KR20220117307A - 인간 il-13 및 il-17에 대해 결합 특이성을 갖는 다중 특이적 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 대해 특이성을 갖는 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중 특이적 항체를 제조하는 방법, 및 아토피성 피부염 및 기타 질환의 치료를 위한 이의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

인간 IL-13 및 IL-17에 대해 결합 특이성을 갖는 다중 특이적 항체

본 발명은 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 IL-17F에 대해 특이성을 갖는 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중 특이적 항체를 제조하는 방법, 및 아토피성 피부염 및 기타 질환의 치료를 위한 이의 치료적 용도에 관한 것이다.

아토피성 습진으로도 알려져 있는 아토피성 피부염(AD)은 피부가 심하게 가렵고 붉어지고 부어 오르고 진물이 나고 갈라져서 시간이 경과함에 따라 종종 두꺼워지는 염증성 질환이다.

20세기 초부터, 많은 점막 염증성 질환들이 더 흔해졌고; 아토피성 피부염은 그러한 질환의 전형적인 예이다. 현재 선진국과 미국에서는 어린이의 15~30%와 성인의 2~10%에 영향을 미치며 지난 30 내지 40년 사이 3배 가까이 증가했다. 1,500만 명이 넘는 미국 성인과 어린이들이 아토피성 피부염을 앓고 있다.

AD에 사용되는 치료에는 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 인터페론 감마, 마이코페놀레이트, 모페틸 및 아자티오프린과 같은 전신 면역억제제를 포함한다. 항우울제 및 날트렉손을 사용하여 소양증(가려움증)을 조절할 수 있다. 2016년에는 포스포디에스테라제-4 억제제인 크리사보롤이 경증 내지 중등도 습진에 대해 승인되었으며, 2017년에는 IL-4Rα의 모노클로날 항체 길항제인 두필루맙이 중등도 내지 중증 습진 치료에 승인되었다.

기존 약물의 한계 때문에 아토피성 피부염의 개선된 치료에 대한 필요성이 크다.

WO2013/102042A2 (Abbvie)는 IL-13 및 IL-17에 대한 이중특이적 결합 단백질 및 광범위한 질환 목록의 치료에서 이들의 잠재적인 용도를 기재하고 있다. 결합 단백질은 임상 개발로 진행되지 않았다.

WO2015/127405A2 (Genentech)는 항-IL-13/IL-17 이중특이적 항체, 및 중등도 내지 중증 천식 및/또는 호산구성 천식을 치료하기 위해 이들을 사용하는 방법을 기재하고 있다. I상 임상 시험에서, BITS7201A는 항약물 항체(ADA)의 높은 발병률과 관련이 있었고 임상 개발에서 제외되었다.

본 발명은 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합할 수 있는 개선된 다중 특이적 항체를 제공한다.

본 발명의 항체는 현재 이용 가능한 항체와 비교하여 개선된 성질, 예를 들어, 더 낮은 면역원성 및/또는 더 나은 약동학적 프로파일을 갖는다. 또한, 본 발명의 항체는 산업적 규모에서 비용 및 시간 효과적인, 현재 이용 가능한 방법보다 적은 단계를 포함하는 개선된 정제 방법을 사용하여 보다 효율적으로 정제될 수 있도록 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 개선된 제조성(manufacturability)을 가질 수 있다.

본 발명은 다음을 추가로 제공한다:

◆ 다중 특이적 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.

◆ 폴리뉴클레오티드를 운반하는 발현 벡터.

◆ 벡터를 포함하는 숙주 세포.

◆ 숙주 세포를 배양하고 제조된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 다중특이항체의 제조 방법.

◆ 다중 특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물.

◆ 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학적 조성물.

◆ 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기, 또는 호산구성 식도염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 다중 특이적 항체 또는 약학적 조성물을, 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

도 1.
Ab650 인간화 정렬.
래트 항체(공여자) V-영역 서열과 설계된 인간화 서열과 함께 인간 생식계열(수용체) V-영역 서열의 정렬.
(A) 경쇄 이식편 650:
650 = 래트 가변 경쇄 서열.
650gL8 = 수용체 프레임워크로서 IGKV1-39 인간 생식계열을 사용하는 650 가변 경쇄의 인간화 이식편.
CDR은 볼드체/밑줄로 나타낸다.
공여자 잔기는 볼드체/이탤릭체로 나타내며 강조 표시된다: I58 및 Y71.
(B) 중쇄 이식편 650:
650 = 래트 가변 중쇄 서열.
650gH9 = 수용체 프레임워크로서 IGHV1-69 인간 생식계열을 사용하는 650 가변 중쇄의 인간화 이식편.
CDR은 볼드체/밑줄로 나타낸다.
공여자 잔기는 볼드체/이탤릭체로 나타내며 강조 표시된다: A67, F69 및 V71.
도 2.
아미노산 및 DNA 서열.
도 3.
IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 정제.
(A) 정제된 다중 특이적 항체의 BEH200 SEC-UPLC 분석, FLR에 의한 검출.
(B) 비환원(레인 1) 또는 환원(레인 2) 조건 하에 Tris-글리신 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질 샘플. 젤은 쿠마시 신속 염색(Coomassie quick stain)으로 염색하고 dH₂O에서 탈염색하였다. Mark 12 단백질 마커(Life Technologies)를 표준(M)으로 사용하였다. 분자량(MW)은 킬로 달톤(kDa)으로 측정되었다.
도 4.
IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 STAT6 신호전달의 억제.
도 5.
(A) TNF-α와 조합된 인간 또는 시노몰구스 IL-17A에 대한 반응으로 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-6 생성 억제. (i) 인간 IL-17A. (ii) 시노몰구스 IL-17A.
(B) TNF-α와 조합된 인간 또는 시노몰구스 IL-17F에 대한 반응으로 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-6 생성 억제. (i) 인간 IL-17F. (ii) 시노몰구스 IL-17F.
도 6.
NHEK CXCL1 방출 생물검정에서 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-13, IL-17A 및 IL-17F의 동시 중화.
기호 설명:
원 = 항-IL-13/IL-17AF
정사각형 = 항-IL-17A
위를 가리키는 삼각형 = 항-IL-17F
아래를 가리키는 삼각형 = 항-IL-13
도 7.
본 발명에 따른 다중 특이적 IL-13/IL-17AF 항체의 개략도.

IL-13

IL-13은 IL-4와 25% 서열 동일성을 공유하는 단쇄 사이토카인이다. 이는 대략 132개의 아미노산으로 구성되며, 잔기 33-36 및 87-90에 걸쳐 있는 2개의 β 가닥과 함께 잔기 10-21(나선 A), 43-52(나선 B), 61-69(나선 C) 및 92-110(나선 D)에 걸쳐 있는 4개의 나선의 2차 구조를 형성한다. IL-13의 솔루션 구조가 해결되어 IL-4에서도 관찰되는 예측된 업-업-다운-다운 4-나선-번들 입체형태(up-up-down-down four-helix-bundle conformation)가 드러났다(Eisenmesser 2001).

인간 IL-13은 17 kDa 당단백질이며 Th2 계통의 활성화된 T-세포에 의해 생성되지만, Th0 및 Th1 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 비만 세포와 같은 몇 가지 비-T 세포 집단도 IL-13을 생성한다. IL-13의 기능은 인간 B 세포에서 면역글로불린 이소형을 IgE로 전환하고 인간과 마우스 둘 모두에서 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것을 포함한다.

IL-13은 세포 표면 수용체인 IL-13R-알파1 및 IL-13R-알파2에 결합한다. IL-13R-알파1은 낮은 친화도(K_D ~ 10 nM)로 IL-13과 상호작용한 다음, IL-4R-알파를 동원하여 이종이량체 수용체 복합체를 신호전달하는 높은 친화도(K_D ~ 0.4 nM)를 형성한다.

IL-4R/IL-13R-알파1 복합체는 B 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호산구, 호염기구, 섬유아세포, 내피 세포, 기도 상피 세포 및 기도 평활근 세포와 같은 많은 세포 유형에서 발현된다. IL-13R-알파/IL-4R 수용체 복합체의 결찰은 신호 전달인자 및 전사 활성인자 6(STAT6) 및 인슐린 수용체 기질 2(IRS2) 경로를 포함하는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 초래한다.

IL-13R-알파2 사슬은 단독으로 IL-13에 대해 높은 친화도(K_D ~ 0.25-0.4 nM)를 갖는다. 이것은 IL-13 결합을 부정적으로 조절하는 미끼 수용체로서 그리고 대식세포 및 가능하게는 다른 세포 유형에서 AP-1 경로를 통해 TGF-β 합성 및 섬유증을 유도하는 신호전달 수용체로서 둘 모두 기능한다.

IL-13은 많은 인간 장애의 발병기전과 관련이 있으며 치료 전략은 IL-13 활성을 억제하거나 상쇄하도록 설계되었다. 특히, IL-13에 결합하고 이를 중화하는 항체는 IL-13 활성을 억제하는 수단으로 추구되어 왔다. 그러나, IL-13, 특히 인간 IL-13, 특히 인간 IL-13을 중화할 수 있는 항체에 결합할 수 있는 적합하고/하거나 개선된 항체가 당업계에 필요하다.

본 발명은 인간 IL-13에 결합하고 높은 친화도로 결합하고 인간 IL-13에 결합 및 중화할 수 있는 결합 단백질, CDR 이식된 항체, 인간화 항체 및 이의 단편의 신규 패밀리를 제공한다.

IL-13 활성을 억제하는 항체는 몇 가지 가능한 작용 기전을 통해 작동할 수 있다. bin 1은 인간 IL-13에 결합하여 IL-13Rα1의 결합을 방지하고 그 결과 또한 IL-4가 결합하는 것을 차단하는 항체를 나타낸다. bin 1 항체는 또한 IL-13이 IL-13Rα2에 결합하는 것을 방지할 수 있다. bin 2는 IL-13Rα1에 대한 결합을 허용하지만 IL-4R이 복합체로 동원되는 것을 방지하는 방식으로 hIL-13에 결합하는 항체를 나타낸다. 본 발명자들은 bin 1을 통해 작동하는 항체를 선택하였다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-13에 결합하고 IL-13Rα1의 결합을 방지한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-13에 결합하고 IL-13Rα2의 결합을 방지한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-13에 결합하고 L-13Rα1 및 IL-13Rα2의 결합을 방지한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 100 pM 미만의 K_D로 인간 IL-13에 결합한다.

IL-17

사이토카인의 IL-17 패밀리는 23-36 kDa의 분자 질량과 이량체 구조를 갖는 구조적 유사성을 기반으로 하는 6개의 구성원으로 이루어진다. 발견된 구성원 IL-17A(여전히 문헌에서 단순히 IL-17이라고 지칭함)는 다른 구성원: IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E(IL-25로도 알려져 있음) 및 IL-17F와 16% - 50% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. IL-17A 및 IL-17F는 큰 상동성(50%)을 공유하고 동일한 수용체 복합체에 결합하므로 이들 2개의 사이토카인 사이에 공유된 생물학적 활성이 관찰되었다. 또한, IL-17A 및 IL-17F는 동종이량체로서 뿐만 아니라 IL-17A/F 이종이량체로도 존재한다. IL-17E(IL-25)는 IL-17A와 유사성이 가장 적다. IL-17A 및 IL-17F의 생물학적 활성에 대한 중요성과 관련성은 이들이 동일한 IL-17RA/IL-17RC 수용체 복합체를 공유하며 IL-17A는 IL-17RA에 대해 가장 큰 친화성을 갖는 반면 IL-17F는 IL-17RC에 더 강하게 결합한다는 발견이다. IL-17RA를 활용하는 다른 패밀리 구성원은 IL-17RA/IL-17RB 수용체 복합체를 통해 신호를 전달하는 IL-17E이다.

IL-17A 및 IL-17F는 CD4+ T 세포의 Th17 서브세트에 의해 생성된다. 또한, 다른 T 세포 서브세트는 세포독성 CD8+ T 세포(Tc17), gdT 세포 및 NK T 세포를 포함하는 IL-17A 및 IL-17F를 생성한다. IL-17A를 분비하는 것으로 보고된 다른 세포 집단은 호중구, 단핵구, NK 세포, 림프 조직 유도인자-유사(LTi-유사) 세포, 장 파네트 세포(intestinal paneth cell), 및 심지어 B 세포 및 비만 세포를 포함한다. 또한, 상피 세포는 IL-17F를 분비하는 것으로 보고되었다.

IL-17 사이토카인에 반응하는 세포 유형은 상이한 수용체의 발현에 의해 반영된다. IL-17RA는 조혈 조직에서 특히 높은 수준으로 편재적으로 발현되는 반면, IL-17RC는 관절, 간, 콩팥, 갑상선 및 전립선의 비면역 세포에서 보다 높게 발현된다. 높은 수준의 IL-17RC를 발현하는 세포가 IL-17F에 더 반응할 수 있는 반면, IL-17RC보다 IL-17RA의 더 높은 발현을 갖는 세포는 IL-17A에 더 쉽게 반응할 수 있기 때문에 이러한 차등 발현은 IL-17A 및 IL-17F 생물학적 활성의 차이를 설명할 수 있다. IL-17A 및 F에 반응하는 특정 세포 유형은 섬유아세포, 상피 세포, 각질 세포, 활막 세포 및 T 및 B 세포 및 대식세포에 작용하는 것으로도 보고된 IL-17A가 있는 내피 세포를 포함한다.

본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합할 수 있다. 따라서, 항체는 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17AF 이종이량체에 결합할 수 있다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-17A에 결합한다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-17F에 결합한다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-17A 및 IL-17F에 결합한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 50 pM 미만의 K_D로 인간 IL-17A에 결합한다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 25 pM 미만의 K_D로 인간 IL-17A에 결합한다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 10 pM 미만의 K_D로 인간 IL-17A에 결합한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 200 pM 미만의 K_D로 인간 IL-17F에 결합한다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 100 pM 미만의 K_D로 인간 IL-17F에 결합한다.

알부민

항체의 높은 특이성과 친화성은 특히 단백질:단백질 상호작용을 조절하는 데 이상적인 진단 및 치료제로 만든다. 그러나, 항체는 특히 생체내에서 긴 수명을 부여하는 Fc 도메인이 결핍된 경우 혈청으로부터의 제거율 증가를 겪을 수 있다 (Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217).

항체의 반감기를 개선하는 수단이 알려져 있다. 한 가지 접근법은 단편을 중합체 분자에 접합하는 것이었다. 따라서, 동물에서 Fab', F(ab')₂ 단편의 짧은 순환 반감기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG; 예를 들어, WO98/25791, WO99/64460 및 WO98/37200 참조)에 대한 접합에 의해 개선되었다. 또 다른 접근법은 FcRn 수용체와 상호작용하는 제제에 대한 접합에 의해 항체 단편을 변형시키는 것이었다(예를 들어, WO97/34631 참조). 반감기를 연장하기 위한 또 다른 접근법은 혈청 알부민에 결합하는 폴리펩타이드를 사용하는 것이었다[예를 들어, 문헌(Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756; EP0486525; US6267964; WO04/001064; WO02/076489; 및 WO01/45746) 참조].

혈청 알부민은 약 19일의 인간에서의 반감기를 갖는 혈관 및 혈관외 구획 둘 모두에 풍부한 단백질이다(Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161-245). 이것은 약 21일인 IgG1의 반감기와 유사하다(Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110).

항-혈청 알부민 결합 단일 가변 도메인은 NCE(화학적 실체) 약물, 단백질 및 펩타이드를 포함한 약물의 반감기를 증가시키기 위한 접합체로서의 이들의 사용과 함께 설명되었고, 예를 들어, 문헌[Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288, WO04003019, WO2008/096158, WO05118642, WO2006/0591056 및 WO2011/006915]을 참조한다. 다른 항-혈청 알부민 항체 및 다중특이적 항체 형식에서의 이의 용도는 WO2009/040562, WO2010/035012 및 WO2011/086091에 기재되어 있다. 특히, 본 발명자들은 이전에 WO2013/068571에서 개선된 인간화를 갖는 항-알부민 항체를 설명하였다.

본 발명의 다중 특이적 항체는 생체내 혈청 반감기를 연장하여 개선된 약동학적 프로파일을 생성하기 위해 인간 혈청 알부민에 결합하도록 조작될 수 있다.

항체

본 개시내용의 맥락에서 사용하기 위한 항체는 전체 항체 및 이의 기능적 활성 단편, 즉 항원-결합 단편으로도 칭하는 IL-13, IL-17A 및/또는 IL-17F에 특이적으로 결합하는 분자를 포함한다. 항체와 관련하여 본원에 기재된 특징은 문맥에서 달리 지시하지 않는 한 항체 단편에도 적용된다.

"면역글로불린(Ig)"으로도 알려진 전체 항체는 일반적으로 온전한 또는 전장 항체, 즉 특징적인 Y형 3차원 구조를 정의하기 위해 조립되는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 요소를 포함하는 항체에 관한 것이다. 고전적인 천연 전체 항체는 하나의 항원 유형에 결합한다는 점에서 단일특이적이며, 2개의 독립적인 항원 결합 도메인을 갖는다는 점에서 2가이다. 용어 "온전한 항체", "전장 항체" 및 "전체 항체"는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 천연 항체 구조와 유사한 구조를 갖는 단일특이적 2가 항체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.

