KR20220125190A

KR20220125190A - 생강나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 기억력 개선용 건강기능 식품 및 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220125190A
Application number: KR1020220028201A
Authority: KR
Inventors: 최동국; 조송희
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2022-09-14

Abstract

본 발명은 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생강나무 추출물은 세포독성이 없고 염증반응과 관련하여 일산화질소 생성을 억제하는 효과가 있으며, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB 염증 단백질의 발현을 현저하게 저해시켜 우수한 신경 염증 반응 억제, 인지기능 개선 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 각종 신경 염증 질환의 치료 및 예방, 인지기능 개선에 유용한 치료제 및 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있다.

Description

생강나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 기억력 개선용 건강기능 식품 및 약학적 조성물{HEALTH FUNCTIONAL FOOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR IMPROVING INFLAMMATORY DISEASE OR MEMORY CONTAINING LINDERA OBTUSILOBA EXTRACT AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 생강나무 잎 또는 줄기 추출물을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 인지기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퀘르세틴(quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol), 아이소퀴놀린(Isoquinoline) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하여 신경아교세포의 NO 발생 및 iNOS/COX-2 발현을 억제를 통한 염증억제 효능을 갖는 추출물을 포함하는 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증 반응(inflammation)은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때, 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소의 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등의 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우의 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복 작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나는 경우에는 오히려 점막손상을 촉진하고, 일부에서는 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관 질환, 암 등을 유도한다. 즉, 염증 반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응이지만, 지속적이고 과도한 염증반응은 조직을 손상시킨다.

대식세포(macrophage)는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 유해한 환경에서 숙주의 방어기작에 중요한 역할을 하며, 자가면역질환과 같은 다양한 질병의 진행과정에 관여한다. 지질다당류와 같은 염증 자극 인자들은 대식세포를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 IL-1β와 같은 다양한 염증성 매개체를 생성하고, 유도형 NO생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 고리형 산소화효소2 (cyclooxygenase-2, COX2)를 합성하여 니트릭 옥사이드(nitric oxide, NO) 및 PGE 2 (prostaglandin E2)를 생성한다.

한편, Lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 외막 구성성분이며 염증성 인자로 알려져 있으며, 골수에서 생산되는 대식세포 (macrophage)는 미량의 LPS에 의해 활성화되고 다양한 사이토카인(cytokine), 과산화 수소 (hydrogen peroxide, H2O2), 및 니트릭 옥사이드 등의 각종 세포독성물질을 분비하여 면역기구로서 기능한다.

생강나무(Lindera obtusiloba)는 녹나무과(Lauraceae)의 작은키나무로 잎몸은 둥근 난형으로 윗부분에 3-4개의 깊은 결각이 있거나 없으며, 잎맥은 기부에서 크게 3개로 갈라진다. 꽃은 암수딴그루로 3~4월에 지난해 가지에서 잎보다 먼저 노란색으로 피며, 꽃자루가 없는 산형꽃차례에 달린다. 열매는 장과로 검은색으로 익는다.

최근 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 기능은 식품이나 식물체도 가지고 있다는 것이 보고되고 있고, 보다 건강하고 오래 살고자 하는 인류의 필요에 따라, 세계적으로 다양한 자원으로부터 다양한 생리기능을 가진 물질을 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중에서도 특히 식물자원에 포함된 화합물에 많은 관심이 집중되고 있다. 이에 본 발명자들은 생강나무 추출물을 신경교세포에 처리한 결과 염증성 반응물인 NO를 효과적으로 억제하는 것을 확인함으로써, 생강나무 추출물을 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생강나무 줄기 또는 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생강나무 추출물의 유효성분을 분석하여, 염증성 질환 치료에 효과적인 유효성분을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물은 생강나무 줄기(stem)를 추출한 것이다.

상기 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물은 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 용매로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 기억력 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물은 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 용매로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 약학 조성물 내 상기 생강나무 잎 추출물의 농도는 1 내지 5000ug/ml, 1 내지 3000ug/ml, 100 내지 3000ug/ml, 1000 내지 5000ug/ml, 1000 내지 3000ug/ml, 100 내지 300ug/ml, 500 내지 600ug/ml, 1500 내지 3000ug/ml, 25 내지 200ug/ml 또는 1 내지 300ug/ml일 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 3000ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 생강나무 잎 추출물은 하기 화학식 1로 표시되는 퀘르세틴(quercetin), 하기 화학식 2로 표시되는 캠퍼롤(Kaempferol), 하기 화학식 3으로 표시되는 아이소퀴놀린(Isoquinoline) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 인지기능 개선용 건강기능 식품 조성물이 제공된다.

