KR20220020929A - 효소적 촉매작용에 의한 설폰 제조를 위한 선택적 방법 - Google Patents

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아르끄마 프랑스
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위니베르시떼 덱스-마르세이유
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Abstract

본 발명은 효소적 촉매작용에 의해 황화물로부터 설폰을 제조하기 위한 선택적 방법뿐만 아니라 대칭적 황화물(여기서, 산화환원효소는 상기 대칭적 황화물의 대칭적 설폰으로의 산화를 촉매함); 선택적으로 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C; 및 특히 상기 방법의 구현을 허용하는 산화제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

효소적 촉매작용에 의한 설폰 제조를 위한 선택적 방법
설명
본 발명은 효소적 촉매작용에 의해 유기 황화물로부터 유기 설폰을 제조하기 위한 선택적 방법, 및 또한 특히 상기 방법의 구현을 가능하게 하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
메르캅탄은 산업적으로 큰 관심을 받고 있으며, 현재 화학 산업, 특히 더 복잡한 유기 분자의 합성에서 시작 물질로 매우 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 메틸 메르캅탄(CH3SH)은 동물 영양에 사용되는 필수 아미노산인 메티오닌의 합성에서 시작 물질로 사용된다. 메틸 메르캅탄은 또한 디알킬 디설파이드의 합성, 더욱 특히 다른 적용 중에서도 석유 분획용 촉매를 수소화처리하기 위한 황화 첨가제인 디메틸 디설파이드(DMDS)의 합성에 사용된다.
메르캅탄, 더욱 특히 메틸 메르캅탄은 일반적으로 하기 식 (1)에 따라 촉매의 존재하에서 상승된 온도에서 알콜 및 황화수소로부터 시작하는 공지된 방법에 의해 산업적으로 합성된다:
Figure pct00001
그러나, 이러한 반응은 하기 식 (2)에 따른 황화물과 같은 부산물의 형성을 발생시킨다:
Figure pct00002
메르캅탄은 또한 하기 식 (3)에 따라 할로겐화 유도체 및 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 황화수소암모늄으로부터 합성될 수 있다(염화 유도체 및 황화수소나트륨을 사용하여 제공된 예):
Figure pct00003
이러한 두 번째 합성 경로도 또한 원치 않는 황화물의 존재를 발생시킨다.
마지막으로, 메르캅탄은 또한 하기 식 (4)에 따라 표적이 분지형 또는 비분지형 메르캅탄인지의 여부에 따라 산 촉매작용에 의해 또는 광화학적으로 올레핀 및 황화수소로부터 합성될 수 있다:
Figure pct00004
다시 한번, 이러한 합성은 부산물로서 황화물을 발생시킨다.
이들 황화물은 산업적으로 다량으로 획득되며, 주로 파괴를 위해 보내진다. 이는 의도된 메르캅탄을 생성하기 위한 방법에서의 효율성 손실 및 이를 파괴하는 것과 관련된 추가 비용을 나타낸다. 이러한 방식의 폐기물 생성은 이에 따라 이들 부산물로부터 가치를 도출하고자 하는 메르캅탄 생산자에게 실질적인 산업적 문제이다. 이를 수행하는 다양한 방식이 있다.
가장 먼저, 황화물 자체에 대한 시장이 있다: 디메틸 설파이드는 식품 향료 또는 석유 공급원료의 증기 분해에서 항코킹제(anticoking agent)로 사용될 수 있다. 그러나, 이들 시장의 수요는 생성된 황화물의 양보다 훨씬 적다.
황화물은 또한 황가수분해(sulfhydrolysis) 반응에 의해 상응하는 메르캅탄으로 전환될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 반응을 수행하는 데 필요한 조건은 비교적 가혹하며, 새로운 기생 반응을 발생시킨다. 따라서, 이러한 산업적 적용은 제한적이다.
최종적으로, 생성된 황화물로부터 가치를 도출하는 또 다른 수단은 이들을 설폭사이드 및/또는 설폰으로 전환시키는 황화물의 산화 반응을 포함한다. 이들 종류의 화학적 산화 반응은 널리 공지되어 있다. 이들은 촉매의 존재 또는 부재하에서 차아염소산나트륨, 과산화수소, 산소, 오존 또는 N2O4와 같은 질소 산화물과 같은 상이한 유형의 산화제를 수반한다.
그러나, 황화물을 산화시키는 화학적 방법은 실질적 산업적 문제를 제기한다. 가장 심각한 문제 중 하나는 산화 반응의 낮은 화학선택성이다. 현재, 설폭사이드 또는 설폰으로만 산화를 유도하는 산업적으로 이용 가능한 수단은 없으며; 설폭사이드와 설폰의 혼합물이 항상 황화물의 산화의 결과로 획득된다. 이들 화학적 방법의 다른 단점은, 예를 들어, 안전 문제를 야기하는 매우 강력한 시약의 사용, 또는 그렇지 않으면 질소 산화물의 부족한 이용 가능성(산업적 공급자가 거의 없음)이다. 더욱이, 질소 산화물을 사용하는 방법과 같은 이들 화학적 방법 중 일부는 오염물질 배출 문제를 야기한다.
화학적 산화뿐만 아니라, 황화물 산화는 생물학적 방법에서 용액 또는 유기체, 일반적으로 미생물에서 효소적 촉매작용에 의해 촉매될 수 있다. 그러나, 효소적 촉매작용에 의해 수행되는 이들 산화는 획득된 생성물에 대해 더 이상 선택적이지 않으며; 여기서 다시, 설폭사이드와 설폰의 혼합물이 상응하는 황화물로부터 획득된다.
따라서, 설폭사이드에 비한 설폰으로의 황화물의 산화 반응의 낮은 선택성은 사용되는 산화 방법(화학적 또는 효소적)에 관계 없이 산업 전선에서 문제를 야기한다. 실제로, 비용 및 품질의 명백한 이유로 인해, 설폭사이드 또는 설폰 중 어느 하나인 관심 생성물에 대해 가능한 가장 큰 선택성을 갖는 것이 바람직하다.
문헌[Bordewick et al.]에 의한 작업은 비대칭 방향족 황화물의 설폭시화 반응을 촉매하기 위한 야로위아(Yarrowia) 모노옥시게나제 A-H의 사용을 제안한다(S. Bordewick, Enzyme Microb. Technol., 2018, 109, 31-42). 이러한 간행물에서, 시작 효소의 변이체를 획득하기 위한 유전적 돌연변이 기술의 사용은 디메틸 설폰의 생성을 거의 95%까지 감소시킨다.
상기 유전적 변형 기술의 사용은 불확실하고 비용이 많이 든다.
