアミノ酸配列
配列番号63:5H.RH4 VH CDR1の配列
配列番号64:5H.RH4 VH CDR2の配列
配列番号65:5H.RH4 VH CDR3の配列
配列番号66:5H.RH4 VL CDR1の配列
配列番号51:5H.RH4 VL CDR2の配列
配列番号67:5H.RH4 VL CDR3の配列
配列番号93:5G.RF6 VHのアミノ酸配列
配列番号94:5G.RF6 VLのアミノ酸配列
配列番号68:5G.RF6 VH CDR1の配列
配列番号14:5G.RF6 VH CDR2の配列
配列番号69:5G.RF6 VH CDR3の配列
配列番号57:5G.RF6 VL CDR1の配列
配列番号28:5G.RF6 VL CDR2の配列
配列番号58:5G.RF6 VL CDR3の配列
配列番号95:5G.RD6 VHのアミノ酸配列
配列番号95:5G.RD6 VLのアミノ酸配列
配列番号70:5G.RD6 VH CDR1の配列
配列番号71:5G.RD6 VH CDR2の配列
配列番号72:5G.RD6 VH CDR3の配列
配列番号57:5G.RD6 VL CDR1の配列
配列番号28:5G.RD6 VL CDR2の配列
配列番号58:5G.RD6 VL CDR3の配列
配列番号97:5H.RA3 VHのアミノ酸配列
配列番号98:5H.RA3 VLのアミノ酸配列
配列番号55:5H.RA3 VH CDR1の配列
配列番号73:5H.RA3 VH CDR2の配列
配列番号74:5H.RA3 VH CDR3の配列
配列番号57:5H.RA3 VL CDR1の配列
配列番号28:5H.RA3 VL CDR2の配列
配列番号58:5H.RA3 VL CDR3の配列
配列番号99:5G.RG1 VHのアミノ酸配列
配列番号100:5G.RG1 VLのアミノ酸配列
配列番号75:5G.RG1 VH CDR1の配列
配列番号76:5G.RG1 VH CDR2の配列
配列番号77:5G.RG1 VH CDR3の配列
配列番号78:5G.RG1 VL CDR1の配列
配列番号28:5G.RG1 VL CDR2の配列
配列番号62:5G.RG1 VL CDR3の配列
配列番号101:5H.RG4 VHのアミノ酸配列
配列番号102:5H.RG4 VLのアミノ酸配列
配列番号79:5H.RG4 VH CDR1の配列
配列番号80:5H.RG4 VH CDR2の配列
配列番号81:5H.RG4 VH CDR3の配列
配列番号57:5H.RG4 VL CDR1の配列
配列番号28:5H.RG4 VL CDR2の配列
配列番号58:5H.RG4 VL CDR3の配列
配列番号103:5G.RC5 VHのアミノ酸配列
配列番号104:5G.RC5 VLのアミノ酸配列
配列番号82:5G.RC5 VH CDR1の配列
配列番号80:5G.RC5 VH CDR2の配列
配列番号83:5G.RC5 VH CDR3の配列
配列番号57:5G.RC5 VL CDR1の配列
配列番号51:5G.RC5 VL CDR2の配列
配列番号58:5G.RC5 VL CDR3の配列
配列番号105:5F.RE6 VHのアミノ酸配列
配列番号106:5F.RE6 VLのアミノ酸配列
配列番号55:5F.RE6 VH CDR1の配列
配列番号73:5F.RE6 VH CDR2の配列
配列番号74:5F.RE6 VH CDR3の配列
配列番号84:5F.RE6 VL CDR1の配列
配列番号51:5F.RE6 VL CDR2の配列
配列番号85:5F.RE6 VL CDR3の配列
配列番号107:5H.RF2 VHのアミノ酸配列
配列番号108:5H.RF2 VLのアミノ酸配列
配列番号86:5H.RF2 VH CDR1の配列
配列番号87:5H.RF2 VH CDR2の配列
配列番号88:5H.RF2 VH CDR3の配列
配列番号109:5H.RF2 VL CDR1の配列
配列番号51:5H.RF2 VL CDR2の配列
配列番号85:5H.RF2 VL CDR3の配列。
本明細書全体において、別段の明記がない限り、または文脈上他の意味が要求されない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への言及は、これらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群のうちの1つ及び複数(すなわち1つ以上)を包含するように解釈するものとする。
本明細書で使用される場合、文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」には複数の指示対象が含まれる。「a」(または「an」)、ならびに「1つ以上」及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
誤解を避けるために言及するが、モノクローナル抗体mAb ARC3は、実施例に示されるようなこの抗体の他の名称、例えばMoB5A−RC3と同義である。この抗体をさらにサブクローニングして、派生モノクローナル抗体MoB5−ARC3.F10b.H4bとしている。このサブクローンもmAb ARC3.H4bと呼ばれる。この抗体に対応する配列は、配列番号11〜18に見いだされる。
本開示は、抗体mAb ARC3.H4bの重鎖及び軽鎖可変領域配列における1つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を伴い、ただしmAb ARC3.H4bの機能を依然として保持する抗PAR4抗体またはその抗原結合断片も企図している。いくつかの例において、PAR4結合タンパク質は、10以下の保存的アミノ酸置換、例えば、9、または8、または7、または6、または5、または4、または3、または2、または1個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖及び/または疎水性親水性及び/または親水性を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。疎水性親水性指標は、例えばKyte and Doolittle(1982)に記載されており、親水性指標は、例えばUS4554101に記載されている。
抗体を生成するための方法は当技術分野で知られており、及び/またはHarlow and Lane(1988)またはZola(1987)に記載されている。概して、このような方法では、任意選択で任意の好適なまたは所望の担体、アジュバント、または医薬的に許容される賦形剤と共に製剤化されたFnl4タンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープ含有、またはそれを発現し示す細胞(すなわち、免疫原)が、非ヒト動物に、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはブタに投与される。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または他の既知の経路により投与することができる。
本開示の抗体またはPAR4結合タンパク質の1つの例はキメラ抗体である。すなわち、PAR4結合タンパク質はキメラタンパク質である。「キメラタンパク質」という用語は、抗原結合ドメインVHまたはVLが、特定の種(例えば、マウスもしくはラットのようなネズミ科動物)に由来するタンパク質内、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するタンパク質内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖(複数可)の残部が、別の種(例えば、ヒトのような霊長類)に由来するタンパク質内、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するタンパク質内の対応する配列と同一または相同である、タンパク質を指す。1つの例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体(例えば、ネズミ科動物抗体)からのVH及びVLを含むキメラ抗体であり、抗体の残りの領域はヒト抗体からのものである。このようなキメラタンパク質の産生は当技術分野で知られており、標準的な手段(例えば、US6331415;US5807715;US4816567;及びUS4816397に記載のもの)によって達成することができる。このようなキメラ抗体の産生は当技術分野で知られており、標準的な手段(例えば、Morrison,Science 229:1202(1985);Oi et al,BioTechniques 4:214(1986);Gillies et al,(1989)J.Immunol. Methods 125:191−202;米国特許第5,807,715号;第4,816,567号;及び第4,816,397号に記載のもの)によって達成することができる。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGl0、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18、またはIgG19定常領域から選択され得ることが企図されている。
