KR20220032974A - 현호색 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
현호색 추출물을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 현호색 추출물을 포함하는 탈모의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물은 DHT에 의해 억제된 모유두세포의 증식을 활성화시키며, 모유두세포의 생장기 세포를 증가시키고 사멸세포를 감소시키므로 모발의 성장을 촉진하는 효과를 갖는다.
Description
본 발명은 현호색 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물은 모유두 세포를 증식시키고 모발 길이의 성장을 촉진하는 효과를 갖는다.
인간의 머리카락은 약 100,000개의 개별 모발의 집합체이며, 모발은 모낭 (hair follicle)에 의해 생성된다. 모낭은 모낭 자신, 상피 및 피지선을 재구성하는 데 필요한 모든 세포주를 생성할 수 있는 줄기세포의 저장소 역할을 한다. 모낭은 모유두 세포 (dermal papilla cell: DPC), 모모세포 (hair germinal matrix cell), 외모근초 세포 (outer root sheath: ORS), 내모근초 세포 (inner root sheath: IRS) 등으로 구성되어 있다.
모유두 세포는 모발의 발생과 성장을 담당하는 핵심 세포로, 모발의 피하에 있는 뿌리인 모근의 가장 밑부분에 위치한다. 실제로 두피에서 모유두 세포를 채집해 배양 후 이식할 경우 모발이 새로 자라난다. 하지만 모유두 세포를 탈모 치료제로 사용하기에는 여러 어려움이 존재한다. 우선 두피로부터의 분리가 어렵고, 배양 조건이 까다로우며 충분한 양의 세포를 배양하는 것이 어렵다. 또한 많이 배양할 경우 모발 재생 능력이 현저히 저하되는 한계가 있다.
모발은 성장기 (anagen), 퇴화기 (catagen) 및 휴지기 (telogen)의 3단계 주기를 거쳐 성장, 유지 및 탈락된다. 모발이 자라는 기간인 성장기에는 성인의 경우, 하루 평균 0.3 mm 정도의 모발이 자라며, 한 달에 1 cm 정도 성장하고, 통상 3년 내지 7년간 지속되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 성장기 후 10일 내지 14일 동안 전반적인 모낭세포의 세포사멸 (apoptosis)이 일어나면서 모낭이 축소되는 단계인 퇴화기 (catagen), 평균 3개월의 다음 성장기를 준비하는 단계인 휴지기 (telogen)를 거쳐 모발이 빠지게 되며, 부위별로 모발의 길이가 다른 이유는 각각의 부위에 따라서 모낭의 고유한 특징인 성장기의 지속기간이 서로 다르기 때문이다.
이와 같이 사람의 모발은 일정한 모발 성장주기 (hair growth cycle)를 가지고 있기 때문에 항상 일정한 수의 모발을 유지하게 된다. 그러나 탈모가 진행되면 모근에 존재하는 모유두가 작아지고, 모유두가 작아지면 머리털의 굵기가 가늘어지고, 동시에 모발 성장주기도 짧아진다. 따라서 탈모가 진행되면 머리털은 매우 가늘어지며 모발 성장주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠지게 된다.
탈모의 원인으로는 유전적인 원인, 남성호르몬의 작용뿐만 아니라 내분비 질환, 영양 결핍, 약물 사용, 출산, 발열, 수술 등의 심한 신체적, 정신적 스트레스 등의 요인들이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 남성형 탈모는 디히드로테스토스테론 (dihydrotestosterone, DHT)의 영향이 큰 것으로 알려져 있다. 남성 호르몬의 일종인 테스토스테론은 5α-reductase 효소에 의해 DHT로 활성화되며, 이 DHT가 탈모를 유도하는 것으로 알려져 있다. DHT는 모낭을 위축시켜 검고 굵은 모발을 가늘고 축 처지게 만드는 연모화 현상을 일으킨다. 또는 모근 파괴물질을 분비시켜 모발을 이른 시기에 퇴행기로 이행시켜 탈모가 진행된다.