본 발명에서 상기 염증성 질환에는 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 염, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 천식, 아토피, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 및 만성 염증질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염 및 근육염이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 신경 퇴행성 질환에는 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증(cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 생강나무 추출물은 천연물에서 유래되어 부작용이 없으며, 염증관련 인자인 NO, iNOS 및/또는 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현을 억제할 뿐만 아니라, 학습 또는 기억력 증진 효과가 우수하므로 신경염증 또는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 분쇄 후의 생강나무 잎 시료 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 감압 농축하여 제조된 시료의 이미지이다.
도 3은 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물의 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase type2) 단백질의 발현 억제 작용을 확인한 이미지이다.
도 4는 단백질 수준에서 LPS로 유도된 BV-2 신경교세포에서 100% 에탄올 생강나무 잎 추출물의 항염증 효능을 확인한 이미지이다.
도 5는 mRNA 수준에서 LPS로 유도된 BV-2 신경교세포에서 100% 메탄올 생강나무 잎 추출물의 항염증효능 분석한 이미지이다.
도 6 내지 9는 생강나무 잎 열수추출 및 100% 에탄올 추출물 시료의 negative 및 positive mode로 분석된 UPLC Qtof-MS 크로마토그램 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 생강나무 추출물에서 검출된 quercetin pentoside의 NMR 이미지이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 생강나무 추출물에서 검출된 Kaempferol pentoside의 NMR 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 생강나무 추출물에서 검출된 isoquinoline 유도체의 NMR 이미지이다.
도 13은 생강나무 잎 100% 에탄올추출물 시료에서 질량분석을 통한 단일화합물의 NMR 결과이다.
도 14는 생강나무 잎 100% 에탄올추출물 시료에서 질량분석을 통한 단일화합물 분석 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 세절 가공된 생각목 소재의 이미지이다.
도 16은 inflammatory mediators인 iNOS, COX-2의 expression level을 확인한 결과이다. Protein, mRNA 수준에서 iNOS, COX-2의 expression level이 LOS-ME(생강나무 줄기 메탄올 추출물, methanol extract of L. obtusiloba stem, 이하 'LOS-ME')에 의하여 감소함을 확인하였다.
도 17은 inflammatory mediators인 iNOS, COX-2의 expression level을 확인한 결과이다. Pro-inflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 expression level을 LOS-ME의 처리 농도에 비례하여 감소함을 확인하였다.
도 19는 LPS-stimulated BV-2 cell을 ICC (Immunocytochemistry) 방법으로 NF-κB p65 (red)의 세포에서 움직임을 확인, LPS를 처리한 BV-2 cells에서는 p65가 nuclear (blue)로 trans;ocation되는 것을 확인, LOS-ME 처리군에서 p65의 translocation이 억제된 것을 확인한 이미지이다.
도 20은 Western blot 분석법으로 ERK, JNK, p38 MAPKs의 activation을 확인, LOS-ME는 ERK의 phosphorylation이 억제됨을 확인한 이미지이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 C57BL/6 mice를 이용, 생강목 추출물 (20 mg/kg)을 7일간 경구투여 (p.o) 방법으로 투여하고, scopolamine (2 mg/kg)을 복강주사(i.p)를 통해 투여하여 인지능력 저해 model을 유도한 실험 절차를 나타낸 이미지이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 LOS-ME (20 mg/kg for 7days, p.o)를 투여하고, scopolamine (2 mg/kg, i.p)를 투여한 실험동물 모델의 인지기능을 Y-maze 장치를 이용하여 확인한 결과이며, 도 22의 B,C 및 D를 참조하면 Scopolamine에 의해 감소된 인지기능은 LOS-ME 투여에 의해 개선됨을 알 수 있다. 도 22의 D는 Morris water maze 장치를 이용하여 LOS-ME의 인지기능 개선 능력을 확인한 이미지이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라, scopolamine (2 mg/kg, i.p)를 투여한 실험동물 모델의 해마에서 iNOS, COX2의 발현을 LOSE-ME 처리에 따라 확인한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "추출물"은, 상기 생강나무 잎의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 명세서에서 생강나무(Lindera obtusiloba)란, 우리나라, 일본, 중국 등지에 분포하는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 녹나무과의 낙엽관목이며, 잎이나 가지를 꺾으면 생강냄새가 난다고 하여 생강나무라 부르고, 개동백나무 혹은 황매목이라고도 불린다.

본 명세서에서, 생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물은 생강나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 바람직하게는 생강나무의 잎 또는 줄기로부터 얻은 추출물을 의미한다.

