CN107530391B - 用于骨关节炎的协同组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗一种或多种与关节炎或类风湿性关节炎或骨关节炎相关病症的协同组合物。更具体地，本发明涉及协同组合物，其含有治疗有效量的如下的组合：a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖，b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，c)任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。本发明还涉及用协同组合物治疗一种或多种与关节炎或类风湿性关节炎或骨关节炎相关病症的方法。

Description

用于骨关节炎的协同组合物
发明领域
本发明涉及用于治疗一种或多种与关节炎或类风湿性关节炎或骨关节炎相关病症的协同组合物。更具体地，本发明涉及含有治疗有效量的罗望子(Tamarindus indica)种子提取物与姜黄(Curcuma longa)根茎提取物的组合，任选地结合赋形剂/载体/稀释剂的协同组合物。
发明背景
骨关节炎(OA)是一种关节退行性疾病并由于其引起的疼痛和功能障碍，其比任何其他关节疾病影响更多的人。骨关节炎是退行性关节和骨疾病最广泛的形式之一。根据美国疾病控制中心(Center for Disease Control,USA)的数据，OA影响13.9％的25岁及以上成年人，其中65岁及以上的成年人占33.6％(1240万)。病理状况的特征在于滑膜关节内局部区域的关节软骨损失，其与骨肥大和关节囊增厚有关。骨关节炎的原因被认为涉及细胞的复杂相互作用和诸如细胞因子、生长因子、炎症介质、金属蛋白酶以及软骨降解酶的可溶性介质。这一复杂的相互作用可进一步由身体创伤、手术、感染或其他疾病过程触发。在其更高级的阶段，骨关节炎的特征在于由于蛋白水解产生的软骨磨损和颤动，以及通过最初攻击关节基质的软骨细胞产生的胶原蛋白酶。
疾病的进展可以从引起疼痛和肿胀的相对温和的症状，至极度衰弱和身体丧失能力。关节中缓冲组织的完全破坏也可能导致骨侵蚀。这种疾病的高发病率不仅影响患有这种疾病的个体，而且使医疗保健行业的成本增加，工作场所的生产力下降。约35-50％的OA病例可能是遗传决定的。其他危险因素包括身体质量、关节损伤、机械应力过度、错配、女性性别和老龄化(Int.J.Osteoarchaeology,2007,17:437-450)。软骨、骨和滑膜相互缠绕的异常导致关节变性。
骨关节炎的治疗方案包括直接介导细胞/炎性细胞因子相互作用，并使疾病进展持续下去的药物治疗。虽然提供非处方药物和处方药用于症状缓解，但它们会引起一些副作用。例如，长期使用高剂量的诸如阿斯匹林、布洛芬或对乙酰氨基酚的非甾体抗炎药可导致胃部不适、胃肠道出血和可能的肝损伤。较强的处方药，如皮质类固醇可能导致脆骨、白内障和血糖升高。
罗望子(Tamarindus indica L.)通用名：印度罗望子、罗望子。
罗望子(Tamarindus indica)是一种单型物种，意味着罗望子属内只有一个物种。这种热带植物主要来源于非洲本土并分布在整个非洲大陆。它在苏丹和印度野生。罗望子(Tamarindus indica L.)是一种常青树、缓慢生长但寿命长的植物，其高度可以在15至25米之间，圆周可达7.5米。它有深根、粗糙的深灰色树皮和强壮的树枝，灵活地承受大风。罗望子树在树龄3至7年之间开始结果。它由种子再现。浆果生产稳定在15岁。罗望子树直到40至60年都产果。罗望子种子坚硬、棕色，并包裹在保护性内皮层中。鞘通常每1厘米直径包含2至10个种子。罗望子通常使用的部分是花、果肉、种子、叶、根、树干或树皮。
美国专利申请US 2008/0286387公开了罗望子种子皮的提取方法。
姜黄、草本植物姜黄(Curcuma longa L.，姜科)的粉末化根茎广泛用于印度和亚洲美食，且它还用作着色和调味剂。发现粉末化的姜黄或其提取物在许多市售的植物补品中。在阿育吠陀医学(Ayurvedic medicine)中，传统上使用姜黄治疗炎症、皮肤伤口和肿瘤(Ammon and Wahl,1991,Planta Med.,57:1-7)。姜黄素是在姜黄中发现的主要活性化合物。已报道姜黄提取物和姜黄素具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌作用。包含总姜黄素的姜黄醇提取物用于展示本发明。也可使用其它富含总姜黄素的溶剂提取物或提取部分。
根据发明人的知识，没有与含有罗望子种子和姜黄根茎的提取物，用于丰富抗关节炎活性的组合物有关的是现有技术。
因此，本发明的主要目的是提供含有罗望子和姜黄提取物或提取部分的治疗有效组合的协同营养食品或膳食补充剂。
发明概述
为补救上述缺点，本发明公开了新的协同组合物，其用于预防或治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解中的至少一种病症，含有治疗有效量的如下的组合：
a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖，
b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，
c)任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
一方面，用于制备含有原花青素化合物的罗望子种子提取物所使用的醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和叔丁醇及其混合物。可以从姜黄根茎制备姜黄提取物，使用的溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、乙酸乙酯以及源自所述提取物的富含总姜黄素的提取部分。