이들 방법은 또한 높은 실패율을 가지며, 이는 전체적으로, 더욱 특히 관심 기질에서 효소 활성의 감소 또는 심지어 손실로 해석된다. 따라서, 상기 변형은 우수한 선택성을 보장하지 않는다.
결과적으로, 산업적으로 그리고 경제적으로 실행 가능한 황화물, 특히 메르캅탄 합성으로부터의 황화물을 활용하기 위한 방법이 필요하다.
더욱 특히, 산업적으로 적용 가능하고, 보다 경제적이며, 보다 환경 친화적인 황화물을 설폰으로 산화시키기 위한 방법이 필요하다.
선택적이고, 산업적으로 작동하기에 간단하고 경제적인 황화물을 설폰으로 산화시키기 위한 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 상기 요구의 전부 또는 일부를 충족시키는 것이다.
따라서, 본 발명은,
a) 하기를 포함하는 조성물 M을 제조하는 단계;
- 황화물;
- 상기 황화물의 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E;
- 선택적으로, 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C; 및
- 산화제;
b) 황화물의 설폰으로의 효소적 산화 반응을 수행하는 단계;
c) 단계 b)에서 획득된 설폰을 회수하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 회수된 설폰을 선택적으로 분리시키고/시키거나 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는, 설폰을 제조하기 위한 바람직하게는 선택적인 방법에 관한 것으로,
상기 황화물은 효소적 반응을 수행하는 단계 b) 동안 완전히 소모된다.
놀랍게도, 본 발명자는 효소적 촉매작용에 의해 설폰을 제조하기 위한 선택적 방법을 발견하였다. 상기 방법으로, 더욱 특히 단계 b)의 끝에서 설폭사이드를 획득하지 않고(또는 무시할 수 있는 양으로 획득하고) 상응하는 황화물로부터 설폰을 획득하는 것이 가능하다.
그 이유는 효소적 촉매작용에 의한 황화물의 산화가 하기 반응 순서에 따라 일반적으로 발생하기 때문이다:
Figure pct00005
상기 반응식에서, 사용되는 효소, 이의 임의의 보조인자(들) 및 산화제는 설폭사이드가 형성되는 제1 단계, 및 설폰이 형성되는 제2 단계에서 동일하다. 따라서, 동일한 반응 혼합물 내에서, 상기 표시된 바와 같이 설폭사이드 및 바람직하지 않은 설폰 둘 모두를 획득하는 것이 가능하다.
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명자는 획득된 부산물, 더욱 특히 설폭사이드를 감소시키거나 심지어 억제함으로써 설폰이 선택적으로 획득되도록 하는 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명자는 단계 b)의 끝에서 설폭사이드를 획득하지 않고 설폰을 획득하는 수단을 결정하였다.
놀랍게도, 황화물의 설폭사이드로의 산화가 우선시되고, 설폭사이드의 설폰으로의 산화와 관련하여 배타적으로 발생한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 반응 혼합물(예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 조성물 M)에 황화물이 있는 경우, 설폰이 형성되지 않고 설폭사이드가 선택적으로 형성된다. 설폭사이드는 반응 혼합물(예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 조성물 M)이 더 이상 임의의 황화물을 함유하지 않고 대신 설폭사이드만을 함유하는 경우에 설폰으로 전환된다.
따라서, 본 발명 덕분에 설폭사이드 또는 설폰의 선택적인 생성을 용이하게 제어할 수 있고, 방법의 작동 조건을 변경하지 않고도 그렇게 할 수 있다.
정의
용어 "(C1-C20)알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있고, 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 포화 지방족 탄화수소를 나타낸다. 바람직하게는, 알킬은 1 내지 12개의 탄소 원자, 또는 심지어 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸을 포함한다. 용어 "분지형"은 알킬기가 주 알킬 사슬을 따라 치환됨을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "(C2-C20)알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 나타낸다.
용어 "(C2-C20)알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 나타낸다.
용어 "(C6-C10)아릴"은 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 방향족 탄화수소 화합물, 더욱 특히 페닐 및 나프틸을 나타낸다.
용어 "(C3-C10)사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 포화 지방족 탄화수소, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 나타낸다.
(C3-C10)헤테로사이클로알칸은 3 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고, 적어도 하나의 황 원자, 바람직하게는 테트라하이드로티오펜 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 헤테로원자를 포함하는 사이클로알칸을 지칭한다.
(C4-C10)헤테로아렌은 4 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고, 적어도 하나의 황 원자, 예를 들어, 티오펜 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 헤테로원자를 포함하는 아렌을 지칭한다.
헤테로원자는 특히 O, N, S, Si, P 및 할로겐으로부터 선택되는 원자인 것으로 이해된다.
"촉매"는 일반적으로 반응을 촉진하고 이러한 반응의 끝에서 변하지 않는 물질인 것으로 이해된다. 일 구현예에 따르면, 상기 효소 E는 황화물의 설폰으로의 산화 반응을 촉매한다.
"촉매량"은 특히 반응을 촉매하고, 더욱 특히 황화물의 설폰으로의 산화를 촉매하기에 충분한 양을 지칭한다. 더욱 특히, 촉매량으로 사용되는 시약은 화학양론적 비율로 사용되는 시약의 중량에 의한 양에 비해 더 적은 양, 예를 들어, 약 0.01 중량% 내지 20 중량%로 사용된다.
반응의 선택성은 일반적으로 반응 후 소모된 반응물의 몰 수, 예를 들어, 소모된 황화물의 몰 수에 비한 형성된 생성물의 몰 수, 예를 들어, 형성된 설폰의 몰 수를 나타낸다.
전환, 선택성 및 수율의 일반적인 정의는 하기와 같다:
전환 = (초기 상태의 반응물의 몰 수 - 반응 후 남은 반응물의 몰 수) / (초기 상태의 반응물의 몰 수)
선택성 = 원하는 생성물로 전환된 반응물의 몰 수 / (초기 상태의 반응물의 몰 수 - 반응 후 남은 반응물의 몰 수)
수율 = 전환 X 선택성
따라서, "설폰을 제조하기 위한 선택적 방법"은 특히 방법의 끝에서 설폭사이드가 획득되지 않고, 바람직하게는 단계 b)의 끝에서 설폭사이드가 획득되지 않고(또는 무시할 수 있는 양의 설폭사이드가 형성되고) 황화물을 소모하고 설폰을 생성하는 방법을 지칭한다. 일 구현예에 따르면, 황화물의 설폰으로의 산화 반응은 화학선택적이다.
예를 들어, 본 발명의 방법, 더욱 특히 단계 b)는 설폰에 대해 95% 내지 100%, 바람직하게는 99% 내지 100%의 선택성을 제공한다.
방법
본 발명의 방법은 설폰을 제조하기 위한 선택적이고 심지어 화학선택적인 방법일 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 상응하는 설폭사이드가 획득되도록 하지 않는다.