현재 국내에서 가장 빈번하게 쓰이는 탈모 치료제로는 피나스테라이드 (finasteride; 상품명 Propecia®), 두타스테라이드 (dutasteride; 상품명 Avodart®), 미녹시딜 (minoxidil; 상품명 마이녹실® 또는 Rogaine®) 등이 있다. 피나스테라이드와 두타스테라이드는 5α-reductase 효소의 작용을 차단해 DHT생성을 억제하지만 성욕감퇴, 발기부전, 운전 및 수행능력 상실 등의 부작용을 나타낸다. 미녹시딜의 경우 도포 부위의 가려움, 홍반, 피부 자극, 눈의 자극 등의 부작용이 나타나며, 머리 이외에 다른 신체 부위에서의 원치 않는 모발의 성장이 관찰되기도 한다. 또한 최근 중증 탈모 환자들을 대상으로 모발 이식술이 시도되고 있지만, 고가의 비용과 시술 후 부작용이 한계로 지적되고 있다.
한편, 현호색 (Corydalis remota)은 양귀비목과의 식물로 알칼로이드 계열 성분이 주성분이다. 현호색의 충치 예방 (한국 등록특허 제 10-0999597호) 및 여드름 치료 (한국 등록특허 제 10-1059359 호) 효능이 알려져 있으나, 탈모의 개선 효능은 공지된 바 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 부작용이 적고 탈모 개선 효과가 우수한 천연물을 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 현호색 추출물 및 현호색 추출물로부터 분리된 팔마틴 (palmatine) 및 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline)이 우수한 탈모 개선 효과를 가지는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 현호색 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 팔마틴 (palmatine), 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 현호색 (Corydalis remota) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 현호색 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 현호색 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 용매는 에탄올 수용액일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 50% 에탄올 수용액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30% 에탄올 수용액일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 추출물은 현호색 중량 대비 7배수 또는 10배수의 에탄올 수용액으로 추출한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 추출물은 20 내지 30℃에서 교반 추출한 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 모유두 세포를 증식시키고 모발 길이를 성장시키는 효과를 나타낸다.
일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 모유두 세포의 생장기 세포 수를 증가시키고 사멸세포 수를 감소시키는 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 상기 분획물은 현호색 추출물에 물, C1 내지 C6의 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매를 가하여 분획된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 분획물은 현호색 추출물의 부탄올 분획물일 수 있다.
본 발명은 팔마틴 (palmatine), 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 팔마틴, 데히드로코리달린, 또는 이의 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 팔마틴, 데히드로코리달린, 또는 이의 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 팔마틴 또는 데히드로코리달린은 현호색 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 팔마틴 또는 데히드로코리달린은 현호색의 10 내지 50% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물로부터 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 현호색의 30% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 팔마틴 및 데히드로코리달린은 1:1 내지 1:20의 중량비로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1:3 내지 1:16의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 현호색 추출물은 DHT에 의해 억제된 모유두세포의 증식을 활성화시키며, 모유두세포의 생장기 세포를 증가시키고 사멸세포를 감소시키므로 탈모의 예방, 개선 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 현호색 추출물의 모발 길이 성장 촉진 효과를 나타낸다.
도 2는 현호색 추출물을 처리한 모유두세포의 세포 주기 변화를 나타낸다.
도 3은 현호색 추출물을 처리한 모유두 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 현호색 추출물을 처리한 모유두 세포에서 살아있는 세포와 사멸 세포의 비율을 나타낸다.
도 5는 현호색 추출물로부터 분획물과 분리물을 수득하는 과정을 나타낸다.
도 6은 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 분리물의 모유두세포 증식 효능을 나타낸다.
도 7은 현호색 추출물의 분리물의 성분 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 현호색 추출물의 분리물에서 수득한 각 성분의 모유두세포 증식율을 나타낸다.
도 9는 현호색 추출물의 분리물에서 수득한 팔마틴 및 데히드로코리달린을 단일 또는 혼합하여 처리한 경우 모유두세포 증식율을 나타낸다.