可用于配制本发明组合物的药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂可以选自表面活性剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、聚合物、颜料、调味剂、悬浮液和药物递送系统。
在优选的方面，本发明的协同组合物含有：(a)在20％至80％的范围内变化的罗望子种子提取物，(b)在20％至60％的范围内变化的姜黄根茎提取物；和(c)在0-30％的范围内变化的任选的含有的赋形剂/载体。
在另一方面，本发明提供新的协同作用罗望子种子提取物，其用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎和骨关节炎中的至少一种病症，含有：a)1％至99％重量的，主要由原花青素组成的醇或水醇提取物，和b)1至50％重量的，主要由多糖组成的水提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在另一方面，本发明提供用于预防或治疗患者中选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解的至少一种病症的方法，该方法包括施用给有需要的患者有效量的协同组合物，所述的协同组合物含有：a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖；b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在另一方面，本发明提供给有需要的患者用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解的病症的方法，该方法包括施用给患者有效量的新的协同罗望子种子提取物，其含有a)1％至99％重量的，主要由原花青素组成的醇或水醇提取物，和b)1至50％重量的，主要由多糖组成的水提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
根据本发明的新的协同组合物可以配制成口服或局部给药。因此，药物/营养组合物可以以片剂、软凝胶、胶囊、颗粒、粉末、液体、溶液、霜剂、洗剂、喷雾剂、植入物或经皮贴片的形式制备，用于各种施用途径。
在另一方面，本发明提供新的协同组合物用于预防或治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解中的至少一种病症的用途，所述的新的协同组合物含有治疗有效量的如下的组合：a)选自醇/水醇提取物的罗望子种子提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖，b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，c)任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在下面的描述中阐述了本发明的一种或多种实施方式的细节。本发明的其他特征或优点将从以下几种实施方式的详细描述以及所附权利要求书中明显体现。
附图简述
图I：图I表示从罗望子种子甲醇提取物(提取物-1)分离和表征的各种黄烷醇和原花青素化合物。
图II：图II是大鼠爪水肿(A)、爪水肿抑制百分数(B)和百分比承重(C)的图示说明。每个条表示平均值±S.E.M，n＝6。通过单因素分析方差，接着进行Dunnett测试，##p<0.01对正常对照l(G1)；*p<0.05；**p<0.01对AIA对照(G2)。G3和G4是补充200和400mg/kg体重的组合物-11的治疗组，G5是补充10mg/kg体重的泼尼松龙的治疗组。
发明详述
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
炎症是血管组织对进入体内的刺激物如病原体、受损细胞或过敏剂的反应。它是机体的保护机制，以去除有害病原体或物质并保护组织。诸如TNFα、IL-1β、IL-6、GM-CSF和CD4+、Th2亚型衍生的IL-4、IL-5和IL-13淋巴因子的促炎细胞因子被认为是炎性疾病免疫发病机理的关键因素[Knight D A,等,J.Allergy Clin.Immunol.2001；108:797-803]。
5-脂氧合酶是从花生四烯酸合成白三烯的关键酶，从花生四烯酸合成白三烯是炎症过程中的关键步骤。5-脂氧合酶(5-LOX)的活化和基因表达对炎症性疾病负责。因此，阻断或下调5-LOX是治疗和控制炎症状态的有效治疗方法。
肿瘤坏死因子-α(TNFα)是一种是主要由巨噬细胞产生的重要的多效促炎细胞因子。TNF-α是急性期蛋白和趋化因子，其启动细胞因子的级联并增加血管通透性，从而将巨噬细胞和嗜中性粒细胞聚集到感染部位。然而，高水平的TNFα将具有不利影响并导致许多疾病状况。因此，TNFα是用于开发对抗广泛范围的炎症疾病的新型治疗方法的重要靶点。
基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性内肽酶，其能够分解如胶原蛋白和蛋白多糖的各种细胞外基质蛋白，并可引起软骨和炎症的疾病。MMP主要分为三个主要组，成纤维细胞胶原酶-1(MMP-1)、包含明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)的明胶酶、以及含有基质溶解酶-1(MMP-3)的基质溶解酶。MMP-3蛋白的表达与OA的致病机制密切相关。因此，它是骨关节炎早期诊断和治疗的重要指标。
