KR20220075141A

KR20220075141A - 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220075141A
Application number: KR1020200163296A
Authority: KR
Inventors: 정재현; 한사라; 신성규; 지윤숙; 조성우; 임준우
Original assignee: 숭실대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-07

Abstract

본 발명은 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 활용하여 피부 장벽을 통한 기능성 단백질의 전달 효율이 우수하고, 적은 양으로도 우수한 기능성(주름개선, 미백, 항염 등)을 가지는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법 {COSMECEUTICAL COSMETICS INCLUDING PROTEIN CARRIER USING POLYAMINO ACID DERIVATIVE HAVING HIGHER ORDER STRUCTURE}

본 발명은 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 활용하여 피부 장벽을 통해 기능성 단백질을 높은 효율로 전달하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

기능성 단백질은 코스메슈티컬(Cosmeceutical) 화장품의 중요 구성물질로 기대되고 있다. 이러한 상기 기능성 단백질로는 크게 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 섬유모세포성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF)가 있는데, 상기 상피세포성장인자는 인체의 자연치유 과정에서 새살을 돋게 하고 혈관을 재생시키는 몸 안의 상처치유 물질로 피부의 톤, 모공, 트러블, 탄력 등 전체적인 피부품질을 향상시켜주는 효과가 있으며, 이는 피부 각질을 형성하는 세포(keratinocytes 등)의 활동을 촉진시켜 피부의 재생주기를 정상화시키는 작용을 한다.

또한, 상기 섬유모세포성장인자는 표피 아래 진피층까지 재생작용을 하여 피부 속 3대 중요 구성물질 합성을 촉진하여 피부 노화와 직접 관련이 있는 주름, 처짐, 건조함 등을 개선시켜주는 효과가 있다.

그러나, 이러한 기능성 단백질은 화장품 제형에 적용하게 되면 쉽게 단백질 구조 안정성이 파괴되는 현상이 발생할 수 있는데, 이는 주름 개선, 미백, 치료 등 성능 저하를 가져올 뿐 아니라 기능성 단백질이 산화되어 오히려 피부에 해를 끼치는 현상을 초래할 수 있다. 그러므로, 이러한 기능성 단백질의 피부 적용을 효과적으로 피부 장벽을 통해 전달하는 기술에 대한 연구가 시급한 실정이다.

이러한 연구의 일예로, 일본 공개특허 제2015-110522 호에서는 리포좀을 기능성 단백질의 전달체로서 사용하고 있으나, 리포좀, 고분자 전달체 등 일반적인 전달체를 사용하여 기능성 단백질을 전달할 수 있으나 안정성 및 전달효율에 한계를 지니는 문제가 있고, 특히, 리포좀의 경우 용액 상에서 분산된 입자들이 서로 달라붙어 응집되는 현상이 일어나고, 짧은 시간 안에 봉입된 물질이 유출되는 단점이 있다.

한편, 기능성 단백질은 단백질 분자이기 때문에 구조 안정성 문제와 피부장벽을 통한 전달효율이 현저히 낮은 한계를 갖고 있으며, 이를 해결하기 위한 신개념 전달체 개발이 요구되고 있고, 기능성 단백질은 안정적으로 포집할 수 있는 기술, 그리고 피부 장벽을 통한 전달 효율을 향상시켜, 적은 양으로 우수한 기능성(주름개선, 미백, 항염 등)을 확보할 수 있는 기술에 대한 연구가 촉구되고 있다.

일본 공개특허 제2015-110522 호 (2015.06.18.)

상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출한 본 발명은 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 활용하여 피부 장벽을 통한 기능성 단백질의 전달 효율이 우수하고, 적은 양으로도 우수한 기능성(주름개선, 미백, 항염 등)을 가지는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법은 자기조립체를 포함하는 제1 상을 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계; 상기 제1 용액에 제2 상을 투입하고 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계; 상기 제2 용액에 제3 상을 투입하고 교반하여 제3 용액을 제조하는 단계; 상기 제3 용액에 제4 상을 투입하고 교반하여 제4 용액을 제조하는 단계; 상기 제4 용액에 제5 상을 투입하고 교반하여 제5 용액을 제조하는 단계; 상기 제5 용액을 가스 제거(Degassing)하는 단계; 및 가스 제거된 제5 용액을 필터링하여 코스메슈티컬 화장품을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제1 상은 정제수(Water); 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol); 자기조립체; 글리세레스-26(Glycereth-26); 베타인(Betaine); 다이프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol); 1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol); 메틸글루세스-20(Methyl Gluceth-20); 비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인(Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane); 피이지-32(PEG-32); 다이소듐 이디티에이(Disodium EDTA); 및 알에이치-올리고펩타이드-1(rh-Oligopeptide-1);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제2 상은 하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트 코폴리머(Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer); 아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트 크로스폴리머(Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer); 셀룰로오스검(Cellulose Gum); 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제3 상은 정제수(Water); 및 알지닌(Arginine);을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제4 상은 글리세린(Glycerin); 및 소듐폴리아크릴레이트(Sodium Polyacrylate);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제5 상은 카카오 추출물(Theobroma Cacao (Cocoa) Extract); 및 덱스트린(Dextrin);을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적으로 상기한 제조방법을 통해 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품을 제조할 수 있다.

