CN116801909A - 静电纳米颗粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；和(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。本发明还涉及通过本发明的方法可获得的纳米颗粒，以及涉及纳米颗粒，其包含(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；(c)一种或多种带负电荷的分子。本发明还涉及包含本发明的纳米颗粒的组合物，并且涉及用于治疗中的本发明的纳米颗粒或组合物。

Description

静电纳米颗粒及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月2日递交的102272号卢森堡专利申请、于2021年5月21日递交的21175260.5号欧洲专利申请、于2021年10月29日递交的21205482.9号欧洲专利申请的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。本发明还涉及一种通过本发明的方法可获得的纳米颗粒，以及涉及一种纳米颗粒，其包含(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；(c)一种或多种带负电荷的分子。本发明还涉及包含本发明的纳米颗粒的组合物，并且涉及用于治疗中的本发明的纳米颗粒或组合物。
背景技术
RNA抑制(RNAi)的原理对医学应用提出了很高的期望，并在2006年获得了诺贝尔奖。该方法通过选择和合成基因特异性siRNA寡核苷酸，经由使mRNA失活和随后使几乎任意基因的表达沉默而显示出高效率。虽然这种方法革新了分子生物学，但由于许多具体问题，已证明将该原理转化到治疗领域是困难的。
siRNA寡核苷酸受到核酸酶攻击，显示出改善的免疫原性和肾清除率，因此“裸siRNA”的半衰期和循环时间通常远低于预期。因此，已将siRNA与诸如纳米颗粒或胶囊的稳定剂复合。使用这些稳定剂，siRNA的循环时间和生物利用度提高，但是仍然缺乏靶细胞决定结构，所述靶细胞决定结构a)靶向具有特异性表面分子的胞，并将siRNA递送至这些细胞，和b)能够实现阴离子siRNA在阴离子细胞质膜上的靶特异性转移。
尽管已经进行了许多临床阶段研究I-III来治疗神经系统疾病、病毒感染和癌症，但是到目前为止，FDA仅批准了一种siRNA。例如Patisiran(商品名Onpattro)是一种治疗遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的人的多神经病的药物。遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性是致命的罕见疾病，据估计其影响全世界50,000人。
为了开发治疗肿瘤疾病的模块化治疗手段，我们开发了一种系统，该系统将siRNA与针对癌细胞特异性表面分子的抗体偶联，并通过将siRNA递送到预期的癌细胞的特异性阳离子肽-鱼精蛋白与相应的表面分子(如受体)结合，并以受体依赖性方式内化而在结合时引起内化。
鱼精蛋白是一种阳离子的核酸结合肽，其运输浓缩在精子头部中的基因组DNA的完整集合。由于鱼精蛋白能够复合核酸并促进核酸在细胞质膜中的转移，这吸引了许多研究者来研究其在转染、靶向递送和基因疗法中的应用((Choi等，2009；Chono等，2008；Hansen等,1979；He等，2014；Liu,B.,2007)。作为核酸递送载体对鱼精蛋白进行了测试，并将其与各种细胞决定靶向部分连接。2005年，Song等(Song等，2005a)提出了一种基因融合蛋白，其连接了针对人免疫缺陷病毒HIV gp 160包膜蛋白的Fab片段(F105)和截短的鱼精蛋白肽。该融合蛋白复合了靶向HIV gag蛋白的siRNA，并且该缀合物能够靶向难以转染的HIV感染的T细胞和HIV包膜转染的黑素瘤细胞。该siRNA-F105载体缀合物抑制感染的T细胞中HIV的复制。为了验证靶向原理，将相同的策略用于用与鱼精蛋白融合的Erb2单链抗体靶向ErbB2。由此，在许多出版物中都遵循了鱼精蛋白和细胞决定簇之间的基因融合，但从未将这个概念成功地转化到临床中。
在先前的工作中，根据N.等，2016Nat.Protoc.11,22-36,/>N.等，2018PLoS One 13,e0200163；和/>S.等，2015Clin Cancer Res 21,1383-94中描述的化学缀合方案，本申请的发明人通过双特异性交联磺基-SMCC的手段将抗EGFR单克隆抗体(mAB)西妥昔单抗与阳离子肽鱼精蛋白缀合。所得到的IgG-鱼精蛋白缀合物分子能够使EGF受体内化并将siRNA递送至靶细胞。
本发明的目的是提供进一步和优选改进的手段和方法以用于将阴离子分子递送至靶细胞。
发明内容
本发明涉及一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。
本发明还涉及一种纳米颗粒，所述纳米颗粒通过本发明的方法可获得。
本发明还涉及一种纳米颗粒，其包含：(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含经由双官能连接子与带正电荷的多肽缀合的抗体；以及(c)一种或多种带负电荷的分子。
本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的纳米颗粒。
本发明还涉及一种本发明的纳米颗粒或本发明的组合物，其用于治疗中。
附图说明
图1：通过应用(N.等，2016)中公开的缀合方法，大量抗体-SMCC-鱼精蛋白缀合物的形成。反应后不耗竭过量磺基-SMCC(如图2)，残余交联剂能够与IgG、鱼精蛋白-SMCC和反应性磺基-SMCC形成多种不同的缀合物。通过SDS-PAGE可以观察到的非预期副产物的实例是：已经通过过量磺基-SMCC被内部交联的IgG(A和B：抗-EGFR-mAB西妥昔单抗)，伴随有与鱼精蛋白的相同交联。此外，我们观察到高分子量IgG多聚体，其是不可还原的(A)，伴随有与鱼精蛋白的相同交联，参见凝胶B)。极端地，非预期副反应的复杂性可能导致出现云状外观(B)，其可能由所有可能的缀合物a-d的混合物形成。HC：重链，LC：轻链。未反应SMCC的耗竭的遗漏可能导致可能干扰预期产物(c)的功能的不期望副产物的形成。例如，反应性SMCC可导致给定IgG分子(a)中轻链与重链的交联(a)或形成IgG二聚体(d)的两个IgG分子的交联。
图2：(N.等，2016)中公开的缀合方法的修饰。A：在将磺基-SMCC与鱼精蛋白偶联后，未耗竭过量的磺基-SMCC，残余交联剂能够与IgG、鱼精蛋白-SMCC和反应性磺基-SMCC形成多种不同的缀合物。不同地，在以前的方案的偶联过程之后，使抗体-SMCC-鱼精蛋白偶联物脱盐。在新的方案中省略了该步骤。(C：抗-EGFR-抗体西妥昔单抗，D：抗-IGF1R-抗体ImcA12)。通过SDS-PAGE可以观察到的非预期副产物的实例用圆圈突出显示。B：新的缀合方案现在包括磺基-SMCC和鱼精蛋白偶联之后的纯化步骤。使用Zeba-Spin凝胶纯化柱耗竭未结合的磺基-SMCC中的SMCC-鱼精蛋白缀合物，该Zeba-Spin凝胶纯化柱保留游离的磺基-SMCC并洗脱SMCC-鱼精蛋白缀合物。结果，现在形成了SMCC-鱼精蛋白与IgG抗体西妥昔单抗(Cet；E)和ImcA12(A12；F)的重链(HC)和轻链(LC)的确定的缀合产物，并且其可以在考马斯染色的SDS-PAGE中观察到。HC：重链，LC：轻链，P：鱼精蛋白。未反应SMCC的耗竭的遗漏可能导致可能干扰预期产物(c)的功能的不期望副产物的形成。例如，反应性SMCC可导致给定IgG分子(a)中轻链与重链的交联(a)或形成IgG二聚体(d)的两个IgG分子的交联。
图3：NSCLC中靶向KRAS的抗体介导的siRNA。A：抗-EGFR单克隆抗体(mAB)西妥昔单抗和鱼精蛋白之间的靶向构建体。B：抗EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白(P/P)复合物(α-EGFR-mAB)结合至多8mol siRNA/mol抗体。C：西妥昔单抗(抗-EGFR-mAB-)鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白(P/P)将Alexa488-标记的(白点，左上小图)siRNA转运至核内体，但不转运至溶酶体，因为Alexa488-阳性囊泡不与溶酶体标志物lysotracker(白点，右上小图)重叠。D：经α-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/siRNA(α，抗；含有P/P)处理的NSCLC细胞显示KRAS siRNA使KRAS表达沉默，而对照siRNA不能使KRAS表达沉默。E：用α-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/siRNA(P/P)处理的细胞显示显著减少的集落形成，其具有靶向WT和G12D突变体等位基因的KRAS siRNA。F：全身性应用的与对照和KRAS-siRNA复合的α-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白在具有皮下异种移植的SKLU1和A549细胞的CD1-裸鼠中是良好耐受的，α-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/KRAS-siRNA在SKLU-和A549-肿瘤中显著抑制肿瘤生长。G：虽然携带西妥昔单抗-P/P的对照(混杂的)siRNA已经治疗性地抑制了A549肿瘤，但是KRAS siRNA治疗组中的肿瘤重量明显轻于任何对照组。切除的肿瘤示于H。统计学：在除F外的所有实验中，平均值+/-标准偏差，这里选择标准误差平均值(SEM)。显著性：*P＜0.05，双侧t-检验。
图4：增殖标志物Ki67在KRAS敲低的NSCLC异种移植物中含量较少。组织学异种移植切片上的增殖标志物Ki67(A、C、E和G、I、K中的灰点)的免疫荧光测定。与PBS和对照siRNA载体处理组相比，在A549(A-F)和SK-LU1(G-L)中KRAS siRNA处理的肿瘤组织切片中，Ki67阳性细胞核的数目大量减少。
图5：NSCLC异种移植物显示了更高丰度的凋亡细胞。通过TUNEL分析的异种移植肿瘤切片中凋亡的免疫组织学定位。A-L：在两种异种移植的细胞系中，与对照组相比，在KRASsiRNA载体处理的肿瘤中观察到了凋亡速率的提高。M-N：切片中TUNEL阳性细胞核的统计：与PBS处理相比，在用EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白(mAB-P/P)处理的A549肿瘤中TUNEL阳性细胞核数目增加了两倍，而用KRAS siRNA载体处理的肿瘤中增加了三倍。在SK-LU1中，仅EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白KRAS siRNA处理导致凋亡细胞增加四倍。α，抗；cntr，对照。
图6：抗体-siRNA复合物可以靶向横纹肌肉瘤(RMS)细胞系。A：在两种RMS细胞系细胞表面受体EGFR和IGFR1R的表达，两种细胞系中均表达IGFR1R和EGFR。B：西妥昔单抗-鱼精蛋白(含有游离SMCC-鱼精蛋白(/P/P)的EGFR-mAB-P)使Alexa488标记的对照siRNA穿梭至大多数RD细胞(FACS图C中＞90％)，而在RH-30中效果较差(FACS未示出)。RH-30又被抗IGF1R导向的GR11L-鱼精蛋白(P/P)穿梭Alexa488对照siRNA标记。
图7：在软琼脂分析中，用介导cyc/NRAS和KRAS以及RH30中PAX3的siRNA敲低的西妥昔单抗-鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白(P/P)靶向RD(胚胎RMS，ERMS)和RH30(肺泡RMS，ARMS)细胞降低了集落生长。将细胞收获，用30nM与对照(scr)或如所示的有效抗c-Myc和NRAS的两种siRNA偶联的西妥昔单抗-鱼精蛋白/P(含有游离SMCC-/P的EGFR-mAB-P)处理，接种在96个平板的软琼脂中，培养两周，染色并计数(A)。两种有效siRNA的组合将对照组中的集落数从87％减少至对PBS对照标准化的63％(B)。C：用与KRAS或NRAS特异性siRNA偶联的EGFR-mAB-P/P处理RD细胞适度降低了相应细胞中的NRAS表达。P＜0.001，双侧T-检验。D：序列GGCCTCTCACCTCAGAATTC(siPF1,SEQ ID NO:49)、GCCTCTCACCTCAGAATTCA(siPF2,SEQID NO:50)、CCTCTCACCTCAGAATTCAA(siPF3,SEQ ID NO:51)示出了siRNA的相应位置，所述siRNA覆盖由序列TGGCCTCTCACCTCAGAATTCAATTCGTC(SEQ ID NO:48)所示的融合癌基因PAX3-叉头(FKHR)的断点区域，PAX3部分为浅灰色，FKHR部分为深灰色。E：在软琼脂分析中，西妥昔单抗-鱼精蛋白/P介导的RH30细胞中的PAX3-FKHR的siRNA敲低降低了集落生长。通过应用西妥昔单抗介导的断点导向的siRNA siPF2(在D中观察到siRNA步查(walking))可显著抑制集落生长。P＜0.05，双侧T-检验。
图8：抗体-siRNA-P/P复合物的形成可用于IGF1R靶向。A：流式细胞术显示，A673尤文肉瘤细胞在37℃下内化鼠抗-IGF1R抗体GR11L-磺基-SMCC-鱼精蛋白/P复合物，如未偶联的GR11L抗体，其通过与非内化的4℃对照相比直方图信号的向左移位来描绘。B：由AlexaFluor488-siRNA组成的A673细胞中的绿色荧光胞质囊泡结构被含游离SMCC-P的GR11L-鱼精蛋白内化(箭头，右侧小图)，但在缺少抗体缀合物的对照实验中未被内化(左侧小图)。可以将内化的Alexa Fluor488-siRNA看作白色囊泡沉积(白色箭头)。通过Hoechst对细胞核的复染色以灰色显示为肾形结构。方框区域示出了所指示细胞的更高放大倍数。标尺，20μm。C：然后将GSP复合物偶联至针对致癌融合蛋白EWS-FLI1的mRNA的siRNA，并用这些复合物处理A673细胞。结果，如在FLI1表达的蛋白质印迹中所检测到的，EWS-FLI1表达下调。与对照siRNA和PBS对照相比，EWS-FLI1(E/F)特异性siRNA 2使EWS-FLI1蛋白表达降低了80％。其它E/F特异性siRNA(siRNA1和FLI1-esiRNA)被证明效果低得多。EWS-FLI1行进为～64kDa的双带，肌动蛋白为43kDa。其在(N.等，2016)中公布。
图9：用于靶向尤文肉瘤细胞的抗-IGF1R-mAbs A12和Tepro。A：在我们的实验室中表达和纯化靶向IGF1R的mABs A12(西妥木单抗)和Tepro(替妥木单抗)，并且将其与鱼精蛋白/P缀合以使siRNA能够结合和转运。IgG-鱼精蛋白/P缀合物表现出适当的分子量偏移(箭头)。HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：使用抗-IGF1R-mAbs-鱼精蛋白和不同比例的siRNA进行的条带转移分析。C：抗-IGF1R-mAbs-鱼精蛋白(含有游离SMCC-P)使Alexa488标记的对照siRNA穿梭至SKNM-C尤文细胞(白点)。
图10：与对照相比，断点siRNA显著降低尤文SKNM-C细胞中的集落形成。用鱼精蛋白/P-缀合的A12(A)或Tepro(B)和所指示的siRNA处理SKNM-C细胞，并对细胞进行集落形成分析。E/F-siRNA是一种干扰驱动尤文肉瘤EWS-Fli1的mRNA的siRNA。BCL2，抗BCL2的siRNA。P＜0.05，双侧T-检验。
图11：一种纳米颗粒样结构的实例的横截面的图示，所述纳米颗粒样结构满足从我们的实验推导出的有效抗体-SMCC-鱼精蛋白/P-siRNA或-SM-1/RF载体复合物的那些条件。在mAB(其中一些鱼精蛋白偶联到靶向抗体)和相应的阴离子货物(cargo)之间形成静电结合桥，阴离子货物包括siRNA(A)以及诸如SM-1/RF的阴离子小分子(B)或包括两者(C)。
图12：抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白缀合物可以结合单链反义寡核苷酸(ASO)。条带转移分析揭示1mol EGFR-抗体-鱼精蛋白-缀合物结合8-32mol ASO。
图13：有效siRNA结合剂的分子构成的说明。将抗-CD20 mAB缀合至具有如所指示的超过mAB的摩尔量的SMCC-鱼精蛋白。然后测试所得缀合物混合物复合siRNA的能力。与所提供的鱼精蛋白-SMCC的摩尔过量无关，所得的复合siRNA的能力没有明显不同，其范围为每mol载体结合剂约16mol siRNA。
图14：CD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物结合8mol siRNA。A：考马斯染色的SDS-PAGE显示了抗-CD20-mAB，与30x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-CD20-mAB和分子标志物(M)；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：采用CD20-mAB-鱼精蛋白/P和不同比例的siRNA进行的条带转移分析。
图15：用抗体-P/P-siRNA复合物靶向DLBCL细胞系。顶部小图：通过FACS分析测试了选择的DLBCL细胞系关于CD20和CD33的表达。中间小图(白点)：Alexa488-标记的siRNA结合到鱼精蛋白缀合的CD20(利妥昔单抗)和CD33(吉妥单抗)单克隆抗体(均含有游离SMCC-鱼精蛋白)并将相应的细胞系用该组合物处理过夜。经由相应的抗体靶向siRNA内化并浓缩在胞质囊泡结构中。两种靶向mAb(左：抗-CD20，右：抗-CD33)均显示将siRNA转运至相应的细胞系。下方小图：将DLBCL细胞系接种到甲基纤维素中，并用所示的抗体-鱼精蛋白/P-siRNA缀合物处理。尽管CD33在所有细胞系中高度表达，并且利妥昔单抗将siRNA转运到细胞内囊泡中，但通过集落形成能力检测的对关键基因敲低的应答是低的，这表明核内体释放有问题。相对地，靶向表达较低的CD33的吉妥单抗显示对基因敲低的更好的应答：显著性*p<0.01。在本文中，尤其是HBL-1细胞显示了针对BTK激酶敲低以及胞质激酶SYK和B细胞受体信号传导通路的其它组分(比如CARD11b、CD79B和MYD88)的良好应答。
图16：用于通过单克隆抗体进行静电转运的聚阴离子小分子(SM)衍生物的合成。将SM-1缀合至聚阴离子红色荧光发色团(RF)以形成低分子量(1.44kDa)的聚阴离子。
图17：CD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物和EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物结合SM-1/RF。A：使用高达1:32的不同比例的SM-1/RF、使用CD20-mAB-鱼精蛋白/P和EGFR-mAB-鱼精蛋白/P的条带转移分析。B：使用高达1:200的不同分子过量的SM-1/RF、使用CD20-mAB-鱼精蛋白/P和EGFR-mAB-鱼精蛋白/P的条带转移分析。含有游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白缀合物可以复合至少100mol的SM-1/RF。
图18：CD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物和EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物转运SM-1/RF。A：CD20阳性HBL-1DLBCL细胞内化CD20-mAB-鱼精蛋白/P/SM-1/RF(含有游离SMCC-P)复合物(灰色阴影，左手侧)。B：EGFR阳性A549 NSCLC细胞内化EGFR-mAB-鱼精蛋白/P/SM-1/RF/P复合物(白点，左手侧)。
图19：在通过HPLC耗竭游离SMCC-鱼精蛋白后，EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白缀合物不能有效结合siRNA。A：考马斯染色的SDS-PAGE显示了抗-EGFR-mAB、与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-EGFR-mAB、和在未结合的SMCC-鱼精蛋白耗竭后与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-EGFR-mAB的HPLC-级分25-31；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：条带转移分析。
图20：在用含有和不含游离鱼精蛋白的不同siRNA载体处理的NSCLC细胞的软琼脂中的集落形成分析，所述siRNA载体。A：用EGFR-mAB-鱼精蛋白/P-KRAS-siRNA处理的A549细胞在软琼脂中形成的集落显著少于用EGFR-mAB-鱼精蛋白/P/contr(scr)-siRNA处理的细胞。B：SK-LU1细胞。与PBS处理的细胞相比，当用不含游离鱼精蛋白的EGFR-mAB-鱼精蛋白缀合物处理A549(A)或SK-LU1(B)细胞时(参见图19A，级分29/30)或当仅使用相同量的SMCC-鱼精蛋白时，未观察到集落形成的差异。这里显示的是集落分析的照片和三次独立实验的平均值±SD。星号表示显著差异(P＜0.05，双侧T-检验)。
图21：在通过HPLC耗竭游离SMCC-鱼精蛋白后，CD33-mAB吉妥单抗-鱼精蛋白缀合物不能有效结合siRNA。A：考马斯染色的SDS-PAGE显示了抗--CD33-mAB、与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-CD33-mAB和在未结合的SMCC-鱼精蛋白耗竭后与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-CD33-mAB的HPLC级分24-30；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：条带转移分析。C：集落形成分析。用CD33-mAB-鱼精蛋白/P-DNMT3A-siRNA(含有游离SMCC-P)处理的OCI-AML2细胞在软琼脂中形成的集落显著少于用CD33-mAB-鱼精蛋白/P-Contr(scr)-siRNA(含有游离SMCC-P)处理的细胞。与PBS处理的细胞相比，当用不含游离SMCC-鱼精蛋白的CD33-mAB-鱼精蛋白缀合物处理OCI-AML2细胞时，未观察到集落形成的差异(参见A+B，级分30)。这里显示的是三次独立实验的平均值±SD。*P<0.033，双侧T-检验。
图22：在通过HPLC耗竭游离SMCC-鱼精蛋白后，CD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白缀合物不能有效结合SM-1/RF。A：考马斯染色的SDS-PAGE显示了抗-CD20-mAB、与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-CD20-mAB和在未结合的SMCC-鱼精蛋白耗竭后与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-CD20-mAB的HPLC-级分19-25/26；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：用耗竭鱼精蛋白的(左)和含鱼精蛋白的CD20-mAB制剂(右)进行条带转移分析。未进行SMCC-鱼精蛋白耗竭的CD20-mAB制剂结合＞32mol的SM-1/RF。
图23：在通过HPLC耗竭游离SMCC-鱼精蛋白后，抗-IGF1R单克隆AB IMCA-12(A12)-鱼精蛋白缀合物物不能有效结合siRNA。A：考马斯染色的SDS-PAGE显示了抗-IGF1R，与32xSMCC-鱼精蛋白偶联的抗-IGF1R-mAB，和在未结合的SMCC-鱼精蛋白耗竭后与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-IGF1R-mAB的HPLC-级分15-21；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝SMCC-鱼精蛋白。B：用耗竭鱼精蛋白的(下方；级分20；参见A)和含SMCC-鱼精蛋白的IGF1R-mAB制剂(上方)进行条带转移分析。未进行SMCC-鱼精蛋白耗竭的IGF1R-mAB制剂结合8mol的siRNA。
图24：在用含有和不含游离鱼精蛋白的A12载体处理的SKNM-C尤文肉瘤细胞的软琼脂中的集落形成分析。用含游离SMCC-P的IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/P-EWS-FLI1-siRNA处理的SKNM-C细胞在软琼脂中形成的集落显著少于用含游离SMCC-P的IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/P-Contr(scr)-siRNA处理的细胞。当用不含游离鱼精蛋白的EGFR-mAB-鱼精蛋白缀合物处理SKNM-C细胞时，未观察到集落形成的差异。这里显示了三次独立实验的平均值±SD。星号表示显著差异(*P<，双侧T-检验)。
图25：在用含有或不含游离SMCC-鱼精蛋白的不同siRNA载体处理的SKNM-C尤文肉瘤细胞的软琼脂中的集落形成分析。用含有游离SMCC-P的IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/P/EWS-FLI1(E/F)siRNA处理的SKNM-C细胞在软琼脂中形成的集落显著少于用含有游离SMCC-P的IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/P/contr(scr)-siRNA处理的细胞。当用含有或不含游离SMCC-鱼精蛋白的EGFR-mAB-鱼精蛋白缀合物处理SKNM-C细胞，(参见图19，级分29/30)，或仅用相同量的SMCC-鱼精蛋白时，与scr-siRNA(scr，混杂的)处理的细胞相比，没有观察到集落形成的差异。这里显示了3个独立实验的平均值±SD。星号表示显著差异(P＜0.05，双侧T-检验)。
图26：用在假定的IgG-鱼精蛋白-SMCC-鱼精蛋白//游离鱼精蛋白/siRNA复合物中相同浓度的未耗竭的A12抗IGF1R mAB vs.非抗体结合的SMCC-鱼精蛋白处理的SKNM-C尤因肉瘤、OCI-AML-2白血病和A549 NSCLC细胞在软琼脂中的集落形成分析。A：用IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/EWS-FLI1-siRNA/游离SMCC-P处理的SKNM-C细胞在软琼脂中形成的集落显著少于用IGF1R(A12)-mAB-鱼精蛋白/contr(scr)-siRNA/游离SMCC-P处理的细胞。相对地，将有效的EWS-FLI1(E/F)-siRNA仅与1800nM浓度的SMCC-鱼精蛋白复合，则证明是无效的(A，右)。B：同样将SMCC-鱼精蛋白与有效的DNMT3a siRNA联合且不含靶向抗体用于AML细胞系OCI-AML2，结果未显示出集落形成的抑制。C：最后，在A549中用与游离SMCC-鱼精蛋白结合的有效KRAS siRNA测试相同的设置，无效果且与对照无差异。这里显示了3个独立实验的平均值±SD。星号表示显著差异(P＜0.05，双侧T-检验)。
图27：A549 NSCLC细胞中的囊泡示踪。使用EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P-Alexa488 siRNA处理的细胞进行Lysotracker红染色。含有Alexa488的囊泡(白点，右侧小图)很少与Lysotracker(灰点，中间小图)染色共定位。
图28：用不同复合物处理的EGFR-阳性NSCLC细胞SK-LU1中不同抗-EGFR-mAB(西妥昔单抗)制剂的内化。用含有(上方小图中的白点)和不含游离SMCC-鱼精蛋白(下方小图)的EGFR-mAB-鱼精蛋白/P/Alexa488-对照-siRNA处理的SK-LU1细胞。
图29：用不同复合物和游离SMCC-鱼精蛋白处理的EGFR-阳性NSCLC细胞A549中不同抗-EGFR-mAB(西妥昔单抗)制剂的内化。用含有(A中为核染色和D中siRNA为白点)或不含游离SMCC-鱼精蛋白(B和E)的EGFR-mAB-鱼精蛋白/P/Alexa488-对照-siRNA和游离SMCC-鱼精蛋白(C和F)处理A549细胞。A-C：使用Hoechst的核染色，D-F：描绘与A-C中相同细胞的Alexa488-siRNA内化的囊泡的绿色通道(白点)。
图30：用不同复合物处理的CD33-阳性AML细胞OCI-AML2中不同抗-CD33-mAB(吉妥单抗)制剂的内化。用含有(A和D)和不含游离SMCC-鱼精蛋白(B和E)的抗-CD33-mAB-鱼精蛋白/P/Alexa488-对照-siRNA和游离SMCC-鱼精蛋白(C和F)处理OCI-AML2细胞。A-C.使用Hoechst的核染色(灰点)，D-F.描绘与A-C中相同细胞的Alexa488-siRNA内化的囊泡的绿色通道(D中的白点)。
图31：用不同的复合物处理的IGF1R-阳性的尤文肉瘤细胞SKNM-C中不同抗-IGF1R-mAB(ImcA12)制剂的内化。用含有(A和D)和不含游离SMCC-鱼精蛋白(B和E)的抗-IGF1R-mAB-鱼精蛋白/P/Alexa488-对照-siRNA和游离SMCC-鱼精蛋白(C和F)处理SKNM-C细胞。A-C：使用Hoechst的核染色，D-F：描绘与A-C中相同细胞的Alexa488-siRNA内化的囊泡的绿色通道(D中的白点)。
图32：在EGFR-阴性SKNM-C细胞培养物中存在不同的抗-EGFR-mAB(西妥昔单抗)制剂。下方小图描绘了如白框所示的上方小图的插图的更高放大倍数。A：未偶联的西妥昔单抗不将Alexa488-对照siRNA转运到SKNMC细胞中。B：鱼精蛋白偶联的西妥昔单抗不将Alexa488-对照siRNA转运到SKNMC-细胞中，Alexa488-阳性的囊泡结构仅在细胞附近(白点，上方小图中的箭头)和培养物的无细胞区域中(下方小图中的箭头)出现。C：不含游离SMCC-鱼精蛋白(其通过HPLC移除)的鱼精蛋白偶联西妥昔单抗不再形成Alexa488-阳性囊泡结构。
