KR101852906B1 - 로즈마리와 카모마일을 성분으로 하는 항산화, 향균 및 피부개선 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연허브복합비료의 제조법과 허브를 이용하는 병충해 방지용 식재방법을 통한 카모마일 및 로즈마리의 재배방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 재배방법은 우수한 품질의 카모마일과 로즈마리를 재배하는데 효과가 있다. 상기의 재배방법을 이용하여 카모마일, 로즈마리 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 항산화, 향균 및 피부 개선에 효과가 있다. 상기 카모마일, 로즈마리 추출물은 항산화 효과와 향균 효과를 갖고 우수한 피부 자극 완화 효과를 갖고 있어서 이를 유효 성분으로 함유하는 화장료는 피부 개선에 우수한 효과를 타나낸다.

Description

로즈마리와 카모마일을 성분으로 하는 항산화, 향균 및 피부개선 화장료 조성물 및 그 제조방법{Anti-oxidant herb cosmetic composition containing Camomile and Rosemary for Protecting skin care and Method for Preparing the Same}

본 발명은 항산화, 향균 및 피부개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 포천 종현산 유래의 카모마일 로즈마리 허브추출물과 로즈우드, 제라늄, 유황유, 일랑일랑, 라벤더, 로즈, 네롤리 에센셜 오일을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

허브추출물을 화장료 원료로 이용하고자 하는 선행기술은 많이 제시되어 있는바, 대한민국 등록특허 10-1571323 '허브 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물' 에는 유효성분으로서 페퍼민트, 카모마일, 로즈마리, 레몬그라스, 들국화, 티트리 및 라벤더의 허브 복합추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.1~10 중량%로 함유하는 화장료 조성물이 개시되어있다.

대한민국 공개특허 10-2011-004110 '화이트 사포나리아, 레몬밤, 카모마일, 로즈마리, 페퍼민트, 유칼립투스, 티트리, 로즈힙 추출물을 함유하는 함염증, 해독 피부노화, 방지용 피부 외용제 조성물' 에는 유효성분으로서 화이트 사포나리아, 레몬밤, 카모마일, 로즈마리, 페퍼민트, 유칼립투스, 티트리, 로즈힙 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 15 중량%로 함유하는 피부 외용제 조성물이 개시되어있다.

정현진, 「폴리페놀 함량과 항산화력에 따른 로즈마리의 최적 추출조건 확립」, 한국식품과학회지 제 45권 제 4호, 2013. 501-507 에는 추출용매의 종류와 온도 조건에 따른 로즈마리 추출물의 항산화력을 비교 분석하여 확립한 최적의 추출조건이 개시되어 있다.

Khalid Mohammad Al-Lsmail, Antioxidant activity of water and alcohol extracts of chamomile flowers, anise seeds and dill seeds, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 173-178 에는 추출용매의 종류에 따른 카모마일 추출물의 항산화력을 비교 분석하여 확립한 최적의 추출조건이 개시되어 있다.

대한민국 공개특허 10-2011-0010946 '피부 보습용 화장료 조성물' 에는 유효성분으로서 쉐어버터, 엑스트라 버진 올리브오일, 카모마일 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001~80 중량%로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물이 개시되어있다.

본 발명자들은 항산화, 항염 및 피부개선에 가 있는 포천 종현산 유래 허브를 선별하고 이에 대한 추출물의 추출법 및 제조방법과 활성에 대하여 연구하여 왔으며, 카모마일, 로즈마리 추출물 및 로즈우드, 제라늄, 유황유, 일랑일랑꽃, 라벤더, 장미, 네롤리 에센셜오일 복합물이 항산화, 향균, 피부개선을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

자외선은 유해한 활성 산소종(reactive oxygen species)을 많이 만들어 내고, 활성 산소종은 피부 세포에서 고분자 물질들인 불포화 지방산, 단백질, DNA 등과 반응하여 피부 콜라겐 등의 결합조직 형성 파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포 간 에너지 전이, 신진대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.

또한 염증은 다양한 외래의 병원균의 침입이나, 유해한 화학 물질, 조직의 상해나 상처, 질병 등에 의해 일어나는 대식세포와 단핵구와 같은 면역 관련 세포를 통한 우리 몸의 방어적인 반응을 말한다.