在寻找具有抗炎和抗骨关节炎活性的新化合物期间，发明人发现罗望子种子的醇提取物具有一些预料不到的性质。当用分光光度法分析(USP 29-NF 24 2552页)时，使用甲醇(提取物-1)或乙醇(提取物-1A)作为提取介质产生的罗望子粉状种子原料的提取物主要含有原花青素(PAC)。通过在闪蒸和制备型HPLC系统上的广泛的色谱法纯化提取物，接着在waterXevoG2QTOF质谱仪上进行NMR和LC-MS/MS分析表明如图I所述，儿茶素、表儿茶素、原花青素B2(二聚体)、原花青素C1(三聚体)、原花青素(四聚体)、原花青素(五聚体)和原花青素(六聚体)的存在。用选自丙酮、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇及其混合物或它们的具有小百分比水的水醇溶液的含水醇或其他有机溶剂提取也产生含原花青素的提取物。罗望子种子的水提取物(提取物-4)在另一方面主要是具有可以忽略量的原花青素化合物的多糖化合物。含有罗望子种子多糖(TSP)的罗望子种子提取物或提取部分具有独特的性质。类似地，含有原花青素(PAC)化合物的罗望子种子的甲醇或乙醇提取物也表现出独特的性质，且如下表(表1)所示，它们与含TSP的提取物或提取部分不同。
表-1：罗望子醇和水提取物的性质比较
WSE为水溶性提取物；ASE为醇提取物
本发明中使用的罗望子种子提取物/提取部分可以是使用醇或醇水得到的罗望子种子提取物，或含有罗望子种子的醇提取物和水提取物的混合提取物。在独特的方法中，本发明中使用的罗望子种子提取物可以通过粉化罗望子种子并然后用诸如甲醇或乙醇的醇提取粉末以分别得到提取物-1或提取物-1A。然后将在醇提取后剩下的种子残留物用水提取以得到罗望子种子残留物水提取物(提取物-2/提取物-2A)。或者，用水直接提取种子粉末，得到提取物-4。罗望子种子的醇提取物显示非常有效的5-脂氧合酶(5-LOX)和环氧合酶(COX)抑制活性，且它们还显示了表-3、-4和-5中所总结的TNFα和MMP-3的有效抑制。相比之下，罗望子种子的水提取物(提取物-2/提取物-2A/提取物-4)在上述研究中效果较差。以所需比例合并浓缩的醇和水提取物以得到新提取物(提取物-3、-5、-6和-7)。或者，将提取液合并并蒸发，得到混合的新提取物。通过分别以1:1和10:1的比例合并醇提取物(提取物-1)和水提取物(提取物-2)得到提取物-3和提取物-5。作为本发明一部分制备的不同提取物总结在表2中。惊奇地发现通过合并其含有原花青素的醇提取物(提取物-1或提取物-1A)，或它们含有罗望子种子多糖的水提取物(提取物-2或提取物-4)的提取部分，或它们的提取部分得到的罗望子的混合提取物(提取物-3、提取物-5、提取物-6和提取物-7)显示独特/改进的生物学特性。如表5所总结，混合提取物，例如提取物-3、提取物-5和提取物-6，当与它们单独的提取物显示的26.02％(提取物-1)、0％(提取物-2)和0％(提取物-4)抑制相比较时，在人SW982滑膜细胞浓度为25μg/ml时，分别显示46.71％、39.58％和46.52％的MMP-3抑制百分比。类似地，如表3所总结，混合提取物，提取物-3、提取物-5、提取物-6和提取物-7，当与单独提取物，提取物-1、提取物-2和提取物-4分别显示的15.62μg/mL、>100μg/mL和>100μg/mL的IC50相比，显示更有效的5-脂氧合酶抑制活性，半最大抑制浓度(IC50)分别为12.02、13.15、10.72和11.08μg/mL。这表明含有原花青素的提取物或提取部分与含有多糖的提取物或提取部分协同作用。
表-2：提取物描述
还惊讶地发现，当与姜黄提取物合并时，含有罗望子种子提取物的组合物显示协同作用。含有总姜黄素的姜黄醇提取物用于展示本发明。也可使用其它富含总姜黄素的溶剂提取物或提取部分。例如，当与它们的单独成分，提取物-1(15.62μg/mL)和提取物-8(17.96μg/mL)相比时，分别含有1:1和2:1的罗望子甲醇提取物(提取物-1)和姜黄甲醇提取物(提取物-8)的组合物-1和组合物-2分别显示8.98和7.81μg/mL的半最大抑制浓度(IC50s)(表3)。因此，组合物显示的功效优于相应的单独成分，表明罗望子和姜黄的提取物对5-脂氧合酶的协同抑制。类似地，如表3所总结，其它组合物(组合物-3至-7)也显示抑制，发现它们比相应单独成分贡献的加成效果更好。此外，当与姜黄根茎提取物组合时，罗望子种子提取物也显示对细胞因子TNFα的协同抑制作用。组合物-1至-10表现出对TNFα的优越抑制作用，其优于相似剂量下相应单独成分所表现的抑制和/或优于对各单独成分估计的加成效应。例如，当与相应的单独成分，罗望子种子甲醇提取物(提取物-1)和姜黄甲醇提取物(提取物-8)分别显示的48.13％和78.78％的抑制相比时，组合物-1、-2、-3和-4在10μg/ml的浓度分别显示99.2、81.94、65.09和95.25％的TNFα的抑制。类似地，当与它们的单独成分，提取物-5(34.27％)和提取物-8(78.78％)相比时，来自罗望子种子混合提取物(提取物-5)的组合物-6和组合物-8也分别显示对于TNFα抑制的91.14％和86.69％的协同活性。如表4中所总结，其它的组合物也显示改善的TNFα抑制作用。进一步测试本发明的组合物以评估其在人类SW982滑膜细胞中抑制MMP-3的功效。来自罗望子种子甲醇提取物(提取物-1)的组合物-1,-2和来自罗望子种子混合提取物(提取物-5)的组合物-6和组合物-8也显示完全抑制MMP-3，它们在25μg/ml的浓度在MMP-3产生中分别减少102.1％、99.2％95.07％、106.38％和115.27％。