일 구현예에 따르면, 이는 단계 b), 더욱 특히 선택적이고, 바람직하게는 화학선택적인 단계 b)에서 수행되는 황화물의 설폰으로의 효소적 산화 반응이다.
효소적 반응을 수행하는 단계인 단계 b)는 특히 하기 두 단계를 포함할 수 있다:
b1) 황화물의 설폭사이드로의 완전한 산화;
b2) 설폭사이드의 설폰으로의 산화.
"황화물의 완전한 산화"는 황화물이 단계 b1) 동안 완전히 소모됨을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 황화물은 조성물 M에서 제한 반응물(즉, 디폴트로 존재하는 반응물)이다.
"완전히 소모된"은 특히 효소적 반응을 수행하는 단계인 단계 b) 후에 남은 황화물의 양이 중량 기준으로 황화물의 시작량, 즉, 단계 a)로부터의 황화물에 비해 0 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0 중량% 내지 5 중량%, 예를 들어, 0 중량% 내지 1 중량%, 더 더욱 바람직하게는 0 중량% 내지 0.01 중량%일 수 있음을 의미한다.
더욱 특히, 조성물 M은 하기를 포함한다:
- 화학양론적 양의 황화물;
- 촉매량의 효소 E;
- 선택적으로, 촉매량의 적어도 하나의 보조인자 C; 및
- 화학양론적 양의 산화제.
황화물:
황화물은 특히 유기 황화물이며, 이는 적어도 하나의 -C-S-C- 작용기를 포함하는 임의의 유기 화합물이다.
일 구현예에 따르면, 조성물 M은 적어도 하나의 황화물을 포함한다. 예를 들어, 이는 하나, 둘 또는 다수의 상이한 황화물을 포함할 수 있다. 상기 황화물은 대칭적일 수 있으며, 이는 황 원자가 화합물에 대한 대칭 중심을 나타낸다는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 황화물은 하기 일반식을 갖는다:
R1-S-R2 (I)
상기 식에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 서로 독립적으로 선택되거나;
R1 및 R2는 이들이 부착된 황 원자와 함께 고리, 바람직하게는 (C3-C10)헤테로사이클로알칸 또는 (C4-C10)헤테로아렌 기를 형성하고;
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 것이 가능하고;
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 아릴 기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 것이 가능하다.
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 선택적으로 (C1-C20)알킬, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있고;
비제한적인 예로, 알콜, 알데하이드, 케톤, 산, 아미드, 니트릴 및 에스테르 작용기 또는 그 밖의 황, 인 및 규소를 함유하는 작용기로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로 선택적으로 관능화될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 (C1-C20)알킬, (C3-C10)사이클로알킬, (C6-C10)아릴, -OH, -C(O)OH, -C(O)H, -C(O)-NH2, -NH2, -NHR, -NRR', -C(O)-, -C(O)-NHR', -C(O)-NRR', -COOR 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있고; 여기서, R 및 R'은 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬 기를 나타낸다.
바람직한 일 구현예에 따르면, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐 및 (C3-C10)사이클로알킬로 구성된 군으로부터 서로 독립적으로 선택되거나;
R1 및 R2는 이들이 부착된 황 원자와 함께 (C3-C10)헤테로사이클로알칸 기를 형성한다.
R1 및 R2는 바람직하게는 (C1-C20)알킬로부터 선택되거나, R1 및 R2는 이들을 갖는 황 원자와 함께 (C3-C10)헤테로사이클로알칸을 형성한다. 상기 황화물의 라디칼 R1 및 R2는 바람직하게는 동일하다(즉, 대칭적 황화물을 형성함).
더욱 바람직하게는, 황화물은 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜으로부터 선택된다. 디메틸 설파이드가 본 발명에 따라 특히 바람직하다. 일 구현예에 따르면, 황화물은 대칭적이고 따라서 프로키랄이 아니다. 일 구현예에 따르면, 황화물은 tert-부틸 메틸 설파이드(CAS 번호 6163-64-0)가 아니다.
산화제:
산화제는 황화물을 설폰으로 산화시킬 수 있는 임의의 화합물이다.
산화제는 공기, 산소-고갈 공기, 산소-풍부 공기, 순수한 산소 및 과산화수소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 특정 구현예에 따르면, 산화제는 효소 E가 모노- 또는 디옥시게나제인 경우 공기, 산소-고갈 공기, 산소-풍부 공기 및 순수한 산소로 구성된 군으로부터 선택되고, 효소 E가 과산화효소인 경우 과산화수소이다. 산화제가 기체 형태인 경우, 이는 용해된 기체로서 조성물 M에 존재한다. 풍부하거나 고갈된 공기에서 산소의 백분율은 당업자에게 공지된 방식으로 반응 속도 및 효소적 시스템과의 상용성에 따라 선택된다.
산화제는 조성물 M에서 화학양론적 양으로 또는 과량으로 존재할 수 있다. 따라서, 존재하는 황화물은 단계 b)에서 수행되는 효소적 반응에서 산화제와 함께 완전히 소모된다.
공기(산소가 고갈되거나 풍부할 수 있는 공기)가 사용되는 경우, 산화제로서 단계 b)에서 수행되는 효소적 반응 동안 소모되는 것은 분명히 공기 내의 산소이다.
상기 반응의 끝에서, 산소는 사용되는 효소 E가 모노옥시게나제인 경우 물로 일반적으로 전환되거나, 효소 E가 디옥시게나제인 경우 완전히 소모된다. 차례로 과산화수소는 과산화효소의 작용에 이어 물로 전환된다. 따라서, 본 발명의 방법은 배출 및 환경 친화성 측면에서 특히 유리하다.
효소 E:
상기 효소 E는 산화환원효소, 바람직하게는 모노옥시게나제, 디옥시게나제 및 과산화효소로 구성된 군, 더욱 바람직하게는 모노옥시게나제로부터 선택되는 산화환원효소일 수 있다.
상기 효소 E는 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(Baeyer-Villiger monooxygenase; BVMO)이다.
더 더욱 바람직하게는, BVMO 중에서, 효소 E는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO), 더욱 특히 사이클로헥사논 1,2-모노옥시게나제 또는 사이클로펜타논 모노옥시게나제(CPMO), 더욱 특히 사이클로펜타논 1,2-모노옥시게나제일 수 있다.
사이클로헥사논 1,2-모노옥시게나제는 특히 클래스 EC 1.14.13.22로부터의 것이다.
일 특정 구현예에서, CHMO는 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.)(예를 들어, 균주 NCIMB 9871의 아시네토박터 종)으로부터의 CHMO 및/또는 클러스터 AB006902에 속하는 유전자 chnB에 의해 인코딩되는 CHMO이다.
사이클로펜타논 1,2-모노옥시게나제는 특히 클래스 EC 1.14.13.16으로부터의 것이다.