본 발명의 상기 생강나무 추출물에 있어서, 상기 생강나무를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 생강나무 잎 또는 줄기로부터 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 생강나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출되며, 보다 바람직하게는 에탄올을 사용하여 추출된다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 생강나무 추출물은, 퀘르세틴(quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol), 아이소퀴놀린(Isoquinoline) 또는 이의 유도체를 유효성분을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 생강나무 추출물 또는 이의 분획물은 염증관련 인자로 알려진 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(PGE2), iNOS 및/또는 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현을 억제함으로써 신경염증 또는 이로부터 발병할 수 있는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료, 인지기능 개선 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌신경 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말하며, "치료"는 상기 조성물에 의하여 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌신경 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 "염증성 질환(inflammatory disease)"은 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 천식, 아토피, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 및 만성 염증질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염 및 근육염을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disease)"은 신경변성질환이라고도 하며, 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증(cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 생강나무 추출물은"신경염증"을 치료할 수 있으며, 이는 신경계, 즉 신경세포, 신경조직 등에 발생하는 염증성 반응을 총칭한다. 병원체연관분자유형(PAMP)을 감지한　조직의　대식세포와　비만세포는 염증과 관련된 물질들을 분비한다. 이중 대표적인 것 중 하나가 NO(일산화 질소)로 체내에서 국부적인 조절인자 및 신경전달물질로 작용하며 주변의　근육세포에 작용하여 근육을 이완시키는　효소를 활성화시켜 혈관을 확장시키는 효과가 있다. NO는 병원균 제거 및 면역 계와 관련하여 대식세포 가 염증활성 상태에서 iNOS (inducible nitric oxide synthase)를 다량 생산함으로 아르기닌(arginine)으로부터 NO를 생성, 염증 반응을 촉진하며, 전염증반응(pro-inflammatory)인자로서 작용을 하게 된다. 특히 박테리아와 같은 세균감염 시 방출된 LPS(lipopolysaccharide)가 host receptor와 결합하여 세포 내 신호 전달이 일어나는 데, 이 때 IkB kinase (IKK) complex가 활성화되어 IkB의 phosphorylation 및 degradation이 유발된다. 이 때 IkB에서 분리되어 자유로워진 NF-B dimmer (p65/p50)는 세포질에서 핵으로 전위하여 면역 및 염증 관련 유전 자들의 promoter 영역에 결합하여 전사를 증가시키므로 iNOS 발현 및 NO 생성을 포함하는 다양한 염증 반응이 일어난다.

특히, 신경 염증은 중추신경계에 존재하는 면역세포인 소신경교세포가 다양한 외인성, 내인성 물질로 인해 활성화되어, 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β, 일산화질소, 프로스타글란딘, 초과산화물 등의 물질을 생산, 방출하는 현상을 포함할 수 있다. 이러한 물질들의 생성은 단기적으로는 면역반응을 유발하지만, 그 과도한 생산이나 지속적인 생산은 근접한 신경세포들의 사멸을 유도하여 결국 신경퇴행을 유발한다고 알려져 있다.

또한, 핵 전사 인자인 nuclear factor-κB (NFκB)는 염증 조절 인자로서 다양한 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase), cyclooxygenase-2 (COX-2)의 전사를 유도하여 interleukin (IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α 및 nitric oxide (NO)와 prostaglandin E2 (PGE2)의 분비를 증가시킨다. MAPK (mitogen-activated protein kinase)는 ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinases), p38의 단백질을 포함하며, lipopolysaccharide (LPS) 등 다양한 자극에 의해 활성화되면 핵 내 전사인자로서 염증 반응에 중요한 역할을 하게 된다.

본 발명은 또한, 생강나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "인지기능 장애(cognitive impairment)"는 추론능력의 상실, 망각, 학습장애, 집중력 문제, 지능의 저하, 이외의 다른 정신 기능의 감소가 포함되고, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 뇌혈관성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 생강나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 생강나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 또는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 개선용, 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "개선"은 생강나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 염증성 질환, 인지기능 장애 또는 신경 퇴행성 질환과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다. 이 때 상기 식품 조성물은 비만 또는 비만 관련 합병증의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 생강나무 추출물 또는 이의 분획물을 염증성 질환, 신경염증성 질환 또는 인지기능 장애의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다. 생강나무 추출물은 전체 조성물에 3 내지 3000μg/mL의 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 3μg/mL 미만의 농도로 생강나무 추출물을 포함하는 경우 신경 염증 또는 인지기능 장애 예방, 치료, 개선 효과가 미미할 수 있으며, 3000μg/mL 농도를 초과하여 생강나무 추출물을 포함하는 경우, 세포 독성이 나타날 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 생강나무 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 생강나무 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 "식품보조첨가제"는 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소로서, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가될 수 있으며 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 "천연 탄수화물"의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

생강나무 잎 추출물

1-1. 농축방법에 따른 생강나무 잎 추출물 제조

생강나무 잎(Leaf of Lindera obtusiloba) 시료를 구매를 하여 절단식 분쇄기에서 시료를 분쇄하였다(도 1 참조). 추출방법으로는 열수추출, 50% 에탄올추출 그리고 100% 에탄올 추출로 하기위해 분쇄하고 난 시료를 각 500 g, 750 g 그리고 750 g으로 소분하여 진행하였습니다. 열수 추출을 하기 위해 정제수를 5L를 투입하였고 50% 에탄올 추출을 하기 위해 7.5L를 투입하였고 100% 에탄올 추출을 하기 위해 7.5L를 투입하였으며 60 ℃ 온도에서 16시간동안 추출탱크와 증발되는 용매를 열교환기를 통하여 액체로 변하는 용매를 추출 탱크로 주입하는 방식으로 환류 추출을 진행하였다. 추출물을 10 μm 여과포를 이용해 여과하고 압착한 시료를 감압 농축하여 3종 시료를 완성하였다(도 2 참조).

