KR20220087736A

KR20220087736A - 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출 방법

Info

Publication number: KR20220087736A
Application number: KR1020200178085A
Authority: KR
Inventors: 서보윤; 정인홍; 박부용; 조점래; 이관석; 정진교
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-06-27
Also published as: KR102487657B1

Abstract

본 발명은 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출용 키트 및 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로 5종의 옥수수 가해 밤나방 중 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출용 키트 및 검출 방법에 관한 것으로, 뒷흰가는줄무늬밤나방을 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출 방법{Primer set for detecting Mythimna loreyi and detection method using the same}

본 발명은 뒷흰가는줄무늬밤나방(Mythimna loreyi)을 검출하기 위한 프라이머 세트, 키트, 조성물 및 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 다른 유사 옥수수 가해 나방류들과 구별하여 뒷흰가는줄무늬밤나방(Mythimna loreyi)을 검출하기 위한 프라이머 세트, 키트, 조성물 및 검출 방법에 관한 것이다.

옥수수는 벼과에 속하는 한해살이 식물로서, 중앙아메리카에서 북쪽으로는 캐나다, 남쪽으로는 아르헨티나까지 전파되어 종류와 품종이 다양하게 분화되었으며 오늘날에는 전 세계적으로 널리 재배되고 있는 작물이다. 국내에서는 과거 쌀이나 보리를 재배하지 못하는 산간 지대에서 식량 대용으로 재배하기 시작하였으나, 1970년대에 축산업 및 가공산업의 발달과 함께 옥수수의 알곡 수요량이 증가하면서 옥수수를 재배하는 면적이 점차 증가하는 추세이며, 특히 최근에 초등학생을 비롯한 젊은 층이 단옥수수를 선호하는 현상이 발생하면서 옥수수 재배가 증가하고 있다.

국내에서 옥수수 가해 나방류 해충으로 보고되고 있는 해충들은 포충나방과(Crambidae)의 조명나방(Ostrinia furnacalis), 밤나방과(Noctuidae)의 멸강나방(Mythimna separata), 왕담배나방(Helicoverpa armigera), 거세미나방류(Agrotis spp.), 파밤나방(Spodoptera exigua), 그리고 최근에는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda)과 뒷흰가는줄무늬밤나방(Mythimna loreyi)이 보고되고 있다. 이 중에서도 뒷흰가는줄무늬밤나방은 벼와 밀, 보리, 사탕수수, 옥수수 등에 대한 해충으로 알려져 있으며, 아프리카, 호주, 극동 및 중동 아시아 지역에 분포하고 있는데, 국내에서 연중 4회 성충 발생을 하는 것으로 예상하고 있으나, 옥수수의 포장 등에서는 발생과 휴면 등 월동에 관한 연구가 전혀 진행되지 않았다.

일본에서는 뒷흰가는줄무늬밤나방이 유사종인 멸강나방과 함께 자주 발견된다고 보고되고 있으며, 중국에서도 최근에 멸강나방과 함께 발생해 피해를 주고 있는 상황이며, 18-30℃의 넓은 온도 범위에서 발육, 생식 등 생존이 가능한 것으로 알려져 그 피해가 늘어나고 있는 실정이다. 현재 뒷흰가는줄무늬밤나방 성충 포획용 성페로몬 트랩이 개발되어 있으나 트랩에 함께 포획되는 유사한 나방류와 구별이 필요하고 더욱이 국내의 옥수수 포장에서 함께 발생하는 다른 옥수수 가해 나방류와 알, 유충 단계에서의 구별이 매우 필요하다. 따라서 뒷흰가는줄무늬밤나방에 대한 기주식물 및 생활사 등의 생태 연구와 예찰 및 방제 기술 개발을 위해서 뒷흰가는줄무늬밤나방의 모든 발육 단계를 조기에 검출할 수 있는 프라이머와 검출 방법 등의 발굴이 절실한 실정이다.