图33：DLS测量中的EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白缀合物。上方小图：描绘了分离的或用于下方小图测量的不同复合物的考马斯染色的PAGE凝胶。下方小图：将含有和不含游离SMCC-鱼精蛋白的EGFR-mAB-P以及单独的SMCC-鱼精蛋白在室温下温育2小时，然后通过动态光散射(DLS)在ζ-计数器(MALVERN)上对其进行测量。不同的峰代表以nm计的不同尺寸的颗粒。尽管具有游离SMCC-鱼精蛋白/siRNA的EGFR-mAB-P的最高峰出现在约427nm处，但是不含游离SMCC-鱼精蛋白的EGFR-mAB-P仅在约3.2nm处产生峰，游离SMCC-鱼精蛋白/siRNA在5.7nm处产生峰。
图34：于室温温育0至24小时期间DLS测量中的EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/P缀合物。混合后，通过西妥昔单抗-鱼精蛋白/未结合鱼精蛋白载体系统将siRNA单体(约1.92nm)组装成较大的结构，其稳定并进一步组装成更大的宏观结构(～500nm)。在PBS中的无保护环境中24小时后，该宏观结构再次开始部分地解组装。下方的数字表示以nm为单位的测量的颗粒尺寸。
图35：在腔室载玻片上在无细胞温育过夜中具有荧光Alexa488-siRNA(白点)的抗体-鱼精蛋白/游离SMCC-P(P/P)缀合物。在40x放大倍数下的A:EGFR-mAB-P/P，B:CD20-mAB-P/P，C:CD33-mAB-P/P，D:IGF1R-mAB-P/P，标尺＝10μm。E-H：A-D的更高放大倍数，比例尺仍然为10μm。
图36：在腔室载玻片上在无细胞温育过夜中具有荧光Alexa488-siRNA(白点)的含有和不含游离的SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白偶联物和单独的SMCC-鱼精蛋白。含有游离SMCC-鱼精蛋白的抗体复合物：A-D.A.EGFR-mAB-P，B.CD20-mAB-P，C.CD33-mAB-P，D.IGF1R-mAB-P，E.游离的SMCC-鱼精蛋白。不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗体复合物：F-I.F.EGFR-mAB-P，G.CD20-mAB-P，H.CD33-mAB-P，I.IGF1R-mAB-P，所有均为40x放大倍数。
图37：抗体复合物的一个共聚焦光学切片(C和D)上的荧光显微镜(A和B)和激光扫描显微镜(LSM)照片。在腔室载玻片上在无细胞温育过夜中具有荧光Alexa488-siRNA(白点)的西妥昔单抗抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC_P缀合物(A和C)和抗-CD20-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P(B和D)的形成。
图38：在腔室载玻片上于所示不同温度无细胞温育过夜中，具有荧光Alexa488-siRNA(白点)的含有游离SMCC-鱼精蛋白的抗-EGFR-抗体-鱼精蛋白偶联物。
图39：采用抗体与SMCC-鱼精蛋白的不同比例的西妥昔单抗的缀合。A：各缀合过程的详细配方。B：考马斯染色的SDS-PAGE显示未偶联的抗-EGFR-抗体西妥昔单抗与如A中所示偶联的缀合产物的比较。
图40：采用抗体与SMCC-鱼精蛋白的不同比例的西妥昔单抗的缀合产物的功能分析。A-F：如图中所示采用不同的缀合产物进行的条带转移分析。G-L：当将不同的缀合产物与Alexa488-siRNA(白点，尤其是J中)一起温育时，在载玻片上无细胞囊泡的形成。M-R：不同的西妥昔单抗-SMCC-鱼精蛋白/P/Alexa488-siRNA复合物向EGFR阳性的A549细胞中的内化(白点，箭头)。S-X：A549细胞的集落形成，所述A549细胞由与对照(“scr”)siRNA或抗-KRAS siRNA(“KRAS”)复合的含游离鱼精蛋白的不同的西妥昔单抗-SMCC-鱼精蛋白/P缀合物处理。当使用超过50XSMCC-鱼精蛋白时，缀合物是非特异毒性的。这里示出了3个独立实验的平均值±SD。星号表示显著差异(P＜0.009，2双侧T-检验)。
图41：具有不同比例的补充SMCC-鱼精蛋白或单独的鱼精蛋白的耗竭游离SMCC-鱼精蛋白的抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白的囊泡形成的功能分析。用Alexa488-siRNA温育后载玻片上无细胞囊泡的形成。如图所示(白点)，不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白不形成囊泡。当逐步加入游离的SMCC-鱼精蛋白时，采用1×SMCC-鱼精蛋白(A)，至低程度的10×SMCC-鱼精蛋白(B)，至高程度的32×SMCC-鱼精蛋白(C)不发生囊泡形成。当逐步加入未与磺基-SMCC偶联的游离鱼精蛋白时采用1×SMCC-鱼精蛋白(D)，至低程度的10×SMCC-鱼精蛋白(E)，至高程度的32×SMCC-鱼精蛋白(F中的白点)不发生囊泡形成。
图42：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有荧光Alexa488-siRNA和/或SM-1/RF的抗-CD20-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P缀合物的形成。A.-C.绿色荧光通道(白点)，D.-F.红色荧光通道(灰点)，A.和D.具有Alexa488-siRNA的抗-CD20-mAB-P/P，B.和E.具有红色荧光SM-1/RF的抗-CD20-mAB-P/P，C.和F.具有Alexa488-siRNA和红色荧光SM-1/RF的抗-CD20-mAB-P/P，40x放大倍数，比例尺＝10μm。
图43：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有荧光Alexa488-siRNA和/或SM-1/RF的抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P缀合物的形成。A-D：绿色荧光通道(白点)，E-H：红色荧光通道(灰点)。A和E.具有Alexa488-siRNA的EGFR-mAB-P/P，B.和F.具有红色荧光SM-1/RF的EGFR-mAB-P/P，C和G.具有非荧光对照-siRNA和红色荧光SM-1/RF的EGFR-mAB-P/P，D.和H.具有绿色荧光Alexa488-siRNA和红色荧光SM-1/RF的EGFR-mAB-P/P，40x放大倍数，比例尺＝10μm。
图44：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有荧光Alexa488-siRNA和SM-1/RF的利妥昔单抗抗-CD20-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P缀合物的形成。A-C：40x放大的绿色(白点)和红色荧光(灰点)通道，D-L：A-C的细节的相同放大，比例尺＝10μm。在D、G和L中：灰色环描绘Alexa488-siRNA荧光(箭头)。在E、H和K中：灰色圆圈描绘了SM-1/RF的红色荧光(箭头)。在F、I和L中，可以区分绿色荧光(灰)边缘(Alexa488-siRNA，箭头)和红色内部荧光(SM-1/RF)。
图45：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有绿色荧光Alexa488-siRNA和红色荧光SM-1/RF的西妥昔单抗抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-P缀合物的形成。A-C：40x放大倍数绿色(A和C中的白色和环状)和红色荧光通道(B和C中的灰色圆圈)。D：A-C的细节的放大，比例尺＝10μm。
图46：在光学显微镜下，在相差中可见由抗-CD20-mAB/P/游离SMCC-/P(A中的灰色环)、SM-1/RF(B中的灰色圆圈)和Alexa488-siRNA形成的大的胶束结构(B和C)。比例尺＝5μm。
图47：一个共焦光学切片和抗体复合物的Z-堆叠的LSM照片。A：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有荧光Alexa488-siRNA(白点)和SM-1/RF的抗-EGFR-mAB(西妥昔单抗)-鱼精蛋白/游离SMCC-P缀合物的形成。a：横跨囊泡的一个水平，B和C：在两个轴上重建囊泡的3D结构的Z-堆叠。B：在腔室载玻片上在无细胞温育o/n中具有荧光Alexa488-siRNA(白环和点)和SM-1/RF(灰影)的抗-CD20-mAB(利妥昔单抗)-鱼精蛋白/P缀合物的形成。d：跨越囊泡的一个水平，e和f：在两个轴上重建囊泡的3D结构的Z-堆叠。
图48：用于通过单克隆抗体进行静电转运的聚阴离子依鲁替尼衍生物的合成。将依鲁替尼缀合至Cy3.5发色团以形成低分子量(1.44kDa)聚阴离子。阴离子依鲁替尼-Cy3.5(Cy3.5-RMA561)通过静电相互作用与阳离子鱼精蛋白连接的mAB形成稳定囊泡的化学结构。
图49：Cy3.5-RMA561的高分辨率质谱。在质谱仪中通过电子束将样品电离并碎裂，根据它们的具体偏转通过它们的质荷比(m/z)分析所得碎片。HRMS(ESI,CH3CN/H2O):
m/z calc.对于C64 H62 N9 O15 S4 3-[M-H](z＝3):441.44216；发现：441.44160；
m/z calc.对于C64 H62 N9 O15 S4H2-[M-H](z＝2):662.66687；发现：662.66630；
m/z calc.对于(C64 H62 N9 O15 S4H)2 4-[M-H](z＝4):662.66687；发现：662.66630。
图50：αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物和αEGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物结合依鲁替尼-Cy3.5。A.采用高达1:32的不同比例的依鲁替尼-Cy3.5、使用αCD20-mAB-鱼精蛋白/P和αEGFR-mAB-鱼精蛋白/P的条带转移分析。B.使用高达1:200的不同分子过量的依鲁替尼-Cy3.5、使用αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC和αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC的条带转移分析。抗体-鱼精蛋白缀合物复合可以复合至少100mol依鲁替尼-Cy3.5。α，抗。
图51：αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5缀合物和αEGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物内化依鲁替尼-Cy3.5。A.CD20-阳性HBL-1DLBCL细胞内化αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5复合物。左：核染色，右：灰点＝Cy3.5。B.EGFR-阳性A549 NSCLC细胞内化αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5复合物。左：核染色，右：灰点＝Cy3.5。α，抗。
图52：通过由利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC作为载体分子转运的依鲁替尼-Cy3.5缀合物(αCD20-mAB-P/依鲁替尼-Cy3.5)体外共价标记BTK激酶。将105个细胞用所示浓度的化合物处理过夜，在上样染料中裂解并在凝胶上运行。将凝胶暴露至SYBRGold过滤器上的UV光(左)用以INTAS凝胶成像仪上的Cy3.5发射，然后印迹并与抗-BTK-mAB温育以进行识别(右)。RTX，利妥昔单抗。细胞内BTK结合游离依鲁替尼-Cy3.5以及抗体-鱼精蛋白-复合的依鲁替尼-Cy3.5。
图53：αCD20-mAB(利妥昔单抗)-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白缀合物和αEGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白缀合物转运依鲁替尼-Cy3.5，并且比依鲁替尼-Cy3.5或单独的抗体更有效地抑制集落形成。A.和B.集落形成分析。与用PBS、未复合的依鲁替尼-Cy3.5处理细胞或用αCD20 mAB-(利妥昔单抗)鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5处理的细胞相比，用αCD20-mAB(利妥昔单抗)-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5处理的HBL-1细胞(A)和用αEGFR mAB-(西妥昔单抗)鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5处理的A549细胞(B)在甲基纤维素中形成的集落显著更少。这里显示了3次独立实验的平均值±SD。星号显示显著差异(p值<0.05，双侧t-检验)。α，抗。
图54：在通过HPLC耗竭游离的鱼精蛋白-SMCC后，αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白缀合物不能有效结合依鲁替尼-Cy3.5。A.考马斯染色的SDS-PAGE显示αCD20-mAB、与32x鱼精蛋白-SMCC偶联的αCD20-mAB，和在未结合的SMCC-鱼精蛋白耗竭后与32x鱼精蛋白-SMCC偶联的αCD20-mAB的HPLC级分19-25/26；HC＝重链，LC＝轻链，-P＝鱼精蛋白-SMCC。B.用耗竭鱼精蛋白的(左)和含鱼精蛋白的αCD20-mAB制剂(右)进行条带转移分析。未进行鱼精蛋白-SMCC耗竭的αCD20-mAB制剂结合＞32mol的依鲁替尼-Cy3.5。C.集落形成分析。与单独用未偶联的依鲁替尼-Cy3.5或未偶联αCD20-mAB处理的细胞相比，用αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5处理的HBL-1细胞在软琼脂中形成显著更少的集落。与PBS处理的细胞相比，当用不含游离鱼精蛋白-SMCC的αCD20-mAB-鱼精蛋白缀合物处理HLB-1细胞时，未观察到集落形成的差异(参见A+B，级分25)。这里显示了三次独立实验的平均值±SD。*P＜0.0003，双侧T-检验。α，抗。
图55：αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物在体内有效地协调并转运依鲁替尼-Cy3.5至肿瘤部位，并显著降低肿瘤生长。A.NSG-HBL1异种移植物模型的肿瘤生长和治疗方案。移植后，肿瘤生长至200mm3，治疗开始前，每周腹膜内注射两次。B.采用利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5 1:20复合物(4mg/kg小鼠体重，或每单个剂量0.625nmol利妥昔单抗-鱼精蛋白和/或12.5nmol依鲁替尼衍生物)的治疗(图中＝利妥昔单抗-依鲁替尼-Cy3.5(C)或利妥昔单抗-P/依鲁替尼-Cy3.5(B))显著减少肿瘤体积和生长。在每个治疗日，每周两次，通过卡尺测量评估肿瘤体积。而在利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5 1:20复合物治疗组中，肿瘤体积被限制在远低于1,000mm3，并且在三次治疗后开始缩小至600mm3，所有其它组均表现出快速的肿瘤生长并且必须在预先定义的法律规定下而被提前杀死。C.治疗组与对照组的存活曲线。将每组10只小鼠用PBS、利妥昔单抗、依鲁替尼标准品、依鲁替尼-Cy3.5和利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5 1:20复合物处理。在治疗开始8天后，依鲁替尼-Cy3.5不能降低肿瘤生长，由于预先定义的标准，必须将所有小鼠处死，而PBS和利妥昔单抗治疗的小鼠寿命不显著地增长至第16天，10只依鲁替尼治疗的小鼠中的最后一只必须在第20天处死，而10只依鲁替尼-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5 1:20复合物治疗的小鼠中的5只存活直到治疗开始后第16天和其中的4只存活至第20天。将利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5治疗组与对照组之间的差异评估为p≤0.03(ANOVA)。α，抗，RTX，利妥昔单抗。
图56：异种移植于NSG小鼠中的HBL-1细胞的肿瘤在用利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5处理的小鼠中显示Cy3.5荧光信号的显著富集。在达到无法忍受的肿瘤尺寸后，将来自图55所示实验的异种移植小鼠处死，将器官以及肿瘤制备并暴露于在530nm激发和600nm发射下的Cy3.5信号的离体荧光检测。与未靶向的依鲁替尼-Cy3.5和标准依鲁替尼相比，来自利妥昔单抗-P/游离P/依鲁替尼(图中＝Rtx/依鲁替尼-Cy3.5)处理组(下方行)的肿瘤的肿瘤组织的所有部分都显示出Cy3.5-依赖性荧光信号的显著富集，而在对照器官中，仅能检测到显示自体荧光的坏死病灶。所示肿瘤制备物的直径在所有病例中都相似，但荧光区域不同。标度尺表示荧光的任意单位。虚线代表每个肿瘤的外部界限。数字指单个小鼠的标识符。
图57：分析来自用HBL1小鼠异种移植的NSG小鼠的Cy3.5荧光的不同小鼠器官的概览。在达到无法忍受的肿瘤尺寸后，将来自图55和56中所示实验的异种移植小鼠处死，将器官以及肿瘤制备并暴露于在530nm激发和600nm发射下的Cy3.5信号的离体荧光检测。与非靶向依鲁替尼-Cy3.5相比，来自利妥昔单抗-P/游离P/依鲁替尼(图中＝Rtx/依鲁替尼-Cy3.5)处理组(下方行)的肿瘤显示出Cy3.5依赖性荧光信号的显著富集。标度尺表示荧光的任意单位。(如右侧示意图中所示)在明场(上方小图)和红色(Cy3.5)荧光(下方小图)中器官总是以相同的取向排列。
图58：在腔室载玻片上在无细胞温育过夜(o/n)中具有绿色荧光Alexa488-siRNA和/或红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的利妥昔单抗αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白纳米囊泡的形成。A.-C.绿色荧光通道，D.-F.红色荧光通道。A.和D.具有绿色Alexa488-siRNA的αCD20-mAB-P/游离P，B.和E.具有红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的αCD20-mAB-P/游离P，C.和F.具有绿色Alexa488-siRNA和红色依鲁替尼-Cy3.5的αCD20-mAB-P/游离P，40x放大倍数，比例尺＝10μm。所有利妥昔单抗-鱼精蛋白制剂均含有未结合的鱼精蛋白-SMCC。α，抗。
图59：在腔室载玻片上在无细胞温育过夜(o/n)中具有绿色荧光Alexa488-siRNA和/或红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的西妥昔单抗αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物的形成。A.-D.绿色荧光通道，E-H.红色荧光通道。A.和E.具有绿色荧光Alexa488-siRNA的西妥昔单抗αEGFR-mAB-P/游离鱼精蛋白-SMCC，B.和F.具有红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的西妥昔单抗αEGFR-mAB-P/游离鱼精蛋白-SMCC，C.和G.具有非荧光对照siRNA(scr，混杂的)和红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的αEGFR-mAB-P，D.和H.具有非荧光Alexa488-siRNA和红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的αEGFR-mAB-P，40x放大倍数，比例尺＝10μm。所有西妥昔单抗鱼精蛋白制剂均含有未结合的鱼精蛋白-SMCC。α，抗。
图60：在腔室载玻片上在无细胞温育过夜(o/n)中具有绿色荧光Alexa488-siRNA和红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的西妥昔单抗αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(A-B)和利妥昔单抗抗-CD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(C-D)缀合物的形成。40x放大的绿色和红色荧光通道。在A和C中，绿色荧光边缘(Alexa488-siRNA)是可见的，而在B和D中，可以看到红色内部荧光(依鲁替尼-Cy3.5)。所有抗体-鱼精蛋白制剂均含有未结合的鱼精蛋白-SMCC。
图61：αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC与siRNA和依鲁替尼-Cy 3.5的不同复合物形式中的粒径的测定。A.B-E中所示的平均直径(nm)的图示说明。在温育开始后1小时和2小时进行所示复合物的Zetaview测量。这里显示的是平均囊泡大小(nm)，其通过B-E中的直方图描绘的每个颗粒的平均直径来确定。所有利妥昔单抗-鱼精蛋白制剂均含有未结合的鱼精蛋白-SMCC。α，抗。
图62：A：αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(αCD20-mAB-P/P)缀合物结合依鲁替尼-Alexa488。采用高达1:2的不同比例的依鲁替尼-Alexa488、使用αCD20-mAB-鱼精蛋白/P的条带转移分析。α，抗。B：由于Alexa488分子具有有限的阴离子电荷-2(箭头)，发现聚阳离子鱼精蛋白融合物与Alexa488之间的相互作用不如其与Cy 3.5(其净电荷为-4)的相互作用强烈。使用Alexa488缀合的依鲁替尼和鱼精蛋白缀合物，实现了仅2:1的偶联比。然而，依鲁替尼-Alexa488与αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(αCD20-mAB-P/P)的复合仍然是成功的。C-H：在αCD20-mAb-鱼精蛋白、游离鱼精蛋白和依鲁替尼-Cy 3.5以1:20的比例自组装1h后，然后在PBS(C,D)以及诸如细胞培养基RPMI/10％ FCS(E,F)和PBS/50％ FCS(G,H)的挑战性条件下温育24h的稳定性。C,E,G:Cy3.5荧光，D,F,H:相衬。α，抗。
图63：带电荷的依鲁替尼-Cy 3.5而非不带电荷的依鲁替尼(商品名：imbruvica)与不同的精蛋白缀合的mAB形成稳定的纳米颗粒。与不带电荷的依鲁替尼相比，通过SMCC与鱼精蛋白缀合并含有游离SMCC-鱼精蛋白的相应抗体载体负载带电荷的依鲁替尼-Cy 3.5。只有与Cy 3.5缀合的那些依鲁替尼样品显示出了纳米颗粒的密集形成，而不带电荷的依鲁替尼则不能。在Cy 3.5依赖性荧光显微照片(上部)和相差(下部)中测试的抗-EGFR抗体(A-D)、抗-CD33抗体(E-H)和抗-IGF1R抗体(I-L)。α，抗。
图64：一种纳米颗粒样结构的理想实例的横截面的图示，所述纳米颗粒样结构满足从我们的实验推导出的有效抗体-鱼精蛋白-鱼精蛋白-siRNA或-依鲁替尼-Cy 3.5载体复合物的那些条件。图示不是按比例绘制的。在mAB(其中一些鱼精蛋白偶联到靶向抗体)和相应的阴离子货物之间形成静电结合桥，阴离子货物包括siRNA(A)以及依鲁替尼-Cy 3.5(B)或包括两者(C)。
图65：通过αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-依鲁替尼-Cy 3.5形成静电纳米颗粒。使载体抗体-鱼精蛋白缀合物以1:20的比例负载阴离子依鲁替尼-Cy 3.5，并应用于细胞培养处理的载玻片以进行荧光显微镜检查(A，B)或应用于铜栅格以进行磷-Wolfram负染色电子显微镜检查(C)。这里，静电负载导致形成许多聚集体，其中较大的聚集体显示强烈的Cy3.5荧光(A)并且在使用浮雕(emboss)动态过滤器以通过对比度增强来说明3D结构的光学显微镜中是可见的(B)。在透射电子显微镜(C)中，负染色导致大致相同的粒径范围，但揭示了大量在光学显微镜中不可检测的较小囊泡(C)的存在。α，抗。
图66：αCD20-mAB-P/P-复合的依鲁替尼-Cy3.5对布鲁顿氏激酶BTK的细胞靶向。A-F：用靶向缀合物和对照处理的HBL1 DLBCL细胞的荧光显微镜检查显示了显著的Cy 3.5信号的细胞内富集。G：使来自用靶向缀合物和对照处理72小时的细胞的裂解物进行SDS PAGE并照射Cy 3.5信号。在此，通过平行免疫印迹识别为BTK的70kDa的清晰条带被依鲁替尼-Cy3.5共价标记，这表明了结合以及由此的依鲁替尼-Cy 3.5衍生物的功能性。H-P：用依鲁替尼-氟硼吡咯(绿色、N和P)预处理的HBL1 DLBCL细胞的荧光显微镜检查在αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5处理后未显示Cy 3.5信号的细胞内富集(M，与L相比)。α，抗。
图67：DLBCL细胞系中通过αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-依鲁替尼-Cy 3.5处理的BTK失活的生理和功能结果。A：将HBL1细胞用所示的相应缀合物处理72小时，裂解，并对其进行针对磷酸-BTK(pBTK)、总磷酸-BTK(tBTK)、磷酸-ERK(p-ERK)、总磷酸-ERK(t-ERK)和作为上样对照的肌动蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹。这里，非靶向依鲁替尼-Cy 3.5抑制BTK的磷酸化的程度略小于αCD20-mAB-鱼精蛋白-依鲁替尼-Cy 3.5，预期下游磷酸化靶标(如ERK)的差异更为显著：这里，仅αCD20-mAB-P/P-介导的依鲁替尼-Cy 3.5处理能够降低ERK磷酸化。B：在集落形成分析中，未靶向的依鲁替尼-Cy 3.5适度地降低了HBL1细胞的集落生长，而αCD20-mAB-P/P对依鲁替尼-Cy 3.5的特异性靶向促使集落生长减少至30％以下。为了证明游离鱼精蛋白在缀合物构建体中的重要性，我们使游离鱼精蛋白从缀合物混合物中耗竭，与依鲁替尼-Cy 3.5的单独应用相比，该组合的应用揭示了没有更高的集落形成减少，因此抗体缀合物失去了其靶向能力(B，最右边的柱)。α，抗。
图68：在DLBCL细胞系HBL1中通过αCD20-mAB-P/P复合的依鲁替尼-Cy 3.5处理诱导BTK靶向的凋亡。将HBL1细胞用所示的相应缀合物处理72小时，并对其进行Annexin V-染色。通过流式细胞术通过Annexin V表达(上方小图，X-轴)检测凋亡细胞，而通过尤其是在αCD20-mAB-P/P复合的依鲁替尼-Cy 3.5处理的细胞中，Y轴(上方小图)上的荧光观察到内化的依鲁替尼-Cy 3.5荧光增加。计数来自右上和右下的门控值。下方小图：汇总了三个独立实验中的Annexin V阳性细胞。P＜0.05，双侧T-检验。α，抗。
图69：在通过采用αIGF1R-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-siRNA-鱼精蛋白纳米载体的系统治疗敲除致癌EWS-FLI1易位产物后，尤文肉瘤异种移植肿瘤生长得到抑制。A.体内实验的治疗方案。如所示腹膜内给予纳米颗粒。B-C.在SK-N-MC异种移植肿瘤上靶向纳米载体的系统性体内应用的结果。B.用αIGF1R-mAB替妥木单抗(“Tepro”)-鱼精蛋白/PsiRNA纳米颗粒处理的SK-N-MC的肿瘤生长曲线(平均值±SEM；双侧t-检验，*p＜0.05)。C.实验结束时切除的肿瘤的重量统计(平均值±SD；双侧t-检验，*p＜0.05)。α，抗。
图70：由载体抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白和siRNA形成的纳米颗粒暴露近中性的表面电荷。如本文其它地方所述使纳米颗粒形成2小时，并进行动态光散射(DLS)分析(Malvern Zeta-sizer)。根据不同的抗体缀合制剂，颗粒尺寸范围在具有指示的偏差的350至750nm之间。更重要的是，颗粒表面的ζ电位仅为微负至中性。
图71：破译(deciphering)抗-EGFR-mAB-SMCC-鱼精蛋白缀合物、游离SMCC-鱼精蛋白和siRNA之间的有效纳米颗粒形成的先决条件。A-G.在32x SMCC-鱼精蛋白和与抗体浓度相比升高的(1:0.6-1:40)摩尔比的Alexa488-对照-siRNA的存在下，用60nMαEGFR-mAB-P形成囊泡。在5-10x摩尔过量的siRNA下可观察到囊泡的形成(D-E)。上方小图：Alexa488-siRNA阳性囊泡的荧光显微镜检查。下方小图：与上方小图相同的制剂的相差。α，抗。
图72：由αEGFR-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-Alexa488-siRNA形成的纳米颗粒在含血清条件下是稳定的。A-B.在αEGFR-mAB-鱼精蛋白、游离鱼精蛋白和Alexa488-siRNA以1:10的比例自组装2h后，随后在PBS(A)和PBS/50％ FCS(B)中温育24小时的稳定性。α，抗。
图73：αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离P-依鲁替尼-Cy 3.5纳米载体的血清稳定性。A-F.在αCD20-mAB-鱼精蛋白、游离鱼精蛋白和依鲁替尼-Cy3.5以1:20的比例自组装2h后，然后在PBS(A,D)以及诸如细胞培养基RPMI/10％ FCS(B,E)和PBS/50％ FCS(C,F)的挑战性条件下温育24h(A-C)或72h(D-F)的稳定性。A-F：Cy 3.5荧光显微镜检查，α，抗。