도 2는 현호색 추출물을 처리한 모유두세포의 세포 주기 변화를 나타낸다.
도 3은 현호색 추출물을 처리한 모유두 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 현호색 추출물을 처리한 모유두 세포에서 살아있는 세포와 사멸 세포의 비율을 나타낸다.
도 5는 현호색 추출물로부터 분획물과 분리물을 수득하는 과정을 나타낸다.
도 6은 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 분리물의 모유두세포 증식 효능을 나타낸다.
도 7은 현호색 추출물의 분리물의 성분 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 현호색 추출물의 분리물에서 수득한 각 성분의 모유두세포 증식율을 나타낸다.
도 9는 현호색 추출물의 분리물에서 수득한 팔마틴 및 데히드로코리달린을 단일 또는 혼합하여 처리한 경우 모유두세포 증식율을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 현호색 (Corydalis remota) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 팔마틴 (palmatine), 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 "탈모"는, 그 원인과 무관하게, 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 지칭하며, 예를 들어, 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모, 휴지기성 탈모, 스트레스성 탈모, 또는 화학요법제로 인해 발생한 탈모일 수 있다. 본 발명의 조성물은 DHT에 의해 억제된 모유두 세포의 증식과 모발 길이의 성장을 촉진하므로, 남성형 탈모의 치료에 특히 효과적일 수 있다.
상기 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
1) 현호색에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 현호색 추출물의 추출 방법으로는 교반추출, 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매를 가한 추출은 상온(25℃) 또는 40℃에서 진행할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출 용매 배수는 7배 또는 10배로 할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 팔마틴 (palmatine)은 팔마틴산에서 유도될 수 있는 유기화합물로, 화학명은 2,3,9,10-테트라메톡시-5,6-디히드로이소퀴놀리노[2,1-b]이소퀴놀린-7-이움이고, 프로토베르베린 알칼로이드의 하나이며, 하기의 구조식을 갖는다.
본 발명의 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline)은 알칼로이드의 하나로 코리달린을 산화함으로써 얻어질 수 있고, 화학명은 2,3,9,10-테트라메톡시-13-메틸-5,6-디히드로이소퀴놀리노[2,1-b]이소퀴놀린-7-이움이며, 하기의 구조식을 갖는다.
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 탈모를 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 탈모의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 탈모 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 또는 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구투여 또는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 또한 상기 조성물의 치료적으로 유효한 양은 투여방법, 목적부위, 환자의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 인체에 사용시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다.
본 발명의 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 피부 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제제화를 위해 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 등의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 부형제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있으며, 상기 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
식품 조성물은 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하며, 기타 빵류, 과자류, 아이스크림류, 면류 등으로의 가공도 가능하다. 아울러, 상기 식품 조성물은 건강보조식품 또는 식품첨가물일 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 샴푸, 린스, 컨디셔너, 화장수, 크림, 로션, 세럼, 에센스, 젤, 팩, 클렌저, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
모유두 세포 증식 효과를 갖는 생약 후보물질 스크리닝
DHT (dihydrotestosterone)에 의해 증식이 억제된 모유두 세포를 증식시킬 수 있는 물질을 도출하기 위하여, 60 종의 생약 후보물질에 대하여 모유두 세포의 증식율을 측정하였다.
먼저 음성대조군으로 DHT를 준비하여 DMSO에 10 mM 농도로 녹인 후 멸균 여과하였다. 효능평가 물질인 60종 천연물의 70% 에탄올 추출물을 각각 제조하여 PBS 1X에 10 mg/ml로 녹인 후 최종 농도가 1 mg/ml이 되도록 희석하였다. 경북대학교 의과대학에서 분양받은 탈모 환자의 모낭조직에서 분리한 모유두세포 (primary dermal papilla cell)를 96-well plate에서 24시간 배양한 후 기존의 배지를 제거하고 배지와 각각의 시료를 1/100씩 혼합한 배지를 각 well 당 200 μl씩 처리하였다.
