KR20220092565A - 활성제를 전달하기 위한 생체 적합성 중합체 약물 담체 - Google Patents

활성제를 전달하기 위한 생체 적합성 중합체 약물 담체 Download PDF

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크리스토프 토멘
마이클 학케배일
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Abstract

본 개시내용은 전달을 위한 담체로서 반응성 아지드 잔기에 의해 알파-아미노기에서 작용화된(이에 의해 페이로드 분자가 공중합체에 커플링됨) 측쇄-연결된 아미노산을 포함하는 생체 적합성 공중합체를 사용하여, 활성제 또는 활성제를 포획할 수 있는 킬레이트화제와 같은 페이로드 분자의 다중 복제물을 전달함에 관한 것이다. 공중합체는 일반적으로 세포 유형- 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기의 단일 복제물을 함유하도록 추가로 작용화된다.

Description

활성제를 전달하기 위한 생체 적합성 중합체 약물 담체
본 발명은 활성제가 직접적으로 또는 링커 분자를 통해 결합되는 측쇄-연결된 아미노산을 포함하는 생체 적합성 공중합체를 전달용 담체로서 사용하는 활성제, 예를 들어 약물 물질의 전달에 관한 것이다.
암은 인간의 건강에 대한 주요 위협 중 하나이며, 그의 가능성이 연령의 함수라는 사실을 감안할 때 인구의 고령화와 함께 발병 건수는 증가할 것이다. 버거(Berger, NA) 등의 문헌[(2006) Cancer in the Elderly, Transactions of the American Clinical and Climatological Association 117: 147-156]; 얀식(Yancik, R)의 문헌[(2005) Cancer J. 11: 437-41]. 최근 몇 년 동안, 종양 치료법은 모노클로날 항체와 같은 종양-특이적 약제의 사용으로 인해 엄청나게 개선되었다. 이들 항체는 표피 성장인자 경로(EGFR)와 같은 증식 신호를 차단하거나[세툭시맙(Cetuximab), 에르비툭스(Erbitux)®, 메르크 카가아(Merck KGaA)/파니투무맙(Panitumumab), 벡티빅스(Vectibix)®, 암젠(Amgen)/트라스투주맙(Trastuzumab), 헤르셉틴(Herceptin)®, 로슈(Roche)], 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 경로를 표적화함으로써 새로운 혈관 형성을 방지하여[베바시주맙(Bevacizumab), 아바스틴(Avastin)®, 로슈], 종양 성장을 늦춘다. 그들의 표적 항원은 일반적으로 종양 조직에서 과발현되기 때문에 건강한 세포는 덜 손상되며, 따라서 항체 요법은 기존의 세포 독성제에 비해 표적-외 효과가 적다. 조(Zhou, Q.)의 문헌[(2017) Biomedicines 5(4)]; 라이헤르트(Reichert, JM)의 문헌[(2017) MAbs 9: 167-181]. 항체의 독특한 특이성은 세포 독성 약물을 종양 세포에 표적화하는 것을 목표로 하는 조합 접근법에서도 이용되었다. 이러한 소위 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 항체 또는 세포 독성제를 사용한 단일 요법보다 우수한 것으로 입증되었다. ADC 개념은 1960년대부터 알려졌지만 비교적 최근에야 제약 산업에서 관심을 받았으며, 60개보다 많은 ADC가 임상 실험을 진행하고 있다. 물라드(Mullard, A)의 문헌[(2013) Nat Rev Drug Discov 12: 329]; 벡(Beck, A) 등의 문헌[(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337].
ADC의 1세대는 항체의 자유 아미노기를 사용하여 세포 독성 약물과 약물 링커 구성물을 부착시켰다. 항체당 최대 80개의 자유 아미노기가 있어서, 이들의 무차별적인 작용화는 항체의 결합 계면에 세포 독성 약물이 의도하지 않게 부착되어 서로 다른 약물 대 항체 비율(DAR) 및 친화성을 갖는 매우 이질적인 ADC 종을 생성시킨다. DAR에 관련된 이질성은 반응에 사용되는 약물 및 항체의 화학량론을 조정함으로써 어느 정도 제한될 수 있다. 부위-특이성과 관련하여, 이질성은 제 1 임상 실험이 수행되었을 때 화학적 접근성에 의해서만 제한되었다. 1세대 ADC가 FDA 승인을 받는 데 20년이 더 걸렸다. ADC의 개발은 30개의 ADC가 반응성 그룹에 들어간 이후 극적으로 증가하였다. 상기 이질성은 또한 1세대 ADC의 주요 문제이자 규제 문제였다. 야오(Yao, H) 등의 문헌[(2016) Int J Mol Sci 17(2): 194]. 또한, 1세대 ADC는 중요한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 마우스 면역글로불린을 기반으로 하였다. 이러한 단점 때문에 1세대 ADC는 기존 치료법에 비해 많은 개선을 나타내지 못했고, 최초의 FDA-승인 ADC인 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)[마일로타르그(Mylotarg)®]은 2010년 화이자(Pfizer)가 자발적으로 시장에서 철수시켰다. 벡 등의 문헌[(2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315-337]; 벡 등의 문헌[(2010) Discov Med 10(53): 329-39].
2세대 ADC는 인간화 항체의 유리 티올기를 표적화함으로써 상기 어려움을 완화하였다. 이러한 유리 티올기는 항체의 힌지 영역에서 4개의 쇄간 디설파이드 브릿지(bridge)의 온화한 환원(예: 1,4-디티오트레이톨(DTT) 사용)에 의해 커플링 반응 전에 생성되었다. 이 전략을 사용하면 가능한 부착 부위를 8개로 줄여 ADC의 균질성을 높일 수 있다. 쇄간 디설파이드 결합이 항체 무결성에 중요한 역할을 한다는 사실을 감안할 때, 항체 안정성에 대한 부정적인 영향으로 인해 종종 더 높은 균질성이 희생되었다. 디설파이드 브릿지 무결성을 보존하는 보다 특이적인 링커가 설계되었지만[예컨대, 쇼낙(Shaunak, S) 등 (2006) Nat Chem Biol 2(6): 312-3 및 발란(Balan, S) 등 (2007) Bioconug Chem 18(1): 61-76에 자세히 기재된 바와 같음], 생성된 ADC는 일반적으로 약 3 내지 4인 낮은 DAR을 겪었다. 약물 로드가 더 증가하면, 항체의 안정성이 부정적인 영향을 받아 혈류에서 빠르게 제거되었다. 또한, 종양 세포-특이적 표적에 대한 항체의 친화력에 부정적인 영향을 미쳤다. 벡 등의 문헌[(2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315-337]; 야오 등의 문헌[(2016) Int J Mol Sci 17(2): 194.]; 벡 등의 문헌[(2010) Discov Med 10(53): 329-39]. 소수의 세포 독성 물질만이 이들 항체에 결합되었기 때문에, 독소루비신과 같은 기존의 세포 독성제는 종양 세포를 죽이는데 불충분하게 효과적인 것으로 판명되었다. 톨처(Tolcher, AW)의 문헌[(1999) J Clin Oncol 17(2): 478-478]. 따라서, 세포 독성이 몇 차수 더 높은 새로운 종류의 세포 독성제를 사용해야 했다. 이러한 물질의 예로는 메르탄신(DM1) 또는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)와 같은 미세소관 억제제가 있다. 벡 등 (2017). 이러한 강력한 약물 물질의 경우, 약물 물질이 ADC의 표적 부위에서만 방출되도록 하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 심각한 부작용이 발생할 수 있다. 따라서, 약물과 항체 사이의 링커가 중요한 역할을 한다. 트라스투주맙 엠탄신[캐드실라(Kadcyla)®, 로슈(Roche)] 및 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin)[애드세트리스(Adcetris)®, 테카다 파마슈티칼(Tekada Pharmaceutical)] 및 머사나 컨셉(Mersana concept)[머사나 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Mersana Therapeutics Inc.)(매사추세츠주 케임브리지)]과 같이 최근에 판매된 ADC는 시스테인-함유 단백질, 특히 혈청 알부민과 반응하는 것으로 알려진 말레이미드-기반 링커를 사용한다. 앨리(Alley, SC) 등의 문헌[(2008) Bioconjug Chem 19(3): 759-765]. 쉔(Shen, BQ) 등의 문헌[(2012) Nat Biotechnol 30(2): 184-9].
소위 3세대 ADC는 항체에 대한 약물의 부위-특이적 커플링을 이용하였다. 눈에 띄는 예는 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)의 바다툭시맙 테일리린(Vadatuximab tailirine)이다. ADC는 DNA를 가교시켜 세포 분열을 차단하고 세포 사멸을 유발할 수 있는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체의 커플링에 사용되는 두 중쇄의 위치 239에 유전자 조작된 시스테인을 함유한다. ADC는 1상 연구에서 성공적으로 시험되었으며, 현재 3상 임상 실험 중이다. 벡 등 (2017); 케네디(Kennedy, DA) 등의 문헌[(2015) Cancer Res 75(15 Supp.), Abstract DDT02-04]. 항체에 대한 약물의 부위-특이적 커플링의 다른 예는 "알데히드-태그(aldehyde-tag)"[레드우드 바이오사이언시즈(Redwood Biosciences), 카탈렌트(Catalent)] 또는 "소르타제 태그(sortase tag)"{SMAC-테크놀로지(SMAC-Technology)™, NBE 쎄라퓨틱스(NBE Therapeutics); 스테판(Stefan, N) 등의 문헌[(2017) Mol Cancer Ther 16(5): 879-892]}와 같은 스마트 태그를 이용한다. 후자의 두 가지 접근 방식은 항체에 유전자 조작된 펩티드 태그를 도입하여 효소 커플링 반응에 대한 특정 모티브(motive)로서 작용시킨다. 3세대 ADC는 안정성이 향상된 보다 균질한 생성물을 제공하지만, 여전히 항체당 몇 가지 독성 물질만 전달한다.
이러한 한계를 피하기 위해, 최근 머사나 쎄라퓨틱스에서 중합체 담체를 사용하는 새로운 접근 방식을 개발하였다. 이 개념은 몇 가지 세포 독성 약물 분자로 분해성 담체 중합체["플렉시머(Fleximer)"라고 함]를 작용화시킴에 기초를 둔다. 약물-로딩된 중합체는 후속적으로 통상적인 링커 화학에 의해 모노클로날 항체에 커플링된다. 이를 통해 DAR은 항체 분자당 12 내지 15개의 약물 분자로 증가할 수 있으며, 이 약물 분자는 3 내지 5개의 부착된 중합체 담체에 걸쳐 분포되어 있다. "Non-clinical pharmacokinetics of XMT-1522, a HER2 targeting auristatin-based antibody drug conjugate"; 워싱턴 DC에서 열린 미국 암 연구 협회(AACR) 연례 회의에서의 포스터 프레젠테이션, 2017. 이 접근 방식은 많은 이점을 갖지만, 생성된 ADC는 가변적인 쇄 길이와 약물 로드를 갖는 플렉시머 중합체를 함유한다. 사용된 티올-말레인이미드 링커 화학에 따라, ADC의 분자량이 어느 정도 변한다. 또한, 플렉시머 중합체는 생분해성 에스테르 결합을 포함하여 장기 저장 및/또는 혈청 안정성 문제를 제기한다. 코이트카(Koitka, M) 등의 문헌[(2010) J Pharm Biomed Anal 51(3): 664-78]; 리(Li, B) 등의 문헌[(2005) Biochem Pharmacol 70(11): 1673-84].
항체에 덧붙여, 압타머를 비롯한 다른 표적-특이적 제제도 대사 질환 및 암을 치료하기 위하여 비정상적인 경로를 차단하거나 활성화하도록 정교화되었다. 압타머는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 의해 형성된 한정된 3차원 구조를 가진 작은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다. 잘 정의된 구조로 인해, 이들은 세균 독소 또는 세포 표면 마커와 같은 분리된 작은 분자를 포함하는 특정 표적에 높은 친화력으로 결합될 수 있다. 머시어(Mercier, MC) 등의 문헌[(2017) Cancers (Basel) 9(6): E69]; 러시토(Ruscito, A) 등의 문헌[(2016) Front Chem 4:14]. 압타머는 항체보다 훨씬 작고 생산하기 쉽고 면역원성을 갖지 않는다. 레이 (Ray, P) 등의 문헌[(2013) Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 61(4): 255-271]; 페이(Pei, X) 등의 문헌[(2014) Mol Clin Oncol 2(3): 341-348]; 조우(Zhou, G) 등의 문헌[(2016) Oncotarget 7(12):13446-63]. 이들은 일반적으로 반복적인 결합, 세척 및 증폭 단계를 포함하는 농축 과정에서 최대 1015개의 무작위적인 폴리뉴클레오티드 풀로부터 생성된다. 각 사이클 후에, 가장 높은 표적 친화도를 가진 압타머가 다음 사이클에 선택된다. 이렇게 하여, 10 내지 12 사이클 후에 나노- 또는 심지어 서브-나노몰 범위의 결합 친화도를 갖는 분자를 선택하게 된다. 이 과정은 SELEX(지수 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)라고도 한다. 조우 등 (2016). 항체와 유사하게, 최초의 치료용 압타머 접근법은 주요 단백질, 수용체 또는 대사산물과의 상호작용을 통해 질병-관련 경로를 차단하는 것을 목표로 하였다. 대표적인 예로 2004년 시장에 진입한 최초의 FDA-승인 압타머 치료제인 마쿠겐(Macugen)®[페갑타닙(Pegaptanib); 아이테크 파마슈티칼즈(EyeTech Pharmaceuticals), 화이자]이 있다. 마쿠겐®은 27개 뉴클레오티드 길이의 RNA 압타머이며, 실명을 유발하는 심각한 안과 질환인 노화-관련 황반변성(AMD)에 사용된다. AMD는 증가된 성장 인자 수준으로 인한 비정상적인 혈관 형성이 특징이다. 마쿠겐®의 표적은 혈관 신생을 담당하는 성장 인자인 VEGF165[동형 단백질(isoform)]이다. 이 압타머는 빠른 신장 제거 및 분해로 인해 반감기가 짧기 때문에, 전체 크기를 증가시키기 위해 40kDa PEG 중합체에 결합되었다. 또한, 뉴클레아제에 의한 분해를 피하기 위해 일부 뉴클레오티드를 2'-플루오로-피리미딘 및 2'-O-메틸-퓨린으로 치환하였다. 비아기(Biagi, C) 등의 문헌[(2014) Eur J Clin Pharmacol 70(12): 1505-12]; 포자로스카(Pozarowska, D) 등의 문헌[(2016) Cent Eur J Immunol 41(3): 311-316]. 항-VEGF 항체{예: 베바시주맙, 아바스틴®, 로슈)와 달리, 마쿠겐®은 전신 투여에서 낮은 성능으로 인해[아마도 우회 경로(예: PDGF-B)에 의한 효과 손실로 인해] 암 치료에 사용되거나 허가된 적이 없다. 알바레즈(Alvarez, RH) 등의 문헌[(2006) Mayo Clin Proc 81(9): 1241-57]. 최근 몇 년간 개선된 사항에 따라, 세포 독성제를 표적화 및 차단하기 위해서 뿐만 아니라 세포 독성제의 담체로서 압타머를 사용하려는 여러 시도가 있었다. 바갈콧(Bagalkot)과 동료들은 압타머-독소루비신 착체를 개발하였다. 그러나, 이 착체는 낮은 로딩 효율과 빠른 전신 제거로 어려움을 겪었다. 바갈콧 등의 문헌[(2006) Angew Chem Int Ed 45(48): 8149-8152]. 2010년에는, 도세탁셀/시스플라틴이 로딩된 PLGA-PEG 나노입자를 기반으로 하는 다른 접근 방식이 개발되었다. 종양 세포막 단백질을 표적화하는 압타머인 A10으로 작용화시킴으로써 이들 입자를 전립선암 세포로 유도하였다. 이 다소 복잡한 약물 전달 시스템은 적어도 시험관 내 실험에서 유망한 결과를 보여주었다. 콜리쉐티(Kolishetti, N) 등의 문헌[(2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(42): 17939-17944]. 압타머는 siRNA(일반적으로 특정 유전자 발현을 억제하도록 설계된 짧은 간섭 RNA)와 같은 여러 뉴클레오티드-기반 치료제의 전달을 위해 추가로 시험되었다. 츄(Chu, TC) 등의 문헌[(2006) Nucleic Acids Res 34(10): e73]. 종양 치료를 위해 압타머의 표적화 능력을 활용하는 다양한 접근법의 개발에도 불구하고, 현재까지 압타머는 열악한 로딩 용량, 혈청 불안정성 및 빠른 신장 제거로 고통받고 있으며, 이러한 모든 특성은 임상 적용을 제한한다. 이러한 압타머-약물 컨쥬게이트 또는 착체 중 어느 것도 임상 3상 또는 시장에 진입하지 못하였다. 조우 등 (2016).
위에서 언급한 단점을 극복하고 각각의 표적에 대한 항체/압타머 친화성을 동시에 유지하면서 약물 대 항체/압타머 비율(DAR)을 증가시키기 위해, 생체 적합성, 친수성, 비-분해성 공중합체를 활성제의 담체로 활용하는 새로운 전략이 개발되었다. 중합체는 다수의(한도 내에서, 임의의 바람직한 수의) 활성제 분자를 보유하도록 제조될 수 있다. 공중합체는 종양-표적화 잔기, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 압타머에 커플링될 수 있다. 이러한 커플링은 활성제 또는 다른 페이로드(payload)를 공중합체에 로딩하기 전 또는 후에 발생할 수 있다. 높은 친수성으로 인해, 공중합체는 각 항체/압타머의 약동학적 특성을 유지하면서 고도로 소수성인 세포 독성 약물도 운반할 수 있다.
본 개시내용에 제시된 접근법은 항체 또는 압타머 분자에 다수의 활성제 분자를 결합하는 데 단지 하나의 커플링 부위가 필요하다는 이점을 갖는다. 항체 중쇄의 C-말단에서 펩티드 태그에 대한 효소적 커플링 반응과 같은 부위-특이적 커플링 방법을 이용함으로써, 활성제-함유 공중합체가 항체의 결합 계면에서 적절한 거리에 위치하게 된다. 이 접근법을 이용하면 표적 조직에 대한 최대 친화도가 보존될 뿐만 아니라 비교적 균질한 생성물이 얻어진다. 선택한 연결 전략은 공중합체와 항체/압타머 사이에 안정적인 펩티드 결합을 형성하고, 이는 혈류에서 ADC의 높은 안정성을 보장한다. 또한, 선택된 공중합체 설계는 동일한 공중합체 분자에 2개 이상의 상이한 활성제의 커플링을 촉진하여 조합 요법을 가능하게 한다. 일단 활성제(예를 들어, 암과 관련하여 세포 독성 약물)가 표적 세포, 예를 들어 종양 세포 내부에서 방출되고 표적화 잔기(예를 들어, 항체 또는 압타머)가 분해되면, 비교적 작은 공중합체는 신장 제거에 의해 신체에서 제거되는 것으로 생각된다.
본 개시내용은 제 1 페이로드 분자의 다중 분자를 함유하는 공중합체 분자 뿐만 아니라 이 공중합체의 제조 방법에 관한 것이다. (a) (1) 아지드 잔기를 함유하는 하기 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키고; (b) 일반적으로 클릭-반응성 기로 작용화된 제 1 페이로드 분자를, 전형적으로는 클릭 반응을 통해 단계 (a)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 커플링시킴으로써, 페이로드-운반 공중합체를 제조한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이고;
L은 생리학적 조건하에서 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 링커/스페이서이다.
용어 "아미노산 잔기"는 그의 반응성 측쇄를 통해 아크릴 잔기에 커플링되고 작용화되거나 작용화되지 않은 알파-아미노 및 알파-카복시 작용기를 함유하는 아미노산을 지칭한다. 용어 "아지드 잔기"는 아지도 기를 지칭한다.
바람직하게는, X 잔기는 그의 -NH-, -O-, 또는 -S- 기를 통해 C(O)- 잔기에 부착된다.
본 발명의 범위 내에서, "자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템"은 특별히 제한되는 것을 의미하지 않으며, 당업자에게 공지된 임의의 이들 시스템이 사용될 수 있다. 예는 본원에 기재되어 있다. 이 용어는 또한 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 UV 선의 사용을 포함함을 의미한다.
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-이면 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 또한 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
상기 반응 혼합물은 하기 화학식 II의 공동-주요 단량체 및/또는 하기 화학식 III의 공동-주요 단량체를 추가로 포함할 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00002
[상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며; Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이다]
[화학식 III]
Figure pct00003
[상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이다].
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-이면 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
화학식 I의 예시적인 절단될 수 없는 링커/스페이서 L은 -CO-CnH2n(n은 1 내지 10임) 또는 -CO-PEGn(n은 1 내지 14임)일 수 있다. 바람직하게는, PEGn은 본원에서 화학식 -(OCH2CH2)n- 또는 -(CH2CH2O)n-에 따른 잔기로서 이해된다. 화학식 I의 절단될 수 있는 링커/스페이서 L은 카텝신 B-민감성 링커, 예를 들어 디펩티드 링커, -CO-발린-시트룰린-PABC 또는 이의 변형체, 발린-라이신, 발린-알라닌, 발린-아르기닌, 또는 트리펩티드 링커, 예를 들어 글루타메이트-발린-시트룰린, 히드라존 또는 시스-아코니틸-기반 링커와 같은 pH-민감성 링커, 피로포스페이트 디에스테르와 같은 리소좀 트래피킹 및 절단용 링커를 포함한다. PABC는 파라-아닐린-베타-카바메이트이다. 변형체는 바람직하게 시트룰린이 다른 아미노산 잔기로 대체된 잔기로서 정의된다.
화학식 I 뿐만 아니라 화학식 II 및/또는 화학식 III의 단량체를 포함하는 공중합체는 2개의 상이한 페이로드로 충전될 수 있다. 일반적으로 클릭-반응성 기로 작용화된 제 1 페이로드는 화학식 I의 단량체의 아지드 잔기와 반응한다. 적합한 반응성 기를 포함하도록 일반적으로 유도체화된 제 2 페이로드는 화학식 II 및 화학식 III의 단량체의 아미노산 잔기의 알파-아미노 또는 알파-카복시기에 결합된다. 이는, 화학식 II 및/또는 화학식 III의 단량체의 적어도 일부에서, 화학식 II의 단량체에서 알파-아미노 또는 알파-카복시기 또는 작용화되지 않은(유리), 즉 Y 또는 Z 중 하나 또는 둘 모두가 H이고/이거나, 화학식 III의 단량체에서 Z가 H일 것을 필요로 한다. 단계 (a)의 공중합체는 먼저 제 1 페이로드로 로딩되고 이어서 제 2 페이로드로 로딩될 수 있다. 다르게는, 단계 (a)의 공중합체는 먼저 제 2 페이로드로 로딩되고 이어서 제 1 페이로드로 로딩될 수 있다. 따라서, 페이로드-운반 공중합체의 제조는 중합 단계 (a), 커플링 단계 (b) 및 반응성 기를 함유하는 제 2 페이로드 분자가 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체에 커플링되는 추가 단계를 포함한다. 마지막 단계는 단계 (b) 이전 또는 이후에 이루어질 수 있다.
활성제의 구조에 따라, 활성제 분자는 공중합체에서 화학식 I의 공동-주요 단량체의 아지드기 또는 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체의 알파-아미노 또는 알파-카복시기와 직접적으로 또는 링커 구조를 통해 간접적으로 반응할 수 있다. 상기 링커는 세포 독성 약물의 의도하지 않은 방출을 피하기 위해 저장 동안, 또한 혈류에서 안정해야 한다. 링커는 특정 세포내 효소에 의해 절단될 수 있거나, 또는 "비-분해성" 유형일 수 있으며 리소좀 및 퍼옥시좀의 가혹한 환경에서만 파괴된다.
바람직한 실시양태에서, (단계 (a)의) 공중합체는 공중합을 제어하기 위한 RAFT제를 추가로 포함하는 반응 혼합물의 중합에 의해 제조된다. RAFT제는 2 내지 30 단위의 단분산 스페이서를 포함할 수 있다. 또한, RAFT제는 예를 들어 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기의 공중합체로의 부착을 위해 사용될 수 있는 반응성 기를 특징으로 할 수 있다. 상기 반응성 기는 티올, 알데히드, 알킨, 아지드, 아민, 카복실, 에스테르, 디아지린, 페닐 아지드, 티오에스테르, 디아조, 슈타우딩거(Staudinger) 반응성 포스피노에스테르(또는 포스피노티오에스테르), 히드라진, 옥심, 아자-마이클(aza-Michael) 라이게이션을 수행하기 위한 아크릴레이트, 또는 효소적 커플링 반응에 사용될 수 있는 모티프일 수 있다. 모티프는 2 내지 8개의 아미노산을 포함하는 올리고-글리신일 수 있으며, 이 펩티드 모티프는 소르타제-매개 커플링 반응, 트랜스글루타미나제 반응성 기질, 알데히드 태그, 자가촉매 인테인 서열 또는 클릭-반응성 기를 가능하게 한다. 다르게는, RAFT제는 중합 후에 전환되어, 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기를 공중합체에 부착하기 위한 반응성 기를 제공할 수 있다. 일반적으로 중합 및/또는 작용화가 완료되면 이에 의해 열 처리, 적합한 아민과의 반응(아미노 분해), 또는 인 옥소산의 존재하에 개시제 분자와 또는 인 옥소산의 부재하에 과량의 개시제와의 새로운 반응에 의해 RAFT 기의 제거가 수행되어, RAFT제가 불활성화된다.
공중합체의 제조(단계 (a))는 또한 두 개의 연속적인 중합 반응을 포함할 수 있다. 제 1 반응 혼합물은 아미노산 기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 중합가능한 주요 단량체, 공중합을 제어하기 위한 RAFT제, 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함할 수 있으며, 중합은 RAFT 예비중합체를 생성시킨다. 제 2 중합 반응은 제 1 중합 반응의 RAFT 예비중합체, 화학식 I의 공동-주요 단량체 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 제 2 반응 혼합물에서 수행된다. 제 2 반응 혼합물은 화학식 II 및 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체 및/또는 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 중합 가능한 주요 단량체를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 공중합체는 전형적으로 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기로 추가로 작용화된다. 표적화 잔기는 제 1 및/또는 제 2 페이로드 분자와의 작용화 이전 또는 이후에, 즉 단계 (b) 또는 제 2 페이로드 분자를 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체에 커플링함을 포함하는 단계 이전 또는 이후에 공중합체에 부착될 수 있다.