图74：用三种不同的靶向抗体构建的siRNA纳米载体的pH稳定性。在标准条件下，在室温下形成由αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白(上方小图)、αIGF1R-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白(中间小图)和αCD33-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白(下方小图)形成的纳米载体达2小时，每种纳米载体均具有10倍摩尔过量的siRNA，然后将纳米载体稀释于30倍体积的相应缓冲液中以用于在腔室载玻片中进行各自的pH稳定性测试达24小时。接着，将载玻片洗涤，封片并进行荧光显微镜检查。纳米载体在5.2至8.0之间的pH值下是稳定的，在较低pH下具有聚集的趋势。α，抗。
图75：用αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白和依鲁替尼-Cy3.5构建的纳米载体的pH稳定性。在标准条件下，在室温下形成由具有20倍摩尔过量依鲁替尼-Cy3.5的αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白形成的纳米载体达2小时，然后将纳米载体稀释于30倍体积的相应缓冲液中以用于在腔室载玻片中进行各自的pH稳定性测试达24小时。接着，将载玻片洗涤，封片并进行荧光显微镜检查。纳米载体在5.8至8.0之间的pH值下是稳定的，在较低pH下具有解体的趋势。α，抗。
图76：αEGFR-mAB-P/游离鱼精蛋白-siRNA纳米载体中的靶向IgG抗体的免疫标记。通过自组装(αEGFR-P/游离鱼精蛋白+Alexa488-siRNA(A和D中的绿色))2小时形成纳米载体，在经处理的玻璃表面固定o/n(A，E)，用αhIgG-Alexa 647(A-C)染色，用PBS冲洗，用DAKOFluo封片剂封固，并进行荧光显微镜检查。纳米载体结构仅在表面区域上显示了靶向αEGFR抗体的Alexa 647的显著染色(B-C)。F.染色程序的示意性概览。α，抗。
图77：αIGF1R-mAB-P/游离鱼精蛋白siRNA纳米载体中的靶向IgG抗体的免疫标记。通过自组装(替妥木单抗-鱼精蛋白+Alexa488-siRNA(绿色))2小时形成纳米载体，在经处理的玻璃表面固定o/n(A，D)，用αhIgG-Alexa 647(A-C)染色，用PBS冲洗，用DAKO Fluo封片剂封固，并进行荧光显微镜检查。纳米载体结构仅在表面区域上显示了靶向替妥木单抗抗体的Alexa 647的显著染色(B-C)。F.染色程序的示意性概览。α，抗。
图78：纳米载体复合物中游离鱼精蛋白的可视化。这里，使用通过尺寸排阻色谱耗竭游离鱼精蛋白并用游离鱼精蛋白重构该制剂的αEGFR-mAB-鱼精蛋白制剂，将其用Cy3生色团标记。A：根据制造商的建议将鱼精蛋白与Cy3-NHS酯缀合，并通过旋转柱纯化。所得鱼精蛋白-Cy3表现出强Cy3-依赖性荧光，并以与未缀合材料相当的方式浓缩，因此将其以通常32倍摩尔过量重构为抗体-鱼精蛋白(B)。由这种具有未标记siRNA的重构材料形成的siRNA纳米载体在纳米结构的内腔中显示出鱼精蛋白的强Cy3依赖性荧光信号(C)。相对地，用αhIgG-Alexa 647抗体对α人IgG信号染色的相同纳米结构显露出染色为抗体位置阳性的边缘结构(D)。E：将C和D中的突出显示部分合并并更高倍数放大。F：E中突出显示部分的更高倍数放大。α，抗。
图79：缀合有花青染料的抑制剂吉非替尼、吉西他滨和维奈托克的合成。
图80：将该概念延伸到更容易和更廉价的聚阴离子分子部分。
具体实施方式
本申请的发明人已经令人惊讶地发现对如N.等，2016Nat.Protoc.11,22-36所述的抗体-鱼精蛋白缀合物的缀合方案的改进导致形成了包含抗体-鱼精蛋白缀合物和待递送至靶标的带负电荷的货物分子的纳米颗粒。
包含与鱼精蛋白化学缀合的靶向部分、游离鱼精蛋白和带负电荷的货物分子(如siRNA)的复合纳米颗粒的形成可用于siRNA和可选择性阻断致癌通路的其它效应药物的细胞类型特异性治疗性递送。
在本发明的缀合方案中，改进了两个步骤。首先，用抗体和基本上不含游离磺基-SMCC的SMCC-鱼精蛋白缀合物进行产生抗体-鱼精蛋白的缀合步骤。在如由N.等，2016Nat.Protoc.11,22-36所述的方案中，游离磺基-SMCC存在于该缀合步骤中，并且仅在缀合步骤之后被移除。第二，对于将siRNA负载到抗体-鱼精蛋白缀合物上的步骤，在一定量的游离鱼精蛋白存在下，使抗体-SMCC缀合物和siRNA彼此接触。令人惊讶地，用这种改进的方法形成了包含抗体-鱼精蛋白缀合物、游离鱼精蛋白和siRNA的大颗粒。
本申请的发明人还惊奇地发现，与使用前述方案(N.等，2016Nat.Protoc.11,22-36)产生的缀合物相比，此类纳米颗粒提供siRNA的更有效的结合和转运。
本发明的方法产生的纳米结构远远大于线性单一抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物，并且其可以通过光学显微镜而被检测为囊泡结构。本申请的发明人已经发现，需要一定量的未结合的鱼精蛋白来形成这些纳米颗粒并有效地靶向相应的细胞。然后，特异性地进行预期靶(癌)基因的敲低。如实施例6、15和18-21所示，带正电荷的纳米结构(胶束)也可以作为其他带负电荷的小分子的载体，其中小分子也以靶向且有效的方式被转运到相应的细胞中。利用这种方法，诸如siRNA的治疗分子不仅可有效形成静电纳米结构，还可被包封在纳米结构内部。
由于在本发明发明时大多数处于晚期和转移期的癌症类型是不能有效治愈的，因此强烈需要新的、更有效且更好耐受的治疗选择。包含靶向部分(比如具有化学结合的SMCC-鱼精蛋白的癌细胞特异性抗体)和游离鱼精蛋白的纳米颗粒能够转运带负电荷的分子(比如siRNA)和其它不被真核细胞摄取的小分子。因为尤其是可以针对任何基因定义siRNA，所以该系统潜在地适用于包括癌症、神经变性和病毒感染的大量疾病。
因此，本申请涉及一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。
如本文所用的“第一缀合物”指包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽的缀合物或优选地由其组成的缀合物。
在本公开的方法中，(c)是缀合步骤，其中抗体与第一缀合物缀合。与由N.等，2016Nat.Protoc.11,22-36先前描述的方法不同，该步骤使用的包含第一缀合物的组合物基本上不含未缀合的双官能连接子。与此一致，步骤(c)的缀合优选在基本上不含未缀合的双官能连接子的组合物中进行。
在步骤(c)中，优选地，与抗体相比，第一缀合物是摩尔过量的，这意味着优选地存在比抗体分子更多的第一缀合物分子。在一些实施方案中，步骤(c)中的第一缀合物与抗体之间的摩尔比为至少约10:1，优选为至少约15:1，优选为至少约20:1。在一些实施方案中，第一缀合物与抗体之间的摩尔比为高达约50:1，优选地高达约45:1，优选高达约40:1。在一些实施方案中，步骤(c)中的第一缀合物与抗体之间的摩尔比在约10:1至50:1的范围内，优选在约15:1至约45:1，优选在约20:1至约40:1的范围内。优选的实施方案，第一缀合物与抗体之间的摩尔比为约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、约26:1、约27:1、约28:1、约29:1、约30:1、约31:1、约32:1、约33:1、约34:1、约35:1、约36:1、约37:1、约38:1、约39:1、约40:1。
在本公开的方法中，在步骤(d)中，使第二缀合物、带正电荷的多肽和带负电荷的分子彼此接触。不希望受理论的束缚，认为上述三种组分自组装形成纳米颗粒。在本文中，第二缀合物是在步骤(c)中形成的第二缀合物。
当在步骤(d)的上下文中提及带正电荷的多肽时，该表达涵盖游离的带正电荷的多肽和带正电荷的多肽的缀合物(比如与连接子缀合的带正电荷的多肽)两者。步骤(d)的带正电荷的多肽可以是如步骤(c)中的第一缀合物，或者它也可以是不同于步骤(c)中的第一缀合物的另一分子。例如，在步骤(d)的上下文中，术语带正电荷的多肽可涵盖(游离)鱼精蛋白和SMCC-鱼精蛋白两者。在步骤(d)的上下文中，该术语还涵盖不同带正电荷的多肽的混合物，包括带正电荷的多肽和带正电荷的多肽的缀合物的混合物。
在一些实施方案中，步骤(d)的带正电荷的多肽是步骤(c)的第一缀合物。作为一个说明性实例，步骤(d)的带正电荷的多肽是SMCC-鱼精蛋白，步骤(c)的第一缀合物也是SMCC-鱼精蛋白。如果步骤(d)的带正电荷的多肽是步骤(c)的第一缀合物，则步骤(c)中形成的组合物可用于步骤(d)中，而无需将步骤(c)中形成的第二缀合物自“残余的”带正电荷的多肽(在本上下文中包括“残余的”第一缀合物)分离的步骤。
在一些实施方案中，步骤(d)的带正电荷的多肽不同于步骤(c)的第一缀合物。作为说明性实例，步骤(d)的带正电荷的多肽是(游离)鱼精蛋白，而步骤(c)的第一缀合物是SMCC-鱼精蛋白。在这种情况下，该方法可以在步骤(c)之后包括在步骤(c)之后和/或在步骤(d)之前将第二缀合物自第一缀合物中分离的步骤。该方法还可以包括在步骤(d)中和/或步骤(d)之前带正电荷的多肽的添加。
在步骤(d)的上下文中，优选的带正电荷的多肽包括、但不限于鱼精蛋白、SMCC-鱼精蛋白、组蛋白亚基、与SMCC缀合的组蛋白亚基、或它们与鱼精蛋白的混合物，优选SMCC-鱼精蛋白或它们的混合物，更优选鱼精蛋白或SMCC-鱼精蛋白。
在步骤(d)中，优选地，与第二缀合物相比，带正电荷的多肽是摩尔过量的，这意味着优选地存在比第二缀合物分子更多的带正电荷的多肽分子。在一些实施方案中，步骤(d)中的带正电荷的多肽与第二缀合物之间的摩尔比为至少约10:1，优选为至少约15:1，优选至少为约20:1。在一些实施方案中，带正电荷的多肽与第二缀合物之间的摩尔比为高达约50:1，优选为高达约45:1，优选为高达约40:1。在一些实施方案中，步骤(d)中的带正电荷的多肽与第二缀合物之间的摩尔比在约10:1至50:1的范围内，优选在约15:1至约45:1，优选约20:1至约40:1的范围内。优选的实施方案，带正电荷的多肽与第二缀合物之间的摩尔比为约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、约26:1、约27:1、约28:1、约29:1、约30:1、约31:1、约32:1、约33:1、约34:1、约35:1、约36:1、约37:1、约38:1、约39:1、约40:1。
在步骤(d)中，优选地，与第二缀合物相比，带负电荷的分子是摩尔过量的，这意味着优选地存在比第二缀合物分子更多的带负电荷的分子。在一些实施方案中，步骤(d)中的带正电荷的多肽与第二缀合物之间的摩尔比为至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约70:1、至少约100:1、至少约150:1、至少约200:1、至少约250:1、至少约300:1、至少约400:1或至少约500:1。
在步骤(d)中，优选地，与带正电荷的多肽相比，带负电荷的分子是等摩尔的或摩尔过量的，这意味着优选存在与带正电荷的多肽分子大约相同数目或更多的带负电荷的分子。在一些实施方案中，步骤(d)中的带负电荷的分子与带正电荷的多肽之间的摩尔比为至少约1:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约100:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约60:1、至少约70:1、至少约80:1、至少约90:1或至少约100:1。
本公开的方法可以在大的温度范围下进行。本申请的实施例显示，可以在约4℃、室温以及37℃下形成纳米颗粒。因此，设想本公开的方法(包括例如步骤(c)和/或步骤(d))可以在约1℃至约60℃、优选约2℃至约50℃、优选约3℃至约40℃、更优选约4℃至约37℃的温度下进行，因此，步骤(d)可以在约1℃至约60℃、优选约2℃至约50℃、优选约3℃至约40℃、更优选约4℃至约37℃的温度下进行。
可以设想，步骤(d)优选包括允许纳米颗粒形成的温育步骤。优选地，温育步骤进行至少约1h，优选至少约1.5h，优选至少约2h。优选地，温育步骤进行高达约48h，优选高达约24h，优选高达约18h，优选高达约12h，优选高达约10h，优选高达约9h，优选高达约8h，优选高达约7h，优选高达约6h。优选地，温育步骤进行约1h至约48h，优选约1h至约24h，优选约1h至约18h，优选约1h至约12h，优选约1h至约10h，优选约1h至约9h，优选约1.5h至约8h，优选约1.5h至约7h，优选约2h至约6h。不希望被理论束缚，认为约2h至约6h内的温育可以达到最佳结果。因此，优选的实施方案，步骤包括约2h至约6h，包括约2h、约2.1h、约2.2h、约2.3h、约2.4h、约2.5h、约2.6h、约2.7h、约2.8h、约2.9h、约3h、约3.1h、约3.2h、约3.3h、约3.4h、约3.5h、约3.6h、约3.7h、约3.8h、约3.9h、约4h、约4.1h、约4.2h、约4.3h、约4.4h、约4.5h、约4.6h、约4.7h、约4.8h、约4.9h、约5h、约5.1h、约5.2h、约5.3h、约5.4h、约5.5h、约5.6h、约5.7h、约5.8h、约5.9h和约6h的温育步骤。
在步骤(c)之前，本公开的方法可进一步包括步骤(a)将带正电荷的多肽与双官能连接子缀合和(b)移除未缀合的连接子。
如本文所用，术语“移除未缀合的连接子”是指适于将带正电荷的多肽和双官能连接子的缀合物(即第一缀合物)自未缀合的连接子中分离的任何步骤。此类方法是本领域技术人员熟知的，包括、但不限于例如过滤、透析、凝胶过滤、层析或电泳。
如本文所用，术语“缀合(“conjugation”或“conjugate”)”是指通过所有形式的共价连接，通过包括但不限于化学缀合的方式将两个或更多个分子连接在一起。因此，缀合可包括连接子的至少一部分与多肽的缀合。这种连接可以通过不同的反应性基团或通过相同的反应性基团实现。
多肽上可被靶向用于交联的官能团包括伯胺、巯基、羰基、羟基、碳水化合物、羧酸等，优选通过胺和/或巯基和/或羧基被靶向用于交联。在一些实施方案中，连接子与多肽的缀合通过所述多肽的NH2-基团实现。在一些实施方案中，连接子与多肽的缀合通过所述多肽的巯基实现。在一些实施方案中，连接子与多肽的缀合通过所述多肽的羧基基团实现。将连接子(或交联剂)化学缀合至多肽的方法是技术人员熟知的。
在步骤(c)之前，本公开的方法可进一步包括纯化抗体的步骤。此类纯化步骤可以是脱盐步骤。此类脱盐方法是本领域技术人员熟知的，包括、但不限于如凝胶过滤或透析。
本公开的方法还可以包括从其生产环境的组分中分离和/或回收在步骤(c)中获得的纳米颗粒的步骤。优选地，在分离和/或回收之后，纳米颗粒不与或基本上不与来自其生产环境的所有其它组分缔合。其生产环境的污染物组分是通常会干扰纳米颗粒的用途，特别是其治疗用途的材料，并且这些污染组份可以包括游离的第二缀合物(即未包含在纳米颗粒中的第二缀合物)、游离的带正电荷的多肽(即未包含在纳米颗粒中)或游离的带负电荷的分子(即未包含在纳米颗粒中)。按重量计，纳米颗粒可以例如占(constitute)给定样品中总蛋白质的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％。在优选的实施方案中，按重量计，纳米颗粒占给定样品中总蛋白质的至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％。在优选的实施方案中，按重量计，纳米颗粒占给定样品中总蛋白质的至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。应理解，根据情况，按重量计，分离的纳米颗粒可以占总蛋白质含量的约5％至约99.9％或约100％。
本公开的方法可以包括以下步骤：
任选地：(a)将带正电荷的多肽与双官能连接子缀合；
任选地：(b)移除未缀合的双官能连接子；
任选地：纯化抗体；
(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；
任选地：测定蛋白质含量；
任选地；优选通过流式细胞术评估抗体功能性；
(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒；和/或
任选地：回收和/或分离所述纳米颗粒。
如本文所用的术语“多肽”是指一种由通过肽键连接的氨基酸残基的单链组成的化合物。本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，或者可以指两种或多种多肽的复合物。本文所用的多肽可以包含至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约600、至少约700或甚至更多个氨基酸。
本文所用的多肽优选由天然存在的和/或蛋白原的氨基酸组成。然而，其中氨基酸和/或肽键已经被功能类似物取代的肽模拟物也涵盖在本发明中。术语多肽还指并且不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这些修饰在基础教科书和更详细的专论以及研究文献中有详细描述。
术语“带正电荷的多肽”是指在生理pH或接近生理pH(例如，在pH为4至10、5至9或6至8的溶液中)具有净正电荷并且优选能够通过静电相互作用结合核酸或带负电荷的小分子的多肽。这类载体包括、但不限于鱼精蛋白、组蛋白或组蛋白亚基。优选地，此类带正电荷的多肽具有至少2+，优选至少3+，优选至少4+，优选至少5+，优选至少6+，优选至少7+，优选至少8+，优选至少9+，优选至少10+，优选至少11+，优选至少12+，优选至少13+，优选至少14+，优选至少15+，优选至少16+，优选至少17+，优选至少18+，优选至少19+，优选至少20+的净电荷。术语“带正电荷的多肽”可以包括游离(即未缀合的)多肽以及缀合的多肽，比如缀合至连接子的多肽。
根据本公开的优选的带正电荷的多肽包含鱼精蛋白。鱼精蛋白是指小的强碱性蛋白质，其带正电荷的氨基酸基团(尤其是精氨酸)通常成组排列，并且由于它们的聚阳离子性质中和核酸的负电荷。本文所用的术语“鱼精蛋白”意指包括从天然或生物来源获得或衍生的任何鱼精蛋白氨基酸序列，所述生物来源包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。鱼精蛋白可以是天然来源的或通过重组方法产生。使用重组方法允许产生多拷贝的鱼精蛋白，或者可以在鱼精蛋白的分子大小上和氨基酸序列中对其进行修饰。相应的化合物也可以化学合成。当合成人工鱼精蛋白时，所用的方法可以包括，例如，用其它合适的氨基酸替换天然鱼精蛋白中具有转运功能(例如，DNA的缩合)所不需要的功能的氨基酸残基。通常，根据本公开的鱼精蛋白可以是任何物种或衍生自任何物种。本公开的鱼精蛋白可以来自哺乳动物、鸟、两栖动物、爬行动物或鱼。本公开的鱼精蛋白可以是选自如下的任何物种或衍生自选自如下的任何物种：人、狗、猫、小鼠、大鼠、马、牛(cattle)、猪、山羊、鸡、绵羊、驴、兔、羊驼、美洲驼、鹅、牛(ox)、火鸡、鲑鱼等，优选人或鲑鱼。本公开的鱼精蛋白还可以是不同鱼精蛋白的混合物。优选的鱼精蛋白包括鲑鱼鱼精蛋白。优选的鱼精蛋白包括人鱼精蛋白。优选的鱼精蛋白包含与SEQ ID NO:53所示的鲑鱼鱼精蛋白具有至少约80％，优选至少约85％，优选至少约90％，优选至少约95％的序列同一性的序列或优选由其组成。优选的鱼精蛋白包括SEQ ID NO：53所示的鲑鱼鱼精蛋白或优选地由其组成。优选的鱼精蛋白包含与SEQ ID NO:55所示的人鱼精蛋白1具有至少约80％，优选至少约85％，优选至少约90％，优选至少约95％的序列同一性的序列或优选由其组成。优选的鱼精蛋白包含如SEQID NO:55所示的人鱼精蛋白1或优选地由其组成。
如上所述，鱼精蛋白是一种强的带正电荷的蛋白质，其也与带负电荷的核酸(如siRNA)立即相互作用。不希望受理论的束缚，认为复合物向细胞中的摄取是通过受体介导的内吞作用介导的。进一步认为抗体结合到受体上，纳米颗粒通过内吞作用被内化在成笼蛋白有被小窝中。还认为囊泡被转运到细胞中，在细胞中siRNA从纳米颗粒中释放并可以进入RNAi通路。
根据本公开的进一步优选的带正电荷的多肽包含组蛋白或组蛋白亚基。组蛋白是指存在于染色质中的小DNA结合蛋白，其具有高比例的带正电荷的氨基酸(赖氨酸和精氨酸)的高原部分，这使得它们能够独立于核苷酸序列而结合DNA并将其折叠为核小体。本文所用的术语“组蛋白”意指包含从天然或生物来源获得或衍生的任何组蛋白氨基酸序列，所述生物来源包括组蛋白亚基、其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。组蛋白H2、H3和H4是特别合适的。通常，根据本公开的组蛋白可以是任何物种或衍生自任何物种。本公开的组蛋白可以来自哺乳动物、鸟、两栖动物、爬行动物或鱼。本公开的组蛋白可以是选自如下的任何物种的或衍生自选自如下的任何物种：人、狗、猫、小鼠、大鼠、马、牛(cattle)、猪、山羊、鸡、绵羊、驴、兔、羊驼、美洲驼、鹅、牛(ox)、火鸡、鲑鱼等，优选地为人。本公开的组蛋白还可以是不同组蛋白或组蛋白亚基的混合物。优选的组蛋白包括人组蛋白。优选的组蛋白包含与SEQ ID NO：56所示的人组蛋白H2具有至少约80％，优选至少约85％，优选至少约90％，优选至少约95％，优选至少约98％，优选至少约99％的序列同一性的序列或优选地由其组成。优选的组蛋白包含或如SEQ ID NO：56所示的人组蛋白H2或优选地由其组成。优选的组蛋白包含与SEQ ID NO：57所示的人组蛋白H2衍生肽具有至少约80％，优选至少约85％，优选至少约90％，优选至少约95％的序列同一性的序列或优选地由其组成。优选的组蛋白包含SEQ ID NO：57所示的人组蛋白H2衍生肽或优选地由其组成。优选的组蛋白包含与SEQ ID NO：58所示的人组蛋白H2衍生肽具有至少约80％，优选至少约85％，优选至少约90％，优选至少约95％的序列同一性的序列或优选地由其由其组成。优选的组蛋白包含SEQID NO：58所示的人组蛋白H2衍生肽或优选地由其组成。
如本文所用，“连接子”可指含有至少两个游离(即，未缀合)形式的官能团的交联剂或交联试剂。在一个实施方案中，本发明的方法包括具有官能团的同-或异-双官能的交联剂，包括但不限于碳二亚胺、羰基、亚氨酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯、磺基-NHS-酯、PFP-酯、羟甲基膦、芳基叠氮化物、吡啶基二硫化物、乙烯基砜。它们产生的键包括、但不限于酰胺键、二硫键、肼键、硫醚键和酯键。可被连接子或交联剂靶向以进行交联的官能团包括伯胺、巯基、羰基、羟基、碳水化合物、羧基等，优选胺和巯基，最优选地为巯基。优选地，连接子不包含可切割的二硫键(S-S)。在一个实施方案中，所述连接子包含pH依赖性的可切割侧。连接子可以是水溶性的、细胞膜可渗透的、具有各种间隔臂长的、自发反应性的或包含光反应性基团。此外，连接子可以被标记或示踪。
在一个实施方案中，连接子可与抗体和带正电荷的多肽直接缀合，该种连接子的一个实例是磺基-SMCC连接子。交联剂的实例包括、但不限于N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、磺基琥珀酰亚胺基(全氟-叠氮苯甲酰胺基)乙基-1，3'-二硫代丙酸酯(磺基-SFAD)、琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸酯丙酮腙(SANH)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、2-亚氨基硫烷(Traut's试剂)、N-琥珀酰亚胺基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和3[2-吡啶基二硫代]丙酰肼(PDPH)或本领域技术人员可以获取的且公知的任何其它连接子。
“异官能”连接子是指其中目标官能团彼此不同的连接子。在一个实施方案中，所述连接子包含胺和巯基，或胺和羟基作为被靶向用于交联的官能团，优选地为胺和巯基。在另一个实施方案中，本发明的方法包括含有作为被靶向用于交联的官能团的胺和巯基的连接子。在又一个实施方案中，本发明的方法包括异双官能连接子，其不包含切割位点，例如不具有可切割二硫键(S-S)。优选的异官能连接子是例如α-马来酰亚胺基乙酰氧基-琥珀酰亚胺酯(AMAS)，N(4-[对-叠氮水杨酰胺基]丁基)-3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP*)、(β-马来酰亚胺基丙酸)酰肼·TFA(BMPH)、(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、ε-马来酰亚胺基己酸(EMCA)、(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、κ-马来酰亚胺基十一酸(KMUA)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、琥珀酰亚胺基-6-(3'-[2-吡啶基-二硫代]丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚胺基-3-(溴代乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基碘醋酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基4-(ρ-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、NHS-PEG24-马来酰亚胺SM(PEG24)、NHS-PEG12-马来酰亚胺(SM[PEG]12)、NHS-PEG8-马来酰亚胺(SM[PEG]8)、NHS-PEG6-马来酰亚胺(SM(PEG)6)、NHS-PEG4-马来酰亚胺(SM[PEG]4)、NHS-PEG2-马来酰亚胺(SM[PEG]2)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基碘醋酸酯(SIA)(SIA)、琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)、-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、-(κ-马来酰亚胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)、磺基琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-[2-吡啶基二硫代]-甲苯胺)己酸酯(磺基-LC-SMPT)、磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP)、马来酰亚胺苯甲酰基-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-羧酸酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、磺基-NHS-(2-6-[生物素酰氨基]-2-(p-叠氮苯甲酰氨)(磺基-SBED)。在本发明的方法中优选异双官能连接子。
在一些实施方案中，本发明的方法包括为磺基-SMCC的异双官能连接子。
如本文所用的“未缀合的双官能连接子”是指双官能连接子，其中两个官能团都未缀合。在一些实施方案中，未缀合的双官能连接子不与带正电荷的多肽缀合。在一些实施方案中，未缀合的双官能连接子不与抗体缀合。
如本文所用，术语“基本上不含未缀合的双官能连接子”意指，尽管优选在组合物中不存在未缀合的双官能连接子，但在根据本公开的组合物中可以具有非常少量的未缀合的双官能连接子，优选地条件是这些量不会实质上影响此类组合物的有利利用。在一些实施方案中，包含基本上不含未缀合的连接子的第一缀合物的组合物包含比未缀合的连接子分子多至少约10倍的第一缀合物分子。因此，基本上不含未缀合连接子的第一缀合物优选具有约10:1或更大，优选约20:1或更大，优选约50:1或更大，优选约100:1或更大，优选约200:1或更大，优选约500:1或更大，优选约1000:1或更大，优选约2000:1或更大，优选约5000:1或更大，优选约10000:1或更大的第一缀合物与未缀合连接子的摩尔比。在一些实施方案中，将最初包含第一缀合物和未缀合的双官能连接子，已经经历能够完全或部分移除未缀合的双官能连接子的纯化步骤(例如脱盐步骤)的组合物看作是基本上不含未缀合的双官能连接子的组合物。
术语“抗体”的定义包括例如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体和人抗体的实施方案。除了全长抗体之外，该定义还包括抗体衍生物和抗体片段，尤其是Fab片段。抗体片段或衍生物还包含F(ab')2、Fv、scFv片段或单结构域抗体，比如结构域抗体或纳米抗体、单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，其仅包含一个可以是VHH、VH或VL的可变结构域，其独立于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位。所述术语还包括双抗体或双亲和重-靶向(DART)抗体。进一步设想的是(双特异性)单链双抗体、串联双抗体(Tandab)，示例结构如下的“微抗体”：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2、FcDART“和IgG DART”多体(如三体)。免疫球蛋白单可变结构域不仅涵盖分离的抗体单可变结构域多肽，而且涵盖包含抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体的更大的多肽。
此外，本文所用的术语“抗体”还涉及本文所述抗体的衍生物或变体，所述衍生物或变体显示与所述抗体相同的特异性。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体和具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260)。
术语“抗体”还包括不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(比如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白。同样落入本发明意义中的术语抗体的定义内的抗体衍生物包括这些分子的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、法呢酰化、羟基化、甲基化或酯化。