作为对比，它们单独的提取成分提取物-1、提取物5和提取物8分别显示了对于MMP-3的26.02％、39.6％和82.81％的抑制作用。I、体内使用关节炎的佐剂诱导模型进一步证实本发明组合物在体外显示的改善的功效。如表6中所总结，当与其单独成分，提取物-5和提取物-8相比时，含有姜黄提取物(提取物-8)和罗望子提取物(提取物-5)的组合物-6在关节炎的佐剂诱导模型中显示更好的功效。最后，如图IIA和IIB所示，含有罗望子种子混合提取物5和姜黄提取物，以及赋形剂的组合物-11显示剂量依赖性抑制爪水肿，其在200mg和40mg/kg体重的剂量分别减少22.3％和30.3％的爪水肿。在诱导前和治疗的第20天在所有组用等电容表(Incapacitance Meter，IITC Life Science Inc.,CA)测量百分比承重能力，且数据总结于表-7和图IIC中。组合物-11显示剂量依赖性承重改善，且与疾病对照组相比，400mg/kg治疗组显示承重方面统计学上的显著改善。
从上述显而易见，含有含原花青素的醇提取物和含多糖的水提取物的罗望子种子混合提取物；以及含有含原花青素的罗望子种子提取物和姜黄提取物的组合物提供对于炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解改善的治疗。
在主要的实施方式中，本发明涉及含有罗望子种子提取物，组合至少一种来自植物材料的提取物，优选姜黄提取物的协同组合物，所述的植物材料选自姜黄(Curcumalonga)、姜(Zingiber officinale)、番荔枝(Annona squamosa)、穿心莲(Andrographispaniculat)、南非醉茄(Withania somnifera)。
在另一种主要的实施方式中，本发明提供罗望子种子的改善的提取物，其通过以选择的比例合并含有原花青素的有机溶剂提取物和含有多糖的罗望子种子的水提取物得到。
因此，本发明公开了新的协同组合物，其用于预防或治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解中的至少一种病症，含有治疗有效量的如下的组合：
a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖，
b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，
c)任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
本用于治疗骨关节炎的，含有罗望子种子和姜黄根茎提取物的协同组合物也可以配制成膳食补充剂。
在另一种实施方式中，罗望子提取物和姜黄根茎提取物的比例在1:10至10:1的范围内变化。
在一种优选的实施方式中，本发明提供协同营养补充剂/草本植物组合物，其由10％至80％的重量百分比范围内的罗望子提取物或它的提取部分，20％至80％的重量百分比范围内的姜黄提取物或提取部分，和(c)在0-30％范围内变化的任选含有的赋形剂/载体组成。
在另一种优选的实施方式中，协同组合物含有：(a)在40％至70％的范围内变化的罗望子种子提取物；(b)在20％至40％的范围内变化的姜黄根茎提取物；和(c)在0-15％范围内变化的任选含有的赋形剂/载体。
在又一种优选的实施方式中，协同组合物含有：a)60％的罗望子种子提取物；b)30％的姜黄根茎提取物，和c)10％的赋形剂/载体。
根据其它主要的实施方式，本发明提供新的协同作用罗望子种子提取物，其用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎和骨关节炎中的至少一种病症，含有：a)1％至99％重量的，主要由原花青素组成的醇或水醇提取物，和b)1至50％重量的，主要由多糖组成的水提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在另一种实施方式中，用于制备草本植物、罗望子种子和姜黄根茎的提取物或提取部分的溶剂可以选自乙酸乙酯、丙酮、乙酸、如乙醇，甲醇的C1-C5醇、水及其混合物。具体地，可用于制备包含原花青素化合物的罗望子种子提取物的醇可以选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和叔丁醇及其混合物。姜姜提取物可以从姜黄根茎制备，使用的溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、乙酸乙酯的溶剂以及源自所述的提取物的富含总姜黄素的提取部分。
本文使用的术语"赋形剂/载体"或"药学上可接受的载体"指稀释剂、赋形剂、可接受的试剂等，其为本领域普通技术人员所熟知并可用于制备药物组合物。
将协同组合物与药物或营养药物或膳食上可接受的赋形剂、载体或稀释剂配制成锭剂、片剂、薄膜包衣片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、溶液、乳剂、注射溶液、注射液、软膏、霜剂、喷雾剂、吸入剂、软凝胶、液体、洗剂、植入物或透皮贴剂，以用于各种给药途径。可用于制备组合物的药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂可以选自表面活性剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、聚合物、颜料、香料、悬浮液和药物递送系统。