각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(C_L)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 Ig 부류 따라 3개의 불변 도메인 CH₁, CH₂ 및 CH₃ 또는 4개의 불변 도메인 CH₁, CH_2, CH₃ 및 CH₄로 구성된 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. Ig 또는 항체의 "부류"는 불변 영역의 유형을 지칭하며 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하며 이들 중 몇 개는 하위부류, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 더 나눌 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 V_H 및 V_L 영역은 항원 인식을 결정하는 초가변성 영역 (또는 "초가변 영역")으로 더 세분화될 수 있으며, 상보성 결정 영역(CDR)으로 칭하며, 프레임워크 영역(FR)으로 칭하는 더 구조적으로 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카복시 말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다. CDR과 FR은 함께 가변 영역을 형성한다. 통상적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역에서 CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭되고 경쇄 가변 영역에서는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭된다. 이들은 각 사슬의 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 번호가 넘버링된다.

CDR은 카바트(Kabat) 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적으로 넘버링된다. 이 시스템은 문헌[Kabat et al., 1991 in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이하 "Kabat et al. (상기)")]에 기재되어 있다. 이 넘버링 시스템은 달리 지시된 경우를 제외하고 본 명세서에서 사용된다.

카바트 잔기 지정이 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 직접적으로 일치하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역에 관계없이 구조적 구성요소의 단축 또는 이로의 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 넘버링에서보다 더 적거나 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.

중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia) (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 상당하는 루프는 잔기 26에서 잔기 32까지 연장된다. 따라서, 달리 지시하지 않는 한, 본원에 사용된 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템과 코티아의 토폴로지 루프 정의의 조합에 의해 기술된 바와 같이 잔기 26 내지 35를 지칭하는 것으로 의도된다.

경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.

CDR 루프 이외에도, 프레임워크 3(FR3)에 의해 형성되는 CDR-3(CDR-L3 또는 CDR-H3)과 CDR-2(CDR-L2 또는 CDR-H2) 사이에 네 번째 루프가 존재한다. 카바트 넘버링 시스템은 프레임워크 3을 중쇄에서 위치 66-94 및 경쇄에서 위치 57-88로 정의한다.

면역글로불린 패밀리의 상이한 구성원의 서열 정렬을 기반으로 하여, 넘버링 방식이 제안되었으며 예를 들어, 문헌[Kabat et al., 1991, and Dondelinger et al., 2018, Frontiers in Immunology, Vol 9, article 2278]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "불변 도메인(들)", "불변 영역"은 가변 영역 외부에 있는 항체의 도메인(들)을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 불변 도메인은 동일한 이소형의 모든 항체에서 동일하지만 이소형마다 상이하다. 전형적으로, 중쇄의 불변 영역은 3개 또는 4개의 불변 도메인을 포함하는 CH₁-힌지 -CH₂-CH₃-임의로 CH₄에 의해 N에서 C 말단으로 형성된다.

본 발명의 항체 분자의 불변 도메인은, 존재한다면, 항체 분자의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 도메인, 특히 항체 분자가 치료적 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 필요한 경우 IgG1 및 IgG3 이소형이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있다. 이들 불변 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 위치 241에서 세린(카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨)이 문헌[Angal et al. (Angal et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108)]에 기술되고 본원에서 IgG4P로 칭하는 프롤린으로 변경된 IgG4 분자가 사용될 수 있다.

"Fc", "Fc 단편", "Fc-도메인" 및 "Fc 영역"은 제1 불변 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 항체의 C-말단 영역을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 도메인인 CH₂ 및 CH₃, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 지칭한다. 인간 IgG1 중쇄 Fc 영역은 본원에서 이의 카복실-말단에 잔기 C226을 포함하도록 정의되며, 여기서, 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG1의 맥락에서, 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 하부 힌지는 위치 226-236을 지칭하고, CH₂ 도메인은 위치 237-340을 지칭하고, CH₃ 도메인은 위치 341-447을 지칭한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 Fc 영역은 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.

본 개시내용의 맥락에서, 존재하는 경우, 불변 영역 또는 Fc 영역은 상기 정의된 바와 같이 천연일 수 있거나, 기능적 FcR 결합 도메인, 바람직하게는 기능적 FcRn 결합 도메인을 포함하는 한 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역은 기능 및/또는 약동학을 개선한다. 변형은 Fc 단편의 특정 부분의 결실을 포함할 수 있다. 변형은 항체의 생물학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 다양한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. FcRn 결합 및 이에 따른 생체내 반감기를 증가시키는 돌연변이도 존재할 수 있다. 변형은 항체의 글리코실화 프로파일의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 천연 Fc 단편은 위치 297에서 아스파라긴 잔기(Asn297)에 결합된 N-글리칸이 2개의 중쇄 각각에 존재하는 CH₂ 도메인에서 글리코실화된다. 본 개시내용의 맥락에서, 항체는 글리코-변형될 수 있으며, 즉, 특정 글리코실화 프로파일을 갖도록 조작될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 개선된 성질, 예를 들어, 개선된 이펙터 기능, 또는 개선된 혈청 반감기를 유도한다.

본원에 기재된 항체는 단리된다. "단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 (예를 들어, 정제 수단에 의해) 분리된 항체이다.

용어 "항체"는 1가, 즉 단 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체(예를 들어, "절반 항체"로도 칭하는, 상호연결된 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 하나의 아암 항체), 및 다가 항체, 즉 하나 초과의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명에 따른 용어 "항체"는 또한 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv 및 dsscfv), Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단일 도메인 항체 또는 나노바디(예를 들어, V_H 또는 V_L, 또는 V_HH 또는 V_NAR)를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO2011/117648, WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다.

이러한 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[예를 들어, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181 참조)].

본원에 사용된 용어 "Fab 단편"은 V_L(가변 경쇄) 도메인 및 경쇄의 불변 도메인(CL), 및 V_H(가변 중쇄) 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH₁)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.

전형적인 "Fab' 단편"은 중쇄가 가변 영역 V_H, 불변 도메인 CH₁ 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고 경쇄가 가변 영역 V_L 및 불변 도메인 C_L을 포함하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다. 본 개시내용에 따른 Fab'의 이량체는 F(ab')₂를 생성하며, 여기서, 예를 들어, 이량체화는 힌지를 통한 것일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단일 도메인 항체"는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체의 예는 V_H 또는 V_L 또는 V_HH 또는 V-NAR을 포함한다.

용어 "Fv"는 2개의 가변 도메인, 예를 들어, 동족 쌍 또는 친화도 성숙 가변 도메인, 즉 V_H 및 V_L 쌍과 같은 협력 가변 도메인을 지칭한다.

본원에 사용된 "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 V_H 및 V_L 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화된 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하거나 이로 이루어진 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다. V_H 및 V_L 가변 도메인은 임의의 적합한 배향일 수 있고, 예를 들어, V_H의 C-말단은 V_L의 N-말단에 연결될 수 있거나, V_L의 C-말단은 V_H의 N-말단에 연결될 수 있다.

본원에 사용된 "이황화물-안정화된 단일 사슬 가변 단편" 또는 "dsscFv"는 V_H 및 V_L 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화되고 V_H와 V_L 사이의 도메인간 이황화 결합도 포함하는 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다[예를 들어, 문헌(Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012, WO2007109254) 참조].

본원에 사용된 "이황화물-안정화된 가변 단편" 또는 "dsFv"는 V_H 및 V_L 가변 도메인 사이에 펩타이드 링커를 포함하지 않고 대신 V_H와 V_L 사이의 도메인간 이황화 결합에 의해 안정화된 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다.

한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 길항 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "길항 항체"는, 예를 들어, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-17F의 이들의 수용체에 대한 결합을 차단하거나 결합을 감소시킴으로써 하나 이상의 항원의 생물학적 신호전달 활성을 억제하거나 중화할 수 있는 항체를 설명한다.

본 발명에 사용하기 위한 항체는 모노클로날, 인간화, 완전 인간 또는 키메라 항체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l; WO92/02551; WO2004/051268 및 국제 특허 출원 번호 WO2004/106377]에 기재된 방법에 의해 특이적 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝 및 발현함으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성될 수 있다.

항체에 대한 스크리닝은 항원에 대한 결합을 측정하기 위한 검정 및/또는 하나 이상의 이의 수용체에 대한 항원의 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 검정을 사용하여 수행할 수 있다. 결합 검정의 예는, 예를 들어, 플레이트에 고정된 IL-13의 융합 단백질을 사용하고, 접합된 이차 항체를 사용하여 IL-13에 결합된 항-IL-13 항체를 검출하는 ELISA이다. 차단 검정의 예는 IL-13R에 결합하는 IL-13 리간드 단백질의 차단을 측정하는 유세포분석 기반 검정이다. 형광 표지된 이차 항체는 IL-13R에 결합하는 IL-13 리간드 단백질의 양을 검출하는 데 사용된다.

인간화 항체(CDR-이식된 항체 포함)는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, US 5,585,089; WO91/09967 참조). 전체 CDR보다는 CDR의 특이성을 결정하는 잔기만을 전달하는 것이 필요할 수 있음을 이해할 것이다[예를 들어, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조]. 인간화 항체는 임의로 CDR이 유래된 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.

키메라 항체는 요소가 이것이 유래된 종의 특성을 유지하도록 2개의 상이한 종에서 유래된 요소로 구성된다. 일반적으로, 키메라 항체는 하나의 종, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 유사체로부터의 가변 영역, 및 인간과 같은 또 다른 종으로부터의 불변 영역을 포함할 것이다.

항체는 또한 당업계에 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있으며 문헌[Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) 및 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108]에 개시된 것들을 포함한다.

완전한 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 인간 기원이거나 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일하지만 반드시 동일한 항체로부터 유래할 필요는 없는 항체이다. 완전한 인간 항체의 예는, 예를 들어, EP 0546073, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 및 EP 0463151에서 일반 용어에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 상기 기재된 파지 디스플레이 방법에 의해 제조된 항체 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의로 불변 영역 유전자가 이들의 인간 대응물로 대체된 마우스에 의해 제조된 항체를 포함할 수 있다.

다중 특이적 항체

본 발명의 항체는 다중 특이적 항체이다. 본원에 사용된 "다중특이적 또는 다중 특이적 항체"는 적어도 2개의 결합 도메인, 즉 2개 이상의 결합 도메인, 예를 들어, 2개 또는 3개의 결합 도메인을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 지칭하며, 여기서, 적어도 2개의 결합 도메인은 2개의 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프를 동일한 항원에 독립적으로 결합한다. 다중 특이적 항체는 일반적으로 각 특이성(항원)에 대해 1가이다. 본원에 기재된 다중 특이적 항체는 1가 및 다가, 예를 들어, 2가, 3가, 4가 다중 특이적 항체를 포함한다.

파라토프는 항원을 인식하고 이에 결합하는 항체의 영역이다. 본 발명의 항체는 다중-파라토프 항체일 수 있다. 본원에 사용된 "다중-파라토프 항체"는 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원으로부터의 상이한 에피토프와 상호작용하는 2개 이상의 별개의 파라토프를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 지칭한다. 본원에 기재된 다중-파라토프 항체는 2중 파라토프, 3중 파라토프, 4중 파라토프일 수 있다.

본원에 사용된 "항원 결합 도메인"은 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 가변 도메인의 일부 또는 전체, 예를 들어, 한 쌍의 가변 도메인 V_H 및 V_L의 일부 또는 전체를 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 결합 도메인은 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 각각의 결합 도메인은 1가이다. 바람직하게는, 각각의 결합 도메인은 하나 이하의 V_H 및 하나의 V_L을 포함한다.

본원에 사용된 "구체적으로"는 이것이 특이적인 항원만을 인식하는 결합 도메인, 또는 이것이 비특이적인 항원에 대한 친화도와 비교하여 이것이 특이적인 항원에 대해 유의하게 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 결합 친화도는 표준 검정, 예를 들어, BIAcore와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 수 있다.

다양한 다중 특이적 항체 형식이 제조되었다. 상이한 분류가 제안되었지만 다중 특이적 IgG 항체 형식은 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 이중특이적 IgG, 부가된 IgG, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 단편, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 융합 단백질 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 접합체를 포함한다.

이중특이적 항체를 제조하는 기술은 CrossMab 기술(Klein et al. Engineering therapeutic bispecific antibodies using CrossMab technology, Methods 154 (2019) 21-31), 놉-인-홀 조작(Knobs-in-holes engineering) (예를 들어, WO1996027011, WO1998050431), DuoBody 기술(예를 들어, WO2011131746), Azymetric 기술(예를 들어, WO2012058768)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 추가 기술은, 예를 들어, 문헌[Godar et al., 2018, Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276]에 기재되어 있다. 이중특이적 항체는 특히 CrossMab 항체, DAF(투-인-원(two-in-one)), DAF(포-인-원(four-in-one)), DutaMab, DT-lgG, 놉-인-홀 커먼 LC, 놉-인-홀 어셈블리, 전하 쌍, Fab-아암 교환, SEED바디, 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-바디 및 직교 Fab를 포함한다.

부가된 IgG는 전형적으로 IgG의 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 및/또는 C-말단에 추가 항원-결합 도메인 또는 항원-결합 단편을 부가함으로써 조작된 전장 IgG를 포함한다. 그러한 추가 항원-결합 단편의 예는 sdAb 항체(예를 들어, V_H 또는 V_L), Fv, scFv, dsscFv, Fab, scFav를 포함한다. 부가된 IgG 항체 형식은, 예를 들어, 문헌[Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 특히 DVD-IgG, lgG(H)-scFv, scFv-(H)lgG, lgG(L)-scFv, scFv-(L)lgG, lgG(L,H)-Fv, lgG(H)-V, V(H)-lgG, lgC(L)-V, V(L)-lgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-lgG, lgG-2scFv, scFv4-lg, Zy바디 및 DVI-IgG(포-인-원)를 포함한다.

다중특이적 항체 단편은, 예를 들어, 문헌[Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 나노바디, 나노바디-HAS, BiTE, 디아바디, DART, TandAb, sc디아바디, sc-디아바디-CH3, 디아바디-CH3, 삼중바디, 미니항체; 미니바디, Tri Bi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFV3, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 탬덤 scFv-Fc; 및 인트라바디를 포함한다.

다중 특이적 융합 단백질은 Dock 및 Lock, ImmTAC, HSA바디, sc디아바디-HAS, 및 탬덤 scFv-독소를 포함한다.

다중 특이적 항체 접합체는 IgG-lgG; Cov-X-바디; 및 scFv1-PEG-scFv2를 포함한다.

추가 다중 특이적 항체 형식은, 예를 들어, 문헌[Brinkmann and Kontermann, The making of bispecific antibodies, mAbs, 9:2, 182-212 (2017), 특히 도 2]에 기재되어 있으며, 예를 들어, 탠덤 scFv, 트리플바디, Fab-VHH, taFv-Fc, scFv₄-Ig, scFv₂-Fcab, scFv₄-IgG이다. 바이바디, 트리바디 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, WO99/37791에 개시되어 있다.

본 발명은 인간 IL-13, 인간 IL-17A, 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체를 제공한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-13에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, IL-13 결합 부위는 CDR-L1에 대해 서열번호 15에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 16에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 인간 IL-13에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하고, 여기서, IL-13 결합 부위는 CDR-H1에 대해 서열번호 18에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 19에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, IL-13 결합 부위는 서열번호 27에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, IL-13 결합 부위는 서열번호 28에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, IL-13 결합 부위는 서열번호 31에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, IL-13 결합 부위는 서열번호 32에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 하기를 포함하는, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다:

CDR-L1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 하기를 포함하는, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다:

CDR-H1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.

한 구현예에서, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 Fc-도메인이 결여되어 있고 반감기는 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 부위에 의해 제공된다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 서열번호 57 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 서열번호 61 또는 서열번호 63에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 서열번호 59에 제시된 서열 및 서열번호 63에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 하기의 사슬들을 포함하거나 그로 이루어진다:

하기 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬; 및

V _H -CH ₁ -(CH _2)s -(CH _3)t -X-(V ₁ ) _p ;

하기 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬:

V _L -C _L -Y-V ₂ ;

상기 식에서,

V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;

CH₁은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;

CH₂는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;

CH₃은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;

X는 결합 또는 링커를 나타내고 ;

V₁은 scFv, dsscFv, 또는 dsFv를 나타내고;

V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;

C_L은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;

Y는 결합 또는 링커를 나타내고;

V₂는 dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타내고;

p는 0 또는 1을 나타내고;

s는 0 또는 1을 나타내고 ;

t는 0 또는 1을 나타내고 ;

여기서, p가 0인 경우 X는 부재이고, q가 0인 경우 Y는 부재이고;

화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;

화학식 (II)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다.

한 구현예에서, s가 0이고 t가 0인 경우, 본 개시내용에 따른 다중 특이적 항체는 각각 화학식 (I) 및 (II)의 중쇄 및 경쇄의 이량체로서 제공되며, 여기서, V_H-CH₁ 부분은 V_L-C_L 부분과 함께 기능적 Fab 또는 Fab' 단편을 형성한다.

한 구현예에서, s가 1이고 t가 1인 경우, 본 개시내용에 따른 다중 특이적 항체는 각각 화학식 (I) 및 (II)의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 이량체로서 제공되며, 여기서, 2개의 중쇄는 특히 CH₂-CH₃ 수준에서 사슬간 상호작용에 의해 연결되고, 각 중쇄의 V_H-CH₁ 부분은 각 경쇄의 V_L-C_L 부분과 함께 기능적 Fab 또는 Fab' 단편을 형성한다. 그러한 구현예에서, 2개의 V_H-CH_1- CH_2-CH₃ 부분은 2개의 V_L-C_L 부분과 함께 기능적 전장 항체를 형성한다. 그러한 구현예에서, 전장 항체는 기능적 Fc 영역을 포함할 수 있다.

