KR20220084465A

KR20220084465A - 편백나무 수피 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20220084465A
Application number: KR1020200173947A
Authority: KR
Inventors: 김지필; 전성하
Original assignee: 주식회사 유니온키드
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-06-21

Abstract

본 발명은 본 발명은 편백나무 수피 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 편백나무 수피를 수세하여 그늘에서 건조하는 건조단계와, 상기 건조된 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하는 분말제조단계와, 상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올 900 내지 1100 중량부를 혼합하고, 실온에서 22 내지 26시간마다 2 내지 4회 반복 추출하여 추출물을 획득하는 추출단계와, 상기 추출물을 여과한 후, 여과액을 35 내지 45℃의 온도조건에서 감압 농축하는 농축단계 및 상기 농축된 여과액을 동결 건조시켜 분말화하여, 최종 추출물을 획득하는 동결 건조단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

편백나무 수피 추출물의 제조방법 {Method for preparing extracts of chamecyparis obutsa bark}

본 발명은 편백나무 수피 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 화장품 조성물 등에 사용 가능하며, 피부에 대한 항산화 및 항염효과 등의 약리 활성도가 우수한 편백나무 수피 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

편백나무에서 생산되는 피톤치드는 식물의 자기방어 물질로써, 병원균 및 해, 곰팡이 등에 저항하기 위해 식물이 내뿜거나 분비하는 물질로 그 자체에 항균, 항염 성분이 포함되어 있다.

이러한 여러 기능성이 잘 알려진 편백나무의 추출물의 경우, 각종 피부트러블을 일으키는 병균에 대해 살균력이 높아 여드름, 아토피, 가려움증 등 트러블 피부의 개선에 큰 도움이 된다.

이러한 여러 기능성이 잘 알려진 편백나무와 관련하여, 잎 및 가지를 포함하여 각 부위별로 유효성분을 추출하여 각각의 용도로 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 편백나무의 수피를 활용하고자 하는 연구는 매우 제한적이다.

이에 따라, 편백나무 수피의 주요 기능성 성분인 유효 성분을 충분히 사용할 수 없으므로, 이를 활용하기 위한 추출방법의 개발이 필요한 실정이다.

등록특허공보 제10-1796547호(2017.11.06)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 편백나무 수피의 유효성분을 최대로 함유하되, 추출 효율을 향상시킬 수 있는 편백나무 수피 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 편백나무 수피를 수세하여 그늘에서 건조하는 건조단계와, 상기 건조된 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하는 분말제조단계와, 상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올 900 내지 1100 중량부를 혼합하고, 실온에서 22 내지 26시간마다 2 내지 4회 반복 추출하여 추출물을 획득하는 추출단계와, 상기 추출물을 여과한 후, 여과액을 35 내지 45℃의 온도조건에서 감압 농축하는 농축단계 및 상기 농축된 여과액을 동결 건조시켜 분말화하여, 최종 추출물을 획득하는 동결 건조단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 건조단계에서, 상기 수세된 편백나무 수피는 18 내지 22℃의 온도조건에서 건조되는 것을 특징으로 하는 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 추출단계에서, 상기 에탄올의 농도는 98 내지 100%인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 동결 건조단계에서, 상기 농축된 여과액은 -75 내지 -85℃의 온도 조건에서 70 내지 74 시간동안 동결 건조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 편백나무 수피를 수세하여 그늘에서 건조하는 건조단계와, 상기 건조된 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하는 분말제조단계와, 상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올 900 내지 1100 중량부를 혼합하고, 실온에서 22 내지 26시간마다 2 내지 4회 반복 추출하여 추출물을 획득하는 추출단계와, 상기 추출물을 여과한 후, 여과액을 35 내지 45℃의 온도조건에서 감압 농축하는 농축단계 및 상기 농축된 여과액을 동결 건조시켜 분말화하여, 최종 추출물을 획득하는 동결 건조단계를 포함하되, 상기 추출단계에서 상기 에탄올의 농도는 98 내지 100%인 것을 사용하여, 추출물 내 편백나무 수피의 유효성분을 최대로 함유하되, 추출 효율을 향상시킬 수 있는 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 편백나무 수피 추출물의 제조방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 편백나무 수피 추출물의 HPLC 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 MTT assay 세포 생존율 측정 결과를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 시토카인(cytokine) 생성량 측정 결과를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명의 기술적 사상을 첨부된 도면을 사용하여 더욱 구체적으로 설명한다.

첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 도시한 일예에 불과하므로 본 발명의 기술적 사상이 첨부된 도면의 형태에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명에 따른 편백나무 수피 추출물의 제조방법의 순서도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 편백나무 수피 추출물의 제조방법은 건조단계(S100), 분말제조단계(S200), 추출단계(S300), 농축단계(S400) 및 동결 건조단계(S500)를 포함한다.