1-2. 추출방법에 차이에 따른 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba ) 추출물의 NO 방출 억제

신경교세포에서의 염증유도는 LPS (lipopolysaccharide)에 의하여 아질산염 (NO)의 생산이 수반되며, 아질산염 (NO)의 증가는 뇌 손상 시 세포독성에 매우 중요하게 작용하는 병리학적 기전임이 많은 보고를 통하여 알려져 있다. 농축방법에 차이에 따른 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물의 뇌세포 보호효능 분석을 위하여 신경아교세포의 염증반응에 의해 생성되는 아질산염의 억제 및 아질산염의 생성에 직접적인 영향을 미치는 iNOS의 유전자 및 단백질 발현 조절 효능을 검사하였다. NO 농도 측정결과 LPS에 의해서 유도되는 NO는 17.5 ± 1 μM로 대조군으로 사용한 1.8 ± 0.2 μM에 비하여 약 10배의 증가를 보였으며, 실험군으로 사용한 100% 에탄올 생강나무 잎 추출물을 다양한 농도로 처리하였을 때, 14.5 ± 0.7 μM, 10.7 ± 1.2 μM, 6 ± 1 μM 그리고 5.1 ± 0.5 μM로 NO의 생성이 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. 반면에 열수와 50% 에탄을로 추출한 생강나무 잎 추출물을 처리하였을 때, LPS에 의해 유도된 NO의 생성이 억제되지 않음을 확인하였음 (도 3). 이러한 결과는 생강나무 잎을 100% 에탄올 추출로 진행하였을 때, 항염증 효능이 가장 좋음을 볼 수 있었다.

1-3. 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물의 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase type2) 단백질의 발현 억제 작용 확인

뇌염증반응에 의해 야기되는 신경아교세포의 활성화는 여러 가지 경로의 신호전달과정을 거쳐 야기되는데 이 경로의 첫 번째가 iNOS와 COX-2등의 효소에 의한 것이다. iNOS는 아질산염의 합성효소로 염증반응을 매개하는 인자이고, COX-2는 PGE2 (prostaglandin 2)의 전사조절 인자로 작용하여 COX-2의 발현 증가는 PGE2의 발현을 증가시켜 염증반응을 매개한다. 이에 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba)의 염증억제 효능을 검정하기 위하여 iNOS와 COX-2의 발현 분석을 수행하였다. BV-2 마이크로글리아 세포에 LPS 및 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물을 농도별로 처리하고 염증 생성에 관여하는 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질의 발현양상을 분석하였다. 발현 분석을 시행한 결과 LPS를 처리한 대조군에 비하여 iNOS와 COX-2 단백질의 발현양이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 4 참조).

본 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 생강나무 잎 추출물은 뇌염증반응을 완화시킬 수 있음을 알 수 있다.

1-4. 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba ) 추출물의 염증매개 cytokine의 발현저해 작용 확인

신경변성질환에서 미세아교세포의 활성화에 의해 사이토카인이 발현되기도 하는데 이러한 사이토카인은 전염증성 사이토카인으로 TNF-α, IL-1, IL-6가 발현되어 염증반응을 증폭 및 지속시킨다. 성상세포에서 IL-1은 IL-6의 발현을 유도하며 iNOS의 활성을 자극하며 신경세포의 AChE (acetylcholinesterase)의 활성을 증가시킨다. IL-6는 생체방어에서 다양한 역할을 하는 사이토카인으로 염증반응에서 주요 조절인자로 작용하며 신경세포에서 직·간접적으로 neurotrophic effect를 가지며 성상교세포증 (astrogliosis)를 촉진하며 미세아교세포의 활성화한다. TNF-α는 염증반응의 사이토카인 경로 조절에서 중추적인 역할을 수행하는 사이토카인으로 일반적으로 뇌에서는 TNF-α의 발현이 현저히 낮지만 미세아교세포의 활성화에 의해서 발현이 급격하게 증가된다. 이에 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물의 신경염증 억제능을 분석하기 위하여 염증 매개 cytokine 유전자의 발현 양상을 BV-2 마이크로글리아 세포에 LPS 및 100% 에탄올 생강나무 잎 (Leaf of Lindera obtusiloba) 추출물물을 농도별로 처리하고 발현분석을 통하여 발현 양상을 분석한결과, TNF-α, IL-1β, IL-6가 추출물 농도 의존적으로 감소하는 발현변화 양상을 확인하였다(도 5).

본 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 생강나무 잎 추출물은 염증을 완화시키고 특히, 농도 의존적으로 사이토카인 매개 염증반응을 완화시킨다는 것을 알 수 있다.