抗体的功能片段包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv的结构域或包含单免疫球蛋白可变结构域或单结构域抗体多肽(如单重链可变结构域或单轻链可变结构域)的构建体，以及如上文所述的其它抗体片段。F(ab')2或Fab可经工程化以最小化或完全移除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用。
本文所用的术语“人”抗体应理解为意指抗体或其功能片段包含人种系抗体库中所含的氨基酸序列。对于本文定义的目的，如果抗体或其片段由此类人种系氨基酸序列组成，即如果所讨论的抗体或其功能片段的氨基酸序列与表达的人种系氨基酸序列相同，则该抗体或其片段由此被认为是人的。如果抗体或其功能片段由这样的序列组成，则其也可以被认为是人的，该种序列与其(它们)最接近的人种系序列偏离不超过由于体细胞高突变的印记而预期的序列。另外，许多非人哺乳动物，例如啮齿类动物(如小鼠和大鼠)的抗体包含VH CDR3氨基酸序列，预期其也存在于表达的人抗体库中。对于本发明的目的，预期存在于表达的人库的人或非人来源的任何此类序列也被认为是“人”。因此，术语“人抗体”包括具有基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，包括例如Kabat等(Kabat等，(1991)'Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.',National Institutes of Health)中描述的那些。
本公开的人抗体可以例如在CDR中，特别是在CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个位置被替换为不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。
优选地，非人和人抗体或其功能片段是单克隆的。制备单克隆的人抗体是特别困难的。相对于鼠B细胞与永生化细胞系的融合，人B细胞与永生化细胞系的融合是不可行的。因此，人单克隆抗体是克服抗体技术领域中普遍公认存在的显著技术障碍的结果。抗体的单克隆性质使它们特别适合用作治疗剂，因为此类抗体将作为单一的、均质的分子种类存在，其可以被良好表征并且可重复地制备和纯化。这些因素导致可以高精确度预测产品的生物活性，而这对于使这些分子获得对人治疗性施用的监管批准是非常重要的。如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，所述基本上同质的抗体群即除了可能以微量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(如，异构化、酰胺化)，构成该群的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养合成的，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等，Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。也可以例如采用Clackson等，Nature,352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术自噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
特别优选的是，单克隆抗体或相应的功能片段是人抗体或相应的功能片段。在考虑用于对人治疗性施用的抗体药剂时，抗体是人来源的是高度有利的。在对人患者施用后，人抗体或其功能片段将极有可能不引起患者免疫系统的强免疫原性应答，即，将不被识别为是非人蛋白质的外来物。这意味着不会产生针对治疗性抗体的宿主(即患者)抗体，否则所述宿主(患者)抗体会阻断治疗性抗体的活性和/或加速治疗性抗体从患者体内消除，从而阻止治疗性抗体发挥其期望的治疗效果。
根据本发明的另一实施方案，所述抗体可以是免疫球蛋白。根据本发明的又一实施方案，所述抗体可以是IgG抗体。IgG同种型不仅包含负责高度区别性抗原识别和结合的重链和轻链的可变抗体区，而且包含通常存在于“天然”产生的抗体中的重链和轻链抗体多肽链的恒定区，并且在一些情况下，甚至包含用碳水化合物在一个或多个位点的修饰。这种糖基化通常是IgG形式的标志，并且位于恒定区，该恒定区包含已知在体内引发各种效应子功能的完整抗体的Fc区。此外，例如，Fc区介导IgG与Fc受体的结合，以及促进IgG返回(homing)至具有增加的Fc受体存在-炎症组织的位置。有利地，IgG抗体是IgG1抗体或IgG4抗体，由于这两种形式的体内作用机制是得到充分理解和表征的，因此它们是优选的。IgG1抗体尤其如此。
根据本发明的另一实施方案，抗体的功能片段优选是scFv、单结构域抗体、Fv、VHH抗体、双抗体、串联双抗体、Fab、Fab'或F(ab)2。这些形式通常可分为两个亚类，即由单一多肽链组成的那些，和包含至少两个多肽链的那些。前一亚类的成员包括scFv(包含通过多肽连接子连接成单一多肽链的一个VH区和一个VL区)；单结构域抗体(包含单一抗体可变区)，比如VHH抗体(包含单一VH区)。后一亚类的成员包括Fv(包含彼此非共价连接的作为分开的多肽链的一个VH区和一个VL区)；双抗体(包含两条非共价连接的多肽链，每条多肽链包含两个抗体可变区-每条多肽链通常为一个VH和一个VL-这两条多肽链以头-尾构象排列以便产生二价抗体分子)；串联双抗体(双特异性单链Fv抗体，其包含具有两种不同特异性的四个共价连接的免疫球蛋白可变-VH和VL-区，形成与上述双抗体相比两倍大的同型二聚体)；Fab(包含作为一条多肽链的完整抗体轻链，其自身包含VL区和完整轻链恒定区，以及作为另一条多肽链的包含完整VH区和部分重链恒定区的抗体重链的一部分，所述两条多肽链经由链间二硫键在分子间连接)；Fab'(如上所述的Fab，除了抗体重链上包含的另外的还原二硫键)；和F(ab)2(包含两个Fab'分子，每个Fab'分子通过链间二硫键与各自的另一个Fab'分子连接)。通常，上文所述类型的功能抗体片段允许在定制例如针对手头的特定紧急情况的治疗性施用所需的抗体的药代动力学性质方面具有很大的灵活性。例如，当治疗已知血管化不良的组织(例如，关节)时，可能需要减小所施用的抗体的大小以便增加组织渗透的程度。在一些情况下，也可能需要增加治疗性抗体从体内消除的速率，所述速率通常可通过减小所施用抗体的大小来加速。在本发明的上下文中，只要片段保持了亲本抗体的表位/靶标的特异性结合特征，例如只要片段特异性结合CD33、EGFR、IGF1R或CD20，则将抗体片段定义为功能抗体片段，或将抗体片段定义为在抗体结合时具有内化的能力的靶向其它细胞表面结构的抗体。
根据本发明的另一实施方案，所述抗体可包含CL结构域。根据本发明的又一实施方案，所述抗体可包含CH1结构域。根据本发明的再一实施方案，所述抗体可包含CH2结构域。根据本发明的另一实施方案，所述抗体可包含CH3结构域。根据本发明的另一实施方案，所述抗体可以包含完整的轻链。根据本发明的又一实施方案，所述抗体可以包含完整的重链。
根据本发明的另一实施方案，所述抗体或其功能片段可以单价单特异性；多价单特异性，特别是二价单特异性；或多价多特异性，特别是二价双特异性形式存在。通常，多价单特异性，特别是二价单特异性抗体，例如上文所述的完整人IgG，可以带来治疗优势，即通过亲合力效应，即通过相同抗体与相同抗原的多个分子，本文例如CD33、EGFR、IGF1R或CD20的结合，来强化由这种抗体实现的中和。上文描述了一些单价单特异性形式的抗体片段(例如，scFv、Fv、VHH或单结构域抗体)。
抗体或其功能片段可以例如用有机聚合物，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)分子衍生化。如本领域已知的，这种衍生化在调节抗体或其功能片段的药效学特性中可以是有利的。特别优选的是衍生为PEG-马来酰亚胺的PEG分子，其能够经由半胱氨酸氨基酸的巯基以位点特异性方式与抗体或其功能片段缀合。其中，特别优选的是20kD和/或40kD的支链或直链形式的PEG-马来酰亚胺。特别有利的是通过将较小的人抗体片段(如scFv片段)与一个或多个PEG分子(尤其是PEG-马来酰亚胺)偶联来提高所述较小的人抗体片段的有效分子量。
本公开的抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中的重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或与其同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或与其同源，以及包括此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文所关注的嵌合抗体包括“远古的(primitized)”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是主要为人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中来自受体的高变区(也称为CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体，比如如小鼠、大鼠或兔)的高变区的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，如本文所用的“人源化抗体”还可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体最好还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节，参见Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等，Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
优选的抗体是结合细胞表面分子，优选结合细胞表面结构域，优选以受体依赖性方式内化的那些抗体，例如抗-CD33抗体、抗-EGFR抗体、抗-IGF1R抗体或抗-CD20抗体。优选的抗体选自西妥昔单抗、吉妥单抗、西妥木单抗、替妥木单抗、GR11L和利妥昔单抗。结合细胞表面结构域并以受体依赖性方式内化的其它抗体公开于LU 92353A中，其通过引用并入本文。
优选的抗体包含含有以下三个重链CDR的VH结构域和含有以下三个轻链CDR的VL结构域：具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:1)的CDR-H1，具有序列IWSGGNT(SEQ ID NO:2)的CDR-H2，具有序列ARALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:3)的CDR-H3，具有序列QSIGTN(SEQ ID NO:4)的CDR-L1，具有序列YAS的CDR-L2，和具有序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO:5)的CDR-L3。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:6所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:7所示序列的VL结构域。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:8所示序列的重链和具有SEQ ID NO:9所示序列的轻链。
优选的抗体包含含有以下三个重链CDR的VH结构域和含有以下三个轻链CDR的VL结构域：具有序列GYTITDSN(SEQ ID NO:10)的CDR-H1、具有序列IYPYNGGT(SEQ ID NO:11)的CDR-H2、具有序列VNGNPWLAY(SEQ ID NO:12)的CDR-H3、具有序列ESLDNYGIRF(SEQ IDNO:13)的CDR-L1、具有序列AAS的CDR-L2和具有序列QQTKEVPWS(SEQ ID NO:14)的CDR-L3。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:15所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:16所示序列的VL结构域。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:17所示序列的重链和具有SEQ ID NO:18所示序列的轻链。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:65所示序列的重链和具有SEQ ID NO:18所示序列的轻链。
优选的抗体包含含有以下三个重链CDR的VH结构域和含有以下三个轻链CDR的VL结构域：具有序列GGTFSSYAIS(SEQ ID NO:19)的CDR-H1、具有序列GIIPIFGTANYAQKFQ(SEQID NO:20)的CDR-H2、具有序列APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV(SEQ ID NO:21)的CDR-H3、具有序列QGDSLRSYYAT(SEQ ID NO:22)的CDR-L1、具有序列GENKRPS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2和具有序列KSRDGSGQHLV(SEQ ID NO:24)的CDR-L3。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:25所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:26所示序列的VL结构域。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:27所示序列的重链和具有SEQ ID NO:28所示序列的轻链。
优选的抗体包含含有以下三个重链CDR的VH结构域和含有以下三个轻链CDR的VL结构域：具有GFTFSSYG(SEQ ID NO:29)序列的CDR-H1，具有IWFDGSST(SEQ ID NO:30)序列的CDR-H2，具有ARELGRRYFDL(SEQ ID NO:31)序列的CDR-H3，具有QSVSSY(SEQ ID NO:32)序列的CDR-L1，具有IWFDGSST(SEQ ID NO:33)序列的CDR-L2，和具有QQRSKWPPWT(SEQ ID NO:34)序列的CDR-L3。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:35所示序列的VH结构域和具有SEQ IDNO:36所示序列的VL结构域。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:37所示序列的重链和具有SEQID NO:38所示序列的轻链。
优选的抗体包含含有以下三个重链CDR的VH结构域和含有以下三个轻链CDR的VL结构域：具有序列GYTFTSYN(SEQ ID NO:39)的CDR-H1、具有序列IYPGNGDT(SEQ ID NO:40)的CDR-H2、具有序列CARSTYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:41)的CDR-H3、具有序列SSVSYI(SEQ IDNO:42)的CDR-L1、具有序列ATS的CDR-L2和具有序列QQWTSNPPT(SEQ ID NO:43)的CDR-L3。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:44所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:45所示序列的VL结构域。优选的抗体包含具有SEQ ID NO:46所示序列的重链和具有SEQ ID NO:47所示序列的轻链。
本文所用的“细胞表面结构域”意指细胞表面上的任何蛋白质。细胞表面结构域还包括细胞表面抗原。它还包括任何可以在细胞表面上识别的表位。优选地，表位或蛋白质是细胞类型特异性的，因为其仅存在于某些细胞类型中。在一个实施方案中，细胞表面结构域存在于癌细胞上。潜在的细胞表面靶标包括CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD40、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD138、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、MUC16、GPNMB、PSMA、Cripto、ED-B、TMEFF2、EphB2、EphA2、FAP Av、整联蛋白、间皮素、EGFR、TAG-72、GD2、CAIX和/或5T4。其它潜在的细胞表面结构域包括CD52、CD3、CD117、CD99、CD34、CD44、CD117、CA15-3、CA-125、CA27-29、EpCAM、癌胚抗原、T细胞1识别的黑素瘤抗原(MART1)、滋养层糖蛋白(TPBG)。根据本发明的细胞表面分子是这样一种分子，其优选在易受带负电荷分子治疗的细胞上表达。
优选地，此类细胞表面结构域是CD33、EGFR、IGF1R、CD20。细胞表面结构域还可以提供根据本发明的抗体可以结合的表位。
与上述一致，术语“表位”定义一种抗原决定簇，其被本文定义的抗体特异性结合/识别。抗体可以特异性结合构象或连续表位或与之相互作用，所述构象或连续表位对于靶结构是独特的。
在优选的实施方案中，本公开的抗体对癌症相关抗原是特异性的。如本文所用，可在本文中互换使用的“癌症相关抗原”或“肿瘤相关抗原”通常指与癌症或肿瘤细胞相关的任何抗原，即与正常细胞相比以相同或更大的程度存在。这些抗原可以是相对肿瘤特异性的，并且它们在恶性细胞表面上的表达是有限的，但是也可以在非恶性细胞中发现这些抗原。在一个实施方案中，本公开的抗体结合癌症相关抗原。
本发明中使用的术语“内化”意指内吞作用，其中诸如蛋白质的分子被细胞膜吞没并被吸入细胞。特别地，结合结构域结合的细胞表面结构域被内化。在本申请的实施例中公开了如何测量这种内化的方法。另外，例如，这种过程可以通过时间推移显微镜观察，其中目标受体和细胞膜被双重染色。优选地，包含能够结合细胞表面分子的抗体的纳米颗粒在结合细胞表面分子后被内化。
如本文所用的“第二缀合物(B)”是指包含本文公开的抗体、本文公开的带正电荷的多肽和优选本文公开的双官能连接子或优选由它们组成的缀合物。在本文中，优选地，通过双官能连接子将带正电荷的多肽和抗体相互连接。
术语“带负电荷的分子”是指这样一种分子，该分子在生理pH或接近生理pH(例如，在pH为4至10、5至9或6至8的溶液中)下具有净正电荷的分子，并且优选能够通过静电相互作用结合带正电的多肽(例如鱼精蛋白或组蛋白)。优选的带负电荷的分子是核酸和带负电荷的小分子。优选地，此类带负电荷的分子具有至少2-，优选至少3-，优选至少4-，优选至少5-，优选至少6-，优选至少7-，优选至少8-，优选至少9-，或优选至少10-的净电荷。
当在本文中提及术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸”“核酸分子”时，它们可互换使用，并指任何长度的聚合的无支链形式的核苷酸，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。如本领域技术人员容易理解的，核酸序列包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA(如mRNA、siRNA)、合成形式和混合的聚合物，有义链和反义链，或可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此外，这些核酸的非限制性实例包括但不限于任何类型的RNA干扰(RNAi)，所述RNAi为单链或双链，并进行基因终止和/或基因敲低，包括通过mRNA的降解或翻译停滞的信使(mRNA)的基因敲底、tRNA和rRNA功能或表观遗传效应的抑制；短(或小)干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、核糖核酸内切酶制备的siRNA(esiRNA)、反义寡核苷酸、微小RNA和非编码RNA等、DNA上的短RNA活性和Dicer-底物siRNA。优选的核酸是siRNA、esiRNA反义寡核苷酸或miRNA，其中siRNA是最优选的。在一些实施方案中，优选地如果核酸是双链的，则核酸具有约18至约25bp。在一些实施方案中，优选地如果核酸是单链的，则核酸具有约18至约25nt。
本发明所用的核酸作用于靶细胞。例如，通过提供核酸分子，使靶细胞中特定分子或蛋白质的表达降低或增加。优选地，通过利用核酸分子降低特定分子蛋白质的表达。
根据本公开内容的核酸包括siRNA分子，将其设计为靶向和抑制或阻断与癌症相关的或参与癌症的发展和/或进展的基因或蛋白的表达。
优选的核酸分子选自siRNA、esiRNA、反义寡核苷酸或miRNA，优选地它们对KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3具有特异性。甚至更优选的是对KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3特异的siRNA。这种siRNA是技术人员已知的，这种siRNA的说明性实例示于下表中。
靶标 siRNA序列
KRAS UUC UGC UUG UGA CAU UAA AAA(SEQ ID NO:59)
PIK3CA AAA CUU GGC UGA AGU UUA AAA(SEQ ID NO:60)
PAX3-FKHR UGA AUU CUG AGG UGA GAG GCTT(SEQ ID NO:61)
EWS-FLI1 GGC AGC AGA ACC CUU CUU AUU(SEQ ID NO:62)
c-MYC ACA CAA ACU UGA ACA GCU ATT(SEQ ID NO:63)
TP53 GAA AUG UUC UUG CAG UUA ATT(SEQ ID NO:64)
本公开优选的核酸还包括针对一种或多种靶，优选地针对一种靶的不同siRNA的混合物。例如，本公开的核酸可以包含对选自如下的靶标特异性的siRNA的混合物：KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1和FLT3。
根据本发明的带负电荷的分子还可以是非核酸的分子。此类分子可以是小分子，或优选地，小有机分子。带负电荷的分子可以具有约20kDa或更低，优选约15kDa或更低，或约10kDa或更低的分子量。带负电荷的分子还可以具有约9kDa或更低、约8kDa或更低、约7kDa或更低、约6kDa或更低、约5kDa或更低、约4kDa或更低、约3kDa或更低、或约2kDa或更低的分子量。作为说明性实例，带负电荷的分子可以是药物和/或前药。药物和/或前药可以与带负电荷的部分缀合。例如，药物可以是与带负电荷的部分(如Cy 3.5或Alexa488)缀合的依鲁替尼。然而，药物也可与另一带负电荷的部分缀合。用于缀合的合适的带负电荷的部分是技术人员已知的。合适的带负电荷的部分的说明性实例包括(聚)磺化芳基(例如作为过渡金属的共配体)、(聚)磺化染料(例如犬(dicycanine)染料)、单/二/三磷酸酯、单糖或支链寡糖的(聚)硫酸酯、来自谷氨酸或天冬氨酸的寡肽。药物和/或前药可以不与任何另外的部分缀合而具有负净电荷。作为一个说明性的实例，具有负净电荷的药物是三磷酸瑞德西韦。本领域技术人员将理解，上述实施仅用于说明目的，并且可以将许多其他带负电荷的分子用于本发明的上下文中。
如本文所用，“依鲁替尼”(IUPAC名称：1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，CAS号：936563-96-1)涉及具有(以其游离形式)以下结构的分子。
本文所用的“三磷酸瑞德西韦”(IUPAC名称[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲氧基-羟基磷酰基]膦酰基磷酸氢盐，CAS号：1355149-45-9)涉及具有以下结构的分子。
本申请还涉及纳米颗粒。优选地，这样的纳米颗粒可通过本文所述的方法获得。本发明的纳米颗粒可以包含(a)带正电荷的多肽，优选如本文所公开的带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含优选通过双官能连接子缀合至带正电荷的多肽的抗体；和(c)一种或多种带负电荷的分子，优选如本文所公开的带负电荷的分子。
不希望受理论的束缚，认为带正电荷的多肽、第二缀合物和一种或多种带负电荷荷的分子不均匀地分布在颗粒内。另外，在一些实施方案中，第二缀合物富集在纳米颗粒的外部部分中。在一些实施方案中，所述一种或多种带负电荷的分子富集在纳米颗粒的内部部分。在一些实施方案中，带正电荷的多肽富集在纳米颗粒的外部部分中。在一些实施方案中，带正电荷的多肽富集在纳米颗粒的内部部分中。因此，本发明的纳米颗粒可以形成囊泡样结构，其中第二缀合物主要存在于外部部分中，而带负电荷的分子富集或包封在纳米颗粒的内部部分中。不希望受理论的束缚，认为这种结构保护带负电荷的分子，从而增加它们的稳定性。还认为，至少部分或甚至全部纳米颗粒在经由第二缀合物结合至细胞时可被内化。
在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有为至少约0.05μm的平均直径。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有为至少约0.1μm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径为至少约0.2μm。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有约0.05μm至约10μm，优选约0.1μm至约10μm，优选约0.2μm至约5μm的平均直径。本公开的纳米颗粒的平均直径也可以在约0.3μm至约4μm、约0.4μm至约3μm、或约0.5μm至约2μm的范围内。可以通过任何适于测定粒度的方法，包括动态光散射和显微镜分析来测定纳米颗粒的平均直径。测定粒度的优选方法是通过显微镜分析，优选通过透射光学显微镜。
本发明还涉及包含本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒的组合物。
本发明进一步涉及包含本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒的药物组合物。
在本公开的组合物(包括本公开的药物组合物)中，包含在组合物中的第二缀合物的至少约10％可以包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，包含在组合物中的第二缀合物的至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，组合物基本上不含未包含在纳米颗粒中的第二缀合物。
在本公开的组合物(包括本公开的药物组合物)中，包含在组合物中的带正电荷的多肽的至少约10％可以包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，包含在组合物中的带正电荷的多肽的至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，组合物基本上不含未包含在纳米颗粒中的带正电荷的多肽。
在本公开的组合物(包括本公开的药物组合物)中，包含在组合物中的带负电荷的分子的至少约10％可以包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，包含在组合物中的带负电荷的分子的至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％包含在纳米颗粒中。在优选的实施方案中，组合物基本上不含未包含在纳米颗粒中的带负电荷的分子。
术语“药物组合物”涉及用于向患者、优选向人类患者施用的组合物。药物组合物或制剂通常是这样的形式，该种形式允许活性成分的生物活性是有效的，并且因此可以如本文所述施用于受试者用于治疗用途。通常，药物组合物包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适(即药学上可接受的)制剂。合适的药物载体的实例由E.W.Martin描述于"Remington'sPharmaceutical Sciences"中。这样的组合物含有治疗有效量的上述分子(优选以纯化的形式)，以及适量的载体，以便提供用于向患者适当施用的形式。制剂应适合施用的方式。
在一个实施方案中，药物组合物是用于胃肠外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或用于直接注射到组织中的组合物。特别设想的是，所述组合物通过输注或注射施用于患者。合适的组合物的施用可以通过不同的方式实现，所述不同的方式例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或皮内施用。本发明的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，包括缓冲盐水溶液、水、诸如油/水乳液的乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。可以通过熟知的常规方法配制包含这些载体的组合物。
根据本发明的实施方案，术语“治疗有效量”是指本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子的量，该量对于治疗与癌症相关的疾病是有效的。优选的施用剂量和优选的施用方法是施用后，本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子在血液中以有效剂量存在。可以通过观察疾病状况并分析实验室测试中降低靶分子表达的分子的血清水平，然后延长施用间隔(例如从每周两次或每周一次延长至每两周一次、每三周一次、每四周一次等)，或者可选地相应地缩短施用间隔来调整施用方案。在癌症的情况下，本文公开的分子或组合物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即，减缓和/或停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，减缓和/或停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长；和/或减轻与癌症相关的一种或多种症状。