본 특허에 이용된 전자공여능은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품 중의 지방질 산화를 억제하는 목적으로 이용되고 인체에서는 활성 라디칼에 의해 노화를 억제시키는 작용으로 알려져 있다.

DPPH는 안정한 free radical로 cysteine, glutathione과 같은 황 함유 아미노산과 ascorbic acid, tocopherol 등의 황산화 물질에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화물질의 항산화능을 측정할 때 많이 이용되는데 DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 band를 보이나, phenolics 화합물과 같이 수소에 전자를 제공해주는 전자공여체와 반응을 하게 되면 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하여 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하여 그 수에 비례하여 진보라색의 DPPH의 색깔은 점점 옅어지게 되고 흡광도가 감소하게 됨으로 항산화 활성을 측정하는 방법 중의 하나이다.(주요 허브 추출물의 항산화성 및 향균활성, 최인영 외, 2010 참조)

세포독성 실험을 위한 MTT 분석법은 세포 독성 또는 생존율을 측정하는 실험방법 중 하나로 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색 수용성 기질인 MTT 테트라졸룸(tetrazolium)이 세포 안에 침투하여 미토콘드리아 속에서 적자색을 띄는 비용성 formazan produc로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT 분석법에서 세포들을 DMSO와 같은 유기용매로 용해시킨 후, 떨어져나오는 가용성 formazan reagent을 분광학적인 방법으로 측정하는 것이다. MTT의 환원성은 대사가 활발한 세포의 경우에만 일어나므로 세포의 생존능력도 측정할 수 있다.

(그림 1 참조)

본원은 카모마일, 로즈마리 재배 시 허브를 함유하는 천연허브 복합비료를 사용하고 또한 병충해 예방을 위한 피톤치드를 방출하는 레몬밤과 페파민트를 함께 식재하는 방법을 통하여 허브식물의 질을 향상시켜 에센셜 오일, 화장료 제조 등에 사용할 수 있는 우수한 품질의 카모마일, 로즈마리를 재배하고 이의 추출물을 통하여 항산화, 항염, 피부 개선 효과를 갖는 화장료 첨가 조성물을 제공하고자 하는 목적을 갖는다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본원에 개시되는 기술사상은 허브추출물의 제조방법에서, 천연허브복합비료로 가축두엄 70±10 wt%, 복합허브두엄 20±5 wt%, 달걀껍질 10±5 wt를 포함하는 조성으로 천연허브복합비료를 얻는 제1단계; 허브식물을 재배할 때 로즈마리 또는 카모마일 100주 기준에 레몬밤 및 페퍼민트가 각각 0.5~2.0주 비율로 식재되어 병충해를 예방하는 조건으로 허브식물을 얻는 제2단계;상기 로즈마리, 카모마일 중에서 선택되는 허브식물의 잎과 꽃잎을 건조 후 분쇄하고 에탄올 용매로 추출한 후 용매를 제거하여 허브추출물을 분리하는 제3단계 공정을 포함하여 이루어지는 공정을 통하여 허브추출물을 얻고자 하는 발명이다.

또한 본원은 허브추출물의 이용방법에서, 천연허브복합비료로 가축두엄 70±10 wt%, 복합허브두엄 20±5 wt%, 달걀껍질 10±5 wt를 포함하는 조성으로 천연허브복합비료를 얻는 제1단계와 허브식물을 재배할 때 로즈마리 또는 카모마일 100주 기준에 레몬밤 및 페퍼민트가 각각 0.5~2.0주 비율로 식재되어 병충해를 예방하는 조건으로 허브식물을 얻는 제2단계와 상기 로즈마리, 카모마일 중에서 선택되는 허브식물의 잎과 꽃잎을 건조 후분쇄하고 에탄올 용매로 추출한 후 용매를 제거하여 허브추출물을 분리하는 제3단계와 상기 제3단계를 통하여 얻은 허브추출물이 화장료 조성물의 0.1~2.0 wt% 범위로 사용되는 제4단계 공정을 포함하여 이루어지는 허브추출물의 이용방법에 관한 발명이다.

상기 허브추출물은 화장료로 사용되는 경우 항산화, 항염, 피부 개선 효과를 갖고 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 폼, 팩 중 하나의 제형을 이루며 사용되도록 적용될 수 있음을 확인하여 완성된 발명이다.