잠재적인 표적화 잔기는 모노클로날 항체, 항체 단편, 나노체(단일-도메인-항체), DARPin(설계된 안키린 반복 단백질), 펩티드 호르몬, 종양 세포 표면에서 발현되는 단백질에 결합하는 단백질, DNA- 또는 RNA-기반 압타머, 또는 종양 세포에서 과발현되는 것으로 알려진 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 소분자(예: 엽산 또는 비오틴)이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 표적화 잔기의 공유 부착은 일반적으로 공중합체의 헤드 기(일반적으로 RAFT제를 통해 또는 언급된 RAFT제의 전환에 의해 도입됨)의 반응성 기를 포함하는 부위-특이적 방식으로 수행된다. 적합한 커플링 전략은, 클릭 반응의 "상대 부분"을 포함하는 세포 유형-특이적 표적화 잔기 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기를 결합하는 데 후속적으로 사용되는 공중합체의 헤드 기에서 반응성 기(예: [3+2] 고리 첨가의 경우 변형 알킨 또는 [4+2] 고리 첨가의 경우 변형 알켄)를 사용하는 소위 "클릭-화학 반응"을 포함한다. 위에서 언급한 클릭 반응의 반응성 부분은 호환적이라는 의미이다. 페이로드 분자로 공중합체를 변형시키고 표적화 잔기를 공중합체에 부착하는 데 이용되는 "클릭 반응"은 직교 상용성 클릭 반응, 예를 들어 [3+2] 고리 첨가 반응과 [4+2] 고리 첨가 반응의 조합을 이용하여 순차적 방식으로 또는 "병렬로" 수행될 수 있다.
일반적으로 클릭 반응의 상대 부분으로 표적화 잔기를 변형시키는 것은 예를 들어 트랜스글루타미나제-매개 또는 소르타제-매개 커플링과 같은 효소적 커플링 기술의 사용에 의해, 또는 합성 동안 또는 합성 후 표적화 잔기 내로 비-규범적(비천연) 아미노산을 통합함으로써, 부위-유도 방식으로 수행되어야 한다.
상이한 실시양태에서는, 효소적 커플링 반응을 또한 이용하여, 다중 페이로드 분자를 함유하는 공중합체로 세포- 또는 조직-유형 특이적 표적화 잔기를 직접 변형시킬 수 있다. 이는 소르타제-매개 커플링을 위한 올리고-글리신, 알데히드 태그 또는 트랜스글루타미나제 태그와 같은 적절한 태그로 중합체의 헤드 기를 변형시킴으로써 수행된다. 트랜스글루타미나제-매개 반응의 경우, 적합한 연쇄 이동제에 의해 도입된 공중합체의 헤드 기는 반응성 라이신(또는 글루타민) 잔기를 함유하는 펩티드 모티프 또는 비-펩티드 모티프, 예를 들어 말단 아미노기를 함유하는 링커 구조체를 포함할 수 있다. 상기 헤드 기 변형은 특히 높은 회전율로 비-펩티드 모티프를 수용하는 것으로 알려진 미생물 트랜스글루타미나제와 함께 사용될 수 있다.
페이로드 분자는 활성제 또는 킬레이트화제일 수 있다. 페이로드가 킬레이트화제인 본 개시내용의 페이로드-운반 공중합체의 경우, 공중합체는 킬레이트화제에 의해 포획될 수 있는 활성제로 항온처리되거나 활성제에 노출된다. 바람직하게는, 공중합체가 활성제에 노출되는 상황은 본원에 개시된 바와 같이 공중합체를 활성제와 접촉시키는 것을 지칭한다. 페이로드 분자로서 킬레이트화제의 사용은 진단 또는 치료 사용 직전에 페이로드-운반 공중합체에 결합될 수 있는 수명이 짧은 방사성 동위원소의 경우에 특히 유리할 수 있다.
명확하게 하기 위해, "화학식 I의 공동-주요 단량체", "주요 단량체", "화학식 II의 공동-주요 단량체", "RAFT제" 및 "개시제 시스템"과 같은 상기 및 청구범위에서 사용된 용어는 그 유형의 분자 수를 의미하지 않는다. 단수는 또한 복수를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "화학식 I의 공동-주요 단량체"라는 용어는 화학식 I의 요건을 충족하는 하나 이상의 화학적으로 상이한 화합물의 양의 존재를 나타내는 것을 의미한다.
다중 페이로드 분자를 운반하는 전술한 임의의 공중합체에서, 공중합체는 5,000달톤 내지 80,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 공중합체의 평균 분자량은 5,000달톤 내지 40,000달톤이다. 가장 바람직하게는, 공중합체는 5,000달톤 내지 20,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 이러한 분자량은 결합된 표적화 잔기의 중량을 포함하지 않는다. 본 발명에서 공중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 공지된 분자량 표준(본원에서는 상이한 풀룰란 중합체)과 비교하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)/겔 투과 크로마토그래피(GPC)의 측정을 기반으로 계산된 수평균 분자량으로서 이해된다. 자세한 내용은 실시예 13에 제시된 방법을 참조한다. 다르게는 또는 추가적으로, 다중 페이로드 분자를 보유하는 상기 기재된 임의의 공중합체에서, 공중합체 분자의 적어도 80%(w)는 5,000달톤 내지 80,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 공중합체 분자의 적어도 80%(w)는 5,000달톤 내지 40,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 가장 바람직하게는, 공중합체 분자의 적어도 80%(w)는 5,000달톤 내지 20,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 따라서, 마지막 단락에 제시된 백분율 부분은 공중합체의 다분산 지수(PDI)의 결과이다. 다분산 지수(PDI) 또는 불균일 지수라고도 하는 분산도(đ)는 주어진 중합체 샘플에서 분자 질량 분포의 척도이다. 중합체의 đ(PDI)는 PDI 식 Mw/Mn에 의해 정의되며, 여기에서 Mw는 공지된 중합체를 참조 표준으로 사용하여 겔 투과 크로마토그래피로 측정한 중량 평균 분자량이고, Mn은 수평균 분자량이다. 분산도는 중합체의 배치(batch)에서 개별 분자 질량의 분포를 나타낸다. 본 발명에서 공중합체의 PDI는 전형적으로 1.03 내지 1.4 범위, 바람직하게는 1.05 내지 1.35 범위, 보다 바람직하게는 1.1 내지 1.30 범위, 가장 바람직하게는 1.15 내지 1.25 범위이다. PDI는 달리 명시되지 않는 한 실시예 13에 제시된 방법을 특징으로 한다.
바람직하게는, 화학식 I의 공동-주요 단량체를 유일한 공동-주요 단량체로서 함유하는 공중합체에서, 공동-주요 단량체의 평균 갯수는 2 내지 12개이다. 보다 바람직하게는, 공중합체는 평균적으로 2 내지 8개의 공동-주요 단량체, 가장 바람직하게는 2 내지 6개의 공동-주요 단량체를 함유한다. 작용화되지 않은 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체를 또한 함유하는 공중합체의 경우, 모든 공동-주요 단량체의 바람직한 평균 갯수는 10 내지 50개이다. 10 내지 40개의 평균 공동-주요 단량체 갯수가 보다 바람직하고 10 내지 30개의 평균 공동-주요 단량체 갯수가 가장 바람직하다. 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체가 페이로드 분자로 작용화되는 경우, 모든 공동-주요 단량체의 바람직한 평균 갯수는 4 내지 20개이다. 더 바람직한 것은 4 내지 15개의 평균 공동-주요 단량체 갯수이고, 가장 바람직한 것은 4 내지 10개의 평균 공동-주요 단량체 갯수이다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 용어 "작용화된"은 화학식 II 및/또는 화학식 III의 단량체(들)에 대한 제 2 페이로드 분자(들)의 부착에 관한 것이다. 단량체가 작용화되지 않는 경우, 이들이 제 2 페이로드 분자(들)를 함유하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말해서, 제 2 페이로드 분자(들)가 그에 부착되지 않는다.
본 개시내용의 공중합체에 함유된 페이로드 분자가 활성제인 경우, 이 활성제는 미세소관 억제제, 삽입제, 알킬화제, 대사길항제, 호르몬 또는 호르몬 수용체 조절제, 티로신 키나제 억제제, 유전자 또는 각각의 메신저 RNA를 방해할 수 있는 폴리뉴클레오티드-기반 약물, 단백질-기반 세균 독소, 전구약물 요법에 적합한 효소(ADEPT 개념), 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 활성제는 또한 소분자 형광단, 단백질/펩티드-기반 형광단, 근적외선(NIR) 형광 프로브, 생물발광 프로브, 방사선 조영제 또는 방사성 동위원소를 포함하는 추적자 분자일 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 (a) (1) 하기 화학식 II의 단량체, (2) 하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키고; (b) 단계 (a)의 공중합체를 링커/스페이서 L 및 아지드 잔기를 함유하는 아민 반응제로 처리하고, (c) 단계 (b)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 제 1 페이로드 분자를 커플링시킴으로써 수득될 수 있는 제 1 페이로드 분자의 다중 복제물을 함유하는 공중합체를 또한 포함한다:
화학식 II
Figure pct00004
상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며; Y는 H이고; Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이다.
다르게는, Y는 또한 H 또는 -CnH2n+1B(n은 1 내지 8임)로 정의될 수 있으며, 여기에서 B는 H 또는 OH이고, 바람직하게는 Y는 H이다. 바람직하게는 본원에서 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고, A가 -NH-인 경우 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 또한 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
상기 반응 혼합물은 추가로 바람직하게는 하기 화학식 III의 단량체로 보충될 수 있다:
화학식 III
Figure pct00005
상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이다.
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-인 경우 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수도 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 하기 화학식 R1a의 반복 단위를 포함하는 공중합체에 관한 것이다:
[화학식 R1a]
Figure pct00006
상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며; Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이고; L은 링커/스페이서이다.
L은 본원에 정의된 바와 같다. 본원에 정의된 중합체는 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있다.
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-이면 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 또한 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 하기 화학식 R1의 반복 단위를 포함하는 공중합체에 관한 것이다:
[화학식 R1]
Figure pct00007
상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며; Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고; A는 -O- 또는 -NH-이고; L은 링커/스페이서이고; P는 제 1 페이로드 분자를 포함한다.
L 및 페이로드 분자는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-이면 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 또한 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
바람직하게는, 화학식 R1a의 반복 단위를 포함하는 공중합체 또는 화학식 R1의 반복 단위를 포함하는 공중합체는 추가로 하기 화학식 R2의 반복 단위 및/또는 하기 화학식 R3의 반복 단위를 포함한다:
[화학식 R2]
Figure pct00008
[상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며; Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Y는 제 2 페이로드 분자를 포함하고; Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Z는 제 2 페이로드 분자를 포함하고; A는 -O- 또는 -NH-이다]
[화학식 R3]
Figure pct00009
[상기 식에서, R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고; Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Z는 제 2 페이로드 분자를 포함하고; A는 -O- 또는 -NH-이다].
본원에서 바람직하게 이해되는 바와 같이, A가 -O-이면 Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 반면, A가 -NH-이면 Z는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이다. 다르게는, Z는 또한 바람직하게는 Z가 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 것으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, A가 -O-인 경우, Z는 바람직하게는 H이다.
바람직하게는, Z는 H일 수 있고/있거나 Y는 H일 수 있다. 다르게는, Z 및/또는 Y는 제 2 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 페이로드 분자는 본원에 정의된 바와 같다. 다르게는, 특정 실시양태에서, Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Z는 제 2 페이로드 분자를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 공중합체는 N,N-디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드의 중합에 의해 수득가능한 반복 단위, 또는 메타크릴산, 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드의 중합을 통해 수득되는 반복 단위를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 화학식 R2 및 화학식 R3의 반복 단위가 존재하지 않는 본 발명의 공중합체에서, 공중합체 분자당 화학식 R1에 따른 반복 단위의 평균 갯수는 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 공중합체에서, 화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 본원에 정의된 바와 같이 작용화되지 않은 경우, 공중합체 분자당 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 갯수는 10 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 40개, 더욱 바람직하게는 10 내지 30개이다.
더욱 바람직하게는, 화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 제 2 페이로드 분자로 작용화된 본 발명의 공중합체에서, 공중합체 분자당 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 갯수는 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 15개, 더욱 바람직하게는 4 내지 10개이다.
본 개시내용은 또한 공유 결합된 활성제 또는 공유 결합된 킬레이트화제에 의해 포획된 활성제 및 담체의 다중 분자를 함유하는 본 개시내용의 공중합체 유효량을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 활성제의 성질에 따라, 이들 조성물은 다양한 암 또는 기타 질병/상태의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 공유 결합된 활성제 또는 공유 결합된 킬레이트화제에 의해 포획된 활성제 및 담체의 다중 분자를 함유하는 본 개시내용의 공중합체(본원에서 "활성 잔기"로도 지칭됨) 유효량을 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상이한 유형의 암 또는 다른 질병 및 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 대상체에게 공중합체 유효량을 투여함을 포함하는, 공유 결합된 활성제 또는 공유 결합된 킬레이트화제에 의해 포획된 활성제 및 담체의 다중 분자를 함유하는 본 개시내용의 공중합체 유효량을 포함하는 약학 조성물의, 대상체에서 암 또는 다른 질병 또는 상태의 치료를 위한 용도 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 발명은 추가로 바람직하게는 공중합체가 제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자를 포함하고, 제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자가 조합 요법으로서 함께 투여되는 2개의 활성제인, 치료에서의 본 발명의 공중합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 바람직하게는 진단 용도, 바람직하게는 암 모니터링에 사용하기 위한 본 발명의 공중합체에 관한 것이다. 바람직하게는 암의 모니터링은 암 치료와 동시에 수행된다. 바람직하게는, 공중합체는 본원에 개시된 바와 같이 진단에 유용한 방사성 핵종을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 모든 용어는 관련 기술 분야에서 통상적인 의미를 갖는다. 다음 용어가 정의되며 다음과 같은 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"는 멸균 발열원-비함유 물과 같은, 약학적 투여와 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 해당 분야의 표준 참조 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴, 19th ed. 1995]에 기술되어 있으며, 이 문헌은 참조로 본원에 포함된다. 약학적으로 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 비제한적 예는 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 그의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올리레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄 등의 완충제; 알긴산; 발열원-비함유 물; 등장성 식염수; 링거액(Ringer's solution); 에틸 알코올, 포스페이트 완충액 뿐만 아니라 라우릴황산나트륨, 스테아르산마그네슘과 같은 무독성 상용성 윤활제이고, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미료, 향미제, 방향제, 보존제, 산화방지제도 조제자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다. 또한, 크레모포어(cremophor) EL 및 솔루톨(solutol) HS15와 같은 유화제/계면활성제, 레시틴 및 포스파티틸콜린과 같은 인지질도 포함된다. 리포솜도 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 인간 대상체이다.
"활성 잔기"라는 용어는 페이로드 분자의 다중 분자를 함유하는 본 개시내용의 공중합체(이 공중합체는 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기로 추가로 작용화될 수 있음)에 관한 것으로서, 페이로드 분자가 킬레이트화제인 경우, 이 용어는 킬레이트화제에 의해 포획된 활성제도 포함하는 공중합체를 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기"는 결합력을 갖는 특정 유형의 세포 또는 특정 조직의 세포 상의 표면 마커에 결합하여 운반되는 활성제의 세포로의 전달에 유용하게 만드는 분자를 가리킨다. 이는 모노클로날 항체, 단일-도메인, 항체 쇄의 가변 단편, 단일-쇄 항체, DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein), DNA- 또는 RNA-기반 압타머, 펩티드-기반 압타머, 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 펩티드 또는 단백질, 호르몬, 또는 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 소분자일 수 있다.
"추적 분자"는 진단 또는 과학적 용도에서 판독 신호를 생성시킬 수 있는 분자로 정의된다. 이는 소분자 형광단, 단백질/펩티드-기반 형광단, 근적외선(NIR) 형광 프로브, 생물발광 프로브, 방사선 조영제 또는 방사성 동위원소일 수 있다.
본 개시내용의 활성 잔기의 "유효량"은 치료 과정에 걸쳐 1회 또는 수회 투여될 때 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이점/위험 비로 치료 대상체에게 치료 효과를 부여하는 활성 잔기의 양을 의미한다. 치료 효과는 객관적(즉, 일부 시험 또는 마커로 측정 가능) 또는 주관적(즉, 대상체가 증세를 나타내거나 효과를 느낌)일 수 있다. 본 개시내용의 활성 잔기의 유효량은 바람직하게는 약 0.01mg/kg 대상체의 체중 내지 약 50mg/kg 체중 범위, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 약 30mg/kg 체중 범위의 양으로 활성제를 포함하는 활성 잔기의 양이다. 유효 투여량은 또한 투여 경로 및 다른 약제와의 병용 가능성에 따라 달라진다. 그러나, 본 개시내용의 활성 잔기 및 약학 조성물의 총 일일 투여량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 특정 환자에 대한 특정 유효 투여량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 활성제의 활성; 사용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 특정 활성 잔기의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 활성 잔기와 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 요인을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예방 또는 방지의 맥락에서 사용되는 경우, 본 개시내용의 활성 잔기의 "유효량"은 치료 과정에 걸쳐 1회 또는 수회 투여되는 경우 치료 대상체에 원하는 예방 효과를 부여하는 활성 잔기의 양을 의미함에 주목한다.
"페이로드 분자" 또는 "페이로드"라는 용어는 직접적으로 또는 링커를 통해 공중합체에 공유 결합된 활성제, 또는 공중합체에 공유 결합되고 활성제를 포획할 수 있는 킬레이트화제를 말한다. 공중합체에 공유 결합된 킬레이트화제는 방사성 동위원소를 고정하는 데 사용될 수 있다. 킬레이트화제는 (1,4,7,10)-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산[DOTA], 2,2',2"-(10-(2,6-디옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산[DOTA-GA], 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산[NOTA], 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산)[TETA], 디에틸렌-트리아민-펜타아세트산 무수물[DTPA] 및 사르(Sar) 같은 사르코파긴(sarcophagine) 킬레이터[니콜라스(Nicholas) 등, 2019, Angewandte Chemie 131:15133-15136 참조]를 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
용어 "활성제"는 본 개시내용의 공중합체에 결합되는 치료 활성 물질을 의미한다. 암 요법의 맥락에서, 활성제는 전형적으로 세포 독성 물질/분자이다. 세포 독성 물질/분자의 예는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 엠탄신(DM1)과 같은 미세소관 억제제, 독소루비신과 같은 삽입 약물, 사이클로포스파미드(CP)와 같은 알킬화제, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질, 타목시펜 시트레이트와 같은 호르몬 또는 호르몬 수용체 조절제, 아파티닙(Afatinib) 또는 보수티닙(Bosutinib)과 같은 티로신 키나제 억제제, 펩티드-기반 독소, 예를 들어 α-아마니틴, 니볼루맙(nivolumab)® 또는 펨브롤리주맙(pembrolizumab)®과 같은 면역 관문 억제제, 항체-유도 효소 전구 약물 요법(ADEPT)에 적합한 효소, 유전자 또는 각각의 메신저 RNA(siRNA, 마이크로RNA 또는 안티센스-RNA)를 방해할 수 있는 폴리뉴클레오티드-기반 약물 및 방사성 동위원소, 예를 들어 플루오르-18, 구리-64, 갈륨-68, 지르코늄-89, 인듐-111, 요오드-123(진단 용도) 또는 구리-67, 스트론튬- 89, 이트륨-90, 요오드-131, 사마륨-153, 루테튬-177, 라듐-223 및 악티늄-225(치료 용도)(이들로 한정되지는 않음)를 포함한다. 추가의 예시적인 활성제는 스칸듐-43, 스칸듐-44, 테르븀-152, 및 테르븀-155(진단 용도) 또는 스칸듐-47 테르븀-149, 및 테르븀-161(치료 용도)을 포함한다. 나열된 방사성 핵종 중 일부는 진단 및 치료 용도에 적합하다. 예를 들어 테르븀-161은 치료제로 사용될 수 있지만 γ-방출로 인해 감마 카메라에 일부 가시성을 갖거나, 또는 테르븀-149는 표적화된 알파 치료에 사용될 수 있고 PET 스캔에서 가시성을 갖는다. 또한, 여기에 제시된 방사성 핵종은 치료적 접근에서 생체 분포의 가시화를 위해 "테라노스틱-탠덤(theranostic-tandem)"과 결합될 수도 있다.
"활성제"라는 용어는 또한 단량체에 공유 결합된 킬레이트화제에 의해 공중합체의 공동-주요 단량체에 전형적으로 커플링되는 방사성 동위원소/방사성 핵종을 포함한다.
본 발명의 범위에서 "방사성 동위원소/방사성 핵종"이라는 용어는 바람직하게는 동의어로 사용되며, 바람직하게는 원자를 불안정하게 만드는 과잉 핵 에너지를 갖는 원자를 나타낸다. 이 과잉 에너지는 다음 세 가지 방법 중 하나로 사용될 수 있다: 핵에서 감마선으로 방출됨; 그의 전자 중 하나로 전달되어 그 전자를 변환 전자로서 방출함; 또는 핵에서 새로운 입자(알파 입자 또는 베타 입자)를 생성하고 방출하는 데 사용됨. 방사성 동위원소/방사성 핵종은 본원에서 바람직하게는 1019년 미만의 반감기를 갖는 동위원소로서 정의된다.
용어 "활성제"는 예를 들어 Bcl-2와 같은 항-세포자멸 인자를 억제하거나 세포 유출 펌프(예: MDR-1 수송체)를 표적화함으로써 종양 세포 내성을 극복할 수 있는 물질, 또는 염증 관련 치료 부작용을 줄이는 데 유용한 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드 및 비스테로이드성 항염증제(예: 프로스타글란딘)를 비롯한 항염증성 성분을 추가로 포함한다.