본 발명을 통해 피부 장벽을 통한 기능성 단백질의 전달 효율이 우수하고, 적은 양으로도 우수한 기능성(주름개선, 미백, 항염 등)을 가지는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 코스메슈티컬 화장품의 제조방법 도식이다.
도 2의 (a)는 자기조립체의 제조과정을 나타낸 도식이고, 구체적으로는 도 2의 (a-1)은 전구체인 폴리숙신이미드(Polysuccinimide, PSI)의 제조과정을 나타낸 것이고, 도 2의 (a-2)는 PHEA-NH2의 제조과정을 나타낸 것이며, 도 2의 (a-3)는 자기조립체인 PHEA-g-oligo(L-valine)의 제조과정을 나타낸 것이고, 도 2의 (b) PHEA-g-oligo(L-valin) 자기조립체의 DS 및 DP효과에 대한 도면이다.
도 3은 valine-conjugated PHEAs의 분자적 특성을 나타낸 표이다.
도 4의 (a) ~ (c)는 PHEA-g-Oval 1, PHEA-g-Oval 2 및 PHEA-g-Oval 3 각각을 H-NMR을 통해 분석한 결과 그래프이다.
도 5의 a-1은 Pyrene이 포집된 PHEA-g-oligo(L-valin)의 농도에 따른 형광 방출 스펙트럼 및 I₃/I₁ 비율을 나타낸 그래프, 도 5의 a-2는 형광스펙트럼에 의해 측정된 PHEA-g-oligo(L-valin) 자기조립체의 임계미셀농도 그래프, 도 5의 b-1은 PHEA-g-oligo(L-valin) 자기조립체의 원형편이색성 스펙트럼 그래프, 도 5의 b-2는 베타 시트 비율과 발린 분자 수 그래프이다.
도 6의 a는 PHEA-g-oligo(L-valin) 자기조립체의 f(w) 평가를 위한 도식, 도 6의b는 접목도 및 중합도에 따른 자기조립체의 f(w) 검량선 그래프, 도 6의 c는 PHEA-g-Oval 1의 TEM 이미지, 도 6의 d는 PHEA-g-Oval 2의 TEM 이미지, 도 6의 e는 PHEA-g-Oval 3의 TEM 이미지이다. 도 7은 시험대상자 정보에 관한 표이고, 도 8은 시험대상자의 무작위 배정표이다.
도 9의 (a-1) ~ (a-2)는 눈가주름(Ra) 깊이를 분석 수행한 그래프이고, 도 9의 (b-1) ~ (b-2)는 눈가주름(Rmax)의 깊이를 분석 수행한 그래프이다.
도 10은 시험대상자의 눈가주름(Ra)를 분석한 결과 표이고, 도 11은 시험대상자의 눈가주름(Rmax)를 분석 수행한 결과 표이다.
도 12는 시험대상자를 Visia-CR을 통해 촬영한 정면 이미지이고, 도 13 ~ 도 15는 시험대상자를 Visia-CR을 통해 촬영한 눈가 주름 이미지이다.
도 16은 시험대상자를 Primos CR를 통해 눈가 주름부위를 촬영한 이미지이다.
도 17은 시험대상자가 유효성 평가 설문한 결과표이고, 도 18 ~ 19는 시험대상자가 시험제품 및 대조제품에 대하여 기호도 평가한 결과표이다.
도 20은 안전성 평가에 관한 것으로, 연구자가 각 시험대상자를 육안으로 평가한 그래프이고, 도 21은 안전성 평가에 관한 것으로, 시험대상자가 시험제품 및 대조제품의 안전성을 평가한 결과표이다.
도 22는 EGF 단백질 구조가 시간에 따라 붕괴되는 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 눈가주름(Rmax) 분석 수행한 결과 표이다.
도 24는 시험대상자가 실시한 시험제품 및 대조제품의 기호도 설문조사 결과이다.
도 25는 시험대상자의 시험제품 및 대조제품의 유효성 평가 설문조사 결과이다.

이하 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

기능성 단백질에는 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 섬유모세포성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF) 등이 있고, 상기 상피세포성장인자는 인체의 자연치유 과정에서 새살을 돋게 하고 혈관을 재생시키는 몸 안의 상처치유 물질로 피부의 톤, 모공, 트러블, 탄력 등 전체적인 피부품질을 향상시켜준다. 그리고, 상기 섬유모세포성장인자는 표피 아래 진피층까지 재생작용을 하여 피부 속 3대 중요 구성물질 합성을 촉진하여 피부 노화와 직접 관련이 있는 주름, 처짐, 건조함 등을 개선시켜 준다.