상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 뒷흰가는줄무늬밤나방을 특이적으로 검출해낼 수 있는 프라이머를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 본 발명의 프라이머를 활용하는 경우, 뒷흰가는줄무늬밤나방과 유사한 옥수수 가해 나방류 중에서 뒷흰가는줄무늬밤나방을 특이적으로 검출해낼 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 방법은 제한효소 절편길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism; RFLP), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트는 알 및 유충 상태일 때 구별이 힘든 옥수수 가해 나방류 중 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출해 낼 수 있다는 사실을 확인한바, 아직 구체적인 생활사 및 기주식물이 밝혀지지 않은 뒷흰가는줄무늬밤나방의 특성을 판단하여 농업 현장에서 필요한 예찰과 방제 대책을 세우는 데에 도움이 될 것으로 기대된다.

단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 옥수수 가해 나방류 4종과의 비교를 통해 확인한 뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적인 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 PCR 증폭 후 전기영동을 통해 본 발명의 프라이머 세트가 뒷흰가는줄무늬밤나방의 DNA만 특이적으로 증폭할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 PCR 증폭을 수행한 것으로서, 뒷흰가는줄무늬밤나방(M. loreyi, Ml)과 멸강나방(M. separata, Ms), 파밤나방(S. exigua, Se), 열대거세미나방(S. frugiperda, Sf) 및 조명나방(O. furnacalis, Os)의 PCR 결과를 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 증폭한 뒷흰가는줄무늬밤나방의 DNA에 Taq1을 활용한 PCR-RFLP를 수행한 결과이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 증폭한 뒷흰가는줄무늬밤나방의 DNA에 Vsp1을 활용한 PCR-RFLP를 수행한 결과이다.

본 발명자들은 본 발명의 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트는 알 및 유충 상태일 때 구별이 힘든 옥수수 가해 나방류 중 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출해 낼 수 있다는 사실을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 뒷흰가는줄무늬밤나방(M. loreyi)은 밤나방과(Noctuidae)에 속하는 옥수수 가해 나방 중 하나로서, 벼, 밀, 사탕수수, 옥수수 등에 대한 해충이며, 18-30℃의 넓은 온도 범위에서 발육, 생식 등 생존이 가능하나, 현재 구체적인 생활사 등을 밝혀지지 않았다.

본 발명에 있어서 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA/RNA 증폭을 개시할 수 있다.

본 발명에 따른 뒷흰가는줄무늬밤나방 진단용 프라이머 세트는 뒷흰가는줄무늬밤나방에 대한 종 특이적 RNA 증폭을 유발하기 위해 개발되었다. 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단 대상이 되는 종의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 종내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 본 발명의 프라이머는 유사 종의 핵산에 대해 비특이적인 산물을 생산하는 일반적인 프라이머와 달리 종 특이적으로서 뒷흰가는줄무늬밤나방을 특이적으로 진단하기 위해 사용된다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물은 RNA 증폭 반응, 예를 들어 RT-PCR을 수행하기에 필요한 시약, 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온 등 통상적인 RNA 증폭 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트(kit)를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 상술한 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물에 포함되어 제공될 수 있다.

본 발명의 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트는 증폭 반응(역전사도 포함)을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명의 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트는 검출용 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 검출용 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출할 수 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 프라이머 세트를 활용하는 경우 뒷흰가는줄무늬밤나방만의 DNA가 증폭된다는 사실을 확인하여 특이적으로 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출할 수 있다는 사실을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 프라이머 세트에 제한효소를 첨가하는 경우 예상되는 절편 사이즈를 예측한 다음, 실제로 제한효소인 Taq1과 Vsp1을 처리하여 RFLP를 통해 절편 크기를 확인한 결과, 예상했던 절편과 동일한 사이즈를 가지는 것을 확인하여 본 발명의 프라이머 세트가 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출할 수 있다는 사실을 재확인하였다(실시예 3 참조).