"아민 반응제"라는 용어는 바람직하게는 아미노기와 반응할 수 있고, 이에 의해 공유 결합에 의해 아미노기에 부착될 수 있는 잔기에 관한 것이다.
용어 "복제물"는 바람직하게는 다수개, 즉 하나보다 많은 경우의 분자와 관련되며, 이 때 하나보다 많은 경우의 분자는 동일한 화학 구조를 갖는다.
"단량체"는 중합될 수 있는 저분자량 화합물을 의미한다. 화학식 I 내지 화학식 III의 공동-주요 단량체, 또는 주요 단량체의 경우, 저분자량은 일반적으로 800달톤 미만의 분자량을 의미한다. 공중합체와 관련되어 언급될 때, 용어 "단량체"는 공중합체의 가장 작은 구성 블록을 지칭한다.
"반복 단위"라는 용어는 바람직하게는 (동종- 또는 공-)중합체에서 여러 번 반복되는 2가 하위구조에 관한 것이다. 전형적으로, 이중 결합을 함유하는 단량체의 (공)중합에 의해 수득가능한 중합체에서, 반복 단위의 부착 지점은 상기 이중 결합에 의해 연결된 원자에 상응한다. 다시 말해서, 반복 단위는 단량체가 중합체에 포함됨으로써 단량체로부터 유도된다.
"RAFT제" 및 "RAFT 공정"이라는 용어는 바람직하게는 특별히 제한되지 않으며, 임의의 유형의 가역적인 부가-단편화 연쇄 이동을 지칭할 수 있다. 용어 "RAFT제" 및 "RAFT 공정"은 적합한 연쇄 이동 반응제(CTA)의 존재 하에 단량체의 통상적인 자유 라디칼 중합을 포함한다. 일반적으로 사용되는 RAFT제에는 디티오에스테르, 디티오카바메이트, 트리티오카보네이트 및 크산테이트와 같은 티오카보닐티오 화합물이 포함되며, 이들 약제는 가역적인 연쇄 이동 공정을 통해 중합을 매개한다. 치에파리(Chiefari, J.) 등의 문헌[(1998) Macromolecules 31(16): 5559-62].
"예비중합체"라는 용어는 RAFT제에 의해 지향되고 10 내지 25 단위의 친수성 주요 단량체, 예를 들어 디메틸-아크릴아미드를 포함하는 짧은 중합체에 관한 것이다. 이러한 예비중합체는 수성 환경에서 주요 및 공동-주요 단량체의 공중합체를 합성하기 위해 제 2 중합 반응에 사용되는 수용성 매크로-RAFT제를 나타낸다.
"기질, 모티프 또는 태그" 또는 "반응성 기질, 모티프 또는 태그"라는 용어는 효소 촉매(enzymatically catalyzed) 반응에 참여할 수 있는 화학 구조와 관련하여 호환적으로 사용된다. 이러한 화학 구조는 효소의 활성 중심에 의해 인식되며 효소 촉매 반응이 일어나기 전에 중간에 공유 또는 정전기 효소-기질 착체를 형성할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, 이들 반응은 종종 종양 세포 또는 조직-특이적 표적화 잔기에 대한 본 개시내용의 공중합체의 공유 부착을 매개하기 위해 사용된다. 일반적인 기질, 모티프 및 태그는 아미노산 또는 펩티드의 정의된 서열, 아미노, 티올 또는 카복실기와 같은 반응성 작용기 또는 공중합체 헤드 기의 유연한 스페이서 영역에 있는 불포화 탄소 결합이다.
"중합체 유사 반응"이라는 용어는 바람직하게는 원래 거대분자의 중합도를 유지하기 위한 일반적인 목적으로 거대분자 쇄에 운반되는 작용기의 의도적인 변화로 정의된다.
"ADC"로 약칭되는 "항체-약물 컨쥬게이트"라는 용어는 세포 유형- 또는 조직 유형-특이적 항원(종양 항원 포함)을 표적으로 하는 항체와 약물 분자 또는 다수의 약물 분자의 조합을 나타내며, 이 때 약물 분자는 항체에 공유 결합된다. 본 개시내용의 맥락에서, ADC는 본 개시내용의 활성제의 다중 분자를 드러내는 공중합체와 세포 유형- 또는 조직 유형-특이적 항원-표적화 항체의 컨쥬게이트를 지칭한다. 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 공중합체는 링커를 통해 또는 직접적으로 공유 결합된 다수의 활성제 분자 또는 상이한 활성제 분자의 조합을 공동-주요 단량체 내의 아지드, 알파-아미노 및 알파-카복시기에 운반한다. 이는 또한 링커를 통해 또는 직접적으로 공동-주요 단량체의 아지드, 알파-아미노 및 알파-카복시기에 공유 결합되는 다수의 킬레이트화제를 운반할 수 있으며, 이 킬레이트화제는 활성제 분자를 포획한다.
용어 "항체 방사성 핵종 컨쥬게이트"(ARC)는 바람직하게는 "약물 분자 또는 활성 분자"가 예를 들어 방사성 요오드의 경우 항체-중합체-컨쥬게이트에 공유 결합되거나 또는 예컨대 방사성 루테튬, 악티늄 또는 테르븀과의 금속 킬레이터 착체에 의한 방사성 핵종/방사성 동위원소를 나타내는 ADC의 변형으로서 정의된다. 이렇게 형성된 ARC는 종양 조직에 많은 양의 방사선을 전달할 수 있어서, DNA, 필수 효소 등의 손상으로 인해 종양 세포를 죽이다.
"압타머"라는 용어는 다음과 같이 정의된다: 압타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 일반적으로 가장 높은 표적 친화도를 갖는 압타머 서열을 식별하기 위해 반복 강화 공정에서 대규모 무작위 서열 풀로부터 선택함으로써 생성된다. 이 과정은 "지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화(SELEX)"로도 알려져 있다. 보다 구체적으로, 압타머는 DNA, RNA, 제노 핵산(XNA)(당 주쇄 면에서 상이한 천연 핵산에 대한 합성 대안) 또는 펩티드 압타머로 분류될 수 있다. 압타머는 (보통 짧은) 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 아미노산 서열로 구성된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 서열은 한 종류의 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA, 또는 상이한 뉴클레오티드 유형, 예를 들어 DNA, RNA 및/또는 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 추가적인 브릿지로 변형된 리보스 잔기를 갖는 특별히 설계된 소위 "잠금-뉴클레오티드(locked-nucleotide)"의 조합으로 형성될 수 있다. 본 개시내용에서 압타머는 또한 하나(또는 그 이상)의 짧은 펩티드 도메인으로 구성된 펩티드 압타머를 의미한다.
"압타머-약물 컨쥬게이트"라는 용어는 압타머와 활성제 분자 또는 상이한 활성제 분자의 조합을 의미한다. 본 개시내용의 맥락에서, 활성제 분자는 공중합체의 압타머에 대한 커플링 이전 또는 이후에 공중합체에 부착된다.
"향상된 투과성 및 체류(EPR) 효과"라는 용어는 특히 거대분자 약물의 경우 종양 조직에서의 비정상적인 분자 및 유체 수송 역학을 설명하는 데 사용된다. 특정 크기의 분자(일반적으로 리포솜, 나노입자 및 거대분자 약물)는 정상 조직보다 더 높은 수준으로 종양 조직에 축적되는 경향이 있다. 이 현상에 대한 일반적인 설명은 종양 세포가 빨리 자라기 위해서는 혈관 생성을 자극해야 한다는 것이다. 새로 형성된 종양 혈관은 일반적으로 형태와 구조가 비정상적이며 분자량이 더 큰 분자에 대해 투과성이다. 게다가, 종양 조직은 일반적으로 효과적인 림프 배수가 없기 때문에 분자가 일단 종양 조직에 들어가면 이 조직에서 효과적으로 제거되지 않는다.
공동-주요 단량체의 맥락에서 용어 "측쇄-연결된 아미노산"은 아미노산이 그의 측쇄를 통해(예를 들어, 에스테르 또는 아미드 연결을 통해) 아크릴로일기를 함유하는 잔기에 공유 결합됨을 의미한다. 화학식 I 내지 화학식 III의 단량체는 측쇄 연결된 아미노산을 함유한다.
"주요 단량체" 및 "공동-주요 단량체"라는 용어는 주로 본 발명의 설명을 용이하게 하기 위해 사용된다. 주요 단량체는 아미노산 잔기, 즉 작용화되거나 작용화되지 않은 아미노산 잔기, 또는 아지드기를 포함하지 않는 단량체를 지칭하고, 공동-주요 단량체는 아미노산 잔기를 포함하는 단량체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "주요 단량체" 또는 "중합성 주요 단량체"는 용어 "하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체" 또는 "아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체"와 호환적으로 사용된다. 바람직하게는, "원칙" 및 "주요"이라는 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다.
본 개시내용의 공동-주요 단량체에 존재할 수 있는 측쇄-연결된 아미노산은 라이신(K), 티로신(Y), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 4-하이드록시프롤린(HO-P), 오르니틴(ORN) 및 4-아미노-페닐알라닌(HOX)을 포함한다. 아미노산은 L 또는 D 형태 또는 라세미 혼합물일 수 있다. 공중합체에는 단일 유형의 측쇄-연결된 아미노산 또는 여러 유형의 측쇄-연결된 아미노산이 존재할 수 있다. 예를 들어, 공중합체는 아크릴로일-L-라이신(AK) 및 아크릴로일-L-트레오닌(AT) 둘 다를 포함할 수 있다. 명확성을 위해, 화학식 I 내지 화학식 III에 의해 기재된 모든 단량체는 측쇄-연결된 아미노산을 포함한다. 화학식 I의 단량체는 아미노산의 알파-아미노기에서 아지드기로 작용화된다. 화학식 II 및 화학식 III의 단량체는 작용화되지 않을 수 있거나 이들이 함유하는 아미노산 잔기의 알파-아미노 및/또는 알파 카복시기에서 작용화될 수 있다. 본 개시내용의 아미노산-함유 공중합체는 하나 이상의 중합성 주요 단량체(이 단량체는 하나 이상의 비닐기를 갖지만 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 함), 임의의 화학식 I에 따른 하나 이상의 공동-주요 단량체 및 임의적으로는 화학식 II 및/또는 화학식 III의 하나 이상의 공동-주요 단량체를 포함한다.
바람직하게는, 화학식 I의 공동-주요 단량체만을 함유하는 공중합체에서, 공동-주요 단량체의 평균 수는 2 내지 12개이다. 보다 바람직하게는, 공중합체는 평균적으로 2 내지 8개의 공동-주요 단량체, 가장 바람직하게는 2 내지 6개의 공동-주요 단량체를 함유한다. 작용화되지 않은 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체를 또한 함유하는 공중합체의 경우, 모든 공동-주요 단량체의 바람직한 평균 수는 10 내지 50개이다. 10 내지 40개의 평균 공동-주요 단량체 수가 보다 바람직하고, 10 내지 30개의 평균 공동-주요 단량체 수가 가장 바람직하다. 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체가 작용화되는 경우, 모든 공동-주요 단량체의 바람직한 평균 수는 4 내지 20개이다. 더 바람직한 것은 4 내지 15개의 평균 공동-주요 단량체 수이고, 가장 바람직한 것은 4 내지 10개의 평균 공동-주요 단량체 수이다.
측쇄-연결된 아미노산을 포함하는 단량체의 합성은 이전에 기재된 바 있다. 즈바이다(Zbaida, D) 등의 문헌[(1987) Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents 6(2-3): 241-253]. 이러한 단량체는 라이신, 티로신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 오르니틴, 4-아미노-페닐알라닌 또는 4-하이드록시프롤린의 아미노산 구리 착체를 아크릴로일 클로라이드, 메타크릴로일 클로라이드, 에틸-아크릴로일 클로라이드 또는 프로필-아크릴로일과 반응시킨 후, 황화수소 기체 스트림 또는 황화나트륨의 산성 용액으로 처리하여 보호되지 않은 단량체를 생성시킴으로써, 제조할 수 있다. 합성은 국제 특허 출원 공개 WO2017/055536 호 및 실시예 하에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, 주요 단량체는 아크릴아미드의 유도체이고, 디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드를 포함한다. 여기에서, 디메틸 아크릴아미드는 바람직하게는 N,N-디메틸아크릴아미드로서 이해된다. 바람직하게는, 본원에서 이해되는 바와 같은 주요 단량체는 또한 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체로도 지칭된다.
다른 특정 실시양태에서, 주요 단량체는 메타크릴산 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 및 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드를 포함하는 아크릴산의 유도체이다. 바람직하게는, 본원에서 이해되는 바와 같은 주요 단량체는 또한 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체로도 지칭된다.
화학식 I 및 임의적으로는 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체의 하나 이상의 유형을 포함하는 공중합체는 전형적으로 라디칼 중합 반응에서 제조된다. 다양한 요법, 특히 암 요법에서 약물 로드가 정밀하게 제어되어야 하기 때문에 본 개시내용의 공중합체가 좁은 크기 분포를 갖는 것이 중요하다. 주의 깊게 제어하지 않으면 과다 투여 또는 과소 투여 효과가 발생할 수 있다. 좁은 크기 분포를 갖는 공중합체를 얻기 위해서는 중합 공정에서 자유 라디칼의 수를 제어해야 한다. 이는 원자 이동 라디칼 중합(atom transfer radical polymerization; ATRP), 나이트록사이드-매개 중합(nitroxide-mediated polymerization; NMP) 또는 가역적인 부가-단편화-연쇄 이동 중합(RAFT 중합)을 비롯한 중합 기술을 이용하여 달성할 수 있다. RAFT는 광범위한 단량체, 특히 아크릴에 적합하고 수성 시스템에서 쉽게 수행될 수 있기 때문에 본원에 설명된 공중합체에 가장 바람직한 기술이다. 또한, RAFT 중합은 블록 공중합체의 합성에 이용될 수 있다. 또한, RAFT 기를 사용하여 중합체의 헤드 기에 반응성 잔기를 추가할 수 있다(예: 항체 또는 압타머와의 컨쥬게이션을 위해). RAFT 기술은 CSIRO(Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization)의 연구 그룹에서 발명하였다. 치에파리 등 (1998). 쇄 크기 분포의 제어는 성장하는 중합체 쇄에서 연쇄 이동 반응제로의 연쇄 이동 반응을 통해 달성된다. 소위 RAFT제는 중간체를 형성하고 전파 쇄(R-기로 일컬어짐)와 안정화 잔기(Z-기로 지칭됨)에서 라디칼로 단편화될 수 있다. 결과적으로 라디칼의 수는 제한되고 성장하는 모든 중합체 쇄가 유사한 전파 가능성을 가지므로 좁은 크기 분포를 갖는 공중합체가 생성된다. RAFT 중합에서 얻어지는 전형적인 다분산 지수(PDI)[Mw/Mn으로 정의됨, 여기에서 Mw는 중합체의 중량 평균 몰 질량이고, Mn은 중합체의 수 평균 몰 질량임]는 1.05 내지 1.4의 범위에 있다. 적합한 RAFT제는 티오카보닐티오 화합물이다. 티오카보닐티오 화합물은 4가지 주요 부류, 즉 디티오벤조에이트, 트리티오카보네이트, 디티오카바메이트 및 크산테이트로 나뉘어질 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 전형적인 중합 혼합물은 주요 단량체 및 공동-주요 단량체, RAFT제, 및 바람직하게는 "자유 라디칼 종 생성을 위한 개시제 시스템"으로도 지칭되는 라디칼 개시제를 포함한다. 이어, 혼합물을 적절한 용기에 붓는데, 여기에서 중합이 유도된다. 개시제는 열 개시제, 예를 들어 반응성 라디칼를 생성시키기 위해 승온에서 불안정화되는 VA-044, 산화환원 개시제 또는 광 개시제일 수 있다. 수용액에서의 중합을 위한 바람직한 산화환원 개시제는 과산화물, 예를 들어 티오황산나트륨과 조합된 과황산암모늄 또는 과황산칼륨, 또는 아조-유형 화합물, 예를 들어 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드 또는 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)이다. 비-수성 용매에서의 중합 반응의 경우에는, 아조 유형의 개시제/촉매, 예를 들어 아조비스(이소부티로니트릴)(AIBN), 1,1'-아조비스(사이클로헥산-1-카보니트릴), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸발레로니트릴)이 바람직하다. 중합체-개질된 아조-유형 개시제, 예컨대 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌글리콜도 사용할 수 있다. 위에서 언급한 개시제는 일반적으로 더 높은 온도에서 불안정화되어 반응성 라디칼을 형성시킨다.
다르게는, 단량체는 비닐계 또는 아크릴계 단량체의 중합을 개시할 수 있는 파장의 방사선에 대해 투과성인 용기에서 광중합될 수 있다. 적합한 광개시제 화합물은 유형 I, 예를 들어 α-아미노 알킬페논 또는 유형 II, 예를 들어 벤조페논으로부터 유래될 수 있다. 더 긴 파장의 사용을 허용하는 감광제가 또한 사용될 수 있다. 사용된 개시제 화합물에 따라, 중합은 가열, 방사선 조사 또는 촉매 첨가에 의해 개시된다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서는, 공중합체(주요 단량체와 공동-주요 단량체의 혼합물 함유)의 중합 전에 친수성 주요 단량체의 10 내지 25개의 단량체 단위로 구성된 매크로-RAFT 또는 RAFT 예비중합체를 합성하는 것이 유용하다. 이를 통해 흔히 소수성인 RAFT제의 친수성을 향상시켜 수성 환경에서의 중합 반응을 촉진할 수 있다.
다른 실시양태에서는, 3 내지 25개 단위의 수용성 단분산 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서의 혼입에 의해 RAFT제 자체가 화학적으로 변형된다. 바람직하게는, PEG 스페이서는 본원에서 화학식 -(OCH2CH2)n- 또는 -(CH2CH2O)n-에 따른 잔기로 이해되며, 여기에서 n은 3 내지 25의 정수이다. 변형된 RAFT제는 개선된 수용해도를 나타내고, 하나의 중합 단계에서 친수성 아미노산-함유 공중합체의 합성을 가능하게 한다.
다른 실시양태에서는, 중합체 유사 반응에서 화학식 I의 공동-주요 구성 블록을 생성시키는 것이 유용할 수 있다. 이를 위해, 먼저 단량체 혼합물이 주요 단량체 및 하나 이상의 화학식 II의 단량체, 및 임의적으로 하나 이상의 화학식 III의 단량체로만 이루어진 것을 제외하고는 상기 제시된 절차에 따라 RAFT 공중합체를 제조한다. 공중합체의 정제 및 RAFT 기의 제거 후, 공중합체는 링커 및 아지드 기를 함유하는 아민 반응제로 처리되어, 측쇄에 아지드기를 갖는 공중합체를 생성시킨다. 명확하게 하기 위해, 이 중합체 유사 반응에서 생성된 공중합체는 화학식 I의 단량체를 포함하는 공중합에 의해 생성된 공중합체와 동일한 구조를 갖는다. 상이한 측쇄 기를 갖는 공중합체를 합성하기 위하여, 중합체 유사 반응에서 제시된 아민 반응성 아지드의 몰비를 변화시켜 화학식 I 및 화학식 II 및/또는 화학식 III의 혼합물을 합성시킬 수 있는데, 그 결과 공중합체 측쇄의 모든 아미노기가 전환되지는 않는다.
RAFT제가 아민의 존재 하에서 불안정한 것으로 알려져 있고 수득된 공중합체의 강한 냄새를 담당하기 때문에, 이는 일반적으로 중합 및 작용화 공정이 완료되면 불활성화되어야 한다. 본 개시내용에서 RAFT 기 불활성화를 위한 바람직한 방법은 친핵체와의 반응, 열 제거, 또는 양성자-공여제와 조합된 개시제 또는 과량의 작용화된 개시제와의 제 2 반응이다.
본 개시내용의 공중합체가 환자에서 약물 전달을 위해 사용되도록 의도되기 때문에, 중합 후 또는 작용화(즉, 페이로드, 표적화 잔기의 커플링 등) 후에 공중합체를 정제하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이 단계는 잔류 개시제, 단량체 또는 촉매를 비롯하여 잠재적으로 유해한 성분을 제거한다. 본 발명의 공중합체에 대한 바람직한 정제 방법은 투석, 접선 유동 여과 및 모세관 한외여과이다.
유용한 매개변수 값을 한정하는 데 과도한 노력이 필요하지 않은 것은 매개변수의 수가 제한되어 있고 일부 매개변수 값의 선호 범위가 알려져 있기 때문이다. 아미노산-함유 공중합체에서 공동-주요 단량체의 수준은 중합 혼합물에 존재하는 모든 단량체의 약 2%(몰) 내지 95%(몰), 바람직하게는 약 3%(몰) 내지 40%(몰), 가장 바람직하게는 4%(몰) 내지 25%(몰)이다. 아미노산-함유 공중합체(세포 유형- 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기 없음)의 평균 분자량은 일반적으로 약 5,000 내지 80,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 40,000Da, 가장 바람직하게는 약 5,000 내지 20,000Da이다. 본 개시내용의 공중합체가 함유할 수 있는 공동-주요 단량체의 수는 상기에서 3가지 시나리오, 즉 유일한 단량체 유형으로서 화학식 I의 단량체를 함유하는 공중합체의 경우, 화학식 I의 단량체뿐만 아니라 화학식 II 및/또는 화학식 III의 단량체를 함유하는 공중합체(화학식 I의 단량체만 중합 후 작용화됨(제 1 페이로드에 커플링됨))의 경우, 및 모든 공동-주요 단량체가 작용화된(제 1 및 제 2 페이로드에 커플링됨) 유사한 공중합체의 경우에 대해 논의된 바 있다.
본원에서 이해되는 바와 같이, 특정 유형의 단량체와 관련하여 용어 "단량체의 수준"은 바람직하게는 (공)중합체의 분자에서 특정 유형의 단량체로 인한 반복 단위의 수 대 모든 단량체로 인한 반복 단위의 수 사이의 비로서 정의된다. 본원에서 이해되는 수준은 바람직하게는 퍼센트 값으로 표현된다.
공중합이 완료되면, 화학식 I의 공동-주요 단량체를 포함하는 본 발명의 공중합체는 활성제 분자 및/또는 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기(예: 항체)로 작용화할 준비가 된다. 이러한 작용화는 공중합체와 활성제 분자 및/또는 표적화 잔기 사이의 공유 결합의 확립을 초래한다. 특정 활성제, 예를 들어 특정 방사성 동위원소의 경우, 공중합체는 킬레이트화제로 작용화되고 활성제는 킬레이트화제에 의해 보유된다. 공중합체에 결합될 특정 활성제의 성질에 따라, 공중합체는 활성제의 도입 전에 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기로 작용화될 수 있거나, 또는 활성제는 표적화 잔기로 작용화되기 전에 공중합체에 결합될 수 있다.
화학식 I의 공동-주요 단량체는 아지드 잔기를 함유한다. 아지드 잔기는 알킨과의 소위 "클릭 반응"에 사용되는 반응성이 높은 물질이다. 아민 또는 티올 부가 반응과 달리, 아지드-알킨 또는 테트라진-트랜스사이클로옥텐 클릭 반응은 빠르고 선택성이 높다. 실제로, 생물학적 환경(펩티드, 단백질)에 아미노 및 티올기가 존재하기 때문에 부가 반응에서 부반응이 발생하지 않아, 아지드기는 직교 반응성으로 인해 약물 전달 용도에 완벽한 선택이 된다. 또한, 측쇄-연결된 아미노산을 포함하는 단량체 및 이러한 단량체를 적절한 비율(2몰% 이상)로 포함하는 (공)중합체는 독성이 낮다는 이점이 있다. 예를 들어, 아크릴로일-라이신 단량체 및 이 단량체를 포함하는 (공)중합체는 최대 5mM 농도에서 세포 배양 실험에서 독성 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 이상적인 약물 담체는 아지도기를 사용한 아크릴로일-라이신 또는 다른 측쇄 연결된 아미노산의 작용화에 의해 설계되어 독성 가능성이 낮은 생체 적합성 공중합체를 제공할 수 있다. 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 분야에서는, 독성이 강한 약물이 자주 사용되므로, 이러한 ADC의 제조는 비용이 많이 들고 안전성 측면에서 까다롭다. 본 개시내용에 따라, "약물 반응성" 항체 중합체 컨쥬게이트를 생성시키기 위해 항체에 커플링될 수 있는 측부 반응성 담체 공중합체가 도입된다. 세포 독성 페이로드(즉, 세포 독성 약물 또는 세포 독성 약물을 보유하는 킬레이트화제)는 생산의 마지막 단계에서 컨쥬게이트에 커플링된다. 따라서, 고역가(HIPO) 물질이 존재하는 생산 단계 및 이후의 공정의 수를 줄일 수 있다. 또한, 본원에 제시된 기술은 페이로드가 항체 부착 전에 중합체 담체에 결합될 수 있기 때문에 높은 수준의 유연성을 제공한다. 이것은 분해에 민감한 항체 또는 기타 암 세포-특이적 표적화 잔기에 특히 유용할 수 있다.
본 개시내용의 공중합체는 또한 화학식 II 및/또는 화학식 III의 공동-주요 단량체를 포함할 수 있다. 상기 공동-주요 단량체는 자유 또는 작용화된 알파-아미노 및/또는 카복시기를 함유하는 측쇄-연결된 아미노산을 함유한다. 알파-아미노 또는 카복시기 중 하나 이상이 작용화되지 않은 화학식 I의 아지드-함유 단량체 및 화학식 II 및/또는 화학식 III의 단량체를 포함하는 공중합체는 2개의 상이한 페이로드 분자와 항체의 "원-포트(one-pot)" 커플링을 가능하게 한다. 예를 들어, 제 1 페이로드 분자, 예를 들어 방사성 동위원소에 대한 킬레이터는 아지드-반응성 잔기(예: 변형 알킨)로 작용화되고, 제 2 페이로드 분자, 예를 들어 세포 독성 약물은 아민-반응성 기(예: NHS 에스테르)로 작용화된다. 이는 두 반응이 무관하기 때문에 부작용 및 "오-표지"의 위험 없이 강력한 조합 요법을 위한 약물 담체를 가능하게 한다. 또한, 민감하고 매우 강력한 페이로드 분자에 유용한 반응 및 투석과 같은 정제 단계의 수를 줄일 수 있다. 또한, 암 치료 용도에서는, 본원에 제시된 조합 접근 방식을 통해 공중합체에 세포 독성제 및 진단 방사성 동위원소를 로딩하여 추적할 수 있다. 작은 종양 전이에도 세포 독성제를 전달하면 고해상도 양전자 방출 단층 촬영(PET)이 수행될 수 있어 치료 진행에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
항체 약물 또는 중합체 컨쥬게이트에서 암 세포-특이적 표적화 잔기의 친수성/소수성 균형은 응집이 저장 수명과 순환 시간을 모두 감소시켜 치료 효능을 감소시키는 경향이 있기 때문에 구조물의 저장 수명 및 순환 시간에 중요하다. 중합체 약물 담체를 사용하면 약물이 항체에 직접 연결되는 것이 아니라 담체에 연결되기 때문에 특정 항암제와 같은 고도의 소수성 페이로드에 의해 유도되는 응집 위험을 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 이러한 긍정적인 효과는 약물 담체의 사용으로 가능해진 훨씬 더 높은 약물 로드에 의해 약화되거나 심지어 없어질 수 있다. 본 개시내용의 공중합체의 일부 실시양태에서, 상기 문제는 화학식 II 및/또는 화학식 III의 작용화되지 않은 공동-주요 단량체를 공중합체에 포함시킴으로써 상쇄된다. 따라서, 아크릴로일-라이신-아지드와 같은 아지드-작용화된 측쇄 연결된 아미노산을 담체 공중합체로의 페이로드의 커플링에 사용하며, 아크릴로일-라이신과 같은 고도로 친수성이고 변형되지 않은 측쇄 연결된 아미노산은 소수성 페이로드의 개선된 "용해도"를 가능하게 한다. 소수성 페이로드-로딩된 중합체 담체의 전체적인 "소수성"이 감소하고 그와 함께 응집 가능성이 감소된다.
특정 실시양태에서, 활성제(여기에서는, 암 치료에 사용되는 세포 독성 약물 또는 분자)는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 엠탄신(DM1)과 같은 미세소관 억제제; 삽입 약물, 예를 들어 독소루비신; 사이클로포스파미드(CP)와 같은 알킬화제; 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 타목시펜 시트레이트와 같은 호르몬 또는 호르몬 수용체 조절제; 아파티닙 또는 보수티닙과 같은 티로신 키나제 억제제; 펩티드-기반 독소, 예를 들어 α-아마니틴; 니볼루맙® 또는 펨브롤리주맙®과 같은 면역 관문 억제제; 항체-지향 효소 전구약물 요법(ADEPT)에 적합한 효소; 유전자(들) 또는 이의 각각의 메신저 RNA, siRNA, 마이크로RNA 또는 안티센스-RNA를 방해할 수 있는 폴리뉴클레오티드-기반 약물; 또는 플루오르-18, 구리-64, 갈륨-68, 지르코늄-89, 인듐-111, 요오드-123(진단용) 또는 구리-67, 스트론튬-89, 이트륨-90, 요오드-131, 사마륨-153, 루테튬-177, 라듐-223 및 악티늄 225(치료 용도)와 같은 방사성 동위원소일 수 있다.