음성대조군 및 효능평가 물질을 모유두 세포에 처리하여 CO2 배양기에 48시간 배양한 후 CCK-8 assay (Dojindo, Japan, CK04-13)를 통해 세포 증식율을 확인하였다. 이후 plate의 기존 배지를 제거하고 배지와 CCK-8 용액이 1/10씩 혼합된 배지를 100 μl씩 처리하였다. CO2 배양기에 48시간 배양 후, ELISA reader (Molecular device, Spectramax M)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 각각의 효능평가 물질의 흡광도 값을 음성대조군 대비 % 값으로 환산하여 그룹 간 세포 증식율을 비교하였다.
DHT와 함께 60 종 천연물의 70% 에탄올 추출물을 각각 10 μg/ml 농도로 처리하여 음성대조군 대비 모유두 세포의 증식율이 증가한 정도를 측정한 결과, 가장 증식율이 높은 6 종의 천연물에 대한 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
생약명 | 모유두 세포 증식율 (%) | |
1 | 현호색 | 26.7 |
2 | 괴각 | 14.7 |
3 | 산약 | 19.9 |
4 | 맥문동 | 16.2 |
5 | 우슬 | 20.7 |
6 | 회향 | 10.7 |
표 1에서 확인되는 바와 같이, 60 종의 생약 후보물질 중 특히 현호색 추출물은 모유두 세포의 증식율을 DHT 처리군 대비 약 27% 증가시켜 모유두 세포의 증식 활성이 매우 우수한 것을 알 수 있었다.
현호색 추출물의 최적 추출 조건 탐색
현호색 추출물의 모유두 세포 증식율 영향을 증가시키기 위하여 추출법 최적화 연구를 진행하였다. 먼저 10, 30, 50, 70, 100% 에탄올 용매를 사용하여 상온에서 24시간 동안 추출하고 여과, 농축, 건조 과정을 거쳐 추출물을 제조하였다. 그 중에서 모유두 세포 증식율이 가장 높았던 30% 에탄올을 선정하여 추출 용매 배수(현호색 중량 대비 7 또는 10 배수)별로, 상온 및 40℃가온 조건에서 추출물을 제조하였다. 또한, 최종적으로 추출 방식을 선정하기 위하여 침지 및 shaking incubator를 이용하여 교반 조건을 구축하여 추출물을 제조하였다. 제조한 추출물을 이용하여 실시예 1과 동일한 CCK assay로 DHT 처리 대비 모유두 세포의 증식율을 평가하고, 사용 원생약 대비 최종 수득한 추출물의 수율을 각각 측정하여, 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
추출용매 | 추출온도 | 추출방식 | 용매배수 | 증식율 (%) | 수율 (%) |
30 % 에탄올 |
상온 (25℃) |
침지 | 7배 | 23.6±5.5 | 3.4 |
10배 | 19.6±3.2 | 4.2 | |||
교반 | 7배 | 22.9±5.5 | 8.5 | ||
10배 | 18.0±1.8 | 10.9 | |||
40℃ | 침지 | 7배 | 19.5±4.3 | 6.9 | |
10배 | 17.4±5.1 | 5.7 | |||
교반 | 7배 | 8.3±2.4 | 8.9 | ||
10배 | 6.6±8.1 | 9.6 |
표 2에서 확인되는 바와 같이, 상온에서 7배수의 30% 에탄올을 사용하여 교반 추출하였을 때, 현호색 추출물의 모유두 세포 증식율 및 수율이 모두 높은 것으로 나타났으며, 이하의 실시예에서는 상기의 추출물을 사용하여 실험을 진행하였다.
사람 모낭 조직을 이용한 모발 길이 성장 영향 평가
상기 실시예 2에서 선정된 현호색 추출물을 모낭 기관 배양 (hair follicle organ culture)에 10 μg/ml로 처리하여 모발 성장 길이 증가 (hair shaft elongation) 효과를 확인하였다.