本開示のPAR4結合タンパク質は、ヒト化またはヒトであり得る。
本開示のPAR4結合タンパク質は、合成ヒト化タンパク質であってもよい。「合成ヒト化タンパク質」という用語は、WO2007/019620に記載の方法により調製されるタンパク質を指す。合成ヒト化PAR4結合タンパク質は、可変領域が新世界霊長類抗体可変領域からのFRと非新世界霊長類抗体可変領域からのCDRとを含む、抗体の可変領域を含む。例えば、合成ヒト化PAR4結合タンパク質は、可変領域が新世界霊長類抗体可変領域からのFWRとマウス抗体からのCDR(例えば、本明細書に記載のもの)とを含む、抗体の可変領域を含む。1つの例において、合成ヒト化PAR4結合タンパク質は、可変領域の一方または両方が合成ヒト化されているPAR4結合抗体である。
本開示は、脱免疫化された抗体またはPAR4結合タンパク質も企図している。脱免疫化抗体は、1つ以上のエピトープ、例えば、B細胞エピトープまたはT細胞エピトープを除去する(すなわち、変異させる)ことにより、対象が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性を低減する。脱免疫化抗体及びタンパク質を産生するための方法は当技術分野で知られており、例えば、WOOO/34317、WO2004/108158、及びWO2004/064724に記載されている。
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本開示のPAR4結合タンパク質は単一ドメイン抗体である(この名称は、「ドメイン抗体」または「dAb」という用語と互換的に使用される)。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全てまたは部分を含む、単一のポリペプチド鎖である。あるいくつかの例において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,MA;例えば、US6248516;WO90/05144;及び/またはWO2004/058820を参照)。
抗体抗原結合ドメインを含む例示的なPAR4結合タンパク質は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びより高次のタンパク質複合体、例えばWO98/044001及びWO94/007921に記載のものである。
当業者は、scFvが単一ポリペプチド鎖内にVH領域及びVL領域を含むことを認識しているであろう。ポリペプチド鎖はさらに、VHとVLとの間に、scFvが抗原結合に望ましい(すなわち、単一ポリペプチド鎖のVH及びVLが互いに会合してFvを形成するのに望ましい)構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。例えば、リンカーは、scFvに対しより好ましいリンカーの1つである(Gly4Ser)3と共に12個超のアミノ酸残基を含む。
当業者は、ミニボディが、抗体の(CH2ドメイン及び/または(CH3ドメインと融合した抗体のVHドメイン及びVLドメインを含むことを認識しているであろう。任意選択で、ミニボディはVHとVLとの間にヒンジ領域を含み、この立体構造はFlexミニボディと呼ばれることもある。ミニボディは、CH1もCLも含まない。1つの例において、VHドメイン及びVLドメインは、抗体のヒンジ領域及びCH3ドメインと融合している。当該ミニボディの可変領域の少なくとも1つが、本開示の方式でPAR4に結合する。例示的なミニボディ及びその生成方法は、例えば、WO94/09817に記載されている。
本開示はPAR4結合タンパク質を含む他の可変領域も企図しており、例えば以下のものが挙げられる:
(i)US5,731,168に記載の「キー・アンド・ホール(key and hole)」二重特異性タンパク質;
(ii)ヘテロ結合体タンパク質(例えば、US4,676,980に記載のもの);
(iii)化学的クロスリンカーを用いて産生したヘテロ結合体タンパク質(例えば、US4,676,に記載のもの);
(iv)Fab′−SH断片(例えば、Shalaby(1992)j Exp Med 1;175(1):217−25に記載のもの);
(v)1本鎖Fab;または
(vi)Fab3(例えば、EP19930302894に記載のもの)。
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の化合物の1つの例は、免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質であり、例えば、T細胞受容体または重鎖免疫グロブリン(例えば、IgNA、ラクダ科動物抗体)である。
重鎖免疫グロブリンは、重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、多くの他の免疫グロブリン形態(例えば、抗体)と構造的に異なる。したがって、このような免疫グロブリンは「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類(IgNARとも呼ばれる)に見いだされる。
本開示のPAR4結合タンパク質の1つの例は、T細胞受容体である。T細胞受容体は2つのVドメインを有し、これらは化合して、抗体のFvモジュールに類似した構造となる。Novotny et al,Proc Natl Acad Sci USA 88:8646−8650,1991は、T細胞受容体の2つのVドメイン(アルファ及びベータと称される)がどのように融合し1本鎖ポリペプチドとして発現し得るか、さらに、どのように表面残基を改変して抗体scFvに直接的に類似する疎水性を低減するかについて記載している。2つのV−アルファ及びV−ベータドメインを含む1本鎖T細胞受容体または多量体T細胞受容体の産生について記載しているその他の刊行物としては、WO1999/045110またはWO2011/107595が挙げられる。
1つの例において、本開示のPAR4結合タンパク質はアドネクチンである。
さらなる例において、本開示のPAR4結合タンパク質はアンチカリンである。アンチカリンは、疎水性小分子(例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、及び脂質)を輸送する細胞外タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、円錐状構造の開放端部に複数のループを有する剛性のβシート二次構造を有し、このループは、抗原に結合するように操作することができる。このような操作されたリポカリンはアンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる説明については、US7250297B1またはUS20070224633を参照。
さらなる例において、本開示のPAR4結合タンパク質はアフィボディである。アフィボディは、Staphylococcus aureusのプロテインAのZドメイン(抗原結合ドメイン)に由来するスキャフォールドであり、このZドメインは抗原に結合するように操作することができる。Zドメインは、およそ58アミノ酸の3本ヘリックス束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、EP1641818を参照。
さらなる例において、本開示のPAR結合タンパク質はアビマーである。アビマーは、Aドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。およそ35アミノ酸のネイティブドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Aドメインのファミリーにより示される天然の変形形態をシャッフルすることにより生成される。さらなる詳細については、WO2002088171を参照。
さらなる例において、本開示のPAR4結合タンパク質は、設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)である。DARPinは、複合膜タンパク質が細胞骨格に付着するのを媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、2つのaヘリックス及び1つのβターンからなる33残基のモチーフである。DARPinは、各リピートの第1のaヘリックス及びβターン内の残基をランダム化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。モジュールの数を増加させることにより、DARPinの結合界面を増加させることができる(親和性成熟法)。さらなる詳細については、US20040132028を参照。