V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타낸다. 한 구현예에서, V_H는 인간화된다. 한 구현예에서, V_H는 완전한 인간이다.

V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타낸다. 한 구현예에서, V_L은 인간화된다. 한 구현예에서, V_L은 완전한 인간이다.

일반적으로, V_H 및 V_L은 함께 항원 결합 도메인을 형성한다. 한 구현예에서, V_H 및 V_L은 동족 쌍을 형성한다.

본원에 사용된 "동족 쌍"은 생체내에서 생성된 단일 항체로부터의 가변 도메인 쌍, 즉 숙주로부터 단리된 가변 도메인의 자연 발생 쌍을 지칭한다. 따라서, 동족 쌍은 V_H 및 V_L 쌍이다. 한 예에서, 동족 쌍은 항원에 협력적으로 결합한다.

본원에 사용된 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 CDR 및 프레임워크, 특히 적합한 프레임워크를 포함하는 항체 사슬 내의 영역을 지칭한다.

본 개시내용에서 사용하기 위한 가변 영역은 일반적으로 항체로부터 유래될 것이며, 이는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

본원에 사용된 "~로부터 유래된"은 사용된 서열 또는 사용된 서열과 매우 유사한 서열이 항체의 경쇄 또는 중쇄와 같은 원래의 유전 물질로부터 얻어졌다는 사실을 지칭한다.

본원에 사용된 "매우 유사한"은 전장에 걸쳐 95% 이상, 예컨대 96, 97, 98 또는 99% 유사한 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다.

V_H 및 V_L에 대해 상기 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용하기 위한 가변 영역은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래할 수 있고, 예를 들어, 완전한 인간 또는 인간화될 수 있다.

한 구현예에서, V_H 및 V_L에 의해 형성된 결합 도메인은 제1 항원에 특이적이다.

한 구현예에서, V₁의 결합 도메인은 제2 항원에 특이적이다.

한 구현예에서, V₂의 결합 도메인은 제3 항원에 특이적이다.

한 구현예에서, 존재하는 V_H-V_L, V₁, 및 V₂ 각각은 이의 각 항원에 개별적으로 결합한다.

한 구현예에서, CH₁ 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터의 자연 발생 도메인 1이다. 한 구현예에서, CH₂ 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터의 자연 발생 도메인 2이다. 한 구현예에서, CH₃ 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터의 자연 발생 도메인 3이다.

한 구현예에서, 경쇄에서 C_L 단편은 불변 카파 서열 또는 이의 유도체이다. 한 구현예에서, 경쇄에서 C_L 단편은 불변 람다 서열 또는 이의 유도체이다.

본원에 사용된 자연 발생 도메인의 유도체는, 예를 들어, 바람직하지 않은 성질을 제거하는 것과 같이 도메인의 성질을 최적화하기 위해 자연 발생 서열에서 적어도 하나의 아미노산이 대체되거나 결실되지만 도메인의 특징적 특징(들)이 유지되는 경우를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 구현예에서, 자연 발생 도메인의 유도체는 자연 발생 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 또는 12개의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.

한 구현예에서, 하나 이상의 천연 또는 조작된 사슬간(즉, 경쇄 및 중쇄간) 이황화 결합이 기능적 Fab 또는 Fab' 단편에 존재한다.

한 구현예에서, "천연" 이황화 결합은 화학식 (I) 및 (II)의 폴리펩타이드 사슬에서 CH₁과 C_L 사이에 존재한다.

C_L 도메인이 카파 또는 람다로부터 유래되는 경우, 시스테인을 형성하는 결합에 대한 자연 위치는 인간 c카파 및 c람다에서 214이다(Kabat numbering 4^th edition 1987).

CH₁에서 시스테인을 형성하는 이황화 결합의 정확한 위치는 실제로 사용되는 특정 도메인에 따라 달라진다. 따라서, 예를 들어, 인간 감마-1에서 이황화 결합의 자연 위치는 위치 233에 위치한다(Kabat numbering 4^th edition 1987). 감마 2, 3, 4, IgM 및 IgD와 같은 다른 인간 이소형에 대한 결합 형성 시스테인의 위치는 알려져 있는데, 예를 들어, 인간 IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4의 경우 위치 127이고 인간 IgD 및 IgA2B의 중쇄의 경우 128이다.

임의로, 화학식 I 및 II의 폴리펩타이드의 V_H와 V_L 사이에 이황화 결합이 있을 수 있다.

한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 다중 특이적 항체는 CH₁과 C_L 사이에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 상응하는 위치에 이황화 결합을 갖는다.

한 구현예에서, CH₁을 포함하는 불변 영역 및 C_L과 같은 불변 영역은 비-자연 발생 위치에 있는 이황화 결합을 갖는다. 이것은 필요한 위치 또는 위치들에서 아미노산 사슬 내로 시스테인(들)을 도입함으로써 분자로 조작될 수 있다. 이 비-천연 이황화 결합은 CH₁과 C_L 사이에 존재하는 천연 이황화 결합에 추가되거나 이에 대한 대안이다. 자연 위치에서 시스테인(들)은 이황화 브릿지를 형성할 수 없는 세린과 같은 아미노산으로 대체될 수 있다.

조작된 시스테인의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법은 PCR 연장 중첩 돌연변이유발, 부위-지정된 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[일반적으로, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993) 참조]. 부위-지정된 돌연변이유발 키트, 예를 들어, QuikChange® 부위-지정된 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)는 상업적으로 입수 가능하다. 카세트 돌연변이유발은 문헌[Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323]에 기반하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체는 중첩 올리고뉴클레오티드의 어닐링, 결찰 및 PCR 증폭 및 클로닝에 의한 전체 유전자 합성에 의해 만들어질 수 있다.

한 구현예에서, CH₁과 C_L 사이의 이황화 결합은 완전히 부재하고, 예를 들어, 사슬간 시스테인은 세린과 같은 또 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 분자의 기능적 Fab 단편에는 사슬간 이황화 결합이 없다. 본원에 참조로 포함된 WO2005/003170과 같은 개시내용은 사슬간 이황화 결합 없이 Fab 단편을 제공하는 방법을 설명한다.

본 발명에서 사용하기 위한 항체 형식의 예는 IgG 및 부가된 Fab를 포함하며, 여기서, 전체 IgG 또는 Fab 단편은 각각, 예를 들어, 모두 본원에 참조로 포함된 WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, WO2011/061492, WO2011/061246 및 WO2011/086091에 기재된 바와 같이, 상기 IgG 또는 Fab의 경쇄의 N- 및/또는 C-말단에 그리고 임의로 상기 IgG 또는 Fab의 중쇄에 적어도 하나의 추가 항원 결합 도메인(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 추가 항원-결합 도메인), 예를 들어, 단일 도메인 항체(예컨대 V_H 또는 V_L, 또는 VHH), scFv, dsscFv, dsFv를 부가하여 조작된다. IgG의 경쇄 (및 임의로 중쇄)의 C-말단에 dsFv를 부가함으로써 조작된 전장 IgG를 포함하는 부가된 IgG는 본원에 참조로 포함된 WO2015/197789에 처음 개시되었다.

본 발명에 사용하기 위한 바람직한 항체 형식은 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함하며, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적(예를 들어, 치료 표적에 결합하는 하나의 scFv 또는 dsscFv, 및 예를 들어 알부민에 결합하여 반감기를 증가시키는 하나의 scFv 또는 dsscFv)에 결합한다. 그러한 항체 단편은 국제 특허 출원 공개 번호 WO2015/197772에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 특히 항체 단편의 논의와 관련하여 본원에 참조로 포함된다.

V₁은 dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타낸다.

V₂는 dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타낸다.

한 구현예에서, V₁ 및/또는 V₂가 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V₁ 및/또는 V₂의 가변 도메인 V_H와 V_L 사이의 이황화 결합은 아래 나열된 잔기 중 2개 사이에 있다(문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 카바트 넘버링이 하기 목록에서 사용됨). 카바트 넘버링이 언급되는 곳마다 관련 참조문헌은 문헌[Kabat et al., 1991 (5^th edition, Bethesda, Md.), in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]이다.

한 구현예에서, 이황화 결합은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 위치 및 분자 내에 위치한 가변 영역 쌍에서 이에 상응하는 위치에 있다:

ㆍ V_H37 + V_L95C [예를 들어 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조];

ㆍ V_H44 + V_L100 [예를 들어, 문헌(Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012) 참조];

ㆍ V_H44 + V_L105 [예를 들어, 문헌(J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)) 참조];

ㆍ V_H45 + V_L87 [예를 들어, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조];

ㆍ V_H55 + V_L101 [예를 들어, 문헌(FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)) 참조];

ㆍ V_H100 + V_L50 [예를 들어, 문헌(Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)) 참조];

ㆍ V_H100b + V_L49 [예를 들어, 문헌(Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)) 참조];

ㆍ V_H98 + V_L46 [예를 들어, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조];

ㆍ V_H101 + V_L46 [예를 들어, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조];

ㆍ V_H105 + V_L43 [예를 들어, 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); 또는 Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994)) 참조],

ㆍ V_H106 + V_L57 [예를 들어, 문헌(FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)) 참조].

한 구현예에서, 이황화 결합은 위치 V_H44 및 V_L100 사이에서 형성된다.

상기 나열된 아미노산 쌍은 이황화 결합이 형성될 수 있도록 시스테인에 의한 대체에 도움이 되는 위치에 있다. 시스테인은 알려진 기술에 의해 이러한 원하는 위치로 조작될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 조작된 시스테인은 주어진 아미노산 위치에서 자연 발생 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 경우를 지칭한다.

조작된 시스테인의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 PCR 연장 중첩 돌연변이유발, 부위-지정된 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[일반적으로, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993) 참조]. 부위-지정된 돌연변이유발 키트, 예를 들어, QuikChange® 부위-지정된 돌연변이유발 키트(Stratagen, La Jolla, CA)는 상업적으로 입수 가능하다. 카세트 돌연변이유발은 문헌[Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323]에 기반하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체는 중첩 올리고뉴클레오티드의 어닐링, 결찰 및 PCR 증폭 및 클로닝에 의한 전체 유전자 합성에 의해 만들어질 수 있다.

따라서, 한 구현예에서, V₁ 및/또는 V₂가 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V₁의 가변 도메인 V_H 및 V_L 및/또는 V₂의 가변 도메인 V_H 및 V_L은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결될 수 있으며, 여기서, 한 쌍의 시스테인 잔기의 위치는 V_H37 및 V_L95, V_H44 및 V_L100, V_H44 및 V_L105, V_H45 및 V_L87, V_H100 및 V_L50, V_H100b 및 V_L49, V_H98 및 V_L46, V_H101 및 V_L46, V_H105 및 V_L43 및 V_H106 및 V_L57로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 구현예에서, V₁ 및/또는 V₂가 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V₁의 가변 도메인 V_H 및 V_L 및/또는 V₂의 가변 도메인 V_H 및 V_L은 CDR 외부에 있는, 하나가 V_H에 있고 하나가 V_L에 있는 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결될 수 있으며, 여기서, 한 쌍의 시스테인 잔기의 위치는 V_H37 및 V_L95, V_H44 및 V_L100, V_H44 및 V_L105, V_H45 및 V_L87, V_H100 및 V_L50, V_H98 및 V_L46, V_H105 및 V_L43 및 V_H106 및 V_L57로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 구현예에서, V₁이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V₁의 가변 도메인 V_H 및 V_L은 하나가 위치 V_H44에 있고 다른 하나가 V_L100에 있는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다. 한 구현예에서, V₂가 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V₂의 가변 도메인 V_H 및 V_L은 하나가 위치 V_H44에 있고 다른 하나가 V_L100에 있는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다.

한 구현예에서, V₁이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V₁의 V_H 도메인은 X에 부착된다.

한 구현예에서, V₁이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V₁의 V_L 도메인은 X에 부착된다.

한 구현예에서, V₂가 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V₂의 V_H 도메인은 Y에 부착된다.

한 구현예에서, V₂가 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V₂의 V_L 도메인은 Y에 부착된다.

당업자는 V₁ 및/또는 V₂가 dsFv를 나타낼 경우, 다중 특이적 항체는 X 또는 Y에 부착되지 않은 상응하는 유리 V_H 또는 V_L 도메인을 코딩하는 제3 폴리펩타이드를 포함할 것임을 이해할 것이다. V₁ 및 V₂가 dsFv인 경우, "유리 가변 도메인" (즉, 이황화 결합을 통해 폴리펩타이드의 나머지 부분에 연결된 도메인)은 두 사슬 모두에 공통적일 것이다. 따라서, X 또는 Y를 통해 폴리펩타이드에 융합되거나 연결된 실제 가변 도메인은 각 폴리펩타이드 사슬에서 상이할 수 있지만, 이와 쌍을 이루는 유리 가변 도메인은 일반적으로 서로 동일할 것이다.

일부 구현예에서, p는 1이다. 일부 구현예에서, p는 0이다.

일부 구현예에서, s는 1이다. 일부 구현예에서, s는 0이다.

일부 구현예에서, t는 1이다. 일부 구현예에서, t는 0이다.

일부 구현예에서, s는 1이고 t는 1이다. 일부 구현예에서, s는 0이고 t는 0이다.

한 구현예에서, p는 1이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 0이고 t는 0이고, V₁ 및 V₂는 둘 다 dsscFv를 나타낸다. 따라서, 한 양태에서, 하기 a) 및 b)를 포함하거나 그로 이루어진, 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체가 제공된다:

a) 하기 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬; 및

V _H -CH ₁ -X-V ₁ ;

b) 하기 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬:

V _L -C _L -Y-V ₂ ;

상기 식에서,

V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;

CH₁은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;

X는 결합 또는 링커를 나타내고;

Y는 결합 또는 링커를 나타내고;

V₁은 scFv, dsscFv, 또는 dsFv를 나타내고;

V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;

C_L은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;

V₂는 scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;

여기서, V₁ 또는 V₂ 중 적어도 하나는 dsscFv 또는 dsFv이고;

화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;

화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다.

그러한 구현예에서, V₂는 단백질 A에 결합하지 않으며, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 단백질 A 결합 도메인을 포함하지 않는다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 VH1 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 VH2 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 VH4 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 VH5 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 scFv, dsscFv 또는 dsFv는 VH6 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 또는 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 VH 및 V₁에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

또 다른 구현예에서, p는 0이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 1이고, t는 1이고, V₂는 dsscFv이다. 따라서, 한 양태에서, 하기 a) 및 b)를 포함하거나 그로 이루어진, 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체가 제공된다:

a) 하기 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 사슬; 및

V _H -CH ₁ -CH ₂ -CH ₃ ;

b) 하기화학식 (IIb)의 폴리펩타이드 사슬:

V _L -C _L -Y-V ₂ ;

상기 식에서,

V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;

CH₁은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;

CH₂는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;

CH₃은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;

Y는 결합 또는 링커를 나타내고;

V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;

C_L은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;

V₂는 dsscFv를 나타내고;

여기서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;

화학식 (IIb)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다.

그러한 구현예에서, V₂는 단백질 A에 결합하지 않으며, 즉, V₂의 dsscFv는 단백질 A 결합 도메인을 포함하지 않는다. 한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 dsscFv는 VH1 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 dsscFv는 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 또는 CH₂-CH₃에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 VH 및 CH₂-CH₃에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

또 다른 구현예에서, p는 0이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 1이고, t는 1이고, V₂는 dsFv이다. 따라서, 한 양태에서, 하기 a) 및 b)를 포함하거나 그로 이루어진, 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체가 제공된다:

a) 하기 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 사슬; 및

V _H -CH ₁ -CH ₂ -CH ₃ ;

b) 하기 화학식 (IIc)의 폴리펩타이드 사슬:

V _L -C _L -Y-V ₂ ;

상기 식에서,

V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;

CH₁은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;

CH₂는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고

CH₃은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고

Y는 결합 또는 링커를 나타내고;

V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;

C_L은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;

V₂는 dsFv를 나타내고;

여기서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;

화학식 (IIc)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다.

그러한 구현예에서, V₂, 즉, V₂의 dsFv는 단백질 A에 결합하지 않는다. 한 구현예에서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 또는 CH₂-CH₃에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 V_H 및 CH₂-CH₃에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 다중 특이적 항체의 한 구현예에서,

V_L 및 V_H는 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,

V₁은 인간 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,

V₂는 인간 IL-13에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

한 구현예에서, V_L은 CDR-L1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하고; V_H는 CDR-H1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 CDR-L1에 대해 서열번호 39에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 40에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 CDR-H1에 대해 서열번호 42에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 43에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 44에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₂는 CDR-L1에 대해 서열번호 15에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 16에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 CDR-H1에 대해 서열번호 18에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 19에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V_L은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하고, V_H는 서열번호 9에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 46에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₁의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 68에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하는 scFv 또는 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는 dsscFv이다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 27에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 31에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 32에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₂의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 66에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 scFv 또는 서열번호 37에 제시된 서열을 포함하는 dsscFv이다.

한 구현예에서, X는 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는 링커이다.

한 구현예에서, Y는 서열번호 65에 제시된 서열을 포함하는 링커이다.

한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 57 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 61 또는 서열번호 63에 제시된 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하고, 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 63에 제시된 서열을 포함한다.