1-5. 생강나무 잎 열수추출 및 100% 에탄올추출물 시료에서의 단일화합물 분석

생강나무 잎의 열수추출 및 100% 에탄올 추출물 시료에서의 단일화합물을 분석하기 위해 UPLC Qtof-MS 크로마토그램을 진행하였다. 크로마토그램을 Negative 및 Positive mode로 분석한 결과 생강나무 잎의 열수추출 및 100% 에탄올 추출물 시료는 5.23분과 5.75분 피크가 공통적으로 나오는 것으로 보아 주성분으로 추정이 되었고 별도로 피크가 보이는 5.95분과 6.22분에서도 화합물이 추정하고자 하였다. (도 6 내지 9 참조)

1-6. 생강나무 잎 100% 에탄올추출물 시료에서 질량분석을 통한 단일화합물 분석

생강나무 잎의 열수추출 및 100% 에탄올 추출물 시료에서의 단일화합물을 분석하기 위해 UPLC Qtof-MS 크로마토그램을 진행하였다. 크로마토그램을 Negative 및 Positive mode로 분석한 결과 생강나무 잎의 열수추출 및 100% 에탄올 추출물 시료

생강나무 잎 100% 에탄올 추출물 시료의 단일화합물을 추정하기 위해 질량분석을 진행한 결과, 5.23분에서는 C21H20O11 (MW:449.1083), 5.75분에서는 C21H20O10 (MW:433.1135), 5.95분에서는 C20H26NO3 (MW:328.1907) 그리고 6.22분에서는 C18H20NO3 (MW:298.1437)이 측정되었다. MS 데이터의 fragentation 패턴과 이전 논문에 보고된 문헌을 참조하여 이러한 분자량과 화학식을 가진 구조를 비교한 결과 5.23분 피크는 quercetin pentoside (quercitrin), 5.75분 피크는 Kaempferol pentoside (afzelin) 추정할 수 있었다(도 10 및 도 11 참조). 이 두가지의 성분은 생강나무의 주요 성분으로 보고가 되어있기도 하다. 5.95분 피크는 Isoquinoline derivate (colletine)으로 추정할 수 있어 기존에 MS 분석한 논문의 fragmentation 패턴을 비교하였지만 기존 문헌에서는 생강나무에서 알칼로이드 화합물에 대해 보고되어있지 않아 정확한 성분의 확인은 NMR 분석을 통해 확인해야한다(도 12 참조). 6.23분 피크는 MS fragmentation을 선행문헌과 비교하였지만 매치되는 결과가 없어 추정하기 어려웠으나 5.95분 피크에서 보여지는 몇가지의 이온패턴 (m/z 251, 189, 121)이 관측되는 것으로 보아 isoquinoline 유도체로 추정할 수 있었다 (도 13 참조).

1-7. LPS로 유도된 BV-2 신경교세포에서 생강나무 잎 단일화합물의 억제효능 분석

UPLC Qtof-MS분석을 통해 확인된 Quercitrin, Afzelin을 이용하여 신경염증에서의 효능을 보고자 BV-2 신경교세포에 Quecitrin, Afezelin 그리고 Episeasamin을 다양한 농도 (1.5, 3.1, 6.2, 12.5, 25, 50, 100, 200 그리고 500 μM)로 처리하고 NO assay를 수행하였다. NO 농도 측정 결과 LPS에 의해서 유도되는 NO는 평균 16.7 ± 1.8 μM로 대조군으로 사용한 3.6 ± 0.53 μM에 비하여 약 5 배 증가를 보였으며, 실험군으로 사용한 단일화합물의 경우 NO생성을 억제시키지 못함을 확인하였다 (도14).

생강나무 줄기(stem) 추출물

2-1. 생강목 추출물의 제조

생강목 소재(Lindera obtusiloba stem)는 단양군에서 채취된 것을 구매하여 추출을 진행하였다. 자연건조된 생강목 소재(도 15 참조) 100g을 1L의 99.5%의 메탄올에 침전시킨 뒤, 3회의 연속추출 (24시간 동안 침전시킨 뒤, 기존 추출물은 별도로 보관한 뒤 새 용매를 추가하여 추출함)을 하여 추출물을 획득하였다. 획득한 추출물은 여과지 (Whatman, UK)를 이용하여 입자를 제거하고, 회전증발농축기를 이용하여 기존 용매를 최재한 제거한뒤, 농축된 추출물은 -80℃ 동결건조하여 건조된 추출물을 획득하였다.

2-2. 생강목 추출물의 항신경염증 효과 확인

신경계에서 발생하는 염증반응은 내/외부 자극 (세균/바이러스 등의 감염, 사멸 세포 제거, 조직 회복 등)에 반응하여 스스로를 지키는 반응이나, 어떠한 원인에 의하여 염증반응이 조절되지 못하면 사이토카인 폭풍(cytokine storm)과 같은 격렬한 부작용 혹은 퇴행성 신경변성질환 (neuro-degenerative diseases)의 만성 질병을 야기한다.

본 발명자들은 LPS-stimulated BV-2 microglia cell에서 생강나무 소재 추출물의 항신경염증 효능을 확인하고자 하였다. 본 실험에서는 각기 다른 추출방법을 가진 동일량 (건조중량)의 LOS (L. obtusiloba stem) 추출물의 효능을 Griess assay를 통하여 확인하였다. 여러 추출물 중에서 가장 효능이 뛰어난 LOS-ME (생강목 추출물)를 중심으로 생강나무 소재의 항신경염증 효능 연구를 수행하였다.