結合ドメインを含むその他の非抗体タンパク質としては、ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン(アフィリン)、ヒトプロテアーゼ阻害物質のクニッツ型ドメイン、Ras結合タンパク質AF−6のPDZドメイン、サソリ毒(カリブドトキシン)、C型レクチンドメイン(テトラネクチン)に基づくものが挙げられる。
本開示は、可変領域及び定常領域またはそのドメイン(複数可)(例えば、CH2及び/またはCH3)を含むPAR4結合タンパク質を包含する。当業者は、本明細書の開示及び本明細書で論じられている参考文献に基づき、定常領域及び定常ドメインという用語の意味を認識しているであろう。
本開示は、本開示の配列に対し少なくとも80%の同一性を有し、かつ本明細書で記載または特許請求されている機能的特徴と同じPAR4結合タンパク質を提供する。
さらなる例において、本開示の既存のPAR4結合タンパク質は、増加した親和性でPAR4に結合可能な抗体を産生するように親和性が成熟している。例えば、VL及び/またはVHをコードする配列を単離し、CDRコード領域(例えば、VL及び/またはVHのCDR3をコードする領域)を1つ以上のアミノ酸置換が導入されるように変異させる。次いで、得られた変異PAR4結合タンパク質において、例えば競合的アッセイで、PAR4に対する結合をスクリーニングする。
1つの例において、本開示のPAR4結合タンパク質は、細胞株(例えば、本明細書に記載されている及び/または当技術分野で知られているように、例えば、当該タンパク質の産生に十分な条件下でのハイブリドーマ)を培養することにより産生される。
組換えタンパク質の場合には、組換えタンパク質をコードする核酸を1つ以上の発現コンストラクト(例えば、発現ベクター(複数可))内に入れて、次いで宿主細胞(例えば、ジスルフィド架橋または結合をもたらし得る細胞、例えば、E.coli細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞)に形質移入する。例示的な哺乳類細胞としては、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または別の形で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞が挙げられる。このような目的を達成するための分子クローニング技法は当技術分野で知られており、例えば、AusubelまたはSambrookに記載されている。幅広い種類のクローニング及びin vitro増幅の方法が組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体を産生する方法も当技術分野で知られている。US4816567、US7923221、及びUS7022500を参照。
本開示のPAR4結合タンパク質は、単離することも精製することもできる。
本開示は、任意の例に従う本明細書に記載のPAR4結合タンパク質の結合体も提供する。タンパク質が結合体化し得る化合物の例は、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群より選択される。例示的な治療剤としては、以下に限定されないが、抗血管新生剤、抗新血管形成剤及び/またはその他の血管形成剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤、または治療核酸が挙げられる。毒素には、細胞に対し有害な(例えば、細胞を殺滅する)任意の薬剤が含まれる。当技術分野で知られている薬物のクラスについての記載、及びそれらの作用機序についてはGoodman et ah,(1990)を参照。免疫グロブリン−免疫毒素結合体の調製に適切なさらなる技法は、例えば、US5194594に示されている。例示的な毒素としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンシンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、momordica charantia阻害物質、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、W093/21232を参照。
1つの例において、PAR4結合タンパク質は、固体マトリックスまたは半固体マトリックス上に固定される。「固定」という用語は、例えば、W099/56126またはWO02/26292に記載のような、タンパク質を特定のマトリックスに固定するための様々な方法及び技法を伴うものと理解されたい。例えば、固定は、タンパク質を安定化して、特に保管中または単一バッチ使用において、生物学的、化学的、または物理的な露出によってタンパク質の活性が低減または有害に修飾されないようにするのに役立ち得る。マトリックス上にタンパク質を固定するための様々な方法が当技術分野で知られており、このような方法としては、架橋、担体との結合、半透性マトリックス内での保持が挙げられる。例示的なマトリックスとしては、多孔質ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロン、またはポリアクリルアミドが挙げられる。
結合アッセイ
このようなアッセイの1つの形態は、例えば、Scopes(1994)Protein Purification: principles and practice Springer−Verlagに記載のような抗原結合アッセイである。このような方法は、概して、PAR4結合タンパク質を標識することと、当該タンパク質を固定した抗原またはその断片に、例えば、(例えば、配列番号6に示されるような)ビオチンと融合したPAR4の細胞外部分を含むタンパク質に接触させることとを伴う。洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、標識の量、そして結果として結合タンパク質が検出される。当然ながら、PAR4結合タンパク質を固定し抗原を標識することができる。パニング型アッセイも使用することができる。本明細書における実施例は、HEK細胞の表面上に発現させることができるflagタグ付きPAR4に基づいた結合アッセイを記載している。トロンビンの存在下でのPAR4結合タンパク質によるPAR4切断の阻害は、フローサイトメトリーによって測定することができる。
本開示の抗体(例えば、mAb ARC3.H4b)の結合を競合的に阻害するPAR4結合タンパク質を測定するためのアッセイは、当業者には明らかであろう。例えば、本開示の抗体を、検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射性標識と複合体化させる。次いで、標識抗体及び試験PAR4結合タンパク質を混合し、抗体またはそのエピトープを含むペプチドのFc領域と融合したPAR4またはその細胞外ドメインに接触させる。次いで、標識抗体のレベルを測定し、PAR4結合タンパク質の不在下で標識抗体をPAR4またはPAR4−Fc領域またはそのエピトープを含むペプチドと接触させたときに測定したレベルと比較する。試験PAR4結合タンパク質の存在下での標識抗体のレベルが、PAR4結合タンパク質の不在下の場合に比べて低減する場合、そのPAR4結合タンパク質は抗体の結合を競合的に阻害する。
別の例において、本明細書に記載のPAR4結合タンパク質が結合するエピトープがマッピングされている。エピトープマッピングの方法は、当業者には明らかであろう。例えば、目的エピトープを含むPAR4配列またはその領域にまたがる一連の重複ペプチド、例えば10〜15アミノ酸を含むペプチドが産生される。次いで、PAR4結合タンパク質を各ペプチドまたはその組合せに接触させ、当該タンパク質が結合するペプチド(複数可)を決定する。これにより、PAR4結合タンパク質が結合するエピトープを含むペプチド(複数可)を決定することができる。PAR4結合タンパク質が複数の非連続ペプチドに結合する場合、PAR4結合タンパク質は立体構造的エピトープに結合する可能性がある。
任意選択で、PAR4またはそのエピトープ含有ペプチドに対するPAR4結合タンパク質の解離定数(Kd)または会合定数(Ka)または結合定数(KD、すなわち、Ka/Kd)が測定される。PAR4結合タンパク質に対するこれらの定数は、放射標識または蛍光標識PAR4結合アッセイにより測定される1つの例である。このアッセイは、滴定系列の非標識PAR4の存在下、最小濃度の標識PAR4でPAR4結合タンパク質を平衡化する。結合していないPAR4を除去するために洗浄した後、標識の量を測定する。別の例に従えば、係数は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより、例えば、固定したPAR4またはその領域と共にBIAcore表面プラズモン共鳴(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)を使用することにより、測定される。