먼저, 건조단계(S100)는 편백나무 수피를 수세하여 그늘에서 건조하는 단계이며, 편백나무 수피는 나무줄기의 바깥 조직으로써 피톤치드를 방출하여 향균 방취 및 아토피 등의 알레르기 피부질환에 효과가 있으며, 유해물질 중화작용 및 피부 진정작용을 함에 따라 화장품 조성물로 사용하기에 적합하다.

또한, 편백나무 수피의 경우, 퀘르시트린(quercitrin), 미리세틴(myricetin) 및 아멘토 플라본(amento flavone)을 유효성분으로 함유하여, 화장품 조성물로 활용 시에 잎 및 가지를 포함한 다른 부위 추출물 대비하여 피부에 대한 항산화 및 항염효과 등의 약리 활성도가 우수한 특징이 있으며, 이에 관한 상세한 내용은 후술하기로 한다.

또한, 상기 건조단계(S100) 시 상기 수세된 편백나무 수피는 18 내지 22℃의 온도조건에서 수분함량이 5중량% 이하가 되도록 건조됨이 바람직하다.

이는 수세된 편백나무 수피가 충분히 건조되기 위한 최적의 조건으로서, 상기 온도범위를 벗어나는 경우, 불충분한 건조로 인해 수분함량이 5중량% 초과하게 되어 후술할 추출단계(S300) 시 유효성분에 대한 추출 수율이 낮아져, 품질 저하가 발생될 문제점이 있어 바람직하지 않다.

분말제조단계(S200)는 상기 건조된 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하는 단계로서, 분말의 크기나 형태는 특별히 한정되지 않으나, 유효성분의 추출 효율, 여과 방식 및 조건 등을 고려하여 조절될 수 있다.

추출단계(S300)는 상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올 900 내지 1100 중량부를 혼합하고, 실온에서 22 내지 26시간마다 2 내지 4회 반복 추출하여 추출물을 획득하는 단계로서, 상기 에탄올의 농도는 98 내지 100%가 됨이 바람직하다.

보다 상세하게는, 상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올이 900 중량부 미만으로 혼합 시, 분말 내 유효성분이 충분히 추출되지 않으며, 반면 에탄올이 1100 중량부 초과 혼합시에는 후술할 농축단계(S400)에서 에탄올의 제거가 용이하지 못하므로 바람직하지 않다.

또한, 상기 추출단계(S300)에서 추출시간이 길어질수록 유효성분에 대한 수율이 증가하나, 26시간 초과시에는 큰 증가 추세를 보이지 않으므로 경제성 및 추출 효율을 고려하여 22 내지 26시간마다 추출함이 바람직하다.

또한, 추출 용매로서 인체에 유해하지 않은 에탄올이 사용됨이 바람직하며, 에탄올 사용 시, 98 내지 100% 농도의 에탄올 이용 시에 추출 수율이 가장 높음을 확인하였으며, 상세한 내용은 후술하기로 한다.

농축단계(S400)는 상기 추출물을 여과한 후, 여과액을 35 내지 45℃의 온도조건에서 감압 농축하여 추출용매인 에탄올을 제거하는 단계이다.

상세하게는, 농축 온도가 35℃ 미만일 경우, 농축 시간이 과다하게 소요되는 단점이 있어 비경제적이며, 반면 추농축 온도가 45℃ 초과할 경우, 여과액 내 함유된 유효성분이 분해되어 소실되게 되는 문제점이 존재함에 따라 바람직하지 않다.

동결 건조단계(S500)는 상기 농축된 여과액을 동결 건조시켜 분말화하여, 최종 추출물을 획득하는 단계로서, 상기 동결 건조단계(S500)에서 상기 농축된 여과액은 -75 내지 -85℃의 온도 조건에서 70 내지 74 시간동안 동결 건조됨이 바람직하다.

보다 상세하게는, -85℃ 미만의 온도에서 건조하거나, 또는 74시간 초과 건조시에는 냉동 온도를 유지하기 위해 소모되는 전기에너지가 너무 커서 비경제적이므로 바람직하지 않으며, 반면 -75℃ 초과의 온도에서 건조하거나, 또는 70시간 미만 건조시에는, 추출물 내 수분이 제대로 승화하지 않고 남을 수 있고, 유효성분의 손실이 발생할 수 있어 바람직하지 않다.

즉, 상기 온도 및 시간 범위 내에서 추출물 내 유효성분이 손실되지 않으면서 적절한 에너지로 동결 건조 시키 수 있어 효율적인 생산이 가능하다.