일 특정 구현예에 따르면, CPMO는 코마모나스 종(Comamonas sp.)(예를 들어, 균주 NCIMB 9872)으로부터의 CPMO 및/또는 유전자 cpnB에 의해 인코딩되는 CHMO이다.
모노옥시게나제는 또한 하이드록시아세토페논 모노옥시게나제(HAPMO) 및 더욱 특히 4-하이드록시아세토페논 모노옥시게나제일 수 있다.
하이드록시아세토페논 모노옥시게나제는 특히 클래스 EC 1.14.13.84로부터의 것이다.
일 특정 구현예에 따르면, HAPMO는 유전자 hapE에 의해 인코딩되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터의 HAPMO이다.
보조인자(들) C:
"보조인자 C"는 특히 상기 정의된 바와 같은 효소 E의 촉매적 활성에 필요하고/하거나 이의 촉매 활성이 향상되도록 하는 보조인자를 지칭한다.
일 구현예에 따르면, 하나 또는 두 개 이상의 보조인자 C가 조성물 M에 존재한다. 예를 들어, 조성물 M을 다른 보조인자 C에 더하여 효소 E에 이미 자연적으로 존재하는 보조인자 C와 혼합하는 것이 가능하다.
산화환원효소가 과산화효소인 경우, 조성물 M에 보조인자 C를 첨가하지 않는 것이 가능하다. 니코틴 및/또는 플라빈 보조인자는 효소 E가 모노- 또는 디옥시게나제 부류에 속하는 경우에 사용될 수 있다.
상기 적어도 하나의 보조인자 C는 니코틴 보조인자 및 플라빈 보조인자로부터 선택될 수 있다. 더욱 특히, 상기 적어도 하나의 보조인자 C는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD) 및/또는 이들의 상응하는 환원된 형태(즉, NADH,H+ NADPH,H+, FMNH2, FADH2)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 열거된 보조인자 C는 유리하게는 이들의 환원된 형태(예를 들어, NADPH, H+) 및/또는 이들의 산화된 형태(예를 들어, NADP+)로 사용되며, 이는 이들이 조성물 M에 이들 환원된 및/또는 산화된 형태로 첨가될 수 있음을 의미한다.
사용되는 효소 E는 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제, 예를 들어, 아시네토박터 종으로부터의 사이클로헥사논 모노옥시게나제이고, 사용되는 보조인자 C는 선택적으로 FAD에 의해 보충되는 NADP이다.
보조인자(들) C를 재생하기 위한 시스템(들):
상기 정의된 바와 같은 조성물 M은 또한 보조인자(들) C를 재생하기 위한 적어도 하나의 시스템을 포함할 수 있다. "보조인자(들) C를 재생시키기 위한 시스템"은 환원된 보조인자(들) C가 산화된 보조인자(들) C로 또는 그 반대로 재전환되도록 하는 임의의 화학적 및/또는 효소적 반응 또는 일련의 반응을 의미한다.
예를 들어, 재생 시스템은 희생 기질을 사용하는 공지된 효소적 산화환원 시스템일 수 있다. 이러한 종류의 시스템은 희생 기질을 사용하여 사용된 보조인자(들) C의 재활용을 가능하게 하는 제2 효소(재활용 효소로 언급됨)의 사용을 포함한다.
재활용 효소는 글루코스 데하이드로게나제, 데하이드로게나제 포르메이트, 포스파이트 데하이드로게나제(Vrtis, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41(17), 3257-3259) 또는 그 밖의 데하이드로게나제 알콜(Leuchs, Chem. Biochem. Eng. Q., 2011, 25(2), 267-281; Goldber, App. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76(2), 237)을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 희생 기질 중에서, 수소-공여 화합물이 가장 특히 바람직하고, 이들 중에서, 완전히 적합한 화합물은 알콜, 폴리올 당 등과 같은 하이드록실 작용기를 갖는 수소-공여 유기 환원 화합물, 예를 들어, 글루코스 또는 글리세롤이다.
예를 들어, CHMO의 경우, 재활용 시스템의 효소는 NADPH,H+ 형태의 보조인자 NADP+를 환원시키고, 희생 기질은 산화된다.
본 발명에 따른 조성물 M은 또한 하기를 포함할 수 있다:
- 선택적으로, 물, 완충제, 예를 들어, 포스페이트 완충제, Tris-HCl, Tris 염기, 중탄산암모늄, 아세트산암모늄, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), CHES (N-사이클로헥실-2-아미노에탄설폰산), 또는 염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 용매;
- 선택적으로, 특히 효소적 반응의 하나 이상의 반응물 또는 기질의 용해도를 촉진하기 위한 계면활성제와 같은 첨가제.
바람직하게는, 조성물 M은 수용액이다. 예를 들어, 상기 조성물 M은 조성물 M의 총 중량에 대해 50 중량% 내지 99 중량%의 물, 바람직하게는 80 중량% 내지 97 중량%의 물을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 조성물 M은 반응 혼합물을 포함하는 것으로 간주된다.
상기 단계 a)에서 제조된 조성물 M의 다양한 성분은 상업적으로 용이하게 획득 가능하거나 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 이들 상이한 요소는 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 매우 유리하게는 용액으로 만들어질 수 있거나, 물 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 다른 용매에 용해될 수 있다. 사용되는 효소는 또한 지지체(지지된 효소의 경우)에 이식될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 효소 E, 선택적으로 상기 적어도 하나의 보조인자 C, 선택적으로 상기 적어도 하나의 재생 시스템은,
- 분리된 및/또는 정제된 형태 내, 예를 들어, 수용액 내;
- 또는 미정제 추출물, 즉, 분쇄된 세포의 추출물 내; 또는
- 전체 세포 내에 존재한다.
전체 세포가 우선적으로 사용된다. 비 [황화물] (mmol/L 단위) / [세포] (gcdw.L-1 단위)는 바람직하게는 효소적 반응을 수행하는 단계인 단계 b) 동안 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.01 내지 3 mmol/gcdw.일 수 있다. 건조 세포의 그램 단위의 질량 농도(세포 건조 중량에 대한 gCDW)는 통상적인 기술에 의해 결정된다.
효소 E는 숙주 세포로 하기에서 지칭되는 상기 세포에서 과발현될 수 있고 그렇지 않을 수도 있다.
숙주 세포는 상응하는 코딩 유전자의 발현으로부터 효소 E를 생성하기에 적절한 임의의 숙주일 수 있다. 이러한 유전자는 이후 숙주의 유전체에 위치하거나 하기 정의되는 것과 같은 발현 벡터에 의해 운반될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "숙주 세포"는 특히 원핵 또는 진핵 세포인 것으로 이해된다. 재조합 또는 비-재조합 단백질의 발현에 일반적으로 사용되는 숙주 세포는 특히 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 또는 바실러스 종(Bacillus sp.), 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 진균 세포, 예를 들어, 아스퍼질루스 니게르(Aspergillus niger), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum) 또는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포, 또는 그 밖의 포유동물(특히, 인간) 세포, 예를 들어, HEK 293, PER-C6 또는 CHO 세포주를 포함한다.