本開示の1つの例は、PAR4またはPAR4を発現する細胞(例えば、血小板)の存在を検出する。タンパク質または細胞の量、レベル、または存在は、当業者に知られている様々な技法のいずれかを用いて、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学検査、免疫蛍光法、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、タンデム質量分析(質量分析、LC MS/MSを含む)、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー技術、またはプロテインチップ技術からなる群より選択される技法を用いて測定される。
本明細書において有用な抗体の生成及び選択のための代替的な技法としては、リンパ球の(例えば、本明細書に記載の)PAR4タンパク質またはPAR4ペプチドに対するin vitro曝露、及び(例えば、固定または標識されたPAR4タンパク質またはペプチドの使用による)ファージまたは同様のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーの選択が挙げられる。有望なPAR4ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)上またはE.coliのような細菌上に示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複数の方法で、例えば、ランダム変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成により取得することができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーは、既知の標的と相互作用するペプチドのスクリーニングに使用することができ、既知の標的は、タンパク質またはポリペプチド(例えば、リガンドもしくは受容体)、生物もしくは合成の巨大分子、または有機もしくは無機の物質であり得る。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを創出及びスクリーニングするための技法は当該分野で知られており(Ladner et al.,米国特許第5,223,409号;Ladner et al.,米国特許第4,946,778号;Ladner et al.,米国特許第5,403,484号、及びLadner et al.,米国特許第5,571,698号)、ランダムペプチドディスプレイライブラリー及びこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Clontech(Palo Alto,Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego,Calif.)、New England Biolabs,Inc.(Beverly,Mass.)、及びPharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway,N.J.)から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、PAR4に結合するタンパク質を同定するために、本明細書で開示されているPAR4配列を用いてスクリーニングすることができる。PAR4ポリペプチドと相互作用するこのような「結合タンパク質」は、細胞のタグ付け、親和性精製によるホモログポリペプチドの単離に使用することができ、また薬物、毒素、放射性ヌクレオチドなどと直接的または間接的に複合体化させることができる。このような結合タンパク質は、例えば発現ライブラリー及び中和活性をスクリーニングするための分析方法で使用することもできる。また、結合タンパク質は、ポリペプチドの循環レベルを測定するための診断アッセイや、基礎病態または基礎疾患のマーカーとしての可溶性ポリペプチドを検出または定量化するための診断アッセイ向けに使用することもできる。このような結合タンパク質は、PAR4結合及びシグナル伝達をin vitro及びin vivoでブロックするためのPAR4「アンタゴニスト」として作用することもできる。このような抗PAR4結合タンパク質は、プロテアーゼ活性化PAR4に対する細胞応答の阻害に有用であると考えられる。
全てのPAR4バリアントに対するPAR4結合タンパク質の抗血栓活性は、全バリアントの有効性を確証するため、遺伝子型がホモ接合型Ala120もしくはThr120またはヘテロ接合型であると同定された人々からの血液を用いて、ex vivo血小板凝集アッセイで検証することができる。
マイクロプレートベース血小板光透過凝集測定法を使用して、血小板凝集を測定することができる(French et al(2016)Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:1642−1654)。
カルシウム流動は、二重色素レシオメトリックマイクロイメージングアッセイにより単離血小板で測定することができる(Nesbitt WS et al.(2012)Methods Mol Biol 788:73−89)。
血栓症のin vivo動物モデルは、PAR4活性化または抗血栓効果をin vivoでさらに評価することを含めて、本開示の抗体またはその断片をさらにまたは追加的にスクリーニング、評価、及び/または確認するために、当業者が利用することができる。このような動物モデルとしては、以下に限定されないが、頚動脈の電解質損傷に供するモデルが挙げられ、それにより、血栓形成(動脈閉塞までの時間)と、安定性(閉塞後の再疎通事象の回数及び程度)と、損傷した動脈を通る総血流とが検証される。
本開示のPAR4結合タンパク質(活性成分と同義)は、予防的治療または療法的治療のために、非経口、局所、経口、もしくは局在的投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物に製剤化するのに有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジが挙げられる。
(i)抗凝固剤、例えば、Fxa阻害物質、アピキサバンもしくはリバーロキサバンのようなFXIa阻害物質、またはダビガトランのようなトロンビン阻害物質;
(ii)抗血小板剤、例えば、アスピリンまたはP2Y12アンタゴニスト(例えば、クロピドグレル、チカグレロール、もしくはプラスグレル);
(iii)血管形成剤、例えば、血管新生阻害剤。
本明細書で論じられているように、本開示のPAR4結合タンパク質は、対象における血栓症または血栓塞栓性障害の治療、防止、または改善に使用することができる。
本開示は、本発明の検出/診断/予後判定/治療/予防の方法で使用するための、本開示の化合物を含む治療/予防/診断キットも提供する。このようなキットは概して、好適な収容手段で本開示のPAR4結合タンパク質を収容する。キットは、例えば、検出/単離/診断/イメージングまたは併用療法のための、他の化合物も収容することができる。例えば、このようなキットは、一連の抗凝固剤または抗血小板剤のうちのいずれか1つ以上を収容することができる。
抗体の生成
HumAbマウス(Regeneron Pharmaceuticals)を、以下の表2に記載のC末端KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)結合体化ペプチドで免疫化することにより、抗PAR4モノクローナル抗体を産生した。免疫化ペプチドは、hPAR4(配列番号2)のN末端トロンビン切断及び活性化部位に対応する。切断部位はRGによって示され、以下のヒトPAR4配列において下線付きで示される通りである。
裸ペプチド(配列番号3)に対しスクリーニングを実施した。
免疫化ペプチド及びSKB標識ペプチド(表2に示される)を、固相合成を用いてAuspep(Melbourne,Australia)により合成した。
ハイブリドーマ細胞を生成するため、マウスの脾臓を摘出し、分離して単一細胞懸濁液にし、ポリエチレングリコールを用いてSp2/0−Ag14骨髄腫細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を、20×96ウェル組織培養プレート内のアザセリンヒポキサンチン含有培地で成長させた。
マイクロアレイによるハイブリドーマ上清のスクリーニングを、標準的な技法に従って実施した。
96ウェルELISAプレートを、50μlの抗原をコーティングバッファー(0.1M炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)(Merck,#1.06329.0500))中4μg/mlの濃度まで希釈したものでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートした。
