KR20220032507A - 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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김민구
은수현
김형은
임아랑
한치영
이동훈
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Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 충치, 치주질환 치료 및 구취 개선에 모두 효과가 있는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주, 상기 바실러스 서브틸리스 균주의 배양액, 상기 바실러스 서브틸리스 균주의 배양상등액, 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치 및 치주질환 치료용 약학적 조성물, 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 치약제 조성물, 구중청량제 조성물 및 가글제 조성물에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주 및 이의 배양액 또는 배양상등액을 포함하는 조성물은 치주질환 원인균 및 충치 원인균에 대하여 항균, 항염, 바이오필름 억제 효과를 나타내어 충치 및 치주질환을 치료 또는 예방하거나 구취를 개선하는 목적으로 활용이 될 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도 {Bacillus subtilis and use thereof}
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 충치, 치주질환 치료 및 구취 개선에 모두 효과가 있는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주, 상기 바실러스 서브틸리스 균주의 배양액, 상기 바실러스 서브틸리스 균주의 배양상등액, 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취 치료용 약학적 조성물, 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 치약제 조성물, 구중청량제 조성물 및 가글제 조성물에 관한 것이다.
최근 잘못된 식습관 및 고령화로 인해 면역력이 감소하고 영양 및 대사 장애가 증가하여 치주질환이 발생하는 환자의 수가 증가하고 있다. 치주질환의 직접적인 원인은 치아에 지속적으로 형성되는 플라그(plaque)라는 세균막과 이것이 제거되지 않고 단단해져 생긴 치석이다. 플라그와 치석이 쌓이면 잇몸이 치아로부터 떨어지게 되고, 이로 인해 치아와 잇몸 사이에 염증이 발생하게 된다.
치주 질환이란 치아 주변을 둘러싸고 있는 치주 인대와 치은 등의 연조직과 치조골 등의 경조직을 파괴하는 염증성 질환과 관련된 증상들을 포함하여 일컫는다.
연령이 증가함에 따라 선천적, 후천적으로 치조골 등이 악화될 경우 치주 질환이 발병하게 되며, 대표적인 치주질환은 치주염(periodontal inflammation), 치은염(gingivitis), 및 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy) 등이 있다. 치은염은 잇몸의 연조직에 염증이 생기는 초기 치주 질환으로 비교적 증상이 가볍고 회복이 가역적인 상태이다. 치주염은 치은염이 치료되지 않고 염증이 잇몸과 치골 주변까지 진행 된 경우로 세균의 독소에 의해 자극된 만성 염증반응이 진전되면 잇몸과 치아 사이에서 분리되어 감염된 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어져서 결국, 치주인대에 염증이 생기게 되고 골소실이 일어난다. 또한, 치조골에서 조골세포에 의한 골형성과 파골세포에 의한 골흡수의 대사가 여러 가지 요인에 의해 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면 치조골다공증과 같은 치조골 형성장애가 발생한다.
치주 질환은 환자의 개선된 구강위생 확립을 통한 예방이 가장 중요하고, 임상에서는 비외과적 혹은 외과적인 치석제거술, 치근활택술, 치은소파술, 신부착을 응용한 치주 조직의 재생술 등 외과적인 치료가 주를 이루고 있다. 그러나 이런 외과적인 치료 방법들은 치료가 번거롭고, 효과적인 치료가 어려우며, 또한 병의 예방보다는 병이 어느 정도 진행되었을 경우 행하는 치료에 국한되어 있어, 치료를 하지 않을 경우 만성으로 진행되는 경우가 대부분이다. 또한, 부가적인 치료로 전신적인 항생제의 복용과 국소 서방형 제재가 사용되어 있으나, 불필요한 부위에도 약물이 과량 전달되어 그로 인한 부작용이 발생하고 있고, 최근에는 항생제 내성을 나타내는 치주질환균이 심각한 문제를 야기하는 것으로 보고되고 있다.
충치란 벌레 먹은 치아라는 뜻으로 치아의 경조직이 침식되어 결손하는 증세이며 치아우식증이라고도 한다. 충치는 치아의 딱딱한 석회화 조직의 일부가 용해되고 파괴되는 통증을 유발하고 결국에는 치아를 잃게 되는 감염성 세균 질환으로, 치과질병의 가장 큰 부분을 차지하고 있으며 발생빈도가 높아지고 있다. 대한치과의사협회의 보고에 따르면, 아동의 90% 이상이 치아우식을 경험하며, 성인의 80% 이상이 잇몸질환을 갖고 있다고 한다. 이런 질환을 일으키는 주요한 원인은 구강내의 미생물에 의한 감염으로 세균, 음식물, 타액의 상호작용에 의해 유발된다.