在另一实施方案中，药物组合物适于与另外的药物组合施用，即将药物组合物作为共联合疗法的一部分。在所述联合疗法中，任选地，活性剂可以与本发明分子包含在相同的药物组合物中，或者可以包含在单独的药物组合物中。在后一种情况下，所述单独的药物组合物适于在施用包含本发明的分子的药物组合物之前、同时或之后施用。所述另外的药物或药物组合物可以是非蛋白质的化合物或蛋白质的化合物。在另外的药物是蛋白质的化合物的情况下，有利的是该蛋白质的化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号。优选地，所述蛋白质的化合物或非蛋白质的化合物可以与如上文定义的本发明的分子(或制剂)、如上文定义的载体或如上文定义的宿主同时或非同时施用。
可以以合适的剂量将药物组合物施用至受试者。剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域所熟知的，任一患者的剂量取决于许多因素，这些因素包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(比如基于林格氏葡萄糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，比如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。此外，根据本发明的药物组合物可以包含蛋白质的载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，所述蛋白质的载体优选为人源的。根据药物组合物的预期用途，设想除了上述分子之外，根据本发明的药物组合物可以包含另外的生物活性药剂。这些药剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统和/或本领域已知的诸如细胞因子的药剂。
为了分析本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒例如在癌症治疗中的效果，可以从例如药代动力学、免疫原性和通过例如MRI成像减小癌症尺寸的潜力以及患者报告的结果中选择结果量度。
在如本发明的药物组合物的药物开发中的另一个主要挑战是药代动力学性质的可预测的调节。为此，建立了候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病症的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括、但不限于：半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药剂的功效可受上述各参数的影响。“半衰期”意指通过例如代谢、排泄等的生物学过程消除50％的施用药物所需的时间。“肝脏首过代谢”是指在首次与肝脏接触时，即在首次通过肝脏期间，药物代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体的各个区室，例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等中的保留程度，以及药物在这些区室中的分布。
“血清结合程度”意指药物与诸如白蛋白的血清蛋白相互作用并结合，导致药物的生物活性降低或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括对于给定量的施用药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收速率和/或Cmax。“生物利用度”意指在血液隔室中的药物的量。“滞后时间”意指药物的施用和其在血液或血浆中检测出和可测得之间的时间延搁。“Tmax”是指药物达到最大血液浓度所需要的时间，将吸收定义为药物从给药部位向体循环的运动，而“Cmax”是指由给定药物得到的最大血液浓度。药物达到其生物效应所需的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。
本文所用术语“毒性”是指表现为不良事件或严重不良事件的药物毒性作用。这些副作用事件可能是指对于药物缺乏整体耐受性和/或在给药后缺乏局部耐受性。毒性也可包括该药物所引起的致畸或致癌作用。
本文所用术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义在直接施药后(局部耐受性)以及用药后的一个较长时期内药物的施用不会诱导严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以在如治疗和后续追踪期间定期进行评价。测量包括临床评价，如器官的表现，以及实验室异常筛查。可以进行临床评价并依据NCI-CTC和/或MedDRA标准将相对于正常有偏差的结果记录/编码。器官的表现可包括如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血功能等的标准，如阐述于如不良事件的通用术语标准第3.0版(CTCAE)中。可以进行测试的实验室参数包括如血液学、临床化学、凝血功能情况及尿液分析，及检查其它体液如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、液体等。因此，可例如通过身体检查、成像技术(即超声、X光、CT扫描、核磁共振成像(MRI)、其它技术设备的测量(即心电图)、生命体征、通过实验室参数测量并记录不良事件而进行安全性评价。本文所用术语“有效且无毒剂量”是指本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子，优选地如本文定义的抗体的耐受剂量，所述剂量应当足够高从而治愈或稳定目标疾病，而不具有或基本不具有较大毒性作用。这一有效且无毒剂量可以通过如本领域描述的剂量递增研究测定，且该剂量应当低于诱导严重不良副作用的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。
本发明的药物组合物可以具有不同的制剂。优选地，所述制剂(本文有时也称为“物质的组合物”；“组合物”或“溶液”)可以处于各种物理状态，例如液体、冷冻的、冻干的、冷冻干燥的、喷雾干燥和重构制剂，其中液体和冷冻制剂是优选的。
本文所用的“液体制剂”是指发现作为液体的物质的组合物，特征为在它们中组成分子的自由移动但在室温下并没有分离的倾向。液体制剂包括水性及非水性液体，以水性制剂为优选的。水性制剂是其中的溶剂或主要溶剂为水、优选为注射用水(WFI)的制剂。本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子在制剂中的溶解可为匀相或非匀相，以如上述的匀相为优选的。
可使用任何合适的非水性液体，条件是其提供本发明制剂的稳定性。优选地，非水性液体是亲水的液体。合适的非水性液体的示例性实例包括：甘油；二甲基亚砜(DMSO)；聚二甲基硅氧烷(PMS)；乙二醇类，诸如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200、PEG 300和PEG 400；及丙二醇类，诸如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”)425和PPG725。
本文所用的“混合的水性/非水性液体制剂”是指包含水(优选WFI)和另外的液体组合物的混合物的液体制剂。
当用于本文时，“制剂”或“组合物”是本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子(即活性药物/物质)和另外的化学物质和/或药用产品中所需的添加剂的混合物，其优选为液体状态。本发明的制剂包括医药制剂。
制剂的制备包括这样的过程：在该种过程中，将不同化学物质(包括活性药物)组合以生产最终药物产品，诸如药物组合物。本发明制剂的活性药物是本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒。
在一些实施方案中，要配制的本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒实质上为纯的和/或实质上匀相的(即基本上不含污染性物质，例如蛋白质等，其可为产品相关和/或过程相关的杂质)。术语“基本上纯的”意为包括至少约80％、优选化合物重量的约90％、优选化合物重量的至少约95％、更优选化合物重量的至少约97％或最优选化合物重量的至少约98％的组合物。术语“实质上匀相的”意为包括化合物重量的至少约99％、化合物优选为单体状态的组合物，排除溶液中多种稳定剂与水的质量。
“稳定的”制剂是在制剂中本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子实质上在储存后维持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性和/或与对照样品相比未显示聚集、沉淀、裂解、降解和/或变性的实质迹象的制剂，优选是在视觉检查颜色和/或澄清度后，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析法测量。多种另外用于测量蛋白质稳定性的分析技术在本领域中可用且例如在下列中综述：Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。
本文所使用的“在储存期间”意为一旦制剂制备后并未立即使用；或者，在其制备后，将其包装用于储存，是为液体形式、冷冻状态或以后续重构为液体形式或其他形式的干燥形式
根据本发明，“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人受试者。
“脊椎动物”包括脊椎动物鱼、鸟、两栖动物、爬行动物和哺乳动物。
“哺乳动物”包括狗、猫、马、大鼠、小鼠、猿、兔、牛、猪、绵羊，优选人。对于人而言，其也可以用术语患者来指代。
本发明还涉及通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的纳米颗粒和/或本发明的药物组合物，其用在治疗中。在治疗中的应用优选地是在治疗受试者中的癌症的方法中的应用。
本发明所用的术语“癌症”和“癌性”意指脊椎动物、优选哺乳动物、更优选人中的病症，其特征通常在于不受调节的细胞生长。
癌症根据肿瘤细胞类似的细胞类型分类，因此推测癌症是肿瘤的起源。这些类型包括癌(carcinoma)、肉瘤、血癌、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。
当在本文提及时，“癌(carcinoma)”可以包括源自上皮细胞的癌症。
当在本文提及时，“肉瘤”可以包括由间充质(结缔组织)来源的细胞产生的癌症。
当在本文提及时，“血癌”可包括由造血(血形成)细胞产生的癌症类型，所述造血(血形成)细胞离开骨髓并倾向于分别在淋巴结和血液中成熟。当在本文中提及白血病时，可以包括在血流中正常成熟的骨髓衍生细胞。当在本文中提及淋巴瘤时，可以包括在淋巴系统中正常成熟的骨髓来源的细胞。
当在本文提及时，“生殖细胞肿瘤”可包括衍生自多能细胞，常存在于睾丸或卵巢中的癌症。
当在本文提及时，“胚细胞瘤”可以包括衍生自未成熟“前体”细胞或胚胎组织的癌症。
通过本发明的方法可获得的分子或本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子可用在治疗癌症的方法中，其中癌症可选自肺癌(如非小细胞肺癌)、肉瘤(如横纹肌肉瘤或尤文肉瘤)、结肠直肠癌、血癌(如白血病或淋巴瘤，如急性髓性白血病(AML)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBLC))。
如本文所用，术语“治疗”意指缓解、减少、稳定或抑制疾病或病症(如癌症)的进展。
本发明还涉及通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的纳米颗粒或本发明的药物组合物，其用在抑制和/或控制受试者中肿瘤生长的方法中。
“肿瘤”或“赘生物”是由于细胞异常生长或分裂而导致的异常组织块。肿瘤细胞的生长超过了它周围的正常组织，并且不与它周围的正常组织的生长协调。然而，在本发明意义上的肿瘤还包括白血病和原位癌。肿瘤可以是良性的、恶化前的或恶性的。在优选的实施方案中，肿瘤是恶化前的或恶性的。最优选地，肿瘤是恶性的。
本发明还涉及通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的纳米颗粒或本发明的(药物)组合物，其用于将核酸分子递送至受试者中的肿瘤部位。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的应用的通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的纳米颗粒或本发明的药物组合物包括选自如下的siRNA：KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1和FLT3 siRNA。本发明的siRNA可以靶向KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3。优选地，siRNA降低细胞的KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3的表达。优选地，降低了这些靶标的表达。
“siRNA靶标”意指被特定siRNA识别的靶标。可以以不同的方式构建siRNA。例如，siRNA可以靶向mRNA。
一般而言，siRNA的设计是本领域技术人员已知的。参见例如Reynolds等，(Reynolds等，(2004)“Rational siRNAdesign for RNAinterference”NatureBiotechnology 22,326 -330)或Judge等，(Judge等，2006)“Design of NoninflammatorySynthetic siRNAMediating Potent Gene Silencing in Vivo”Molecular Therapy(2006)13,494–505)或Sioud和Leirdal(Sioud and Leirdal(2004)“Potential designrules and enzymatic synthesis of siRNAs”Methods Mol Biol.2004；252:457-69)。
术语“表达”或“基因表达”是指一种或多种特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别是指一种或多种基因或基因构建体转录成结构RNA(rRNA，tRNA)或mRNA，随后将后者翻译或不将其翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。然后mRNA被翻译成肽/多肽链，这些肽/多肽链最终被折叠成最终的肽/多肽/蛋白质。蛋白质组学研究人员通常使用蛋白质表达来表示特定细胞或组织中一种或多种蛋白质的存在和丰度的测量。可以通过各种方法测定细胞的蛋白质表达。例如，采用免疫组织化学或蛋白质印迹分析。在本文中，应该与健康细胞或对照标准进行比较来评估所获得的结果。与对照细胞相比，低表达细胞显示的染色在如强度上降低。与相同环境中的对照细胞相比，高表达细胞显示的染色在如强度上增加。另外，可通过例如RT-PCR来测定mRNA的表达。在本文中，与相同环境中的对照细胞相比，低表达细胞显示例如更高数量的扩增循环以显现可检测信号。本领域技术人员已知确定细胞的蛋白质、mRNA表达的不同技术。
例如，所述细胞可存在于受试者的血液、肝脏、胃、口腔、皮肤、肺、淋巴系统、脾、膀胱、胰腺、骨髓、脑、肾、肠、胆囊、脑、喉或咽中。
在一个实施方案中，根据本发明使用通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的纳米颗粒或本发明的药物组合物，其中受试者是哺乳动物，优选地是人。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含一种或多种偶联缓冲液/试剂和适于实施本发明方法的规程。
在一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种偶联缓冲液/试剂和适于实施本发明方法的规程。
本发明涉及一种试剂盒，其包含缓冲液/试剂以及适于实施本发明方法的规程，以及任选地包含纯化或富集例如本发明的分子或通过本发明的方法获得的分子的手段和/或洗涤所述分子的手段和/或储存所述分子的手段。因此优选地，将所述分子和另外的手段一起包装在一个密封包装或试剂盒中。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明的纳米颗粒和/或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒。
本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的纳米颗粒和/或可通过本发明的方法可获得的纳米颗粒和/或任选地纯化或富集所述分子的手段和/或洗涤所述分子的手段和/或储存所述分子的手段。因此优选地，将所述分子和另外的手段一起包装在一个密封包装或试剂盒中。
本发明的试剂盒的各部分(或“各部分的试剂盒”)可以单独包装在小瓶或瓶中，或组合在容器或多容器单元中。试剂盒的制备优选按照本领域技术人员已知的标准方法进行。
本发明的试剂盒可以包括一个或多个容器，任选地所述容器具有标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可以由各种材料制成，例如玻璃或塑料，并且优选地所述容器是经消毒的。容器装有具有活性成分或包含对本发明方法有效的缓冲剂的组合物。另外的容器可以装有合适的缓冲液(例如反应缓冲液)，其允许发生特定的反应。还设想包括装有各种缓冲液的容器，所述缓冲液例如反应缓冲液和/或用于纯化本发明的分子和/或通过本发明的方法可获得的分子的缓冲液等。优选地，组合物中的活性剂是通过本发明的方法可获得的分子或本发明的分子或本发明的药物组合物。
试剂盒还可以包括用于根据本发明的方法和应用实施本发明的方法的书面说明书。所述试剂盒可以进一步包含指示内容物可以用于根据本发明的纳米颗粒和/或用于本发明的所述纳米颗粒的增加(augmentation)的标签或印记。
还设想本发明的试剂盒还包含例如缓冲液、小瓶、对照品、稳定剂、帮助技术人员制备或使用本发明的纳米颗粒的书面说明。
此外，本发明还涉及本发明的纳米颗粒或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的药物组合物在治疗中的用途，优选在受试者的癌症治疗中的用途。
本发明还涉及一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的纳米颗粒或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的药物组合物。
术语“施用”意指向受试者施用治疗或诊断有效剂量的本发明的上述纳米颗粒。不同的施用途径是可能的，并且如上所述。
本发明还涉及本发明的纳米颗粒或通过本发明的方法可获得的纳米颗粒或本发明的药物组合物用于制备药物的用途。例如，在癌症治疗中有效的药物。
除非另有说明，否则本文(包括说明书和权利要求书)中所使用的以下术语具有以下给出的定义。
本领域技术人员采用不超出常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案的等同情况。本发明旨在涵盖这些等同情况。
需要注意的是，除非本文另有明确说明，本文所用单数形式“一种”、“一个”和“该”包含复数指代。因而，例如，提到“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，及提到“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修饰或取代本文所述方法的等同步骤和方法。
除非另有说明，一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。
本文所用术语“和/或”包括“和”、“或”及“所述术语连接的要素的所有或任意其它组合”的含义。
本文所用术语“大约”或“接近”表示在给出值或范围的±20％内，优选在±10％内，更优选在±5％内。然而，其也包括具体的数值，如约20包括20。
在本文整个说明书及以下的权利要求书中，除非上下文另有所指，词语“包含(comprise)”及其变形如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任意其它整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”又可用术语“含有”或“包括”替代，或本文所用术语有时可用术语“具有”替代。
当在本文使用时，“由…组成”排除未在要求保护的要素中具体提到的任一要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由…组成”时不排除对权利要求的基本和新特征没有重大影响的材料或步骤。
在本文每个实例中任一术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”可用其它二词中任一取代。本公开设想了任何这样的取代。
应理解本发明并未限制于本文所述的特定方法学、方案、材料、试剂和物质等，它们是可变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
在本说明书全文中引用的所有文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明书等)在此通过引用以其整体并入。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
通过以下项目来进一步说明本发明：
项目1.一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。
项目2.根据项目1所述的方法，其中在步骤c)之前，所述方法包括：
a)将带正电荷的多肽与双官能连接子缀合；b)移除未缀合的双官能连接子。
项目3.根据项目1或2所述的方法，其中在步骤c)之前，纯化所述抗体。
项目4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法还包括所述纳米颗粒的回收。
项目5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，与抗体相比，所述第一缀合物是摩尔过量的。
项目6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，与第二缀合物(B)相比，所述带正电荷的多肽是摩尔过量的。
项目7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，与第二缀合物(B)相比，所述带负电荷的分子是摩尔过量的。
项目8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，与带正电荷的多肽相比，所述带负电荷的分子是摩尔过量的。
项目9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，所述第一缀合物(A)与所述抗体之间的摩尔比为至少约10:1。
项目10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，所述第一缀合物(A)与所述抗体之间的摩尔比为约10:1至约50:1。
项目11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述带正电荷的多肽与所述第二缀合物(B)之间的摩尔比为至少约10:1。
项目12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中步骤d)中，所述带正电荷的多肽与所述第二缀合物(B)之间的摩尔比为约10:1至约50:1。
项目13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述带负电荷的分子与所述第二缀合物之间的摩尔比为至少约1:1。
项目14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述纳米颗粒通过自组装形成。
项目15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中步骤d)包括在约4-37℃下温育。
项目16.根据前述项目中任一项所述的方法，其中步骤d)包括温育至少约1小时。
项目17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在所述第二缀合物中，所述带正电荷的多肽和所述抗体经由双官能连接子互相连接。
项目18.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体包含重链和轻链。
项目19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体对细胞表面分子是特异性的。
项目20.根据项目19所述的方法，其中细胞表面分子能够在结合所述抗体时内化。
项目21.根据项目19或20所述的方法，其中所述细胞表面分子在易受所述带负电荷的分子的治疗性处理影响的细胞上表达。
项目22.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体对癌症相关抗原是特异性的。
项目23.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体对CD33、EGFR、IGF1R或CD20是特异性的。
项目24.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体是吉妥单抗、西妥昔单抗、西妥木单抗、替妥木单抗、GR11L、利妥昔单抗。
项目25.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体具有选自以下的CDR序列：a.CDR-H1:GFSLTNYG(SEQ ID NO:1),CDR-H2:IWSGGNT(SEQ ID NO:2),CDR-H3:ARALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:3),CDR-L1:QSIGTN(SEQ ID NO:4),CDR-L2:YAS,和CDR-L3:QQNNNWPTT(SEQ ID NO:5)；b.CDR-H1:GYTITDSN(SEQ ID NO:10),CDR-H2:IYPYNGGT(SEQ IDNO:11),CDR-H3:VNGNPWLAY(SEQ ID NO:12),CDR-L1:ESLDNYGIRF(SEQ ID NO:13),CDR-L2:AAS,和CDR-L3:QQTKEVPWS(SEQ ID NO:14)；c.CDR-H1:GGTFSSYAIS(SEQ ID NO:19),CDR-H2:GIIPIFGTANYAQKFQ(SEQ ID NO:20),CDR-H3:APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV(SEQ ID NO:21),CDR-L1:QGDSLRSYYAT(SEQ ID NO:22),CDR-L2:GENKRPS(SEQ ID NO:23),和CDR-L3:KSRDGSGQHLV(SEQ ID NO:24)；d.CDR-H1:GFTFSSYG(SEQ ID NO:29),CDR-H2:IWFDGSST(SEQID NO:30),CDR-H3:ARELGRRYFDL(SEQ ID NO:31),CDR-L1:QSVSSY(SEQ ID NO:32),CDR-L2:IWFDGSST(SEQ ID NO:33),和CDR-L3:QQRSKWPPWT(SEQ ID NO:34)；以及e.CDR-H1:GYTFTSYN(SEQ ID NO:39),CDR-H2:IYPGNGDT(SEQ ID NO:40),CDR-H3:CARSTYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:41),CDR-L1:SSVSYI(SEQ ID NO:42),CDR-L2:ATS,和CDR-L3:QQWTSNPPT(SEQID NO:43)。
项目26.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体具有选自以下的VH和VL序列：a.SEQ ID NO:6和7；b.SEQ ID NO:15和16；c.SEQ ID NO:25和26；d.SEQ ID NO:35和36；和e.SEQ ID NO:44和45。
项目27.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体具有选自以下的重链和轻链序列：a.SEQ ID NO:8和9；b.SEQ ID NO:17和18；c.SEQ ID NO:27和28；d.SEQ IDNO:37和38；e.SEQ ID NO:46和47；和f.SEQ ID NO:65和18。
项目28.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子为核酸。
项目29.根据项目28所述的方法，其中所述核酸是双链核酸。
项目30.根据项目28所述的方法，其中所述核酸是单链核酸。
项目31.根据项目28-30中任一项所述的方法，其中所述核酸具有约18至约25bp。
项目32.根据项目28-30中任一项所述的方法，其中所述核酸具有约18至约25nt。
项目33.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子为DNA或RNA。
项目34.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子是siRNA、esiRNA、shRNA、反义寡核苷酸或miRNA。
项目35.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子是对KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3特异性的siRNA。
项目36.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子为对优选选自KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1和FLT3中的一种或多种靶标特异性的siRNA的混合物。