이러한 기능성 단백질을 화장품 제형에 적용하게 되면 쉽게 단백질 구조 안정성이 파괴되는 현상이 발생하는 문제가 있었다. 이는 주름 개선, 미백, 치료 등 성능 저하를 가져올 뿐 아니라 기능성 단백질이 산화되어 오히려 피부에 해를 끼치는 현상이 발생할 수 있다.

한편, 상기 기능성 단백질 중 상피세포성장인자(EGF)는 도 22에도 나타내었듯이, 시간에 따라 그 구조가 붕괴되기 때문에, 피부 장벽을 통과하여 기능성 단백질을 효과적으로 전달하기 위해서는 단백질 전달체가 필수적이다.

본 발명은 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 이용한 코스메슈티컬 화장품 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

상기한 기능성 단백질은 α-헬릭스(α-helix) 및 β-시트(β-sheet)를 일정 비율로 포함하고 있는 2차 구조인데, 본 발명의 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체는 상기 기능성 단백질과 유사한 구조로 설계될 수 있다.

구체적으로는, 상기 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체는 α- 헬릭스(α-helix) 및 β-시트(β-sheet)의 구조를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 α-헬릭스(α-helix) 2.9% 및 β-시트(β-sheet) 28%를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기능성 단백질과 α-헬릭스(α-helix) 및 β-시트(β-sheet)의 비율이 동일할 수 있다.

한편, 상기 기능성 단백질 전달체는 도 1에 나타낸 바와 같이 양친성 폴리아미노산 유도체를 합성하여 고차구조 폴리아미노산 자기조립체를 제조한 후, 기능성 단백질(EGF)을 봉입하여 제조할 수 있으며, 이를 화장품 제형에 적용할 수 있다.

먼저, 상기 기능성 단백질 전달체의 제조방법은 양친성 폴리아미노산 유도체를 합성하여 고차구조 폴리아미노산 자기조립체를 제조하는 단계; 및 기능성 단백질(EGF)을 봉입하여 기능성 단백질 전달체를 제조하는 단계;를 포함하여 제조할 수 있다.

이때, 상기 양친성 폴리아미노산 유도체는 친수성 폴리아미노산 유도체에 소수성 아미노산을 접목시켜 제조할 수 있다. 상기 양친성 폴리아미노산 유도체는 폴리숙신이미드(polysuccinimide, PSI)를 전구체(원료)로 하여 얻어진 PHEA-NH₂에 L-valine 또는 L-leucine를 접목하여 PHEA-g-Oligo(L-amino acid)를 제조할 수 있다. 그리고, 상기 L-valine 및 L-leucine의 NCA(N-carboxyanhydride)를 만들어 접목시킬 수 있다. 이때, 상기 L-valine 및 L-leucine은 각각 α-helix, β-sheet 같은 단백질 2차 구조를 형성하며, 이 2차 구조의 패킹 정도를 제어하여 생체모방 자기조립체(기능성 단백질 봉입 전)를 제조할 수 있다.

상기한 자기조립체는 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에서 전구체로 사용한 poly(succinimide) (PSI, Mw: 27,000g/mol)는 아스파르트산(L-aspartic acid, Sigma)을 산 촉매(phosphoric acid, Sigma) 하에서 180℃로 중합하여 얻었다. (도 2의 (a-1)) 이렇게 합성한 PSI를 DMF(N, N'-dimethylformamide, Sigma)에 녹여 적정량(designated)의 에탄올아민(ethanolamine, Sigma)을 첨가하고 6시간 반응 후, 에틸렌디아민(ethylenediamine, Sigma)을 과량으로 첨가하여 연속적으로(sequentially) 반응시키는 과정을 통해, 아민기가 도입된 poly(2-hydroxyehtyl aspartamide) (PHEA-NH₂)를 합성하였다. (도 2의 (a-2)) PHEA-NH₂을 개시제(macroinitiator)로 하여, 발린 NCA(valine N-carboxyanhydride)를 원하는 중합도에 맞게 적정량 첨가한 후 질소 환경에서 40℃로 15시간 동안 중합시켜, 자기조립체인 PHEA-g-oligo(L-valine)을 합성하였다. (도1의 (a-3))

이때, 발린 NCA는 발린 분자(L-valine, Sigma)에 트리포스겐(triphosgene, Sigma)을 첨가하여 Fuchs-Farthing 합성법으로 얻었다. 합성한 Valine-NCA와 PHEA-NH₂는 DMSO-d6, PHEA-g-oligo(L-Valine)는 TFA-d를 용매로 400MHz에서 1H-NMR (AvanceⅡ Bruker Biospin)로 구조를 분석하여, 최종 고분자의 DS와 DP를 결정하였다.