상기 숙주 세포는, 예를 들어, 배양 배지로부터 제거된 고정기 또는 성장기에 있을 수 있다.
바람직하게는, 효소 E 및 이의 관련된 적어도 하나의 보조인자 C는 박테리아 에스케리키아 콜리에서 발현된다. CHMO는 바람직하게는, 예를 들어, 에스케리키아 콜리 BL21(DE3)와 같은 에스케리키아 콜리 균주 내에서 발현된다.
HAPMO는 바람직하게는, 예를 들어, 에스케리키아 콜리 BL21(DE3)와 같은 에스케리키아 콜리 균주 내에서 발현된다.
전체 및/또는 용해된 세포의 경우, 예를 들어, 이는 사용되는 보조인자(들) C를 재생하는 세포 기구이다. 예를 들어, 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO) 및/또는 사이클로펜타논 모노옥시게나제(CPMO)를 발현하는 에스케리키아 콜리 균주의 경우, 보조인자 C는 NADP이다.
일 구현예에 따르면, CHMO가 황화물을 설폰으로 전환시키는 경우, 선택적으로 보조인자 C2 FAD와 함께 보조인자 C1은 NADP이다. CHMO가 황화물을 설폰으로 전환시키는 경우, 보조인자 NADPH,H+는 NADP+로 산화되며, 이는 세포 및/또는 설치된 재생 시스템에 의해 재생될 것이다.
환원된 보조인자의 재생은, 예를 들어, 배지에 글리세롤이 보충되는 경우 E. 콜리에 자연적으로 존재하는 효소, 특히 효소 글리세롤 데하이드로게나제에 의해 가능해질 것이다. 글루코스가 보충된 배지의 경우, 펜토스 포스페이트 경로의 효소, 특히 E. 콜리에 자연적으로 존재하는 효소 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및/또는 6-포스포글루콘산 데하이드로게나제가 환원된 보조인자 C1의 재생에 참여할 것이다.
본 발명에 따르면, 효소 E, 선택적으로 적어도 하나의 보조인자 C 및 선택적으로 보조인자(들) C를 재생하기 위한 시스템을 포함하는 숙주 세포는 "생체촉매"로 지칭된다.
상기 정의된 바와 같은 효소 E 및/또는 생체촉매는 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 획득될 수 있다.
세포 숙주에서의 효소 E에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 통합
플라스미드와 같은 발현 벡터가 사용되는 경우, 원핵 및 진핵 세포의 형질전환은, 예를 들어, 리포펙션, 전기천공, 열 충격 또는 화학적 방법에 의한 것과 같은 당업자에게 널리 공지된 기술이다. 발현 벡터 및 숙주 세포 내에 발현 벡터를 도입하는 방법은 선택된 숙주 세포에 따라 선택된다. 이러한 형질전환 단계는 재조합 효소 E를 코딩하는 유전자를 발현하는 형질전환된 세포를 생성한다. 세포는 효소 E를 생성하기 위해 배양/인큐베이션 단계에서 배양될 수 있다.
원핵 및 진핵 세포의 인큐베이션/배양은, 예를 들어, 배양 배지 또는 그 밖의 온도 및 시간 조건을 결정할 수 있는 당업자에게 널리 공지된 기술이다. 사용되는 벡터에 따라, 효소 E의 증가된 생성에 상응하는 유도 기간이 관찰될 수 있다. 약한(예를 들어, 벡터 pBad에 대한 아라비노스) 또는 강한(예를 들어, 벡터 pET22b, pRSF 등에 대한 이소프로필 β-D-1-티오갈락토시드(IPTG)) 유도물질을 사용하는 것이 고려될 수 있다. 숙주 세포에 의한 효소 E의 생성은 SDS-PAGE 전기영동 기술 또는 웨스턴 블롯 기술을 사용하여 검증될 수 있다.
"발현 벡터"는 관심 뉴클레오티드 서열이 삽입될 수 있는 감소된 크기의 DNA 분자이다. 플라스미드, 코스미드, 파지 등과 같은 다수의 공지된 발현 벡터로부터 선택이 이루어질 수 있다.
벡터는 특히 사용되는 세포 숙주의 기능으로 선택된다.
당해 발현 벡터는, 예를 들어, 문서 WO 83/004261호에 기재된 것일 수 있다.
발현 벡터의 부재하에 숙주 세포의 유전체에서의 효소 E에 대한 코딩 서열의 통합
효소 E를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 공지된 방법, 예를 들어, 상동성 재조합 또는 그 밖에 시스템 CRISPR-Cas9 등에 의해 숙주 세포의 유전체로 통합될 수 있다. 숙주 세포에 의한 효소 E의 생성은 SDS-PAGE 전기영동 기술 또는 웨스턴 블롯 기술을 사용하여 검증될 수 있다.
분리된 및/또는 정제된 형태로 사용하기 위한 효소 E의 분리 및/또는 정제
형질전환된 숙주 세포의 형질전환 및 배양/인큐베이션 후, 효소 E의 분리 및 선택적으로 정제 단계가 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 숙주 세포의 존재하에 수행되는 것이 아니라, 조성물 M의 용액, 바람직하게는 수용액에서 효소 E에 의해 수행된다.
생성된 상기 효소 E의 분리 및/또는 정제는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어, 전기영동, 분자 체질, 초원심분리, 예를 들어, 황산암모늄을 사용한 차등 침전, 초여과, 막 또는 겔 여과, 이온 교환, 소수성 상호작용을 통한 분리, 또는 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, IMAC로부터 선택되는 기술을 포함할 수 있다.
숙주 세포의 용해 방식, 분쇄된 세포의 미정제 추출물의 제조
세포 용해질은 화학 제제(예를 들어, Triton) 등의 사용을 통해 음파처리, 압력(프렌치 가압기(French press))과 같은 다양한 공지된 기술에 의해 획득될 수 있다. 획득된 용해질은 분쇄된 세포의 미정제 추출물에 해당한다.
단계 a)에서, 조성물 M의 다양한 성분은 임의의 원하는 순서로 첨가될 수 있다. 조성물 M은 다양한 성분을 단순히 혼합함으로써 제조될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 b)와 단계 c) 사이에 단계 b')를 포함하고, 여기서 효소적 반응은 생체촉매 및/또는 효소 E의 불활성화에 의해 중단된다. 이러한 단계 b')는 열 충격(예를 들어, 약 100℃의 온도) 또는 삼투 충격, 고압의 적용, 세포 및/또는 효소 E의 파괴 및/또는 침전을 가능하게 하는 용매의 첨가, pH 변형(약 2의 낮은 pH 또는 약 10의 높은 pH)과 같은 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다.