항원에 결합하고 이의 생물학적 활성을 중화시키는 항체의 능력을 유의하게 변경시키지 않으면서 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 본 발명에 의해 제공된 서열에 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는, 예를 들어, 본원에 기재된 방법, 특히 실시예에 예시된 방법을 사용하여 항원 결합 및 생물학적 활성 억제를 결정함으로써 당업자에 의해 쉽게 시험될 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 39, 40, 41, 42, 43 및 44에 제시된 서열에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하며, 여기서, 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어, 하기 본원에 정의된 바와 같은 유사한 아미노산으로 치환되었다.

본원에 사용된 "동일성"은 정렬된 서열에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 사이에서 동일함을 나타낸다. 본원에 사용된 "유사성"은 정렬된 서열에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 사이에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);

- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);

- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);

- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및

- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 동일성과 유사성의 정도는 쉽게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST^TM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

한 구현예에서, 다중 특이적 항체의 CDR은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 39, 40, 41, 42, 43 및 44에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V_L은 서열번호 7에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, V_H는 서열번호 9에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 45에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 46에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 49에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 50에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₁의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 68에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₁은 서열번호 53에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열 포함하는 scFv 또는 서열번호 55에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 dsscFv이다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 27에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 28에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 31에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 32에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

한 구현예에서, V₂의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 66에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, V₂는 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 scFv 또는 서열번호 37에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 dsscFv이다.

한 구현예에서, X는 서열번호 67에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 링커이다.

한 구현예에서, Y는 서열번호 65에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 링커이다.

한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 57 또는 서열번호 59에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 61 또는 서열번호 63에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 59에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호 63에 제시된 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

에피토프

에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이며 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 가지고 있다. 에피토프는 또한 비선형 아미노산으로 구성된 형태적일 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 인산 기 또는 설포닐 기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기들인 결정인자를 포함할 수 있으며, 특정 구현예에서, 특정 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.

항체가 당업계에 알려진 일상적인 방법을 사용하여 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 참조 항체가 포화 조건 하에 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 허용된다. 다음으로, 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후 단백질 또는 펩타이드에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체가 참조 항체와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후 단백질 또는 펩타이드에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 본 발명의 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

항체가 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 확인하기 위해, 상기 기재된 결합 방법론은 두 배향으로 수행된다. 제1 배향에서, 참조 항체는 포화 조건 하에 단백질/펩타이드에 결합하도록 허용되고, 이어서 단백질/펩타이드 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 시험 항체는 포화 조건 하에 단백질/펩타이드에 결합하도록 허용되고, 이어서 단백질/펩타이드에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 두 배향 모두에서 제1 (포화) 항체만 단백질/펩타이드에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체와 참조 항체가 단백질/펩타이드에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론짓는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합할 필요는 없지만, 중첩되거나 인접한 에피토프에 결합하여 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.

두 항체는 각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 하나의 항체의 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량은 경쟁 결합 검정에서 측정할 때 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제한다[예를 들어, 문헌(Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502) 참조]. 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 본질적으로 항원의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 두 항체는 중첩 에피토프를 갖는다.

이어서, 시험 항체의 관찰된 결합 결핍이 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 또는 입체 차단 (또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결핍의 원인인지 확인하기 위해 추가의 일상적인 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하였다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행할 수 있다.

항체는 서열번호 1/2/3/4/5/6의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함을 포함하는 다중 특이적 항체와 IL-17A 또는 IL-17F에 대한 결합에 대해 경쟁하거나 이와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 서열번호 15/16/17/18/19/20의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함하는 다중 특이적 항체와 IL-13에 대한 결합에 경쟁하거나 이와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 서열번호 39/40/41/42/43/44의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함하는 다중 특이적 항체와 혈청 알부민에 대한 결합에 대해 경쟁하거나 이와 동일한 에피트프에 결합할 수 있다.

이펙터 분자

원하는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 다중 특이적 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 단일 이펙터 분자 또는 2개 이상의 그러한 분자를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 얻고자 하는 경우, 이것은 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 그러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다[문헌(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123) 참조]. 특정한 화학적 절차는, 예를 들어, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03031581에 기재된 것들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 연결은, 예를 들어, WO 86/01533 및 EP 0392745에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 사용하여 달성될 수 있다.

본원에 사용된 용어 이펙터 분자는, 예를 들어, 항종양제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터 군, 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.

이펙터 분자의 예는 세포에 유해한(예를 들어, 사멸) 임의의 제제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성 제제를 포함할 수 있다. 예는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다.

이펙터 분자는 또한 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카르마이신), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다른 이펙터 분자는 ¹¹¹In 및 ⁹⁰Y, Lu¹⁷⁷, 비스무트²¹³, 캘리포늄²⁵², 이리듐¹⁹² 및 텅스텐¹⁸⁸/레늄¹⁸⁸과 같은 킬레이트된 방사성 핵종; 또는 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 약물을 포함할 수 있다.

다른 이펙터 분자는 단백질, 펩타이드 및 효소를 포함한다. 관심 효소는 단백질분해 효소, 가수분해효소, 분해효소, 이성질화효소, 전이효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관심 있는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 면역글로불린, 독소, 예컨대 아브린, 라이신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 항혈전제 또는 항혈관신생제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다른 이펙터 분자는, 예를 들어, 진단에 유용한 검출 가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층 촬영에 사용하기 위한) 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단용으로 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 번호 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결 분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생물발광 물질은 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종은 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In 및 ⁹⁹Tc를 포함한다.

또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나 상피 장벽을 가로질러 면역 시스템으로 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 WO 05/117984에 기재된 것과 같은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물을 포함한다.

이펙터 분자가 중합체인 경우, 이는 일반적으로 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 폴리사카라이드, 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-폴리사카라이드일 수 있다.

상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특정 임의의 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.

합성 중합체의 특정 예는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이의 유도체, 특히 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.

특정 자연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.

본원에 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어, 티올-선택성 반응성 기, 예컨대 말레이미드 등을 포함하도록 의도된다. 반응성 기는 중합체에 직접적으로 또는 링커 세그먼트를 통해 연결될 수 있다. 그러한 기의 잔기는 일부 경우에 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 일부를 형성할 것임을 이해할 것이다.

중합체의 크기는 원하는 대로 다양할 수 있지만, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어, 5000 내지 40000 Da, 예컨대 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위일 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어, 종양과 같은 특정 조직에 국한되거나 순환 반감기를 연장하는 능력에 기반하여 선택될 수 있다[검토를 위해 문헌(Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) 참조]. 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환을 떠나 조직에 침투하도록 의도된 경우, 예를 들어, 약 5000 Da의 분자량을 갖는 저분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환시에 남아 있는 적용의 경우, 예를 들어, 20000 Da 내지 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.

적합한 중합체는 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체와 같은 폴리알킬렌 중합체, 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 중합체를 포함한다.

한 예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 한 특정 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 아미노산은 항체 단편에서 자연적으로 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편으로 조작될 수 있다(예를 들어 US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형이 이펙터 분자의 부착을 허용하는 하나 이상의 아미노산의 중쇄의 C-말단 말단에 부가되는 변형된 Fab 단편이다. 적합하게는, 추가 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 2개 이상의 PEG 분자를 부착하기 위해 다중 부위를 사용할 수 있다.

적합하게는 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 연결될 수 있다. 공유적 연결은 일반적으로 이황화 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착점으로 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어, 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택성 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 바와 같이 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예컨대 α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들어, 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드를 포함하는 임의의 중합체일 수 있다. 그러한 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나(예를 들어 Nektar, 이전에 Shearwater Polymers Inc.(Huntsville, AL, USA)로부터), 통상적인 화학적 절차를 사용하여 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 특정 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio로부터 입수 가능) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에 Shearwater로부터 입수 가능)를 포함한다.

한 구현예에서, 항체는, 예를 들어, EP 0948544 또는 EP 1090037에 개시된 방법에 따라 PEG화, 즉, PEG (폴리(에틸렌글리콜))가 이에 공유적으로 부착된 변형된 Fab 단편 또는 diFab이다[또한 문헌("Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545) 참조]. 한 예에서, PEG는 힌지 영역에서 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역에서 단일 티올 기에 공유적으로 연결된 말레이미드 기를 갖는다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유적으로 연결될 수 있고 라이신 잔기 상의 각각의 아민 기에 대략 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.

한 구현예에서, 다중 특이적 항체는 이펙터 분자에 부착되지 않는다.

폴리뉴클레오티드/벡터/숙주 세포

본 발명은 또한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 분자의 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

변이체 폴리뉴클레오티드는 서열 목록에 제시된 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 최대 10, 최대 20, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 75개 또는 그 이상의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변이체는 1-20, 1-50, 1-75 또는 1-100개 치환 및/또는 결실을 갖는다.

적합한 변이체는 본원에 개시된 핵산 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70% 상동성일 수 있고, 전형적으로 이와 적어도 약 80 또는 90%, 보다 적합하게는 적어도 약 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 변이체는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 보유할 수 있다. 변이체는 전형적으로 약 60% - 약 99% 동일성, 약 80% - 약 99% 동일성, 약 90% - 약 99% 동일성 또는 약 95% - 약 99% 동일성을 보유한다. 이러한 수준에서의 상동성 및 동일성은 일반적으로 적어도 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역과 관련하여 일반적으로 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 문맥에서 상동성은 핵산 동일성에 기반하여 계산된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러한 상동성은 적어도 약 15, 적어도 약 30, 예를 들어, 적어도 약 40, 60, 100, 200개 이상의 연속 뉴클레오티드(길이에 따라 다름)의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 그러한 상동성은 비변형된 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.

상동체는 관련 폴리뉴클레오티드에서 서열과 약 3, 5, 10, 15, 20개 이상 돌연변이(각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음) 미만만큼 상이할 수 있다. 예를 들어, 상동체는 3-50개 돌연변이, 종종 3-20개 돌연변이만큼 상이할 수 있다. 이들 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 약 40, 60 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.

본 발명의 DNA 서열은, 예를 들어, 화학적 처리에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 하기를 참조한다: "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

또한, IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어, 이. 콜리(E. coli) 및 기타 미생물 시스템이 사용될 수 있거나 진핵생물, 예를 들어, 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 단리하는 단계를 포함하여, IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 제조 방법을 제공한다.

다중특이적 항체의 제조

다중 특이적, 특히 이중-특이적 항체를 제조하기 위한 다수의 접근법이 있다. Morrison 등(Coloma and Morrison 1997, Nat Biotechnol. 15, 159-163)은 전체 항체, 예를 들어, IgG에 대한 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 융합을 설명한다. Schoonjans 등(2000, Journal of Immunology, 165, 7050-7057)은 항체 Fab 단편에 대한 scFv의 융합을 설명한다. WO2015/197772는 Fab 단편에 대한 이황화물 안정화된 scFv(dsscFv)의 융합을 설명한다.

선행 기술에 기술된 표준 접근법은 숙주 세포에서 적어도 2개의 폴리펩타이드의 발현을 포함하며, 각각은 전체 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, Fab의 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)를 코딩하며, 항체의 추가 항원 결합 단편은 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 및/또는 C-말단 위치에 융합될 수 있다. 2개(부착된 Fab를 형성하기 위해 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄) 또는 4개의 폴리펩타이드(부착된 IgG를 형성하기 위해 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)를 발현함으로써 그러한 다중 특이적 항체를 재조합적으로 제조하려고 할 때, 상응하는 경쇄와 조립시 중쇄의 적절한 폴딩을 보장하기 위해 일반적으로 중쇄에 걸쳐 경쇄를 과도하게 발현하는 것이 필요하다. 특히, CH₁(중쇄 불변 영역의 도메인 1)은 상응하는 LC에 의해 대체될 수 있는 BIP 단백질에 의해 자체적으로 폴딩되는 것을 방지하고; 따라서 CH₁/HC의 올바른 폴딩은 이의 상응하는 LC의 가용성에 따라 달라진다(Lee et al., 1999, Molecular Biology of the Cell, Vol. 10, 2209-2219).

본 발명자들은 다중 특이적 항체를 발현하는 이러한 방법이 숙주 세포 수확물에 남아있는 중쇄에 비해 과량의 경쇄 생성을 초래할 수 있고 과량의 경쇄가 원하는 다중 특이적 항체, 특히 단량체와 함께 제조 공정의 부산물로 존재하는 이량체 복합체 (또는 "LC 이량체")를 형성하는 경향이 있으므로 정제된 방식이 필요하다는 것을 관찰하였다.

중요하게는, N- 및/또는 C-말단에서 추가 항원 결합 단편(들)에 융합될 때 경쇄의 이량체 형성과 관련된 기술적 문제는 지금까지 확인되지 않았으며 일반적으로 사용되는 분석 방법은 제조 공정의 이질적인 생성물 중에서 이러한 부가된 LC 이량체의 검출 및 정량화를 허용되지 않는다. 이것은 표준 분석 방법을 사용하여 생성물의 양을 추정할 때 상당한 편향을 초래할 수 있다.

따라서, 제조 공정의 초기 단계에서 부가된 LC 이량체를 쉽고 효율적으로 단리 및 제거할 수 있게 하여 특히 단량체 형태의 다중 특이적 항체인, 치료에 사용하기 위한 관심 단백질의 수율을 개선하는, 다중 특이적 항체 및 이의 제조 방법을 개선할 필요가 있다.

본 발명의 다중 특이적 항체는 정제 후, 특히 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는 1단계 정제 후에 얻은 "다중 특이적 항체" 물질, 특히 단량체의 수율을 증가시키면서 동등한 기능 및 안정성을 갖는 개선된 다중 특이적 항체를 제공하도록 조작되었다.

유리하게는, 본 개시내용의 다중 특이적 항체는 특히 개선된 방법이 더 적은 단계를 포함하여 산업적 규모에서 비용 및 시간 효과적이라는 점에서 선행 기술에서 일반적으로 사용되는 방법보다 개선된 정제 방법으로 더 효율적으로 정제될 수 있다. 특히, 본 개시내용의 다중 특이적 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는 1단계 정제 방법 후에 수득된 관심 단백질의 양(즉, 정확한 다중 특이적 항체 형식)을 최대화하여 관심 있는 다중 특이적 항체의 정제와 부가된 LC 이량체의 제거가 동시에 발생한다. 유리하게는, 본 개시내용의 다중 특이적 항체의 제조 및 정제 방법은 과량의 유리된 비결합 경쇄, 특히 부가된 LC 이량체를 포획하기 위한 추가 정제 단계를 필요로 하지 않는다.

단백질 A

단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 원래 발견되는 42 kDa 표면 단백질이다. 단백질 A는 면역글로불린을 검출, 정량화 및 정제하는 데 널리 사용되었다. 단백질 A는 VH3 패밀리 항체에서 유래한 Fab 부분과 IgG의 불변 영역 부분(CH₂와 CH₃ 도메인 사이)에서 Fc 감마 영역에 결합하는 것으로 보고되었다. 단백질 A와 Fab에 의해 형성된 복합체의 결정 구조는, 예를 들어, 문헌[Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404]에 기재되어 있다. 본 개시내용의 맥락에서, 단백질 A는 단백질 A 변이체 또는 유도체가 VH3 도메인 및/또는 Fc 감마 도메인에 결합하는 능력을 유지하는 정도로 천연 단백질 A 및 이의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 1, 2 또는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

본원에 사용된 "단백질 A 결합 도메인"은 단백질 A에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 지칭하는 것으로 의도된다. 단백질 A 결합 도메인은 VH3 도메인 또는 단백질 A에 결합하는, 즉 단백질 A 결합 계면을 포함하는 VH3 도메인의 일부를 지칭할 수 있다. 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인의 부분은 VH3 도메인의 CDR을 포함하지 않으며, 즉 VH3의 단백질 A 결합 계면은 CDR을 포함하지 않으며; 결과적으로, 단백질 A 결합 도메인은 본 출원에 개시된 항원 결합 도메인과 경쟁하지 않는 것으로 이해될 것이다.

한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 및/또는 CH₂-CH₃ 및/또는 V₁에 존재하는 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 및/또는 CH₂-CH₃ 및/또는 V₁에 존재하는 1, 2 또는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 또는 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, s는 0이고, t는 0이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H 또는 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, s는 0이고, t는 0이고, p는 0이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V_H에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, s는 0이고, t는 0이고, p는 1이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 V₁에 존재하는 단 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 V_H 및 CH₂-CH₃에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 V_H 및 V₁에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 각각 CH₂-CH₃ 및 V₁에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.

한 구현예에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 사슬은 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함하고, 각 도메인은 V_H, CH₂-CH₃ 및 V₁에 존재한다.

천연 단백질 A는 특히 IgG의 불변 영역 부분에서 Fc 감마 영역과 상호작용할 수 있다. 보다 특히, 단백질 A는 CH₂와 CH₃ 사이의 결합 도메인과 상호작용할 수 있다. 한 구현예에서, s가 1이고, t가 1일 때, CH₂와 CH₃ 둘 모두는 IgG 부류의 자연 발생 도메인이다.

일부 구현예에서, 단백질 A 결합 도메인(들)은 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단백질 A 결합 도메인(들)은 자연 발생 VH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인의 변이체는 자연 발생 VH3 도메인의 변이체이고, 상기 자연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합할 수 없다.

본 개시내용의 화학식 (II)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다. 한 구현예서, V₂의 결합 도메인은 단백질 A에 결합하지 않는다.

일부 구현예에서, V₂는 VH1 및/또는 VH2 및/또는 VH4 및/또는 VH5 및/또는 VH6을 포함하거나 이로 이루어지고 VH3 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, V₂는 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, V₂는 단백질 A에 결합할 수 없는 자연 발생 VH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인의 변이체는 자연 발생 VH3의 변이체이며, 상기 자연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합할 수 있다.

