TW202334408A - 用於生物合成２，６－雙（羥甲基）吡啶的單氧化酶突變體及使用該單氧化酶突變體製備２，６－雙（羥甲基）吡啶的方法 - Google Patents
用於生物合成２，６－雙（羥甲基）吡啶的單氧化酶突變體及使用該單氧化酶突變體製備２，６－雙（羥甲基）吡啶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明涉及提供一種使用突變的二甲苯單加氧酶(稱為ppXMO)從2,6-二甲吡啶開始製備2,6-二(羥甲基)吡啶的酶促方法，該酶包括來自惡臭假單胞菌的xylM亞單元和xylA亞單元，其中該突變酶在XylM組分的胺基酸序列的第116位具有胺基酸交換。本發明的實質是該位置的甲硫胺酸(M)被選自天冬醯胺酸(N)、離胺酸(K)、精胺酸(R)和甘胺酸(G)的胺基酸取代，這令人驚訝地導致6-甲基-2-吡啶甲醇的直接甲基羥基化，導致提高的整體工藝產率，產生了更少的副產物，避免了有毒反應中間體，並最小化對內源性還原酶的參與以及NADPH及其再生的需求。在位置116或其等效位置周圍的高度保守區域具有相同的胺基酸交換的與惡臭假單胞菌的XylM相關的其他酶，也表現出類似的改進特性。
Description
本發明屬於生物化學領域，更確切地說，屬於不同用途的酶及製備突變酶的基因工程。本發明也屬於有機化學領域。本發明涉及用於生物合成2,6-二(羥甲基)吡啶(式I)的單加氧酶突變體及使用該單加氧酶突變體製備2,6-二(羥甲基)吡啶的方法。
2,6-二(羥甲基)吡啶(式I)是一種可用作製備其他複雜產品的多功能中間體的化合物。羥基可以轉化為其他官能團，諸如醛基、鹵代烴、胺基等，其然後用於製備進一步有用的化合物。此外，由於2、6位上的取代，2,6-二(羥甲基)吡啶也可用於大環化合物的合成。一個實例是pyclen，一種氮雜大環框架，其在12元大環單元中併入了芳香吡啶部分。
式I的化合物可以從2,6-二甲吡啶(lutidine)II其是一種容易獲得的原料，通過用KMnO4氧化至相應的二羧酸，轉化為相應的酯，並且最後將酯基還原為醇進行合成(Journal of Dispersion Science and Technology 2006,27,p.15-21)。引用的參考文獻未提及關於該三步轉化的產率。此外，這種合成方法很繁瑣，因為它需要三個整體步驟和幾個伴隨純化的中間分離。
專利申請CN105646334A公開了上述合成方法，省去了酯轉化步驟，即，先分離出二羧酸，然後直接轉化為二醇。中國專利申請報告稱，這種兩步法的總產率為64%，對於如此短的合成來說，這是一個適中的產率。
Egorov等人在1985年報道(Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya,21(3),pp.349-353)發現某些非增殖細胞的懸浮液能夠將2,6-二甲吡啶羥基化為2-甲基-6-羥甲基吡啶。發現少量的2,6-二(羥甲基)吡啶僅由變硫色側孢(Sporotrichum sulfurescens)ATCC 7159物種形成。這表明底物的極性通過插入第一羥基而增加，這阻礙了第二甲基的氧化。該文件公開了不能通過增加轉化反應的持續時間來顯著增加產率。
需要開發一種選擇性方法，以從2,6-二甲吡啶(式II)生產2,6-二(羥甲基)吡啶(式I)，而無需分離中間體，並且具有高產率，從工業製造的前景來看其成本效益高，並且也更具可持續性。
此外，本發明的目的是提供將提高從2,6-二甲吡啶生產2,6-二(羥甲基)吡啶的效率的酶變體。
最近提交的專利申請PCT/EP2021/068920(在本申請撰寫時其尚未公佈)公開了一種將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的方法，
該方法中使用的酶是氧化還原酶，較佳地NAD(P)H依賴
性氧化還原酶，其使用分子氧來氧化2,6-二甲吡啶II。根據該文件，可能的氧化還原酶是：
- 由惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的xylM和xylA基因編碼的二甲苯單加氧酶，其被稱為ppXMO或
- 以下中的XylMA樣酶：
˙麥氏交替單胞菌(Alteromonas macleodii)或