본원은 카모마일, 로즈마리 재배 시 허브를 함유하는 천연허브 복합비료를 사용하고 또한 병충해 예방을 위한 피톤치드를 방출하는 레몬밤과 페파민트를 함께 식재하는 방법을 통하여 허브식물의 질을 향상시킨 허브식물을 얻는 효과를 제공한다.

또한 본원에서 제공되는 허브추출물은 화장료로 사용되는 경우 항산화, 항염, 피부 개선 효과를 갖고 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 폼, 팩 중 하나의 제형을 이루며 사용되도록 적용될 수 있는 효과를 제공한다.

도 1 : MTT의 환원성 측정 실험식 예시도.
도 2 : 출원서의 실험예3에 행당하는 항균실험을 위해 추출물을 디스크 위에 떨어트리는 과정에 대한 사진도.
도 3 : 상기 도 2의 사진도에서 떨어트린 추출물이 균을 제거하며 생육억제환이 생성되는 과정에 대한 사진도.

본원의 기술사상이 구현되기 위한 발명의 실시내용을 실시예 형태로 기재하기에 앞서, 본 출원의 명세서나 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 될 것이며, 본원의 보호범위는 본원발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 할 것이고, 본 명세서에 기재된 실시양태의 예시는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본원의 기술사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 할 것이다.

또한 본원의 출원서에 기재되는 실시예는 수 많은 시행오차를 거쳐 밝혀낸 베스트 모드를 기재한 것으로 수치의 상한 및 하한을 나타내는 범위는 기재된 수치의 상한 및 하한을 벗어나는 경우에는 발명자가 원하는 목적을 달성하기에 미흡하기 때문에 정해진 수치임을 인식하여야 할 것이다.

본원은 자연원료인 허브식물을 이용하여 천연허브복합비료를 얻고, 천연허브복합비료를 이용하여 로즈마리나 카모마일을 얻을 때 병충해 예방성능을 갖는 식물을 함께 재배하여 우수한 품질의 로즈마리나 카모마일을 얻으며, 로즈마리나 카모마일로부터 추출한 허브추출물을 화장료의 첨가물질로 사용하고자 하는 기술사상의 발명이다.

본원의 기술사상이 적용되는 천연허브복합비료를 얻는 구체적인 제조단계를 공정별로 설명하기로 한다.

제 1단계 (식물원료 준비단계)

자연적으로 떨어졌거나, 미관을 위해 베어낸 페퍼민트, 로즈마리, 라벤더, 레몬밤, 스테비아, 레몬버네나를 상온에서 각각 건조하고 각 성분의 배합비율이 로즈마리 0.1 내지 20.0 wt%, 페퍼민츠 0.1 내지 20.0wt%, 라벤더 0.1 내지 20.0wt%, 레몬밤 0.1 내지 20.0wt%, 스테비아 0.1 내지 20.0wt%, 레몬버베나 0.1 내지 20.0wt%의 함량비율로 혼합되어 100 wt%를 이루도록 혼합한다.

제 2단계 (두엄 혼합단계)

가축(소, 닭)배설물 70±10 중량부에 상기 1단계에서 준비된 건조식물 30±10 중량부 비율로 혼합된 혼합물을 얻고 양지바른 곳에서 2~3년간 자연 방치하며 발효시켜 허브발효퇴비를 얻는다.

제 3단계 (살포 및 식재단계)

상기 제2단계 공정을 거쳐 얻은 허브발효퇴비 90±5 중량부와 분쇄된 달걀껍질 10±5 중량비율로 혼합한 천연허브복합비료를 얻고 경작지 3.3㎡ (1평)당 10~15kg 범위로 살포 후 로즈마리나 카모마일을 6 내지 10송이를 식재할 때 병충해 방재효과를 갖는 식물을 함께 식재하여 작물의 질을 향상시켜 화장료 제조 등에 사용할 수 있는 우수한 품질의 카모마일, 로즈마리를 얻을 수 있음을 확인하여 완성된 발명이다.

이하에서는 본원의 기술사상으로 제공되는 로즈마리와 카모마일 각각의 허브식물을 재배하고 재배 수확물로부터 각각의 허브추출물을 얻으며, 허브추출물을 이용하여 화장료의 조성으로 사용되는 적용예를 설명하기로 한다.