황화물은 단계 b)에 따른 효소적 반응에서의 반응 속도보다 낮은 속도로 조성물 M에 도입될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 효소적 반응을 수행하는 단계인 단계 b)는 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 바람직하게는 7 내지 8, 예를 들어, 7의 pH에서 수행된다.
일 구현예에 따르면, 효소적 반응을 수행하는 단계인 단계 b)는 5℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다.
상기 효소적 반응에 사용되는 압력은 사용되는 반응물 및 장비에 따라 대기압에 비해 감소된 압력에서 수 bar(수백 kPa)까지의 범위일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 획득되는 이점이 많다. 이들 이점은 매우 온화한 온도 및 압력 조건 및 중성에 가까운 pH 조건 하에서 수용액에서 작업할 수 있는 가능성을 포함한다. 이들 모든 조건은 "그린(green)" 또는 "지속 가능"으로 지칭되는 생체촉매 공정의 전형이다.
단계 c)에서, 설폰은 액체 또는 고체 형태로 회수될 수 있다. 설폰은 이의 용해도에 따라 수용액으로, 또는 디캔팅에 의해 액체 형태로, 또는 심지어 침전에 의해 고체 형태로 회수될 수 있다.
단계 d)의 경우, 정제 방법은 당해 설폰의 특징에 좌우된다. 따라서, 초여과 또는 원심분리에 의한 세포(효소 E를 함유함)의 분리 후, 증류는 설폰의 분리를 가능하게 할 수 있다.
이러한 증류는 대기압, 감압(진공)에서, 또는 당업자가 임의의 이점을 유지한다고 생각하는 경우 더 높은 압력하에서 발생할 수 있다.
막 분리는 또한 증류를 위해 혼합물의 수분 함량을 감소시키거나, 결정화 공정을 가속화하기 위한 목적으로 고려될 수 있다. 수성 반응 혼합물로부터 디캔팅에 의해 설폰이 회수된 경우, 분자 체 상에서의 건조(또는 임의의 다른 건조 방법)가 고려될 수 있다.
상기 방법은 배치식(batchwise) 또는 연속적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은,
a-1) 하기를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
- 상기 효소 E;
- 선택적으로, 상기 적어도 하나의 보조인자 C;
- 상기 산화제;
a-2) 단계 a-1)에서 획득된 조성물에 상기 황화물을 바람직하게는 주입에 의해 첨가함으로써 상기 정의된 바와 같은 조성물 M을 제조하는 단계;
b) 황화물의 설폰으로의 효소적 산화 반응을 수행하는 단계;
c) 단계 b)에서 획득된 설폰을 회수하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 회수된 설폰을 선택적으로 분리시키고/시키거나 선택적으로 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 구현에 따르면, 상기 방법은,
a-1) 하기를 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
- 상기 황화물;
- 상기 효소 E; 및
- 선택적으로, 상기 적어도 하나의 보조인자 C;
a-2) 단계 a-1)에서 획득된 조성물에 상기 산화제를 첨가함으로써 상기 정의된 바와 같은 조성물 M을 제조하는 단계;
b) 황화물의 설폰으로의 효소적 산화 반응을 수행하는 단계;
c) 단계 b)에서 획득된 설폰을 회수하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 회수된 설폰을 선택적으로 분리시키고/시키거나 선택적으로 정제하는 단계를 함유할 수 있다.
조성물 M
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 조성물 M에 관한 것이다.
조성물 M의 다양한 요소 그 자체 및 이의 용도는 상기 방법에 대해 정의된 바와 같다.
더욱 특히, 본 발명은 또한 하기를 포함하는 조성물 M에 관한 것이다:
- 상기 정의된 바와 같은 대칭적 황화물;
- 상기 대칭적 황화물의 대칭적 설폰으로의 산화를 촉매하는 상기 정의된 바와 같은 산화환원효소, 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(BVMO), 더욱 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO);
- 선택적으로, 상기 정의된 바와 같은 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C; 및
- 선택적으로, 상기 정의된 바와 같은 산화제.
더 더욱 특히, 본 발명은 하기를 포함하는 조성물 M에 관한 것이다:
- 일반식 (I): R1-S-R2 (I)의 황화물(여기서, R1 및 R2는 동일하고 상기 정의된 바와 같음);
- 상기 황화물 (I)의 일반식 (II): R1-S(O)2-R2 (II)(여기서, R1 및 R2는 동일하고 상기 정의된 바와 같음)의 설폰으로의 산화를 촉매하는 상기 정의된 바와 같은 산화환원효소, 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(BVMO), 더욱 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO);
- 선택적으로, 상기 정의된 바와 같은 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C; 및
- 선택적으로, 상기 정의된 바와 같은 산화제.
황화물은 바람직하게는 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜으로부터 선택된다. 디메틸 설파이드가 특히 바람직한 황화물이다.
일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 방법을 구현하기 위한 상기 정의된 바와 같은 조성물 M에 해당한다.
용도
본 발명은 또한 대칭적 황화물을 상응하는 대칭적 설폰으로 산화시키기 위한 상기 정의된 바와 같은 산화환원효소, 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(BVMO), 더욱 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)의 용도에 관한 것이다. 상기 효소적 산화 반응은 특히 본 발명의 의미에서 선택적이다. 일 구현예에 따르면, 황화물은 일반식 R1-S-R2 (I)의 황화물이고, 일반식 R1-S(O)2-R2 (II)(여기서, R1 및 R2는 동일하고 상기 정의된 바와 같음)의 설폰으로 전환된다.
도면의 설명
도 1:
도 1은 반응이 효소 CHMO에 의해 촉매되는 경우 시간의 함수(시간 단위)로서 반응 혼합물에 존재하는 디에틸 설파이드(DES), 디에틸 설폭사이드(DESO) 및 디에틸 설폰(DESO2)의 농도(mM 단위)를 나타낸다.
표현 "X와 X 사이"는 언급된 종점을 포함한다. 하기 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 : 본 발명에 따른 디에틸 설파이드로부터의 디에틸 설폭사이드의 선택적 합성
I. 생체촉매의 제조:
플라스미드 pET22b(Promega, Qiagen에 의해 시판됨)에 삽입된 chnB 유전자를 발현하는 에스케리키아 콜리 BL21(DE3)의 균주(Merck Millipore에 의해 시판됨)를 작제하였다. 이는 아시네토박터 종으로부터의 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)의 이종성 발현을 가능하게 한다.