한편, 구취는 구강 및 인접 기관으로부터 유래되는 냄새를 말하며 많은 사람들이 구취로 일상 생활에 불편을 호소하고 있다. 구취의 85-90%가 구강에서 유래하며 특히 혀의 뒷쪽에서 유래하고 있다. 구취의 주요 성분은 휘발성 유황화합물인데 휘발성 유황화합물의 전체 양 중 90%가 시스테인으로부터 만들어지는 황화수소 (hydrogen sulfide)와 메치오닌으로부터 만들어지는 메틸머캡탄(methyl mercaptan)이다. 이러한 성분들은 혐기성세균에 의해 생성되며, 혀의 뒷쪽이 가장 중요한 서식지가 된다. 이 부위는 타액에 의해 세정작용이 잘 되지않고 많은 작은 함몰이 있어 세균이 지속적으로 살아가는 장소가 된다. 혐기성세균에 의한 휘발성 유황화합물 생성이 구취의 원인으로 가장 중요하지만, 그 외 충치와 치주염 등과 같은 구강질환에 의해서도 발생한다.
구취 환자의 구강에서 많이 발견되는 세균은 푸소박테리움 뉴크레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)이다. 전에는 박테로이드스속과 포피로모나스속은 프레보텔라(Prevotella)속과 함께 같은 속으로 알려질 정도로 비슷한 세균들이다. 구취를 발생시키는데 많은 종류의 혐기성세균이 관여하지만, 구취 발생의 대표적인 세균은 푸소박테리움 뉴크레아툼과 포피로모나스 진지발리스이다.
최근에는 유산균을 이용하여 실험관에서 혐기성 세균의 증식을 억제하고자 하는 시도가 있었다. 유산균은 탄수화물을 발효하여 최종 대사산물로 유산을 생산하는 세균을 말하는바, 유산균은 인간과 동물의 구강 및 소화관에 존재하며 통상적으로 김치 또는 요구르트 등 발효식품의 제조과정에 활용되고 있는 것이다. 그러나 유산균은 구강에 투여하면 금속염이나 소독제와 같이 타액에 의해 희석이 되면서 식도로 바로 삼켜져 구강에 잔류하기가 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)와 같은 유산균은 강산을 만들어 실험관에서 혐기성세균의 증식을 억제할 수 있으나, 정상인의 구강에서는 타액의 완충작용으로 유산균이 만든 강산이 중화되어 다른 세균의 증식을 억제하기 어렵다. 더구나 강산은 치아우식증을 일으키기 때문에 이러한 세균을 구강에 장기간 투여하면 구강 위생에 좋지 않다는 문제점이 있다.
한편, 기존에 충치 개선, 치주질환 개선 또는 구취 개선 중 1가지 기능을 하는 균주는 있었으나, 충치·치주질환·구취에 모두 기능하는 균주는 거의 없었다.
한국등록특허공보 10-1956759호 한국등록특허공보 10-1629551호
이에 본 발명자들은 치주질환 치료에 우수한 활성을 나타내는 균주를 찾기위해 노력하던 중, 특정 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 충치 및 치주질환의 치료 또는 예방효과 및 구취를 개선하는 효과가 우수함을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주(KCTC14184BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주의 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주의 배양상등액을 제공하는 것이다
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 치약제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 구중청량제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 가글제 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주(KCTC14184BP)를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주의 배양액을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주의 배양상등액을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 치약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 구중청량제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 가글제 조성물을 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주(KCTC14184BP)를 제공한다.
상기 균주는 균주 자체, 균주 파쇄물, 균주 농축물, 균주 추출물 및 균주 건조물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 용어 "바실러스"는 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성 혐기성의 그람 양성 간균 속으로, 바실러스 속에 속하는 미생물에는 바실러스 벨레젠시스, 바실러스 서브틸리스 등이 있다. 본 발명자들은 충치 및 치주질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 가지는 바실러스 균으로 바실러스 서브틸리스에 속하는 신규한 균주를 하기와 같이 규명하였다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 ID-A05 (Bacillus subtilis ID-A05; 수탁번호 KCTC14184BP) 균주는 발효음식 유래의 바실러스 서브틸리스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주를 발효음식에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예를 통해 발효음식으로부터 분리한 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과. ID-A05 바실러스 서브틸리스와 99% 동일함을 확인할 수 있었다. 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 5월 11일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC14184BP).