인간 VH3 생식계열 유전자 및 VH3 도메인 (또는 프레임워크)은 잘 특성화되어 있다. 많은 자연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합하는 능력이 있지만 특정 자연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합하는 능력이 없다[문헌(Roben et al., 1995, J Immunol.;154(12):6437-6445) 참조].

본 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 여러 방법에 의해 획득될 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 본 개시내용의 폴리펩타이드 (I) 및/또는 (II) 내의 위치에 따라 단백질 A에 결합하는 능력 또는 무능력에 대해 선택되는 자연 발생 VH3 도메인이다. 예를 들어, 항체의 패널은 비인간 동물의 면역화에 의해 관심 항원에 대해 생성된 다음, 인간화될 수 있으며, 인간화 항체는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 컬럼에 대해 인간화 VH3 도메인을 통해 단백질 A에 결합하는 능력 또는 무능력에 기반하여 스크리닝되고 선택될 수 있다. 대안적으로, 디스플레이 기술(예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 포유동물 세포 표면 디스플레이, mRNA 디스플레이, DNA 디스플레이)은 항체 라이브러리를 스크리닝하고, 특히 CDR을 포함하지 않거나 단백질 A에 결합하지 않는 단백질 A 결합 인터페이스를 통해 결합하는 VH3 도메인을 포함하는 항체를 선택하는 데 사용될 수 있다.

대안적으로, 본 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 자연 발생 VH3의 변이체이다. 한 구현예에서, VH3 변이체는 단백질 A에 결합할 수 있는 자연 발생 VH3의 서열을 포함하고, 단백질 A에 결합하는 이의 능력을 없애는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하는 VH3 변이체는 단백질 A에 결합할 수 없는 자연 발생 VH3의 서열을 포함하고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 그러한 구현예에서, 돌연변이(들)는 VH3 도메인이 단백질 A에 결합하는 능력을 얻는 원인일 수 있으며, 즉 돌연변이(들)는 자연적으로 존재하지 않는 단백질 A 결합 도메인의 생성에 기여한다 .

한 구현예에서, VH3 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구현예에서, VH3 변이체는 카바트에 따라 넘버링되는 VH3 상의 위치 15, 17, 19, 57, 59, 64, 65, 66, 68, 70, 81 또는 82에서의 돌연변이를 포함하고 예를 들어, 문헌[Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404]에 기재되어 있다. 돌연변이는 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 한 구현예에서, VH3 변이체는 카바트에 따라 넘버링되는 VH3 상의 위치 15, 17, 19, 57, 59, 64, 65, 66, 68, 70, 81 또는 82에서의 치환을 포함한다.

자연 발생 H1, VH2, VH4, VH5 및 VH6은 단백질 A에 결합하지 않는다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 V_H 도메인은 VH1이다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 V_H 도메인은 VH2이다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 V_H 도메인은 VH4이다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 V_H 도메인은 VH5이다. 한 구현예에서, 단백질 A에 결합하지 않는 V_H 도메인은 VH6이다.

약학적 조성물, 투여량 및 투여 용법

본 발명의 다중 특이적 항체는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 일반적으로 멸균일 것이고 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 양립 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는, 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내, 안내, 복강내, 피하, 척수 또는 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 기타 비경구 투여 경로에 적합할 수 있다. 대안적으로, 담체는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로와 같은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 담체는 경구 투여에 적합할 수 있다. 투여 경로에 따라, 조절제는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질에 코팅될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다.

약학적으로 허용되는 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 담체의 예는 물, 완충수 및 식염수를 포함한다. 다른 담체의 예는 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 많은 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

치료 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 추가 활성 성분을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 범위 내에는 본 발명의 항체 또는 조절제 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 있다. 키트는 상기 논의된 바와 같은 추가 치료제 또는 예방제와 같은 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조절제 및/또는 항체 또는 이의 제형 또는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다.

치료적 적용에서, 화합물은 상기 기재된 바와 같은 장애 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게 병태 또는 이의 증상 중 하나 이상을 치유, 경감 또는 부분적으로 진행을 막기에 충분한 양으로 투여된다. 그러한 치료적 치료는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나 무증상 기간의 빈도 또는 기간을 증가시킬 수 있다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "치료학적 유효량"으로 정의된다.

예방적 적용에서, 제형은 병태 또는 이의 증상 중 하나 이상의 후속 효과를 예방 또는 감소시키기에 충분한 양으로 상기 기재된 바와 같은 장애 또는 병태의 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "예방학적 유효량"으로 정의된다. 각 목적을 위한 유효량은 질환 또는 부상의 심각성 뿐만 아니라 대상체의 체중 및 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다.

투여 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 인간에 대한 투여가 전형적이다.

본 발명의 항체/조절제 또는 약학적 조성물은 당업계에 알려진 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물에 대한 투여 경로의 예는 정맥내, 근육내, 피내, 안내, 복강내, 피하, 척수 또는 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 문구 "비경구 투여"는 장내 이외의 투여 방식 및 일반적으로 주사에 의한 국소 투여를 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 항체/조절제 또는 약학적 조성물은 비경구 외 경로(non-parenteral route), 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체/조절제 또는 약학적 조성물은 경구 투여용일 수 있다.

본 발명의 항체/조절제 또는 약학적 조성물의 적합한 투여량은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 치료받는 환자의 이전 병력을 포함한 다양한 약동학적 인자, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 달라질 것이다.

적합한 용량은, 예를 들어, 약 0.01 μg/kg 내지 약 1000 mg/체중 kg, 전형적으로 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/치료될 환자의 체중 kg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 1일당 약 1 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 또는 1일당 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중일 수 있다.

최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 투여 용법이 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 시간 경과에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 의해 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본원에 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다.

투여는 단일 또는 다중 용량일 수 있다. 다중 용량은 동일하거나 상이한 경로를 통해 동일하거나 상이한 위치에 투여될 수 있다. 대안적으로, 용량은 서방출 제형을 통해 이루어질 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자의 길항제의 반감기와 원하는 치료 기간에 따라 달라질 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조절제/항체 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제와 공동 투여될 수 있다.

2개 이상의 제제의 조합 투여는 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 둘 다 단일 조성물로 함께 투여될 수 있거나 이들은 조합 요법의 일부로 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나는 다른 하나보다 먼저, 이후에 또는 동시에 투여될 수 있다.

치료 적응증

본 발명의 항체는 IL-13 및/또는 IL-17A 및/또는 IL-17F 활성과 관련된 임의의 병태; 예를 들어, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-17F 수용체를 통한 신호전달로부터 전체 또는 부분적으로 발생하는 임의의 병태를 치료, 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

이러한 질환에는 유방, 결장, 직장, 폐, 인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담관, 소장, 요로(콩팥, 방광 및 요로상피 포함), 여성 생식기(자궁경부, 자궁 및 난소뿐만 아니라 융모막암 및 임신성 융모성 질환 포함), 남성 생식기(전립선, 정낭, 고환 및 생식 세포 종양 포함), 내분비선(갑상선, 부신 및 뇌하수체 포함), 및 피부의 암종뿐만 아니라 혈관종, 흑색종, 육종(뼈 및 연조직에서 발생하는 육종뿐만 아니라 카포시 육종 포함), 뇌, 신경, 눈 및 수막 종양(성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 신경초종 및 수막종 포함), 백혈병 및 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 둘 모두)과 같은 조혈 악성종양에서 발생하는 고형 종양을 포함한 원발성 및 전이성 암, 류마티스 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염(Lyme arthritis), 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신성 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 갑상선염, 알레르기성 질환, 건선, 피부염 경피증, 이식편 대 숙주 질환, 장기 이식 거부반응, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 파종성 혈관 내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpurea), 콩팥의 현미경적 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변증, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 애디슨병, 산발성, 다선 결핍 I형 및 다선 결핍 II형, 슈미트 증후군, 성인(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 관절병증, 라이터병, 건선성 관절병증, 궤양성 대장염 관절병증, 장병증 활막염, 클라미디아, 여시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 죽종성 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 엽상천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰즈 양성 용혈성 빈혈(Coombs positive haemolytic anaemia), 후천성 악성빈혈, 청소년 악성빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환(Royal Free Disease), 만성 피부 점막 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 일반적인 다양한 면역결핍(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소부전, 조기난소부전, 섬유성 폐질환, 잠재성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성(interstitial) 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신성 홍반성 루푸스 관련 폐 질환, 피부근염/다발성근염 관련 폐 질환, 쇼그렌병 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관성 미만성 폐 질환, 혈우병 관련 폐 질환, 약물 유발 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐쇄성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐질환, 감염후 간질성 폐질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개성 저혈당, 흑색극세포증을 동반한 B형 인슐린 저항성, 부갑상선기능저하증, 장기 이식과 관련된 급성 면역 질환, 장기 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 제1형 건선, 제2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 콩팥의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판형 홍반성 루푸스, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 결합 조직 질환에 의한 폐고혈압, 굿파스처 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역성 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토병), 위축성 자가면역 갑상선기능저하증, 원발성 점액종, 균성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변증, 알코올성 간손상, 담즙정체, 특발성 간질환, 약물 유발 간염, 비알코올성 지방간염, 알레르기, B군 연쇄상구균(GBS) 감염, 정신 장애, 우울증, 정신 분열증, Th2형 및 Th1형 매개 질환, 급성 및 만성 통증, 상이한 형태의 통증, 암, 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 대장암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 직장암, 조혈 악성종양, 백혈병, 림프종, 무베타지질단백혈증, 말단청색증, 급성 및 만성 기생충 또는 감염 과정, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암, 심방 이소성 박동, 에이즈 치매 복합증, 알코올성 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염(계절성 알레르기 비염 포함), 비알레르기성성 비염, 동종이식 거부반응, 알파-I-항트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 변성(anterior horn cell degeneration), 항 cd3 요법, 항인지질 증후군, 항수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥루, 운동실조, 심방세동(지속성 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부반응, 골수 이식(BMT) 거부반응, 각차단(bundle branch block), 버킷 림프종, 화상, 심장 부정맥, 심장 스턴 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부반응, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 다원성 또는 다소성 심방 빈맥(chaotic or multifocal atrial tachycardia), 화학 요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병리, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 살리실산염 중독, 결장직장암, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐성심, 관상동맥 질환, 크로이츠펠트야콥병, 배양 음성 패혈증, 낭포성 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 권투선수 치매(dementia pugilistica), 탈수초성 질환, 뎅기열 출혈열, 피부염, 피부과적 병태, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 미만성 루이소체 질환, 확장성 울혈성 심근병증, 기저핵의 장애, 중년의 다운증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유발되는 약물 유발 운동 장애, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 홍색성 통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 조혈세포 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부반응, 프리드라이히 운동실조, 기능적 말초동맥질환, 진균성 패혈증, 가스 괴저(gas gangrene), 위궤양, 사구체 신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식 거부반응, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체에 의한 육아종, 모발세포 백혈병, 할러보덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 꽃가루 알레르기, 심장 이식 거부반응, 혈색소 침착증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전 용해성 혈소판 감소성 자반병, 출혈, A형 간염, 히스속 부정맥(His bundle arrythmias), HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨병, 과운동성 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동저하 운동장애, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가, 특발성 애디슨병, 특발성 폐섬유증, 항체매개 세포독성, 무력증, 영아척수성근위축증, 대동맥 염증, A형 인플루엔자, 전리방사선 노출(ionizing radiation exposure), 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 청소년 류마티스 관절염, 청소년 척수성 근위축증, 카포시 육종, 콩팥 이식 거부반응, 레지오넬라균, 리슈만편모충증, 나병, 피질척수계 병변, 지방종, 간 이식 거부반응, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증가증, 악성 흑색종, 수막염, 수막구균혈증, 대사성/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다계통 장애, 혼합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마병증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 변성(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-Joseph), 세포내 미코박테륨 아븀(mycobacterium avium intracellulare), 미코박테륨 튜버쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 골수이형성증후군, 심근경색증, 심근허혈 장애, 비인두암, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 근위축증, 호중구감소성 발열, 비호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 그 가지의 폐쇄, 폐쇄성 동맥 장애, okt3 요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관 절제술 역전 시술, 기관비대, 골다공증, 췌장 이식 거부반응, 췌장 암종, 부신생물 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부반응, 골반 염증성 질환, 통년성 비염, 심낭 질환, 말초 죽상동맥경화증, 말초혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 기관비대증, 내분비병증, 모노클로날 감마병증 및 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, M1 심장 절제술 후 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐고혈압, 방사선 요법, 레이노의 현상과 질환(Raynaud's phenomenon and disease), 레이노드병, 레프섬병(Refsum's disease), 규칙적이고 좁은 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 노인성 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상 적혈구 빈혈, 피부 동종 이식 거부반응, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부반응, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추 운동 실조, 척수 소뇌 변성, 연쇄상 구균 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 과민증, 전신 염증 반응 증후군, 전신성 발병 청소년 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL 모세혈관확장증, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민반응, IV형 과민증, 불안정형 협심증, 요독증, 요로증, 판막 심장병, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 생명성 뇌염/무균성 수막염, 생명성 관련 조혈구 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 윌슨병(Wilson's disease), 임의의 장기 또는 조직의 이종이식 거부반응, 급성 관상동맥 증후군, 급성 특발성 다발성 신경염, 급성 염증성 탈수초 다발성 신경근신경병증, 급성 허혈, 성인 스틸병, 아나필락시스, 항인지질항체증후군, 재생불량성 빈혈, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 난청, 자가면역 림프증식 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 조기난소부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 치명적 항인지질 증후군(catastrophicantiphospholipid syndrome), 셀리악병(celiac disease), 경추증, 만성 허혈, 간질성 유천포창, 다발성 경화증의 위험이 있는 임상적으로 격리된 증후군(cis), 소아기 발병 정신질환, 누낭염, 피부근염, 당뇨망막병증, 디스크 탈출증(disk herniation), 디스크 탈출증(disk prolapse), 약물 유발 면역 용혈성 빈혈, 자궁 내막증, 안구내염, 상공막염, 다형 홍반, 주요 다형 홍반, 임신 유천포창, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome; GBS), 휴즈 증후군(Hughes syndrome), 특발성 파킨슨병, 특발성 간질성 폐렴, IgE 매개 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 전염성 안구 염증성 질환, 염증성 탈수초 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 콩팥 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성각막염, 쿠스마울병 또는 쿠스마울-마이어병(Kussmaul disease or Kussmaul-Meier disease), 란드리 마비(Landry's paralysis), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhan's cell histiocytosis), 망막색소변성, 황반변성, 현미경적 다발혈관염, 모르부스 베츠테루(morbus bechterew), 운동 신경 장애, 점막 유천포창, 다발성 장기부전, 중증 근무력증, 골수이형성 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비A 비B형 간염, 시신경염, 골용해, 소관절 JRA, 말초동맥 폐쇄성 질환(PAOD), 말초혈관질환(PVD), 말초동맥질환(PAD), 정맥염, 결절성 다발동맥염 (또는 결절성 동맥염), 다연골염, 소아마비, 다관절 JRA, 다내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 원발성 파킨슨병, 전립선염, 순적혈구 무형성증, 원발성 부신 기능부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착, 류마티스성 심장병, 사포(sapho)(활막염, 여드름, 농포증, 골과골증, 및 골염), 이차성 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골 신경통, 이차성 부신 기능부전, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네든 윌킨슨 피부병(sneddon-wilkinson dermatosis), 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome: SJS), 측두 동맥염, 톡소플라즈마 망막염(toxoplasmic retinitis), 독성 표피 괴사, 횡단 척수염, TRAPS(종양 괴사 인자 수용체, 1형 알레르기성 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 봄철 결막염, 바이러스성 망막염, 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome) (VKH 증후군), 습성 황반변성 또는 상처 치유, 아스피린 민감성 천식, 아토피성 천식, 만성 손 습진, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 체강 질환, 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome) (결절성 동맥염 + 아토피), 호산구성 근육통 증후군, 과호산구성 증후군, 일시적인 혈관부종을 포함한 부종 반응, 기생충 감염, 사상충성 피부염, 호산구 관련 위장 장애, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 장염, 호산구성 대장염, 비강 미세용종증 및 용종증, 음식 알레르기, 아스피린 불내성, 및 폐쇄성 수면 무호흡증, 만성 천식, 크론병 및 심근내막 섬유증, 암(예를 들어, 교모세포종(예컨대 다형성 교모세포종), 비호지킨 림프종(NHL)), 섬유증, 염증성 장 질환, 폐 섬유증(특발성 폐 섬유증(IPF) 및 경화증에 따른 폐 섬유증 포함), COPD, 및 감 섬유증이 포함된다.

본 발명의 다중 특이적 항체는 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기, 또는 호산구성 식도염을 치료 또는 예방하는데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 약학적 조성물은 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다. 한 구현예에서, 다중 특이적 항체 또는 약학적 조성물은 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기, 또는 호산구성 식도염을 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 한 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 다중 특이적 항체 또는 약학적 조성물을, 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기, 또는 호산구성 식도염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예

실시예 1. 치료적 항-IL-13 항체 CA650의 생성 및 선택

래트를 정제된 인간 IL-13(Peprotech) 또는 래트 섬유아세포 발현 인간 IL-13(배양 상층액에서 대략 1 ug/ml를 발현), 또는 일부 경우에는 둘의 조합으로 면역화시켰다. 3 내지 6회의 주사 후, 동물을 희생시키고 PBMC, 비장, 골수 및 림프절을 수거하였다. 혈청은 ELISA에서 인간 IL-13에 대한 결합 및 또한 HEK-293 IL-13R-STAT-6 리포터 세포 검정(HEK-Blue 검정, Invivogen)에서 hIL-13을 중화하는 능력에 대해 모니터링되었다.