상기 균주는 CHMO, CHMO의 보조인자, 즉 NADP 및 FAD, 및 이의 재생 시스템을 포함하는 것이 인지될 것이다.
이러한 균주를 당업자에게 공지된 기술에 의해 사전배양하고 배양하였다.
0.85 mmol/L의 최종 농도에서 이소프로필 β-D-1-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가함으로써 촉발된 유도 단계 후, 특정 부피의 배양물을 원심분리(10분, 5000 g, 4℃)하여 원하는 양의 세포를 제공한다. 본 실시예에서, 300 ODU의 신선한 세포의 펠렛을 이후 5 g/L의 글리세롤이 보충된 32 mL의 pH 7의 0.1 mol/L 포스페이트 완충액에 재현탁시킨다. 이후, 획득된 세포 농도는 9.4 ODU/mL 또는 그 밖에 3 gCDW/L(여기서, CDW는 세포 건조 중량을 의미함)이다.
II. 생물전환:
상기 기재된 32 mL의 혼합물을 함유하는 250 mL 플라스크에서, 디에틸 설파이드(DES)의 초기 농도는 t=0에서 4.5 mmol/L로 측정된다.
일정한 간격으로, 50 μL의 반응 혼합물을 회수하고, 25 mg/L의 운데칸(내부 표준)을 함유하는 1450 μL의 아세토니트릴 용액에 희석한다. 원심분리(5분, 12 500 g) 후, 반응 동안 형성된 디에틸 설폭사이드(DESO) 및 디에틸 설폰(DESO2)의 정량적 측정을 위해 상층액을 GC(가스 크로마토그래피)에 주입한다. 수행된 분석 조건하에서, 측정 가능한 최소 농도는 30 μM이다.
분석은 2.5시간의 반응에서 화학선택성의 변화를 제시한다. 이러한 시점 이전에, DESO 양의 선형 증가가 측정되며, 설폰은 검출되지 않는다. 이러한 부분에 대한 황화물의 산화 속도는 이후 시간 당 혼합물 리터 당 4 mmol의 산화된 DES이다.
3시간 후, DESO2의 양의 선형 증가는 DESO의 소모와 동시에 관찰되며, DESO2는 2.8 mmol/L/h의 속도로 형성된다. 6시간의 반응에서, DESO2만이 존재한다.
따라서, DESO2는 DES가 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 경우에 형성된다.
본 실시예는 황화물이 반응 혼합물에 존재하는 동안 황화물의 설폭사이드로의 산화 반응이 화학선택적임을 제시한다(도 1 참조).
획득된 선택성은 약 100%이다.
첫째로, DES가 반응 혼합물에 여전히 존재하는 경우, 사용되는 분석 도구로 설폰이 검출되지 않는다.
둘째로, DES가 반응 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 경우, DESO의 산화가 완료된다. 반응의 끝(t=5 h)에서, 약 100%의 DESO2가 획득되며, 사용되는 분석 도구에 의해 DESO가 검출되지 않는다.
외삽법에 의해, 계산된 비 [황화물] (mmol/L 단위) / [세포] (gcdw.L-1 단위)는 t=2.5에서 0.06 mmol/gcdw이다.
실시예 2:
I. 생체촉매의 제조:
실시예 1에 기재된 것과 동일한 균주를 본 실시예에서 사용하였다.
이번에는 더 많은 양의 세포를 사용하였다.
유도 단계의 끝에서, OD600을 8.4 ODU/mL로 측정하고, 102 mL의 부피를 회수하여 원심분리(10분, 5000g, 4℃) 후 860 ODU의 신선한 세포를 함유하는 펠렛을 제공한다. 이후, 이러한 펠렛을 0.5 g/L의 글리세롤이 보충된 32 mL의 pH 7의 0.1 mol/L 포스페이트 완충액에 재현탁시킨다. 이후, 획득된 세포 농도는 27 ODU/mL(또는 약 9 gCDW/L)이다.
II. 생물전환:
상기 기재된 32 mL의 혼합물을 함유하는 250 mL 플라스크에서, 반응 혼합물에서 측정된 디에틸 설폭사이드(DESO)의 농도는 11.3 mmol/L이다. t=2 h에서, 에탄올 용액 중의 DES가 첨가된 후, 10.4 mmol/L의 DES 농도가 측정된다.
반응을 실시예 1에 기재된 2개의 샘플링 작업을 수행함으로써 모니터링한다. 분석은 0 내지 2시간의 반응에서, 초기에 첨가된 DESO로부터 DESO2만 생성되는 것을 제시한다(이후, 7.7 mmol/L의 농도가 획득됨). t=2 h에서 DES를 첨가한 후, DESO2의 농도는 더 이상 적어도 4.5시간까지 변하지 않는 반면, 동시에 DESO가 생성된다(10.4 mmol/L가 생성됨). 16.5시간의 반응에서, DESO2만이 존재한다(완전히 산화된 DESO).
따라서, DES를 추가하는 것은 설폰(이 경우, DESO2)의 형성을 중단시킨다.
본 실시예는 황화물의 설폭사이드로의 산화가 우선적 반응일뿐만 아니라 설폭사이드의 설폰으로의 산화 반응과 관련하여 배타적임을 제시한다.
실시예 3 : 디메틸 설파이드(DMS)의 효소적 산화
I. 생체촉매의 제조:
생체촉매(CHMO)는 실시예 1의 것과 동일하고, 상기 실시예 1에 기재된 조건하에 생성된다.
II. 생물전환:
실시예 1에 제시된 생물전환 조건은 사용된 황화물을 제외하고는 본 실시예에서 사용된 것과 동일하다. 본 실시예에서, DMS의 에탄올 용액은 4.5 mM의 초기 황화물 농도를 획득하기 위해 사용된다.
반응은 실시예 1에 제시된 방법에 의해 모니터링된다.
놀랍게도, 사용된 생체촉매는 동일한 산화 특징을 발생시킨다. 구체적으로, DMS는 혼합물에 존재하는 경우 화학선택적으로 산화되고(디메틸 설폰이 검출되지 않음), 이후 DMS가 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 시점으로부터 설폭사이드가 산화된다.
이러한 화학선택성 외에도, 반응의 초기 단계에서 동일한 크기 정도(DES에 비함)의 황화물 산화 속도가 획득되었고, 시간 당 혼합물 리터 당 3.9 mmol의 DMS가 산화된다. 더욱이, 설폰 형성 속도는 1 mmol/L/h이다.
실시예 4 : 메틸 에틸 설파이드(MES)의 효소적 산화
I. 생체촉매의 제조:
생체촉매(CHMO)는 실시예 1의 것과 동일하고, 상기 실시예 1에 기재된 조건하에 생성된다.