재배 적용예 1-1 : 로즈마리 재배시 병충해 방지를 위한 레몬밤과 페퍼민트 식재

상기 허브천연복합비료를 살포한 후, 병충해를 방지하기 위하여 병충해 방지효과가 있는 레몬밤과 페퍼민트를 함께 식재하여 로즈마리를 재배하였다. 이 때의 식재비는 로즈마리, 레몬밤, 페파민트 500 : 4 : 6으로 하였다.

재배 적용예 1-2 : 카모마일 재배시 병충해 방지를 위한 레몬밤과 페퍼민트 식재

상기 허브천연복합비료를 살포한 후, 병충해를 방지하기 위하여 병충해 방지효과가 있는 레몬밤과 페퍼민트를 함께 식재하여 카모마일을 재배하였다. 이 때의 식재비는 로즈마리, 레몬밤, 페파민트 500 : 4 : 6으로 하였다.

추출물 제조예 2-1 : 로즈마리 추출물의 제조

상기 재배적용예 1-1의 방법으로 수확한 로즈마리를 잎과 꽃 부위 선단을 분리하여 강제순환건조기(OF-02GW, Jeiotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 40℃에서 24시간 건조시키고 분쇄기(XY-130B, Xiao bao)를 이용하여 50mesh로 분쇄한다. 이 물질을 제거한 후 conical tube(500ml)에 분쇄한 로즈마리 20g과 추출용매로 50% 에탄올 400ml을 넣고 shaking water bath(KMC-1205SW1, Vision, Daejeon, Korea)에서 70℃, 6~12시간 추출하여 추출액을 얻는다. 추출액을 mesh filter(stainless steel filter mesh, R&K, China, 4~400mesh)로 여과한다. 여과한 후 여과액을 rotary evaporator(DL10-3000, Greatwall, 20L)를 이용하여 용매를 제거한 후, 추출물을 얻는다. 추출물을 멸균 처리(KRS A-1,Health up, Korea)된 용기에 옮겨 담는다. 추출물은 10℃에서 냉장보관한다.

추출물 제조예 2-2 : 카모마일 꽃 추출물의 제조

상기 재배적용예 1-2의 방법으로 수확한 카모마일을 꽃만 분리하여 강제순환건조기(OF-02GW, Jeiotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 40℃에서 24시간 건조시키고 분쇄기(XY-130B, Xiao bao)를 이용하여 50mesh로 분쇄한다. 이물질을 제거한 후 conical tube(500ml)에 분쇄한 카모마일 20g과 추출용매로 50% 에탄올 400ml을 넣고 shaking water bath(KMC-1205SW1, Vision, Daejeon, Korea)에서 70℃, 6~12시간 추출하여 추출액을 얻는다. 추출액을 mesh filter(stainless steel filter mesh, R&K, China, 4~400mesh)로 여과한다. 여과한 후 여과액을 rotary evaporator(DL10-3000, Greatwall, 20L)를 이용하여 용매를 제거한 후 추출물을 얻는다. 추출물을 멸균 처리(KRS A-1,Health up, Korea)된 용기에 옮겨 담는다. 추출물은 10℃에서 냉장보관한다.

화장품 제조 실시예 3 : 카모마일 및 로즈마리 추출물을 이용한 로션의 제조

(제조실시예 3에 의해 제조된 로션은 추출물 제조예 2-1과 추출물 제조예 2-2를 원료로 사용한 것임).

성분	함량(중량%)
카모마일 추출물	0.5
로즈마리 추출물	1.5
에센셜오일	0.1
sodium hyaluronate	3.0
cetearyl alcohol	1.5
glycerol stearate	1.0
trehalose	0.5
arginine	0.28
정제수	잔량

제조 실시예 3에서 사용한 Sodium Hyaluronate 는 닭 벼슬에서 추출되는 성분으로 히알우론산이 소듐염이며, 뮤코 다당류의 일종으로서 6000배의 수분함유량을 가지고 있어 우수한 천연보습인자이다. Cetearyl alcohol은 식물성 베이스 유화왁스로 야채와 열매에서 추출하는 천연보습제이다. Glyceryl Stearate 는 야자 앨매와 콩 오일에서 유래된 천연성분으로 계면활성제, 보습제, 피부 컨디셔닝제로 쓰인다. Glycosyl Trehalose 피부 보호 및 보습제로 쓰인다. Arginine는 산화방지 및 pH조절 및 콜라겐 생성에 역할을 한다. 이하 각 성분들의 구조를 하기에 나타내었다.