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하는 경우, 알 및 유충단계에서는 분간하기 힘든 옥수수 가해 나방류들 중에서 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출할 수 있고, 검출된 뒷흰가는줄무늬밤나방의 생활사 및 기주식물을 분석하여 구체적인 방제대책을 수립할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검출하는 방법은 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계(1단계), 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계(2단계), 및 상기 수득한 산물을 분석하여 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출해 내는 단계(3단계)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 제한효소 절편길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism; RFLP), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 또는 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)일 수 있으며, 바람직하게는 제한효소 절편길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism; RFLP)일 수 있다.

일례로, RT-PCR을 하는 경우 1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg²⁺가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg²⁺가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-75℃이며, 보다 바람직하게는 55~72℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.

상기 1단계에서 DNA 또는 RNA 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 3단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABIprism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 2단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적 프라이머의 제조

뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적으로 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 제조하기 위해 옥수수 가해 나방류 5종(뒷흰가는줄무늬밤나방, 명강나방, 열대거세미나방, 파밤나방, 조명나방)의 미토콘드리아 시토크롬 옥시다제1(CO1 영역 DNA 정보를 분석하여 뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적 프라이머 위치를 확인하여 도 1에 나타내었으며, 이러한 결과를 토대로 하여, 프라이머 후보들을 제작한 다음, DNA 증폭효과를 확인하였으며, 옥수수 가해 나방류의 DNA 증폭 여부를 확인하여, 뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적 프라이머를 최종 선발하였고, 본 발명의 발명자들이 최종적으로 선발한 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

Target Species	Primer	Direction	Primer sequence (5'-3')	Length (bp)	PCR product size (bp)
Mythimna loreyi (뒷흰가는줄무늬밤나방)	*M.loreyi_mtF1*	Forward	GGATTTGGTAATTGACTTGTT	21	245
Mythimna loreyi (뒷흰가는줄무늬밤나방)	*M.loreyi_mtR1*	Reverse	ATAGAAGAAATACCAGCAAG	20	245

실시예 2. 프라이머 세트를 이용한 뒷흰가는줄무늬밤나방 DNA 증폭 확인

상기 실시예 1에서 제조한 프라이머 세트를 이용하여 뒷흰가는줄무늬밤나방의 DNA 증폭 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 우선 옥수수 가해 나방류 5종(뒷흰가는줄무늬밤나방, 멸강나방, 열대거세미나방, 파밤나방, 조명나방)의 Genomic DNA를 추출한 다음, 하기 표 2의 순서대로 각각 PCR 반응액과 혼합하였다.

성분		부피(㎕)
반응버퍼(2X)		10.0
프라이머	*M.loreyi_mtF1*	1.0
	*M.loreyi_mtR1*	1.0
3차 증류수		6.0
게놈 DNA		2.0
최종 반응액		20.0

상기와 같이 수득한 최종 반응액을 i) 95 ℃로 5분, ii) 94 ℃로 20초 → 58 ℃(-0.5 ℃/cycle) 20초 → 72 ℃로 20초로 설정된 단계를 9 회 반복하였으며, iii) 94 ℃에서 20초 → 54 ℃로 20초 → 72℃로 20초 설정된 단계를 21 회 반복하였고, iv) 최종적으로 72 ℃에서 7분 동안 반응시켰다.

M을 100bp size marker로 하여 뒷흰가는줄무늬밤나방(M. loreyi, Ml)과 멸강나방(M. separata, Ms), 열대거세미나방(S. frugiperda, Sf), 파밤나방(S. exigua, Se), 조명나방(O. furnacalis, Os)을 비교한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, Ml(뒷흰가는줄무늬밤나방) DNA의 200bp와 300bp 사이에서만 단일한 PCR 증폭산물(245 bp)가 만들어짐을 확인할 수 있고, 멸강나방(M. separata, Ms), 열대거세미나방(S. frugiperda, Sf), 파밤나방(S. exigua, Se), 조명나방(O. furnacalis, Os)에서는 PCR 증폭 산물이 만들어지지 않음을 확인함으로써, 본 발명자들은 본 발명의 프라이머 세트가 뒷흰가는줄무늬밤나방 특이적으로 DNA를 증폭시킴을 확인하였고, 따라서 본 발명의 프라이머 세트가 여러 유사 옥수수 가해 나방류 중에서 뒷흰가는줄무늬밤나방만을 특이적으로 검출해낼 수 있다는 사실을 확인하였다.