본 발명의 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액은 치주질환의 원인균에 대한 항균 효과와 염증성 사이토카인 분비 억제 효과, 바이오필름 생성 억제 효과뿐만 아니라 구취의 주된 원인인 휘발성 황화합물(volatile sulfur compounds, VSC) 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 발효음식으로부터 분리한 신규한 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액을 치주질환의 대표 원인균인 Porphyromonas gingivalis (PGI)와 TYB 배지에 접종하여 배양한 후 흡광도를 측정한 결과, 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액이 PGI에 대한 항균 효과가 우수한 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
또한 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액의 바이오필름 억제 효과를 확인하기 위하여, saliva를 coating (4hr, 37℃) 한 96 well plate에 배지를 분주한 후 Porphyromonas gingivalis (PGI)와 Fusobacterium nucleatum (FNU)을 각각 25%, 0.5% 농도로 접종하고, 샘플을 동시에 처리한 뒤 4일간 37 ℃에서 혐기 배양하여 그 결과를 확인하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액이 바이오필름 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(실시예 6, 7 참조).
또한 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액의 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 확인하기 위하여, HGF-1 세포를 96 well 플레이트에 1x104 cells/well로 seeding 하고 24시간 배양하고, 후보군을 24시간 처리한 후 P. gingivalis-LPS를 50 μg/ml로 24시간 처리하여 상등액을 모아 분석하였다. 그 결과 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주가 염증성 사이토카인 분비를 억제하는 것을 확인하였다(실시예 9 참조).
본 발명은 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주의 배양액을 제공한다.
본 발명의 용어 "배양액"이란, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주를 배양한 액체 배지를 말하는 것으로, 균주가 포함되어 있는 TSB (Tryptic soy broth)를 포함한다.
본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 균주의 배양상등액을 제공한다.
본 발명의 용어 "배양상등액"이란, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주를 배양한 후 균체를 제거한 액체 배지를 말하는 것으로, 균체가 포함되어 있지 않은 TSB (Tryptic soy broth)를 포함한다.
본 발명의 용어 "액체 배지(liquid media)"는 한천(agar)이 들어 있지 않은 액상의 배지이며 미생물의 증식에 이용되고 세균의 생화학적 검사, 증식, 대사산물을 검출할 목적으로 사용되는 것을 말한다.
상기 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 진탕배양법을 이용하여 배양하였다. 진탕배양법은 왕복 진탕기 또는 회전 진탕기에 삼각플라스크 등을 고정시켜 연속 진탕하여 통기와 교반을 효과적으로 하는 방법이다. 진탕배양의 경우 tryptone 17 g/L, soytone 3 g/L, dextrose 2.5 g/L, sodium chloride 5 g/L, dipotassium phosphate 2.5 g/L를 포함하는 TSB 배지(MB cell)에서 37 ℃, 200 rpm 조건에서 40시간 배양을 진행하였다. 배양 종료 후 배양액을 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액을 얻었다. 8.25% HCl을 이용하여 배양 상등액의 pH를 6.5로 보정한 뒤, 완전한 균체 제거를 위해서 0.22 μm 필터를 이용하여 제균하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다.
본 발명의 용어 "충치"는 치아 상아질을 보호하는 치아 법랑질 또는 에나멜질이 입 안에 서식하는 박테리아에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생기는 산(acid)에 의해 손상되어 생기는 것을 말한다.