상기 표 1로 제시된 조성을 갖는 화장료에 대하여 항산화 효과를 측정하고자 하였다.

실험예 1 : DPPH 환원력 측정

DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 band를 보이나, 카모마일이 가지고 있는 apigenin, Chamazulene, bisabolol, bisabolol oxide, 또 로즈마리가 가지고 있는 carnosic acid, carnosol과 같은 전자공여체와 반응을 하게 되면 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생선하여 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하여 그 수에 비례하여 진보라색의 DPPH의 색깔을 점점 옅어지게 되고 흡광도가 감소하게 됨으로 항산화 활성을 측정하는 방법 중 하나이다.

DPPH free radical 소거화성 측정법은 Biois에 의해 소개된 이래 사용법이 간단하고 시간과 상대적인 노력이 적어 지금도 많이 이용되고 있는바, 추출물에 대한 항산화 활성은 Blois's 방법에 따라 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyle)에 대한 전자공여능(electron donating abliity)으로 각 카모마일과 로즈마리에 대한 환원력을 측정하였다.

제조예 2-1, 2-2를 동결건조 시킨 것을 에탄올에 농도를 바꿔가며 첨가한 후, 각각이 1ml가 되도록 하여 0.2mM DPPH 용액 0.5ml을 함께 넣고 혼합한 후 실온에서 30분간 방치한 다음 UV-vis-spectrophotometer(Varian carry 300, USA)로 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 활성은 다음과 같은 식으로 표현하였다.

상기 수학식에 의해 에탄올로 추출한 카모마일의 DPPH 환원력을 표 2로 나타내었고 에탄올로 추출한 로즈마리의 DPPH 환원력을 표 3에 나타내었다.

농도(mg/ml)	환원력
0	0
0.04	73.0%
0.08	90.3%
0.10	91.0%

농도(mg/ml)	환원력
0.625	32.6%
0.125	68.0%
0.25	76.3%
0.500	78.453

위 실험을 통해 카모마일과 로즈마리가 각각 0.08mg/ml, 0.25mg/ml에서 농도 대비 항산화력이 가장 좋은 것으로 나타내는 결과를 확인할 수 있었다.

실험예 2. 재배방법에 따른 각각의 추출물에 대한 DPPH 환원력 측정

본원 발명자는 상기 추출물 제조예 2-1 및 추출물 제조예 2-2에서 얻은 본원 추출물과 재배방법을 달리한 로즈마리 및 카모마일의 비교예 추출물과 비교하기 위해 비교예 1-1은 천연허브복합비료만 사용하여 재배한 로즈마리, 비교예 1-2는 천연허브복합비료만 사용하여 재배한 카모마일, 비교예 2-1은 천연허브복합비료와 농약을 이용하여 재배한 로즈마리, 비교예 2-2는 천연허브복합비료와 농약을 이용하여 재배한 카모마일, 비교예 3-1은 일반 천연비료와 혼합 식재법만 이용하여 재배한 로즈마리, 비교예 3-2는 일반 천연비료와 혼합 식재법만 이용하여 재배한 카모마일, 비교예 4-1은 일반 천연비료만을 사용하여 재배한 로즈마리, 비교예 4-2는 일반 천연비료만을 사용하여 재배한 카모마일, 비교예 5-1은 일반 천연비료와 농약을 이용하여 재배한 로즈마리, 비교예 5-2는 일반 천연비료와 농약을 이용하여 재배한 카모마일을 적용하는 비교예를 본원 제조예 2-1 및 2-2와 동일한 방법으로 추출한 카모마일 및 로즈마리의 항산화 능력을 같은 농도로 각각 실험하였고, 그 결과를 표 4 및 표 5로 나타내었다.