또한, 상기 동결 건조단계(S500)를 완료한 최종 추출물은, 상기 최종 추출물 100 중량부에 대하여 유효물질인 퀘르시트린(quercitrin)이 0.4 내지 0.5 중량부이 함유되어 있는 것으로 확인되었다.

상기 퀘르시트린은 화장료로 활용 시에 항산화 및 항염효과 등의 약리 활성 효능을 확보하기 위한 성분으로서, 상기 최종 추출물 100 중량부에 대하여 0.4 중량부 미만 함유 시 성분에 대한 효능 및 효과가 미약하고, 반면 0.5 중량부 함유 시 화장료로 활용 시 피부 안정성 또는 제형상의 문제가 존재한다.

이하에서는 본 말명의 내용을 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다.

[실시예 1] 편백나무 수피 추출물 제조

2020년 3월 전남 광양시 광양읍 일원에서 채취한 편백나무를 제공받아 실험에 사용하였으며, 편백나무의 수피 부분을 분리하여 수세하고, 통풍이 잘 되는 그늘에서 건조하였으며, 건조 시 온도는 20℃로 유지하였다.

건조 후, 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하였으며, 편백나무 수피 분말 중량의 10배 양의 추출 용매를 혼합하여 실온에서 24시간마다 2회 반복 추출하여 추출물을 수득하였으며, 추출 용매의 경우, 99% 농도의 에탄올을 사용하였다.

상기 추출물은 거름종이 (Whatman No. 2,G E healthcare, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 여과한 후, 여과액을 용기에 넣어 40℃의 수온에서 회전진공증발기기(rotary vacuum evaporator, HS-10SP; Hahnshin S&T, Korea)를 사용하여 감압 농축하였으며, -80℃의 온도에서 72시간동안 동결기(FD5525; Ilshin BioBase, Korea)로 건조하여 얻어진 최종 추출물을 4℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

[실험예 1] 편백나무 수피 추출물의 추출 수율

본 실험예 1은 추출 용매의 종류 및 농도에 따른 편백나무 수피 추출물의 추출 수율을 측정하였으며, 보다 상세하게는 편백나무 수피 추출물의 수율은 추출 전 편백나무 수피 초기 무게에 대한 동결 건조 후 최종 추출물의 무게 변화를 측정하여 백분율로 계산하였으며, 그 결과는 하기의 표 1을 참조한다.

구분	추출 용매 종류 및 농도	추출 수율
비교예 1	정제수	3.4%
비교예 2	70% 에탄올	5.7%
실시예 1	99% 에탄올	14.3%

표 1에 도시된 바와 같이, 편백나무 수피 추출물의 추출 수율은 추출용매로서 에탄올을 사용하되, 에탄올의 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 98 내지 100% 농도의 에탄올 이용 시에 추출 수율이 가장 높음을 확인하였다.

[실험예 2] 편백나무 수피 추출물의 HPLC 분석

상기 실시예 1에 의하여 제조된 편백나무 수피 추출물의 퀘르시트린(quercitrin) 함량 분석은 HPLC를 이용하였다.

또한, UV detector를 사용하여 330nm의 파장에서 분석하였고, 분석 시 C18 column(4.6 x 250 mm, 5 um, Zorbax Eclipse Plus)를 사용하였으며, 1 mL/min의 유속(rate flow), 30℃의 oven 온도를 유지하고, 아세토니트릴(acetonitrile, solvent A)과 증류수(solvent B)를 초기 시간의 solvent A와 B의 비율을 40:60의 기울기 용리로 하여 20분에 solvent A와 B의 비율이 40:60이 되도록 조절하였다.

또한, 편백나무 수피 추출물은 성분 함량 비교를 위하여 1 mg/mL의 농도를 사용하였고, 주입 용량은 10 uL의 용량으로 하였하였다.

그리고, 편백나무 수피 추출물 내 퀘르시트린(quercitrin) 함량은 standard 퀘르시트린(quercitrin)을 HPLC 이용하여 측정(A)한 후, 검량선을 작성하여 분석하였으며, HPLC 분석 결과, 퀘르시트린(quercitrin) 함량은 4.8485mg/g으로 확인되었으며, 이는 도 2의 (B)를 참조한다.

[실험예 3] 편백나무 수피 추출물의 항산화 효과(DPPH 라디칼 소거 활성 측정)

본 실험예3은 실시예 1에 의하여 제조된 편백나무 수피 추출물의 화장품 조성물로의 사용 가능성을 제시하기 위한 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다.

상세하게는, 편백나무 수피 최종 추출물 100 μL(fimal concentration : 10, 25, 50, 75, 100)과 0.2 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhyd razyl) 용액 50 μL를 넣고 교반하여, 암실상태에서 30분간 반응시킨 후 microplate reader(ELISA reader)를 이용하여 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 대조군으로는 BHA(butylated hydroxyanisole)가 사용되었으며, 전자공여능(EDA, electron donating ability)은 Blois의 방법(1958)에 의한 DPPH free radical 소거법으로 측정되었으며, 이는 도 3을 참조한다.