합성한 PHEA-g-Oval(PHEA-g-oligo(L-valine))은 친수성 PHEA 백본과 소수성 발린이 모두 녹는 co-solvent(TFA)에 녹인 후, 증류수(DI water)에 도입하여 자기조립을 유도하였다. 이후, 투석(dialysis, MWCO; 3,500 g/mol)하여 잔존 용매를 제거하고 동결건조 하여 최종적으로 발린 분자가 접목된 양친성 고분자를 파우더형태로 얻었다. 이렇게 준비된 고분자는 수용액에 녹인 후 750W로 초음파처리(tip type sonication, VCX-750, Sonics, USA)를 10분간 진행하여 자기조립체를 형성시킨 후, 이후에 있는 자기조립체 분석에 사용하였다. 자기조립체의 크기분포도는 90℃의 산란각에서 He-Nelaser를 방출하는 DLS(dynamic light scattering, Nano S90, Malvern Inc., England)로 측정하였다. 임계자기조립농도, CAC(critical aggregation concentration)는 피렌 프로브(pyrene probe)를 사용하여 330nm에서 여기하고 방출되는 스펙트럼을 photo luminescence (with bandwidth; 2.0 nm, QM40, PTI, USA)로 측정하여 확인하였다. 자기조립체에 형성된 2차 구조, β-sheet 구조는 CD(circular dichroism, J-815, JASCO)로 180-250 nm에서 분석하였다. 마지막으로 80kV에서 투과전자현미경(TEM-2010, JEOL Ltd., Japan)을 이용하여 수용액에서 형성된 PHEA-g-OVal 자기조립체의 형태를 관찰하였다.

상기한 고차구조 아미노산 유도체의 자기조립 현상은 L-valine 분자의 중합도(Degree of polymerization, DP)와 접목도(Degree of substitution, DS)에 영향을 받을 수 있다.

베타 시트 구조를 형성할 수 있는 발린 분자를 접목하여 그래프트 공중합체, PHEA-g-oligo(L-valine)를 합성하였다. 발린 분자의 접목도(DS)는 PHEA 분자에 도입된 아민기 접목도로 제어할 수 있었다. 여기서 접목도란 친수성 PHEA 백본(backbone)의 반복 단위마다 접목된 아민기의 mol%를 의미하며, 1H-NMR 분석 결과를 활용하여 하기 계산식 1과 같이 계산할 수 있었다.

[계산식 1]

또한, 중합도(DP)는 친수성 PHEA에 접목된 각 아민기로부터 Valine-NCA가 중합된 발린 분자의 개수를 의미하며, 하기 계산식 2를 통해 산출할 수 있었다.

[계산식 2]

본 발명의 발명자들은 도 2의 b)에 나타내었듯이, L-valine 분자의 중합도(DP)와 접목도(DS)를 각각 제어하여, 수용액상에서 분자의 2차 구조 형성 정도와 자기조립 현상과의 연관성 확인하였으며, 상기 생체모방 자기조립체의 β-sheet 함량은 L-valine 분자의 중합도(DP)에 따라, 자기조립체의 형태(구조 변이)는 접목도(DS)에 주도적으로 영향을 받는 것을 확인하였다.

그 결과 본 발명에서는 도 3에 정리한 것과 같이, 접목도가 4.5, 6.2, 10.9 mol%, 중합도 6, 10, 6 개를 갖는 양친성 폴리아미노산을 제조하였고 각각을 PHEA-g-Oval 1, PHEA-g-Oval 2, PHEA-g-Oval 3으로 명명하였다. 여기서 주목할 것은 PHEA-g-Oval 2과 PHEA-g-Oval 3는 접목도와 중합도는 다르지만 분자 한 개 당 도입된 전체 발린 분자 개수는 비슷한 수준인 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 PHEA-g-Oval 1, PHEA-g-Oval 2 및 PHEA-g-Oval 3 각각을 H-NMR을 통해 분석한 결과를 도 4의 (a) ~ (c)에 나타내었다. 이때, 그래프의 각 피크는 하기 화학식 1에 해당하는 부분이다.

[화학식 1]

이때, 상기 화학식 1의 x, y, z는 1 ~ 20의 정수이고, a, b, c, d, e, f, g, h는 H-NMR로 분석하였을 때 분석되는 피크이다.

본 발명의 발명자들은 합성된 양친성 폴리아미노산 유도체(PHEA-g-OVal)의 수용액상에서 일어나는 자기조립체 형성에 대한 특성화 분석을 수행하였다. 구체적으로, 피렌(pyrene)을 프로브(probe)로 사용하여 임계미셀농도(critical aggregation concentration, CAC)를 측정하였다. 0.0032mg/mL에서 2mg/mL까지 PHEA-g-OVal의 농도를 증가시키면서 피렌을 첨가하여 375nm 파장에서 여기시켜 방출 스펙트럼으로부터 형광 강도 비율(I₃/I₁)을 PHEA-g-OVal에 대하여 플롯하였다.