過去10年間抗血小板薬物を服用していない健康な成人(21〜50歳の男女)からインフォームドコンセントを取得した後、血液を収集した。血液は、肘前静脈から19ゲージ蝶型針を用いて、血小板単離については7分の1体積の酸性クエン酸デキストロース(ACD)(7:1v/v最終濃度)を含むシリンジに、または過去に記載のような全血流実験(Mountford JK et al(2015)Nat Commun 6:6535)については10分の1体積のクエン酸三ナトリウム(0.32%w/v最終濃度)を含むシリンジに採取した。
HumAbマウス(Murphy AJ et al.(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111:5153−5158)をRegeneron Pharmaceuticalsから入手した。HumAbマウスは、マウス重可変Ig座位及びκ軽可変Ig座位の3Mbセグメントをヒトの対応物で置き換えることにより、ヒト抗体応答の生成が可能になるように遺伝子操作されている(Murphy AJ et al.(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111:5153−5158)。HumAbマウスは、正常な可変セグメント再配置と、体細胞超変異と、クラススイッチングとを示し、モノクローナル抗体の大きな多様性をもたらすロバストな液性応答を示し、Regeneronが使用する、一連の標的に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためのプラットフォームである。
ヒトまたはマウスの洗浄済み血小板(5×107/mL)を抗PAR4抗体(0.1mg/ml)と共に37℃で30分間インキュベートし、次いでパラホルムアルデヒド(1%v/v最終濃度)で固定した。次いで、懸濁液を1000×gで2分間遠心分離して血小板ペレットを取得し、次いでこれを、FITC結合体化抗ウサギIgGの1:50希釈物を含む修飾タイロードバッファー(12mM NaHCO3、10mM HEPES pH7.4、137mM NaCl、2.7mM KCl、5.5mM D−グルコース、1mM CaCl2)に再懸濁した。室温で30分後、試料を再び遠心分離し、血小板ペレットを修飾タイロードバッファーに再懸濁し、フローサイトメーター(FACSCalibur,BD Biosciences)を使用することにより分析した。
1x106 HEK293T細胞(ダルベッコ修飾イーグル培地+10%ウシ胎仔血清中)を、形質移入の24時間前に12ウェルプレートに播種した。コンフルエントになったら、PAR4バリアント(pBJ−FLAG−PAR4−120A−296FまたはpBJ−FLAG−PAR4−120T−296F;Edelstein et al(2014)Blood 124(23):3450−8)のうちの1つからの1μgのDNAに加えて4μLのLipofectamine 2000を製造業者の指示に従って形質移入した。形質移入から48時間後、細胞を採取し、PBSで2回洗浄し、次いで再懸濁して1×106/mLのカウントにした。次いで細胞(50μLアッセイ/0.5x105細胞/条件)を1、10、もしくは100μg/mlの5RC3もしくはサブクローン5A.RC3.F10b.H4b、または100μg/mlのマッチしたアイソタイプ対照(マウスIgG1)のいずれかを用いて37℃で15分間前処置した。次いで細胞を2U/mLのトロンビンで10分間刺激した。4U/mLのヒルジンを加えることにより反応を停止した。次いで、細胞を1回洗浄し、FITC抗FLAG抗体(Sigma、クローンM2)の1:200希釈物を含むPBSで再懸濁し、暗中室温で1時間インキュベートした。次いで、細胞を1%パラホルムアルデヒド(最終濃度)で固定し、FC1/FITC陽性事象の%を測定するためにFACSCaliburフローサイトメーターで読み取った。データを静止試料(100%トロンビン処置なし)に対し正規化した。
表面プラズモン共鳴(SPR)は、標識なしでリアルタイムのタンパク質間相互作用の測定を可能にするバイオセンサー技術である。標準的な技法によりBio−Rad ProteOn XPR36アレイシステムまたはBiacore T200(GE system)を用いてタンパク質及び抗体のSPR結合分析を実施した。
ProteOnは、単回の注入ステップで最大36のタンパク質相互作用を分析するためのマルチチャネルモジュールと相互作用アレイセンサーチップとを備えたSPRバイオセンサーである。分析は、ビオチン化タンパク質及びペプチドの捕捉のためのアルギン酸ポリマーに結合したNeutrAvidinからなる表面を含む、ProteOn NLCバイオセンサーチップを用いて実施した。
2つの異なる方法、抗マウスFc捕捉アプローチ、またはProteoOnシステムを用いた上述と類似の方法のいずれかを用いて、Biacore T200でBiacore分析を実施した。
ヤギ抗マウスIgG Fcを伴った製造業者推奨のプロトコルを用いて、標準的なEDC/NHSアミンカップリング化学によりseries S CM5センサーチップを活性化した。抗hPAR4 mAbを1〜2ug/mlで2分間、フローセル2(FC2)上で10ul/m分にて捕捉し、フローセル1(FC1)を参照チャネルとして使用した。hPAR4ペプチドの希釈物をランニングバッファー(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween(登録商標)20及び0.1% BSA)で、典型的には1000、500、250、125、62.5nMで調製し、FC1及び2の両方に30ul/分で60〜100秒間流し、解離を80〜120秒間モニターした。バッファー単独のブランク注入も実施した。全ての注入を2連及びランダムな順序で実施した。各捕捉/注入/解離サイクル後、0.1MグリシンpH2.0の30秒注入によりチップを再生した。
製造業者推奨のプロトコルを用いてseries SセンサーチップSAを調整し、FC2上の1ug/ml hPAR4−ビオチン化ペプチド及びFC1上のhPAR1−ビオチン化ペプチド(対照)で固定した。抗hPAR4の希釈物をランニングバッファーで、典型的には10、5、2.5、1.25、6.25、及び0nMで調製し、FC1及び2の両方に100ul/分の流速で60秒間流し、解離を200秒間モニターした。バッファー単独のブランク注入も実施した。全ての注入を2連及びランダムな順序で実施した。各捕捉/注入/解離サイクル後、0.1MグリシンpH2.0の30秒注入によりチップを再生した。
血小板凝集は、96ウェルプレート形式において光透過凝集測定法により測定した。ヒト単離血小板(2×108/ml)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)(1%v/v)、PAR1アンタゴニストボラパキサル(90nM)、抗PAR4抗体5RC3(20〜100μg/ml)、またはボラパキサルと5RC3との組合せにより、37℃で10分間前処置した。血小板をトロンビン(0.1U/ml)で処置し、凝集を37℃で、FLUOstar OPTIMAプレートリーダー(BMG Labtech)内で595nm励起フィルターを用いて50分間の期間分析した(各読取り間に5分の二重軌道振とう期間を伴う10回の読み取りサイクル)。光学密度をブランク(最大値)及び非刺激血小板(最小値)に対し正規化し、最大値%として表現した。
クエン酸(3.2%)中に収集したヒト全血を、PE結合体化抗CD9抗体(4μg/mL)及び抗フィブリン抗体(5μg/ml)、ならびにヒルジン(800U/ml)、DMSO(1%v/v)、PAR−1アンタゴニストE5555(1μM)、抗PAR4抗体(0.2mg/ml)、または両方のPAR阻害物質の組合せのうちの1つと共に、37℃で15分間プレインキュベートした。全血を5〜7.5mM CaCl2(最終濃度)で再石灰化して凝固を開始し、ウシ1型コラーゲン(250μg/ml)でコーティングしたガラスマイクロスライド(1×0.1mm内径)に0.06ml/分の固定流速で取り出し、600s−1の壁剪断速度を得た。2色共焦点蛍光画像を488及び561nmの励起で記録し、40×水浸対物レンズを通じて収集した。共焦点z−スタックを修正前の2分間継続的に記録し、カルシウム非含有タイロードバッファーを血栓に流し、血栓野全体を包含するz−スタックを10分の期間にわたり記録した。抗CD9−PEを用いて血小板血栓を定義し、血栓野の平均蛍光を用いてフィブリン体積を定量化した。データをヒルジンベースラインに対し正規化し、対照のパーセンテージとして表現した。