구체적으로, 탈모 환자로부터 분리한 모낭을 사용하여 시험군 당 12개씩 2회 반복하여 시험하였으며, 배양배지로 L-글루타민 (2 mM), 인슐린 (10 μg/ml), 항생제 (1%), 하이드록시코르티손 (10 ng/ml)을 포함하는 William's E media를 사용하였고, 3일마다 배지를 교환하여 모발 길이를 측정하였다. 양성 대조군으로는 1X PBS를 첨가하였고, 음성 대조군으로 DHT 100 μM을 처리하였으며, 현호색 시험군은 DHT 100 μM 및 현호색 추출물 10 μg/ml을 동시에 처리하여 7일간 배양하였다.
(i)
양성 대조군
(ii)
DHT 100 μM (음성 대조군)
(iii)
DHT 100 μM + 현호색 추출물 10 μg/ml
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 현호색 추출물을 처리하면 DHT에 의해 억제되었던 모발의 길이 성장이 10% 이상 증가하는 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
사람 모유두 세포의 세포 주기 분석
현호색 추출물을 처리한 경우 모유두 세포의 세포 주기 변화를 확인하기 위해 실시예 3과 동일한 실험군에 대하여 유동 세포분석 (FACS Canto II (BD))을 수행하였다. 각 대조군 및 시험군을 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후, 1 mM BrdU (BD FITC BrdU Flow kit, BD Biosciences, BD559619, BrdU antibody: BrdU (Bu20a) Mouse mAb, Cell signaling, 5292S) 용액을 샘플당 100 μl씩 첨가하여 37℃에서 CO2 배양기에서 2시간 배양한 후 세포를 채집 (harvest)하였다. 세포 채집 시, HBSS 2ml, Trypsin-EDTA 2ml, TNS 3ml을 사용하여 세포를 plate에서 떼어내고 15 ml conical tube를 사용해 원심분리기에서 5분간 가라앉힌 후 상등액을 제거하였다. 3% 소태아혈청 (FBS)을 넣어 세포를 재부유 시킨 후, 마이크로튜브로 옮겼다. BD cytofix/cytoperm buffer (BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit를 사용하여, 해당 매뉴얼에 따른 시험 진행)를 100 μl 첨가하고, 15분간 얼음에서 반응 후, BD perm/wash buffer를 1ml 넣고 원심분리기를 돌려 상등액을 제거하였다. 그 후, BD cytoperm permeabilization buffer plus를 100 μl 넣고 10분간 얼음에서 반응 후, BD perm/wash buffer를 1ml 넣고 원심분리기를 이용해 상등액을 제거하였다. 다시 BD cytofix/cytoperm buffer를 100 μl 첨가하고, 5분 간 얼음에서 반응 후, BD perm/wash buffer를 1 ml 넣고 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거하였다. PBS 705μl과 DNase 300μl를 혼합한 후, 한 샘플 당 100 μl씩 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 마지막으로, BD perm/wash buffer 1ml씩 첨가 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거하였다. 유동 세포분석 결과를 하기 표 3 및 도 2에 나타냈다.
세포주기 | 세포주기별 비율 (%) | ||
양성 대조군 | 음성 대조군 (DHT 100 μM) |
DHT 100 μM + 현호색 추출물 10 μg/ml |
|
G0-G1 | 70.7 | 63.9 | 69.4 |
S | 18.8 | 18.1 | 17.2 |
G2-M | 9.8 | 9.9 | 8.5 |
사멸세포 (apoptosis) | 0.7 | 8.1 | 4.9 |
표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 음성대조군 (DHT 처리군)은 양성 대조군과 비교하여 생장기 (G0-G1기) 모유두 세포의 비율이 감소하고 사멸세포의 비율이 현저히 증가하였다. 반면, 현호색 추출물 처리군은 음성대조군 (DHT 처리군)과 비교하여 생장기 (G0-G1기) 모유두 세포의 비율이 무처리 대조군의 수준으로 증가하고 사멸세포의 비율이 월등하게 감소한 것을 확인하였다.