그 결과, 도 5의 a-1)에 나타내었듯이, 낮은 농도에서는 I₃/I₁가 거의 일정하지만 농도가 증가하면서 I₃/I₁가 S자(sigmoidal)형태로 증가함을 알 수 있었는데, 이것은 피렌 분자의 미세환경 극성도가 감소하기 때문이며, PHEA-g-OVal이 수용액상에서 자기조립체를 형성하기 시작함을 의미한다. 따라서, 광강도 비율(I₃/I₁)에서의 급격한 변화점이 CAC이며, CAC는 회귀직선을 통해 외삽으로 구할 수 있고 두 직선의 교차점을 읽으면 CAC값을 얻게 된다. 도 5의 a-2)에도 나타내었듯이, PHEA-g-OVal에 대한 CAC값은, PHEA-g-Oval 1는 2.5Х10^-1mg/mL이고, PHEA-g-Oval 2는 1.5Х10^-1mg/mL이고, PHEA-g-Oval 3는 1.0Х10^-1mg/mL이었다. 이러한 결과는 L-valine의 접목도가 증가할수록 CAC는 감소하는 경향을 보여주는데, 이것은 접목도가 증가할수록 자기조립체를 쉽게 형성할 수 있고 더욱 안정한 자기조립체를 형성할 수 있음을 나타낸다.

한편, 본 발명의 발명자들은 고차구조 폴리아미노산 자기조립체의 β-sheet(2차 구조) 형성 정도를 확인하였는데, PHEA-g-OVal의 자기조립체 형태는 수용액상에서 L-valine 분자의 2차 구조 형성 및 결합 정도에 기인한다. 때문에, 자기조립체 내에 도입된 2차 구조를 원형편광이색성(circular dichroism, CD) 분광기를 사용하여 확인할 수 있다. 특히, 아래 식과 같이, 분자당 편광 타원율(mean residual ellipticity,

)로 정규화(normalized)하여 2차 구조 형성 정도를 확인할 수 있다.

[관계식 3]

상기 관계식 3에서,

는 측정된 파장에 따른 타원율(ellipticity) 값, M_MRW는 폴리아미노산 분자의 반복 단위의 평균 분자량, c는 측정 시료의 농도, l은 측정 큐벳(cuvette)의 길이를 의미한다.

그 결과, 도 5의 b-1)에도 나타내었듯이, 양친성 폴리아미노산 유도체로 제조한 자기조립체는 모두 안정적인 β-sheet구조를 갖는 것을 확인하였다. 특히, 도입된 L-valine 분자의 수가 많을수록 분자 내의 β-sheet 형성비(% of β-sheet)가 증가하는 것을 알 수 있었다.

그리고, 도 5의 b-2)에 나타내었듯이, 전체 도입된 L-valine 분자 개수가 비슷한 PHEA-g-Oval 2와 PHEA-g-Oval 3을 비교해보면, PHEA-g-Oval 2가 β-sheet 형성이 더 잘 되었음을 확인할 수 있었다. 이는 양친성 폴리아미노산 유도체의 β-sheet 형성이 도입된 발린 분자 수가 동일한 경우, 접목도보다는 중합도에 더 영향을 받기 때문으로 판단된다.

한편, 본 발명의 발명자들은 고차구조 폴리아미노산 자기조립체의 형태를 분석 수행하였는데, 일반적으로 자기조립체의 형태는 양친성 분자의 구조에 따라 예측 가능하다. 양친성 폴리아미노산 유도체의 경우, 도 6의 (a)와 같이 친수성 헤드 그룹을 소수성 분자단이 차지하는 정도에 따라 상응하여 친수성 정도(fhydrophilic)를 계산하여 예측할 수 있다. 예측 모델(도 6의 (b))에 의하면 본 발명에서 적용한 접목도 범위에서는 모두 미셀 형태의 구형 자기조립체를 기대할 수 있다. 그러나, TEM결과에서 볼 수 있는 것처럼 접목도가 증가함에 따라 자기조립체의 형태가 도 6 (c)와 같이 구형 입자(spherical structure), 도 6의 (d)와 같이 층상 구조(lamellar-like structure), 도 6의 (e)와 같이 막대 형태(rod-like structure)로 변화하는 것을 확인할 수 있다. 일반적인 소수성-소수성 결합에 의해 형성되는 자기조립체와 비교할 때, β-sheet mediated self-assembly의 경우, 접목도에 따라 그래프트 분자 내 이웃한 분자와의 결합(intermolecular interaction)이 증가하여, 층상 구조를 갖는 형태의 자기조립체를 형성하는 것을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 목적인 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 조성물로는 정제수(Water); 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol); 자기조립체(PHEA-g-Oligo); 글리세레스-26(Glycereth-26); 베타인(Betaine); 다이프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol); 1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol); 메틸글루세스-20(Methyl Gluceth-20); 비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인(Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane); 피이지-32(PEG-32); 다이소듐 이디티에이(Disodium EDTA); 알에이치-올리고펩타이드-1(rh-Oligopeptide-1); 하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트 코폴리머(Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer); 아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트 크로스폴리머(Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer); 셀룰로오스검(Cellulose Gum); 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate); 알지닌(Arginine); 글리세린(Glycerin); 소듐폴리아크릴레이트(Sodium Polyacrylate); 카카오 추출물(Theobroma Cacao (Cocoa) Extract); 및 덱스트린(Dextrin);을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 목적인 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법은 제1 상을 교반하여 제1 용액을 제조하는 1단계; 상기 제1 용액에 제2 상을 투입하고 교반하여 제2 용액을 제조하는 2단계; 상기 제2 용액에 제3 상을 투입하고 교반하여 제3 용액을 제조하는 3단계; 상기 제3 용액에 제4 상을 투입하고 교반하여 제4 용액을 제조하는 4단계; 상기 제4 용액에 제5 상을 투입하고 교반하여 제5 용액을 제조하는 5단계; 상기 제5 용액을 가스 제거(Degassing)하는 6단계; 및 가스 제거된 제5 용액을 필터링하여 코스메슈티컬 화장품을 제조하는 7단계;를 포함할 수 있다.