QIAamp Blood Kit−Miniを製造業者の指示に従って用いて、ヒト全血のバフィーコートからゲノムDNA(gDNA)を抽出した。Taqman SNP遺伝子型判定アッセイ(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)を製造業者の指示に従って用いて、10ng DNAを用いて、DNA試料に対しrs773902の遺伝子型判定を行った。Roche 96ウェルプレートlightcyclerで、以下の熱サイクル条件を用いてPCRを実施した:95℃で15秒、60℃で60秒を40サイクル反復。(Mygo Pro)ソフトウェアを用いたエンドポイント遺伝子型判定分析をアレル間の識別に使用した。465〜510nm(「A」アレル)/533〜580nm(「T」アレル)に蓄積した相対蛍光シグナルのレシオメトリック分析を使用した。
GRAPHPAD PRISM(version 6.0,La Jolla,CA,USA)を用いて統計的分析を実施した。有意性は、対応のない両側スチューデントt検定、または多重比較のためのフィッシャーのLSD検定を伴った一元配置ANOVAのいずれかにより決定されるP<0.05で定義した。
反対のことが示されない限り、以下の命名法は、下記の表2に示されるように、本明細書で言及されている抗体を指すために使用される。例えば、5A.RC3に対する簡略な言及は、反対のことが示されない限り、モノクローナル抗体サブクローン5A.RC3.F10b.H4bを指す。
発明者らは、ヒトPAR4を標的化するモノクローナル抗体の開発に努めた。Monash Antibody Technology Facility(MATF)で、当該施設の指導教官Prof Mark Sleemanは、Regeneron Pharmaceuticals独自のHuMabマウス(VelocImmune(登録商標))を用いて抗体産生及びスクリーニングを実施し、後にさらなる詳細が記載されるようにPAR4に対する高親和性抗体を産生した。
ヒトPAR4(hPAR4)のN末端トロンビン切断及び活性化部位のKLH結合体化ペプチドを生成してHumAbマウスの免疫化に使用し、次いで標準的なプロトコルに従って3回の追加免疫を行った。裸hPAR4ペプチド(表3)を用いてELISAにより血清力価を測定した。
融合は、融合パートナーとしてのSP2/O Ag14と共に、標準的な融合プロトコルを用いて実施し(Yokoyama,W.Production of monoclonal antibodies. In:Coligan J,Kruisbeek A,Marguiles D,Shevach E M,Strober W., editors. Current Protocols in Immunology. Vol.1.New York,N.Y:John Wiley & Sons;1994.pp.2.5.2−2.5.17.)、20個の96ウェルプレートで平板培養した。細胞を、選択マーカーとしてのHATを含有する培地中で成長させた。
発明者らは、数千種のハイブリドーマ上清において、高親和性特異的抗原陽性株をスクリーニングした。モノクローナル抗体は、マウス定常領域に連結したヒトIg可変領域を含む(そのため、このようなキメラ抗体を指すために本明細書では「mAb」と称する)。
モノクローナル抗体ハイブリドーマ上清(MoB5ARC3、MoB5BRB4、MoB5BRC6、MoB5BRH3、及びMoB5CRC4)において、N末端FLAGタグを含むヒトPAR4を形質移入したHEK293細胞の表面上に存在するインタクトPAR4を切断する能力についてスクリーニングした。切断をフローサイトメトリーにより定量化し、図2に示した。
抗hPARクローンのPAR4に対する特異性を測定するため、上述のようにELISAスクリーニングを実施した。図5Aは、クローンmAb−5ARC3(5A.RC3)及びmAb−5BRB4(5B.RB4)のhPAR1、hPAR2、hPAR3、及びhPAR4に対する結合特異性の結果を示している。
先行技術のPAR4阻害物質の制約の1つは、PAR4の特定のバリアントに特異的であり、したがって首尾よく阻害できるのは、該当PAR4受容体バリアントを有する者の血小板凝集に過ぎないということである。
抗hPAR4抗体MoB5ARC3.H4b(5A.RC3)が、血小板凝集により観察されるトロンビンのPAR4に及ぼす効果を阻害し得るかどうかを決定するため、ヒト血小板に対するex vivo血小板凝集アッセイを実施した。異なるPAR4バリアントのヒト単離血小板において、PAR4アゴニストに対する応答を評価した。図7に示すように、3つの異なる遺伝子型(TT、AT、及びAA)を試験した。
クローン5A.RC3において、in vitroでの単離ヒト血小板に対する結合を試験した。フローサイトメトリーを用いて結合の分析を決定した。単離血小板をマウスIgG1(アイソタイプ対照)または5A.RC3のいずれかと共にインキュベートし、PAR4に対する結合について試験した。血小板上に発現するマーカーであるCD41aを陽性対照として使用した。図8に示すように、5A.RC3(10μg/ml)は単離血小板中のヒトPAR4に結合する。
血小板表面ホスファチジルセリン(PS)露出を、アネキシンV結合を測定することにより決定した。ヒト単離血小板(5×107/ml)を指示濃度の5A.RC3で前処置(5分)し、Alexa Fluor 488結合体化アネキシンV(1:100)と共にインキュベートしてからトロンビンで刺激した。刺激後、フローサイトメトリー分析(FACSCalibur,BD Biosciences)向けに修飾タイロードバッファーに再懸濁した。
血小板沈着、トロンビン活性、フィブリン体積、及び血栓当たりのフィブリンの比を含めた血栓症パラメーターを、凝固条件下の本明細書に記載のような全血血栓症アッセイにおいて、10分の期間にわたりリアルタイムで測定した。
結合スクリーニングからヒトPAR4に対する合理的な親和性及び特異性を有すると同定されたクローンを、機能的血小板凝集アッセイによりさらに検証した。
全てIgG1カッパアイソタイプであるモノクローナル抗体のシークエンシングを、Monash UniversityのMonash Antibody Technologies Facilityで行った。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図12にも示す。この抗体はアンタゴニストであり、IgG2aアイソタイプに属する。
5A.RC3重鎖CDR:
CDR1:GFTLSNYG(配列番号13)
CDR2:IWYDGSNK(配列番号14)
CDR3:ARESIVEVLPPFDY(配列番号15)
5A.RC3軽鎖CDR:
CDR1:QRVRNNY(配列番号16)
CDR2:GAS(配列番号17)
CDR3:QQYGNSYT(配列番号18)
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図14にも示す。この抗体はアンタゴニストである。抗体アイソタイプはIgG2bカッパである。
5F.RF3重鎖CDR:
CDR1:AYTFTNYG(配列番号24)
CDR2:ISPYNGNT(配列番号25)
CDR3:AREYNRSSRGRYYYYGMDV(配列番号26)
5F.RF3軽鎖CDR:
CDR1:QSVSSNY(配列番号27)
CDR2:GAS(配列番号28)
CDR3:QQYGSSPWT(配列番号29)
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図13にも示す。この抗体はPAR4に結合するが、アンタゴニストとしては機能しなかった。この抗体のアイソタイプはIgG1カッパである。
5H.RD2重鎖CDR:
CDR1: GFTFFNTW(配列番号34)
CDR2:VKSKNDGGTK(配列番号35)
CDR3:TTDPHYDFWSAY(配列番号36)
5H.RD2軽鎖CDR:
CDR1:QSLVHSDGNT(配列番号37)
CDR2:VKSKNDGGTK(配列番号38)
CDR3:LQATQFMYT(配列番号39)
2つの異なる方法を使用して、下の表4に記載されている7種の精製抗hPAR4 mAbの結合動態を測定した。
実施例11に記載のELISAスクリーニング方法に類似する方法を使用して、hPAR4ペプチドに結合する精製mAbの反応性を同定した。実験は、ハイブリドーマ上清の代わりにPBSに希釈した精製mAbを用いて完了した。
ストレプトアビジンコーティングプレートのウェル(SuperblockでブロックされたThermo Scientific Pierceストレプトアビジン高結合能コーティングプレート、コード#15500)を洗浄バッファー(0.05% TWEEN(登録商標)20及び0.1%ウシ血清アルブミンを含むPBS)で3回洗浄した。ビオチン化ペプチド(hPAR1〜4)を洗浄バッファーで希釈し、ブロックしたストレプトアビジンコーティングウェルに10ug/ml(ウェル当たり100ul)で室温で1時間、穏やかに混合しながら結合させた。ウェルを上記のように3回洗浄し、洗浄バッファー中10ug/mlで調製した精製抗hPAR4 mAbを室温で1時間穏やかに混合しながら結合させた(100ul/ウェル)。プレートを上記のように3回洗浄し、0.3ug/ml(100ul)でアルカリホスファターゼ(AP)と結合体化した抗マウスFcコンジュゲートを上記のように1時間かけてウェルに加えた。ウェルを上記のように3回洗浄し、上清スクリーニングELISAにおいて記載のようにアルカリホスファターゼ基質で発色させた。