특정 실시양태에서, 활성제(여기에서는, 암 치료에 사용되는 세포 독성 약물 또는 분자)는 방사성 동위원소/방사성 핵종, 예컨대 비제한적으로 플루오르-18, 스칸듐-43, 스칸듐-44, 구리-61, 구리-64, 갈륨-68, 지르코늄-89, 인듐-111, 요오드-123, 테르븀-152, 테르븀-155(진단용) 또는 스칸듐-47, 구리-67, 스트론튬-89, 이트륨-90, 요오드-131, 테르븀-149, 사마륨-153, 테르븀-161, 루테튬-177, 라듐-223 및 악티늄-225(치료 용도)일 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자를 포함하는 본 발명에 따른 공중합체(여기에서, 제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자는 조합 요법에 유용한 활성제임)가 활성제 둘 모두를 동일한 암 세포에 동시-전달하는데 유용하다는 것을 발견하였다. 세포 독성 페이로드는 바람직하게는 세포 독성 가능성에 더하여 예를 들어 DNA 복구 메커니즘의 억제(예: 단백질 키나제 억제제)에 의해 또는 DNA 균주를 직접 표적화함으로써(예: 독소루비신의 경우와 같은 삽입에 의해) 암 세포의 "방사선-감도"에 대한 효과를 갖는 약제일 수 있다. 이러한 약제는 본원에서 바람직하게는 "방사선 증감제"로 지칭된다. 이러한 맥락에서 이들 "방사선 증감제"는 방사선 요법의 세포 사멸 효과가 강화되기 때문에 방사성 핵종과의 조합 요법에서 유용하다. 이에 따라, 본원에 개시된 담체 기술은 두 약제가 동일한 담체 분자에 결합될 수 있고 동일한 암 세포 특이적 표적화 잔기를 커플링하여 동일한 암 세포에 대한 "동시-전달"을 보장할 수 있다는 이점을 갖는다. 예를 들어, 제 1 페이로드 분자, 예를 들어 방사성 동위원소에 대한 킬레이터는 아지드-반응성 잔기(예: 변형 알킨)로 작용화되고 제 2 페이로드 분자, 예를 들어 세포 독성 약물은 아민-반응성 기(예: NHS 에스테르)로 작용화된다.
바람직하게는, 방사성 동위원소와의 조합 사용을 위해 본원에서 이해되는 바와 같은 방사선 증감제는 바람직하게는 알리세르팁, MK-1775, MK-2206, 사라카티닙 및 템시롤리무스로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 알리세르팁 및 MK-2206으로부터 선택되는 키나제 억제제이다. 바람직하게는, 방사선 증감제와의 조합 사용을 위해 본원에서 이해되는 바와 같은 방사성 동위원소는 루테튬-177 및 테르븀-161로부터 선택된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서 조합 사용을 위한 방사선 증감제 및 방사성 동위원소는 알리세르팁과 루테튬-177, 알리세르팁과 테르븀-161, MK-2206과 루테튬-177, 및 MK-2206과 테르븀-161로부터 선택된다.
본원에서 이해되는 바와 같이, 알리세르팁은 예를 들어 그의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합을 통한 부착에 의해 본 발명의 공중합체에 포함될 수 있는 하기 화학식에 따른 화합물이다:
Figure pct00010
본원에서 이해되는 바와 같이, MK-2206은 예를 들어 그의 아미노기에 의해 형성된 펩티드 결합을 통한 부착에 의해 본 발명의 공중합체에 포함될 수 있는 하기 화학식에 따른 화합물이다:
Figure pct00011
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 공중합체가 진단 용도 뿐만 아니라 조합된 진단 및 치료 용도에 적합하다는 것을 발견하였다. 조합된 진단 및 치료 용도는 또한 치료진단(theranostic) 용도로 지칭될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따르면, 본 발명의 공중합체는 세포-유형-특이적 또는 조직-특이적 표적화 잔기, 예를 들어 특정 유형의 암 세포를 표적화하는 항체, 및 방사성 핵종과의 킬레이트화제인 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 특정 방사성 핵종은 모니터링될 수 있으며, 예를 들어 γ-방출로 인해 테르븀 161은 감마 카메라로 가시화될 수 있고 따라서 항체에 의해 표적화된 암 조직 또는 세포 유형의 검출에 사용될 수 있다. 표적화된 알파 치료에 사용할 수 있는 테르븀-149는 PET 스캔에서 가시성이 있어 모니터링이 가능하다. 본 발명에 따르면, 플루오르-18, 스칸듐-43, 스칸듐-44, 구리-61, 구리-64, 갈륨-68, 지르코늄-89, 인듐-111, 요오드-123, 테르븀-152, 테르븀-155가 본원에 기재된 진단 용도에 특히 유용하고, 진단에 유용한 방사성 핵종으로 지칭될 수 있다. 숙련자에게 알려진 바와 같이, 진단에 유용한 방사성 핵종은 적절한 방법, 예를 들어 신티그래피(Scintigraphy), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPE-CT); 또는 양전자 방출 컴퓨터 단층촬영(PET-CT)을 이용함으로써 모니터링될 수 있다. 본 발명에 따른 공중합체의 이러한 사용은 바람직하게는 공중합체의 생체 분포의 모니터링을 허용한다. 공중합체의 생체내 분포는 본원에서 상기 공중합체를 투여할 때 대상체, 바람직하게는 환자의 조직 내 분포로 이해된다. 당업자는 활성제가 예를 들어 구리-67, 스트론튬-89, 이트륨-90, 요오드-131, 사마륨-153, 루테튬-177, 라듐-223 및 악티늄 225(이들 방사성 핵종은 치료에 유용한 방사성 핵종으로 지칭될 수 있음)로부터 선택되는 치료 용도에 유용한 방사성 핵종을 포함하는 이러한 공중합체가, 방사성 핵종이 진단 용도에 유용한 공중합체와 실질적으로 동일한 생체내 분포를 가짐을 알게 될 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본 발명의 공중합체는 바람직하게는 치료 중 치료용 공중합체의 생체내 분포의 모니터링에 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료에 유용한 방사성 핵종인 활성제를 포함하는 공중합체는 이 목적을 위하여 바람직하게는 페이로드가 본원에 정의된 바와 같이 진단에 유용한 방사성 핵종을 포함하는 공중합체(10중량% 미만)로 보충될 수 있다. 추가로 바람직하게는, 조합된 치료 및 진단 용도에 사용하기 위한 본 발명의 공중합체는 예를 들어 각각 제 1 및 제 2 페이로드 분자 내에 포함된 2개의 방사성 핵종(한 방사성 핵종은 치료에 유용하고, 한 방사성 핵종은 진단에 유용함)을 포함할 수 있다. 치료에 유용한 방사성 핵종과 진단에 유용한 방사성 핵종이 동일한 원소의 동위원소인 조합이 바람직하다. 따라서, 바람직한 조합은 스칸듐-43과 스칸듐-47, 구리-61과 구리-67, 구리-64와 구리-67, 요오드-123과 요오드-131, 테르븀-152와 테르븀-161, 및 테르븀-155와 테르븀-161을 포함한다. 또한 바람직한 조합은 2개의 상이한 원소의 동위원소, 예를 들어 인듐-111과 루테튬-177, 및 인듐-111과 테르븀-161을 포함한다. 본 발명의 공중합체는 또한 진단 모니터링에 유용하다. 예를 들어, 특정 암 조직 유형을 표적으로 하는 표적화 잔기를 포함하는 공중합체(상기 공중합체는 진단에 유용한 방사성 핵종을 추가로 포함함)의 생체내 분포의 변화는 상기 암 조직을 표적으로 하는 요법의 진행을 나타낼 수 있다. 특히, 이 접근법은 암 모니터링, 바람직하게는 전이된 암의 치료를 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 공중합체는 대상체, 바람직하게는 환자의 신체에서 암 조직의 분포로서 본원에서 정의되는 암 모니터링에 유용할 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, 활성제는 세포 독성 약물, 및 예를 들어 Bcl-2와 같은 항-세포자멸 인자를 억제하거나 세포 유출 펌프(예를 들어, MDR-1 수송체)를 표적화함으로써 종양 세포 내성을 극복할 수 있는 약물의 조합이다.
상기 언급된 활성제는 본 개시내용의 공중합체와 양립가능한 작용제 및 작용제 부류의 비제한적인 예이고, 당업자는 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 개시된 작용제 및 작용제 부류의 변형 또는 유도체를 사용할 수 있다.
활성제 또는 다른 페이로드 분자의 구조에 따라, 이는 공중합체에 함유된 화학식 I의 공동-주요 단량체의 아지드 잔기 또는 화학식 II 또는 III의 공동-주요 단량체의 알파-아미노 또는 알파-카복실산기에 직접 커플링될 수 있거나, 또는 이는 링커 구조체를 통해 공중합체에 커플링될 수 있다. 이러한 링커는 활성제와 공중합체 사이의 단순 스페이서로서 기능하거나, 공중합체 약동학의 변형제로서 기능하거나, 표적 세포에서 활성제의 방출을 가능하게 하거나 촉진하는 요소를 함유할 수 있다. 링커는 활성제의 의도하지 않은 방출을 피하기 위해 보관 동안에 그리고 나중에 혈류에서 안정해야 한다. 공중합체로부터 활성제의 방출은 표적 세포 내부에서만 일어나야 한다. 따라서, 유용한 링커(암 치료에 초점을 맞춤)는 카스파제 또는 카텝신 같은 세포간 인자, 글루쿠로니다제(GUSB)(β-글루쿠로니드-기반 링커), 산성 pH(종양 조직 또는 세포 소기관[리소좀]에서 발견됨) 또는 환원성 환경(세포간 글루타티온 농도 증가에 대응)에 대해 민감해야 한다. 또 다른 가능성은 특정 효소의 표적이 아니며 리소좀 또는 퍼옥시좀의 가혹한 조건에서만 분해되는 디아민 유형 또는 티오에테르 유형의 비-분해성 링커를 사용하는 것이다. 후자의 링커 유형은 혈청 안정성을 최대화하고 비특이적 독성을 감소시키기 때문에 선호된다.
본 개시내용의 공중합체는 전형적으로 세포 유형- 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기로 작용화된다. 이 작용화 단계는 활성제가 공중합체에 결합된 후에 수행될 수 있지만, 먼저 공중합체와 표적화 잔기의 컨쥬게이트를 제조하는 것이 종종 유리할 것이다(특히 높은 세포 독성제 또는 반감기가 짧은 방사성 동위원소가 사용되는 경우). 활성제가 대상체에게 투여되기 직전에 활성제를 공중합체에 로딩할 수 있다. 잠재적인 표적화 잔기는 면역 관문 억제제, 항체 단편, 나노체(단일-도메인-항체), DARPin, 펩티드 호르몬, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 비-항체 단백질, DNA/RNA-기반 압타머 및 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 소분자(예: 종양과 관련하여 엽산 또는 비오틴)이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 암 요법의 맥락에서, 상기 언급된 표적화 잔기가 부작용을 피하기 위해 건강한 조직에서 낮거나 무시할 수 있는 발현 수준 및 암 세포의 세포 표면에서 높은 발현 수준/복제물 수를 갖는 것이 유리하다. 잠재적인 표적은 CD19(B-림프구 표면 항원 B4), CD20(B-림프구 항원), CD21(보체 수용체 유형 2, CR2), CD22(분화 클러스터-22), CD40(분화 클러스터-40), CD52(CAMPATH-1 항원), CD152(ETLA-4, 세포 독성 T-림프구-관련 단백질 4), CD180(RP105), CD274(PD-L1, 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1), CD279(PD-1, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체), FAP(섬유아세포 활성화 단백질), GD2(디시알로강글리오사이드), GITR(글루코코르티코이드-유도 TNFR 계열 관련 유전자), HER2(인간 표피 성장 인자 수용체 2, ERBB2, erb-b2 수용체 티로신 키나제), KIR2DL1(살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 2DL1), NKG2D(KLRK1) MSLN(메조텔린), PDGF(혈소판 유래 성장 인자), PDGFR(혈소판 유래 성장 인자 수용체), VEGF(혈관 내피세포 성장 인자), VEGFR(혈관 내피 성장 인자 수용체), CAE(암배아 항원), CA9/CA IX(탄산 안하이드라제 IX), α-폴레이트 수용체(폴레이트 수용체 1) 및 PSMA(전립선-특이적 막 항원)이지만, 이들로 한정되지는 않는다.
표적화 잔기의 공중합체에 대한 공유 결합은 표적화 잔기의 결합 친화도를 보존할 뿐만 아니라 균질한 생성물을 얻기 위해 부위-특이적 방식으로 수행되어야 한다. 적합한 커플링 전략은 펩티드 태그(예를 들어, 소르타제-매개 커플링), 알데히드 태그 또는 트랜스글루타미나제 태그와의 효소 촉매 반응, 또는 공중합체와 표적화 잔기 사이의 소위 "클릭" 반응이다. 후자의 과정은 반응성, 비정규(비천연) 아미노산의 합성 동안 단백질 표적화 잔기, 예를 들어 항체로 통합함으로써 달성될 수 있다(예들 들어, 비천연 아미노산의 경우 tRNA에 의해 인식되는 재프로그래밍된 정지 코돈을 사용하는 코돈 확장 기술에 의해).
소르타제는 카복실-말단 분류 신호를 인식하고 절단하여 표면 단백질을 변화시키는 원핵 효소의 군을 나타낸다. 스타필로코커스 아우레우스-유래 효소의 경우, 인식 신호는 모티프 LPXTG(Leu-Pro-any-Thr-Gly)로 구성되며, 스타필로코커스 피오게네스-유래 효소의 경우에는 LPXTA(Leu-Pro-any-Thr-Ala)이다. 신호 서열 앞에는 매우 소수성인 막횡단 서열과 아르기닌 같은 염기성 잔기의 클러스터가 있다. 신호 서열의 Thr과 Gly/Ala 잔기 사이에서 절단이 일어나며, Thr 잔기가 소르타제의 활성 부위 Cys 잔기에 일시적으로 부착된 후, 단백질을 세포벽 성분(예: 그램-양성 세균의 펩티도-글리칸 층)에 공유 결합시키는 펩티드 전이가 이어진다. 코지(Cozzi, R.) 등의 문헌[(2011) FASEB J 25(6): 1874-86]. 이 효소 메커니즘은 펩티드 또는 단백질의 융합을 달성하기 위해 조정될 수 있으며 최근 ADC의 제조에 사용되었다. 유럽 특허 출원 제 20130159 484 호(EP 2 777 714 호); 비얼리(Beerli, RR) 등의 문헌[(2015) PloS One 10(7): e0131177]. 공개된 접근 방식에서 모노클로날 항체는 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 소르타제 모티프를 포함하도록 유전적으로 변형되었으며, 세포 독성 약물은 올리고-글리신 스트레치를 포함하도록 변형되었다. 소르타제-촉진된 반응은 변형된 약물 분자를 항체 쇄의 C-말단에 고효율로 추가하여 균질한 ADC를 생성시켰다.
본 개시내용의 공중합체의 헤드 기를 올리고-글리신 스트레치로 변형함으로써, 공중합체 자체가 소르타제-촉진되는 반응의 표적이 된다. 공중합체에는 다수의 활성제가 로딩될 수 있기 때문에, 이 접근법은 많은 활성제 분자가 항체의 소수의 정의된(무해한) 부위(항체 분자 1개당 2 내지 4개의 C-말단 소타제 태그)에 연결되는 ADC를 생성시킨다. 결과적으로, DAR이 상승하고 ADC의 효능도 함께 높아진다. 최근에 개발된 2 내지 8개의 글리신 잔기를 포함하는 RAFT제를 사용하여 중합 개시시 공중합체의 올리고-글리신 스트레치를 도입할 수 있다. 이 작용화된 RAFT제를 사용하면 각 공중합체 분자에 하나의 소르타제 모티프만 존재한다.
또 다른 효소 커플링 방법은 트랜스글루타미나제-촉진되는 반응을 활용한다. 단백질-글루타민 감마-글루타밀트랜스퍼라제라고도 하는 트랜스글루타미나제는 일반적으로 한 단백질의 글루타민 잔기의 γ-카복시아미드기를 동일하거나 다른 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노기로 전달하여 단백질을 가교결합시킨다. 지난 20년 동안 이러한 효소는 식품 "육류 접착제(meat-glue)"로서 식품 산업[마틴스(Martins IM) 등 (2014), Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 6957-64?], 조직 공학[얼바(Ehrbar M.) 등 (2007) Bio-macromolecules, 8(10):3000-7], 치료 단백질의 변형[메로(Mero A.) 등 (2011) J Control Release, 154(1):27-34] 또는 유전자 전달[트렌틴(Trentin D.) 등 (2005) J Control Release, 102(1):263-75] 같은 다양한 분야에서 사용되었다.
이러한 맥락에서, 미생물 트랜스글루타미나제(MTg)는 내인성 인간 트랜스글루타미나제, 칼슘- 및 뉴클레오티드-비의존적 효소와 대조적으로 그 자체로 바람직한 부류의 효소이다. 이들은 인간 트랜스글루타미나아제의 4개 도메인에 비해 단일 도메인으로 구성되며, 인간 트랜스글루타미나아제의 약 절반의 분자량을 갖는다. 또한 MTg는 더 넓은 범위의 pH 값, 완충액 및 온도에서 작동하며 잠재적 기질 목록이 훨씬 더 많다. 키엘리스젝(Kieliszek M) 등의 문헌[(2014) Rev Folia Microbiol. 59: 241-50; 마틴스 등 (2014)].
소르타제-매개 커플링 전략과 유사하게, 트랜스글루타미나제 모티프는 RAFT-제의 변형에 의해 본 개시내용의 공중합체의 헤드 기에 도입되어 중합체 쇄당 하나의 트랜스글루타미나제 모티프만 도입되도록 보장한다. 적합한 모티프는 잠재적인 라이신 공여체 서열로서의 FKGG[어바 등 (2007)] 및 글루타민 수용체 서열로서의 LQSP 또는 TQGA[캐포레일(Caporale A.) 등 (2015) Biotechnol J. 10(1):154-61][이 경우에는 암 세포 특이적 표적화 잔기의 반응성 라이신 잔기가 사용됨] 같은 작은 펩티드(이들로 한정되지는 않음); 또는 잠재적인 글루타민 수용체 서열로서 말단 아미노기를 함유하는 3 내지 25 단위 길이의 단분산 PEG 스페이서이다.
이 전략의 변형은 클릭-반응성 기(예: 아지드 또는 테트라진)를 표적화 잔기, 예를 들어 모노클로날 항체에 부위-지정 부착하기 위해 트랜스글루타미나제를 사용하며, 상기 항체-연결된 반응성 기는 본 개시내용의 공중합체의 중합체 헤드 기에서 "반대" 클릭 반응성 기(알킨 또는 변형된 알켄)와의 반응을 위해 후속 사용된다. 공중합체/항체에서 언급된 반응성 부분은 호환적임을 의미한다. 이 바람직한 전략은 본원에 제시된 실시예(실시예 16, 23 및 34)에서 사용되었다.
표적화 잔기를 공중합체에 연결하기 위한 다른 방법이 이용될 수 있다. 표적화 항체 또는 다른 폴리펩티드는 예를 들어 아미노산 측쇄의 하이드록실 작용기를 반응성 알데하이드로 전환함으로써 번역 후 변경될 수 있다. 폴리뉴클레오티드-기반 표적화 잔기, 예를 들어 압타머의 경우, 본 개시내용의 공중합체에 대한 커플링은 고체상 합성 동안 압타머에 통합된 반응성 작용기(예를 들어, 아민, 티올, 알데히드)와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 다른 부위-지정 커플링 기술을 이용하여 공중합체를 표적화 잔기에 커플링할 수 있다.
약학 조성물
본 개시내용의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화된 유효량의 본 개시내용의 활성 잔기를 포함한다.
본 개시내용의 약학 조성물은 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 눈에 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해, 바람직하게는 주사(또는 주입)에 의한 투여에 의해 투여될 수 있다. 본 개시내용의 약학 조성물은 임의의 통상적인 약학적으로 허용되는 비독성 담체, 보조제 또는 비히클을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 제제의 pH는 제형화된 활성 잔기 또는 그의 전달 형태의 안정성을 향상시키기 위해 약학적으로 허용되는 산, 염기 또는 완충제로 조정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
주사가능한 제제, 예를 들어 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 유화액일 수 있다. 사용할 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 가용화 부형제는 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 400, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드 및 디메틸설폭시드 같은 수용성 유기 용매; 크레모포어(Cremophor) EL, 크레모포어 RH40, 크레모포어 RH60, 솔루톨(Solutol) HS15, d-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소르비탄 모노올리에이트, 폴록사머 407, 라브라필(Labrafil) M-1944CS, 라브라필 M-2125CS, 라브라솔(Labrasol), 겔루셔(Gellucire) 44/14, 소프티겐(Softigen) 767, 및 PEG 300, 400 및 1750의 모노- 및 디-지방산 에스테르 같은 비이온성 계면활성제; 피마자유, 옥수수유, 면실유, 올리브유, 땅콩유, 페퍼민트유, 홍화유, 참기름, 대두유, 경화 식물성유, 경화 대두유, 및 코코넛유 및 야자씨유의 중간쇄 트리글리세리드 같은 수불용성 지질; α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린[예: 클렙토즈(Kleptose)] 및 설포부틸에테르-β-사이클로덱스트린[예: 캅티솔(Captisol)] 같은 다양한 사이클로덱스트린; 및 레시틴, 수소화 대두 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, L-α-디미리스토일포스파티딜콜린 및 L-α-디미리스토일-포스파티딜글리세롤 같은 인지질을 포함한다. 스트릭클리(Strickley)의 문헌[(2004) Pharm. Res. 21: 201-30].
주사 가능한 제형은 예를 들어, 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 후속적으로 사용 전에 멸균수 또는 기타 주사가능한 멸균 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물에 멸균제를 혼입함으로써(또는 조사에 의해 고체 조성물을 멸균함으로써) 멸균될 수 있다.
활성제의 효과를 연장하기 위해, 종종 피하 또는 근육내 주사로부터 활성제의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 비경구 투여된 활성 잔기의 지연된 흡수는 활성 잔기를 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다. 주사 가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체의 활성 잔기를 마이크로캡슐화함으로써 제조된다. 중합체에 대한 활성 잔기의 비 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라 활성제 방출 속도를 제어할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 있다. 주사 가능한 데포 제형은 또한 신체 조직에 적합성인 리포솜 또는 마이크로유화액에 활성 잔기를 포획함으로써 제조된다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게는 본 개시내용의 활성 잔기를 주위 온도에서 고체이지만 체온에서 액체여서 직장이나 질강에서 녹아 활성 잔기(및 결과적으로 활성제)를 방출하는 부형제/담체인 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 적절한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합하여 제조할 수 있는 좌약이다.
안과용 제형, 점안액, 안연고, 분말 및 용액도 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
폐 전달을 위해, 본 개시내용의 약학 조성물을 제형화하여 직접 투여, 예를 들어 호흡기계로의 흡입에 의해 고체 또는 액체 미립자 형태로 환자에게 투여한다. 본 개시내용을 실시하기 위해 제조된 활성 잔기의 고체 또는 액체 미립자 형태는 호흡가능한 크기의 입자, 즉 흡입시 입과 후두를 통과하여 기관지 및 폐의 폐포 내로 통과하기에 충분히 작은 크기의 입자를 포함한다. 에어로졸화된 치료제, 특히 에어로졸화된 항생제의 전달은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 5,76 7,068 호, 미국 특허 제 5,508,269 호 및 WO 98/43650 호 참조). 항생제의 폐 전달에 대한 논의는 또한 미국 특허 제 6,014,969 호에 있다.
단일 투여량 또는 분할 투여량으로 인간 대상체 또는 환자에게 투여되는 본 개시내용의 활성 잔기의 총 1일 투여량은 바람직하게는 0.01 내지 50mg/kg 체중의 활성제 또는 보다 바람직하게는 0.1 내지 30mg/kg 체중의 활성제를 포함한다. 단일 투여 조성물은 1일 투여량을 구성하기 위해 이러한 양 또는 더 적은 여러 양을 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용에 따른 치료 계획은 이러한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 1일 약 1mg 내지 약 5000mg의 활성제(본 개시내용의 활성 잔기에 포함됨)를 투여하는 것을 포함한다. 포유동물에 대한 투여량은 인간 투여량에 기초하여 추정될 수 있다.
방사성 핵종, 특히 치료에 유용한 방사성 핵종을 포함하는 본 발명의 공중합체의 경우, 방사성 핵종의 투여량은 또한 방사능 단위, 바람직하게는 MBq/kg 체중으로 기재될 수 있다. 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 인간 대상체 또는 환자에게 투여되는 본 개시내용의 방사성 핵종을 포함하는 공중합체의 총 1일 투여량은 바람직하게는 3 내지 300MBq/kg 체중이다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 더욱 바람직한 투여 계획은 사용되는 방사성 핵종에 따라 달라진다. 이트륨-90을 포함하는 본 발명의 공중합체의 경우, 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 인간 대상체 또는 환자에게 투여되는 총 1일 투여량은 바람직하게는 5 내지 35MBq/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 7 내지 25MBq/kg 체중, 가장 바람직하게는 10 내지 15MBq/kg 체중이다. 루테튬-177을 포함하는 본 발명의 공중합체의 경우, 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 인간 대상체 또는 환자에게 투여되는 총 1일 투여량은 바람직하게는 5 내지 100MBq/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 80MBq/kg 체중, 가장 바람직하게는 10 내지 60MBq/kg 체중이다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 단일 투여량 조성물은 1일 투여량을 구성하는 이러한 양 또는 이보다 적은 여러 양을 함유할 수 있다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 당업자는 방사성 핵종 및 원하는 용도(예를 들어, 고형 종양의 치료, 혈액 종양의 치료, 효율적인 CART-T 요법을 가능하게 하는 림프 고갈)에 따라 바람직한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 개시내용의 활성 잔기는 예를 들어 약 0.01 내지 약 50mg/kg 체중의 활성제를 포함하는 1일 투여량으로서 주사에 의해, 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 근육내 또는 피하로; 또는 협측으로, 비강으로, 경점막으로, 안과용 제제로 국소적으로, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 다르게는, 투여량(활성제의 상기 1일 투여량을 기준으로 함)은 4 내지 120시간마다 또는 특정 활성 잔기의 요건에 따라 투여될 수 있다. 본원의 방법은 원하는 또는 명시된 효과를 달성하기 위한 유효량의 활성 잔기(약학 조성물 내)의 투여를 고려한다. 전형적으로, 본 개시내용의 약학 조성물은 1일 약 1 내지 약 6회 또는 다르게는 연속 주입으로서 투여될 것이다. 이러한 투여는 만성 또는 급성 요법으로 사용될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성시키기 위해 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 조합될 수 있는 활성 잔기의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 전형적인 조성물은 약 5% 내지 약 95% 활성 잔기(w/w)를 함유할 것이다. 다르게는, 이러한 제제는 약 20% 내지 약 80% 활성 잔기를 함유할 수 있다. 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료 계획은 사용되는 특정 활성 잔기의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식단, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 질병, 상태 또는 증상의 중증도 및 경과, 질병, 상태 또는 증상에 대한 환자의 성향, 치료 의사의 판단을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라진다.