项目37.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子具有约20kDa或更小的分子量。
项目38.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子具有至少2-的电荷。
项目39.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的多肽是鱼精蛋白或组蛋白。
项目40.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述双官能连接子是异双官能连接子。
项目41.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述双官能连接子为磺基-SMCC。
项目42.一种纳米颗粒，其通过前述项目中任一项所述的方法可获得。
项目43.一种纳米颗粒，其包含：a)带正电荷的多肽；b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；和c)一种或多种带负电荷的分子。
项目44.根据项目42或43所述的纳米颗粒，其中所述带正电荷的多肽富集在所述纳米颗粒的外部和/或内部部分。
项目45.根据项目42-44中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第二缀合物富集在所述纳米颗粒的外部部分。
项目46.根据项目42-45中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种带负电荷的分子富集在所述纳米颗粒的内部部分。
项目47.根据项目42-46中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有约0.05μm至约10μm的平均直径。
项目48.根据项目42-47中任一项所述的纳米颗粒，其中在所述第二缀合物中，所述带正电荷的多肽与所述抗体经由双官能连接子相互连接。
项目49.根据项目42-48中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体包含重链和轻链。
项目50.根据项目42-49中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体对细胞表面分子具有特异性。
项目51.根据项目50所述的方法，其中细胞表面分子能够在结合所述抗体时内化。
项目52.根据项目50或51所述的纳米颗粒，其中所述细胞表面分子在易受所述带负电分子的治疗处理影响的细胞上表达。
项目53.根据项目42-52中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体对癌症相关抗原具有特异性。
项目54.根据项目42-53中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体对CD33、EGFR、IGF1R或CD20是特异性的。
项目55.根据项目42至54中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体是吉妥单抗、西妥昔单抗、西妥木单抗、替妥木单抗、GR11L、利妥昔单抗。
项目56.根据项目42-55中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体具有选自以下的CDR序列：a.CDR-H1:GFSLTNYG(SEQ ID NO:1),CDR-H2:IWSGGNT(SEQ ID NO:2),CDR-H3:ARALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:3),CDR-L1:QSIGTN(SEQ ID NO:4),CDR-L2:YAS,和CDR-L3:QQNNNWPTT(SEQ ID NO:5)；b.CDR-H1:GYTITDSN(SEQ ID NO:10),CDR-H2:IYPYNGGT(SEQ IDNO:11),CDR-H3:VNGNPWLAY(SEQ ID NO:12),CDR-L1:ESLDNYGIRF(SEQ ID NO:13),CDR-L2:AAS,和CDR-L3:QQTKEVPWS(SEQ ID NO:14)；c.CDR-H1:GGTFSSYAIS(SEQ ID NO:19),CDR-H2:GIIPIFGTANYAQKFQ(SEQ ID NO:20),CDR-H3:APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV(SEQ ID NO:21),CDR-L1:QGDSLRSYYAT(SEQ ID NO:22),CDR-L2:GENKRPS(SEQ ID NO:23),和CDR-L3:KSRDGSGQHLV(SEQ ID NO:24)；d.CDR-H1:GFTFSSYG(SEQ ID NO:29),CDR-H2:IWFDGSST(SEQID NO:30),CDR-H3:ARELGRRYFDL(SEQ ID NO:31),CDR-L1:QSVSSY(SEQ ID NO:32),CDR-L2:IWFDGSST(SEQ ID NO:33),和CDR-L3:QQRSKWPPWT(SEQ ID NO:34)；和e.CDR-H1:GYTFTSYN(SEQ ID NO:39),CDR-H2:IYPGNGDT(SEQ ID NO:40),CDR-H3:CARSTYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:41),CDR-L1:SSVSYI(SEQ ID NO:42),CDR-L2:ATS,和CDR-L3:QQWTSNPPT(SEQID NO:43)。
项目57.根据项目42-56中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体具有选自以下的VH和VL序列：a.SEQ ID NO:6和7；b.SEQ ID NO:15和16；c.SEQ ID NO:25和26；d.SEQ IDNO:35和36；和e.SEQ ID NO:44和45。
项目58.根据项目42-57中任一项所述的纳米颗粒，其中所述抗体具有选自以下的重链和轻链序列：a.SEQ ID NO:8和9；b.SEQ ID NO:17和18；c.SEQ ID NO:27和28；d.SEQID NO:37和38；e.SEQ ID NO:46和47；和f.SEQ ID NO:65和18。
项目59.根据项目42-58中任一项所述的纳米颗粒，其中带负电荷的分子为核酸。
项目60.根据项目42-59中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸是双链核酸。
项目61.根据项目42-60中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸是单链核酸。
项目62.根据项目42-61中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸具有约18至约25bp。
项目63.根据项目42-62中任一项所述的纳米颗粒，其中所述单链核酸具有约18至约25nt。
项目64.根据项目42-63中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子为DNA或RNA。
项目65.根据项目42-64中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子为siRNA、esiRNA、shRNA、反义寡核苷酸或miRNA。
项目66.根据项目42-65中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子是对KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1或FLT3特异性的siRNA。
项目67.根据项目42-66中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子是对优选地选自KRAS、BRAF、PIK3CA、PAX3-FKHR、EWS-FLI1、c-MYC、TP53、DNMT3A、IDH1、NPM1和FLT3中的一种或多种靶标特异性的siRNA的混合物。
项目68.根据项目42-67中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子具有约20kDa或更小的分子量。
项目69.根据项目42-68中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子具有至少2-的电荷。
项目70.根据项目42-69中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带正电荷的多肽是鱼精蛋白或组蛋白。
项目71.根据项目42-70中任一项所述的纳米颗粒，其中所述双官能连接子为异双官能连接子。
项目72.根据项目42-71中任一项所述的纳米颗粒，其中所述双官能连接子为磺基-SMCC。
项目73.一种组合物，其包含项目42-72中任一项所述的纳米颗粒。
项目74.根据项目73所述的组合物，其中该组合物是药物组合物。
项目75.根据项目42-72中任一项所述的纳米颗粒或根据项目73或74所述的组合物，其用在治疗中。
项目76.根据项目75所述应用的纳米颗粒或组合物，其中所述应用是在癌症的治疗中。
项目77.根据项目75所述应用的纳米颗粒或组合物，其中所述应用是在实体瘤的治疗中。
项目78.根据项目75所述应用的纳米颗粒或组合物，其中所述应用是在选自一下的癌症的治疗中：肺癌、肉瘤、结肠直肠癌、血癌。
项目79.一种试剂盒，其包含项目42-72中任一项所述的纳米颗粒或项目73或74所述的组合物。
项目80.根据项目1-41中任一项所述的方法或根据项目42-72中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子是药物和/或前药，比如三磷酸瑞德西韦。
项目81.根据项目1-41中任一项所述的方法或根据项目42-72中任一项所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的分子是与具有负净电荷的部分(比如Cy 3.5或Alexa488)缀合的药物和/或前药(比如依鲁替尼)。
实施例
下列实施例说明本发明。不应将这些实施例解释为限制本发明的范围。这些实施例纳入本文仅为了说明，且本发明仅受到权利要求的限制。
实施例1：缀合方案的改进
当我们按照N.等，2016；/>N.等，2018；/>S.等，2015的公开内容实施所选载体抗体磺基-SMCC和鱼精蛋白之间的化学缀合时，我们对所得的缀合物感到困惑，这些缀合物在SDS-PAGE电泳中具有非预期的性质：例如，我们经常观察到IgG缀合物的现象，证明其不再被诸如DTT、DTE、β-巯基乙醇或TCEP的还原剂还原(图1，A和B，参见用于说明的凝胶a)。接着，我们观察到显示出比预期的分子量高得多的分子量的缀合物，这代表了彼此交联的IgG的二聚体或多聚体，一些含有另外的鱼精蛋白，一些则不含(图1，附图说明，图C，参见用于说明的凝胶B)。在极端情况下，所有这些副反应的复杂性导致所得缀合物出现云状外观，这可能是由图1B中所有这些缀合物a-d的混合物导致的。
相反，预期的缀合物是图1中标记为C的制剂，其是一种保留了肽内和肽外HC和LC的天然二硫键，没有另外的内部交联操作，但具有多种与轻链(LC)和重链(HC)交联的鱼精蛋白。
因此，我们通过在采用磺基-SMCC的鱼精蛋白肽的氨基末端活化后引入另外的纯化步骤来改进缀合方案。将所得产物通过凝胶色谱纯化，将活化的SMCC-鱼精蛋白与仍然有活性的过量离析物磺基-SMCC分离。从该步骤开始，通过纯SMCC-鱼精蛋白的均相溶液进行抗体缀合，而没有任何残余交联剂的污染(图2)。
因此，下列实施例中所示的所有实验均按照“新”的SMCC-耗竭方案进行。所得的复合物在电泳均匀性、靶向性能和功能有效性方面有很大改善。
因此，本文所示的所有发现均使用通过新的生产方法合成的治疗剂进行，而不是使用在N.等，2016；/>N.等，2018；/>S.等，2015中公开的制剂进行。
实施例2：使用未公开的改进的缀合方案使非小细胞肺癌中的致癌基因失活
接下来，我们用西妥昔单抗-鱼精蛋白靶向表达EGFR的非小细胞肺癌细胞系(NSCLC)。这里，西妥昔单抗-鱼精蛋白能够结合8mol siRNA/mol西妥昔单抗-鱼精蛋白(图3A，B)，并以受体依赖性方式将siRNA递送至早期核内体(图3C)。在用抗-KRAS的与siRNA复合的抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白处理后，在体外处理的NSCLC细胞系中有效地沉默了KRAS(图3D)。在西妥昔单抗敏感的A549细胞中，负载了对照siRNA的缀合西妥昔单抗对CD1裸鼠中的细胞生长、集落形成、肿瘤生长和肿瘤重量具有较小的影响，这与在NSCLC患者中使用西妥昔单抗的随机临床试验一致。但是，通过使用KRAS siRNA显著放大了这种作用，参见图3E和F(右侧小图)。西妥昔单抗抗性SK-LU1细胞可更好地耐受西妥昔单抗-对照siRNA，但在这里，KRAS siRNA显著抑制了集落和肿瘤生长(图3E和F，左侧小图)。
接下来，我们研究了NSCLC异种移植肿瘤的系统性抗-EGFR-mAB-siRNA处理对在冰冻切片(A549肿瘤)和石蜡切片(SK-LU-1肿瘤)上免疫荧光的增殖标志物Ki67表达的影响。在PBS或抗-EGFR-mAB-对照-siRNA处理的A549(图4A-D)和SK-LU-1肿瘤(图4G-J)中，Ki67染色在各肿瘤细胞的Hoechst染色的细胞核中广泛分布。相对地，用抗-EGFR-mAB-KRAS-siRNA处理的肿瘤表现出低得多的显示Ki67染色的增殖性细胞(图4E-F和2K-L)。
系统性抗-EGFR-mAB-siRNA应用的肿瘤生长阻滞不仅可以通过降低肿瘤组织的增殖来诱导，而且可以通过增加凋亡来诱导。此外，凋亡的诱导当然是能够活性地减小肿瘤尺寸的潜在癌症治疗剂的期望效果。我们旨在通过揭示细胞核中的DNA断裂作为凋亡的标志的TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)染色各离体自肿瘤组织来研究凋亡细胞的丰度。过氧化物酶染色显色后，对照处理的肿瘤切片显示，与PBS处理(图5A-B)相比，用-抗EGFR-mAB-对照siRNA处理(图5C-D)的A549肿瘤中TUNEL-阳性核加倍，当载体含有KRAS siRNA时进一步加倍(图5E-F用于说明，图5M用于统计)。通过凋亡信号，用PBS(图5G-H)和抗-EGFR-mAB-对照siRNA(图5I-J)处理的SK-LU1肿瘤是不可区分的，但是如果KRAS-siRNA与抗体载体缀合并应用于异种移植肿瘤，则TUNEL-阳性细胞核的数目增加4倍(图5K-L和图5N)。
总之，通过采用抗-EGFR-mAB-KRAS siRNA的处理肿瘤尺寸的明显且显著减小可以用各肿瘤中增殖减少和凋亡增加的组合来解释。
此外，我们还利用了EGFR在肉瘤中也是表面表达的事实(参见(Herrmann等，2010)和下一章)。在肉瘤的首次临床试验中西妥昔单抗作为单一药剂无效的观察结果(Ha等，2013)与我们的目的无关，因为我们的系统依赖于这样的抗体，该抗体不作为活性抗癌剂，而是作为携带致癌基因特异性效应物siRNA的穿梭系统的组分。
实施例3：靶向横纹肌肉瘤中的致癌基因
横纹肌肉瘤(RMS)是侵袭性软组织肉瘤，其源自未成熟成肌细胞，主要发生在儿童和年轻人中。儿科RMS根据其组织学外观分为两个主要类别：大约2/3代表胚胎RMS(ERMS)，其具有更良好的预后，1/3代表更具侵蚀性的肺泡RMS(ARMS)(Stevens，2005)。迄今为止，除了11p15杂合性缺失的累积，在ERMS中没有发现具有诊断价值的常见遗传病变(Chen等，2013)。靶向ARMS的关键驱动剂更有可能具有治疗效果。特征为肺泡横纹肌肉瘤(ARMS)的遗传病变是通过t(1；13)或t(2；13)的染色体易位的PAX3-FKHR或PAX7-FKHR融合体。因此，靶向PAX-FKHR融合基因及其转录物可能是抑制ARMS细胞恶性生长并诱导其凋亡的特异性和有效的手段。发现抑制致癌融合蛋白或突变蛋白是具有挑战性的。要么蛋白质是“无成药性的”，或者药物治疗导致该蛋白质的抗性形式选择并导致更强烈的复发(Verdine和Walensky，2007)。
通过RNAi下调融合蛋白旨在克服这些问题，因为在mRNA水平上抑制了表达。具体地，在RMS细胞中通过RNAi下调PAX3-FKHR融合蛋白的表达对恶性表型具有直接影响。通过针对PAX3或PAX3-FKHR的siRNA沉默PAX3-FKHR融合降低了RMS细胞系的增殖、迁移和集落形成(Kikuchi等，2008；Liu，L.等，2012)。因此，我们希望通过我们建立的抗体-鱼精蛋白载体系统，通过稳定且特异性的方法，通过携带至肿瘤细胞的RNAi有效下调ARMS特异性融合蛋白，从而产生治疗效果。
在RMS中，IGF1R和上皮生长因子受体(EGFR)是我们的模块化载体的候选靶标。我们的技术允许通过两个独立的特征将肿瘤细胞与其他细胞区分开来，并因此提供了双层特异性：a)细胞表面受体饰纹(decoration)和b)细胞致癌设备。我们和其他人(Herrmann等，2010)识别了在不同肺泡(和胚胎)RMS细胞系上的EGFR以及IGF1R高密度表面表达。两种细胞表面受体都可以作为我们系统的靶标成分。
为了检查我们的抗体构建体在RMS细胞系中的靶向效率，我们用抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)-siRNA复合物处理了ERMS EGFR+细胞系RD，并用抗-IGF1R-siRNA复合物处理了ARMS IGF1R+细胞系RH-30(图6)。两种细胞系以可变水平表达IGF1R和EGFR(图6A)，并且根据它们的最高表达，RD细胞优先内化抗-EGFR-Alexa488-siRNA(图6B和C，上方小图)，而RH-30细胞优先内化抗-IGF1R-Alexa488 siRNA复合物(图6B，下方小图)。Alexa488-siRNA可以通过西妥昔单抗-鱼精蛋白内化进入高达90％的所有EGFR+RD细胞(图6C，中间小图，而抗-IGF1R抗体在IGF1R+RH-30细胞中效果较差(图6B，下方小图)。
为了进行RMS-典型PAX3-叉头融合致癌基因特异性靶向的原理验证实验，我们设计了跨越PAX3-FKHR的断点区域(图7D)的各种siRNA，并在集落形成分析中用那些偶联于西妥昔单抗-鱼精蛋白的跨越断点的siRNA处理ARMS RH-30细胞。与对照相比，断点siRNA显著降低RH-30中的集落形成(图7E)，而ERMS型细胞RD集落形成被NRAS与cMyc siRNA组合的转运所损害(图7A和B)，两种靶基因代表ERMS中熟知的致癌基因。因此，在RD细胞中用抗-EGFR/NRAS siRNA处理后，在免疫印迹中NRAS的致癌基因表达降低(中间行图7C)。
这些结果说明，我们可以使用我们的具有至少2种不同单克隆抗体的模块抗体-siRNA系统靶向RMS细胞系，这取决于我们选择的特异性转运核酸以引发致癌基因失活的RMS肿瘤的受体饰纹(decoration)。
实施例4：靶向尤文肉瘤中的致癌基因
尤文肉瘤是儿童和年轻人的骨肿瘤。其中，在转移阶段中，长期完全缓解低于35％，非常需要更好的治疗选择(Paulussen等，1998；Paulussen等，2008)。中心遗传事件是染色体易位t(11；22)的发生，其导致在这些肿瘤细胞中形成融合蛋白EWS-FLI1(Arvand和Denny，2001)。尤文肉瘤细胞在其表面表达大量的IGF1R。因此，我们旨在使用抗-IGF1R-抗体如克隆ImcA12(西妥木单抗)或替妥木单抗作为SMCC-鱼精蛋白缀合物以转运EWS-FLI1断点特异性siRNA，从而应用我们的模块疗法。作为原理的验证，我们使用商业化的抗-IGF1R鼠抗体GR11L(Merck)并显示靶向尤文细胞。这些结果在(N.等，2016)中公布并且在图8中描绘。
为了能够使用这种治疗选择，我们在CHO-S细胞中克隆并表达了两种不同的IGF1R-抗体，并使用HPLC对其进行了纯化。它们是克隆西妥木单抗(这里称为“A12”)和替妥木单抗(这里称为“Tepro”)。两者均以足够量产生并与SMCC-鱼精蛋白偶联(图9A)，两者均结合siRNA(图9B)并将siRNA转运至IGF1R-阳性细胞SKNM-C(图9C)。
当用这些与针对EWS-FLI1的siRNA复合的IGF1R-mAB-鱼精蛋白缀合物温育细胞，并将细胞接种在半固体软琼脂中时，菌落形成被显著降低(图10A和B)。
因此，我们推断我们的模块系统也可以应用于抗-IGF1R抗体和肉瘤细胞的用途，尤其是用于融合蛋白特异性siRNA，例如EWS-FLI1-siRNA的敲低。
实施例5：淋巴瘤模型中的致癌基因靶向
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)代表常见的淋巴瘤亚型。DLBCL细胞在其表面表达CD20。用于患病患者的标准一线疗法是化学疗法和抗-CD20抗体利妥昔单抗的组合。利妥昔单抗结合并阻断CD20分子，并导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过这种方法，可以治愈大约65％的患者。对一线治疗难治的或在初始反应后复发的患者的特征在于极低的存活，这表明迫切需要新的治疗方法。因此，我们的目的是将作为细胞靶向抗体的一线药物利妥昔单抗与针对在遗传上完全不同的淋巴瘤细胞中识别的不同致癌基因的siRNA组合(图15)。
我们首先将CD20-抗体利妥昔单抗与不同比例的SMCC-鱼精蛋白化学偶联，以比较每种复合物结合siRNA的有效性(图13)。有趣的是，尽管80或120mol的未结合SMCC-鱼精蛋白是高过量，siRNA的结合几乎和1mol抗体与40mol SMCC-鱼精蛋白偶联的分子与siRNA结合相同(图13)。因此，我们推断，最少量的SMCC-鱼精蛋白是足够的，并且回到1:32的抗体：SMCC-鱼精蛋白的常规比例(图14)。我们首先如前所述检测利妥昔单抗-鱼精蛋白与siRNA的结合能力，并观察到与其它载体抗体相似的siRNA和载体系统的配位(coordination)(约8mol/mol)(图14B)。
随后，测试不同的DLBCL细胞系的CD20和CD33的表面表达呈阳性(图15，上方小图)。因此，通过抗-CD20 mAB利妥昔单抗和抗-CD33-mAB吉妥单抗进行内化研究。
通过抗体介导的siRNA敲低对DLBCL细胞系进行B细胞受体轴分子筛选，以产生除BTK之外的其它靶分子(图15)，其导致显著的集落生长抑制，这在使用抗-CD33-抗体-siRNA靶向的HBL1细胞中尤其明显(图15，下方小图)。
实施例6：载体抗体-鱼精蛋白与化学结构不同于siRNA的小分子量聚-阴离子药物形成的复合物
在另一个研究项目中，我们假设诸如利妥昔单抗或吉妥单抗的治疗性单克隆抗体可以用作低分子量(lmw)药物的载体分子。这种策略在临床中是重要的，因为相比于非靶向形式，许多lmw药物，比如激酶抑制剂类的药效学和安全性可能被靶向载体改善。因此，我们假设使用这样的抗体-抑制剂缀合物，即i)这些缀合物可以以较低剂量应用，因为抗体有助于将所述抑制剂富集在预期靶细胞中，和ii)抗体抑制非预期细胞吸收抑制剂，在非预期细胞中抑制剂可诱导非预期的毒性反应。
在第一组实验中，我们合成了具有4-电荷的带负电荷的小分子，其是已知增殖抑制剂的衍生物，在此将其称为小分子1(SM-1)。因此，我们通过加入带负电荷并发射红色荧光将不带电荷的小分子抑制剂转化为强阴离子的化合物(在此称为“SM-1/RF”)，这使得其通过静电力结合到我们的基于鱼精蛋白的载体系统上，以形成抗体-抑制剂-缀合物。
除了红色荧光染料的强聚阴离子电荷之外，该缀合物还具有易于以红色荧光的形式在体外和体内追踪的优点。
随后，我们针对SM-1/RF和两种载体系统，利妥昔单抗(CD20)-鱼精蛋白和可靠的西妥昔单抗(EGFR)-鱼精蛋白之间的结合进行了相同的实验。两种载体都表现出了SM-1/RF的强共组装，并且由于与siRNA相比SM-1/RF分子量低(约13kDa)，因此具有极高的静电饱和的mol/mol比，超过100mol SM-1/RF/mol载体mAB(图17)。
将负载亚临界20x过量SM-1/RF的相应缀合物利妥昔单抗-鱼精蛋白和西妥昔单抗-鱼精蛋白用表达CD20和EGFR的细胞系温育，并分析SM-1/RF的细胞内富集。在两种情况下，可以记录在典型的红色荧光激发/发射波长组合下的荧光信号的细胞内富集(图18)。结果，修饰的SM-1/RF化合物被细胞内化，从而可以开始起作用。
实施例7：有效的抗体-鱼精蛋白-siRNA制剂的令人惊讶的特征
我们使用的所有抗体的确切缀合方法可以分成两个步骤：首先，将鱼精蛋白与磺基-SMCC在氨基端缀合，然后进行尺寸排阻过程以移除过量的缀合交联剂，第二，将活化的鱼精蛋白-SMCC与IgG骨架半胱氨酸定向缀合。如SDS-PAGE电泳所见，所得生物缀合物在IgG的重链和轻链中均显示显著的分子量偏移。约60-80％的IgG被转化为含有鱼精蛋白标签，并且总是可见残余量的过量鱼精蛋白。
针对EGFR-mAB西妥昔单抗-鱼精蛋白缀合物的图19A所示，我们通过蛋白G相互作用色谱从反应混合物中耗竭了未结合的鱼精蛋白。鱼精蛋白缀合的抗体与蛋白G基质结合，而未结合的鱼精蛋白较早被洗脱，随后是不含鱼精蛋白的纯化的IgG-鱼精蛋白复合物，参见级分29-31。我们惊讶地发现，尽管缀合了鱼精蛋白，但该物质在典型的条带转移分析中不能结合siRNA，参见图19B的右半部，而未纯化的mAB-鱼精蛋白复合物以通常的1:16摩尔比结合siRNA。
为了进一步检验含鱼精蛋白和鱼精蛋白耗竭的制剂的有效性，我们用转运KRAS-siRNA和对照-siRNA的两种制剂处理表达EGFR和KRAS-依赖性A549和SK-LU1 NSCLC细胞系。只有那些含有游离鱼精蛋白的制剂(参见图19A和B，“与32x SMCC-鱼精蛋白偶联的抗-EGFR-mAB”)有效地降低了含有KRAS-siRNA的细胞系的集落生长，正如对于它们的癌基因成瘾所预期的(图20A和B)。
我们对抗-CD33 mAB吉妥单抗进行了完全相同的纯化步骤，我们将其用于AML的实验治疗并观察到相同的效果：通过HPLC耗竭未结合鱼精蛋白的缀合物制剂不能将siRNA结合至需要的量(图21B，下方小图)，而未纯化的制剂则完全可以(图21B，上方小图)。
此外，相对于未纯化的材料，在集落形成试验中，不含未结合的SMCC-鱼精蛋白的载体对OCI-AML2细胞没有剩余的抗-DNMT3A-siRNA抑制功效(图21C)。这个观察结果与我们之前对载体系统的分子组装假设(图3A)不一致，并且总体上挑战了我们之前的假设。
为了找到对这些令人困惑和意外的观察的解释，我们进行了多次实验。
考虑到图19的结果，我们假设CD20-mAB-鱼精蛋白-SM-1/RF-鱼精蛋白加合物中未结合的SMCC-鱼精蛋白的存在可能与在siRNA加合物中一样重要，因此我们通过如前所述的亲和色谱从利妥昔单抗-CD20 mAB制剂中耗竭了鱼精蛋白。假设，耗竭的制剂(图22A，级分25)不能与含SMCC-鱼精蛋白的制剂(图22B，右)相同程度地结合并配位聚阴离子SM-1/RF(图22B，左)。
通过使用抗-IGF1R单克隆AB IMCA-12缀合物获得了相同的发现(图23)。SMCC-鱼精蛋白耗竭的抗体-鱼精蛋白缀合物不能静电结合siRNA。
在图24中，我们测试了耗竭了SMCC-鱼精蛋白的A12载体抗体(图23)在SKNM-C尤文肉瘤细胞中有效递送致癌基因失活的siRNA的能力。尽管负载有效siRNA的未耗竭的A12-SMCC-鱼精蛋白降低了集落生长，但耗竭的制剂(参见图23，级分19-21)不能降低集落生长。
实施例8：破译抗体-SMCC-鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白复合物中游离SMCC-鱼精蛋白的作用
根据前面的结果，我们发现如果不存在游离SMCC-鱼精蛋白，我们的靶向将不起作用。因此，我们希望发现游离SMCC-鱼精蛋白在复合物中起哪种作用。当然，我们必须排除主要功能是由游离的SMCC-鱼精蛋白完成的。因此，我们采用游离SMCC-鱼精蛋白和其它阴性对照进行了一系列实验。
首先，我们采用IGF1R-阳性但EGFR-阴性的尤文肉瘤细胞系SKNM-C进行了集落形成分析，该细胞系依赖于EWS-FLI1-易位产物(图25)。作为阳性对照，我们通过用与抗-EWS-FLI1(E/F)-siRNA缀合的抗-IGF1R-mAB-鱼精蛋白复合物处理细胞来抑制EWS-FLI1-易位产物，这将导致SKNM-C细胞的集落生长显著降低(图25)。相对地，与对照siRNA相比，使用含有和不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗-EGFR-mAB-鱼精蛋白作为载体，抗EWS-FLI1-siRNA的转运未导致集落形成减少(图25)，这表明IGF1R-介导的靶向是特异性的，不是由于游离SMCC-鱼精蛋白。此外，单独使用浓度与抗-EGFR抗体相同的SMCC-鱼精蛋白(60nM)也不能诱导集落形成的抑制(图25)。
接下来，我们用常规的靶向混合物对抗SKNM-C尤文肉瘤细胞，所述常规的靶向混合物包括与SMCC-鱼精蛋白缀合的抗-IGF1R抗体、与抗-IGF1R-mAB-鱼精蛋白复合物中存在的SMCC-鱼精蛋白相同量的游离SMCC-鱼精蛋白(60nM与30倍过量的SMCC-鱼精蛋白缀合的载体相当于≤1800nM的潜在游离SMCC-鱼精蛋白)和有效的抗-EWS-FLI1-siRNA(图26A)。当我们省略了靶向抗-IGF1R-mAB A12，而仅用与完全混合物中相同浓度的游离SMCC-鱼精蛋白加上有效siRNA处理SKNM-C细胞时，与对照scr-siRNA相比，没有观察到集落生长的减少(图26A)。我们还在AML细胞系OCI-AML-2(图26B)和A549 NSCLC细胞(图26C)中测试了这种策略，同样省略靶向mAB(此处分别为：抗-CD33或抗-EGFR)，但提供正常有效的siRNA。如在SKNM-C中，负载有效siRNA的游离SMCC-鱼精蛋白仍然如对照siRNA那样没有任何效果。
这导致我们假设，尽管需要正确的抗体来检测预期的靶细胞表面分子，但必须满足两个另外的先决条件，以有效地结合和复合siRNA并将其靶向致癌分子以获得治疗功效：a)与所述靶向抗体缀合的鱼精蛋白，和b)所述混合物中存在的足够残余量的未结合SMCC-鱼精蛋白。无抗体偶联载体的游离SMCC-鱼精蛋白不能满足这些要求。
下一个待解决的问题是我们的载体系统的哪种改进的组装结构可以毫无矛盾地解释我们的研究中观察到的所有体外和体内功效结果。
实施例9：形成稳定纳米颗粒的不可预期静电宏观结构的检测和可视化