사람 모유두 세포를 이용한 사멸세포의 변화 분석
실시예 3의 실험군에 대하여 살아있는 세포 (live cell), 일찍 사멸한 세포 (early apoptosis), 늦게 사멸한 세포 (late apoptosis), 세포 잔해 (cell debris) 비율을 유동 유동 세포분석법을 통해 분석하였다. 먼저 모유두 세포에 각 대조군 및 시험군을 24, 48, 72시간 동안 처리한 후, 세포를 채집하였다. 세포 사멸 분석 실험의 특성상 죽은 세포도 모두 채집하기 위해 기존의 배지를 제거하지 않고 trypsin-EDTA/TNS를 처리하여 세포를 모은 후, FACS buffer 1ml을 사용하여 재부유한 세포를 마이크로튜브에 모았다. 원심분리기를 통해 상등액을 제거한 후 준비한 항체 Annexin V-FITC (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Biosciences, BD556547)를 buffer를 이용하여 희석하고 wash buffer 100 μl과 혼합하여 빛을 차단하고 얼음에서 반응시켰다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 음성대조군 (DHT 처리군)은 양성 대조군과 비교하여 사멸세포의 비율 (Early apoptosis 및 Late apoptosis)이 증가하였으나, 현호색 추출물 처리군은 사멸세포의 비율이 양성 대조군의 수준으로 감소한 것을 확인하였다.
현호색 추출물 경구 투여 시 모발 성장 효과 측정
5~6주령의 수컷 C57/BL6 마우스를 사용하여 다음과 같이 모발 성장 효과를 확인하였다. 음성 대조군의 경우 DHT를 투여 개시일부터 주 1회 30 mg/kg 피하 투여하였다. 시험군의 경우 현호색 추출물을 경구 투여 또는 피하 투여하였고, 경구 투여 시 일 1회, 4주간, 마우스를 경배부 피부 고정법으로 고정하고, 경구 투여용 존데 (Sonde)를 이용하여 위 내로 직접 투여하였다. 피하 투여 시 일 1회, 4주간, 엄지와 검지로 경배부의 피부를 잡아당겨 피부와 근육 사이에 공간을 만든 후 70% 알코올로 투여부위를 소독한 다음 동물의 전방으로부터 엄지와 검지 사이의 피하공간에 주사바늘을 삽입하고 경배부 피하에 주입하였다. 제모는 제모크림을 사용하지 않고, 제모기를 사용하여 시험물질 투여 하루 전 실시하였다. 시험물질 투여 개시일로부터 0, 7, 14, 21, 28일 차에 졸레틸 50 (zoletil 50) 및 자일라진 (xylazine)으로 마취를 유도한 후 도포 부위를 디지털 카메라로 촬영한 뒤, Image J software를 이용하여 제모 부위 전체 면적 당 모발성장 부위의 면적 비율을 분석하였다.
투여 28일 차에 측정한 대조군 및 시험군 개체수의 모발성장 비율 평균 값을 아래 표 4에 나타내었다.
양성 대조군 | 음성대조군 (DHT 30 mg/kg) |
DHT (30 mg/kg) + 현호색 추출물 (경구투여) | ||||
1 mg/kg | 5 mg/kg | 10 mg/kg | 100 mg/kg | |||
모발 성장 비율(%) | 100.0 ± 0.0 | 64.9 ± 36.0 | 59.2 ± 45.4 |
77.3 ± 38.9 |
79.0 ± 40.0 |
95.3 ± 10.5 |
표 4에서 확인되는 바와 같이, 마우스 등판의 모발 성장 비율을 측정한 결과, 현호색 추출물 처리군은 투여 용량이 증가할수록 모발 성장 효과가 현저히 증가하였으며, 특히 현호색 추출물 100 mg/kg 처리군은 DHT 무처리 대조군(양성 대조군)과 유사한 수준으로 모발이 성장하는 것을 확인하였다.
현호색 추출물 분획물 및 분리물의 모발 성장 효과 측정
현호색 30% 에탄올 추출물의 분획물 및 분리물의 제조
현호색 30% 에탄올 추출물 500 g을 증류수 4.8 L에 녹인 후 분별 깔대기에 800 ml씩 나누어 담았다. 각 유기용매(부탄올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트)를 800 ml씩 첨가하고 충분히 흔들어 섞은 후 용매의 극성에 따라 분리가 되도록 약 24시간 분획하고 각 분획물을 감압 농축하였다.