간행물, 특허 및 특허 출원을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참조문헌은 전체가 통합된 것으로 간주된다.
본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서의 역할을 하도록 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 제공된 모든 정확한 값은 상응하는 근사값을 나타낸다(예를 들어, 특정 요인 또는 측정과 관련하여 제공된 모든 정확한 예시 값은 적절한 경우 "약"으로 수식된 상응하는 근사 측정치를 또한 제공하는 것으로 간주될 수 있음).
요소 또는 요소들을 참조하는 것과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 임의의 양태 또는 실시양태에 대한 본원의 기재는 달리 언급되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 그 특정 요소 또는 요소들로 "구성된다", "본질적으로 구성된다" 또는 "실질적으로 포함한다"라고 하는 본 개시내용의 유사한 양태 또는 실시양태에 대한 근거를 제공하고자 의도된다(예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에서 기재된 조성물은 달리 언급되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 해당 요소로 구성된 조성물을 기재하는 것으로도 이해되어야 함).
본 발명은 적용 가능한 법률이 허용하는 최대 범위 내에서 본원에 제시된 양태 또는 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다.
따라서, 일반적으로 기재된 본 개시내용은, 예시로서 제공되고 본 발명을 제한하고자 하지 않는 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
실시예
참고: 측쇄-연결된 아미노산의 합성과 관련된 실시예에서, 명칭은 먼저 IUPAC 명명법으로 제공된다. 이후에는 약칭을 사용한다. 표 1은 IUPAC 명칭 및 약칭에 해당하는 사항을 보여준다.
IUPAC 약칭
공동-주요 단량체
(S)-6-아크릴아미도-2-아미노헥산산 아크릴로일-L-라이신, AK
(2S)-3-(아크릴로일옥시)-2-아미노프로판산 아크릴로일-L-세린, AS
(2S)-3-(아크릴로일옥시)-2-아미노부탄산 아크릴로일-L-트레오닌, AT
(S)-3-(4-(아크릴로일옥시)페닐)-2-아미노프로판산 아크릴로일-L-티로신, AY
(S)-2-(4-아크릴아미도페닐)-2-아미노아세트산 아크릴로일-L-아미노-페닐알라닌, AHOX
(2S)-4-(아크릴로일옥시)피롤리딘-2-카복실산 아크릴로일-L-시스테인, AC
(R)-3-(아크릴로일티오)-2-아미노프로판산 아크릴로일-L-옥시-프롤린, AHOP
(R)-2-((5-아크릴아미도-1-카복시페닐)아미노)-2-옥소에탄디아조늄 AK-아지드
17-(4-아크릴아미도부틸)-1-아지도-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데칸-18-산 AK-PEG(4)-아지드
(S)-3-(4-아크릴아미도페닐)-2-(2-아지도아세트아미도)프로판산 AHOX-아지드
3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페녹시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)프로판아미드 테트라진-PEG(4)-MC
중합체 물질
α-에틸-트리티오카보네이트-ω-3급-부틸(14-메틸-2,5,8,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자펜타데실)카바메이트 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드) BOC-G3-DMA-RAFT 예비중합체
α-티올-ω-2-메틸프로판산 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드, (S)-6-아크릴아미도-2-아미노헥산산) HS-(DMA(55)-AK(4))
α-티올-ω-2-메틸프로판산 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드, (S)-6-아크릴아미도-2-(6-아지도헥산아미도)헥산산) HS-(DMA(55)-AK-(6-아지도헥사노일)(4))
α-티올-ω-2-메틸프로판산 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드, 2-하이드록시프로필)아크릴아미드) HS-(HPA(55)-AK(4))
중간체
2-(((에틸티오)카보노티오일)티오)-2-메틸프로판산 에틸-RAFT
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(((에틸티오)카보노티오일)티오)-2-메틸프로파노에이트 RAFT-NHS
3급-부틸 (2-(2-(((에틸티오)카보노티오일)티오)-2-메틸프로판아미도)에틸)카바메이트 RAFT-EDA-BOC
2-(2-(((에틸티오)카보노티오일)티오)-2-메틸프로판아미도)에탄아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트 RAFT-EDA-OTf
3급-부틸 (6,6-디메틸-7,12,15,18-테트라옥소-4-티옥소-3,5-디티아-8,11,14,17-테트라아자노나데칸-19-일)카바메이트 BOC-G(3)-RAFT
6,6-디메틸-7-옥소-4-티옥소-11,14,17,20,23-펜타옥사-3,5-디티아-8-아자펜타코산-25-아미늄 클로라이드 NH2-PEG(5)RAFT
2,2',2"-(10-(2,6-디옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 DOTA-무수물
4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스(아세트산)-10-[3-옥소-3-(5-아자디벤조사이클로옥틴)아세트아미드] DBCO-DOTA
2,2',2"-(10-(4-((2-((((1R,8S,9s)-비사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시)카보닐)아미노)에틸)아미노)-1-카복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 BCN-DOTA
N-[3-(11,12-디데하이드로디벤즈[b,f]아조신-5(6H)-일-3-옥소프로필]-2,5-디하이드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-프로판아미드 MC-DBCO
(E)-사이클로옥트-4-엔-1-일 (2-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 TCO-PEG(3)-아민
4-((3-아지도프로필)카바모일)-2-(6-하이드록시-3-옥소-3H-크산텐-9-일)벤조산 FAM-아지드
4-(2-(2-((((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (1-((1-((1-(2-(3-((1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)(메틸)카바메이트 MMAE-NHS
화학약품
N-하이드록시석신이미드 NHS
N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 EDC·HCl
2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드 VA044
4-아미노벤질 알콜 PABOH
N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 EEDQ
디이소프로필에틸아민 DIEA
N-메틸-2-피롤리돈 NMP
디클로로메탄 DCM
테트라하이드로푸란 THF
에틸 아세테이트 EtOAc
메탄올 MeOH
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)아세테이트 테트라진-NHS
본 개시내용에서 공중합체는 RAFT 중합과 같은 제어된 라디칼 중합 기술에 의해 중합되고 일반적으로 1.1 내지 1.4 범위의 낮은 다분산 지수(PDI)를 갖는다는 점에 주목한다. 본 개시내용에서 예시된 중합체성 약물 담체에 주어진 숫자는 공중합체 쇄의 평균 단량체 조성을 나타낸다. 본 개시내용에서 공중합체는 달리 언급되지 않는 한 랜덤 공중합체이다.
실시예 1: 6-아크릴아미도-2-(2-아지도아세트아미도)헥산산의 합성
Figure pct00012
테트라하이드로푸란 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-아지도아세테이트(4.0당량)의 용액을 H2O 중 6-아크릴아미도-2-아미노헥산산(1.0당량) 및 탄산수소나트륨(2.0당량)의 냉각된 용액에 적가하였다. 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. THF를 감압하에서 용액으로부터 제거하였다. 이어서, 6M HCl을 사용하여 용액을 pH 1로 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다(3×). 합한 유기 상을 Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 생성된 유성 필름을 소량의 EtOAc에 용해시키고 헵탄에 적가하였다. 침전된 미세한 백색 분말을 여과해내고 진공하에 건조시켜 원하는 생성물을 얻었다(95% 수율). 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 확인하였다.
실시예 2: 6-아크릴아미도-2-(6-아지도헥산아미도)헥산산의 합성
Figure pct00013
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-아지도헥사노에이트[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 스위스, 4.0당량)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 6-아크릴아미도-2-(6-아지도헥산아미도)헥산산(85% 수율)을 제조하였다. 수득된 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 확인하였다.
실시예 3: AK-PEG (4) -아지드의 합성
Figure pct00014
아지도-PEG(4)-NHS[클릭 케미스트리 툴즈(Click Chemistry Tools), 미국 스코츠데일, 4.0당량]를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 AK-PEG4-아지드(82% 수율)를 제조하였다. 수득된 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 확인하였다.
실시예 4: 구리 착체을 통한 (S)-6-아크릴아미도-2-아미노헥산산 단량체의 합성
L-라이신(14.62g; 100밀리몰)을 150mL 탈이온수에 용해시키고 약 80℃로 가열하였다. 탄산구리(16.6g; 75밀리몰)를 30분에 걸쳐 소량씩 첨가하였다. 반응물을 추가로 30분 동안 교반하였다. 뜨거운 짙은 청색 현탁액을 실리카겔을 통해 여과하였다. 필터를 소량의 물로 세척하였다. 다음날, 라이신 구리 착체를 함유하는 합쳐진 여액을 빙욕에서 냉각하고, 테트라하이드로푸란(THF) 100mL를 첨가하였다. 메틸-3급-부틸에테르(TBME) 중 아크릴로일 클로라이드의 용액(8.9mL, 110밀리몰)을 1시간 동안 적가하였다. pH는 10% 수산화나트륨 용액을 동시에 적가하여 초기에 8 내지 10으로 유지하였다. 아크릴로일 클로라이드 용액의 절반을 첨가한 후, 생성물이 침전되기 시작하였다. 대부분의 아크릴로일 클로라이드가 첨가되었을 때, 수산화나트륨을 느리게 첨가하여 pH가 약 6으로 떨어지도록 하고 반응 혼합물의 온도가 실온에 도달하도록 하였다. 청색 현탁액을 추가로 2시간 동안 교반한 다음 여과하였다. 필터에 남아있는 고체 물질을 물과 아세톤으로 세척한 후 건조시켰다. 아크릴로일-L-라이신 구리 착체 6.5g을 수득하였다.
아크릴로일-L-라이신 구리 착체(29.5g)를 300mL 탈이온수에 현탁시키고 빙욕에서 냉각시켰다. 황화구리 침전이 완료될 때까지 H2S 기체를 현탁액에 폭기시켰다. 3g의 활성탄을 현탁액에 첨가하였다. 현탁액을 100℃로 잠시 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 500mL 아세톤을 현탁액에 첨가한 다음 실리카겔 상에서 여과하였다. 투명한 여액을 회전 증발기에 넣었다. 용매를 증발시킨 후, 고체 생성물을 50% 수성 아세톤 200mL로부터 재결정화하였다. 백색 분말 17.76g(70%)을 수득하였다. 화합물의 구조를 NMR 및 LC-MS 분광법으로 확인하였다.
실시예 5: (2S)-3-(아크릴로일옥시)-2-아미노프로판산의 합성
물(50mL) 중 L-세린(5g, 47.6밀리몰)의 용액을 80℃로 가열하고, 고체 탄산구리(5.79g, 26.2밀리몰)를 첨가하였다. 용액을 10분 동안 교반하였다. 용해되지 않은 잔류물을 후속적으로 여과에 의해 수집하고 물(30mL)로 세척하였다. 합한 여액을 빙욕에서 냉각시키고, KOH(27.1mL, 47.6밀리몰)를 천천히 첨가하였다. 이 용액에 아세톤(30mL) 중 아크릴로일 클로라이드(4.52mL, 59.5밀리몰)의 혼합물을 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 교반 하에 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 형성된 고체를 단리하고 물(50mL)/메탄올(50mL)/에틸-3급-부틸에테르(50mL)(MTBE)로 세척하고 최종적으로 감압 하에 건조시켜 O-아크릴로일-L-세린-Cu2+ 착체(3.8g, 10.01밀리몰; 42.1% 수율)를 수득하였다. 착체 내의 구리를 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차에 의해 후속적으로 제거하였다. 아크릴로일-L-세린 1.43g(45%)을 백색 분말로서 수득하였다. 화합물의 정체는 NMR 및 LC-MS 분광법으로 확인하였다.
실시예 6: (2S)-3-(아크릴로일옥시)-2-아미노부탄산의 합성
6mL 트리플루오로아세트산(TFA)이 있는 반응 용기를 빙욕에서 냉각시켰다. 이어서, 고체 L-트레오닌(2.00g, 16.79밀리몰)을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 트리플루오로메탄설폰산(0.18mL, 2.0밀리몰), 및 이어서 아크릴로일 클로라이드(2.5mL, 32.9밀리몰)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 반응 완료 후, 생성물을 메틸-3급-부틸에테르(MTBE)로 침전시켰다. 고체를 단리한 후, 생성물을 MTBE 및 아세톤으로 세척하였다. O-아크릴로일-L-트레오닌 하이드로클로라이드를 최종적으로 감압 건조시켜 백색 분말을 얻었다(수율 32%). 화합물의 구조는 NMR 및 LC-MS 분광법으로 확인하였다.
실시예 7: (S)-3-(4-(아크릴로일옥시)페닐)-2-아미노프로판산의 합성
실시예 1에 기재된 절차에 따라 O-아크릴로일-L-티로신-Cu2+-착체의 합성을 수행하였다. 구리를 하기 절차에 의해 착체로부터 제거하였다: O-아크릴로일-L-티로신-Cu2+-착체 73.15g(140밀리몰)을 분쇄 접시에서 220mL 2N HCl에 용해시켰다. 폴리트론(Polytron)® PT 3000 장비를 사용하여 혼합물을 균질화하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고 잔류물을 50mL 2N HCl로 2회 세척하였다. 이어서, 고체 화합물을 감압 하에 40℃에서 NaOH 상에서 건조시켜 O-아크릴로일-L-티로신 하이드로클로라이드(46.96g, 63% 수율)를 수득하였다.
실시예 8: (S)-2-(4-아크릴아미도페닐)-2-아미노아세트산의 합성
Boc-4-아미노-L-페닐알라닌[2.50g, 8.9밀리몰, 아나스펙(Anaspec), 캘리포니아주 프리몬트]을 25mL 클로로포름에 용해시켰다. 이 용액에 트리에틸아민(2.47mL, 17.8밀리몰)을 넣고, 혼합물을 -15℃로 냉각시켰다. 이어서, 클로로포름 중 아크릴로일 클로라이드(0.79mL, 9.8밀리몰)를 교반 하에 혼합물에 적가하였다. 아크릴로일 클로라이드 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 유리 필터에 통과시키고, 보호된 (S)-2-(4-아크릴아미도페닐)-2-아미노아세트산을 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 잔류 용매를 증발시켰다. 수득된 (S)-2-(4-아크릴아미도페닐)-2-((3급-부톡시카보닐)아미노)아세트산 (500mg, 1.5 밀리몰)을 5mL 디클로로메탄(DCM)에 용해시켰다. 트리플루오르아세트산(TFA)(800μL, 10.38밀리몰)을 첨가하고, 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 감압하에서 용매를 제거하고, 5mL DCM을 첨가하고, 다시 감압하에서 용매를 제거하였다. 이 절차를 여러 번 반복하였다. 마지막으로, 생성물을 3mL DCM에 용해시키고 메틸-3급-부틸에테르(MTBE)로 침전시켰다. 고체를 유리 필터에 수집하고 진공에서 건조시켜, 순수한 아크릴로일-4-아미노-L-페닐알라닌을 15%의 수율로 얻었다. 화합물의 구조는 NMR로 확인하였다.
실시예 9: (2S)-4-(아크릴로일옥시)피롤리딘-2-카복실산 및 (R)-3-(아크릴로일티오)-2-아미노프로판산의 합성
이들 화합물의 합성은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. (2S)-4-(아크릴로일옥시)피롤리딘-2-카복실산 및 (R)-3-(아크릴로일티오)-2-아미노프로판산의 경우, 출발 물질은 각각 4-하이드록시-L-프롤린 및 L-시스테인이었다.
실시예 10: 실시예 8에 기초한 AHOX-아지드의 합성
Figure pct00015
테트라하이드로푸란 중 아크릴로일-4-아미노-L-페닐알라닌(4.0당량)의 용액을 H2O 중 6-아크릴아미도-2-아미노헥산산(1.0당량) 및 탄산수소나트륨(2.0당량)의 냉각된 용액에 적가한다. 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음 실온에서 하룻밤동안 교반한다. THF를 감압하에 용액에서 제거한다. 이어서, 6M HCl을 사용하여 용액을 pH 1로 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출한다(3×). 합한 유기 상을 Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 생성된 유성 필름을 소량의 EtOAc에 용해시키고 헵탄에 적가한다. 미세한 백색 침전물을 여과해내고 진공하에 건조시켜 원하는 생성물을 생성시킨다.
실시예 11: BOC-G (3) -RAFT제의 합성
단계 1: RAFT-NHS 중간체의 합성:
Figure pct00016
CH2Cl2 중 터커(Tucker) 등의 문헌[ACS Macro Letters (2017) 6(4): 452-457]에 기재된 바와 같이 합성된 에틸-RAFT(22.85g, 102밀리몰, 1.0당량) 및 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(12.89g, 112밀리몰, 1.1당량)의 용액에 0℃에서 EDC·HCl(21.48g, 112밀리몰, 1.1당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 N2의 흐름 하에 부분적으로 증발시키고(총 부피의 약 절반으로), AcOEt 및 재증류수(ddH2O)로 희석하였다. 2상 용액을 분리 깔때기로 옮기고, 추출 후, 유기 상을 ddH2O, NaHCO3의 포화 수용액(3×), ddH2O(2×) 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고(Na2SO4), 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 잔류물을 n-헥산으로 분쇄하고 생성된 황색 현탁액을 여과하였다. 케이크를 n-헥산으로 세척하였다. 황색 고체를 감압 건조시키고, 생성된 중간체(RAFT-NHS)를 추가 정제 없이 사용하였다(31.8g, 99.0밀리몰, 97%). 모든 분석 데이터는 문헌 값과 일치하였다. 양(Yang) 등의 문헌[(2012) Macromolecular Rapid communications 33(22): 1921-6].
단계 2: RAFT-EDA-BOC 중간체의 합성:
Figure pct00017
CH2Cl2중 RAFT-NHS 출발 물질(1.22g, 3.61밀리몰, 1.0당량)의 용액에 -10℃에서 CH2Cl2중 t-부틸-(2-아미노에틸)카바메이트(0.81g, 5.0밀리몰, 1.4당량) 및 Et3N(1.0mL, 7.2밀리몰, 2.0당량)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 유기 혼합물을 NH4Cl의 포화 수용액(2×), NaHCO3의 포화 수용액(2×) 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고(Na2SO4), 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 잔류물을 n-헵탄과 Et2O의 혼합물로부터 재결정화하였다. 황색 결정을 여과하고 n-헵탄으로 세척하고 감압 건조시켜 다음 중간체(RAFT-EDA-BOC, 1.26g, 3.44밀리몰, 95%)를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 MS 및 NMR 분광법으로 확인하였다.
단계 3: RAFT-EDA-OTf 중간체의 합성:
Figure pct00018
TFA 중 RAFT-EDA-BOC(1.25g, 3.41밀리몰, 1.0당량)의 차가운 용액을 60분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 MeOH 및 CH2Cl2(1/2)로 희석하고, 휘발성 물질을 N2의 흐름 하에 부분적으로(총 부피의 2/3) 제거하였다. 생성된 RAFT-EDA-OTf를 황색 오일(2.00g, 3.29밀리몰, 96%)로 단리하고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 얻어진 화합물의 구조는 MS 및 NMR 분광법으로 확인하였다.
단계 4: BOC-G (3) -RAFT 중간체의 합성:
Figure pct00019
CH2Cl2중 BOC-G(3)[바켐 아게(Bachem AG), 스위스 부벤도르프](697mg, 2.41밀리몰, 1.0당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)(92.0mg, 600μ몰, 0.25당량) 및 EDC·HCl(485mg, 2.53밀리몰, 1.05당량)의 용액을 불활성 분위기(N2) 하에 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 CH2Cl2 및 DIPEA(2.13mL, 12.5밀리몰, 5.2당량) 중 RAFT-EDA-OTf(917mg, 2.41밀리몰, 1.0당량)의 용액을 연속적으로 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기 혼합물을 NH4Cl 포화 용액(3×), NaHCO3의 포화 용액, ddH2O 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 수집하고 건조시키고(Na2SO4) 휘발성 물질을 감압하에서 부분적으로(총 부피의 2/3) 제거하였다. 생성된 용액에 EtOAc를 첨가하였다. 이어서, 생성된 탁한 용액을 냉장고에 하룻밤동안 보관하여 황색 현탁액을 수득하고, 이를 여과한 후 케이크를 차가운 EtOAc로 세척하였다. 황색 고체를 감압 건조시켜 BOC-G(3)-RAFT제(396mg, 736μ몰, 31 %)를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 MS 및 NMR 분광법으로 확인하였다.
본원에 제시된 실시예는 올리고-글리신 스페이서로 작용화된 RAFT제의 합성을 위한 일반적인 절차인 것으로 생각된다. 더 길거나 더 짧은 스페이서는 올리고-글리신 구성 블록의 교환에 의해 합성될 수 있다.
실시예 12: RAFT-PEG (5) -NH 3 Cl의 합성
Figure pct00020
CH2Cl2중 RAFT-NHS 출발 물질(1.4밀리몰)의 용액에 CH2Cl2중의 BOC-PEG(5)-CH2CH2-NH2(1.4밀리몰) 및 Et3N(1.5밀리몰)의 용액을 0℃에서 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고 RP-18 컬럼 크로마토그래피(1:1 ACN:H2O)로 정제하여, RAFT-PEG(5)-BOC(1.2밀리몰, 88%)를 수득하였다. 구조는 질량 분석 및 NMR 분광 데이터로부터 결정하였다.
EtOAc 중 3M HCl 중 RAFT-PEG(5)-BOC(0.25밀리몰)의 차가운 용액을 120분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 RP-18 컬럼 크로마토그래피(1:1 ACN:H2O+0.1% 아세트산)로 정제하였다. 생성된 RAFT-PEG(5)-NH3Cl을 황색 오일로서 단리하였다(0.21밀리몰, 84%). 구조는 질량 분석 및 NMR 분광 데이터로부터 결정하였다.
실시예 13: NH 2 -PEG (5) RAFT를 사용한 NH 2 -PEG (5) -(DMA (45) AK-아지드 (4) ) 공중합체의 합성
Figure pct00021