제조 및 비교예 (0.08mg/ml)	환원력
제조예 2-2	92.6%
비교예 1-2	87.4%
비교예 2-2	90.3%
비교예 3-2	89.7%
비교예 4-2	85.2%
비교예 5-2	86.6%

제조 및 비교예 (0.25mg/ml)	환원력
제조예 2-1	80.4%
비교예 1-1	74.3%
비교예 2-1	76.3%
비교예 3-1	75.2%
비교예 4-1	72.1%
비교예 5-1	73.6%

실험예 3 : 피부 균에 대한 향균 활성

1) Propionibacterium acnes(여드름균)

로즈마리 추출물의 여드름 균에 대한 디스크 확산법(paper disc diffusion)의 농도별 투명환(clear zone)을 확인한 결과는 하기 표 6과 같다. 1 ㎎/㎖와 0.1 ㎎/㎖에서는 투명환을 확인할 수 없었고, 10 ㎎/㎖ 농도에서부터 투명환을 관찰할 수 있었다. 제조예2-1과 각 비교예에 대하여 디스크 확산법으로 실험하였다. 상기 실험 결과는 표 6에 나타내었다.

( P. acne에 대한 로즈마리 추출물 향균활성)

Clear zone(mm)
	100 mg/ml	10 mg/ml
제조예 2-1	22.75	13.88
비교예 1-1	20.47	11.27
비교예 2-1	21.45	12.45
비교예 3-1	21.01	12.18
비교예 4-1	19.54	10.42
비교예 5-1	19.98	10.89

2) Staphylococcus aureus(포도상구균)

각종 피부질환의 원인균으로 알려진 S.aureus를 대상으로 한 항균활성 실험의 결과를 표 7에 나타내었다. 로즈마리 추출물의 농도별 투명환의 크기를 측정하였다.

( S.aureus에 대한 로즈마리 추출물 향균활성)

Clear zone(mm)
	100 mg/ml	10 mg/ml
제조예 2-1	22.75	13.88
비교예 1-1	20.47	11.27
비교예 2-1	21.45	12.45
비교예 3-1	21.01	12.18
비교예 4-1	19.54	10.42
비교예 5-1	19.98	10.89

실험예 4 : 피부 진정 및 완화 효과

피부 트러블이 심한 지원자를 대상으로 평가 그룹 당 5명이 되도록 그룹을 나눈 후, 각 그룹 당 해당하는 상기의 실시예 3 및 각 비교예로 제조한 조성물을 지급하고 4주일간 매일 1회 이상 제품을 사용하게 하였다. 사용전과 사용 4주일 후의 피부 상태를 평가하게 하고, 그 평균을 산출하여 각 시험물질의 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정 효과를 평가하였다. 하기 표에 기재한 피부 상태 평가 기준을 토대로 하여 얻어진 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

비교예 1,2,3,4,5는 비교예 1,2,3,4,5-1과 비교예 1,2,3,4,5-2로 실시예 4와 동일하게 제조한 조성물이다.

피부 상태 평가 기준
피부 트러블 및 진정효과	평점
건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 매우 민감해짐	1
건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 약간 민감해짐	2
건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 사용전과 같음	3
건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 약간 진정됨	4
건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 매우 진정됨	5
시료명	피부 트러블 및 진정효과
실시예 3	4.4
비교예 1	3.5
비교예 2	2.1
비교예 3	3.7
비교예 4	3.3
비교예 5	1.2

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 제조한 실시예 3이 각 비교예 1,2,3,4,5보다 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정효과가 모두 우수하였다.

실험예 5 : 세포 독성 시험

(1) 인간 각질형성 세포 배양

대상	인간 각질 형성세포 HaCaT 세포주
환경	- 37℃, 5% CO2 배양기 - 10% FBS - DMEM 배지
계대배양 단위	5 10³ cells / ㎠
독성시험	MTT 분석법
분석법	ELISA, 570nm 흡광도 측정

(2) 세포 독성 시험

실시예 3에서 제조된 본 발명에 따른 항산화 허브 조성물이 장기간 사용 시에도 피부자극 없이 개선 효과를 보일 수 있는 지를 확인하기 위하여, 인간 각질형성 세포에 대한 세포 독성 유무를 시험하였다. 상기에서 배양된 인간 각질형성 세포를 24 well plate에 5 × 10³cells/well 씩 동일하게 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 본 발명에 따른 항산화 허브 조성물이 5% ~ 0.1% 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA)용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200㎕의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200㎕ 처리하여 교반한 후, 100㎕ 씩을 96 well로 취하여 효소 결합 면역 흡수법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