B 세포 배양물을 설정하고 상층액을 Applied Biosystems FMAT 검정에서 비드 기반 검정에서 hIL-13에 결합하는 능력에 대해 먼저 스크리닝하였다. 이것은 스트렙타비딘 비드 상에 코팅된 비오틴화된 인간 IL-13 및 리빌 제제(reveal agent)로서 염소 항-래트 Fc-Cy5 접합체를 사용하는 균질한 검정이었다. 이어서, 이 검정으로부터의 양성을 HEK-293 IL-13R-STAT-6 리포터 세포 검정(HEK-Blue 분석, Invivogen)으로 진행하여 중화물을 확인하였다. 이어서, 중화 상층액을 Biacore에서 프로파일링하여 오프율(off-rate)을 추정하고 중화 작용 방식을 특성화하였다. 중화는 bin 1 또는 bin 2로 분류되었다. bin 1은 인간 IL-13에 결합하여 IL-13Rα1의 결합을 방지하고 그 결과 또한 IL-4R이 결합하는 것을 차단하는 항체를 나타낸다. bin 1 항체는 또한 IL-13이 IL-13Rα2에 결합하는 것을 방지할 수 있다. bin 2는 IL-13Rα1에 대한 결합을 허용하지만 IL-4R이 복합체로 동원되는 것을 방지하는 방식으로 hIL-13에 결합하는 항체를 나타낸다, 본 발명자들은 bin 1을 통해 작동하는 항체를 선택하였다.

대략 7500 IL-13-특이적 양성이 총 27 x 100-플레이트 SLAM 실험으로부터 1차 FMAT 스크린에서 확인되었다. 800개의 웰은 HEK-blue 검정에서 중화를 입증하였다. 170개의 웰은 바람직한 Biacore 프로파일, 즉 오프율이 5x10^-4 s^-1 미만인 bin 1 항체를 가졌다. 이러한 170개의 웰로부터 가변 영역 클로닝이 시도되었고 160개의 웰에서 형광 초점이 성공적으로 생성되었다. 100개의 웰은 역전사(RT)-PCR 후 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 쌍을 생성하였다. 이러한 V-영역 유전자를 마우스 IgG1 전장 항체로 클로닝하고 HEK-293 일시적 발현 시스템에서 재발현시켰다. 서열 분석은 항-인간 IL-13 항체의 27개의 독특한 패밀리가 있다는 것을 밝혀냈다. 이어서, 이러한 재조합 항체를 세포 기반 검정에서 재조합 hIL-13(이. 콜리 유래 및 포유동물 유래), 재조합 변이체 hIL-13 (R130Q) (이. 콜리 유래), 천연 야생형 및 변이체 hIL-13(인간 공여자 유래) 및 시노몰구스 IL-13(포유류 유래)을 차단하는 이들의 능력에 대해 재시험하였다. 재조합 항체를 또한 Biacore에서 변이체 인간 IL-13(R130Q) 및 시노몰구스 IL-13에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이 특성화에 따라, 항체 패밀리는 본 발명의 기준, 즉 모든 인간 및 시노몰구스 IL-13 제제에 대한 역가 및 친화도의 감소가 최소인 100 pM 미만 항체를 충족하도록 선택되었다.

인간화 이식편의 중화 효능, 친화도 및 공여자 함량(아래 참조)을 기반으로, 인간화 CA650이 추가 진행을 위해 선택되었다.

실시예 2. 항체 CA650 인간화

항체 650은 래트 V-영역으로부터의 CDR을 인간 생식계열 항체 V-영역 프레임워크에 이식함으로써 인간화되었다. 항체의 활성을 회복하기 위해, 래트 V-영역으로부터의 다수의 프레임워크 잔기가 또한 인간화 서열에서 유지되었다. 이러한 잔기는 문헌[Adair et al. (1991) (Humanised antibodies. WO91/09967)]에 의해 요약된 프로토콜을 사용하여 선택되었다. 래트 항체(공여자) V-영역 서열과 인간 생식계열(수용체) V-영역 서열의 정렬은 설계된 인간화 서열과 함께 도 1에 나타낸다(도 1a 경쇄 이식편 650 및 도 1b 중쇄 이식편 650). 공여자로부터 수용체 서열로 이식된 CDR은 조합된 코티아/카바트 정의가 사용되는 CDR-H1을 제외하고 문헌[Kabat (Kabat et al., 1987)]에 의해 정의된 바와 같다[문헌(Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967) 참조].

초기 V-영역 서열을 코딩하는 유전하는 Entelechon GmbH에 의해 자동화된 합성 접근법에 의해 설계 및 작제되었으며, 올리고뉴클레오티드 지정된 돌연변이유발에 의해 이식된 버전 gL8 및 gH9를 생성하도록 변형되었다. gL8 서열은 인간 C-카파 불변 영역(Km3 동종형)을 코딩하는 DNA를 포함하는 UCB Celltech 인간 경쇄 발현 벡터 pVhCK에 서브클로닝되었다. gH9 서열은 인간 중쇄 감마-1 CH₁ 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 pVhg1Fab에 서브클로닝되었다.

인간 V-영역 IGKV1-39 + JK2 J-영역(International Immunogenetics Information System® IMGT, http://www.imgt.org)은 항체 650 경쇄 CDR에 대한 수용체로서 선택되었다. 이식편 gL8에서 경쇄 프레임워크 잔기는 잔기 58 및 71(카바트에 따른 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 생식계열 유전자로부터 유래하며, 여기서, 공여자 잔기 이소류신(I58) 및 티로신(Y71)은 각각 유지되었다. 잔기 I58 및 Y71의 유지는 인간화 항체의 완전한 효능에 필수적이었다.

인간 V-영역 IGHV1-69 + JH4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org)은 항체 650의 중쇄 CDR에 대한 수용체로서 선택되었다. 이식편 gH9에서 중쇄 프레임워크 잔기는 잔기 67, 69 및 71(카바트에 따른 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 생식계열 유전자로부터 유래하며, 여기서, 공여자 잔기 알라닌(A67), 페닐알라닌(F69) 및 발린(V71)은 각각 유지되었다. 잔기 A67, F69 및 V71의 유지는 인간화 항체의 완전한 효능에 필수적이었다. 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기는 글루타민산(E1)으로 대체되어 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공한다: 항체 및 항체 단편의 N-말단에서 글루타민의 피로글루타메이트로의 전환이 널리 보고되었다. 최종 선택된 가변 이식편 서열 gL8 및 gH9는 각각 도 1a 및 도 1b에 나타낸다.

항체 650의 CDR, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, scFv 및 dsscFV 형식을 코딩하는 아미노산 및 DNA 서열은 도 2에 나타낸다.

실시예 3. 항-IL-17AF 항체 496.g3의 생성

인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 대한 항체 CA028_00496.g3(본원에서 항체 496.g3으로도 지칭됨)의 생성은 이전에 WO2012/095662에 기재되어 있다. 항체는 인간 IL-17A, IL-17F 및 IL-17A/F 이종이량체에 pM 친화도로 결합한다. 항체 496.g3의 Fab 형식의 CDR, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 아미노산 및 DNA 서열은 도 2에 나타낸다. 496.g3(IL-17A/F 결합) Fab 불변 영역은 인간 C-카파 불변 영역(K1m3 동종형) 및 인간 감마-1 CH₁ 불변 영역 및 힌지(G1m17 동종형)로 구성되었다.

실시예 4. 항-인간 알부민 항체 645의 생성

항-인간 알부민 항체 645의 생성은 이전에 WO2013/068571에 기재되어 있다. 항체 645의 CDR, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, scFv 및 dsscFV 형식을 코딩하는 아미노산 및 DNA 서열은 도 2에 나타낸다.

실시예 5. 다중 특이적 항체 IL-13/IL-17AF - 일시적 플라스미드의 작제 및 세포에서의 발현.

다중 특이적 항체는 Fab 위치에 고정된 항-IL-17AF V-영역(496.g3)으로 설계되었으며; 항-알부민 V-영역(645gL4gH5) 및 IL-13(1539gL8gH9)은 HL 배향에서 이황화-연결된 scFv(dsHL)로 재형식화되었고 11-아미노산 글리신-세린 풍부 링커를 통해 Fab의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 C-말단에 연결되었다(도 7). 다중 특이적 항체의 전장 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 아미노산 및 DNA 서열은 도 2에 나타낸다.

경쇄 및 중쇄 유전자는 hCMV 프로모터의 제어 하에 일시적인 발현을 위해 포유동물 발현 벡터에 독립적으로 클로닝되었다. 동일한 비율의 두 플라스미드를 시판 ExpiCHO 엑스피펙타민(expifectamine) 일시적 발현 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 CHO-S XE 세포주(UCB)에 형질감염시켰다. 배양물을 37℃, 8.0% CO₂, 190 rpm에서 통기 캡이 있는 Corning 롤러 병에서 인큐베이션하였다. 18-22시간 후, 배양물에 적절한 부피의 CHO 인핸서와 제조사에 의해 제공된 HiTiter 방법을 위한 공급물을 공급하였다. 배양물을 32℃, 8.0% CO₂, 190 rpm에서 추가로 10 내지 12일 동안 재인큐베이션하였다. 상층액은 0.45 μm에 이어 0.2 μm 필터를 통해 필터-멸균하기 전에 4℃에서 1시간 동안 4000 rpm에서 원심분리하여 수확하였다. 발현 역가는 1 ml GE HiTrap 단백질 G 컬럼(GE Healthcare) 및 자체 생성된 Fab 표준을 사용하여 단백질 G HPLC에 의해 정량화되었다. 발현 역가는 표 1에 나타낸다.

[표 1] CHO S -XE 세포주에서 일시적 발현으로부터의 발현 역가

실시예 6. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 - 포유동물 세포주 발달.

IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 안정적인 발현을 입증하기 위해, 안정적으로 발현하는 포유동물 세포주가 생성되었다. CHO 세포주는 496.g3 Fab, 1539gH9gL8 dsscFv HL(LC, INS0025609), 645gH5gL4 dsscFv HL(HC, INS0025306) 및 선별 마커를 함유하는 벡터로 형질감염시켰다. 세포주를 클로닝하고 적합한 제조 공정에 적합한지 평가했다. 단백질의 품질과 양을 평가하고 최적의 세포주가 선택되었는지 확인하기 위해 세포주는 제조 유가식 생물반응기(fed-batch bioreactor)의 소규모 모델에서 평가되었다. 1.8 g/L 초과 및 75% 초과의 단량체로 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 발현하는 CHO 세포주가 선택되었다.

실시예 7. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 정제 과정.

다중 특이적 항체 단백질은 천연 단백질 A 포획 단계에 이어 예비 크기 배제 폴리싱 단계에 의해 정제되었다. 표준 일시적인 CHO 발현으로부터 정화된 상층액을 5분 접촉 시간을 제공하는 MabSelect(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하고 결합 완충액(20 mM Hepes pH 7.4 + 150 mM NaCl)으로 세척하였다. 결합된 물질을 0.1 M 시트르산나트륨 pH 3.1 단계 용출로 용출하고 2 M Tris/HCl pH 8.5로 중화하고 280 nm에서 흡광도로 정량화하였다.

크기 배제 크로마토그래피(SE-UPLC)를 사용하여 용출된 생성물의 순도 상태를 결정하였다. 항체(~2 μg)를 BEH200, 200Å, 1.7 μm, 4.6 mm ID x 300 mm 컬럼(Waters ACQUITY)에 로딩하고, 0.35 mL/min에서 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 전개하였다. 연속 검출은 280 nm에서의 흡광도 및 다중-채널 형광(FLR) 검출기(Waters)에 의해 이루어졌다. 용출된 다중 특이적 항체는 72% 단량체인 것으로 밝혀졌다.

중화된 샘플은 Amicon Ultra-15 농축기(10 kDa 분자량 컷 오프 멤브레인)를 사용하여 농축하고 수평 로터(swing out rotor)에서 4000xg에서 원심분리하였다. 농축된 샘플을 PBS, pH 7.4로 평형화된 XK16/60 Superdex200 컬럼(GE Healthcare)에 적용하고 1 ml/min에서 PBS, pH 7.4의 등용매 구배로 전개하였다. 분획을 수집하고 BEH200, 200Å, 1.7 μm, 4.6mm ID x 300 mm 컬럼(Aquity)에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하고 0.35 mL/min에서 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 전개하였고, 280 nm에서의 흡광도 및 다중-채널 형광(FLR) 검출기(Waters)로 검출하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고, 0.22 μm 멸균 여과하고, DropSense96 (Trinean)에서 A280 스캐닝에 의해 농축에 대해 최종 샘플을 검정하였다. Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 시험 카트리지를 갖는 Charles River의 EndoSafe® 휴대용 시험 시스템에 의해 평가된 내독소 수준은 1.0 EU/mg 미만이었다

최종 다중 특이적 항체의 단량체 상태는 BEH200, 200Å, 1.7 μm, 4.6 mm ID x 300 mm 컬럼(Aquity)에서 크기 배제 크로마토그래피로 결정하고 0.35 mL/min에서 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 전개하였고, 280 nm에서의 흡광도 및 다중-채널 형광(FLR) 검출기(Waters)로 검출하였다. 최종 다중 특이적 항체는 도 3a에 나타낸 바와 같이 >99% 단량체성인 것으로 밝혀졌다.

나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분석을 위해, 4 x Novex NuPAGE LDS 샘플 완충액(Life Technologies) 및 10X NuPAGE 샘플 환원제(Life Technologies) 또는 100 mM N-에틸말레이미드(Sigma-Aldrich)를 ~5 μg의 정제된 단백질에 첨가하여 샘플을 제조하고, 3분 동안 100℃로 가열하였다. 샘플을 10웰 Novex 4-20% Tris-글리신 1.0 mm SDS-폴리아크릴아미드 겔(Life Technologies)에 로딩하고 Tris-글리신 SDS 실행 완충액(Life Technologies)에서 40분 동안 225 V의 일정한 전압에서 분리하였다. Novex Mark12 광범위 단백질 표준물질(Life Technologies)을 표준물질로서 사용하였다. 젤은 Coomassie Quick Stain(Generon)으로 염색하고 증류수에서 탈염색하였다.

비환원 SDS-PAGE에서, 다중 특이적 항체, ~100 kDa의 이론 분자량(MW)은 ~120 kDa로 이동했다. 다중 특이적 항체 단백질이 감소되었을 경우, 두 사슬은 각각의 이론적인 MW, 중쇄(HC) ~52 kDa 및 경쇄(LC) ~51 kDa에 근접하는 이동 속도로 이동하였다. ~45 - 50 kDa에서 비환원된 겔에서 추가 밴드는 분자의 Fab 부분에서 이황화 결합이 없어진 '유리' LC 및 HC이며, 이들이 완전히 환원되지 않았기 때문에 레인 2에서 LC 및 HC와 동일한 위치로 이동하지 않았다(도 3b).

실시예 8. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 분자의 항원 결합.

(i) 항원 결합 친화도

인간 및 시노몰구스 IL-13, IL-17A, AF, F 및 알부민의 결합 동역학을 표면 플라즈몬 공명(Biacore T200)에 의해 평가하였다.

염소 항-인간 IgG, F(ab')₂ 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)는 아민 커플링 화학을 통해 대략 5000 RU 수준으로 CM5 센서 칩에 고정되었다. 각 분석 주기는 F(ab')₂ 표면에 대한 IL-13/IL-17AF/알부민 다중 특이적 항체 분자의 포획, 분석물 주입(25℃에서 분당 30 μl의 유속) 후 표면 재생으로 이루어졌다. 인간 및 시노몰구스 분석물은 IL-13의 경우 10 nM 내지 0.3125 nM, IL-17A, AF, F의 경우 5 nM 내지 0.156 nM 및 알부민의 경우 100 nM 내지 3.125 nM의 농도로 HBS-EP+ 실행 완충액(GE Healthcare)에 2배 연속 희석하여 주입하였다. 항원은 인간 IL-13(R&D Systems), 시아노 IL-13(Sinobiologicals) 및 인간 혈청 알부민(Jackson ImmunoResearch)을 제외하고 자체 제조하였다. 기기 소음과 드리프트를 빼기 위해 완충액 블랭크 주입이 포함되었다.

동역학 파라미터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하여 1:1 결합 모델을 사용하여 결정되었고 표 2(1) 및 2(2)에 요약되어 있다. 해리 속도(k _d )가 1.0 x 10^-5 미만으로 측정되었을 경우, 1.0 x 10^-5(제조업체 GE Healthcare에 의해 정의된 Biacore T200 기기의 검출 한계)로 고정되어 친화도(K _D )를 계산하였다.

결과는 다중 특이적 항체가 인간 및 시노몰구스 IL-17A, IL-17AF, IL-17F, IL-13 및 알부민에 효과적으로 결합함을 입증하였다.

[표 2(1)] 인간 항원에 결합하는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 동역학 상수.

결과는 표시된 결정 수로부터의 평균을 나타낸다.

[표 2(2)] 시노몰구스 항원에 결합하는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 동역학 상수.

결과는 표시된 결정 수로부터의 평균을 나타낸다.