本发明进一步提供如本文所述的含有罗望子种子提取物和姜黄根茎提取物的组合物，其任选地含有药学上可接受的载体，用于预防、控制和治疗关节炎或类风湿性关节炎的一种或多种组成。关节炎的非限制性实例包括类风湿(例如软组织风湿病和非关节风湿病、纤维肌痛、纤维性炎症、肌肉风湿病、肌筋膜痛、肱骨上髁炎、冷冻肩、Tietze综合征、筋膜炎、腱炎、腱鞘炎、滑囊炎)、青少年慢性关节疾病、脊柱关节病(强直性脊柱炎)、骨关节炎、高尿酸血症，以及与急性痛风、慢性痛风和系统性红斑狼疮和退行性关节炎有关的关节炎。
在另一种实施方式中，本发明还提供在有需要的受试者或哺乳动物中治疗炎症和与炎症相关疾病状况的方法，所述的方法通过施用来自罗望子的改进的提取物，或施用含有罗望子种子提取物和姜黄根茎提取物，任选地含有赋形剂/稀释剂的组合物，所述的炎症和与炎症相关疾病状况包括但不限于炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解。
因此，本发明提供在需要其的患者中用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解的疾病状态的方法，包括施用给患者有效量的新的协同组合物，所述的新的协同组合物含有：a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖；b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在一种替代的实施方式中，本发明提供在需要其的患者中用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解的疾病状态的方法，包括施用给患者有效量的新的协同作用罗望子种子提取物，所述的新的协同作用罗望子种子提取物含有：a)1％至99％重量的，主要由原花青素组成的醇或水醇提取物，和b)1至50％重量的，主要由多糖组成的水提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂。
在另一种实施方式中，本发明提供新的协同组合物的用途，所述的新的协同组合物含有治疗有效量的如下的组合：a)罗望子种子醇/水醇提取物，其含有单独的或与罗望子种子水提取物组合的原花青素，所述的罗望子种子水提取物含有多糖，b)含有姜黄素的姜黄根茎提取物，c)任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂，所述的用途用于预防或治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎、胶原蛋白降解中的至少一种病症。
在另一种实施方式中，本发明提供新的罗望子种子提取物的用途，所述的新的罗望子种子提取物含有：a)1％至99％重量的，主要由原花青素组成的醇或水醇提取物，和b)1至50％重量的，主要由多糖组成的水提取物，任选地含有药学上或营养上或饮食上可接受的载体/赋形剂，所述的用途用于治疗选自炎症、关节炎、关节疼痛、类风湿性关节炎和骨关节炎的至少一种病症。
用于治疗的最合适的途径和剂量将由本领域技术人员容易地确定。剂量取决于所治疗症状的性质和状态、被治疗患者的年龄和一般身体状况、给药途径和以前实施的任何治疗。
本发明的协同组合物也可以口服递送，其剂型可以是固体或液体剂型。固体组合物包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂等。口服剂型还包括漱口剂和锭剂。胶囊包括硬和软胶囊。这样的口服固体组合物可以单独使用或与稀释剂、螯合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂和辅助溶剂组合使用，以通过使用本领域已知的方法形成所需的剂型。
固体载体或稀释剂或赋形剂的优选实例包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄色糊精、白糊精、气溶胶、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨糖醇、甜菊苷、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、L-抗坏血酸、dl-α-生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、维生素B组、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、钙盐、颜料、调味剂和防腐剂。
液体载体(稀释剂)的优选实例包括蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、醇(例如乙醇)、丙二醇和聚乙二醇；和如各种动物和植物油的油性载体、白色软石蜡、石蜡和蜡。
本发明的另一种实施方式提供了在上述提及的各种制剂、膳食补充剂、食品和饮料组合物中的本发明的组合物的量也可以不均匀，并且根据制剂的性质和组合物的建议的人或动物剂量改变，例如，组合物剂量的大约0.001％至99％，更优选地组合物剂量的大约0.001至90重量％。
下面的具体示例将被解释为仅仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。没有进一步的阐述，相信本领域技术人员可以基于本文的描述最大程度地利用本发明。
实施例
实施例1：罗望子醇提取物的制备
将植物材料的干燥种子(1.0Kg)粉碎成粗粉末，用醇(甲醇，8L)在60-65℃下提取2小时。以对植物材料1:5-1:7W/V的比例用醇重复提取过程三次。合并所有的提取物，精细过滤合并的醇提取物，并将澄清的提取物在50-55℃真空下蒸发，得到稠糊状物。将上述材料在高真空下干燥8-10小时，得到为干粉的醇提取物(提取物-1,130g)。