본 발명의 용어 "치주질환"은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치관주위염(pericoronitis) 및 치주 고름집(Parodontal abscess)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 치주염일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "바이오필름"은 플라크 안에 세균을 포함한 다양한 미생물이 서로 엉겨 있는 현상을 말하는 것으로서, 바이오필름이 닦이지 않아 두꺼워지고 그 속에 병적 세균의 양이 늘어나 우리 몸의 방어력이 감당하기 어려운 지경까지 갈 때 구강질환이 생긴다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 구강붕해필름제, 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 패치제, 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 발효음식으로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액의 구취에 대한 효과를 확인하기 위하여 구취의 주된 원인인 휘발성 황화합물(volatile sulfur compounds, VSC) 생성 저해능을 테스트하였다. 그 결과 바실러스 서브틸리스 ID-A05 균주 배양상등액이 VSC 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명의 용어 "구취"는 구강 및 인접 기관에서 유래하는 냄새로서 일반적으로 타인이나 자신에게 불쾌감을 주는 악취를 말한다. 구취의 주요 원인은 구강 내 존재하는 균이 음식물 찌꺼기, 침, 혈액, 구강점막세포 등에 함유된 아미노산과 단백질을 분해하여 생성되는 휘발성 황화합물(VSC : Volatile Sulfur Compounds)이다. 이 휘발성 화합물을 분석해 보면 CH3SH(메칠 메캅탄)와 H2S(황화수소)가 90%를 차지하며 이런 성분 때문에 달걀 썩은 냄새와 양파 썩은 냄새가 나는 것이다.
본 발명의 용어 "개선"이란 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품을 포함한다.
본 발명에서 상기 의약외품은 구중청량제, 가글제, 액체방지제, 치약제, 생리대, 일회용 라이너, 마스크, 안대, 붕대, 탄력붕대, 석고붕대, 원통형 탄력붕대, 거즈, 탈지면, 반창고, 액취방지제, 연고제, 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "건강기능식품"은 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 충치, 치주질환의 치료 또는 예방이나 구취를 개선하는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 정제, 캡슐, 환, 및 과립으로 구성된 제형으로부터 선택된 하나 이상의 제형일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로는, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 충치, 치주질환 또는 구취에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물 형태로 제조할 수 있으며 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물이 함유된 차, 쥬스 및 드링크 형태로 제조할 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다.
또한 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일 통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지콘비프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액과 함께 보조성분으로 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 올리고당, 아미노산 등의 화합물을 사용할 수 있으며, 이 중에서도 비타민 C, E 나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 내지 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성효과를 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋우기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린(Chlorophyllin), 플라보노이드(Flovonoid) 등의 천연색소 및 감미 성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대하여 약 0.01 내지 10 중량%를 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.1 mg/kg/day 내지 200 mg/kg/day의 양으로 섭취하는 경우 충치, 치주질환 또는 구취 예방 또는 개선 효과가 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 치약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 구중청량제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 가글제 조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 포함하는 조성물은 충치 및 치주질환의 원인균에 대하여 항균, 항염, 바이오필름 억제 효과를 나타내어 충치 및 치주질환을 치료 또는 예방하거나 구취를 개선하는 목적으로 활용이 될 수 있다.
도 1은 Porphyromonas gingivalis (PGI)에 대한 항균력 테스트 결과를 나타낸다.
도 2는 Porphyromonas gingivalis (PGI) 항균 평가에서 우수한 효과를 보였던 균주들의 샘플을 대상으로 바이오필름 효능 평가를 한 결과를 나타낸다.
도 3은 SEM 주사현미경(Scanning electronic microscope)을 이용한 바이오필름 억제 효과 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 바이오필름 제거 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, PGI)로부터 분비된 LPS에 의한 세 가지 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 억제 효능 결과를 나타낸다.
도 6은 VSC 생성 저해능을 테스트한 결과를 나타낸다.
도 7은 Streptococcus mutans (SMU)에 대한 항균력 테스트 결과를 나타낸다.
도 8은 Streptococcus mutans (SMU) 유래 바이오필름 형성 저해 효능평가 결과를 나타낸다.
도 9는 주사전자현미경(Scanning electronic microscopy; SEM)을 이용한 Streptococcus mutans (SMU) 유래 바이오필름 억제 효능 평가 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 바실러스 서브틸리스 분리
발효음식들의 액상을 멸균생리식염수를 이용하여 다단희석법으로 희석한 후 고체배지에 도말하고 37 ℃에서 2~3일간 배양하였다. 고체배지에 뜬 각각의 colony를 액체배지에서 37 ℃에서 2~3일간 배양하였다. 순수 분리된 균주는 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)을 통하여 16S rDNA의 염기서열 및 전장유전체 분석을 진행하여 균을 동정하였다.