˙Tepidiphilus succinatimandens或
˙昆明新鞘氨醇菌(Novosphingobium kunmingense)或
˙海洋生絲單胞菌(Hyphomonas oceanitis)或
˙鞘氨醇菌屬(Sphingobium)sp.32-64-5或
˙食芳香性鹽嗜異生質菌(Halioxenophilus aromaticivorans)；或
- 在胺基酸水平上具有超過70%的序列同一性的XylMA樣酶。
儘管從工業生產的前景來看，根據該方案的工藝具有成本效益，但上述反應途徑並非最佳，原因包括：
- 形成的中間體6-甲基-2-吡啶甲醛和6-(羥甲基)吡啶-2-甲醛的劇毒性質，
- 形成6-甲基-2-吡啶甲酸作為副產物，
- 涉及至少一種內源性酶，以及
- 對NADH和NADPH輔因子的高需求。
這些因素對整個工藝的產率產生負面影響。因此，技術問題是解決這些缺點。
本發明公開了一種從2,6-二甲吡啶(式II)製備式I化合物的酶法。本文公開的方法包括一個步驟，該步驟包括酶的存在，其可以選擇性方式進行雙重氧化。
為了解決使用野生型二甲苯單加氧酶，ppXMO(其包括來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)(鐵莢膜節桿菌，Arthrobacter siderocapsulatus)的XylM亞單元和XylA亞單元的方法的缺點，已經使用基因工程產生了突變酶，其中該突變酶在XylM的胺基酸序列的第116位進行胺基酸交換。本發明的實質是高度保守區域中第116位的甲硫胺酸(M)被任意不同的胺基酸取代，較佳地被選自天冬醯胺酸(N)、離胺酸(K)、精胺酸(R)和甘胺酸(G)的胺基酸取代，這令人驚訝地導致6-甲基-2-吡啶甲醇(式III)的直接甲基羥基化。已觀察到突變酶：
- 將整體工藝產率提高至少50%，
- 改善最終產物分佈圖，意味著產生更少的副產品，
- 促進製備合成期間的工藝控制(在生物反應器中)，
- 減輕反應中間體的毒性，
- 最小化/消除內源性還原酶參與的需要，
- 最小化/消除對NADPH及其再生的需求。
與惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的XylM組分相關的其他酶在第116位附近的高度保守區域內具有相同的胺基酸交換，也表現出類似的改進特性，因此也適用於從2,6-二甲吡啶開始製備式I的化合物。在一些XylM相關酶中，諸如源自食芳香性鹽嗜異生質菌(GenBank：BBB44451.1)的XylM，甲硫胺酸的等效位置是134，而在源自ntnMO WT(GenBank：AAC38359.1)的突變體ntnMO中，等效位置是116，並且代替甲硫胺酸，存在色胺酸(W)。需要在胺基酸水平上與惡臭假單胞菌的XylM組分有50%的同源性，以確保保留酶活性和該突變的效果。
定義
出於本申請的目的，包括所附的請求項，以下術語應具有以下闡述的各自含義。應當理解，當本文提及通用術語，諸如酶、溶劑
等時，本領域技術人員可以從以下定義中給出的那些、以及從以下說明書中列舉的另外的試劑中、或從本領域的文獻參考中找到的那些適當地選擇這種試劑。
如本文所用，術語「酶促工藝」或「酶促方法」表示採用酶或微生物的工藝或方法。
術語「微生物細胞」是指野生型微生物細胞、野生型微生物細胞或基因修飾的單細胞微生物，也稱為重組體，其充當用於產生參與酶促工藝的功能實體(酶)的宿主。術語宿主和細胞在整個本發明中可互換使用。
術語「重組細胞」表示微生物細胞進一步具有以基因組整合或質粒DNA的形式提供的編碼酶功能的異源DNA。
術語「進料速率」表示在酶促工藝的過程中每單位時間和體積添加到反應介質中的物質(例如，葡萄糖、甘油、二甲吡啶或任何其他營養物、輔因子或類似物)的量。
術語「反應介質」是指用於進行包含酶的工藝的任何生長介質。該介質能夠攜帶起始材料、單獨或作為細胞的一部分的酶以及產物和副產物。通常，反應介質是水性溶劑。
術語「輔因子再生系統」表示使用生物相容性底物例諸如標準碳源(葡萄糖、甘油)、酒精或有機酸(例如，甲酸鹽)，還原生物輔因子，較佳地將NAD+還原為NADH，將NADP+還原為NADPH，更佳將NAD+還原為NADH的酶或一組酶。