然后将种子剩余的残留物用水(8L)提取。用水(6L)重复提取两次。合并水提取物并精细过滤。真空蒸发提取物，将残余物在真空干燥器中在75至85℃下进行最终干燥，得到水提取物(提取物-2,30g)。将这两种提取物(提取物-1和提取物-2)以1:1合并，筛分并混合，得到均匀的粉末(提取物-3)。
用如上所述的方法制备罗望子种子的乙醇提取物和种子残留物的水提取物，以分别得到119.2g的乙醇提取物(提取物-1A)和36.4g的水提取物(提取物-2A)。来自乙醇方法的提取物的化学特性与从甲醇方法获得的提取物的化学特性完全一致。
例如丙酮、丙醇、异丙醇、正丁醇和叔丁醇的其它溶剂可以用于制备具有或多或少类似化学特性的提取物。
使用标准程序评价提取物-1的物理和化学参数。使用UV分光光度法(USP 29-NF24 2552页)评价原花青素(PAC)含量，并且使用重量法根据以下测试程序评价多糖含量。
多糖评价程序:
将约2.5gm样品称重到250ml烧杯中，加入15ml水，用表面皿覆盖烧杯，并将该溶液在水浴上加热以溶解固体。将溶液冷却，离心以在250ml烧杯中收集透明液体，并加入25ml80％甲醇，充分混合，然后加入50ml的95％甲醇，并在磁力搅拌器上搅拌1小时。将沉淀物通过预先干燥并称重的Whatman 1号滤纸进行定量过滤，用2×25ml的80％甲醇洗涤烧杯和滤纸。将残留物在105℃±2℃下在烘箱中干燥1小时，冷却并称重沉淀物。使用下式计算多糖的百分比：多糖的百分比＝残留物的重量/样品重量×100。提取物-1中的多糖含量为0％。
原花青素评价程序:
将1.0ml的各标准和样品溶液(浓度为95μg/ml的原花青素)及甲醇转移到三个分开的10ml小瓶中。向每个小瓶中加入6.0ml试剂A(比例为95:5的丁醇和盐酸的混合物)和0.25ml的试剂溶液B(2％硫酸铁铵和17.5ml盐酸的混合物)。将小瓶在水浴中混合并加热40分钟，迅速冷却至室温，并用试剂A稀释至体积为10ml。使用含有甲醇的溶液作为空白，测定从标准溶液和样品溶液获得的溶液的吸光度。使用以下公式计算提取物中总原花青素的百分比。
总原花青素＝样品的吸光度/标准品的吸光度X标准品浓度/样品浓度X标准品纯度(参考文献：USP 37NF32 5484页)。提取物-1中的原花青素含量>90％。
甲醇提取物的性质总结于表1中。使用快速柱色谱和制备型HPLC纯化对提取物进行强化纯化，得到几种类黄酮和原花青素化合物。在Xevo G2 QTOF质谱仪上使用NMR和LC-MS/MS分析表征所选类黄酮和原花青素化合物的结构，并将结构总结于图I中。质谱分析显示罗望子种子醇提取物中儿茶素、表儿茶素、原花青素二聚体、原花青素三聚体、原花青素四聚体、原花青素五聚体和原花青素六聚体的存在。
实施例2
罗望子水提取物的制备
将干燥的植物材料(1.0Kg)粉碎成粗粉末，用水(8L)在85-95℃下提取2小时。用水(6L)重复提取两次。合并水提取物并精细过滤。真空蒸发提取物，将残余物在真空干燥器中在75至85℃下进行最终干燥，得到直接水提取物(萃取物-4，90g)。使用上述方法测定提取物-4中的原花青素和多糖含量。原花青素含量：0.36％。多糖含量：24.49％。
实施例3
罗望子混合提取物的制备
罗望子混合提取物(提取物-3)
将罗望子种子甲醇提取物(提取物-1，1g)与罗望子种子残留物水提取物(提取物-2,1g)合并，并将混合物均匀混合以获得提取物-3。
罗望子混合提取物(提取物-5)
将罗望子种子甲醇提取物(提取物-1，10g)与罗望子种子残留物水提取物(提取物-2，1g)合并，并将混合物均匀混合以获得提取物-5。
罗望子混合提取物(提取物-6)
将罗望子种子甲醇提取物(提取物-1，10g)与罗望子种子水提取物(提取物-4,1g)合并，并将混合物均匀混合以获得提取物-6。
罗望子混合提取物(提取物-7)
将罗望子种子甲醇提取物(提取物-1,10g)与罗望子种子残留物水提取物(提取物-2,2g)合并，并将混合物均匀混合以获得提取物-7。
可以用相同的方法制备具有不同比例的上述成分的组合物。
实施例4
姜黄醇提取物的制备
将干燥的植物材料根茎(1.0Kg)粉碎成粗粉末，用甲醇(9L)在60-65℃下提取2小时。使用甲醇以对植物材料1:6W/V的比例重复三次提取过程。合并所有提取物，精细过滤合并的醇提取物，并在50-55℃，在真空下将澄清的提取物蒸发，得到松膏。将上述物质在高真空下干燥6-8h，得到稠糊状物(95g；提取物-8，20.1％的总姜黄素)。
使用相同的试验步骤制备姜黄根茎的丙酮、乙醇、乙酸乙酯和甲基异丁基酮(MIBK)的提取物，分别得到丙酮提取物(72g，30％的总姜黄素)、乙醇提取物(80g，24％的总姜黄素)、乙酸乙酯提取物(64g，29.7％的总姜黄素)和MIBK提取物(89g，22％的总姜黄素)。
将上述提取物进行丙酮洗涤，得到富集至60％的总姜黄素的提取物。在IPA/甲醇中重复结晶产生含>95％总姜黄素的富集提取物。
实施例5
组合物-1：通过以1:1的比例合并罗望子的醇提取物(提取物-1)和姜黄的醇提取物(提取物-8)制备组合物-1。
实施例6
组合物-2：通过以2:1的比例合并罗望子的甲醇提取物(提取物-1)和姜黄的甲醇提取物(提取物-8)制备组合物-2。
实施例7
组合物-3：通过以3:1的比例合并罗望子的醇提取物(提取物-1)和姜黄的醇提取物(提取物-8)制备组合物-3。
实施例8
组合物-4：通过以1:3的比例合并罗望子的甲醇提取物(提取物-1)和姜黄的甲醇提取物(提取物-8)制备组合物-4。
实施例9
组合物-5:通过以3:1的比例合并罗望子的提取物-5和姜黄的醇提取物(提取物-8)制备组合物-5。
实施例10
组合物-6：通过以2:1的比例合并罗望子的提取物-5和姜黄的甲醇提取物(提取物-8)制备组合物-6。