0.1M NaHCO3 중 DMA(100μL, 970μ몰, 30당량) 및 AK-아지드(69.7mg, 259μ몰, 8당량)의 용액에 NH2-PEG(5) RAFT(16.92mg, 32.2μ몰, 1.0당량) 및 VA044(3.14mg, 9.7μ몰, 0.3당량)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ddH2O 및 디옥산으로 희석하였다. 이 용액에 포스핀산(50w%, 27μL, 158μ몰, 5당량), TEA(22μL, 158μ몰, 5당량) 및 AIBN(1.6mg, 9.5μ몰, 0.3당량)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 8시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 NH2-PEG(5)-(DMA(45)-AK-아지드(4))를 백색 분말로서 수득하였다(130mg, 120μ몰, 두 단계에 걸쳐 85%). 얻어진 화합물의 구조는 하기 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC에 의해 조사하였다: 용리 완충액(0.05%(w/v) NaN3를 함유하는 탈이온수)에서 3.33mg/mL 공중합체의 모용액을 제조하고, 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 이어서, GPC 장치[1260 인피니티 LC-시스템(1260 Infinity LC-System), 애질런트(Agilent), 캘리포니아주 산타 클라라]의 포트에 0.4mL의 모용액을 주입하였다. 용리 완충액에서 0.5mL/분의 일정한 유속으로 크로마토그래피를 수행하였다. 55℃의 외부 컬럼 오븐에 배치된 슈프리마(Suprema) 3-컬럼 시스템(예비-컬럼, 1000Å, 30Å; 5μm 입자 크기; PSS, 독일 마인즈)에서 공중합체 샘플을 분리하였다. 공중합체를 RI(굴절률) 및 UV 검출기로 분석하였다. 하기 10개의 중합체(Mw, Mn 및 PDI가 제공됨)를 비롯하여, PSS(독일 마인즈)에서 얻은 풀룰란 표준을 사용하여 검량선(10개 지점)을 확립하였다: (1) Mw: 342/Mn: 342, PDI 1.0; (2) Mw: 1320/Mn: 1080, PDI 1.23; (3) Mw: 6200/Mn: 5900, PDI 1.05; (4) Mw: 10000/Mn: 9200, PDI 1.09; (5) Mw: 21700/Mn: 20000, PDI 1.09; (6) Mw: 48800/Mn: 45500, PDI 1.07; (7) Mw: 113000/Mn: 100000, PDI 1.13; (8) Mw: 210000/Mn: 189000, PDI 1.11; (9) Mw: 366000/Mn: 318000, PDI 1.15; (10) Mw: 805000/Mn: 636000, PDI: 1.27. 이 표준을 참조하여 특성화된 공중합체의 분자량을 추정하였다. 이를 위하여, 소프트웨어 PSS WinGPC 유니크롬(Unichrom) V:8.1 빌드(Build) 2827(PSS; https://www.pss-polymer.com/)에 의해 GPC 측정치에 기초하여, 중합체의 중량 평균 분자량(Mw), 중합체의 수평균 분자량(Mn) 및 PDI를 결정한다.
실시예 14: NH 2 -PEG (5) -(DMA (45) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00022
0.1M NaHCO3 중 NH2-PEG(5)-(DMA(45)AK-아지드(4))(20mg, 3.45μ몰) 및 킬레이트화제 BCN-DOTA[케마테크 디종(Chematech Dijon), 프랑스](24mg, 34μ몰)의 용액을 35℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜, NH2-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA(4))를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다.
실시예 15: DBCO-NH-PEG (5) -(DMA (45) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00023
DMF 중 실시예 14에 따라 합성된 NH2-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA(4))(10mg, 1.15μ몰), DBCO-NHS(3.96mg, 9.2μ몰) 및 TEA(1.275μL, 9.2μ몰)의 용액을 25℃에서 7시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜, DBCO-NH-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA(4))를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다. 이 DBCO 기의 활성을 확인하기 위해, 수득된 중합체를 DMF에 용해시키고 과량의 FAM-아지드를 실온에서 첨가하고 혼합물을 4시간 동안 교반하였다. 생성된 화합물을 실시예 13에 제시된 프로토콜을 이용하여 GPC로 검증하였다
실시예 16: 암 세포 과발현 Her2 수용체의 진단 및 치료 표적화를 위한 방사성 표지된 트라스투주맙-[NH-PEG (4) -트리아졸-PEG (5) -(DMA (45) AK-DOTA (4) )] 2 컨쥬게이트의 합성
Figure pct00024
종양 진단에서, 말기 종양은 종종 불량한 예후와 관련되기 때문에 원발성 종양 또는 그의 전이에 대한 검출 한계는 환자의 생존율에 중요하다. 암 세포의 검출 및 후속 치료를 위해 방사성 표지된 종양 조직-특이적 항체를 사용하는 것은 잠재적으로 유망한 방사선 의학 방법이다. 그러나, 표적화 잔기/항체에 소수의 방사성 동위원소만 부착될 수 있고 관심 있는 방사성 동위원소의 반감기가 짧다(보통 항체의 반감기보다 더 짧음)는 사실 때문에, 이러한 유형의 접근 방식은 낮은 신호 대 노이즈 비로 인해 방해를 받았다. 따라서, 방사성 동위원소의 로딩 증가는 매우 바람직할 것이다. 이 실시예에는, 개선된 종양 세포 검출 및 치료를 위한 방사성 표지된 항체-공중합체 컨쥬게이트가 기재된다.
실시예 15에 제시된 절차에 의해 합성된 DBCO-작용화된 공중합체 DBCO-NH-PEG(5)-(DMA(45)-AK-DOTA(4)를, 덴러(Dennler) 등의 문헌[Bioconjugate Chem. (2014) 25: 569-578]에 기재된 절차에 의해 위치 295의 글루타민(Q 295)에서 아지드기로 작용화된 IgG 유형의 암 세포-특이적 항체(Her2+ 암 세포를 표적화하기 위한 트라스투주맙)에 컨쥬게이션시켰다.
간단히 말해서, 항체를 PNGaseF[메르크 카가아(Merck KGaA), 독일 다름스타트]에 의해 탈당화시켰다. Q295를 활성화하기 위해 PBS(pH 7.4) 중 트라스투주맙[카보신쓰 리미티드(Carbosynth Ltd), 영국 버크셔] 10μg당 효소 1유닛을 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 이어서, PBS(pH 8) 중 탈당화된 트라스투주맙(6.6μm)을 NH2-PEG(4)-아지드(클릭 케미스트리 툴즈, 미국 스코츠데일)(80몰당량) 및 미생물 트랜스글루타미나제(MTGase)[6U/mL, 제디라(Zedira), 독일 다름스타트]와 함께 37℃에서 16시간 동안 항온처리 하였다. 항온처리 후, MTGase 반응정지제(제디라, 독일 다름스타트)를 첨가함으로써 MTGase 활성을 차단시켰다. 과량의 NH2-PEG4-아지드, MTGase 및 잔류 PNGaseF를 제거하기 위해, 아미콘(Amicon)® 울트라(Ultra) 4mL 컬럼(100kDa MWCO, 메르크 카가아, 독일 다름스타트)을 사용하여 반응 혼합물을 NH4OAc(0.5m, pH 5.5) 중으로 완충액-교환시켰다(3회).
이어, 트라스투주맙-(NH-PEG(4)-아지드)2를 3배 몰 과량의 DBCO-작용화된 중합체와 함께 37℃에서 하룻밤동안 항온처리함으로써, 실제 클릭 반응을 수행하였으며, 트라스투주맙-[NH-PEG(4)-트리아졸-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA(4))]2를 수득하였다. 개질되지 않은 트라스투주맙을 대조군으로 사용하는 SDS PAGE에 의해 반응의 성공 여부를 조사하였다. 5μl 4× SDS-PAGE 로딩 완충액+10% w/v β-메르캅토에탄올[바이오라드(Biorad), 독일]을 첨가함으로써 반응 혼합물(20μl)을 중단시키고, 항온처리하였다(60분, 37℃, 600rpm에서 일정하게 진탕시킴). 후속적으로 40분 동안 150V에서 4 내지 20% SDS-PAGE 겔[미니-프로틴(Mini-PROTEAN)® TGX™ 프리캐스트 겔즈 바이오라드(Precast Gels Biorad), 독일]에서 샘플을 전기영동시킨 후, 겔을 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색시켰다. 이 실험은 공중합체를 사용한 항체 중쇄의 정량적 작용화를 보여주었다.
과량의 중합체 및 작용화되지 않은 잔여 트라스투주맙을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 제거할 수 있고, 원하는 생성물을 함유하는 분획을 합할 수 있다.
111-InCl3(트라스투주맙-[NH-PEG(4)-트리아졸-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA(4))]2 1μg당 4MBq)을 사용한 항체-공중합체 컨쥬게이트의 방사성 표지를 37℃에서 1시간동안 수행한 후, 인듐-111-표지된 항체-중합체-컨쥬게이트를 0.5mL/분의 유속으로 실행되는 슈퍼덱스(Superdex) 75 10/300 GL 컬럼[GE 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 시카고] 상에서의 SEC에 의해 정제시킨다. 주요 피크 분획을 모은다. 생성된 트라스투주맙-[NH-PEG(4)-트리아졸-PEG(5)-(DMA(45)AK-DOTA-IN-111(4))]2는, 예를 들어 유방암, 결장암 또는 폐암 환자에서 양전자-방출-단층촬영(PET)에 의해, 기존의 항체-방사성 동위원소 착체에 의해 얻을 수 있는 것보다 더 높은 감도로, Her2+ 암 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 감도가 증가한 것은 기존의 방사성 표지된 항체와 비교하여 항체-담체 착체에 의해 운반되는 In-111 로딩이 증가했기 때문이다.
동일한 절차를 이용하여, 루테슘-177[상기 절차에서 사용된 111-InCl3가 177-LuCl3로 대체됨]과 같은 적합한 치료용 방사성 동위원소가 로딩된 치료용 항체-공중합체 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.
실시예 17: NH 2 -PEG (5) -(DMA (45) AK-아지드 (4) )를 사용한 테트라진-NH-PEG (5) -(DMA (45) AK-아지드 (4) ) 공중합체의 합성
Figure pct00025
DMF 중 실시예 13에 따라 합성된 NH2-PEG(5)-(DMA(45)AK-아지드(4))(3.57μ몰), 테트라진-NHS(18μ몰) 및 TEA(3.57μ몰)의 용액을 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. 이어, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 테트라진-NH-PEG(5)-(DMA(45)AK-아지드(4))를 수득하였다. 수득된 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다.
실시예 18: BOC-G (3) -RAFT 예비중합체의 합성
Figure pct00026
다이옥산 중 DMA(1000μL, 9704μ몰, 15당량)의 용액에 BOC-G3-RAFT(348mg, 647μ몰, 1.0당량) 및 AIBN(31.9mg, 194μ몰, 0.3당량)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 n-헥산으로 희석하고 n-헥산으로 세척한 후 예비중합체를 황색 분말로서 수득하였다. 수득된 화합물의 구조는 다음 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC에 의해 조사하였다: 용리 완충액(0.05% (w/v) NaN3를 함유하는 탈이온수) 중에서 3.33mg/mL 공중합체의 모용액을 제조하고, 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 이어서, GPC 장치(1260 인피니티 LC-시스템, 애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)의 포트에 0.4mL의 모용액을 주입하였다. 용리 완충액에서 0.5mL/분의 일정한 유속으로 크로마토그래피를 수행하였다. 55℃의 외부 컬럼 오븐에 배치된 슈프리마 3-컬럼 시스템(예비-컬럼, 1000Å, 30Å; 5μm 입자 크기; PSS, 독일 마인즈) 상에서 공중합체 샘플을 분리시켰다. 공중합체를 RI(굴절률) 및 UV 검출기로 분석하였다. 풀룰란 표준을 사용하여 검량선(10개 지점)을 확립하였다. 이 표준을 참조하여 특성화된 공중합체의 분자량을 추정하였다.
실시예 19: Boc-G (3) -(DMA (45) AK (4) AK-아지드 (4) )의 합성
Figure pct00027
ddH2O 중 DMA(116μL, 1120μ몰, 30당량), AK(30mg, 150μ몰, 4당량), AK-아지드(42mg, 150μ몰, 4당량)의 용액에 실시예 16의 BOC-G(3)-RAFT 예비중합체(79mg, 37μ몰, 1.0당량) 및 VA044(3.6mg, 11.2μ몰, 0.3당량)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜, BOC-G(3)-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(l4))를 얻었다. 실시예 13에 제시된 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC에 의해, 수득된 화합물의 구조를 조사하였다.
실시예 20: Boc-G (3) -(DMA (45) AK (4) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00028
DMF 중 Boc-G3-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(4))(260mg, 37μ몰, 1당량)의 용액에 DMF 중 DBCO-DOTA(199mg, 300μ몰, 8당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 디옥산으로 희석시켰다. 이 용액에 포스핀산(50중량%, 32μL, 185μ몰, 5당량), TEA(26μL, 158μ몰, 5당량) 및 AIBN(1.9mg, 11.1μ몰, 0.3당량)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 8시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석시키고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 Boc-G3-(DMA(45)AK(4)AK-DOTA(4))를 백색 분말로서 수득하였다(198mg, 22μ몰, 3단계에 걸쳐 56%). 얻어진 화합물의 구조를, 실시예 13에 제시된 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC로 조사하였다.
실시예 21: Boc-G 3 -(DMA (45) AK-MMAE (4) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00029
ddH2O 중 Boc-G3-(DMA(45)AK(4)AK-DOTA(4))(14mg, 1.5μ몰, 1당량)의 용액에 DMSO 중 MMAE-NHS(5당량)(세포 독성제)의 용액을 첨가하고, 35℃에서 24시간 동안 교반한다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 Boc-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)-AK-DOTA(4))를 얻는다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사한다.
실시예 22: DBCO-G 3 -(DMA (45) AK-MMAE (4) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00030
Boc-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))(28mg, 2μ몰)를 DCM 중 TFA의 용액(1:1)에 용해시킨다. 4시간 후, 유기 용매를 감압 하에 제거하여 NH3Cl-G3-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))를 수득한다. DMF 중 NH3Cl-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))(14, 1μ몰, 1당량)의 용액에 DBCO-NHS(3.4mg, 8μ몰, 8.0당량) 및 TEA(1.1μL, 8μ몰, 8.0당량)를 연속적으로 첨가한다. 반응 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반한다. 생성된 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa), 잔류물을 동결 건조시켜 DBCO-NH-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4)를 수득한다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사한다. 이 DBCO-기의 활성을 확인하기 위해, 얻어진 중합체를 DMF에 용해시키고 FAM-아지드를 첨가하였다. 실시예 13에 제시된 프로토콜을 이용하여 GPC로 생성된 화합물을 확인하였다.
실시예 23: 암 세포 과발현 Her2 수용체의 진단 및 치료 표적화를 위한 방사성 표지된 트라스투주맙-[NH-PEG (4) -트리아졸-PEG-NH-G (3) -(DMA (45) AK-MMAE (4) AK-DOTA (4) ] 2 컨쥬게이트의 합성
Figure pct00031
대부분의 종양 치료는 종양 크기의 감소(CT, MRT 스캔)에 의해 정성적으로 모니터링되며, 일반적으로 세포 독성제의 분포에 대한 상세한 특성화는 수행되지 않는다. 어떤 경우에는 비침습적 방법으로 실제 조직 분포에 대한 정보를 얻는 것이 유용할 수 있다. 동일한 약물 담체에 치료적 접근을 위한 세포 독소와 모니터링을 위한 진단용 방사성 동위원소를 결합시킴으로써 이를 달성할 수 있다. 이 접근 방식 덕분에, 컨쥬게이션된 항체-중합체의 운명을 가시화하고 잠재적인 부작용, 예컨대 간에서의 의도하지 않은 대사 또는 다른 조직에서의 응집에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 이 접근법은 특히 투여량 발견 및 부작용이 특성화되는 1상 임상 연구에 유리할 것이다.
실시예 22에 제시된 절차에 의해 합성된 DBCO-작용화된 공중합체(DBCO-NH-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))는 덴러 등의 문헌[Bioconjugate Chem. (2014) 25: 569-578]에 기재된 절차에 의해 위치 295의 글루타민(Q 295)에서 아지드기로 작용화된 IgG 형의 암 세포-특이적 항체(Her2+ 암 세포를 표적화하기 위한 트라스투주맙)에 컨쥬게이션된다.
간단히 말해서, 항체는 PNGaseF(메르크 카가아, 독일 다름스타트)에 의해 탈당화된다. Q295를 활성화하기 위해, PBS(pH 7.4)에서 트라스투주맙(카보신쓰 리미티드, 영국 버크셔) 10μg당 효소 1유닛을 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 하룻밤동안 항온처리한다. 이어서, PBS(pH 8)에서 탈당화된 트라스투주맙(6.6μm)을 NH2-PEG4-아지드(클릭 케미스트리 툴즈, 미국 스코츠데일)(80몰당량) 및 미생물 트랜스글루타미나제(MTGase)(6U/mL, 제디라, 독일 다름스타트)와 함께 37℃에서 16시간 동안 항온처리한다. 항온처리 후, MTGase 반응정지제(제디라, 독일 다름스타트)를 첨가함으로써 MTGase 활성을 차단한다. 과량의 NH2-PEG4-아지드, MTGase 및 잔류 PNGaseF를 제거하기 위해, 아미콘® 울트라 4mL 컬럼(100kDa MWCO, 메르크 카가아, 독일 다름스타트)을 이용함으로써, 반응 혼합물을 NH4OAc(0.5m, pH 5.5) 중으로 완충액-교환한다(3회).
이어, 트라스투주맙-(NH-PEG4-아지드)2를 3배 몰 과량의 DBCO-작용화된 중합체와 함께 37℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 실제 클릭 반응을 수행하여, 트라스투주맙-[DBCO-NH-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4)]2를 수득한다. 개질되지 않은 트라스투주맙을 대조군으로 사용하여 SDS PAGE에 의해 반응의 성공 여부를 조사한다. 5㎕ 4× SDS-PAGE 로딩 완충액+10% w/v β-메르캅토에탄올(바이오라드, 독일)을 첨가함으로써 반응 혼합물(20μl)을 중단시키고, 항온처리시킨다(60분, 37℃, 600rpm에서 일정하게 진탕시킴). 이어, 4 내지 20% SDS-PAGE 겔(미니-프로틴® TGX™ 프리캐스트 겔즈 바이오라드, 독일) 상에서 150V에서 40분 동안 샘플을 전기영동시키고, 이어 겔을 쿠마씨 블루 염색시킨다.
과량의 중합체 및 작용화되지 않은 잔여 트라스투주맙을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 제거할 수 있으며, 완전히 작용화된 항체를 함유하는 분획을 모은다.
111-InCl3(트라스투주맙-[DBCO-NH-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4)]2 1μg당 4MBq)를 사용하여 37℃에서 1시간동안 항체-공중합체 컨쥬게이트의 방사성 표지를 수행한 후, 0.5mL/분의 유속으로 실행되는 슈퍼덱스 75 10/300 GL 컬럼(GE 헬쓰케어, 미국 시카고) 상에서 SEC에 의해 인듐-111-표지된 항체-중합체-컨쥬게이트를 정제시킨다. 주요 피크 분획을 모은다. 생성된 트라스투주맙-[DBCO-NH-G(3)-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-아지드-(DOTA-In-111)4]2를 사용하여, 예컨대 유방암, 결장암 또는 폐암 환자에서 양전자-방출-단층촬영(PET)으로, 기존 항체-방사성 동위원소 착체에 의해 얻을 수 있는 것보다 더 높은 감도로 Her2+ 암 세포를 검출할 수 있다. 감도가 증가한 것은 기존의 방사성 표지된 항체와 비교하여 항체-담체 착체에 의해 운반되는 In-111 로딩이 증가하기 때문이다.
실시예 24: 테트라진-G (3) -(DMA (45) AK-DOTA (4) AK-아지드 (4) )
Figure pct00032
ddH2O 중 Boc-G(3)-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(4))(14mg, 1.5μ몰, 1당량)의 용액에 DMSO 중 DOTA-NHS(6μ몰, 4당량)의 용액을 첨가하고 35℃에서 24시간 동안 교반한다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 Boc-G(3)-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))를 얻었다. 이어서, Boc-G(3)-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))(2μ몰)를 DCM 중 TFA 용액(1:1)에 용해시킨다. 4시간 후, 유기 용매를 감압 하에 제거하여 NH2-G(3)-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))를 얻었다. DMF 중 NH2-G(3)-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))(14.1μ몰)의 용액에 테트라진-NHS(5μ몰)와 TEA(2μ몰)를 연속적으로 첨가한다. 반응 혼합물을 25℃에서 8시간 동안 교반한다. 생성된 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa), 잔류물을 동결 건조시켜 테트라진-NH-G(3)-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))를 수득한다. 수득된 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사한다.
실시예 25: HS-(DMA (45) AK-아지드 (4) )의 합성
Figure pct00033
ddH2O 중 DMA(116μL, 1120μ몰, 45당량), AK-아지드(42mg, 150μ몰, 4당량)의 용액에 에틸-RAFT(실시예 11 참조)(5.6mg, 24.9μ몰, 1.0당량) 및 VA044(3.6mg, 11.2μ몰, 0.3 당량)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 사이클로헥실아민(493μL, 4977μ몰, 200당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK-아지드(4))를 백색 분말로서 수득하였다(120mg, 20μ몰, 세 단계에 걸쳐 81%). 실시예 13의 프로토콜을 이용하여, 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법 및 GPC로 조사하였다.
실시예 26: HS-(DMA (45) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00034
ddH2O 중 HS-(DMA(45)AK-아지드(4))(20mg, 3.5μ몰, 1당량)의 용액에 DMSO 중 DBCO-DOTA(19.0mg, 24μ몰, 8당량)의 용액을 첨가하고, 35℃에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK-DOTA(4))를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다.
실시예 27: DBCO-(DMA (45) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00035
DMF 중 HS-(DMA(45)AK-DOTA(4))(28mg, 3μ몰)의 용액에 MC-DBCO(11.61mg, 14.4μ몰, 8.0당량)를 첨가하였다. 4시간 후 반응 혼합물을 ddH2O로 희석시킨 다음, 0.1M NH4HCO3에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결건조시켜 DBCO-(DMA(45)AK-DOTA(4)를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다. 이 DBCO-기의 활성을 확인하기 위하여, 얻어진 중합체를 DMF에 용해시키고 FAM-아지드를 첨가하였다. 생성된 화합물을 하기 프로토콜을 사용하여 GPC로 확인하였다: 용리 완충액(0.05%(w/v) NaN3를 함유하는 탈이온수)에서 3.33mg/mL 공중합체의 모용액을 제조하고, 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 이어, GPC 장치(1260 인피니티 LC-시스템, 애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)의 포트에 0.4mL의 모용액을 주입하였다. 용리 완충액에서 0.5mL/분의 일정한 유속으로 크로마토그래피를 수행하였다. 55℃의 외부 컬럼 오븐에 위치된 슈프리마 3-컬럼 시스템(예비-컬럼, 1000Å, 30Å; 5μm 입자 크기; PSS, 독일 마인즈) 상에서 공중합체 샘플을 분리시켰다. 공중합체를 RI(굴절률) 및 UV 검출기로 분석하였다. 풀룰란 표준을 사용하여 검량선(10개 지점)을 확립하였다. 이 표준을 참조하여 특성화된 공중합체의 분자량을 추정하였다. 이 시험에서, 495nm(FAM)의 신호와 공중합체의 RI 신호는 오버레이에서 일치를 보여, 공중합체가 활성 DBCO 헤드 기로 작용화되었음을 나타내었다.
실시예 28: HS-(DMA (45) AK (4) AK-아지드 (4) )의 합성
Figure pct00036
ddH2O 중 DMA(116μL, 1120μ몰, 45당량), AK(30mg, 150μ몰, 4당량), AK-아지드(42mg, 150μ몰, 4당량)의 용액에 에틸-RAFT(실시예 11 참조)(5.6mg, 24.9μ몰, 1.0당량) 및 VA044(3.6mg, 11.2μ몰, 0.3당량)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 사이클로헥실아민(493μL, 4977μ몰, 200당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(4))를 백색 분말(150mg, 23μ몰, 3단계에 걸쳐 88%)로서 수득하였다. 수득된 화합물의 구조를 실시예 13의 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC로 확인하였다.