먼저, 상기 1단계의 제1 상은 자기조립체를 포함할 수 있으며, 상세하게는 정제수(Water); 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol); 자기조립체; 글리세레스-26(Glycereth-26); 베타인(Betaine); 다이프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol); 1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol); 메틸글루세스-20(Methyl Gluceth-20); 비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인(Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane); 피이지-32(PEG-32); 다이소듐 이디티에이(Disodium EDTA); 및 알에이치-올리고펩타이드-1(rh-Oligopeptide-1);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제1상은 코스메슈티컬 화장품의 조성물 100중량% 중에서 정제수(Water) 50.239중량%; 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol) 9.50중량%; 자기조립체(PHEA-g-Oligo) 8.0중량%; 글리세레스-26(Glycereth-26) 4.5중량%; 베타인(Betaine) 2.5중량%; 다이프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol) 2.3중량%; 1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol) 2.0중량%; 메틸글루세스-20(Methyl Gluceth-20) 2.0중량%; 비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인(Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane) 0.7중량%; 피이지-32(PEG-32)0.5중량%; 다이소듐 이디티에이(Disodium EDTA)0.01중량%; 및 알에이치-올리고펩타이드-1(rh-Oligopeptide-1) 0.001중량%;를 포함하였다.

한편, 상기 1단계의 교반은 분산 믹서(disperse mixer)를 통해 상기 제1상의 재료를 10분 동안 실온에서 1,000rpm의 회전속도로 수행하였다.

다음으로, 상기 2단계의 제2 상은 하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트 코폴리머(Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer); 아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트 크로스폴리머(Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer); 셀룰로오스검(Cellulose Gum); 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제2 상은 코스메슈티컬 화장품의 조성물 100중량% 중에서 하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트 코폴리머(Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer) 0.56중량%; 아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트 크로스폴리머(Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer) 0.42중량%; 셀룰로오스검(Cellulose Gum) 0.15중량%; 및 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate) 0.04중량%;를 포함하였다.

한편, 상기 2단계의 교반은 분산 믹서(disperse mixer)를 통해 30분 동안 실온에서 1,500rpm의 회전속도로 수행하였다.

다음으로, 상기 3단계의 제3 상은 정제수(Water); 및 알지닌(Arginine);을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제3 상은 코스메슈티컬 화장품의 조성물 100중량% 중에서 정제수(Water) 5.0중량%; 및 알지닌(Arginine) 0.42중량%;를 포함하였다.

한편, 상기 3단계의 교반은 호모 믹서(Homo mixer) 5분 동안 실온에서 3,000rpm의 회전속도로 수행하였다.

다음으로, 상기 4단계의 제4 상은 글리세린(Glycerin); 및 소듐폴리아크릴레이트(Sodium Polyacrylate);를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제4 상은 코스메슈티컬 화장품의 조성물 100중량% 중에서 글리세린(Glycerin) 11.0중량%; 및 소듐폴리아크릴레이트(Sodium Polyacrylate) 0.14중량%;를 포함하였다.

한편, 상기 4단계의 교반은 호모 믹서(Homo mixer) 10분 동안 실온에서 3,000rpm의 회전속도로 수행하였다.

다음으로, 상기 5단계의 제5 상은 카카오 추출물(Theobroma Cacao (Cocoa) Extract); 및 덱스트린(Dextrin);을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 제4 상은 코스메슈티컬 화장품의 조성물 100중량% 중에서 카카오 추출물(Theobroma Cacao (Cocoa) Extract) 0.01중량%; 및 덱스트린(Dextrin) 0.01중량%;를 포함하였다.