실시예 2 : 바실러스 서브틸리스 16s rDNA 동정
지노믹 DNA 추출은 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, 독일)를 이용하여 수행하였다. 16S rDNA의 염기서열 증폭은 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응법으로 진행하였다. 해당 부위의 염기서열 분석은 ㈜마크로젠에 분석 의뢰를 하였으며, 785F (5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3') 와 907R (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') 프라이머를 이용하여 진행하였다. 염기서열 분석이 완료된 각 균주의 16S rDNA 염기서열 동정 분석은 NCBI BlastN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) 서비스에서 16S database를 이용하여 실시하였다. 16S rDNA 염기서열 기준 동정 결과로는 ID-A05가 99%의 유사도로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 동정 분석되었다. 하지만 B. subtilis는 유사종인 B. siamensis, B. velezensis, 및 B. amyloliquefaciens 와 16S rDNA 염기서열로는 정확한 구분이 어렵기 때문에 전장유전체 분석을 통한 더욱 세밀한 동정 분석을 실시하였다.
실시예 3 : 바실러스 서브틸리스 전장유전체 분석 및 전장유전체를 이용한 동정
전장유전체 염기서열 분석은 ㈜마크로젠에 의뢰하였으며, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, 독일)를 사용하여 지노믹 DNA를 추출한 후 PacBio RS II (Pacific Biosciences, 미국) 및 Illumina MiSeq (Illumina, 미국)을 이용하여 하이브리드 염기서열 분석법으로 진행하였다.
전장유전체 정보를 이용한 동정 분석은 기존에 전장유전체 분석이 완료되어 NCBI Genome Database에 등록되어 있는 B. amyloliquefaciens DSM 7 (FN597644.1), B. subtilis NCIB 3610 (CP034484.1), B. siamensis SCSIO 05746 (CP025001.1), 및 B. velezensis FZB42 (CP000560.2)의 전장유전체 염기서열과 상기 전장유전체 분석이 완료된 ID-A05의 전장유전체 염기서열을 이용하여 ANI (Average nucleotide identity) 분석을 실시하였으며, ANI 분석은 JspeciesWS (http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/)에서 Blast 알고리즘을 이용하여(ANIb) 진행하였다. 전장유전체 염기서열을 이용하여 ANIb를 분석한 결과 ID-A05 균주는 상기 비교 균주들과 각각 76.28%, 98.79%, 76.37%, 76.32%의 상동성을 나타내었다. 본 분석을 통해 ID-A05 균주는 바실러스 서브틸리스로 판명되었다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05(수탁번호 : KCTC14184BP) 균주는 생물자원센터에 2020년 5월 11일자로 기탁하였다.
실시예 4 : 샘플 제조
각 균주들을 TSB 배지에 접종하고 37 ℃에서 200 rpm으로 40시간 배양하였다. 배양액을 원심분리(13,000 rpm, 20 min, 4℃)한 후 균체를 제거하여 상등액을 취한 후 0.22 μm 필터를 이용해 제균하여 샘플을 제조하였다.
실시예 5 : 항균 효능평가 (치주질환)
치주질환의 대표 원인균인 Porphyromonas gingivalis (PGI)에 대한 항균력을 테스트하였다. 본 실험에 사용된 PGI 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에서 표준 균주인 P. gingivalis KCTC 5352을 분양 받아 사용하였다. PGI는 TYB 배지에서 37 ℃, 24시간 동안 혐기배양하였다. PGI와 샘플들을 TYB 배지에 10%씩 접종하여 24시간 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 하기 [도 1]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 매우 낮게 측정되어 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 6 : 바이오필름 효능평가 - 예방모델 (치주질환)
Porphyromonas gingivalis (PGI) 항균 평가에서 가장 우수한 효과를 보였던 6종 균주의 샘플들을 대상으로 바이오필름 효능 평가를 진행하였다. 평가 방법은 saliva를 coating (4hr, 37℃) 한 96 well plate에 배지를 분주한 후 Porphyromonas gingivalis (PGI)와 Fusobacterium nucleatum (FNU)을 각각 25%, 0.5% 농도로 접종하고, 샘플을 동시에 처리한 뒤 4일간 37 ℃에서 혐기 배양하여 그 결과를 확인하는 예방 모델 방법으로 진행하였다.