Well 당 초기 배양 5 × 10³ 세포들이 배양용기 표면적의 25 ~ 30% 만큼 배양된 시점에서 5% 까지의 항산화 허브 조성물을 첨가하여 대조군과 비교한 세포 독성은 유의수준 안 이였다. 10%에서 0.1%까지 처리 대조군에 비해 약 5% 전후의 증식 촉진효과가 있었으나 대조군과 통계적인 차이는 없었다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 항산화 허브 조성물은 세포 독성이 없으므로 장시간동안 높은 농도로 피부 및 두피 보호용 화장료에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

concentration(ug/ml)	M(%)
100	31.98
10	38.37
1	52.98
0.1	73.45
DMSO(1 ul) + LPS(1 ug/ml)	92.32
control(DMSO 1ul)	100

이상의 실험과정을 거치며 본원 발명자는 카모마일, 로즈마리 재배 시 허브를 함유하는 천연허브 복합비료를 사용하고 또한 병충해 예방을 위한 피톤치드를 방출하는 레몬밤과 페파민트를 함께 식재하는 방법을 통하여 허브식물의 질을 향상시킨 허브식물을 얻고 이의 추출물을 통하여 항산화, 항염, 피부 개선 효과를 갖는 화장료 첨가 조성물을 제공할 수 있음을 확인하여 특허출원에 이르게 되었다.

도 1 은 MTT의 환원성 측정 실험식 예시도를 나타낸 것이고, 도 2는: 출원서의 실험예3에 행당하는 항균실험을 위해 추출물을 디스크 위에 떨어트리는 과정에 대한 사진도를 나타낸 것이고, 도 3은 상기 도 2의 사진도에서 떨어트린 추출물이 균을 제거하며 생육억제환이 생성되는 과정에 대한 사진도로서 별도의 설명이 필요없다 할 것이다.

Claims (3)

1. 로즈마리 또는 카모마일 중에서 선택되는 허브추출물의 제조방법에 있어서,
   천연허브복합비료로 가축두엄 70±10 wt%, 복합허브두엄 20±5 wt%, 달걀껍
   질 10±5 wt를 포함하는 조성으로 천연허브복합비료를 얻는 단계;
   상기에서 얻은 천연허브복합비료를 이용하여 허브식물을 재배할 때 로즈마리 또는 카모마일 100주 기준에 레몬밤 및 페퍼민트가 각각 0.5~2.0주 비율로 식재되어 병충해를 예방하는 조건으로 허브식물을 얻는 단계;
   상기 로즈마리, 카모마일 중에서 선택되는 허브식물의 잎과 꽃잎을 건조 후
   분쇄하고 에탄올 용매로 추출한 후 용매를 제거하여 허브추출물을 분리하는 단계;
   를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하여 로즈마리 또는 카모마일 중에서 선택되는 허브추출물의 제조방법.
2. 로즈마리 또는 카모마일 중에서 선택되는 허브추출물의 이용방법에 있어서,
   천연허브복합비료로 가축두엄 70±10 wt%, 복합허브두엄 20±5 wt%, 달걀껍
   질 10±5 wt를 포함하는 조성으로 천연허브복합비료를 얻는 제1단계;
   상기 제1단계에서 얻은 천연허브복합비료를 이용하여 허브식물을 재배할 때 로즈마리 또는 카모마일 100주 기준에 레몬밤 및 페퍼민트가 각각 0.5~2.0주 비율로 식재되어 병충해를 예방하는 조건으로 허브식물을 재배하는 제2단계;
   상기 제2단계 조건으로 재배된 로즈마리, 카모마일 중에서 선택되는 허브식물의 잎과 꽃잎을 건조 후 분쇄하고 에탄올 용매로 추출한 후 용매를 제거하여 허브추출물을 분리하는 제3단계;
   상기 제3단계를 통하여 얻은 허브추출물이 화장료 조성물의 0.1~2.0 wt% 범
   위로 사용되는 제4단계;
   를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 로즈마리 또는 카모마일 중에서 선택되는 허브추출물의 이용방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 허브추출물이 항산화, 항염, 피부 개선 효과를 갖고 유연화장수, 영양
   화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 폼, 팩 중 하나의 제형
   을 이루며 사용되도록 적용되는 것을 특징으로 하는 로즈마리 또는 카모마일 중에서 선택되는 허브추출물의 이용방법.

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