한편, 상기 5단계의 교반은 호모 믹서(Homo mixer) 5분 동안 실온에서 3,000rpm의 회전속도로 수행하였다.

다음으로, 상기 6단계의 가스 제거는 패들 믹서(Paddle mixer)를 통해 실온에서 20rpm의 회전속도로 수행하였다.

상기한 방법으로 제조된 코스메슈티컬 화장품은 그 종류를 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 앰플형태로 제조할 수 있다.

상기 코스메슈티컬 화장품의 효능을 평가하기 위하여, 본 발명에 따른 시험제품, 및 대조제품을 제조하였으며, 시험제품을 'T-SKIN3'으로 명명하고, 대조제품을 'T-SKIN2'라고 명명하였다. T-SKIN3 및 T-SKIN2의 구성은 하기 표 1과 같다.

이때, 상기 코스메슈티컬 화장품은 앰플 타입으로 제조하였으며, 자기조립체(고차구조)를 4ppm으로 포함하고, EGF를 10ppm으로 포함하여 제조하였다.

No.	시험제품(T-SKIN3)	No.	대조제품(T-SKIN2)
1	정제수	1	정제수
2	글리세린	2	글리세린
3	부틸렌글라이콜	3	부틸렌글라이콜
4	글리세레스-26	4	글리세레스-26
5	베타인	5	베타인
6	다이프로필렌글라이콜	6	다이프로필렌글라이콜
7	1,2-헥산다이올	7	1,2-헥산다이올
8	메틸글루세스-20	8	메틸글루세스-20
9	비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인	9	비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인
10	피이지-32	10	피이지-32
11	하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트코폴리머	11	하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트코폴리머
12	아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트크로스폴리머	12	아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트크로스폴리머
13	알지닌	13	알지닌
14	소듐하이알루로네이트	14	소듐하이알루로네이트
15	셀룰로오스검	15	셀룰로오스검
16	소듐폴리아크릴레이트	16	소듐폴리아크릴레이트
17	다이소듐이디티에이	17	다이소듐이디티에이
18	카카오추출물	18	카카오추출물
19	덱스트린	19	덱스트린
20	알에이치-올리고펩타이드-1	20	알에이치-올리고펩타이드-1
21	에스에이치-올리고펩타이드-1	21	자기조립체(고차구조)
22	카퍼트라이펩타이드	22	상피세포성장인자(EGF)
23	자기조립체(고차구조)
24	상피세포성장인자(EGF)

상기 표 1에 나타낸 바와 같이 T-SKIN3은 에스에이치-올리고펩타이드-1와 카퍼트라이펩타이드-1를 유효성분(자기조립체)으로 하고, T-SKIN2은 상기 유효성분을 제외하고는 동일한 구성이다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 T-SKIN3의 눈가주름 개선에 대한 효과를 평가하기 위해서 시험대상자 선정기준 및 제외기준을 만족하는 30 ~ 65세의 성인 여성 24명을 선정하였다. 이때, 상기 시험대상자 선정기준은 눈가에 주름을 보유한 자, 시험책임자 또는 시험책임자의 위임을 받은 사람으로부터 시험대상자에게 알려주어야 할 사항에 대하여 충분히 설명을 듣고 자발적으로 동의서를 작성하고 서명한 자 및 피부 질환을 포함하는 급, 만성 신체 질환이 없는 건강한 자로 하였다.

그리고, 상기 시험대상자 선정 제외기준은 임신 또는 수유중인 여성과 임신 가능성이 있는 여성, 피부 질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 자, 동일한 실험에 참가한 뒤 6개월이 경과되지 않은 자, 민감성, 과민성 피부를 가진 자 시험대상자, 시험 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상소견이 선정 제외기준 있는 자, 연구 시작 전 3개월 내에 연구 부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 자, 연구 시작 전 6개월 내에 피부 박피 시술, 주름 제거 시술 등을 받은 자, 그 외 시험책임자 또는 시험책임자의 위임을 받은 사람의 판단으로 실험에 부적합하다고 생각되는 자에 해당하는 자는 제외하는 것으로 하였다.

상기 선정된 24명에게 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이 시험제품(T-SKIN3) 및 대조제품(T-SKIN2)을 각각 12주 동안 사용하게 하였으며, 구체적으로는 1일 2회 아침, 저녁 세안 후 1-2방울 정도 얼굴에 고루 펴 바르게 하였다. 또한, 인체적용 시험기간 중 본 센터에서 지급한 시험제품 이외에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품(예: 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품)의 사용을 일체 금하였다.

결과 도출을 위하여, 다음과 같은 평가항목으로 평가하였는데, 구체적으로는 기기적 평가, 유효성 평가 설문조사 및 안전성 평가로 평가하였다.