실시예 3. RFLP(Restriction fragment length polymorphism)를 통한 프라이머 세트의 뒷흰가는줄무늬밤나방에 대한 특이성 확인

상기 실시예 1에서 제조한 프라이머 세트의 서열을 분석한 다음, 제한효소(Restriction enzyme)인 Taq1 또는 Vsp1를 처리했을 때, 예상 절편 사이즈를 예측하여 하기 표 3에 나타내었다.

Restriction enzyme	Cleavage site	Expected fragment sizes (bp) by restriction enzymes
Restriction enzyme	Cleavage site	*Mythima loreyi*	*Mythimna separata*	*Spodoptera exiqua*	*Spodoptera frugiperda*	*Ostrinia furnacalis*
*Taq* I	5'...T 'CG_A...3'	57, 188	245	245	245	245
*Vsp* I	5'...AT'TA_AT...3'	106, 139	245	25, 81, 139	106, 139	245

본 발명의 프라이머 세트에 제한효소를 처리했을 때, 상기 표 3과 같에 기재된 대로인 예상 절편사이즈를 보여주는지 여부를 확인하기 위한 실험을 설계하였으며, 이를 위해 PCR을 수행하여 증폭 산물을 수득한 다음, Taq1 제한효소는 하기 표 4와 같은 조건으로 처리하여 반응액과 혼합하여 최종 반응액을 수득하였다.

성분	부피(㎕)
반응버퍼(10X)	2.0
Taq 1	0.5
3차 증류수	12.5
PCR 증폭산물	5.0
최종 반응액	20.0

Taq1 제한효소를 처리한 최종 반응액을 수득한 다음, 65 ℃으로 15분 → 80 ℃로 20분 반응시켰으며, 전기영동을 통해 결과를 확인하였다. PCR 산물의 Taq1 제한효소 처리 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 표 3에서 예상했던 사이즈인 57 및 188 bp가량의 사이즈를 보여줌을 확인할 수 있었다. Vsp1 제한효소는 하기 표 5와 같은 조건으로 처리하여 반응액과 혼합하여 최종 반응액을 수득하였다.

성분	부피(㎕)
반응버퍼(10X)	2.0
Vsp 1	1.0
3차 증류수	12.0
PCR 증폭산물	5.0
최종 반응액	20.0

Vsp1 제한효소를 처리한 최종 반응액을 수득한 다음, 37 ℃으로 120분 → 65 ℃로 20분 반응시켰으며, 전기영동을 통해 결과를 확인하였다. PCR 산물의 Vsp1 제한효소 처리 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 표 3에서 예상했던 사이즈인 106 및 139 bp가량의 사이즈를 보여줌을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 옥수수 가해 나방류 해충 5종의 미토콘드리아 CO1 유전자 비교를 통해서 제작된 뒷흰가는줄무늬밤나방 프라이머 세트는 특이적으로 뒷흰가는줄무늬밤나방의 DNA를 증폭시킬 수 있다는 사실을 확인하였으며, 제한효소를 처리했을 때, 예상사이즈 대로 절단된 단편이 생성됨을 확인함으로써 이러한 사실을 재확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting Mythimna loreyi and detection method using the same <130> PD20-307 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> M.loreyi_mtF1 <400> 1 ggatttggta attgacttgt t 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> M.loreyi_mtR1 <400> 2 atagaagaaa taccagcaag 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트.
제1항에 따른 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 조성물.
제1항에 따른 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 프라이머 세트를 포함하는 뒷흰가는줄무늬밤나방 검출용 키트.
제 1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 방법은 제한효소 절편길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism; RFLP), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것인 뒷흰가는줄무늬밤나방을 검출하는 방법.