術語「甲酸鹽」是指由相應鹽，例如，甲酸鈉產生的陰離子。
術語「營養素」是指可用作碳源(例如，葡萄糖、甘油)、氮源(例如，氨、胺基酸)、磷源(磷酸鹽、植酸鹽)、微量營養素源(金屬離子、維生素)的有機或無機分子。
本發明中採用的酶源自微生物基因組。基因可以是優化和合成製備的，或從各自的宿主中克隆(例如通過PCR)的密碼子。例如，
它們可以被克隆(例如，使用限制酶和DNA連接酶)到合適的表現載體中或整合到重組宿主的基因組上以產生基因工程宿主細胞。
此外，應當理解，在本文的製備方法和請求項中，代詞「一」在用於指代諸如「鹼」、「溶劑」等試劑時，旨在表示「至少一種」，因此，在適當的情況下，包括單一試劑以及試劑的混合物。
將在實施例和附圖的基礎上進一步描述本發明，該附圖顯示：
圖1A由來自惡臭假單胞菌的野生型單加氧酶XylMA(正方形)和在第116位具有M到G交換的突變XylMA(三角形)催化從2,6-二甲吡啶形成2,6-二(羥甲基)吡啶的時間過程。
圖1B通過XMO WT和在位置M116處具有取代的突變體的1g/L 2,6-二甲吡啶II至2,6-二(羥甲基)吡啶I的全細胞生物轉化。為簡單起見，僅繪製了生物轉化過程中目標產物I的濃度。
圖2使用來自惡臭假單胞菌的野生型單加氧酶XylMA(左)和在第116位具有M到G交換的突變XylMA(右)進行的過夜實驗室規模生物轉化產生的HPLC-UV色譜圖。峰的峰面積對應於副產物，6-甲基-2-吡啶甲酸V。
圖3通過XylMA野生型(上圖)和XylMA突變體(下圖)將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的反應方案，與野生型不同，其經由6-甲基-2-羥基吡啶III的直接羥基化有效地催化反應。
圖4通過XylMA野生型(左)和XylMA突變體(右)製備合成2,6-二(羥甲基)吡啶I的中間體和產物的積累。
圖5多序列比對顯示來自惡臭假單胞菌的XylM中M116周圍區域的高度保守性以及與該蛋白質同源性>50%的序列。
圖6通過兩種相關蛋白(GenBank：BBB44451.1(hoXMO WT)和GenBank：AAC38359.1(ntnMA WT)和兩種具有第
116位突變的側向誘變突變體的0.5g/L的化合物III的過夜轉化的HPLC色譜圖。
圖7不同XylM和XylM樣酶與它們的酶活性之間的系統發育關係。
本發明公開了一種製備2,6-二(羥甲基)吡啶(式I)的化合物的酶促法。使用具有以下胺基酸序列SEQ ID NO 1的來自惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的野生型ppXMO，在酶的存在下以高產率且不形成顯著量的副產物(副產品)，可以從容易獲得的式II開始獲得式I化合物。
SEQ ID NO 1：
發明人驚訝地發現，通過基因工程製備的來自惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的突變ppXMO酶，其在XylM組分的胺基酸序列的第116位具有胺基酸交換，能夠使6-甲基-2-吡啶甲醇III直接甲基羥基化。野生型XylM組分中第116位的甲硫胺酸(M)被任何不同於M的胺基酸取代，較佳地被選自天冬醯胺酸(N)、離胺酸(K)、精胺酸(R)和甘胺酸(G)的胺基酸取代，其中較佳的選擇是甘胺酸(G)。因此，本發明涉及突變酶以及編碼具有以下胺基酸序列的突變酶的所有多核酸：
SEQ ID NO 2：
SEQ ID NO 3：
SEQ ID NO 4：
SEQ ID NO 5：
以上所給出序列的下劃線部分表示高度保守的區域，其中與WT相比，第116位M的取代導致酶性質的顯著變化。在一些ppXMO相關酶中，諸如hoXMO，甲硫胺酸的等效位置是134，而在ntnMO中，等效位置是116，並且代替甲硫胺酸，存在色胺酸(W)。突變的效果相同或高度相似。已觀察到突變酶：
- 提高整個製備合成工藝的產率(尤其是在生物反應器中)，其中通常產率提高至少50%，
- 改善最終產物分佈圖，這意味著不生產或生產更少的副產品，
- 促進製備合成(在生物反應器中)期間的工藝控制，
- 減輕反應中間體的毒性問題，這是突變酶能夠同時轉化式I和III化合物的直接結果(與WT相反，WT在開始轉化化合物III之前必須首先耗盡化合物II)，