LOS-ME (25, 100, 200 μg/mL)의 항신경염증 효능을 Griess assay로 확인하였고, BV-2 microglial cells(미세아교세포)는 LPS에 의하여 과활성상태가 되어 23.5 μM (control group의 9배)의 NO (nitric oxide)를 방출하는 것을 확인하였다.

LPS에 의해 유도된 염증반응으로 생성된 NO의 방출량을 LOS-ME의 농도에 비례하여 감소하는 것을 확인하였다. 특히, LOS-ME 고용량 200 μg/mL에서는 LPS 단독 처리군에 비하여 74.8%의 NO 방출의 억제 효능을 확인하였으며, 반복된 실험에서 측정된 LOS-ME의 NO 방출 억제 효능은 92.4 ± 0.1 μg/mL의 IC50수치를 가지는 것을 확인하였다(도 16의 A).

세포 생존능(세포독성, Cell viability)는 MTT (2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-diphenyl-, bromide) assay를 통하여 확인하였고, LOS-ME에 의해 부정적인 부작용(side effect)는 없음을 실험적으로 확인하였다(도 16의 B).

즉, 본 실험에 따르면 본 발명에 따라 제조된 생강목 추출물은 항신경염증 효과가 있음을 알 수 있다.

2-3. 생강목 추출물 처리에 따른 염증성 인자의 발현량 확인

염증성 질환에 중요한 역할을 하는 inflammatory mediators인 iNOS, COX-2의 단백질, mRNA 발현 수준(protein, mRNA expression level)의 변화를 확인하기 위하여 western blot, RT-PCR 방법을 이용할 수 있다.

iNOS는 염증 반응의 중요한 이차 메신저(secondary messenger)인 NO (nitric oxide) 방출에 관여하며, COX-2는 염증반응과 통증반응에 관여하는 PG (prostaglandin)의 합성에 직접적인 관여를 하는 단백질로 다양한 항염증 약품의 타겟 단백질(target protein)로 알려져 있다. 따라서, LOS-ME (생강목 추출물)가 iNOS 및 COX-2를 효과적으로 발현 양(expression level)을 저해한다면 퇴행성 신경질환 예방 및 개선 소재로 이용 가능하다.

본 실험에서는 염증성 매개체(inflammatory mediators)인 iNOS, COX-2의 발현 양(expression level)을 확인하였다. 단백질(Protein), mRNA 수준에서 iNOS, COX-2의 발현 수준이 LOS-ME에 의하여 감소함을 확인하였다(도 17의 A 내지 D). 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현 양(expression level)을 LOS-ME의 처리 농도에 비례하여 감소함을 확인하였다 (도 18의 E 내지 G). 3회의 독립적인 반복실험으로 재현 확인하였다.

LPS-stimulated BV-2 cells에서 LPS의 자극에 의하여 iNOS 및 COX-2의 expression이 증가한 것을 확인할 수 있다. LOS-ME의 처리량 (25, 100, 200 μg/mL)의 증가에 반비례하여 iNOS (도 17 A, B)와 COX-2 (도 17 C, D)의 발현 양(expression level)이 감소한 것을 확인할 수 있다.

이외에도,전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cycokine)으로 잘 알려진 IL-1β, IL-6는 강력한 cytokines로 많은 만성염증성 질환의 원인이 되며, TNF-α 역시 염증성 질환의 발생에 영향을 미치며 강한 세포독성 사이토카인(cytotoxic cytokine)으로 알려져 있다. LPS 자극으로 과활성화된 미세아교세포(microglial cells)에서 염증성 사이토카인(matory cytokiens) TNF-α, IL-1β, IL-6의 expression이 증가하였으며, LOS-ME의 처리량에 반비례하여 염증성 사이토카인 유전자 발현(inflammatory cytokines gene expression)이 조절되는 것을 확인할 수 있다 (도 18 E 내지 G).

결과적으로, RT-PCR 분석 결과에서 LPS에 의하여 활성화된 BV-2 세포의 염증성 매개체(inflammatory mediators) 및 염증설 질환 핵심 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) (TNF-α, IL-1β, IL-6)의 발현 수준(expression level)이 LOS-ME (25, 100, 200 μg/mL)에 의하여 처리농도에 비례하여 감소됨을 확인하여, 따라서 LOS-ME는 미세아교세포 활성화(microglia cell activation)에 의해 발생되는 퇴행성 신경질환을 예방 혹은 치료에 이용될 신소재로 판단할 수 있다.

2-4. NF-κB p65 단백질의 활성 확인

보다 상세한 생물학적 메커니즘(biological mechanism)을 연구하기 위하여, 위의 염증성 매개체/사이토카인(inflammatory mediators/cytokines)의 유전자 발현 수준(gene expression level)을 조절하는 전사인자(transcription factor) NF-κB p65 단백질의 활성을 확인하였다. ICC (immunocytochemistry) 분석법을 이용하여 LPS 자극에 의한 p65 서브유닛(subunit)의 translocation (red, blue fluorescence merged)이 활발하게 일어났음을 확인할 수 있었으며, LOS-ME는 p65의 nuclear로 translocation을 억제하는 메커니즘을 갖는다는 것을 실험적으로 확인하였다(도 19).