먼저, 기기적 평가 방법은 Primos CR을 통해 눈가 주름(Ra, Rmax)을 측정하였고, Visia-CR을 통해 제품 적용부위를 촬영하여 육안으로 평가하였고, 상기 유효성 평가 설문조사는 시험 대상자 각각에게 평가하게 하였으며, 상기 안전성 평가는 사용 전, 4주 후, 8주 후 및 12주 후로 총 4회 방문하여 수행하였으며, 방문 시 시험제품 사용부위에 대한 연구자 육안평가 결과와 시험대상자 설문결과를 종합하여 연구자가 평가하였다.

그 결과, Primos CR 촬영 결과는 도 16에 나타내었으며, 눈가주름(Ra)의 측정결과(도 9의 (a-1) ~ (a-2) 및 도 10) 시험제품 사용 부위는 사용 전과 비교하여 사용 4주 후, 사용 8주 후, 사용 12주 후 유의하게 감소(p<0.017)한 것으로 나타났으며, 대조제품 사용 부위는 사용 전과 비교하여 사용 12주 후 유의하게 감소(p<0.05)하였다. 또한, 시험제품 사용 부위는 대조제품 사용 부위와 비교하여 사용 전 대비 사용 12주 후 유의한 차이(p<0.05)가 나타났다.

한편, 눈가주름(Rmax) 측정결과(도 9의 (b-1) ~ (b-2), 도 11 및 도 23) 시험제품 사용 부위는 사용 전과 비교하여 사용 12주 후 유의하게 감소(p<0.05)하였고, 대조제품 사용부위는 사용 전과 비교하여 모든 시점에서 유의한 변화가 나타나지 않았다. 또한, 시험제품 사용 부위는 대조제품 사용 부위와 비교하여 사용 전 대비 사용 12주 후 유의미한 차이(p<0.05)가 나타났다.

한편, 상기 Visia-CR을 통해 제품 적용부위를 촬영하여 평가한 결과는 도 12(얼굴 정면 촬영), 도 13 ~ 도 15(눈가 주름 촬영)

한편, 상기 시험제품 및 대조제품에 대한 유효성 평가 설문조사 결과, 시험제품 사용 부위는 눈가 주름 개선 항목에 대하여 시험대상자의 91.667%가 약간 개선됨 이상으로 평가하였고, 대조제품 사용 부위는 눈가 주름 개선 항목에 대하여 시험대상자의 95.833%가 약간 개선됨 이상으로 평가하였다. (도 17 ~ 도 19 및 도 25)

한편, 상기 시험대상자들을 대상으로 실시한 시험제품 및 대조제품의 기호도 설문조사 결과를 도 24의 표에 나타내었다.

한편, 상기 안전성 평가 결과로는 시험대상자가 시험제품을 사용하는 기간 동안 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며(도 20 ~ 도 21), 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에도 이상소견은 관찰되지 않았다.

따라서 시험제품인 "T-SKIN3"는 12주 사용으로, 눈가주름 개선에 도움을 주는 제품으로 판단된다.

이상에서 본 발명의 일 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims

자기조립체를 포함하는 제1 상을 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계;
상기 제1 용액에 제2 상을 투입하고 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계;
상기 제2 용액에 제3 상을 투입하고 교반하여 제3 용액을 제조하는 단계;
상기 제3 용액에 제4 상을 투입하고 교반하여 제4 용액을 제조하는 단계;
상기 제4 용액에 제5 상을 투입하고 교반하여 제5 용액을 제조하는 단계;
상기 제5 용액을 가스 제거(Degassing)하는 단계; 및
가스 제거된 제5 용액을 필터링하여 코스메슈티컬 화장품을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 상은 정제수(Water); 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol); 자기조립체; 글리세레스-26(Glycereth-26); 베타인(Betaine); 다이프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol); 1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol); 메틸글루세스-20(Methyl Gluceth-20); 비스-피이지-18 메틸에터다이메틸실레인(Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane); 피이지-32(PEG-32); 다이소듐 이디티에이(Disodium EDTA); 및 알에이치-올리고펩타이드-1(rh-Oligopeptide-1);를 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 상은 하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트 코폴리머(Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer); 아크릴레이트/C10-30 알킬아크릴레이트 크로스폴리머(Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer); 셀룰로오스검(Cellulose Gum); 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate);를 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제3 상은 정제수(Water); 및 알지닌(Arginine);을 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제4 상은 글리세린(Glycerin); 및 소듐폴리아크릴레이트(Sodium Polyacrylate);를 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제5 상은 카카오 추출물(Theobroma Cacao (Cocoa) Extract); 및 덱스트린(Dextrin);을 포함하는 것을 특징으로 하는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조되는 고차구조 폴리아미노산 유도체를 활용한 효과적인 기능성 단백질 전달체를 포함하는 코스메슈티컬 화장품.