- 最小化對內源性酶參與的需求，
- 最小化/消除對NADPH及其再生的需求。
如果與XylMA的其他突變相結合，可以進一步改進位置116處的次較佳的突變以及較佳的突變。
與惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的ppXMO相關的在高度保守區域(等效於XylM組分的第116位)具有相同的甲硫胺酸胺基酸交換的其他酶也表現出類似的改進特性，並且也將適用於從2,6-二甲吡啶開始製備式I的化合物。氧化還原酶是由惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的xylM和xylA基因編碼的二甲苯單加氧酶，或者麥氏交替單胞菌或Tepidiphilus succinatimandens或昆明新鞘氨醇菌或海洋生絲單胞菌或鞘氨醇菌屬某種32-64-5或食芳香性鹽嗜異生質菌的XylM樣酶，或者在整個XylM序列的胺基酸水平上具有超過50%的序列同一性的XylM樣酶。甚至更佳地，氧化還原酶是由惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的xylM和xylA基因編碼的二甲苯單加氧酶，ppXMO。可選地，較佳的選擇也是具有胺基酸序列SEQ ID NO：6的來自H.aromaticivorans的XylMA樣酶，SEQ ID NO：6是：
SEQ ID NO 6：
使用上述突變酶進行2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的工藝。
根據本領域技術人員熟知的技術，所公開的酶可用於所公開的方法中。它們可以用作產生它們的細胞的一部分(全細胞催化)或在體外使用，其中酶是可用的並且在適當的反應條件下用於反應介質中。
在較佳的實施方式中，根據本發明的酶在微生物宿主中表現。微生物宿主然後可稱為重組微生物宿主。重組宿主可進一步通過基因工程進行定制。較佳的微生物宿主是大腸桿菌、谷胺酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、球形紅細菌、鏈黴菌屬某些種、謝氏丙酸桿菌、普通生酮基古龍酸菌、貝氏不動桿菌、嗜鹽單胞菌。更佳的是大腸桿菌。
本領域技術人員熟悉在微生物宿主中表現某些酶的技術。這種技術在相關教科書中進行了舉例說明，諸如“Enzymology”(Book series,Elsevier,ISSN 0076-6879)或“Molecular Cloning”(ISBN 978-1-936113-42-2)。
當使用野生型酶時，酶促工藝至少部分通過6-甲基-2-羥基吡啶III的形成進行。當酶是二甲苯單加氧酶時，除了式III化合物之外，式II化合物向式I化合物的酶促轉化通過式IV化合物的形成進行。
如果2,6-二甲吡啶II保持在適合於維持酶促工藝中發生的各種轉化之間的平衡的進料速率，則是有益的。進料速率不需要恒定，只要根據以下實施方式進行調整即可。進料速率也應處於適當水平，以免達到2,6-二甲吡啶II的生長抑制水平。
在較佳的實施方式中，調整反應介質中2,6-二甲吡啶II的進料速率，使得反應介質中2,6-二甲吡啶的濃度不超過10g/L，較佳地0.1g/L，以及更佳地0.02g/L的值。
在另一個較佳的實施方式中，調整反應介質中2,6-二甲吡啶II的進料速率使得2,6-二甲吡啶的濃度不低於10mg/L，較佳地0.1mg/L，更佳地0.01mg/L的值。
本發明的方法在水性介質中進行。水性介質是水或去離子水，其可進一步包括緩衝劑和營養物。
可根據本領域技術人員的常識調整本工藝中採用的生物質的重量。
反應介質溫度可以使得酶保持其酶促活性。其被較佳地保持在25和37℃之間，最佳地在28和32℃之間。
pH可以使得酶和重組菌株保持它們的酶促活性。較佳地，pH在6.0和8.0之間，更佳地6.5-7.5並且甚至更佳地7.0±0.1。
溶解氧張力(DOT)應保持在0%以上。隨著在生物反應器中重組細胞的生長和生物質的積累，DOT會下降，而且一旦添加底物2,6-二甲吡啶II，DOT就會進一步地顯著下降。因此重要的是，它保持在0%以上或更好地在3-5%以上，以便發生生物催化反應。DOT可以通過用於混合水性介質速度的能量輸入、生物反應器通氣的速率或含有氧氣的供應空氣的補充來控制。