如果处理的细胞表达相应的细胞表面受体或分子，则在处理的细胞培养物样品中容易识别细胞内抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物，如图27所示：在此，具有结合的siRNA的西妥昔单抗(抗-EGFR)-SMCC-鱼精蛋白被内化到表达EGFR的NSCLC细胞中，并且将其内部地加工至早期核内体(白点，左侧小图)，但不加工至溶酶体(灰点，中间小图)。
实施例10：在靶细胞中不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物或单独的游离SMCC-鱼精蛋白-siRNA未内化
有趣的是，只有当来自缀合方案的残余SMCC-鱼精蛋白保留在混合物中时(图28，右手)，才能看到典型的内化的囊泡结构，但如果通过亲和色谱将鱼精蛋白-SMCC耗竭时，则看不到内化的囊泡结构(图28，左侧，层析结果也见图19)。因此，从视觉上来看，未结合的鱼精蛋白-SMCC的存在对于缀合物的功效是至关重要的。
我们还用其它抗体-SMCC-鱼精蛋白复合物和游离SMCC-鱼精蛋白进行了这一过程，并与所述复合物通过HPLC耗竭了游离SMCC-鱼精蛋白的对应物进行了比较：在采用不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物和仅具有游离SMCC-鱼精蛋白的细胞系中都没有观察到内化(图29、图30和图31)。
实施例11：通过抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物在体外形成囊泡结构
每当我们进行阴性对照实验，即用靶向EGF受体的有效缀合物处理不表达EGF受体的细胞时，我们因此观察到极低的细胞靶向效率(图32B)，但是我们被细胞外的荧光胶束结构的积累所吸引。仅在细胞上没有发现结合和内化缀合物的靶标时，才能看到这些可能附着于处理过的培养皿表面上的基质样结构的累积物。此外，这些累积物全部具有相似的大小，并且它们必须比约10-20nm大得多，10-20nm的尺寸相当于1个IgG加上若干鱼精蛋白加上8个附着的siRNA的单体，因为这个尺寸在荧光显微镜中作为颗粒是不可检测的，荧光显微镜大约具有发射波长一半的分辨率，产生大于200nm的颗粒尺寸。
因此，我们假定3个组分1.西妥昔单抗-SMCC-鱼精蛋白，2.siRNA和3.未结合的SMCC-鱼精蛋白形成了一种活性所需的稳定的宏观结构。为了证实这种负责IgG-鱼精蛋白-siRNA的功效的宏观结构的存在，我们应用了通过ζ-计数器(MALVERN)上的动态光散射(DLS)的粒径检测，其与由溶液中颗粒引起的光扩散相关。结果是有趣的：作为动态过程，具有完全似乎合理的尺寸(对于IgG-鱼精蛋白-siRNA单体为22nm)的组分在几小时后自发地组装成尺寸大于400nm的纳米结构，而该过程在鱼精蛋白耗竭的制剂中是不可检测的(图33)。
该过程是时间依赖性的，并且较大的结构仅在温育一定时间后形成(图34)。2-6小时的时间间隔足以形成那些宏观结构，该宏观结构在室温下在未保护的PBS环境中24小时后再次开始部分分解。
基于这些测量，我们假设在细胞外形成了抗体-鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白/siRNA复合物，而与细胞环境无关。为了观察这些复合物，我们在包被的腔室载玻片上使用Alexa488-siRNA过夜温育不含细胞的不同复合物组合物，并在第二天固定所形成的结构。荧光显微镜检查显示，只有当3种组分彼此发现时才形成囊泡结构：1.抗体-SMCC-鱼精蛋白、2.游离SMCC-鱼精蛋白、3.siRNA(参见图35)。
所有具有游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白复合物都形成了囊泡纳米结构，而不含游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白复合物或单独的SMCC-鱼精蛋白不形成任何纳米结构(图36)。
详细地，纳米结构类似于由三种组分mAB-SMCC-鱼精蛋白、未缀合的SMCC-鱼精蛋白和Alexa488-标记的siRNA形成的微米尺寸的球体形状(图37)。通过荧光显微镜检查和激光扫描共焦显微镜验证了该结构。很明显，球体结构完全被来自siRNA化合物的Alexa488信号填充。
结果汇总于下表中。
实施例12：在不同温度下出现体外的囊泡结构
我们还测试了囊泡结构的形成是否依赖于一定的温度。事实上，在4℃、室温(～22℃)和37℃下形成了囊泡结构(图38)。
实施例13：抗体-鱼精蛋白-siRNA复合物在体外形成功能性囊泡结构取决于游离SMCC-鱼精蛋白的量
为了进一步阐明偶联至抗体并作为复合物内游离分子的SMCC-鱼精蛋白的功能，我们滴定了加入到抗体中的SMCC-鱼精蛋白的量，所述抗体在此为：抗-EGFR抗体西妥昔单抗。我们使用恒定量的西妥昔单抗并加入1:1至1:100摩尔比的SMCC-鱼精蛋白(细节参见(图39A))。然后我们在考马斯染色的SDS-PAGE上检查了缀合效率，发现当温育1:1至1:10的抗体：SMCC-鱼精蛋白比时，抗体的轻链(LC)和重链(HC)的偶联是次优的(图39B)。在1:32的抗体：SMCC-鱼精蛋白摩尔比时缀合过程似乎是饱和的，其中在1:50和1:100时缀合过程没有更多的增强(图39B)。
我们通过常规的条带转移分析了这些不同缀合物的siRNA结合能力(图40A-F)。在1:32至1:100的缀合比例下可检测到siRNA的结合(图40D-F)，在更低的比例下没有检测到有效的siRNA结合(图40A-C)。
我们根据当这些缀合产物与Alexa488-对照-siRNA(图40G-L)以及EGFR-阳性A459细胞(图40M-R)一起温育时，在没有细胞的情况下形成囊泡结构的能力，进一步分析了不同缀合产物的性质。当西妥昔单抗与SMCC-鱼精蛋白以1:1至1:10的比例缀合时，没有观察到有效的无细胞囊泡形成(图40G-I)，而在1:32的比例下，囊泡形成非常丰富(图40J)，而在1:50和1:100的比例下囊泡形成减少(图40K-L)。在1:32的缀合时，这些复合物的内化能力最高(图40P)，在1:10的缀合时，其内化能力降低(图40O)。在1:1(图40M)、1:3.2(图40N)或1:50至1:100(图40Q-R)的比例下未观察到内化。这暗示西妥昔单抗与SMCC-鱼精蛋白的最佳复合物形成为1:32，因为在这一比例下导致最有效的缀合、无细胞囊泡形成以及向细胞中的内化。
作为功能测定，我们比较了不同缀合产物在敲低致癌基因KRAS后抑制A549细胞集落形成的效率。我们还将其与等量的不含缀合的西妥昔单抗的游离SMCC-鱼精蛋白进行了比较，以阐明单独的未结合的SMCC-鱼精蛋白的影响(图40S-X)。令人惊讶地，与混杂的对照siRNA相比，仅与KRAS-siRNA复合的缀合西妥昔单抗:SMCC-鱼精蛋白1:32导致了集落形成的显著降低(图40V)。在任何浓度下，单独的SMCC-鱼精蛋白不能通过KRAS敲低来诱导集落形成的抑制(图40S-X)。我们仅观察到与scr-siRNA以及KRAS-siRNA复合的SMCC-鱼精蛋白在最高浓度时的惊人毒性(图40W-X)。
实施例14：可将游离SMCC-鱼精蛋白重新加入到SMCC-鱼精蛋白耗竭的抗体-鱼精蛋白缀合物中以在体外形成囊泡结构，并且游离SMCC-鱼精蛋白可被游离的鱼精蛋白取代
为了进一步阐明偶联至抗体并作为复合物内游离分子的SMCC-鱼精蛋白的功能，我们滴定了加入到通过HPLC耗竭游离SMCC-鱼精蛋白的抗体-鱼精蛋白缀合物中的SMCC-鱼精蛋白的量。如图36F所示，这些抗体-鱼精蛋白缀合物不能与荧光siRNA形成囊泡结构。因此我们想知道，是否可以重新加入游离的SMCC-鱼精蛋白以实现该功能，并且是否可以用不含磺基-SMCC的鱼精蛋白取代SMCC-鱼精蛋白。我们向抗-EGFR-mAB-P中加入了不同量的游离SMCC-鱼精蛋白和单独的鱼精蛋白(图41)。加入与抗体相关的1×SMCC-鱼精蛋白或10×SMCC-鱼精蛋白不能有效地形成囊泡结构(图41A和B)，而加入32×SMCC-鱼精蛋白导致非常有效地囊泡形成(图41C)。根据该分析，可以用未化学偶联磺基-SMCC的鱼精蛋白取代游离的SMCC-鱼精蛋白(图41F)。
实施例15：通过抗体-鱼精蛋白-siRNA和/或SM-1/RF复合物在体外形成囊泡结构
为了测试这种新的和无法预期的纳米结构模型，我们使用了结构完全不同，但带同等静电电荷的分子SM-1/RF(参见实施例8)，并将其与抗体-鱼精蛋白缀合物复合(图42-图45)。
在检查含有和不含另外的siRNA的mAB-鱼精蛋白-SM-1/RF-缀合物的无细胞组装结果期间，我们观察到相应纳米结构在数量和尺寸上的显著差异：与不含siRNA的纳米结构相比，通过由mAB-鱼精蛋白复合的siRNA和SM-1/RF+游离SMCC-鱼精蛋白组装的那些纳米结构大得多并且更频密(图42C和F以及图43D和H)。我们通过由形成稳定纳米结构的所有4种组分组成的混合颗粒的假设来解释这种现象。在详细的荧光显微照片中，最大颗粒的纳米结构可以显示出siRNA形成球体胶束的边界，而SM-1/RF填充该球体的内腔(图44和图45，参见放大)。
在使用抗-CD20-mAB利妥昔单抗(图44)和抗-EGFR-mAB西妥昔单抗(图45)作为载体抗体时都可以看到这种混合的抗体-鱼精蛋白颗粒比单独的SM-1/RF与mAB-鱼精蛋白复合的颗粒更频密且大得多的现象。
这意味着带负电荷的SM-1/RF可与抗体-鱼精蛋白复合物形成小囊泡(图42E和图43F)，但是作为线性的和高度带负电荷的分子，siRNA可作为一种在抗体-鱼精蛋白/游离SMCC-鱼精蛋白复合物之间的静电“胶(glue)”。这可以在看起来充满红色荧光SM-1/RF的异常大的囊泡中观察到圆形闪光(图44和图45)。
在图44和37中看到的大胶束结构在常规光学显微镜分析中在相差条件下也是可见的(参见图46)。
我们通过激光扫描显微镜(LSM，图47)进一步证实了这一观察结果。在此，无细胞形成的囊泡的共焦分析表明绿色荧光siRNA形成环(图47Aa-c和图47B d-f)，对于用抗-CD20-mAB-P形成的异常巨大的囊泡，可以看出该囊泡的内腔被红色荧光SM-1/RF填充(图47B d和f)。
实施例16：提出的模型
总之，通过载体-抗体-鱼精蛋白加上未结合的鱼精蛋白结合阴离子货物分子的原理也可应用于除siRNA-核酸以外的货物。在此，修饰货物分子以使其具有聚阴离子特性，并在制备过程中保留未结合的鱼精蛋白-SMCC，以允许各反应物的强静电配位和自组装是重要的。
这一观察结果有力地支持了新的和无法预期的大分子纳米结构对于我们的载体系统的体外和体内药效学效力是潜在必要和充分的。
因此，我们假设组分1.抗体-鱼精蛋白、2.siRNA/阴离子小分子抑制剂和3.未结合的(SMCC-)鱼精蛋白的组合形成纳米颗粒样宏观结构，该纳米颗粒样宏观结构负责siRNA的稳定性并可有效地将siRNA和/或阴离子小分子抑制剂递送至预期细胞，这是完全无法预期的观察结果。图11中示出了该种组装的纳米结构的示例性和理想化模型。
总之，使用最小共同点要求是聚阴离子的且没有其它结构相似性的各种化学上不同的效应子有效载荷的实验为我们的新的和不可预期的纳米结构模型提供了实验证据，该模型是我们的抗体-SMCC连接子-鱼精蛋白siRNA载体和我们的抗体-SM-1/RF系统的体外和体内药效学特征的基础。
这种具有双重特异性的模块纳米结构系统可以用于包括癌症在内的各种疾病群体，所述双重特异性为1.对于siRNA/阴离子小分子转运和向靶细胞的特异性递送具有特异性，和2.对于特异性细胞内致癌基因失活具有特异性。
实施例17：将反义寡核苷酸偶联到抗体-鱼精蛋白缀合物上
为了检验抗体-鱼精蛋白纳米颗粒是否也可以用于转运目前用作敲低基因表达的替代工具的单链寡核苷酸。这些合成的反义单链寡核苷酸(“ASO”)与siRNA一样短，并且假设它们与siRNA类似结合αEGFR-mAB-鱼精蛋白缀合物。因此，我们使用对照ASO进行了条带转移分析，结果发现，当在室温下温育1小时或在37℃下温育5分钟时，1molαEGFR-mAB-鱼精蛋白缀合物可以结合至少8至32mol ASO(图12)。
实施例18：小分子量聚-阴离子药物依鲁替尼-Cy3.5(“RMA561”)的合成
依鲁替尼是布鲁顿氏激酶的共价结合剂。依鲁替尼用于一些淋巴瘤亚型中，并且通过共价添加至可溶性布鲁顿氏激酶中的ATP结合袋中的半胱氨酸来阻断B细胞受体下游的信号转导。依鲁替尼可具有严重的副作用，比如感染、肺炎或心律失常(Wilson等，2015)，原因是依鲁替尼不仅靶向淋巴瘤细胞，而且靶向正常细胞中的BTK。除了副作用，后者导致更高的剂量，和被无关细胞拦截，这种被无关细胞拦截可能部分是由于对BTK以外的靶标的旁观者作用(Byrd等，2013)。接下来，延长的依鲁替尼的剂量可导致抗性的发展(Lenz2017)。在此，我们首先尝试通过先进的连接子化学将依鲁替尼缀合至合适的载体抗体-利妥昔单抗，其靶向CD20并且是DLBCL中的标准疗法的一部分。该缀合是成功的，但它改变了缀合物的溶解度，因此证明是不能进一步开发利用的。
因此，我们将不带电的依鲁替尼转化为强阴离子化合物Cy3.5-RMA561，本文中将其称为依鲁替尼-Cy3.5，由此允许借助于静电力将其结合到我们的基于鱼精蛋白的载体系统，以便形成抗体-抑制剂-复合物。花青染料Cy3.5通过暴露四个作为潜在的粘合剂的磺酸基团而表现出强的阴离子性质(图48)。从我们的观点来看，优选将集中在分子的一个位点上的阴离子电荷集中，并使其具有总体线性形状以形成纳米载体。此外，花青染料允许在评价的所有阶段使用荧光读出的可能性。根据公开的数据(Kim等，2015；Turetsky等，2014)，我们从可商购获得的吡唑并嘧啶1开始，随后将其碘化并通过Suzuki偶联用4-苯氧基苯硼酸取代以形成依鲁替尼核心结构的主要部分2，从而合成了氨基官能化的依鲁替尼衍生物5。对于高结合亲和力很重要的是，通过形成化合物3的立体控制的MITSUNOBU反应来安装(installed)(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。在哌啶部分去保护后，引入α，β-不饱和连接子4(MICHAEL受体)用以不可逆地结合靶。所得Boc-保护的胺5代表用于以不同的阴离子部分(比如花青染料Cy3.5(Lumiprobe))标记的先导结构，其在碱性条件下产生相应的酰胺依鲁替尼-Cy3.5(Cy3.5-RMA561)。通过C18-SPE柱(纯度＞98％(HPLC))纯化最终产物，并通过高分辨率质谱验证。
将Boc保护的衍生物5(8.2mg，0.014mmol，1.05当量)溶解在0.5mL干燥的二氯甲烷(在mol筛4A上干燥)中，加入氯化氢4M的二恶烷溶液(41μL，0.166mmol，12当量)，将反应混合物在室温下搅拌直至5完全转化为游离胺(通过TLC：二氧化硅，溶剂：10％ MeOH/EtOAc示踪，检测：UV254和茚三酮染色)。通过加热至35℃将反应混合物真空蒸发。将残余的白色固体溶解在0.5mL无水二甲基甲酰胺中，向该溶液中加入溶解在0.5mL无水二甲基甲酰胺和N，N-二异丙基乙胺(72μL，0.414mmol，30当量)中的Cy3.5的NHS酯(Lumiprobe的“磺基-Cy3.5NHS酯”；15mg，0.014mmol，1.0当量)。将反应混合物在室温下避光搅拌直至反应完成，通过TLC分析控制(RP C-18，溶剂：MeOH/H2O/AcOH 10/0.5/0.2v/v/v，检测：UV-VIS和茚三酮染色)。通过加热至35℃将反应混合物在真空干燥，将残余物用戊烷、乙醚、乙酸乙酯研磨，并在室温下真空干燥，得到21mg紫色固体的粗产物(Cy3.5-RMA561)。
通过在12g C18 SPE柱上层析纯化粗产物制备分析纯样品。通过用水(10mL)洗涤预处理柱子。将粗产物分成两部分，分别溶解在0.5mL水中，装载在柱上，然后用水(10mL)再用乙腈(10mL)洗涤，以移除杂质和反应副产物。之后，用ACN/H2O 1:1(v/v)的混合物将产物洗脱到仅含有纯Cy3.5-RMA561的几个级分。冻干后，获得2×8mg的纯产物Cy3.5-RMA561，为紫色固体。
除了Cy3.5染料的强聚阴离子特性外，该缀合物具有易于以红色荧光形式在体外和体内示踪的优点。
实施例19：抗体-鱼精蛋白/鱼精蛋白与依鲁替尼-Cy3.5的复合物形成的体外分析
首先，我们进行实验以表征依鲁替尼-Cy3.5和两种载体系统之间的结合，在条带转移分析中，通过双官能交联剂磺基-SMCC将两种抗体(利妥昔单抗和西妥昔单抗)化学缀合至鱼精蛋白，即含有未结合的鱼精蛋白-SMCC的利妥昔单抗(抗-CD20-mAB)-鱼精蛋白和含有未结合的鱼精蛋白-SMCC的西妥昔单抗(抗-EGFR-mAB)-鱼精蛋白。含有未结合的鱼精蛋白-SMCC的两种载体-缀合物均显示依鲁替尼-Cy3.5衍生物的强共组装，并且由于其与siRNA相比的低分子量(约13kDa)，其具有极高的静电饱和的mol/mol比，超过100mol依鲁替尼-Cy3.5/mol载体mAB(图50)。在所有进一步的实验中，化学缀合的抗体-至-鱼精蛋白的组成保持不变，这意味着除了抗体-鱼精蛋白缀合物外所得产物仍含有未结合的鱼精蛋白-SMCC。
将相应的缀合物利妥昔单抗-鱼精蛋白和西妥昔单抗-鱼精蛋白(两者均含有未结合的鱼精蛋白-SMCC，其负载有亚临界20x过量的依鲁替尼-Cy3.5)与表达CD20和EGFR的细胞系一起温育，并分析依鲁替尼-Cy3.5的细胞内富集。在两种情况下，均可以记录到在典型的Cy3.5激发/发射波长组合下的荧光信号的细胞内富集(图51)。因此，只要经修饰的依鲁替尼-Cy3.5化合物仍仍结合其靶标BTK，其仍被细胞内化，并由此起作用。
接下来，我们用偶联至利妥昔单抗载体抗体的依鲁替尼-Cy3.5衍生物处理DLBCL细胞系，裂解细胞并对裂解物进行SDS PAGE分析。然后将凝胶进行UV照射并扫描Cy3.5发色团的发射，并且实际上，存在发射Cy3.5荧光的70kDa的单一蛋白质条带，随后通过免疫印迹分析将该条带识别为布鲁顿氏激酶BTK(图52)。
总之，依鲁替尼核心结构向聚阴离子衍生物的化学修饰不改变缀合物结合布鲁顿氏激酶BTK的效率。
接下来，我们计划了用于识别抗体-抑制剂-复合物的有效性的功能分析。将DLBCL肿瘤细胞接种在甲基纤维素中以形成无锚定集落生长作为致瘤性的替代标记。用抗体-抑制剂复合物的组合处理各测定，并与合适的对照组比较。很明显，与不含载体mAB的对照组相比，当用具有依鲁替尼-Cy3.5的利妥昔单抗-鱼精蛋白/鱼精蛋白处理时，高CD20表达的HBL-1细胞仅形成30％的集落。相对地，未缀合的利妥昔单抗对集落生长仅具有温和的作用。另外，在高EGFR表达但低CD20表达的A549 NSCLC细胞中(图53B)，西妥昔单抗载体的表现显著优于利妥昔单抗载体，这揭示了如预期的受体特异性摄取机制。
如从我们的抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/siRNA缀合实验的结果所见，我们假设αCD20-mAB-鱼精蛋白-依鲁替尼-Cy3.5-鱼精蛋白加合物中未结合的/游离鱼精蛋白-SMCC的存在可能与其在siRNA加合物中的存在一样重要，因此我们如前所述通过亲和色谱从利妥昔单抗-αCD20mAB制剂中耗竭了游离鱼精蛋白-SMCC。如所预期的，耗竭的制剂(图54A，级分25)不能以与含鱼精蛋白-SMCC的制剂(图54B，右)相同的程度结合和配位聚阴离子依鲁替尼-Cy3.5(图54B，左)。与游离鱼精蛋白-SMCC耗竭后的αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC复合物相当，不含游离鱼精蛋白-SMCC的CD20-mAB-P在与依鲁替尼-Cy3.5复合时不能抑制集落形成(图54C)。
实施例20：在体内抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC与依鲁替尼-Cy3.5形成复合物的分析
为了进一步表征利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5载体与所有必需组分对照相比的体内治疗功效，我们如所描绘(参见图55A)的进行了体内治疗实验。为此，我们将107个HBL-1DLBCL-细胞皮下移植到免疫缺陷NSG小鼠中，观察到肿瘤生长达到200mm3的平均尺寸，将小鼠分为每组十只小鼠的组，并开始用4mg/kg体重的标准浓度进行治疗，该标准浓度是针对利妥昔单抗计算的，对应于0.625nmol利妥昔单抗缀合物/单剂量，利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5(1:20)对应于0.625nmol利妥昔单抗缀合物/单剂量加18μg或12.5nmol依鲁替尼-Cy3.5，以及等量的未配位的依鲁替尼(12.5nmol)和依鲁替尼-Cy3.5(12.5nmol)，进一步通过PBS对照。使用依鲁替尼-Cy3.5的治疗显示对肿瘤生长没有治疗效果，而与所有其它组相比，施用等量的结合到利妥昔单抗-鱼精蛋白载体中的依鲁替尼-Cy3.5产生显著更慢的肿瘤生长(图55C)。这一结果也适用于动物的存活分析(图55B)。
因此，与所有合适的组分对照相比，利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5 1:20复合物在体内模型中显示出显著优异的靶向和治疗特性。此外，施用的依鲁替尼的单剂量在二十倍更低的范围内(12.5nmol依鲁替尼对应于0.720mg/kg小鼠，在Nod-SCID小鼠中标准剂量为12mg/kg(Chen等，2016；Zhang等，2017)。
为了证明这种假设，我们从处死的小鼠中制备器官，并使这些器官经受引入的依鲁替尼-Cy3.5的离体荧光检测(图56)。结果，来自利妥昔单抗-鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5治疗的小鼠的肿瘤显示Cy3.5-来源的荧光信号的显著积累，该种积累随处理周期增加而增加。与该发现相对地，在来自给予利妥昔单抗非配位的依鲁替尼-Cy3.5治疗的小鼠的肿瘤中很少存在可检测的信号(图56)，而在该组中，存在在大多数器官中看到的扩散背景信号的趋势(图57)。
此外，在分析的器官中没有检测到特异性荧光(图57)。我们得出结论，利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC/依鲁替尼-Cy3.5缀合物在CD20-阳性肿瘤中特异性富集。
实施例21：通过抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-siRNA和/或依鲁替尼-Cy3.5复合物在体外形成囊泡结构
为了进一步表征新的纳米结构，我们使用带静电荷的绿色荧光siRNA和红色荧光依鲁替尼-Cy3.5，并将其与抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC缀合物复合(图58-图60)。
在检查含有和不含另外的siRNA的mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/依鲁替尼-Cy3.5-缀合物的无细胞组装结果期间，我们观察到相应纳米结构在数量和尺寸上的显著差异：与不含siRNA的纳米结构相比，通过由mAB-鱼精蛋白复合的siRNA和依鲁替尼-Cy3.5+游离鱼精蛋白-SMCC组装的那些纳米结构大得多并且更频密(图58C和F以及图59D和H)。我们通过由形成稳定纳米结构的所有4种组分组成的混合颗粒的假设来解释这种现象。在详细的荧光显微照片中，最大颗粒的纳米结构可显示出siRNA形成球体胶束边界(图60，A和C)，而依鲁替尼-Cy3.5填充该纳米结构更多的内腔(图60B和D)。
在使用αCD20-mAB利妥昔单抗(图60C-D)和抗-EGFR-mAB西妥昔单抗(图60A和B)作为载体抗体时均可以看到这种混合的抗体-鱼精蛋白颗粒比单独的依鲁替尼-Cy3.5与mAB-鱼精蛋白/鱼精蛋白载体复合的那些颗粒更频密且大得多的现象。
这意味着带负电荷的依鲁替尼-Cy3.5可与抗体-鱼精蛋白复合物形成小囊泡(图58E和图59F)，但作为线性的且高度带负电荷的分子siRNA可作为一种在抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC复合物之间的静电“胶”。这可以在看起来填充有红色荧光依鲁替尼-Cy3.5的异常大的囊泡中观察到圆形闪光(图60)。
为了进一步表征该结构，我们使用纳米颗粒示踪视频显微镜进行了颗粒尺寸的测量。在此，检测1-1000nm的颗粒并分析它们的尺寸和数量(图61)。我们在复合物形成开始后1小时通过分别加入对照(scr)-siRNA、依鲁替尼-Cy3.5或它们两者来检测稳定性和最大的颗粒(图61A、B、C、D)。使用等量的不含抗体的鱼精蛋白-SMCC(＝1800nM＝如用于偶联60nM抗-CD20-mAB的30x摩尔比)形成恒定更小的颗粒(图61A，下方小图和图61E)。有趣的是，由于技术限制，如图60所示在Zetaview数据中没有观察到非常大的混合颗粒的形成。
实施例22：阴离子小分子药物与载体-抗体-鱼精蛋白融合物或抗体-鱼精蛋白缀合物的复合
关于阴离子小分子的复合，我们发现在条带转移分析中，使用高达1:2的不同比例的αCD20-mAB-鱼精蛋白和依鲁替尼-Alexa488，αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(αCD20-mAB-P/P)缀合物结合依鲁替尼-Alexa488。α，抗。(图62，A)：由于Alexa488分子的-2的有限阴离子电荷(图62，B)，发现聚阳离子鱼精蛋白融合物和Alexa488之间的相互作用不如与具有-4的净电荷的Cy 3.5(下一个实施例)的相互作用强烈。因此，使用Alexa488-缀合的依鲁替尼和鱼精蛋白缀合物，实现了仅2:1的偶联比。然而，依鲁替尼-Alexa488与αCD20-mAB利妥昔单抗-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-SMCC(αCD20-mAB-P/P)的复合仍然成功。
稳定纳米颗粒形式的抗体-抑制剂-复合物的构建可以在荧光显微镜检查中检测(图62C-H)，该种纳米颗粒在如公开的其他纳米颗粒的条件下在血清中是稳定的(图62E，G，F，H)。重要的是，由于依鲁替尼-Cy 3.5可通过荧光检测，这为所有下游应用带来了优异的示踪能力。
当体外温育时，负载依鲁替尼-Cy 3.5的αCD20-mAB-P/P导致静电稳定的纳米颗粒的组装，暴露出红色Cy 3.5荧光(图65)。在荧光显微镜检查中，首先检测到规则形状的囊泡结构(图62C，D)，随后检测到大于2μm的不规则形状的聚集体以及较小的颗粒，如果使用未修饰的αCD20-mAB来复合依鲁替尼-Cy 3.5，或使用修饰的αCD20-mAB-P/游离鱼精蛋白来复合疏水性依鲁替尼(商品名：Imbruvica)(未示出)，则观察不到该过程。在电子显微镜(图65C)中也验证了在光学显微镜中观察到的静电颗粒(图65A和B)，其中检测到大量＜100-200nm的较小颗粒(图65C)，这诱导我们选择术语“纳米”载体。
关于阴离子带电小分子与不带电小分子在与鱼精蛋白缀合物的复合方面的比较，我们发现带电依鲁替尼-Cy 3.5而非不带电的依鲁替尼(商品名：Imbruvica)与鱼精蛋白缀合的mAb形成稳定的纳米颗粒。与鱼精蛋白缀合的相应抗体载体负载带电荷的依鲁替尼-Cy3.5与不带电荷的依鲁替尼。值得注意的是，仅与Cy 3.5缀合的那些依鲁替尼样品显示了纳米颗粒的致密形成，而不带电的依鲁替尼则不能形成纳米颗粒(图63)，表明聚-阴离子净电荷以及聚阴离子的某些结构对于与鱼精蛋白的适当静电相互作用是重要的。
实施例23：提出的模型
总之，通过由抗体-鱼精蛋白加上未结合的鱼精蛋白组成的载体结合阴离子货物分子的原理也可应用于除siRNA-核酸以外的货物，比如小分子，如激酶抑制剂依鲁替尼。这里，修饰货物分子以使其具有聚阴离子特性，并在制备过程中保留未结合的鱼精蛋白-SMCC，以使各组分能够强静电自组装成纳米结构。
这种观察结果有力地支持了新的和无法预期的大分子纳米结构负责我们的载体系统的体外和体内药效学效力。
因此，我们预期组分1.抗体-鱼精蛋白，2.siRNA/阴离子小分子和3.未结合的鱼精蛋白(-SMCC)的组合形成纳米颗粒样宏观结构，该纳米颗粒样宏观结构负责siRNA的稳定性并可有效地将siRNA和/或阴离子小分子抑制剂递送至预期细胞，这是完全无法预期的观察结果。该种组装的纳米结构的理想化模型示于图64中。
总之，使用最小共同点要求是聚阴离子的并且没有其他结构相似性的各种化学上不同的效应子有效载荷的实验为我们的新的和不可预期的纳米结构模型提供了实验证据，该模型是我们的纳米载体-siRNA载体和我们的纳米载体-依鲁替尼-Cy 3.5系统的体外和体内药效学特征的基础。
这种具有双重特异性的模块纳米结构系统可以用于包括癌症在内的各种疾病群体，所述双重特异性为1.对于siRNA/阴离子小分子转运和向靶细胞的特异性递送具有特异性，和2.对于特异性细胞内致癌基因失活或药理活性具有特异性。
实施例24：αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5纳米载体的体外功能分析
接下来，研究了该αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5纳米载体在不同细胞模型系统中的功效。
首先，通过Cy 3.5荧光检测向CD20-阳性DLBCL细胞的内化。用未偶联的依鲁替尼-Cy 3.5处理过夜的HBL1和TMD-8淋巴瘤细胞显示出良好的细胞红色荧光标记(图66E中的白色)，当用αCD20-mAB-P/P复合并转运依鲁替尼-Cy 3.5时，该标记增强(图66F)。这表明了相对于没有载体抗体安装(implementation)的依鲁替尼-Cy 3.5阴离子的非靶向摄取机制，经由CD20受体的内化的有益过程(图66E)。接下来，用缀合物处理细胞72小时，在SDS PAGE电泳中显示了一条70kDa蛋白质的共价Cy 3.5标记的单一条带，这表明了修饰的依鲁替尼-Cy 3.5化合物的结合和功能性(图66G)。对于BTK的荧光检测，凝胶必须严重过载，以显示相等的泳道上样和BTK的识别，因此接下来我们在荧光检测后印迹凝胶以免疫检测BTK。实际上，代表BTK的条带出现在与Cy 3.5荧光中所见的相同位置，这表明如所预期的依鲁替尼-Cy 3.5仅共价结合BTK(图66G)。
此外，将HBL1细胞与依鲁替尼-氟硼吡咯温育2小时，洗涤并用αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5处理。细胞掺入依鲁替尼-氟硼吡咯(图66N和P)，但Cy 3.5荧光仅在未预处理的细胞中出现(图66L)，而在用依鲁替尼-氟硼吡咯预处理的细胞中未出现(图66P)。一些亚细胞红囊泡表明CD20介导的依鲁替尼-Cy 3.5的内化(图66P)，但未出现暗示BTK结合的模式(依鲁替尼-Cy 3.5参见图66L，依鲁替尼-氟硼吡咯参见图66N和P)。在αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5处理24小时后并用非荧光依鲁替尼预温育并洗掉后也是如此。