实施例11
组合物-7：通过以3:1的比例合并罗望子的提取物-6和姜黄的醇提取物(提取物-8)制备组合物-7。
实施例12
组合物-8：通过以1:2的比例合并罗望子种子的提取物-5和姜黄的甲醇提取物(提取物-8)制备组合物-8。
实施例13
组合物-9：通过以3:1的比例合并罗望子种子的提取物-7和姜黄的醇提取物(提取物-8)制备组合物-9。
实施例14
组合物-10：通过以1:3的比例合并罗望子种子的提取物-7和姜黄的甲醇提取物(提取物-8)制备组合物-10。
实施例15
组合物-11：通过合并60份的罗望子种子提取物[54份的罗望子种子甲醇提取物(提取物-1)+6份的罗望子种子残留物水提取物(提取物-2)]、30份的姜黄甲醇提取物(提取物-8)、8份的微晶纤维素和2份的二氧化硅(Syloid 244FP)制备组合物-11。
实施例16
5-脂氧合酶(5-LOX)抑制活性
含有罗望子种子提取物提取物-1至提取物-7和姜黄根茎提取物(提取物-8)的组 合物-1至-9的协同抗炎活性
用Lip Yong Chung等(Pharmaceutical Biology,Vol.47(12),1142-1148,2009)的方法测量5-脂氧合酶抑制活性。测定混合物在50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中含有80μM亚油酸和足量的马铃薯5-脂氧合酶。将5μL的5-LOX酶加入到175μL的50mM Tris-HCl缓冲液中。通过在50mM Tris-HCl缓冲液中加入5μL亚油酸(最终浓度140μM)开始反应，接着在黑暗中于25℃孵育20分钟。反应混合物的总体积是185μL。通过加入65μL新鲜制备的福克斯试剂(fox reagent)终止测定。孵育20分钟后，使用Xmark微板分光光度计(Xmark Micro platespectrophotometer，BIO-RAD)在595nm处读取吸光度。监测反应120秒，通过在加入亚油酸两分钟前孵育各种浓度的测试物质来测定测试物质提取物和组合物的抑制潜力。所有测定均进行三次。通过比较试验物质获得的曲线的斜率与对照的曲线斜率来计算抑制百分数。组合物-1至-9、罗望子种子提取物(提取物-1至提取物-7)、姜黄根茎提取物(提取物-8)的抑制百分数(IC50值)总结于表-3中。
表-3：5-脂氧合酶(5-LOX)抑制活性
上述表-3中的5-脂氧合酶抑制活性值清楚地显示了含有罗望子提取物和姜黄提取物的组合物抑制5-脂氧合酶的协同效力。该实验结果表明，提取物的组合物比单独的提取物显示更大的5-脂氧合酶抑制活性。
实施例17
罗望子提取物(提取物-1至-7)和含有罗望子提取物和姜黄提取物的组合物(组合物-1至-10)的体外肿瘤坏死因子(TNF-α)抑制作用。
在基于细胞的体外测定中评价提取物和组合物的抗炎活性。简言之，将THP-1人单核细胞洗涤并重新悬浮于补充有1％胎牛血清(FBS)的无酚红的Dulbecco's ModifiedEagle's Medium(DMEM)中。将96孔TC板的各孔中加入相等数量的细胞，并用不同浓度的提取物和组合物的检测物质(0.5至50μg/ml；在培养基中从含有50mg/l ml DMSO的各试验化合物的储备溶液制备溶液)预处理细胞2小时。通过在5％CO 2存在下，在37℃下用100ng/ml的LPS处理4小时诱导炎症反应。媒介物对照培养孔接受在培养基中0.1％的DMSO。收集细胞培养上清液并评价分泌的促炎细胞因子TNFα。通过由美国R&D Systems提供的高度特异性和灵敏的酶免疫测定(EIA)试剂盒来定量测定TNF-α浓度。基于供应商提供的方案进行酶免疫测定。从成分浓度对TNF-α水平绘制的图中确定TNF-α的50％抑制的抑制浓度(IC50)。表-4显示在细胞体外模型中对于50％TNF-α抑制，提取物和组合物的浓度(IC50)的比较。
表-4：TNF-α抑制作用
实施例18
基质金属蛋白酶-3(MMP-3)活性的抑制
在IL-1β诱导的SW982人滑膜细胞中评价MMP-3。简言之，将SW982细胞在含有2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)的DMEM中培养。在实验前一天，每孔5000个细胞接种96孔细胞培养板(Corning，美国)。用含有1％胎牛血清的新鲜DMEM代替培养基。提取物和组合物在培养基中在2.5μg至100μg/ml的范围连续稀释，并在37℃在5％CO2中与细胞预孵育2小时，并然后用10ng/ml的人重组IL-1β(R&DSystem,Minneapolis,Minn.)刺激24小时。收获培养上清液并用于通过ELISA开发试剂盒(R&D System,Minneapolis,Minn.,美国)测量MMP-3产生。通过将光密度内插到从已知浓度的MMP-3产生的标准曲线中，定量测定无细胞培养上清液中的MMP-3浓度。抑制百分数数据总结于表-5中。
表-5：MMP-3抑制
实施例19
罗望子提取物(提取物-5)和它的协同组合物-6在Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)中抗佐剂诱导性关节炎的疗效