可以根據本領域技術人員的常識調整碳源(諸如，葡萄糖或甘油)進料的比率。
反應時間可根據酶的量及其比活性而變化。可以通過本領域技術人員熟悉的酶促反應的溫度或其他條件對進行進一步調整。典型的反應時間範圍在1小時到72小時之間。
在另一個實施方式中，將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的工藝任選地涉及脫氫酶的存在。轉化可以直接在微生物細胞中進行，而無需持家脫氫酶的進一步工程化。在又另一個實施方
式中，微生物細胞進一步從另一個微生物細胞合成脫氫酶。在甚至又另一個實施方式中，一種或多種持家脫氫酶被滅活或工程化。
在較佳的實施方式中，微生物細胞進一步從另一種微生物細胞合成脫氫酶，並且一種或多種持家脫氫酶被滅活或工程化。
催化2,6-二甲吡啶II的甲基氧化轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的相應羥甲基並且在該實施方式中使用的酶根據前述實施方式。
只要技術人員得出特定的酶組合，它們在同一微生物宿主中的表現就是技術人員熟知的技術。上面已經提供了參考書。
在較佳的實施方式中，脫氫酶是NAD(P)H依賴性或NADH依賴性且優先地NADH依賴性。
在另一個較佳實施方式中，脫氫酶催化6-甲基吡啶-2-甲醛IV至6-甲基-2-羥基吡啶III的還原或6-(羥甲基)-2-吡啶甲醛V至2,6-二(羥甲基)吡啶I的還原。較佳地，脫氫酶催化6-甲基吡啶-2-甲醛IV至6-甲基-2-羥基吡啶III的還原以及6-(羥甲基)-2-吡啶甲醛V至2,6-二(羥甲基)吡啶I的還原二者。
在另一個較佳實施方式中，脫氫酶選自來自乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)的AKR、來自貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)ADP1的XylB和來自馬裡斯假絲酵母(Candida maris)的AFPDH的列表。
在另一個實施方式中，提供了一種將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的方法，其中該轉化在酶的存在下，以及另外地輔因子再生系統的存在下進行，該酶催化2,6-二甲吡啶II的甲基
至2,6-二(羥甲基)吡啶I的相應羥甲基的氧化轉化。
催化2,6-二甲吡啶II的甲基至2,6-二(羥甲基)吡啶I的相應羥甲基的氧化轉化並且在該實施方式中採用的酶是根據先前的實施方式。
轉化可直接在微生物細胞中進行，而無需持家脫氫酶的進一步工程化，如先前實施方式中所公開。
在又另一個實施方式中，微生物細胞進一步由另一種微生物細胞合成脫氫酶。
在甚至又另一個實施方式中，一種或多種持家脫氫酶被滅活或工程化。
在較佳的實施方式中，微生物細胞進一步由另一種微生物細胞合成脫氫酶，並且一種或多種持家脫氫酶被滅活或工程化。
在該實施方式中採用的脫氫酶是根據先前的實施方式。
輔因子可以是NAD(P)H或NADH，並且再生系統是NAD(P)H或NADH再生系統。較佳地，再生系統是NADH再生系統。
再生系統較佳地在表現催化氧化轉化的酶的同一微生物宿主中共表現。在更佳的實施方式中，同一微生物宿主也共表現脫氫酶，如先前的實施方式中所述。
輔因子是在許多酶催化的生化反應中起著重要作用的非蛋白質化合物。輔因子用於在酶之間轉移化學基團。煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)和該分子的還原形式(分別為NADH和NADPH)是在細胞代謝中充當電子轉移劑起著重要作用的生物輔因子。氧化形式的NAD+和NADP+充當電子受體，在此工藝中被還原。反過來，NADH和NADPH可以充當還原劑，在此工藝中被氧化。大多數介導氧化或還原反應的酶都依賴於輔因子，諸如NADPH或NADH。採用輔因子再生系統以確保參與給定生物過程的輔因子不被耗盡和/或降低工藝的總成本。
在較佳的實施方式中，NADH再生系統是甲酸鹽脫氫酶
再生系統。