5種の抗PAR4モノクローナル抗体のヒト血小板に対する結合をフローサイトメトリーによって検証した。表5は、1)フローサイトメトリーによるヒト血小板に対する結合(10μg/mlで観察された、アイソタイプ対照の同濃度のものに対する幾何平均蛍光強度[GMFI]として表現される)と、2)0.1U/mlトロンビンに応答したヒト血小板凝集の阻害におけるIC50値とに関する各クローンの結果を示している。
mAb 5A.RC3及びmAb 5D.RH4によるヒト血栓形成の阻害を共焦点顕微鏡によって検証した。ex vivoヒト全血血栓症アッセイにおいて、3分後に形成されたヒト血栓の体積を共焦点顕微鏡により定量化した。血液を100μg/mlのいずれかのmAbで前処置したところ、図19に示すように合計血栓体積が低減した。
全てIgG1カッパアイソタイプであるモノクローナル抗体のシークエンシングを、Monash UniversityのMonash Antibody Technologies Facilityで行った。IMGT/V−Questプログラムを用いてCDR及びフレームワーク領域の指定を決定した。
Claims (39)
- 抗PAR4組換え抗体もしくは合成抗体もしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であるプロテアーゼ活性化受容体4(PAR4)結合タンパク質であって、トロンビンの存在下で、細胞表面発現ヒトPAR4の切断を50%以上阻害する、前記プロテアーゼ活性化受容体4(PAR4)結合タンパク質。
- 前記トロンビンの存在下で、細胞表面発現PAR4の(i)60%以上の切断、または(ii)70%以上の切断、または(iii)80%以上の切断を阻害する、請求項1に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記トロンビンの存在下で、細胞表面発現PAR4の90%以上の切断を阻害する、請求項1または2に記載のPAR4結合タンパク質。
- PAR4のトロンビン切断部位にまたがるエピトープに対し特異的に結合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記エピトープが配列APRGYを含み、前記トロンビン切断部位がRGに対応する、請求項4に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記エピトープがILPAPRGYまたはAPRGYPGQVから選択される配列を含むまたは前記配列からなる、請求項4または5に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記抗体がヒトPAR4のAla120及び/またはThr120バリアントに結合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記タンパク質が、ヒトPAR1、PAR2、またはPAR3に結合しないかまたは実質的に結合しない、請求項1〜7のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 以下に示される可変重鎖(VH)配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
(配列中、
X1はVまたはIであり、
X2はAまたはVであり、
X3はTまたはAであり、
X4はLまたはFであり、
X5はNまたはSであり、
X6はYまたはDであり、
X7はSまたはAであり、
X8はYまたはFであり、
X9はSまたはRであり、
X10はNまたはSであり、
X11はKまたはRであり、
X12はHまたはYであり、
X13はA、L、またはTであり、
X14はKまたはRであり、
X15はTまたはDであり、
X16はNまたはTであり、
X17はLまたはQであり、
X18はYまたはFであり、
X19はSまたはIであり、
X20はSまたはTであり、
X21はI、S、またはAであり、;
X22はV、I、M、またはLであり、
X23はE、S、V、またはIであり、
X24はV、T、R、またはGであり、
X25はL、R、またはGであり、
X26はPまたはVである) - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR1配列を含む、請求項9または10に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)GFTLSNYG(配列番号13);
(ii)GFTFSSDG(配列番号59);
(iii)GFTFSNYG(配列番号68);
(iv)GFTFSSYG(配列番号55);
(v)GFAFSSYG(配列番号70);及び
(vi)GFTLSSYG(配列番号75)。 - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR2配列を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)IWYDGSNK(配列番号14);
(ii)IWFDGRNK(配列番号60);
(iii)IWYDGSNR(配列番号71);及び
(iv)IWYDGSSK(配列番号76)。 - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR3配列を含む、請求項9〜12のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)ARESIVEVLPPFDY(配列番号15);
(ii)ARESSISTRPPFDY(配列番号61);
(iii)ARETIMVRGVPFD(配列番号69);
(iv)ARETALVRGVPFDY(配列番号56);
(v)ARETAMVRGVPFDY(配列番号72);及び
(vi)ARETILIGGVPFDY(配列番号77)。 - 前記VLが以下からなる群より選択されるCDR1配列を含む、請求項10に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)QRVRNNY(配列番号16);
(ii)QSVRSSY(配列番号57);及び
(iii)QSIRSNY(配列番号78)。 - 前記VLがCDR2配列GAS(配列番号28)を含む、請求項10または14に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記VLが以下からなる群より選択されるCDR3配列を含む、請求項10、14、または15に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)QQYGNSYT(配列番号18);
(ii)QQYGRSYT(配列番号62);及び
(iii)QQYGSSYT(配列番号58)。 - 以下に示される可変重鎖(VH)配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
(配列中、
X1はAまたはSであり、
X2はTまたはAであり、
X3はVまたはIであり、
X4はYまたはSであり、
X5はGまたはSであり、
X6はLまたはFであり、
X7はN、D、またはTであり、
X8はYまたはFであり、
X9はSまたはRであり、
X10はRまたはHであり、
X11はNまたはIであり、
X12はSまたはTであり、
X13はTまたはSであり、
X14はNまたはTであり、
X15はKまたはNであり、
X16はFまたはLであり、
X17はKまたはNであり、
X18はAまたはKであり、
X19はI、F、またはVであり、
X20はYまたはHであり、
X21はNまたはSであり、
X22はR、G、またはSであり、
X23はVまたはHである) - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR1配列を含む、請求項18に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)GGSLSDYY(配列番号86);
(iii)SGSFSTYF(配列番号47);及び
(iv)GGSFSNYY(配列番号66)。 - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR2配列を含む、請求項18または19に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)INHSGTT(配列番号87);
(ii)IIHTGST(配列番号64);または
(iii)INHSGST(配列番号48)。 - 前記VHが以下からなる群より選択されるCDR3配列を含む、請求項18、19、または20に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)AIEYSNSRGYYYGMDV(配列番号88);