도 19를 참조하면, LPS-stimulated BV-2 cell을 ICC (Immunocytochemistry) 방법으로 NF-κB p65 (red)의 세포에서 움직임을 확인하였고, LPS를 처리한 BV-2 cells에서는 p65가 nuclear (blue)로 translocation되는 것을 확인하였고, LOS-ME 처리군에서 p65의 translocation이 억제된 것을 확인하였다. NF-κB p65 (Alexa 568, red fluorescence), Nuclear (DAPI, blue fluorescence)이다.

2-5. 생강목 추출물 처리에 따른 염증성 인자의 발현량 확인

여러 염증성 매개체/사이토카인(inflammatory mediators/cytokines)의 발현을 조절하는 핵심 전사인자(transcription factor)인 p65는 IKK complex (IKK-α, β, NEMO)에 의하여 활성이 제어된다. IKK는 상위 MAPKs (mitogen-activated protein kinases)인 ERK에 의하여 엄격히 제어되며, 그 하위 JNK, p38과 같은 염증(inflammation) 반응에 핵심적인 MAPKs에 의하여 염증 반응(inflammation event)이 조절된다.

활성화된 미세아교세포(Activated microglia cell)에서 LOS-ME의 염증반응(inflammation event)에서 NF-κB p65의 activation을 조절하는 핵심 MAPKs 인 ERK, JNK, p38의 활성화(activity)를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(western blot) 분석법으로 확인하였다. MAPKs 단백질들은 대부분 인산화(phosphorylation) vs. 탈인산화(de-phosphorylation)에 따라서 단백질의 활성화(activity)가 조절되는데, LPS 자극으로 활성화된 (phosphorylated ERK, JNK, p38) MAPKs의 수준을 확인하였다(도 20).

LOS-ME는 특히 ERK MAPK의 인산화(phosphorylation) (도 20의 A)를 억제함으로써 항염증 효과(anti-inflammation effect)를 가짐으로써 염증이 원인이 되는 퇴행성 신경질환을 억제할 수 있음을 확인하였다.

2-6. 생강목 추출물의 인지기능개선 효과 확인

인지 능력은 신경세포-신경세포 사이의 신경전달물질(neuro-transmitters)와 같은 화학물질(chemical)과 그의 수용기(receptors) 사이의 작용으로 촉발되는 능력이다. 퇴행성 신경변성질환들은 내/외부적 원인에 의하여 신경계의 퇴행이 발생하고, 이 신경의 손상에 의하여 정상적인 신경활동이 이뤄지지 않는 상태를 의미한다.

아세틸콜린(Acetylcholine)은 신경계의 주요 7종의 화학물질(chemical) 중의 하나로 대표적인 신경 전달물질(neuro-transmitter)이다. 인지기능 장애로 가장 잘 알려진 퇴행성 신경질환 중 하나는 AD (Alzheimer’s disease)로 뇌의 퇴행, 특히 피질부의 위축이 관찰되는 정신적 질환이다. AD를 예방하거나, 억제할 수 있는 의약품은 나오지 않았으나, AD가 원인이 되어 발생되는 인지기능 장애를 개선시키기 위한 의약품들은 미국 FDA로부터 승인된 바 있다. 특히 AD환자에게 가장 많이 처방되는 의약품 중 하나인 도네페질(Donepezil)은 아세틸콜린(acetylcholine)의 저해효소인 AChE (acetylcholinesterase)의 화학물질 저해제(chemical inhibitor)로, 도네페질(Donepezil)을 처방함으로써 AD환자의 인지기능을 개선시킬 수 있다.

스코폴라민(Scopolamine)은 아세틸콜린 수용기(acetylcholine receptor)중 하나인 muscarinic receptor를 억제하는 화학물질 저해제(chemical inhibitor)로, 의약품으로는 멀미약 등에 사용되나, 과량이 투여되면 인지기능을 저해시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 인지기능 연구에 있어서, 스코폴라민-유도 동물모델(scopolamine-induced animal model)을 연구하여 chemical AD model 혹은 인지기능 개선 능력 평가에 사용된다.

본 실험에서는 다양한 환경적 요인, 노화 등으로 발생하는 퇴행성 신경변성질환에 대하여 생강목 추출물 (LOS-ME; L. obtusiloba stem methanolic extract)의 인지기능 개선 능력을 확인하기 위하여 인지기능 장애 모델 (scopolamine-induced amnesic mouse model)을 이용하였다.

본 연구에서 C57BL/6 mice를 이용하였으며, 생강목 추출물 (20 mg/kg)을 7일간 경구투여 (p.o) 방법으로 투여하였으며, 스코폴라민(scopolamine) (2 mg/kg)을 복강주사 (i.p)를 통해 투여하여 인지능력 저해 model을 유도하였다 (도 21의 A).