DHT를 처리한 모유두 세포에 각 용매 분획물을 100x로 처리 (농도: 1 μg/ml)하여 48시간 동안 배양한 후, 실시예 1에서 수행한 실험법과 동일한 CCK-8 assay로 음성 대조군 대비 증식율을 측정한 결과, 부탄올 (BuOH) 용매 분획물에서 효능이 가장 높았다.
상온에서 7배수의 30% 에탄올을 사용하여 교반 추출한 실시예 2의 현호색 추출물을 사용하여, 도 5에 나타낸 바와 같이 부탄올 분획물의 7 가지 분리물을 수득하였으며, 분리 방법은 다음과 같다. open column을 지지대에 설치 후 슬러리 (slurry)를 채우고 부탄올 분획물을 이동상 용매 (클로로포름 : 메탄올 : 증류수를 6 : 1 : 0.1 ~ 1 : 1 : 0.1 비율로 혼합한 용매)에 최소한으로 녹여 천천히 loading 하였다. 컬럼에 초기 이동상 용매를 넣고 부탄올 분획물을 통과시킨 뒤 동일 용량을 튜브에 받고, 튜브의 TLC 분석을 통해 구간별로 분리하여 농축하고 건조시켜 부탄올 분획물의 7가지 1차 분리물을 수득하였다.
모유두 세포 증식 평가
상기 실시예 1에서 수행한 방법과 동일하게 모유두 세포 증식율을 평가하였다. 실험 물질인 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 1차 분리물을 모유두 세포에 1 μg/ml 농도로 처리하고 동시에 DHT를 100 μM 처리하여 음성대조군 (DHT를 100 μM 처리한 모유두 세포) 대비 세포 증식 (cell proliferation) 정도를 비교하였다 (도 6).
도 6에 나타낸 바와 같이, 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 부탄올 분획물의 분리물들은 모두 음성대조군에 비하여 모유두 세포의 증식을 증가시켰고, 부탄올 분획물에서 추가 용매(클로로포름, 메탄올, 물)의 혼합 비율에 따른 극성도 차이로 분리한 분리물 중 #2 분리물의 경우 음성대조군에 비하여 증식율이 25% 이상 증가한 것을 확인하였으며, 이하의 실시예에서는 상기의 분리물을 사용하여 실험을 진행하였다.
모발 성장 효과 측정
5~6주령의 수컷 C57/BL6 마우스를 입수하여 7일간의 순화기간 (일반 증상을 관찰하여 건강상태를 확인하고 건강한 동물을 사용하는데 필요한 기간)을 거친 후 각 군별로 피부색이 분홍색인 개체를 선별하여 무작위로 군 분리를 실시하였다. 각 군별 마우스의 등판을 제모하고, 투여 개시일부터 DHT 30 mg/kg을 주 1회 피하 주사하였고, 시험물질 투여군인 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 분리물 투여군의 경우, 4주 동안 1일 1회 경구 투여하고, DHT 30 mg/kg을 1주 1회 피하로 투여하였다.
투여 28일 차에 측정한 대조군 및 시험군 개체수의 모발성장 비율 평균 값을 아래 표 5에 나타내었다.