(ii)AFEYSSSGGYYYGMDV(配列番号49);及び
(iii)KVEHSSSSGHYYYGMDV(配列番号65)。 - 前記VLが以下からなる群より選択されるCDR1配列を含む、請求項18〜21のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)QTISNY(配列番号109);
(ii)QSISSY(配列番号50);及び
(iii)QTISYY(配列番号66)。 - 前記VLがCDR2配列AAS(配列番号51)を含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記VLが以下からなる群より選択されるCDR3配列を含む、請求項18〜23のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)RQNYNTPLT(配列番号85);
(iii)QQTYSTPLT(配列番号52);または
(iv)QQSYSTPLT(配列番号67)。 - 以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する可変重鎖(VH)を含む、いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)配列番号13、配列番号14、及び配列番号15;
(ii)配列番号47、配列番号48、及び配列番号49;
(iii)配列番号24、配列番号25、及び配列番号26;
(iv)配列番号55、配列番号14、及び配列番号56;
(v)配列番号59、配列番号60、及び配列番号61;
(vi)配列番号63、配列番号64、及び配列番号65;
(vii)配列番号68、配列番号14、及び配列番号69;
(viii)配列番号70、配列番号71、及び配列番号72;
(ix)配列番号55、配列番号73、及び配列番号74;
(x)配列番号75、配列番号76、及び配列番号77;
(xi)配列番号79、配列番号80、及び配列番号81;
(xii)配列番号82、配列番号80、及び配列番号83;
(xiii)配列番号55、配列番号73、及び配列番号74;または
(xiv)配列番号86、配列番号87、及び配列番号88。 - 以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する可変軽鎖(VL)をさらに含む、請求項25に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)配列番号16、配列番号17、及び配列番号18;
(ii)配列番号50、配列番号51、及び配列番号52;
(iii)配列番号27、配列番号28、及び配列番号29;
(iv)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(v)配列番号57、配列番号28、及び配列番号62;
(vi)配列番号66、配列番号51、及び配列番号67;
(vii)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(viii)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(ix)配列番号78、配列番号28、及び配列番号62;
(x)配列番号84、配列番号51、及び配列番号85;
(xi)配列番号57、配列番号28、及び配列番号58;
(xii)配列番号57、配列番号51、及び配列番号58;または
(xiii)配列番号109、配列番号51、及び配列番号85。 - 配列番号11、配列番号22、配列番号45、配列番号53、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、もしくは配列番号107のうちのいずれか1つに示される配列に対し、少なくとも95%同一であるVH配列、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョンを含む、いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 配列番号12、配列番号23、配列番号46、配列番号54、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、もしくは配列番号108のうちのいずれか1つに示される配列に対し、少なくとも95%同一であるVL配列、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョンをさらに含む、請求項27に記載のPAR4結合タンパク質。
- 以下を含む、いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質:
(i)配列番号11に示されるVH及び配列番号12に示されるVL;
(ii)配列番号45に示されるVH及び配列番号46に示されるVL;
(iii)配列番号22に示されるVH及び配列番号23に示されるVL;
(iv)配列番号53に示されるVH及び配列番号54に示されるVL;
(v)配列番号89に示されるVH及び配列番号90に示されるVL;
(vi)配列番号91に示されるVH及び配列番号92に示されるVL;
(vii)配列番号93に示されるVH及び配列番号94に示されるVL;
(viii)配列番号95に示されるVH及び配列番号96に示されるVL;
(ix)配列番号97に示されるVH及び配列番号98に示されるVL;
(x)配列番号99に示されるVH及び配列番号100に示されるVL;
(xi)配列番号101に示されるVH及び配列番号102に示されるVL;
(xii)配列番号103に示されるVH及び配列番号104に示されるVL;
(xiii)配列番号105に示されるVH及び配列番号106に示されるVL;または
(xiv)配列番号107に示されるVH及び配列番号108に示されるVL。 - 前記抗原結合断片が、
(i)1本鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);
(iii)重鎖定常領域またはFcまたは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/またはCH3に連結している(i)及び/または(ii)のうちの少なくとも1つ
である、いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質。 - 前記抗原結合断片が、
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;
(iii)テトラボディ;
(iv)Fab;
(v)F(ab′)2;
(vi)Fv;または
(vii)重鎖定常領域またはFcまたは重鎖定常ドメイン(CH)2及び/またはCH3に連結している(i)〜(vi)のうちの少なくとも1つ
である、請求項1〜29のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質。 - ある部分と結合している、いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質。
- 前記部分が、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるPAR4結合タンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項32に記載のPAR4結合タンパク質。
- いずれかの先行請求項に記載のPAR4結合タンパク質をコードする核酸。
- 配列番号20に示されるVH核酸配列を含む、及び/または配列番号21に示されるVL核酸配列を含む、請求項34に記載のPAR4結合タンパク質。
- 配列番号30に示されるVH核酸配列を含む、及び/または配列番号31に示されるVL核酸配列を含む、請求項34に記載のPAR4結合タンパク質。
- 請求項1〜33のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質と好適な担体とを含む、組成物。
- 対象における血栓症または血栓塞栓性障害を治療または防止するための方法であって、請求項1〜33のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質もしくは抗体、または請求項37に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 血栓症または血栓塞栓性障害を治療、防止、または改善するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜33のいずれか1項に記載のPAR4結合タンパク質もしくは抗体の治療有効量、または請求項37に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
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