형성된 바이오필름은 0.1% crystal violet 시약으로 염색하여 595 nm 흡광도를 측정하였다. 바이오필름 형성이 많이 된 조건일수록 높은 흡광도를 보이기 때문에 흡광도 비교를 통해 시험 샘플들의 바이오필름 억제 효과를 확인하였다.
그 결과 하기 [도 2]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 낮게 측정되어 바이오필름 생성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : SEM 주사현미경(Scanning electronic microscope)을 이용한 바이오필름 억제 효과 측정 (치주질환)
바이오필름 유도를 위해, coverslip을 올린 24 well plate에 saliva를 coating (4hr, 37℃) 하였다. 각 well에 배지를 분주하고 Porphyromonas gingivalis (PGI)와 Fusobacterium nucleatum (FNU)을 각각 25%, 0.5% 농도로 접종하였다. 샘플을 동시에 처리한 뒤 4일간 37 ℃에서 혐기 배양하면서 바이오필름 형성을 유도하였다. 바이오필름 형성이 된 각 test well의 배지성분을 제거한 뒤 동결건조를 하여 SEM sample을 제작하여 촬영하였다.
실시예 8 : 바이오필름 효능평가 - 치료모델 (치주질환)
Saliva를 coating (4hr, 37℃)한 96 well plate에 배지를 분주한 후 Porphyromonas gingivalis와 Fusobacterium nucleatum을 각각 25%, 0.5% 농도로 접종하여 4일간 37 ℃에서 혐기 배양하여 충분히 바이오필름을 형성하게 한 후, 배지 교체와 동시에 샘플을 처리하여 3일간 더 37 ℃에서 혐기 배양한 뒤 그 결과를 확인하였다. 형성된 바이오필름은 0.1% crystal violet 시약으로 염색하여 595 nm 흡광도를 측정하였다. 바이오필름 형성이 많이 된 조건일수록 높은 흡광도를 보이기 때문에 흡광도 비교를 통해 시험 샘플들의 바이오필름 제거 효과를 확인하였다.
그 결과 하기 [도 4]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 낮게 측정되어 바이오필름 제거 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 9 : 항염 효능평가 (치주질환)
치주염이나 구강건강에는 Porphyromonas gingivalis 로부터 분비된 lipopolysaccharide (LPS)가 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α)을 분비하는 것으로 알려져 있다. 후보군의 염증성 사이토카인 분비 억제 능력을 측정하기 위하여 HGF-1 세포를 96 well 플레이트에 1x104 cells/well로 seeding 하고 24시간 배양하였다. 후보군을 24시간 처리한 후 LPS를 50 μg/ml로 24시간 처리하여 상등액을 모아 분석에 사용하였다. 분비된 사이토카인의 양은 ELISA assay kit를 사용하여 매뉴얼에 따라 시험하였고 plate reader 450 nm에서 측정하였다.
실험 결과 하기 [도 5a, 도 5b, 도 5c]에서 보듯이 후보군을 처리하였을 때 LPS에 의한 사이토카인의 분비가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 후보군을 처리하였을 경우 IL-1β, IL-6, TNF-α 세 가지 사이토카인을 모두 줄이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10 : 휘발성 황화합물 평가(구취)
휘발성 황화합물(volatile sulfur compounds, VSC)는 구취의 주된 원인으로 hydrogen sulfide (H2S), methylmercaptan (CH3SH), dimethylsulfide (CH3SCH3) 등이 있으며, 이 중 H2S와 CH3SH이 90% 이상을 차지한다. VSC는 주로 치주질환 원인균들이 생성하며, 치주질환 환자에서 농도가 높게 나타난다. 구취에 대한 효과를 확인하기 위하여 VSC 생성 저해능을 테스트하였다. 병원균은 치주질환 원인균이며, VSC 생성능을 가지고 있는 PGI와 Fusobacterium nucleatum (FNU) 균주를 사용하였다. FNU 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에서 표준 균주인 F. nucleatum KCTC 2640을 분양 받았다. PGI와 FNU를 각각 TYB, RCB 배지에 접종하여, 37℃에서 24시간 동안 혐기챔버에서 배양하였다. TYB, RCB 배지를 1:1로 혼합한 배지에 PGI와 FNU를 각각 5%, 샘플을 10% 접종하여 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 생성된 H2S를 측정하기 위하여 methylene blue법을 통해 발색시킨 후 668 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 하기 [도 6]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 낮게 측정되어 휘발성 황화합물 생성 저해 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 11 : 항균 효능평가(충치)
충치의 주요 원인균인 Streptococcus mutans (SMU)에 대한 항균력을 테스트하였다. 본 실험에 사용된 SMU 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에서 표준 균주인 Streptococcus mutans KCTC 3065을 분양 받아 사용하였다. SMU는 BHI 배지에서 37 ℃, 24시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. SMU와 샘플들을 BHI 배지에 10%씩 접종하여 24시간 배양한 후 생균수 분석을 하였다.