인지능력을 평가하기 위해서는 model animal의 행동을 측정하고, 평가하는 방법으로 인지능력의 감소와 개선을 평가한다. Y-maze는 120°를 간격으로 가지(arms)를 두는 미로장치를 말한다. 인지기능에 문제가 없는 대조군(control group)은 기존에 방문한 arm을 다시 방문하지 않는 (spontaneous alteration) 행동을 보인다. 그러나, scopolamine에 의하여 인지기능이 저해된 마우스(mice)의 경우는 arm에 재방문하는 횟수가 증가를 하는 특징을 보이며, 이 행동을 기록하여 공간감 인지기능을 측정하는 툴(tool)로써 사용된다. Morris water maze는 원형의 water pool에 수면 아래가 보이지 않도록 색소를 풀고, mouse가 올라서 쉴 수 있는 platform을 설치한 장치이다. 여러 날에 걸쳐 트레이닝(training)을 시킨 대조군 마우스(control mice)는 안정적으로 동일한 위치에 설치된 플랫폼(platform)을 찾아가고, 플랫폼 도착 시간(platform arrival time)이 줄어드는 경향을 보인다. 반대로, 스코폴라민(scopolamine)을 투여하여 인지기능이 저하된 마우스(mouse)는 원형 pool의 벽을 따라 의미가 없는 원형으로 움직이는 경향을 보인다. 전체 행동과, platform arrival time을 분석하는 것으로 scopolamine-induced amnesic mice model에서 기능성 소재의 인지기능 개선 효능을 분석하는 것이 가능하다.

인지기능 (공간감)의 기능성을 평가하는데 사용되는 Y-maze, Morris water maze 장치를 이용하여 스코폴라민(scopolamine)으로 유도된 인지기능 장애 모델 마우스(model mouse)의 score가 대조군(control group)에 비해서 현격히 감소한 것을 확인할 수 있다. 반면에 생강목 추출물 소재 (LOS-ME, 20 mg/kg 7일 간, p.o)를 투여한 group에서는 스코폴라민으로 유도된 인지장애에 대해서 행동적으로 개선됨을 실험적으로 확인하였다 (도 21의 B-D).

2-7. 생강목 추출물의 인지기능개선 효과 확인

실시예 2-1에 따라 제조된 생강목 추출물(LOS-ME)를 스코폴라민(scopolamine, 2mg/Kg) 유도된 마우스 모델에 주입한 후, 마우스 모델의 헤마에서 iNOS 및 COX2의 발현 정도를 확인하였다. 본 실험에서는 해당 마우스 모델 뇌의 해마 부분을 분리하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 23에서 β-액틴은 내부 대조군에 해당한다.). 도 23의 A를 참조하면, 스코폴라민(scopolamine)의 처리 시 iNOS의 발현이 증가하였으며, 대조군인 타크린(tarcine) 처리 마우스 모델의 iNOS의 발현 감소보다, 생강목 추출물(LOS-ME) 처리 군에서 iNOS의 발현 감소가 더 크게 나타났다.

도 23의 B를 참조하면, 생강목 추출물(LOS-ME) 처리군에서의 COX2의 발현이 대조군인 타크린(tarcine) 처리 마우스 모델의 보다 감소하였음을 알 수 있다.

본 실험 결과인 도 23에서의 값은, 대조군 대비 평균 ± SD, n = 8, one-way ANOVA에 의한 스코폴라민 처리군 대비 ^###p < 0.001. * p < 0.05 이다.

즉, 본 실험에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 생강목 추출물(특히, 생강목 줄기 메탄올 추출물은, 스코폴라민으로 유도된 기억력 손상에 대하여, 해마 내 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해하여 기억력, 인지기능을 개선함을 알 수 있으며, 염증성 질환(신경염증)을 완화시킴을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

생강나무(Lindera obtusiloba) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 생강나무 추출물은 생강나무의 줄기(stem)를 추출한 것인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 생강나무 추출물은 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 용매로 추출한 것인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 염증성 질환은 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 염, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 천식, 아토피, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 및 만성 염증질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염 및 근육염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 질환인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 신경 퇴행성 질환은 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증(cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 질환인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
생강나무(Lindera obtusiloba) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 기억력 개선용 건강 기능 식품 조성물.
생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물은 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 용매로 추출한 것인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 생강나무 잎 추출물의 농도는 3 내지 3000ug/ml인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 생강나무 잎 추출물은 퀘르세틴(quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol), 아이소퀴놀린(Isoquinoline) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 염증성 질환은 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 염, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 천식, 아토피, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 및 만성 염증질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염 및 근육염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 질환인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 신경 퇴행성 질환은 다발성경화증 (multiple sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(huntington's disease), 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia), 피질-기저핵 퇴행증(cortico basal degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 질환인, 염증성 질환 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환 또는 인지기능 개선용 건강 기능 식품 조성물.