依鲁替尼共价靶向BTK的功能性作用是BTK自磷酸化能力的抑制。因此，分析了在αCD20-mAB/P/P纳米载体中有和没有复合的依鲁替尼-Cy3.5处理后DLBCL细胞中BTK的磷酸化状态(图67A)。用PBS、未复合的依鲁替尼-Cy 3.5和αCD20-mAB-P/P/依鲁替尼-Cy 3.5复合物处理细胞72小时，将细胞裂解并进行免疫印迹分析。我们发现，无论其是否复合，用依鲁替尼-Cy 3.5处理后，在HBL1(图67A，左侧小图)和TMD8细胞(数据未显示)中，通过特异性磷酸-BTK-抗体检测的BTK在酪氨酸223的磷酸化显著降低。这与图66G中所示的其与BTK的结合一致。总BTK的表达受到轻微影响(图67A)。我们推断，合成的依鲁替尼-Cy 3.5缀合物在结合靶标分子BTK以及灭活BTK自磷酸化方面保留了全部功能。
有趣的是，在所有测试的淋巴瘤细胞系中，淋巴瘤特异性αCD20-mAB-P/P/ibru-Cy3.5纳米载体系统显著抑制软琼脂培养物中的集落生长。对于作为单一药剂的依鲁替尼或依鲁替尼-Cy 3.5，观察到这种情况的程度低得多，而如果使用未修饰的利妥昔单抗(αCD20-mAB)则观察不到这种情况(HBL1：图67B)。这种集落分析用于对非贴壁依赖性克隆细胞生长进行定量，并且是体内致瘤性的标准体外替代品。因此，我们认为，只有当阴离子化合物被组装到由阳离子αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白载体复合物和阴离子货物效应子组成的稳定的静电纳米颗粒中时，才能看到依鲁替尼-Cy 3.5的稳健的治疗效果。
接下来，探究了在DLBCL细胞系上通过αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5的BTK失活在诱导凋亡方面的功能性后果。在此，在HBL1(图68)以及TMD8细胞(数据未显示)中，αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5处理提供了优异的凋亡信号诱导(图68，最右边的柱)，而与靶向处理以及游离的依鲁替尼处理相比，未复合的依鲁替尼-Cy 3.5处理仅显示了轻微(mild)的作用。因此，假定αCD20-mAB-P/P-依鲁替尼-Cy 3.5的靶向处理导致活性依鲁替尼-Cy 3.5在细胞中的积累，并因此导致比未复合的依鲁替尼-Cy 3.5更严重的凋亡诱导。另外，如果未复合，则阴离子分子依鲁替尼-Cy 3.5作为疏水性游离依鲁替尼对细胞的可及性较低或至少对细胞的有效性较低，这通过与游离依鲁替尼相比诱导凋亡较低来判断。
实施例25：通过采用αIGF1R-mAB-鱼精蛋白-siRNA-鱼精蛋白纳米载体的系统治疗在敲低致癌EWS-FLI1易位产物后，尤文肉瘤异种移植肿瘤生长受到抑制。
为了测试替替妥木单抗-鱼精蛋白纳米载体的体内功效，将107个人SK-N-MC细胞皮下(s.c.)异种移植到CD1裸鼠的侧腹，并通过腹膜内注射用PBS或与混杂的对照-siRNA复合的αIGF1R-mAB-P/P或与上述EWS-FLI1-siRNA复合的αIGF1R-mAB-P/P处理至少7只小鼠的组(图69A-C)。当肿瘤达到100-150mm3的平均尺寸时开始治疗。当与两个对照组比较时，由Tepro-mAB-P/EWS-FLI1-siRNA/P纳米颗粒获得的治疗组中的肿瘤显示显著的和几乎完全的生长抑制(图69B和C)。这表明在系统体内应用后，通过Tepro-mAB-P/siRNA/P纳米颗粒敲低EWS-FLI1是成功的。
实施例26：由载体抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白和siRNA形成的纳米颗粒暴露几乎中性的表面电荷。
发现由抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白加siRNA形成纳米颗粒是快速的和可再现的，但取决于抗体制剂。例如，通过DLS分析(图70)和显微镜分析可见，与由αEGFR-鱼精蛋白制剂或αCD33制剂形成的那些纳米颗粒，不同的α-IGFR-鱼精蛋白制剂倾向于形成更大的颗粒。其次，表面电荷仅在弱阴离子范围内轻微变化，暴露几乎中性带电的颗粒。由此可以得出抗体本身的性质以及阴离子和阳离子组分的静电平衡决定了纳米颗粒在尺寸和表面电荷方面的属性。
实施例27：破译抗-EGFR-mAB-SMCC-鱼精蛋白缀合物、游离SMCC-鱼精蛋白和siRNA之间的有效纳米颗粒形成的先决条件。
此外，还评估了siRNA是否是形成囊泡所必需的。将恒定量的具有恒定32x游离SMCC-鱼精蛋白的αEGFR-mAB-P用不同量的Alexa488对照-siRNA温育(图71A-G，上方小图中为绿色荧光，下方小图中为相差)。值得注意的是，采用为抗体5-10倍的siRNA的最佳摩尔过量有效地形成纳米颗粒(图71D-E)。
实施例28：由αEGFR-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白游离鱼精蛋白-Alexa488-siRNA形成的纳米颗粒在含血清条件下是稳定的。
对于靶向纳米颗粒的系统性治疗应用，其在各种挑战性条件下的稳定性是最重要的，否则活性物质将通过解体与纳米载体分离。在此，测试αEGFR-mAB-鱼精蛋白、游离鱼精蛋白和Alexa488-siRNA在高浓度牛血清白蛋白中的稳定性，结果证明纳米载体甚至在24小时后也是稳定的(图72B)。
实施例29：αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离P-依鲁替尼-Cy 3.5纳米载体的血清稳定性。
稳定纳米颗粒形式的αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离P-依鲁替尼-Cy3.5抗体-抑制剂复合物的构建可以在荧光显微镜检查中检测到(图73A-F)，该纳米颗粒在血清中稳定24小时(图73B-C)和甚至72小时(图73E-F)。
实施例30：用三种不同的靶向抗体构建的siRNA纳米载体的pH稳定性。
对于纳米载体的系统应用，在何种pH条件下该结构是稳定的是重要的，以便防止配位的siRNA效应分子的过早解组装和损失。这里，我们在标准条件下采用三种不同靶向抗体与siRNA形成了siRNA纳米载体，并在pH 4.8-8.0的pH条件下测试了它们的完整性(图74)，该pH范围涵盖了治疗应用期间纳米载体可能受到挑战的所有pH条件。结果表明，通过复合的siRNA的Alexa488荧光判断，纳米载体在5.2-8.0的pH条件下是稳定的，在较低pH下具有形成较大超结构的结构趋势。
实施例31：用αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白和依鲁替尼-Cy3.5构建的纳米载体的pH稳定性。
这里，在标准条件下用αCD20-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白形成依鲁替尼-Cy3.5纳米载体，并在pH 4.8-8.0的pH条件下测试了它们的完整性，该pH范围涵盖了治疗应用期间纳米载体可能受到挑战的所有pH条件(图75)。结果表明，通过复合的依鲁替尼-Cy3.5的Cy3.5荧光判断，纳米载体在5.8-8.0的pH条件下是稳定的，在较低pH下具有解体的结构趋势。
实施例32：αEGFR-mAB-P/游离鱼精蛋白-siRNA纳米载体中和αIGF1R-mAB-P/游离鱼精蛋白siRNA纳米载体中的靶向IgG抗体的免疫标记。
阳离子抗体-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白制剂和siRNA的自组装过程导致具有所定义构造的纳米颗粒结构：在此，将αEGFR-mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白-siRNA纳米颗粒(图76)和αIGF1R(替妥木单抗)mAB-鱼精蛋白/游离鱼精蛋白/siRNA纳米颗粒(图77)进行人IgG信号的免疫检测。使用α-人IgG-Alexa647观察纳米载体中人IgG的位置和取向，其仅在纳米颗粒胶束结构的外缘暴露信号(图76B和77B)，而在内腔中不暴露信号。相对地，在结构的内腔中发现了荧光标记的siRNA的信号(图76A和77A)。因此，可以得出结论，大体积的IgG分子朝向纳米颗粒胶束的外部，因此必须确定地接近它们的蛋白质靶标，细胞表面分子的胞外结构域和受体酪氨酸激酶。
实施例33：纳米载体复合物中游离鱼精蛋白的可视化
目前为止，重要的游离鱼精蛋白在纳米载体中的位置尚不清楚，因此我们针对这一点，用缀合至Cy-NHS酯的鱼精蛋白替换αEGFR-鱼精蛋白制剂中的游离鱼精蛋白(图78A)，并将其与非荧光siRNA组合形成纳米载体结构(图78B)。然后对纳米载体进行荧光显微镜检查，并显示染色图，其中鱼精蛋白-Cy3位于纳米载体的内腔中(图78C-E)，而用抗-人IgG-Alexa647染色的IgG部分位于纳米载体的边缘部分(图78E-F)。
实施例34：缀合有花青染料的抑制剂吉非替尼、吉西他滨和维奈托克的合成。
为此，进行三种新化合物的合成，每种化合物与两种不同的花青染料磺基-Cy3.5TM(激发591nm/发射604nm)和磺基-Cy5.5TM(ex 684nm，em 710nm)连接。两种花青染料共享相同的核心荧光团结构，其显示出鱼精蛋白阳离子肽配位所必需的四个强阴离子磺酰基，但仅在共轭双键的数目上不同，从而导致可辨别的荧光染料属性。与依鲁替尼类似，将合成三种不同的药物-染料-缀合物，它们的总体分子形状相当。将吉非替尼(EGFR抑制剂)、吉西他滨(细胞抑制药物)和维奈托克(BLCL-2抑制剂)选择作为可能的候选物，因为在所有情况下，它们在与染料缀合后保留了它们与靶标分子的结合效力，并且允许荧光成像应用(Wu等，2020；Zhu等，2018；Gonzales等，2018)。通过安装PEG4-间隔并使用商购可获得的反应性NHS-酯或叠氮官能化染料而使它们与花青染料缀合(参见图79)。
首先，从商购可获得的吉非替尼1开始，其其脱甲基化，并且使所得的苯酚通过叠氮基-PEG4-甲磺酸酯的亲核攻击而转化，从而合成吉非替尼类似物。将得到的叠氮化物还原为胺2，并用磺基-Cy3.5或磺基-Cy5.5标记，产生用于进一步复合到纳米载体中的吉非替尼-缀合物。
对于吉西他滨3，羟基将被保护，离去基团将被安装在胞嘧啶上，以在炔丙基胺的亲核攻击后得到炔4。(Solanki等，2020)。在通过点击反应用相应的叠氮基官能化的花青染料标记后，将获得所需的缀合物。
就第三个实例维奈托克而言，它将从已知的维奈托克核心结构5的合成开始。(Giedt等，2014)。使用已经提及的甲磺酰基-PEG4-叠氮化物在三个步骤中得到磺酰胺6，并且在将甲磺酰基-PEG4-叠氮化物连接至5、还原叠氮化物和随后用花青染料(NHS-酯)标记后，产生用于进一步评价的相应维奈托克缀合物。
实施例35：将该概念延伸到更容易和更廉价的聚阴离子分子部分，以及诸如PDT和放射疗法的其它治疗干预中。
经过对静电结合原理与具有不同结合基序和靶标的其它抗癌药物进行转换和评价之后，旨在将来自这里使用的花青染料的必需阴离子特征(对于初始光学表征和荧光成像是重要的)改变为(1)就更容易和更便宜的合成而言更容易接近的静电连接子，以便于转化为临床评估。此类静电连接子的候选物是多磺酸单糖、双糖和支链低聚糖或单-、双-和三磷酸酯，这可以为大规模合成铺平道路(图80)。
本文说明性地描述的发明可适当地在缺少在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实施。此外，将本文使用的术语和表达用作描述的而非限制的术语，并且在使用这些术语和表述时，并不意图排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到，在本发明请求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过示例性实施方案和任选特征具体说明了本发明，但是本领域技术人员可以寻求本文公开的体现在本发明中的修改和变化，并且认为这样的修改和变化落入本发明的范围内。
本文已经广泛地且属类地描述了发明。每一个较窄的种类和落入一般公开范围亚属组都构成本发明的一部分。这包括用附加条件或从该属中除去任何主题的负面限制的本发明的一般描述，无论去除的材料是否是本发明具体描述的一部分。
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序列表
<110> S·鲍默;N·鲍默;W·贝尔戴尔;G·伦兹;L·维特曼
<120> 静电纳米颗粒及其用途
<130> LC23310007P
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗CDR-H1
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗CDR-H2
<400> 2
Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr
1 5
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗CDR-H3
<400> 3
Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗CDR-L1
<400> 4
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗CDR-L3
<400> 5
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗VH
<400> 6
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗VL
<400> 7
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 8
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链
<400> 8
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链
<400> 9
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
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<220>
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<400> 10
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗CDR-H2
<400> 11
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗CDR-H3
<400> 12
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗CDR-L1
<400> 13
Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser
1 5
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗VH
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗VL
<400> 16
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗重链
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 18
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗轻链
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-H1
<400> 19
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-H2
<400> 20
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-H3
<400> 21
Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Met Asp Val
20
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-L1
<400> 22
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-L2
<400> 23
Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗CDR-L3
<400> 24
Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val
1 5 10
<210> 25
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗VH
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗VL
<400> 26
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His
85 90 95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 27
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗重链
<400> 27
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln
115 120 125
Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 28
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥木单抗轻链
<400> 28
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
20 25 30
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser
100 105 110
Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
225 230
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-H1
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-H2
<400> 30
Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-H3
<400> 31
Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-L1
<400> 32
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-L2
<400> 33
Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗CDR-L3
<400> 34
Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗VH
<400> 35
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Ser Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗VL
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys
100 105
<210> 37
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗重链
<400> 37
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 38
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替妥木单抗轻链
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单CDR-H1
<400> 39
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单CDR-H2
<400> 40
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单CDR-H3
<400> 41
Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
1 5 10 15
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单CDR-L1
<400> 42
Ser Ser Val Ser Tyr Ile
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单CDR-L3
<400> 43
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单VH
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 45
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单VL
<400> 45
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单重链
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 47
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单轻链
<400> 47
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合致癌基因PAX3- 叉头
<400> 48
tggcctctca cctcagaatt caattcgtc 29
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 49
ggcctctcac ctcagaattc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 50
gcctctcacc tcagaattca 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 51
cctctcacct cagaattcaa 20
<210> 52
<211> 102
<212> DNA
<213> 秋鲑
<400> 52
atgcccagaa gacgcagatc ctccagccga cctgtccgca ggcgccgccg ccctagggtg 60
tcccgacgtc gtcgcaggag aggaggccgc aggaggcgtt ag 102
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 秋鲑
<400> 53
Met Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg
20 25 30
Arg
<210> 54
<211> 153
<212> DNA
<213> 人
<400> 54
atggccaggt acagatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagacaa 60
agaagtcgca gacgaaggag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gaggtgctgc 120
cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cac 153
<210> 55
<211> 51
<212> PRT
<213> 人
<400> 55
Met Ala Arg Tyr Arg Cys Cys Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr
1 5 10 15
Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Cys Gln Thr
20 25 30
Arg Arg Arg Ala Met Arg Cys Cys Arg Pro Arg Tyr Arg Pro Arg Cys
35 40 45
Arg Arg His
50
<210> 56
<211> 130
<212> PRT
<213> 人
<400> 56
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val Arg
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130
<210> 57
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人组蛋白H2衍生肽
<400> 57
Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Lys Gly
35
<210> 58
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人组蛋白H2衍生肽
<400> 58
Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
20 25 30
Leu Arg Lys Trp
35
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 59
uucugcuugu gacauuaaaa a 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 60
aaacuuggcu gaaguuuaaa a 21
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 61
ugaauucuga ggugagaggc tt 22
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 62
ggcagcagaa cccuucuuau u 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 63
acacaaacuu gaacagcuat t 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 64
gaaauguucu ugcaguuaat t 21
<210> 65
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 吉妥单抗重链 2
<400> 65
Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225 230 235 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465

Claims (15)

1.一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括
c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及
d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)之前，所述方法包括：
a)将带正电荷的多肽与双官能连接子缀合；
b)移除未缀合的双官能连接子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，所述第一缀合物(A)与所述抗体之间的摩尔比为至少约10:1。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述带正电荷的多肽与所述第二缀合物(B)之间的摩尔比为至少约10:1。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体对细胞表面分子具有特异性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子为核酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的多肽是鱼精蛋白或组蛋白。
8.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒通过前述权利要求中任一项所述的方法可获得。
9.一种纳米颗粒，其包含：
a)带正电荷的多肽；
b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；以及
c)一种或多种带负电荷的分子。
10.根据权利要求8或9所述的纳米颗粒，其中所述第二缀合物富集在所述纳米颗粒的外部部分中。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种带负电荷的分子富集在所述纳米颗粒的内部部分中。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有约0.05μm至约10μm的平均直径。
13.一种组合物，其包含权利要求8-12中任一项所述的纳米颗粒。
14.根据权利要求8-12中任一项所述的纳米颗粒或权利要求13所述的组合物，其用于治疗中。
15.一种试剂盒，其包含权利要求8-12中任一项所述的纳米颗粒或权利要求13所述的组合物。
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