실시예 29: HS-(DMA (45) AK (4) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00037
ddH2O 중 HS-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(4))(20mg, 3μ몰, 1당량)의 용액에 DMSO 중 DBCO-DOTA(16.3mg, 24μ몰, 8당량)의 용액을 첨가하고 35℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK(4)AK-DOTA(4))를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사하였다.
실시예 30: MMAE와 HS-(DMA (45) AK (4) AK-DOTA (4) )의 커플링
Figure pct00038
ddH2O 중 HS-(DMA(45)AK(4)AK-DOTA(4))(14mg, 1.5μ몰, 1당량)의 용액에 DMSO 중 MMAE-NHS(15.16mg, 12μ몰, 8당량)의 용액을 첨가하고 35℃에서 24시간 동안 교반한다. 그 다음 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))를 얻는다. 얻어진 화합물의 구조는 NMR 분광법으로 조사할 수 있다.
실시예 31: DBCO-DMA (45) AK-MMAE (4) AK-DOTA (4) )의 합성
Figure pct00039
DMF 중 HS-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4))(28mg, 1.8μ몰)의 용액에 MC-DBCO(6.1mg, 14.4μ몰, 8.0당량)를 연속적으로 첨가한다. 4시간 후, 반응 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음 0.1 M NH4HCO3에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa), 잔류물을 동결 건조시켜 DBCO-MC-S-(DMA(45)AK-MMAE(4)AK-DOTA(4)를 수득한다. 수득된 화합물의 구조를 NMR 분광법으로 조사한다. DBCO-기의 활성을 확인하기 위하여, 소량의 공중합체 샘플을 DMF에 용해시키고 FAM-아지드를 첨가한 후 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 그 후, 이렇게 작용화된 공중합체는 RI 신호 및 UV(495nm)의 검출과 함께 실시예 13의 프로토콜을 이용하여 GPC에 의해 분석될 수 있다. 이 시험에서, 공중합체의 495nm(FAM)의 신호 및 RI 신호는 오버레이에서 일치를 보여주어, 공중합체가 활성 DBCO 헤드 기으로 작용화되었음을 나타내었다.
실시예 32: 테트라진-(DMA (45) AK-아지드 (4) )의 합성
Figure pct00040
DMF 중 HS-(DMA(45)AK-아지드(4))(1당량)의 용액에 테트라진-PEG(4)-MC(8.0당량)를 첨가한다. 4시간 후, 반응 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음 0.1M NH4HCO3에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 테트라진-(DMA(45)AK-아지드(4))를 얻었다.
실시예 33: 테트라진-(DMA (45) AK-DOTA (4) AK-아지드 (4) )의 합성
Figure pct00041
ddH2O 중 HS-(DMA(45)AK(4)AK-아지드(4))(1당량)의 용액에 DMSO 중 DOTA-NHS(6μ몰, 4당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 35℃에서 24시간 동안 교반한다. 그런 다음, 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa), 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))를 수득한다.
DMF 중 HS-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4))(1당량)의 용액에 테트라진-PEG(4)-MC(8.0당량)를 첨가한다. 4시간 후, 반응 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음 0.1M NH4HCO3에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜 테트라진-(DMA(45)AK-DOTA(4)AK-아지드(4)를 수득한다.
실시예 34: 암 세포 과발현 Her2 수용체의 진단 및 치료 표적화를 위한 방사성 표지된 트라스투주맙-아지드-공중합체(실시예 17, 24, 32 및 33) 컨쥬게이트의 합성
실시예 17, 24, 32 및 33에 제시된 절차 중 하나에 의해 합성된 테트라진-작용화된 공중합체는 TCO-PEG(3)-아민을 기질로서 사용하여 덴러 등의 문헌[Bioconjugate Chem. (2014) 25: 569-578]에 기재된 절차에 의해 글루타민 위치 295(Q 295)에서 TCO-기로 작용화된 IgG 유형의 암 세포-특이적 항체(예: Her2+ 암 세포를 표적화시키기 위한 트라스투주맙)에 컨쥬게이션된다.
간단히 말해서, 항체는 PNGaseF(메르크 카가아, 독일 다름스타트)에 의해 탈당화된다. Q295를 활성화하기 위해, PBS(pH 7.4) 중 트라스투주맙(카보신쓰 리미티드, 영국 버크셔) 10μg당 효소 1유닛을 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 하룻밤동안 항온처리한다. 후속적으로, PBS(pH 8) 중 탈당화된 트라스투주맙(6.6μm)을 TCO-PEG(3)-아민(80몰당량) 및 미생물 트랜스글루타미나제(MTGase)(6U/mL, 제디라, 독일 다름스타트)와 함께 37℃에서 16시간동안 항온처리한다. 항온처리 후, MTGase 반응정지제(제디라, 독일 다름스타트)를 첨가함으로써 MTGase 활성을 차단한다. 과량의 TCO-PEG(3)-아민, MTGase 및 잔류 PNGaseF를 제거하기 위해, 아미콘® 울트라 4mL 컬럼(100kDa MWCO, 메르크 카가아, 독일 다름스타트)을 사용하여 반응 혼합물을 NH4OAc(0.5m, pH 5.5) 중으로 완충제-교환(3회)시킨다.
트라스투주맙-(NH-PEG(3)-TCO)(2)를 3배 몰 과량의 테트라진-작용화된 중합체(실시예 17, 24, 32 또는 33)와 함께 37℃에서 하룻밤동안 항온처리함으로써, 실제 클릭 반응을 후속적으로 수행하여, 실시예 17, 24, 32 및 33에서 합성된 공중합체에 커플링된 트라스투주맙을 생성시킨다. 대조군으로서 개질되지 않은 트라스투주맙을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 반응의 성공을 조사한다. 이를 위해, 5μl 4× SDS-PAGE 로딩 완충액+10% w/v β-메르캅토에탄올(바이오라드, 독일)을 첨가하고 600rpm에서 일정하게 진탕하면서 37℃에서 60분 동안 항온처리함으로써, 반응 샘플(20μl)을 중단시킨다. 후속적으로 40분 동안 150V에서 4 내지 20% SDS-PAGE 겔(미니-프로틴® TGX™ 프리캐스트 겔즈 바이오라드, 독일) 상에서 샘플을 전기영동시킨 후, 겔을 쿠마씨 블루 염색시킨다.
실시예 35: 세포 독성 약물을 트라스투주맙-아지드-공중합체 컨쥬게이트에 로딩시킴
PBS 중 실시예 34에 따라 합성된 트라스투주맙-아지드-공중합체의 용액에 DBCO-PEG(3)-VC-PAB-MMAE[루체르나-켐(Lucerna-Chem), 루체른(Lucerne), 3당량/AK-아지드 단량체]를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 항온처리한다. 로딩되지 않은 트라스투주맙-(아지드-공중합체)2를 대조군으로 사용하여 상기 실시예에 제시된 절차에 따라 SDS-PAGE 및 GPC를 실행함으로써 반응의 성공을 조사한다.
실시예 36: DBCO-CF 3 (모델 페이로드)의 합성
Figure pct00042
무수 DCM(6mL) 중 상업적으로 입수가능한 DBCO-CO2H(1353016-70-2, 100mg, 0.328밀리몰)의 용액에 DIPEA(0.200mL, 1.146밀리몰) 및 PyBOP(170mg, 0.328밀리몰)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 2,2,2-트리플루오로에탄아민(0.039mL, 0.491밀리몰)을 혼합물에 소량씩 첨가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고 수성 KHSO4로 희석시켰다. 이어, 수성 상을 DCM(3×20mL)으로 추출하고 합쳐진 유기 상을 염수로 세척한 다음, Na2SO4로 건조시켰다. 이어, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고 용리제로서 1.2 Hept/1 EtOAc를 사용하여 실리카 겔 상의 크로마토그래피 컬럼에 의해 잔류물을 정제하였다. 생성물을 백색 분말로서 단리하였다(125mg, 0.324밀리몰, 99%).
실시예 37: 중합체-유사 반응을 통한 HS-(DMA (55) -AK-(6-아지도헥사노일) (4) )의 합성
Figure pct00043
DMF(5mL) 중 전달 시약(200mg, 31μ몰)으로서 에틸-RAFT(1당량)를 사용하여 DMA(55당량) 및 AK(4당량)의 RAFT 중합(유사한 상세한 프로토콜에 대해서는 실시예 25 참조)을 통해 수득한 HS-(DMA(55)-AK(4))의 용액에 1-(6-아지도헥사노일)피롤리딘-2,5-디온(75mg, 314μ몰) 및 TEA(44μL, 314μ몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, ddH2O(12mL)로 희석하고, ddH2O(10L), 수성 NH4HCO3(0.1M, 3L) 및 ddH2O(10L)에 대해 투석하였다. 잔류물을 동결건조시켰다(-78 ℃, 0.010mBar). 얻어진 구조체의 구조는 1H/13C-NMR 분광법으로 조사하였고, DBCO-CF3로 표제 화합물을 유도체화한 후 19F-NMR 분광법으로 DAR(=4.2)을 추정하였다.
실시예 38: 중합체-유사 반응을 통한 모델 화합물 HS-(DMA (55) -(AK-트리아진-CF 3 ) (1) -(AK-아세틸-CF 3 ) (3) 의 합성
Figure pct00044
DMF-D6(0.7mL) 중 HS-(DMA(55)-AK-아지드(4))의 용액에 1-(6-아지도헥사노일)피롤리딘-2,5-디온(5.98mg, 25μ몰), 1-(3,3,3-트리플루오로프로파노일)피롤리딘-2,5-디온(5.25mg, 25μ몰)(두 물질이 동시에 첨가됨) 및 트리에틸아민(10.51μl, 75μ몰)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, DBCO-CF3(19.40mg, 50μ몰)를 첨가하고 반응 혼합물을 하룻밤동안 교반하였다. 그 다음, 중합체를 한외여과(2000 MWCO, 재현탁시키고 3×10mL ddH2O로 여과함)에 의해 정제하였다. 이어, 잔류물을 동결건조시켜 백색 분말(35mg, 4.84μ몰, 77%)을 수득하였다. 백색 잔류물을 19F-NMR 분광법으로 분석하였다.
실시예 39: 모델 화합물 메틸테트라진-PEG4-석신산-S-(DMA (55) -(AK-트리아진-CF 3 ) (1) -(AK-아세틸-CF 3 ) (3) 의 합성
Figure pct00045
DMF-D6(0.7 mL) 중 HS-(DMA(55)-(AK-트리아진-CF3)(1)-(AK-아세틸-CF3)(3)의 용액에 테트라진-PEG(4)-MC(8.0당량)을 첨가하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 ddH2O로 희석한 다음, 0.1M NH4HCO3에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa) 잔류물을 동결 건조시켜, 메틸테트라진-PEG4-석신산-S-(DMA(55)-(AK-트리아진-CF3)(1)-(AK-아세틸-CF3)(3)를 수득하였다.
실시예 40: HS-(HPA (55) -AK (4) )의 합성
DMA 단량체에 대한 대안으로서 페어뱅크스(Fairbanks)와 동료들의 프로토콜(dx.doi.org/10.1021/bm500654q)을 따라 수득한 HPA(2-하이드록시프로필)아크릴아미드)(55당량)를 사용하여, 공중합체 HS-(DMA(55)-AK-아지드(4))(실시예 37의 제 1 부분 참조)와 유사하게, 이 화합물을 수득하였다.
실시예 41: HS-(HEAa (53) AK (4) )의 합성
Figure pct00046
ddH2O 중 HEAa(368μL, 3540μ몰, 53당량), AK(54mg, 267μ몰, 4당량)의 용액에 에틸-RAFT(실시예 11 참조)(15mg, 67μ몰, 1.0당량) 및 VA044(6.5mg, 20μ몰, 0.3당량)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 사이클로헥실아민(1533μL, 13.37밀리몰, 200당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 ddH2O에 대해 투석하고(MWCO 3.5kDa), 잔류물을 동결 건조시켜 HS-(HEAa(53)AK(4))를 백색 분말(395mg, 55.6μ몰, 3단계에 걸쳐 83%)로서 수득하였다. 수득된 화합물의 구조를 실시예 13의 프로토콜을 이용하여 NMR 분광법 및 GPC로 조사하였다.
본 발명의 추가 양태 및/또는 실시양태는 하기 번호가 매겨진 항목에 개시되어 있다.
1. (a) (1) 아지드 잔기를 함유하는 하기 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 제 1 페이로드 분자를 커플링시키는 단계
에 의해 제조되는 제 1 페이로드 분자의 다중 복제물을 함유하는 공중합체:
화학식 I
Figure pct00047
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이고;
L은 생리학적 조건하에서 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 링커/스페이서이다.
2. 항목 1에 있어서, 상기 반응 혼합물이 하기 화학식 II 또는 하기 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체를 추가로 포함하는 공중합체:
화학식 II
Figure pct00048
[상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.]
화학식 III
Figure pct00049
[상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.]
3. 항목 2에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 (b)에 후속하여, 추가적인 단계가 반응성 기-함유 제 2 페이로드 분자를 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체에 커플링시킴으로써, 화학식 II의 단량체에서 Y 및 Z중 하나 또는 둘 모두가 H이거나, 또는 화학식 III의 단량체에서 Z가 H이도록 함을 추가로 포함하는 공중합체.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물이 공중합을 제어하기 위한 RAFT 시약을 추가로 포함하는 공중합체.
5. 항목 4에 있어서, 상기 단계 (a)가 2개의 연속적인 중합 반응으로 분할되고; 이 때 제 1 중합 반응이 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 중합 가능한 주요 단량체, 공중합을 제어하기 위한 RAFT제, 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 제 1 반응 혼합물에서 수행되어, RAFT 예비중합체를 생성시키고; 제 2 중합 반응이 제 1 중합 반응의 RAFT 예비중합체, 화학식 I의 공동-주요 단량체 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 제 2 반응 혼합물에서 수행되는 공중합체.
6. 항목 5에 있어서, 상기 제 2 반응 혼합물이 화학식 II 및 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체 및 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 중합 가능한 주요 단량체를 추가로 포함하는 공중합체.
7. 항목 4 내지 항목 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 RAFT제가 반응성 기를 함유하거나 또는 단계 (a) 이후에 반응성 기를 제공하도록 전환되는 공중합체.
8. 항목 4 내지 항목 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 RAFT제가 2 내지 30 단위의 단분산 스페이서를 함유하는 공중합체.
9. 항목 7 또는 항목 8에 있어서, 상기 단계 (b) 이전에, 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기가 상기 반응성 기에 커플링되는 공중합체.
10. 항목 7 또는 항목 8에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에, 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기가 상기 반응성 기에 커플링되는 공중합체.
11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 제 1 페이로드 분자가 킬레이트화제이고, 공중합체가 활성제에 노출되고, 활성제가 킬레이트화제에 의해 포획되는 공중합체.
12. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 공중합체가 5,000달톤 내지 80,000달톤의 평균 분자량을 갖는 공중합체.
13. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 공중합체가 5,000달톤 내지 40,000달톤의 평균 분자량을 갖는 공중합체.
14. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 공중합체가 5,000달톤 내지 20,000달톤의 평균 분자량을 갖는 공중합체.
15. 항목 1에 있어서, 상기 반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, (3) 임의적으로는, 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고; 공중합체가 화학식 I의 공동-주요 단량체 분자를 2 내지 12개 함유하는 공중합체.
16. 항목 15에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I의 공동-주요 단량체 분자를 2 내지 8개 함유하는 공중합체.
17. 항목 15에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I의 공동-주요 단량체 분자를 2 내지 6개 함유하는 공중합체.
18. 항목 2에 있어서, 상기 반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체, (3) 하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, (4) 임의적으로는, 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (5) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고; 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 공동-주요 단량체 분자를 10 내지 50개 함유하는 공중합체.
19. 항목 18에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 공동-주요 단량체 분자를 10 내지 40개 함유하는 공중합체.
20. 항목 18에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 공동-주요 단량체 분자를 10 내지 30개 함유하는 공중합체.
21. 항목 3에 있어서, 상기 반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체, (3) 하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, (4) 임의적으로는, 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (5) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고, 상기 중합에 의해 공중합체를 생성시키며; 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 공동-주요 단량체 분자를 4 내지 20개 함유하는 공중합체.
22. 항목 18에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 공동-주요 단량체 분자를 4 내지 15개 함유하는 공중합체.
23. 항목 18에 있어서, 상기 공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 공동-주요 단량체 분자를 4 내지 10개 함유하는 공중합체.
24. 항목 1 내지 항목 23 중 어느 하나에 따른 공중합체 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
25. 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 다른 질병 또는 상태를 치료하기 위한 항목 24의 약학 조성물의 용도.
본 발명의 추가 양태 및/또는 실시양태는 하기 번호가 매겨진 단락에 개시되어 있다.
1. (a) (1) 하기 화학식 II의 공동-주요 단량체, (2) 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 중합 가능한 주요 단량체, (3) 임의적으로는, 공중합을 제어하기 위한 RAFT 시약, 및 (4) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키는 단계; (b) 단계 (a)의 공중합체를 링커 및 아지드 잔기를 함유하는 아민 반응제로 처리하는 단계, 및 (c) 단계 (b)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 제 1 페이로드 분자를 커플링시키는 단계에 의해 제조된, 제 1 페이로드 분자의 다중 복제물을 함유하는 공중합체:
화학식 II
Figure pct00050
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Y는 H이고;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.
2. 단락 1에서, 상기 반응 혼합물이 하기 화학식 III의 공동-주요 단량체를 추가로 포함하는 공중합체:
화학식 III
Figure pct00051
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 L이 -CO-CnH2n(n은 1 내지 10임) 또는 -CO-PEGn(n은 1 내지 14임)이거나, 또는 L이 -CO-발린-시트룰린-PABC 또는 이의 변형체, 발린-라이신, 발린-알라닌, 발린-아르기닌, 글루타메이트-발린-시트룰린인 공중합체.
4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 중합 가능한 주요 단량체가 N,N-디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드이거나, 또는 상기 중합 가능한 주요 단량체가 메타크릴산, 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드인 공중합체.
5. 하기 화학식 R1a의 반복 단위를 포함하는 공중합체:
화학식 R1a
Figure pct00052
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이고;
L은 생리학적 조건하에서 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 링커/스페이서이다.
6. 하기 화학식 R1의 반복 단위를 포함하는 공중합체:
화학식 R1
Figure pct00053
상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이고;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이며;
A는 -O- 또는 -NH-이며;
L은 생리학적 조건 하에 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 링커/스페이서이고,
P는 제 1 페이로드 분자를 포함한다.
7. 단락 5 또는 단락 6에 있어서, 상기 공중합체가 하기 화학식 R2의 반복 단위 및/또는 하기 화학식 R3의 반복 단위를 추가로 포함하는 공중합체:
화학식 R2
Figure pct00054
[상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
Z는 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.]
화학식 R3
Figure pct00055
[상기 식에서,
R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
Z는 H(A가 O인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
A는 -O- 또는 -NH-이다.]
8. 단락 7에 있어서, 상기 Y가 H이고/이거나 Z가 H인 공중합체.
9. 단락 7에 있어서, 상기 Y 및/또는 Z가 제 2 페이로드 분자를 포함하는 공중합체.
10. 단락 5 내지 단락 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 L이 -CO-CnH2n(n은 1 내지 10임) 또는 -CO-PEGn(n은 1 내지 14임)이거나, 또는 L이 -CO-발린-시트룰린-PABC 또는 이의 변형체, 발린-라이신, 발린-알라닌, 발린-아르기닌, 글루타메이트-발린-시트룰린인 공중합체.
11. 단락 5 내지 단략 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 공중합체가 N,N-디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드의 중합을 통해 수득되는 반복 단위, 또는 메타크릴산, 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드의 중합을 통해 수득되는 반복 단위를 추가로 포함하는 공중합체.
12. 단락 6 내지 단락 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 R2 및 화학식 R3의 반복 단위가 존재하지 않고, 화학식 R1에 따른 반복 단위의 평균 수가 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개인 공중합체.
13. 단락 5 내지 단락 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 작용화되지 않고, 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 수가 10 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 40개, 더욱 바람직하게는 10 내지 30개인 공중합체.
14. 단락 5 내지 단락 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 제 2 페이로드 분자로 작용화되고, 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 수가 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 15개, 더욱 바람직하게는 4 내지 10개인 공중합체.