(ii) 동시 항원 결합

표면 플라즈몬 공명을 사용하여 IL-17A, IL-13 및 알부민이 인간 또는 시노몰구스 형태의 단백질을 사용하여 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 동시에 결합할 수 있음을 입증하였다.

IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 대한 분석물의 동시 결합을 평가하기 위한 방법 형식은 고정된 항-인간 IgG F(ab')₂ 단편 특이적 항체에 대한 항체 샘플을 포획하는 것이었다. 이어서, 인간 또는 시노몰구스 IL-13, IL-17A, 및 알부민을 포획된 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체(최종 농도 30 nM IL-13, 15 nM IL-17A, 150 nM 알부민)에 대해 단독으로 또는 세 분석물 모두의 혼합 용액(300초 동안 30 l/min)에 주입하였다.

각 주기의 말미에, 표면은 50 mM HCl의 60초 주입에 이어 5 mM NaOH의 30초 주입 및 50 mM HCl의 최종 60초 주입을 사용하여 10 μl/min의 유속으로 재생되었다.

각 항원을 단독으로 주입했을 때의 결합 반응을 결정하였고, 개별 반응의 합을 세 항원이 모두 주입되었을 때 결합 반응과 비교하였다.

IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 대한 인간 IL-17A, IL-13 및 알부민 혼합물의 평균 결합 반응은 개별 결합 반응의 합의 100%였으며(표 3에 요약), 이는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체가 각 항원에 동시에 그리고 독립적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.

[표 3] 인간 IL-17A, IL-13 및 알부민에 대한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 동시 결합

IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 대한 시노몰구스 IL-17A, IL-13 및 알부민 혼합물의 평균 결합 반응은 개별 결합 반응의 합의 97%였으며(표 4에 요약), 이는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체가 각 항원에 동시에 그리고 독립적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.

[표 4] 시노몰구스 IL-17A, IL-13 및 알부민에 대한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 동시 결합

실시예 9. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-13의 중화.

HEK 293 인간 IL4/IL-13 SEAP 리포터 세포주 검정을 사용하여 IL-13을 중화시키기 위한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 활성을 평가하였다. SEAP 분비는 IL-13 반응을 평가하기 위해 STAT6 경로의 활성화 시 측정되었다.

HEK 293 인간 IL4/IL-13 SEAP 리포터 세포(# hkb-il413)는 Invivogen, San Diego에서 입수하였다. 세포주의 배양, 동결 및 유지는 제조업체 프로토콜을 따랐다.

재조합 인간 IL-13은 R&D Systems, Minneapolis, MN. (# 213-ILB)에서 입수하였다.

96개의 평평한 바닥 웰에서 자극 시 대략 80% 컨플루언트되도록 세포를 플레이팅하였다.

24시간 동안 세포에 첨가하기 전에 37℃, 5% CO₂, 100% 습도에서 30분 동안 250 pg/mL IL-13과 함께 사전 인큐베이션된 항체로 세포를 이중으로 처리하였다.

24시간 후, 20 μL의 상층액을 세포 자극으로부터 피펫팅하고 제조업체 지침에 따라 180 μL의 Quanti-blue #rep-qbs(Invivogen, San Diego)에 첨가하였다.

가시적인 색상 변화 구배가 있을 때까지 검정을 전개하고 620 nm에서 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 판독하였다. IC50은 Graphpad 프리즘(San Diego, CA)을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산되었다. 도 4는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 STAT6 신호전달의 억제 %의 대표적인 그래프를 나타낸다.

[표 5] IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 STAT6 신호전달 억제에 대한 IC50 값.

실시예 10. 인간 및 시노몰구스 IL-17A 및 IL-17F에 대한 인간 진피 섬유아세포에 의한 IL-6 반응에 대한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 중화 효과

이 연구의 목적은 인간 1차 세포 시스템에서 인간 및 시노몰구스 IL-17A 및 IL-17F에 대한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 중화 능력을 결정하는 것이었다. IL-17이 TNF-α와 같은 다른 사이토카인과 함께 존재할 때 염증 촉진 반응이 유도된다. 따라서, 이 상승 효과는 IL-17 및 TNF-α로 자극된 1차 정상 신생아 인간 진피 섬유아세포(nHDF)로부터 IL-6 방출 검정을 생성하는 데 이용되었다.

nHDF로부터의 IL-17 유도된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 능력이 이 검정에서 측정되었다. 구체적으로, nHDF는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 적정의 존재시 TNF-α(25 pM)와 함께 인간 또는 시노몰구스 IL-17A(50 pM) 또는 IL-17F(25,000 pM)로 자극되었다(IL-17A 연구의 경우 농도 범위 5000 pM 내지 0.25 pM; IL-17F 연구의 경우 500,000 pM 내지 25 pM). 이어서, 생성된 IL-6 반응은 균질한 시간-분해 FRET(HTRF)를 사용하여 측정하였다.

nHDF 세포(Sigma #106-05n)를 완전 배지(DMEM + 10% FCS + 2 mM L-글루타민)에서 배양하고 표준 기술을 사용하여 조직 배양 플라스크에서 유지하였다. TrypLE (Invitrogen #12605036)를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 세포를 수확하였다. TrypLE를 완전 배지(45 ml)를 사용하여 중화하고 세포를 300 x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포를 완전 배지(3-5 ml)에 재현탁하고, 계수하고 농도를 3.125 x 10⁴개 세포/mL로 조정한 후 384-웰 검정 플레이트(Corning #3701)에 40 μl/웰로 첨가하였다. 세포를 37℃/5% CO₂에서 3시간 동안 인큐베이션하여 플레이트에 부착하였다. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 384-웰 희석 플레이트(Greiner #781281)의 완전 배지에서 IL-17A에 대한 평가의 경우 5000 pM 내지 0.25 pM, IL-17F에 대한 평가의 경우 500,000 pM 내지 25 pM의 최종 농도 범위로 연속 희석하였다. TNF-α와 IL-17 사이토카인의 혼합물은 인간 또는 시노몰구스 IL-17A 50 pM 또는 IL-17F 25,000 pM과 함께 TNF-α25 pM의 최종 농도까지 완전 배지에서 제조하였다. 이어서, 30 μl/웰의 이러한 용액을 384-웰 시약 플레이트(Greiner #781281)에 첨가하였다. 이어서, IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 일련 희석 플레이트로부터 10 μl를 30 μl의 희석된 사이토카인을 포함하는 시약 플레이트로 옮겼다. 이어서, IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체를 37℃/5% CO₂에서 1시간 동안 사이토카인 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 μl를 시약 플레이트에서 세포를 포함하는 검정 플레이트로 옮겼다. 이어서, 검정 플레이트를 37℃/5% CO₂에서 18시간 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, Cisbio IL-6 HTRF 키트(Cisbio #62IL6PEB)로부터의 유로피움 크립테이트 및 Alexa 665 항체를 재구성 완충액에서 희석하고 키트 삽입물에 따라 1:1로 혼합하였다. 이어서, 10 μl/웰의 이 항체 혼합물을 백색의 적은 부피의 384-웰 HTRF 플레이트(Greiner #784075)에 첨가하였다. 이어서, 검정 플레이트로부터의 상층액을 10 μl/웰로 HTRF 플레이트로 옮겼다. 이어서, HTRF 플레이트를 실온에서 2시간 동안 온화하게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 이어서, 제조업체의 지침에 따라 Synergy Neo 2 플레이트 판독기에서 HTRF 플레이트를 판독하여 330/620 nm 및 330/665 nm의 리드(read)에서 형광을 측정하였다. 이어서, 비율 값은 다음 식(330/665 nm를 330/620 nm로 나눔) X 10,000을 사용하여 계산하고 Microsoft 엑셀을 사용하여 대조군 웰과 비교한 상대적 억제 백분율을 결정하는 데 사용하였다. 4PL 곡선 피팅 및 IC₅₀ 값 계산은 GraphPad Prism 7.0을 사용하여 수행하였다.

나타낸 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균(+/- SEM)이다. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 IC50 값은 인간 IL-17A의 경우 42 pM 그리고 시노몰구스 IL-17A의 경우 49 pM로 계산되었다. IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 IC50 값은 인간 IL-17F의 경우 28,030 pM 그리고 시노몰구스 IL-17F의 경우 34,320 pM으로 계산되었다(도 5).

[표 6] IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 대한 효능, 효율 및 경사도 값의 요약.

값은 3개의 독립적인 실험으로부터 계산되었다.

실시예 11. NHEK CXCL1 방출 생물검정에서 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-13, IL-17A 및 IL-17F의 동시 중화

이 검정의 목적은 1차 세포 시스템에서 IL-13, IL-17A 및 IL-17F를 동시에 중화시키는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 능력을 평가하는 것이었다. NHEK를 IL-13, IL-17A 또는 IL-17F로 개별적으로 처리하는 경우, 이들은 염증 부위로 세포를 동원하는 원인인 케모카인인, CXCL1의 분비를 유도한다. 아토피성 피부염의 맥락에서, CXCL1은 더 낮은 자극 역치를 갖도록 뉴런을 민감하게 하는 역할을 하는 증거가 있다. 이 관찰은 환자가 경험하는 가려움증과 관련이 있을 수 있다(Yang T.B. and Kim B.S. 2019; "Pruritus in allergy and immunology" J Allergy Clin Immunol 144(2): 353-360).

NHEK(PromoCell, Heidelberg)를 제조업체 프로토콜에 따라 저장, 배양 및 사용하였다. 48개의 평평한 바닥 웰 플레이트에서 자극시 100% 컴플루언트되도록 세포를 플레이팅하였다. 세포는 72시간 동안 100 ng/mL IL-13 및 100 ng/mL IL-17A, 1 μg/mL IL-17F로 처리하기 전에 각각 30분 동안 증가하는 농도의 항-IL-13, 항-IL-17A, 항-IL-17F, 또는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체와 함께 사전 인큐베이션하였다. 경과 시간 후, 제조업체 프로토콜(R&D Systems)에 따라 ELISA를 통한 CXCL1 농도의 정량화를 위해 50 μl의 무세포 상층액을 수집하였다. 각 실험군의 IC₅₀은 Graphpad prism(San Diego, CA)을 이용한 비선형 회귀로 계산하였다.

결과는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체가 IL-13, IL-17A 및 IL-17F 활성을 동시에 중화한다는 것을 입증하였다(도 6). 검정에서 이용 가능한 결합 부위의 수에 대해 정규화하는 경우, L-13/IL-17AF 다중 특이적 항체(81.3%)는 CXCL1 방출을 억제하는데 항-IL-17A(52.7%), 항-IL-17F(0.7%) 또는 항-IL-13(48.8%)보다 더 효과적이었다. 항-IL-17A, 항-IL-17F 또는 항-IL-13 단독의 농도를 증가시키는 것은 달성된 최대 억제를 개선하지 않았다. 결과는 단일 사이토카인 중화와 비교하여 IL-13, IL-17A 및 IL-17F를 동시에 억제하는 이점을 강조한다.

실시예 12. 다중 특이적 IL-13/IL-17 항체와 선행 기술의 IL-13/IL-17 항체의 비교

서론

본 발명에 따른 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 예는 도 7에 나타낸다. 이것은 하나는 IL-13에 대해 그리고 다른 하나는 알부민에 대해 특이적인 2개의 scFv 도메인에 연결된 IL-17A 및 IL-17F에 대한 이중특이성을 갖는 Fab 도메인을 포함한다. 항-알부민 도메인은 반감기가 연장된 다중 특이적 항체를 제공한다.

IL-13 및 IL-17에 결합하는 이중특이적 항체는 이전에 Abbvie (WO2013/102042A2) 및 Genentech (WO2015/127405A2)에 의해 기재되었다. 그러나, 이들이 어떻게 IL-13, IL-17A 및 IL-17F에 결합하는지에 대해서는 거의 개시되지 않았다. 이러한 성질을 비교하기 위해, 본 발명자들은 선행 기술에 설명된 항체를 만들고 다음 특성에 대한 결합 거동을 조사하였다:

ㆍ IL-13에 대한 친화도

ㆍ 분자와 IL-13 및 IL-13Rα1의 상호작용

ㆍ IL-17A에 대한 친화도

ㆍ IL-17F에 대한 친화도

비교기 항체의 생성

BITS7201A (Genentech)는 WO2015/127405A2의 실시예 6에 기재된 서열을 사용하여 작제하였다.

DVD2166 및 DVD2174 (Abbvie)는 WO2013/102042A2, 표 6 및 표 7에 기재된 서열을 사용하여 작제하였다. 이러한 분자는 IL-13 및 IL-17에 대한 이중특이성의 개별 아암의 보고된 활성이 이들의 각각의 모 항체와 거의 동등하거나 동등하다는 것을 기반으로 선택되었다(WO2013/102042A2 실시예 4, 페이지 83 단락 0195).

ExpiCHO 형질감염 시스템(ThermoFisher Scientific)의 고역가 프로토콜을 사용하여 DNA 작제물을 CHO-SXE 세포에 형질감염시켰다. 수확 시, 세포 배양물을 4,000 RPM에서 적어도 1시간 동안 원심분리하고 상층액을 0.22 μM Stericup 필터 유닛을 사용하여 여과하여 정화하였다.

DVD2166 + DVD2174 정제

DVD-IgG 단백질은 10 ml MabSelect Sure 컬럼 상에 정화된 상층액을 적용하여 정제하고 3 컬럼 부피(CV)에 대해 PBS, pH 7.4로 세척하였다. 0.1 M Na시트레이트 pH 3.6 단계 용출로 컬럼에서 단백질을 용출하고 2 M Tris-HCl, pH 8.5로 중화하였다. 단량체성 단백질은 PBS, pH 7.4로 평형화된 HiLoad 16x60 Superdex 200 pg 컬럼(Sigma)에 적용하여 단리하였다. 단량체성 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 멸균 여과하고 4℃에서 보관하였다.

BITS7201A 정제

10 mL MabSelect Sure 컬럼에 정화된 상층액을 적용하여 모 놉(parental knob) 및 단백질을 정제하고 3 CVs PBS, pH 7.4로 세척하였다. 0.1 M Na시트레이트 pH 3.6을 사용하여 컬럼에서 단백질을 용출하였다. 단백질을 중화하고 안정화하기 위해 샘플을 1 M 아르기닌/석시네이트 완충액, pH 8.7로 1:1 희석하였다. 이어서, 모 항체를 0.15 M 아세트산나트륨, 0.5 M 아르기닌 완충액, pH 8.5로 평형화된 HiLoad 26x60 Superdex 200 pg 컬럼(Sigma)에 적용하였다. 5 mM 시스테아민의 존재 하에 모 항체를 1:1 비율로 혼합하고 실온에서 밤새 인큐베이션함으로써 이중특이적 물질을 후속적으로 제조하였다. 제2 분취 겔 여과 단계는 PBS, pH 7.4로 평형화된 HiLoad 26x60 Superdex 200 pg 컬럼에 적용함으로써 교환된 이중특이적 물질로부터 임의의 고분자량 종을 제거하기 위해 수행되었다. 단량체 이중특이적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 멸균 여과하고 4℃에서 보관하였다.

결합 특성 비교

"UCBXXXX"로 칭하는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 결합하는 인간 IL-13, IL-17A, 및 IL-17F의 결합 동역학 및 선행 기술 항체는 표면 플라즈몬 공명(Biacore T200)에 의해 평가되었고 단일 실험 내에서 직접 비교되었다. 또한, IL-13에 대한 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 UCBXXXX 또는 비교기 분자의 결합이 IL-13 수용체와 IL-13 상호작용을 차단하는지 여부를 평가하기 위해 표면 플라즈몬 공명을 사용하였다.

염소 항-인간 IgG, F(ab')₂ 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)는 아민 커플링 화학을 통해 대략 5000 RU 수준으로 CM5 센서 칩에 고정되었다. 친화도 평가를 위해, 각 분석 주기는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 또는 비교기 이중특이성 분자를 항 F(ab')₂ 표면(50 내지 100 RU)에 포획, 분석물 주입(분당 30 μl의 유속으로 25℃에서 180초 동안)으로 이루어지며, 그 후 해리는 IL-13 및 IL-17A의 경우 1200초 동안 그리고 IL-17F의 경우 600초 동안 모니터링되었다. 각 주기의 말미에, 표면은 50 mM HCl의 60초 주입에 이어 5 mM NaOH의 30초 주입 및 50 mM HCl의 최종 60초 주입을 사용하여 10 μl/min의 유속으로 재생되었다. IL-13의 경우 10 nM 내지 0.3125 nM 그리고 IL-17A 및 IL-17F의 경우 5 nM 내지 0.156 nM 농도에서 HBS-EP+ 실행 완충액(GE Healthcare)에서 2배 연속 희석액으로 분석물을 주입하였다. IL-17A 및 IL-17F는 자체 제조된 반면 인간 IL-13은 R&D Systems으로부터 공급되었다. 기기 소음과 드리프트를 빼기 위해 완충액 블랭크 주입이 포함되었다.

동역학 파라미터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하여 1:1 결합 모델을 사용하여 결정되었다. 결과는 표 7에 요약되어 있다.

[표 7] IL-13, IL-17A 및 IL-17F에 대한 결합에 대한 동역학 상수의 비교.