대조군 | 음성대조군 (DHT 30 mg/kg) |
DHT 30mg/kg | |||
현호색 추출물 100 mg/kg |
BuOH 분획물 10 mg/kg |
분리물 5 mg/kg |
|||
모발 성장 비율(%) | 94.6 ± 12.1 | 22.9 ± 22.3 | 82.4 ± 24.6 | 86.5 ± 32.2 | 93.6 ± 6.0 |
표 5에 나타낸 바와 같이 현호색 추출물, 부탄올 분획물 및 분리물을 각각 투여한 군은 DHT 처리군과 비교하여 모발 성장 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
분리물이 함유하고 있는 성분의 모유두 세포 증식 효과 확인
분리물의 성분 분석 및 모유두 세포 증식 효과
실시예 7에서 제조된 부탄올 분획물의 분리물을 분석하기 위해 분리물 20 mg을 취해 70% 메탄올 희석액 10 ml을 넣고 균일한 용액으로 만들어 30분 동안 방치한 후 상등액을 여과하여 검액하였다. 코리달린 (corydaline), 팔마틴 (palmatine), 베르베린 (berberine) 및 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline) 표준품 (reference standard)을 각 5mg씩 취해 50ml 용량 플라스크에 넣고 70% 메탄올을 넣어 30분간 초음파 추출하여 녹인 다음 표선하여 여과한 액을 표준액으로 하였다.
이동상 A (정제수 2,000 ml에 trifluoroacetic acid (TFA) 2ml을 넣은 액)와 이동상 B (아세토니트릴 99.9% 2,000 ml에 TFA 2ml을 넣은 액)를 제조하여 LC 분석기기 (Waters 2998, Photodiode array detector)로 분석을 진행하였다. 해당 분석결과를 도 7에 나타내었으며, #2 분리물은 코리달린, 팔마틴, 베르베린 및 데히드로코리달린의 4 가지 지표성분을 포함하는 것을 확인하였다.
각 성분에 의한 모유두 세포 증식율을 실시예 1에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 각각 1 μg/ml 농도로 DHT 100 μM와 함께 모유두 세포에 처리하고 48시간 동안 배양한 후 모유두 세포의 증식율을 측정하여 도 8에 나타내었다. 팔마틴 또는 데히드로코리달린의 처리군은 음성대조군 (DHT 처리군)에 비하여 모유두 세포의 증식율이 증가하는 것을 확인하였다.
팔마틴 및 데히드로코리달린 혼합 비율에 따른 모유두 세포 증식 효과
실시예 7에서 제조된 부탄올 분획물의 분리물에 함유된 팔마틴 및 데히드로코리달린을 분리하고, 각 성분의 혼합 비율에 따른 모유두 세포 증식 활성을 상기 실시예 1에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 팔마틴 및 데히드로코리달린을 각각 단독으로 또는 1:1 내지 1:16의 중량비로 혼합하여 1 μg/ml 농도로 DHT 100 μM와 함께 모유두 세포에 처리하고 48시간 동안 배양한 후 모유두 세포의 증식율을 측정하여 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 팔마틴 및 데히드로코리달린을 각각 처리하거나 혼합하여 처리한 군은 모두 음성대조군 (DHT 처리군)에 비하여 모유두 세포의 증식효과가 우수한 것을 확인하였다.
특히, 팔마틴 및 데히드로코리달린을 1:3의 비율로 포함하는 군은 모유두 세포의 증식율이 가장 우수하였고, 팔마틴 대비 데히드로코리달린을 더 많이 포함하는 군이 팔마틴 및 데히드로코리달린을 각각 포함하는 군과 비교하여 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
Claims (17)
- 현호색 (Corydalis remota) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 용매는 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 용매는 10 내지 50% 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 용매는 30% 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 모유두 세포를 증식시키고 모발 길이를 성장시키는 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 모유두 세포의 생장기 세포 수를 증가시키고 사멸세포 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분획물은 현호색 추출물에 물, C1 내지 C6의 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매를 가하여 분획된 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 분획물은 현호색 추출물의 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 팔마틴 (palmatine), 데히드로코리달린 (dehydrocorydaline), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 팔마틴 또는 데히드로코리달린은 현호색 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제10항에 있어서, 팔마틴 및 데히드로코리달린이 1:1 내지 1:20의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제12항에 있어서, 팔마틴 및 데히드로코리달린이 1:3 내지 1:16의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 현호색 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 팔마틴, 데히드로코리달린, 또는 이의 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 현호색 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 팔마틴, 데히드로코리달린, 또는 이의 염 중 하나 이상을 포함하는, 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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