그 결과 하기 [도 7]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 매우 낮게 측정되어 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 12 : 바이오필름 효능평가(충치)
바이오필름 유도를 위해, BHI에 10%로 접종한 Streptococcus mutans (SMU)를 배양 (5% CO2 incubator, 18시간)하였다. 배양액을 원심분리 (9,000 rpm, 5 min, 4 ℃)하여 균체를 확보한 후 reaction media (BHI with 1% Sucrose)에 약 1 X 106 CFU/mL로 희석하여 10% (v/v)의 샘플을 포함하도록 seeding 하였다. 24시간마다 10% (v/v) 샘플을 포함하는 reaction media로 media change를 진행하였고, 해당 조건에서 적정 바이오필름 형성일인 3일차 (72시간)까지 필름 형성을 유도하였다.
바이오필름 효능평가를 위해 crystal violet staining method를 진행하였다. Methyl alcohol로 fixation, 0.1% crystal violet으로 staining 후 ethyl alcohol로 reconstitution 하였다. Washing과정은 각 단계마다 포함되었으며, 595 nm에서 필름 형성 정도를 측정하였다.
그 결과 하기 [도 8]에서 보듯이 ID-A05 균주 배양상등액을 처리한 배지에서 흡광도가 매우 낮게 측정되어 바이오필름 저해 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 13 : SEM 주사현미경(Scanning electronic microscope)을 이용한 바이오필름 억제 효과 측정 (충치)
유도를 위해 BHI에 10%로 접종한 SMU를 배양 (5% CO2 incubator, 18시간)하였다. 배양액을 원심분리 (9,000rpm, 5min, 4℃)하여 균체를 확보한 후 reaction media (BHI with 1% Sucrose)에 약 1 X 106 CFU/mL로 희석하여 준비하였다. SEM 측정에 있어 필요한 전처리과정인 금속 코팅을 용이하게 하기 위해 시험을 진행하는 plate well에 cover slip을 깔아 cover slip 위로 바이오필름이 유도되도록 하였고, 각 well에 희석해준 SMU를 10% (v/v)의 샘플을 포함하도록 seeding 하였다. 24시간마다 10% (v/v) 샘플을 포함하는 reaction media로 media change를 진행하였고, 해당 조건에서 적정 바이오필름 형성일인 3일차(72시간)까지 필름 형성을 유도하였다. 이후, 바이오필름이 유도된 cover slip을 washing 하여 새 plate로 옮긴 후 SEM 측정을 위해 동결건조 과정을 진행하였다.
그 결과 하기 [도 9]에서 보듯이 ID-A05 균주유래 배양상등액을 처리한 cover slip에서 육안상 바이오필름의 형성 정도가 매우 낮게 확인되어 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명이 제공하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주, 이의 배양액 또는 배양상등액을 포함하는 조성물은 충치 및 치주질환의 원인균에 대하여 항균, 항염, 바이오필름 억제 효과를 나타내어 충치 및 치주질환을 치료 또는 예방하거나 구취를 개선하는 목적으로 활용이 될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
한국생명공학연구원 KCTC14184BP 20200511

Claims (12)

  1. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ID-A05 균주 (수탁번호 : KCTC14184BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 i) 충치, 치주질환에 대한 치료 또는 예방 효과; 및 ii) 구취 개선 효과가 우수한 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 바실러스 서브틸리스 균주의 배양액.
  4. 제1항 또는 제2항의 바실러스 서브틸리스 균주의 배양상등액.
  5. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치관주위염(pericoronitis) 및 치주 고름집(Parodontal abscess)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 충치 및 치주질환 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  8. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 치약제 조성물.
  11. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 구중청량제 조성물.
  12. 제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 충치, 치주질환 또는 구취의 예방 또는 개선용 가글제 조성물.
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