도 3에 도시된 바와 같이, DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과, 편백나무 수피 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 유의하게 증가하였으며, 75 μg/mL에서는 대조군인 BHA 대비 높은 활성을 나타냄에 따라 탁월한 황산화 효능을 가짐을 알 수 있다.

[실험예 4] 편백나무 수피 추출물의 항염증 활성 확인(MTT assay 세포 생존율 및 시토카인(cytokine) 생성량 측정)

본 실험예4는 실시예 1에 의하여 제조된 편백나무 수피 추출물의 화장품 조성물로의 사용 가능성을 제시하기 위한 항염증 활성 효과를 확인하기 위하여 MTT assay 세포 생존율 및 시토카인(cytokine) 생성량을 측정하였다.

우선, 편백나무 수피 최종 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였으며, 상세하게는, HaCaT cell (Human keratinocyte cell line, 1×10⁴ cells/well)을 24시간 전배양 후, 편백나무 수피 추출물 시료를 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 배양하였다.

배양 후, 5 mg/mL 농도의 MTT 용액 20 μL를 첨가하여 4시간 반응시킨 후, 상등액을 제거하고 형성된 포마잔(formazan)에 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide)와 에탄올을 1:1로 섞은 용액을 각 well당 200 μL를 가하고, 실온에서 30분동안 반응시킨 뒤, microplate reader(ELISA reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로부터 환산되며, 그 결과는 도 4를 참조한다.

도 4에 도시된 바와 같이, MTT assay를 실시한 결과, 편백나무 수피 추출물은 20μg/mL 농도 이하에서 95% 이상의 세포 생존율을 나타낸 반면, 80μg/mL 이상에서는 세포 생존율이 80% 이하로 낮아짐에 따라 화장품 조성물로서의 안정성을 위하여 시토카인(cytokine) 생성량 측정 시 20 μg/mL의 농도까지 실험을 진행하였다.

시토카인(cytokine) 생성량 측정은 편백나무 수피 최종 추출물이 염증성 시토카인(cytokine)의 생성을 억제할 수 있는지 측정하기 위한 실험으로서, HaCaT cell(1×10⁵ cells/well)을 전배양하고, 편백나무 수피 추출물 시료(concentration : 5, 10, 15)와 LPS(1μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다.

배양 후, 세포 배양액 내 시토카인(cytokine)의 생성량을 측정하였고, 시토카인은 enzyme immuno assay kit를 이용하여 정량하였으며, 각 시토카인(cytokine)의 함량은 표준물질의 반응으로부터 얻어진 표준곡선을 이용하여 환산하였으며, 이는 도 5를 참조한다.

도 5에 도시된 바와 같이, 분석 결과 편백나무 수피 최종 추출물의 경우, LPS 단독 처리군과 대비하여 농도 의존적으로 시토카인(cytokine)인 IL-1β(A), TNF-α(B), IL-6(C)의 생성을 억제하는 것으로 확인됨에 따라 항염증 작용을 가지는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명에 대한 설명을 마친다. 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며, 적용범위가 다양함은 물론이고, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이다.

S100 : 건조단계
S200 : 분말제조단계
S300 : 추출단계
S400 : 농축단계
S500 : 동결 건조단계

Claims

편백나무 수피를 수세하여 그늘에서 건조하는 건조단계;
상기 건조된 편백나무 수피를 일정 크기로 분쇄하여 분말을 형성하는 분말제조단계;
상기 편백나무 수피 분말 100 중량부에 대하여 에탄올 900 내지 1100 중량부를 혼합하고, 실온에서 22 내지 26시간마다 2 내지 4회 반복 추출하여 추출물을 획득하는 추출단계;
상기 추출물을 여과한 후, 여과액을 35 내지 45℃의 온도조건에서 감압 농축하는 농축단계; 및
상기 농축된 여과액을 동결 건조시켜 분말화하여, 최종 추출물을 획득하는 동결 건조단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 편백나무 수피 추출물의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 건조단계에서,
상기 수세된 편백나무 수피는 18 내지 22℃의 온도조건에서 건조되는 것을 특징으로 하는 편백나무 수피 추출물의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 추출단계에서,
상기 에탄올의 농도는 98 내지 100%인 것을 특징으로 하는 편백나무 수피 추출물의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 동결 건조단계에서,
상기 농축된 여과액은 -75 내지 -85℃의 온도 조건에서 70 내지 74 시간동안 동결 건조되는 것을 특징으로 하는 편백나무 수피 추출물의 제조방법.