IL-13Rα1 수용체 차단을 평가하기 위해, 각 항체 분자는 염소 항-인간 IgG, F(ab')₂ 표면(대략 50 내지 100 RU까지)에 포획된 다음, IL-13(10 μl/min에서 180초 동안 25 nM)을 주입하고 IL-13Rα1(R&D Systems, 10 μl/min에서 300초 동안 100 nM)을 주입하였다. 임의의 드리프트 또는 배경 반응을 빼기 위해 IL-13과 IL-13Rα1 둘 모두의 블랭크 주입이 포함되었다. 표 8에 요약된 바와 같이, UCBXXXX는 IL-13과 IL-13Rα1의 상호작용을 차단할 수 있었던 반면, BITS7210A, DVD2166 및 DVD 2174 분자는 차단하지 못했다.

[표 8] IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 및 비교기 분자에 의한 IL-13Rα1 수용체 차단.

IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 대한 결합을 차단하는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체의 능력을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 이 실험에서, 대략 260 RU의 UCBXXXX를 고정된 마우스 항 인간 CH1 항체(UCB 자체)에 포획한 후, IL-13(10 μl/min으로 180초 동안 25 nM)을 주입한 다음, IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2(R&D Systems, 10 μl/min으로 300초 동안 100 nM)를 주입하였다. 임의의 드리프트 또는 배경 반응을 빼기 위해 IL-13, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2의 블랭크 주입이 포함되었다. 결과는 UCBXXXX가 IL-13과 IL-13Ra1 및 IL-13Ra2 둘 모두의 상호작용을 차단할 수 있음을 입증하였다(표 9).

[표 9] IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체에 의한 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 수용체 차단.

논의

비교기 연구는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 UCBXXXX, 이중특이적 항체 BITS7210A, 및 이중 가변 도메인 항체 DVD2166 및 DVD2174가 IL-13에 높은 친화도로 결합할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 결합 상호작용의 특성은 매우 상이하였다. UCBXXXX는 IL-13과 IL-13-Rα1의 상호작용을 차단할 수 있었지만 BITS7210A, DVD2166 및 DVD2174는 차단하지 못했다.

비교기 연구는 다중 특이적 항체 UCBXXXX, 이중특이적 항체 BITS7210A, 이중 가변 도메인 항체 DVD2166 및 DVD2174가 IL-17에 결합할 수 있음을 추가로 입증하였다. 그러나, 다시 말해서, 결합 상호작용의 특성을 매우 상이했다. IL-17A에 대한 UCBXXXX의 결합 친화도는 BITS7210A 및 DVD 항체의 결합 친화도보다 유의하게 높았다. UCBXXXX 및 BITS7210A는 IL-17F와 유사한 친화도로 결합한 반면, DVD 항체는 IL-17F에 전혀 결합할 수 없었다.

이러한 항체의 존재 하에 IL-13과 IL-13Rα1 사이의 상호작용은 잠재적인 면역원성을 감소시키는 맥락에서 중요하다. 증거는 잠재적인 새로운 이중특이적 항체 치료제를 조사할 경우 면역원성, 특히 항약물 항체(ADA)의 생성을 면밀히 고려해야 한다는 것을 시사한다. ADA 생성의 주요 동인은 세포 표면에서 발현된 표적 항원과 치료 항체의 결합 및 후속 내재화이다(Schellekens, H., 2002; Clin Ther. 24(11):1720-40). 내재화된 치료 항체/표적 항원 복합체는 다양한 세포내 구획을 통해 트래피킹되고 세포 표면으로 다시 재순환되거나 분해될 수 있는데(St Pierre et al, 2011); 이는 항원 제시 분자 및 ADA 생성에 의한 펩타이드 제시로 이어질 수 있다.

이중특이적 항체 BITS7201A에서, 분자의 IL-13 F(ab) 부분은 항-IL-13 항체인 레브리키주맙과 동일하다(WO2015/127405A2의 실시예 6 참조). 레브리키주맙은 IL-13이 이의 수용체 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 결합하도록 허용하지만 IL-4Rα 수용체와의 상호작용을 차단하는 부위에서 IL-13에 결합하는 것으로 여겨진다(Popovic et al., 2017; J Mol Biol. 429(2):208-19). 이러한 특정 유형의 상호작용은 IL-13Rα2를 통한 항체/표적 항원/수용체 복합체의 내재화를 가능하게 하여 면역원성 반응의 가능성을 증가시킬 수 있다. I상 임상 시험에서, BITS7201A는 항약물 항체(ADA)의 높은 발병률과 관련이 있었고 임상 개발에서 제외되었다.

유사하게, 이중 가변 도메인 항체 DVD2166 및 DVD2174는 IL-13과 IL-13-Rα1의 상호작용을 차단할 수 없었다.

잠재적인 면역원성 위험을 완화하기 위해, UCBXXXX는 각각의 표적 항원 IL-13, IL-17A 및 IL-17F와 결합할 때 세포 상의 수용체와 상호작용하는 것을 방지하여 내재화, 분해 및 ADA 생성 가능성을 감소시키도록 특별히 설계되었다. 인간에서 UCBXXXX를 사용한 ADA의 발병률은 일단 임상 데이터가 이용 가능한 경우에만 확실하게 알 수 있을 것이다.

상기 생성된 데이터는 IL-13/IL-17AF 다중 특이적 항체 UCBXXXX가 효과적인 IL-13/IL-17 항체 치료제가 되기 위한 올바른 성질을 가지며 효능이 개선되고 면역원성 위험이 낮다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SRL <120> MULTI-SPECIFIC ANTIBODY WITH BINDING SPECIFICITY FOR HUMAN IL-13 AND IL-17 <130> PF0208-WO-PCT <150> GB 1919061.0 <151> 2019-12-20 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 1 Arg Ala Asp Glu Ser Val Arg Thr Leu Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 2 Leu Val Ser Asn Ser Glu Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 3 Gln Gln Thr Trp Ser Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Asn Met Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 5 Thr Ile Thr Tyr Glu Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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cggtttagtg ggtctggttc aggcactgat ttcagactga ccatatcatc tctacagcca 240 gaggacttcg ccacatatta ctgtcagcaa acctggagtg acccgtggac tttcggccag 300 ggcactaaag tagaaattaa a 321 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Tyr Glu Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Pro Gln Tyr Tyr Glu Gly Ser Ile Tyr Arg Leu Trp Phe 100 105 110 Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 10 gaagttcagc tggtcgagtc tggaggtggc cttgtccaac ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggatt cacgttttct gattacaata tggcttgggt tagacaggca 120 ccgggtaagg gccttgaatg ggttgcgacg attacatacg aaggcagaaa tacctattac 180 agggactcag taaaagggcg gtttaccata agccgagata atgctaaaaa cagtctgtat 240 ttgcaaatga acagcctacg agctgaagac actgccgtgt attactgcgc gagtccacct 300 cagtattatg aaggatcaat ctatcgcctc tggttcgcac attggggaca ggggaccctt 360 gtgacagtct cgagt 375 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 11 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Glu Ser Val Arg Thr Leu 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Val Ser Asn Ser Glu Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Arg Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Trp Ser Asp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 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attggggaca ggggaccctt 360 gtgacagtct cgagtgcgtc cacaaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420 aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480 ccagtgacgg tgtcgtggaa ctcaggtgcc ctgaccagcg gcgttcacac cttcccggct 540 gtcctacagt cttcaggact ctactccctg agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600 ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtcgat 660 aagaaagttg agcccaaatc ttgt 684 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 15 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Glu Asn Leu Asp 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 16 Tyr Thr Asp Ile Leu Gln Thr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 17 Tyr Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 18 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 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cagagtcact 60 ctcagttgca aagcaagtca gaatattaat gagaacttag actggtatca tcaaaagcat 120 ggcgaagctc caaaactcct gatatattat acagacattt tgcaaacggg catcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat tacacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg ccacatatta ctgctatcag tattacagtg ggtacacgtt tggacctggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 23 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Gly Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe His Tyr Asp Gly Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial 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Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala 260 265 270 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly 275 280 285 Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 290 295 300 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 305 310 315 320 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 325 330 335 Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln 340 345 350 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 370 375 380 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 385 390 395 400 Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp 405 410 415 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 435 440 445 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 450 455 460 Ala Thr Tyr 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aagaaagttg agcccaaatc ttgtagcggt ggcggtggca ccggaggtgg cggttcagaa 720 gtgcagttgc tggagtcagg tggagggctg gtgcagcccg gaggatcgct gcggttgtca 780 tgcgcggtgt ccggtattga tttgtccaat tacgccatca attgggtacg ccaagcgcca 840 gggaagtgcc ttgagtggat tggcatcatc tgggcgtcgg ggacgacctt ttatgctact 900 tgggccaaag gaagattcac aatctcccga gacaactcga agaacaccgt gtatcttcaa 960 atgaactcgc tcagggccga ggacacggcg gtctactact gtgcacggac agtgccgggt 1020 tattcaacgg caccttactt tgatctttgg ggccagggga ccctcgtgac tgtctcaagt 1080 ggaggtggcg gttctggcgg tggcggttcc ggtggcggtg gatcgggagg tggcggttct 1140 gatattcaga tgacgcaatc accttcgagc gtatccgcct cggtgggaga cagggtgaca 1200 atcacttgtc agtcatcccc ctcagtctgg agcaactttt tgtcatggta tcagcagaag 1260 cccggaaagg ctccgaaatt gctgatctac gaggcatcga agttgacgag cggtgtacca 1320 agcagattct ccggttcggg gtcgggaact gacttcaccc ttacgatctc atcgctgcag 1380 ccggaggatt ttgcgaccta ctactgtggg ggtgggtatt cgtcgatttc cgacacaaca 1440 ttcgggtgcg gcacgaaagt ggaaatcaag cgtacc 1476 <210> 61 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 61 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Glu Ser Val Arg Thr Leu 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Val Ser Asn Ser Glu Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Arg Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Trp Ser Asp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 225 230 235 240 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 245 250 255 Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 260 265 270 Met Gly Arg Ile Gly Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys 275 280 285 Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala 290 295 300 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Cys Ala Arg Phe His Tyr Asp Gly Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu 325 330 335 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 355 360 365 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 370 375 380 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Glu Asn Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 385 390 395 400 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Asp Ile Leu Gln 405 410 415 Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 420 425 430 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 435 440 445 Cys Tyr Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Glu Ile Lys Arg Thr 465 <210> 62 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 62 gcaatccagc tcacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga ccgtgtgact 60 attacctgta gagcggacga gtcggtcagg actctcatgc actggtatca acagaagcct 120 ggtaaagctc ctaaactgct catctatctg gtgtccaact cggagatagg tgtgccagat 180 cggtttagtg ggtctggttc aggcactgat ttcagactga ccatatcatc tctacagcca 240 gaggacttcg ccacatatta ctgtcagcaa acctggagtg acccgtggac tttcggccag 300 ggcactaaag tagaaattaa acgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gcagcggtgg cggtggctcc 660 ggaggtggcg gttcagaggt gcagctggtg cagtccggcg ccgaggtgaa gaagcccggc 720 tcctccgtga aggtgtcctg caaggcctcc ggctactcct tcacctccta ctacatccac 780 tgggtgaggc aggcccccgg ccagggcctg gagtggatgg gcaggatcgg ccccggctcc 840 ggcgacatca actacaacga gaagttcaag ggcagggcca ccttcaccgt ggacaagtcc 900 acctccaccg cctacatgga gctgtcctcc ctgaggtccg aggacaccgc cgtgtactac 960 tgcgccaggt tccactacga cggcgccgac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 1020 tccggaggtg gcggttctgg cggtggcggt tccggtggcg gtggatcggg aggtggcggt 1080 tctgacatcc agatgaccca gtccccctcc tccctgtccg cctccgtggg cgacagggtg 1140 accatcacct gcaaggcctc ccagaacatc aacgagaacc tggactggta ccagcagaag 1200 cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tacaccgaca tcctgcagac cggcatcccc 1260 tccaggttct ccggctccgg ctccggcacc gactacaccc tgaccatctc ctccctgcag 1320 cccgaggact tcgccaccta ctactgctac cagtactact ccggctacac cttcggccag 1380 ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacc 1407 <210> 63 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 63 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asp Glu Ser Val Arg Thr Leu 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Val Ser Asn Ser Glu Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Arg Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Trp Ser Asp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 225 230 235 240 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 245 250 255 Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp 260 265 270 Met Gly Arg Ile Gly Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys 275 280 285 Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala 290 295 300 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Cys Ala Arg Phe His Tyr Asp Gly Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu 325 330 335 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 355 360 365 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 370 375 380 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Glu Asn Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 385 390 395 400 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Asp Ile Leu Gln 405 410 415 Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 420 425 430 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 435 440 445 Cys Tyr Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Glu Ile Lys Arg Thr 465 <210> 64 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 64 gcaatccagc tcacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga ccgtgtgact 60 attacctgta gagcggacga gtcggtcagg actctcatgc actggtatca acagaagcct 120 ggtaaagctc ctaaactgct catctatctg gtgtccaact cggagatagg tgtgccagat 180 cggtttagtg ggtctggttc aggcactgat ttcagactga ccatatcatc tctacagcca 240 gaggacttcg ccacatatta ctgtcagcaa acctggagtg acccgtggac tttcggccag 300 ggcactaaag tagaaattaa acgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gcagcggtgg cggtggctcc 660 ggaggtggcg gttcagaggt gcagctggtg cagtccggcg ccgaggtgaa gaagcccggc 720 tcctccgtga aggtgtcctg caaggcctcc ggctactcct tcacctccta ctacatccac 780 tgggtgaggc aggcccccgg ccagtgcctg gagtggatgg gcaggatcgg ccccggctcc 840 ggcgacatca actacaacga gaagttcaag ggcagggcca ccttcaccgt ggacaagtcc 900 acctccaccg cctacatgga gctgtcctcc ctgaggtccg aggacaccgc cgtgtactac 960 tgcgccaggt tccactacga cggcgccgac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 1020 tccggaggtg gcggttctgg cggtggcggt tccggtggcg gtggatcggg aggtggcggt 1080 tctgacatcc agatgaccca gtccccctcc tccctgtccg cctccgtggg cgacagggtg 1140 accatcacct gcaaggcctc ccagaacatc aacgagaacc tggactggta ccagcagaag 1200 cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tacaccgaca tcctgcagac cggcatcccc 1260 tccaggttct ccggctccgg ctccggcacc gactacaccc tgaccatctc ctccctgcag 1320 cccgaggact tcgccaccta ctactgctac cagtactact ccggctacac cttcggctgc 1380 ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacc 1407 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 65 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 66 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 67 Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (30)

1. 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체로서,
   CDR-L1에 대해 서열번호 15에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 16에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
   CDR-H1에 대해 서열번호 18에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 19에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
   을 포함하는 IL-13 결합 부위를 포함하는 다중 특이적 항체.
2. 제1항에 있어서, IL-13 결합 부위는 서열번호 27에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
3. 제1항에 있어서, IL-13 결합 부위는 서열번호 31에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 32에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   CDR-L1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
   CDR-H1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
   을 포함하는 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 다중 특이적 항체.
5. 제4항에 있어서, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 a) 및 b)를 포함하는, 인간 IL-13, 인간 IL-17A 및/또는 인간 IL-17F에 결합하는 다중 특이적 항체:
   a) 하기 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬; 및
   V _H -CH ₁ -X-V ₁
   b) 하기 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬
   V _L -C _L -Y-V ₂
   상기 식에서,
   V_H는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
   CH₁은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
   X는 결합 또는 링커를 나타내고;
   Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
   V₁은 scFv, dsscFv, 또는 dsFv를 나타내고;
   V_L은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
   C_L은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
   V₂는 scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
   여기서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
   화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 사슬은 단백질 A에 결합하지 않는다.
7. 제6항에 있어서, V_L 및 V_H는 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
   V₂는 인간 IL-13에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
   V₁은 인간 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고;
   여기서,
   V_L은 CDR-L1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하고,
   V_H는 CDR-H1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하고;
   여기서,
   V₁은 CDR-L1에 대해 서열번호 39에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 40에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 CDR-H1에 대해 서열번호 42에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 43에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 44에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
   여기서,
   V₂는 CDR-L1에 대해 서열번호 15에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 16에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 CDR-H1에 대해 서열번호 18에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 19에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, V_L은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하고, V_H는 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, V₂는 서열번호 27에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, V₂는 서열번호 31에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 32에 제시된 서열을 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, V₁은 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 46에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, V₁은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, V₂의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 66에 제시된 서열을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
14. 제13항에 있어서, V₂는 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 scFv 또는 서열번호 37에 제시된 서열을 포함하는 dsscFv인 다중 특이적 항체.
15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, V₁의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고, 상기 링커는 서열번호 68에 제시된 서열을 포함하는 것인 다중 특이적 항체.
16. 제15항에 있어서, V₁은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하는 scFv 또는 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는 dsscFv인 다중 특이적 항체.
17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 서열번호 65에 제시된 서열을 포함하는 링커인 다중 특이적 항체.
18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, X는 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는 링커인 다중 특이적 항체.
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 57 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 61 또는 서열번호 63에 제시된 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 59에 제시된 서열 및 서열번호 63에 제시된 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 다중 특이적 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
23. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 운반하는 발현 벡터.
24. 제23항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 다중 특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 항체의 제조를 허용하는 조건 하에 제24항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 제조된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법.
26. 제25항에 있어서, 단백질 A 정제 단계를 포함하는 제조 방법.
27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
28. 제1항 내지 제21항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 항체 또는 약학적 조성물.
29. 제28항에 있어서, 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기 또는 호산구성 식도염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체 또는 약학적 조성물.
30. 아토피성 피부염, 만성 손 습진, 비강 미세용종증 또는 용종증, 음식 알레르기, 또는 호산구성 식도염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제27항에 따른 약학적 조성물을, 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

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