将Sprague Dawley大鼠饲养在具有不锈钢顶部架子的，坚实底部高压灭菌的聚丙烯笼中，每笼3只。动物随意提供啮齿动物颗粒饲料和矿泉水。动物在进入实验前驯化3天，并且它们习惯/适应于实验者和用于测量等电容表(Incapacitance meter)中后肢承重能力的实验条件。检查一组42只动物，选择36只健康SD大鼠进行研究，并根据爪体积随机分配到6个不同组中的一组，6个不同组即正常对照组、媒介物对照组、用测试物质[罗望子提取物(提取物-5；400mg)、姜黄提取物(提取物-8；400mg)和含有罗望子提取物(提取物5)和姜黄提取物(提取物-8)的组合物-6(400mg)]补充的三组。在施用测试品、参照品或媒介物后7天，在第8天，通过单次皮下注射0.1mL在不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国)中热灭活的结核分枝杆菌(300μg/动物)悬浮液，在除G1的所有组的大鼠中诱发关节炎进入左后肢亚足底区域。对照组动物注射0.1mL生理盐水(0.9％w/v氯化钠)。施用媒介物、测试物和参照药物直到完成研究，即第35天。在第0天(治疗前)和第35天通过器官充满度测量器(Plethysmometer，Pan Lab，LE7500)测量爪体积。最终和初始爪体积之间的差异被认为是水肿体积。通过计算与补充CMC的对照组中观察到的爪水肿相比的爪水肿抑制百分比来预计测试化合物的体内抗炎反应。数据总结于表-6中。与单独成分提取物5和提取物-8相比，组合物-6显示出更好的对爪水肿的抑制作用。
表-6
实施例20
组合物-11在Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)中在佐剂诱导性关节炎中的抗炎活性
将Sprague Dawley大鼠饲养在具有不锈钢顶部架子的，坚实底部高压灭菌的聚丙烯笼中，每笼3只。动物随意提供啮齿动物颗粒饲料和矿泉水。动物在进入实验前驯化3天，并且它们习惯/适应于实验者和用于测量等电容表(Incapacitance meter)中后肢承重能力的实验条件。检查一组35只动物，选择30只健康SD大鼠进行研究，并根据爪体积随机分配到5个不同组中的一组，5个不同组即正常对照组(G1)、媒介物对照组(G2)、用测试物质组合物-11(200mg、400mg)补充的两组(G3和G4)、以及用参照药物10mg/kg的泼尼松龙的组(G5)。在施用测试品、参照品或媒介物后7天，在第8天，通过单次皮下注射50μL完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国)，在除G1的所有组的大鼠中诱发关节炎进入左后肢亚足底区域。对照组动物注射0.1mL生理盐水(0.9％w/v氯化钠)。施用媒介物、测试物和参照药物直到完成研究，即第20天。在第0天(治疗前)和第20天通过器官充满度测量器(Plethysmometer，PanLab，LE7500)测量爪体积。最终和初始爪体积之间的差异被认为是水肿体积。通过计算与补充CMC的对照组中观察到的爪水肿相比的爪水肿抑制百分比来预计测试化合物的体内抗炎反应。如图IIA和IIB中所总结，组合物-11显示与疾病对照组(G2)相比，统计学上显著和剂量依赖性的爪水肿抑制作用。补充200mg和400mg的组合物-11的治疗组显示22.3％和30.3％的爪水肿抑制作用，作为对照的泼尼松龙显示69.7％的抑制。在诱导前和治疗的第20天在所有组用等电容表(Incapacitance meter，IITC Life Science Inc.,CA)测量百分比承重能力。数据总结于表-7和图IIC中。组合物-11显示剂量依赖的承重的改善，且400mg/kg治疗组显示与疾病对照组(G2)相比，在承重方面统计学上的显着改善。
表-7：在AIA中组合物11对平均左后肢承重能力的影响(g)
数据表示为每组六只大鼠的平均值±S.E.M。通过单因素方差分析##p<0.01对正常对照(G1)；*p<0.05；**p<0.01对AIA对照(G2)，接着进行Dunnett测试。

Claims (7)

1.新的协同组合物，其中所述的组合物含有：a) 60%的罗望子种子提取物， b) 30%的姜黄根茎提取物，和c) 10% 的赋形剂/载体；所述罗望子种子提取物由罗望子种子甲醇提取物与罗望子种子残留物水提取物按照10：1的比例组成。
2.根据权利要求1所述的新的协同组合物，其特征在于，所述罗望子种子提取物的制备方法如下：
将干燥种子粉碎成粗粉末，用醇在60-65℃下提取2小时；以对种子1:5-1:7W/V 的比例用醇重复提取过程三次；合并所有的提取物，精细过滤，并将澄清的提取物在50-55℃真空下蒸发，得到稠糊状物；将上述材料在高真空下干燥，得到为干粉的醇提取物；
然后将种子剩余的残留物用水提取两次；合并水提取物并精细过滤；真空蒸发提取物，将残余物在真空干燥器中在75至85℃下进行最终干燥，得到水提取物。
3.根据权利要求1所述的新的协同组合物，其特征在于，所述姜黄根茎提取物的制备方法如下：
将干燥的根茎粉碎成粗粉末，用醇在60-65℃下提取2小时；使用醇以对植物材料1:6W/V的比例重复三次提取过程；合并所有提取物，精细过滤合并的醇提取物，并在50-55℃，在真空下将澄清的提取物蒸发，得到松膏； 将上述物质在高真空下干燥，得到稠糊状物。
4.根据前述权利要求中任何一项的新的协同组合物，其中将组合物配制成口服或局部施用。
5.根据权利要求1所述的新的协同组合物用于制备治疗选自炎症、关节疼痛、胶原蛋白降解的病症的药物的用途，所述的新的协同组合物含有治疗有效量的罗望子种子提取物和姜黄根茎提取物的组合，任选地含有药学上可接受的赋形剂/载体。
6.根据权利要求5所述的新的协同组合物用于制备治疗选自炎症、关节疼痛、胶原蛋白降解的病症的药物的用途，所述炎症包括关节炎。
7.根据权利要求6所述的新的协同组合物用于制备治疗选自炎症、关节疼痛、胶原蛋白降解的病症的药物的用途，所述关节炎包括类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性非类风湿性关节炎。
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