Claims (47)

  1. (a) (1) 아지드 잔기를 함유하는 하기 화학식 I의 단량체, (2) 하나 이상의 비닐기를 갖고, 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 제 1 페이로드 분자를 커플링시키는 단계
    에 의해 수득될 수 있는, 제 1 페이로드 분자의 다중 복제물(copy)을 함유하는 공중합체:
    화학식 I
    Figure pct00056

    상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이며;
    A는 -O- 또는 -NH-이고;
    L은 링커/스페이서이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    반응 혼합물이 하기 화학식 II 또는 하기 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 단량체를 추가로 포함하는 공중합체:
    화학식 II
    Figure pct00057

    [상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이고;
    Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이며;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.]
    화학식 III
    Figure pct00058

    [상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.]
  3. 제 2 항에 있어서,
    단계 (a) 또는 (b) 이후에, 추가적인 단계가 반응성 기-함유 제 2 페이로드 분자를 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 단량체에 커플링시키는 것을 포함하며, 이 때 화학식 II의 단량체에서 Y 및 Z 중 하나 또는 둘 모두가 H이거나 또는 화학식 III의 단량체에서 Z가 H인 공중합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물이 공중합을 제어하기 위한 RAFT 시약을 추가로 포함하는 공중합체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    단계 (a)가 2개의 연속적인 중합 반응으로 분할되고, 이 때
    제 1 중합 반응이 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, 공중합을 제어하기 위한 RAFT제, 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 제 1 반응 혼합물에서 수행되어, RAFT 예비중합체를 생성시키고,
    제 2 중합 반응이 제 1 중합 반응의 RAFT 예비중합체, 화학식 I의 단량체 및 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 제 2 반응 혼합물에서 수행되는 공중합체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 2 반응 혼합물이 화학식 II 및 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 단량체, 및 하나 이상의 비닐기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체를 추가로 포함하는 공중합체.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RAFT제가 반응성 기를 함유하거나 또는 단계 (a) 후에 반응성 기를 제공하도록 전환되는 공중합체.
  8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RAFT제가 2 내지 30 단위의 단분산 스페이서를 함유하는 공중합체.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    단계 (b) 전에, 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기가 반응성 기에 커플링되는 공중합체.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    단계 (b) 후에, 세포 유형-특이적 또는 조직 유형-특이적 표적화 잔기가 반응성 기에 커플링되는 공중합체.
  11. (a) (1) 하기 화학식 II의 단량체, (2) 하나 이상의 비닐 기를 갖고, 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, 및 (3) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 포함하는 반응 혼합물을 중합시켜, 공중합체를 생성시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 공중합체를 링커/스페이서 L 및 아지드 잔기를 함유하는 아민 반응제로 처리하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 공중합체에 함유된 아지드 잔기에 제 1 페이로드 분자를 커플링하는 단계
    에 의해 수득될 수 있는, 제 1 페이로드 분자의 다중 복제물을 포함하는 공중합체:
    화학식 II
    Figure pct00059

    상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
    Y는 H이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.
  12. 제 11 항에 있어서,
    반응 혼합물이 하기 화학식 III의 단량체를 추가로 포함하고, 임의적으로는 추가적인 단계가 화학식 III의 단량체에서 Z가 H인 화학식 III의 단량체에 반응성 기-함유 제 2 페이로드 분자를 커플링하는 것을 포함하는 공중합체:
    화학식 III
    Figure pct00060

    상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 페이로드 분자가 킬레이트화제이고, 공중합체가 활성제에 노출되고, 활성제가 킬레이트화제에 의해 포획되는 공중합체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체의 평균 분자량이 5,000달톤 내지 80,000달톤인 공중합체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체의 평균 분자량이 5,000달톤 내지 40,000달톤인 공중합체.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체의 평균 분자량이 5,000달톤 내지 20,000달톤인 공중합체.
  17. 제 1 항에 있어서,
    반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 단량체, (2) 하나 이상의 비닐 기를 갖고, 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, (3) 임의적으로는, 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (4) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고,
    공중합체가 화학식 I의 단량체 분자를 2 내지 12개 함유하는 공중합체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I의 단량체 분자를 2 내지 8개 함유하는 공중합체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I의 단량체 분자를 2 내지 6개 함유하는 공중합체.
  20. 제 2 항에 있어서,
    반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 단량체, (2) 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 단량체, (3) 하나 이상의 비닐기를 갖고, 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, (4) 임의적으로는, 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (5) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 10 내지 50개 함유하는 공중합체.
  21. 제 20 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 10 내지 40개 함유하는 공중합체.
  22. 제 20 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 10 내지 30개 함유하는 공중합체.
  23. 제 3 항에 있어서,
    반응 혼합물이 (1) 화학식 I의 공동-주요 단량체, (2) 화학식 II 또는 화학식 III 중 하나 또는 둘 모두의 공동-주요 단량체, (3) 하나 이상의 비닐기를 갖고, 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체, (4) 임의적으로는 라디칼 중합을 제어하기 위한 약제, 및 (5) 자유 라디칼 종을 생성시키기 위한 개시제 시스템을 함유하고, 중합시 공중합체를 생성시키며,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 4 내지 20개 함유하는 공중합체.
  24. 제 23 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 4 내지 15개 함유하는 공중합체.
  25. 제 23 항에 있어서,
    공중합체가 화학식 I 내지 화학식 III의 임의의 단량체 분자를 4 내지 10개 함유하는 공중합체.
  26. 제 1 항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
    L이 -CO-CnH2n-(n은 1 내지 10임) 또는 -CO-(PEG)n-(n은 1 내지 14임)이거나; 또는
    L이 -CO-발린-시트룰린-PABC(PABC는 p-아닐린-베타-카바메이트임), 또는 이의 변형체, 발린-라이신, 발린-알라닌, 발린-아르기닌, 글루타메이트-발린-시트룰린인 공중합체.
  27. 제 1 항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체가 N,N-디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드이거나; 또는
    하나 이상의 비닐 기를 갖고 아미노산 잔기 또는 아지드 잔기를 함유하지 않는 단량체가 메타크릴산, 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드인 공중합체.
  28. 하기 화학식 R1a의 반복 단위를 포함하는 공중합체:
    화학식 R1a
    Figure pct00061

    상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이며;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이고;
    A는 -O- 또는 -NH-이고;
    L은 링커/스페이서이다.
  29. 하기 화학식 R1의 반복 단위를 포함하는 공중합체:
    화학식 R1
    Figure pct00062

    상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이며;
    A는 -O- 또는 -NH-이고;
    L은 링커/스페이서이며;
    P는 제 1 페이로드 분자를 포함한다.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    공중합체가 하기 화학식 R2의 반복 단위 및/또는 하기 화학식 R3의 반복 단위를 추가로 포함하는 공중합체:
    화학식 R2
    Figure pct00063

    [상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    X는 -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- 또는 -NH-C6H4-CH2-이고;
    Y는 H 또는 -CO-CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Y는 제 2 페이로드 분자를 포함하며;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Z는 제 2 페이로드 분자를 포함하고;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.]
    화학식 R3
    Figure pct00064

    [상기 식에서,
    R은 -H, -CH3, -CH2-CH3 또는 -(CH2)2-CH3이고;
    Z는 H 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)이거나, 또는 Z는 제 2 페이로드 분자를 포함하고;
    A는 -O- 또는 -NH-이다.]
  31. 제 30 항에 있어서,
    Y가 H이고/이거나 Z가 H인 공중합체.
  32. 제 30 항에 있어서,
    Y 및/또는 Z가 제 2 페이로드 분자를 포함하는 공중합체.
  33. 제 28 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L이 -CO-CnH2n-(n은 1 내지 10임) 또는 -CO-(PEG)n-(n은 1 내지 14임)이거나, 또는 L이 -CO-발린-시트룰린-PABC(PABC는 p-아닐린-베타-카바메이트임) 또는 이의 변형체, 발린-라이신, 발린-알라닌, 발린-아르기닌, 글루타메이트-발린-시트룰린인 공중합체.
  34. 제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체가 N,N-디메틸-아크릴아미드, N-이소부틸-아크릴아미드, N-3급-부틸-아크릴아미드, N-하이드록시에틸-아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-아크릴아미드, N-(3-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)-아크릴아미드 하이드로클로라이드, 또는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드 하이드로클로라이드의 중합에 의해 수득가능한 반복 단위, 또는 메타크릴산, 2-하이드록시에틸-아크릴레이트, 2-하이드록시프로필-아크릴레이트, 3-하이드록시프로필-아크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-아크릴레이트, 2-아미노에틸 아크릴레이트 하이드로클로라이드, 3-하이드록시프로필-메타크릴레이트, 2-하이드록시-1-메틸에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필-메타크릴레이트 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드의 중합을 통해 수득되는 반복 단위를 추가로 포함하는 공중합체.
  35. 제 29 항, 제 33 항 및 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 R2 및 화학식 R3의 반복 단위가 존재하지 않고, 공중합체 분자당 화학식 R1에 따른 반복 단위의 평균 수가 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개인 공중합체.
  36. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 작용화되지 않고, 공중합체 분자당 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 수가 10 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 40개, 더욱 바람직하게는 10 내지 30개인 공중합체.
  37. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 R2 또는 화학식 R3의 반복 단위가 제 2 페이로드 분자로 작용화되고, 공중합체 분자당 화학식 R1, 화학식 R2 또는 화학식 R3에 따른 반복 단위의 평균 수가 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 15개, 보다 바람직하게는 4 내지 10개인 공중합체.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 H(A가 -O-인 경우) 또는 -CnH2n+1(n은 1 내지 8임)인 공중합체.
  39. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 공중합체 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  40. 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 다른 질병 또는 상태를 치료하기 위한 제 39 항의 약학 조성물의 용도.
  41. 제 1 항 내지 제 38 항 및 제 39 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체 또는 약학 조성물이 치료에 사용하기 위한 것인 공중합체 또는 약학 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 치료가 암의 치료인 공중합체 또는 약학 조성물.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    공중합체가 제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자를 포함하고,
    제 1 페이로드 분자 및 제 2 페이로드 분자가 조합 요법으로서 함께 투여되어야 하는 2개의 활성제인 공중합체 또는 약학 조성물.
  44. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체가 진단 용도에 사용하기 위한 것인 공중합체.
  45. 제 44 항에 있어서,
    진단 용도가 암의 모니터링인 공중합체.
  46. 제 45 항에 있어서,
    암의 모니터링이 암 치료와 동시에 수행되는 공중합체.
  47. 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체가 진단에 유용한 방사성 핵종을 포함하는 공중합체.
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