II. 생물전환:
실시예 1에 제시된 생물전환 조건은 사용된 황화물을 제외하고는 본 실시예에서 사용된 것과 동일하다. 본 실시예에서, MES의 에탄올 용액은 4.5 mM의 초기 황화물 농도를 획득하기 위해 사용된다.
반응은 실시예 1에 제시된 방법에 의해 모니터링된다.
놀랍게도, 사용된 생체촉매는 동일한 산화 특징을 발생시킨다. 구체적으로, MES는 혼합물에 존재하는 경우 화학선택적으로 산화되고(메틸 에틸 설폰이 검출되지 않음), 이후 MES가 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 시점으로부터 메틸 에틸 설폭사이드가 산화된다.
이러한 화학선택성 외에도, 반응의 초기 단계에서 동일한 크기 정도(다른 황화물에 비함)의 산화 속도가 획득되었고, 시간 당 혼합물 리터 당 3.6 mmol의 MES가 산화된다. 더욱이, 설폰 생성 속도는 3.5 mmol/L/h이다.
실시예 5 : 테트라하이드로티오펜(THT)의 효소적 산화
I. 생체촉매의 제조:
생체촉매(CHMO)는 실시예 1의 것과 동일하고, 상기 실시예 1에 기재된 조건하에 생성된다.
II. 생물전환:
실시예 1에 제시된 생물전환 조건은 사용된 황화물을 제외하고는 본 실시예에서 사용된 것과 동일하다. 본 실시예에서, THT의 에탄올 용액은 4.5 mM의 초기 황화물 농도를 획득하기 위해 사용된다.
반응은 실시예 1에 제시된 방법에 의해 모니터링된다.
놀랍게도, 사용된 생체촉매는 동일한 산화 특징을 발생시킨다. 구체적으로, THT는 혼합물에 존재하는 경우 화학선택적으로 산화되고(해당 설폰인 설폴란이 검출되지 않음), 이후 THT가 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 시점으로부터 테트라하이드로티오펜 1-옥사이드가 산화된다.
이러한 화학선택성 외에도, 반응의 초기 단계에서 동일한 크기 정도(다른 황화물에 비함)의 산화 속도가 획득되었고, 시간 당 혼합물 리터 당 3.4 mmol의 THT가 산화된다. 더욱이, 설폰 형성 속도는 1.5 mmol/L/h이다.
실시예 6 : 본 발명에 따른 황화물 혼합물의 효소적 산화
I. 생체촉매의 제조:
실시예 1에 기재된 것과 동일한 균주를 본 실시예에서 사용하였다.
유도 단계의 끝에서, OD600을 8.4 ODU/mL로 측정하고, 31 mL의 부피를 회수하여 원심분리(10분, 5000g, 4℃) 후 300 ODU의 신선한 세포를 함유하는 펠렛을 제공한다. 이후, 이러한 펠렛을 0.5 g/L의 글리세롤이 보충된 32 mL의 pH 7의 0.1 mol/L 포스페이트 완충액에 재현탁시킨다. 이후, 획득된 세포 농도는 9.4 ODU/mL(또는 약 3 gCDW/L)이다.
II. 생물전환:
32 mL의 상기 기재된 혼합물을 함유하는 250 mL 플라스크에, 각각 3.64 M의 디에틸 설파이드(DES), 디메틸 설파이드(DMS) 및 테트라하이드로티오펜(THT)의 75 μL의 에탄올 용액을 동시에 도입하며, 이는 반응의 시작이다.
반응을 실시예 1에 기재된 동일한 샘플링 작업을 수행함으로써 모니터링한다.
분석은 첫 번째 기간 동안, 혼합물의 황화물이 설폭사이드로 산화되고, 설폰이 검출되지 않음을 제시한다. 놀랍게도, DES의 산화 속도는 존재하는 다른 두 황화물(DMS 및 THT)(이들 둘 모두는 동일한 산화 속도를 가짐)의 산화 속도보다 크다(하기 표 1 참조).
Figure pct00008
상이한 황화물의 혼합과 함께 이들 조건하에서 검출되지 않은 DMSO2를 제외하고는 두 번째 단계에서만, 황화물이 반응 혼합물에서 더 이상 검출되지 않는 경우에 상응하는 설폰이 획득된다.

Claims (13)

  1. a) 하기를 포함하는 조성물 M을 제조하는 단계;
    - 황화물;
    - 상기 황화물의 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E;
    - 선택적으로, 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C; 및
    - 산화제;
    b) 황화물의 설폰으로의 효소적 산화 반응을 수행하는 단계;
    c) 단계 b)에서 획득된 설폰을 회수하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 회수된 설폰을 선택적으로 분리시키고/시키거나 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는, 설폰을 제조하기 위한 방법으로서,
    상기 황화물이 효소적 반응을 수행하는 단계 b) 동안 완전히 소모되는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 E가 산화환원효소, 바람직하게는 모노옥시게나제, 디옥시게나제 및 과산화효소로 구성된 군, 더욱 바람직하게는 모노옥시게나제로부터 선택되는 산화환원효소인 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소 E가 베이어-빌리거 모노옥시게나제(Baeyer-Villiger monooxygenase; BVMO), 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)인 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황화물이 하기 일반식의 황화물이고;
    R1-S-R2 (I)
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 서로 독립적으로 선택되거나;
    R1 및 R2는 이들이 부착된 황 원자와 함께 헤테로사이클로알칸 또는 헤테로아렌을 형성하고;
    상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 것이 가능하고;
    상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 아릴 기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 것이 가능한,
    제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 황화물의 라디칼 R1 및 R2가 동일한 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황화물이 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜, 바람직하게는 디메틸 설파이드로부터 선택되는 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비 [황화물] (mmol/L 단위) / [세포] (gcdw.L-1 단위)가 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.01 내지 3 mmol/gcdw인 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 공기, 산소-고갈 공기, 산소-풍부 공기, 순수한 산소 및 과산화수소로 구성된 군으로부터 선택되는 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 보조인자 C가 니코틴 보조인자 및 플라빈 보조인자로부터 선택되는 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 E가 사이클로헥사논 모노옥시게나제이고, 보조인자 C가 NADP 및 선택적으로 FAD인 제조 방법.
  11. - 대칭적 황화물;
    - 상기 대칭적 황화물의 대칭적 설폰으로의 산화를 촉매하는 산화환원효소, 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(BVMO), 더욱 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO);
    - 선택적으로, 상기 효소 E의 적어도 하나의 보조인자 C;
    - 선택적으로, 산화제를 포함하는,
    조성물.
  12. 제11항에 있어서, 황화물 (I)이 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜, 바람직하게는 디메틸 설파이드로부터 선택되는 조성물.
  13. 대칭적 황화물을 대칭적 설폰으로 산화시키기 위한 산화환원효소, 바람직하게는 베이어-빌리거 모노옥시게나제(BVMO), 더욱 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)의 용도.
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