在另一個較佳的實施方式中，NADH再生系統是基於甲酸鹽脫氫酶的系統，更佳地是對氧不敏感的胞質甲酸鹽(format)脫氫酶。
在另一個較佳的實施方式中，NADH再循環系統由不依賴金屬的甲酸鹽脫氫酶組成，該甲酸鹽脫氫酶對NAD+種類具有活性並且具有細菌或真菌來源。
較佳地，對NAD+種類有活性的不依賴金屬的甲酸鹽脫氫酶來自熱帶假絲酵母或母牛分枝桿菌FDH。
在較佳的實施方式中，將甲酸鹽進料到如任何先前的實施方式中所限定的工藝，以便再生被酶、脫氫酶或兩者消耗的NADH，該酶催化2,6-二甲吡啶II的甲基至2,6-二(羥甲基)吡啶I的相應羥甲基的氧化轉化。較佳地，將甲酸鹽進料到工藝中，用於再生被氧化還原酶、脫氫酶或兩者消耗的NADH。
在較佳的實施方式中，調節反應介質中甲酸鹽的進料速率，使得甲酸鹽的濃度不超過150mM，較佳地100mM，更佳地50mM的值。
在另一個較佳的實施方式中，調節反應介質中甲酸鹽的進料速率，使得反應介質中甲酸鹽的濃度不低於50mM，較佳地25mM，更佳地5mM的值。
在更佳的實施方式中，調節反應介質中甲酸鹽的進料速率，使得反應介質中2,6-二甲吡啶II的濃度不超過150mM的值並且不低於50mM，較佳地25mM，更佳地5mM的值。
在另一個較佳的實施方式中，調節反應介質中甲酸鹽的進料速率使得反應介質中甲酸鹽的濃度不超過100mM的值並且不低於50mM，較佳地25mM，更佳地5mM的值。
在另一個較佳的實施方式中，調節反應介質中甲酸鹽的進料速率使得反應介質中甲酸鹽的濃度不超過50mM的值並且不低於50
mM的值，較佳地25mM，更佳地5mM。
實施例
實施例1：野生型XylM蛋白的遺傳操縱
WT的胺基酸序列
>sp｜P21395｜XYLM_PSEPU二甲苯單加氧酶亞單元1
OS=惡臭假單胞菌OX=303 GN=xylM PE=3 SV=1
https：//www.uniprot.org/uniprot/P21395
以引入隨機突變為目的對基因序列SEQ ID NO：1的操縱是使用隨機誘變的標準技術進行的，即，使用誘變DNA聚合酶對xylM基因進行易錯PCR擴增。將所得PCR產物克隆到載體主鏈中，該載體主鏈包括pBR322複製起點、編碼卡那黴素抗性蛋白的kan基因和通過適用於蛋白質表現的二環丙基酮(DCPK)進行XylMA誘導的誘導型PalkS啟動子，並通過電穿孔轉化到表現菌株中。DNA測序證實了隨機突變的存在。產生了超過50,000個獨特變體的文庫。
使用MALDI-MS進行目標活性的篩選。該方案允許在大約20分鐘內測量384個樣本(一個384孔微量滴定板)，從而允許從文
庫中篩選>20,000個克隆。在96孔板中重新篩選與目標產品相對應的最高信號的孔中的變體，而通過HPLC-UV量化產品形成，並通過DNA測序鑒定基因序列中包含的突變。
實施例2：通過在搖瓶中表現XylMA蛋白的重組大腸桿菌轉化二甲吡啶
將編碼多組分二甲苯單加氧酶XylMA的惡臭假單胞菌(鐵莢膜節桿菌)的xylM和xylA基因的多核苷酸序列克隆到包含pBR322複製起點、編碼卡那黴素抗性蛋白的kan基因和用於通過二環丙基酮(DCPK)進行XylMA誘導的誘導型PalkS啟動子的質粒中，通過電穿孔轉化到大腸桿菌BL21宿主中，並平板接種在補充有卡那黴素的LB瓊脂板上。在37℃下溫育過夜後，採集單個菌落並在37℃下在搖瓶上以200rpm在4mL的LB生長培養基中繁殖12-14小時。第二天，使用LB中的過夜培養物在含有4.5g/L的KH2PO4、6.3g/L的Na2HPO4、2.3g/L的(NH4)2SO4、1.9g/L的NH4Cl、1g/L的檸檬酸、20mg/L的硫胺素、10g/L的甘油、55mg/L的CaCl2、240mg/L的MgSO4、1×微量元素(0.5mg/L的CaCl2．2H2O；0.18mg/L ZnSO4．7H2O，0.1mg/L MnSO4．H2O，20.1mg/L Na2-EDTA，16.7mg/L FeCl3．6H2O，0.16mg/L CuSO4．5H2O)、50mg/L的卡那黴素最小培養基中接種主培養物，用NH4OH調節pH為7。將100mL搖瓶中的20mL主培養物的起始光密度(OD600)調整為0.05，並且將搖瓶在37℃、200rpm下溫育，直至達到0.6-0.8的OD，然後添加0.025% DCPK並將培養物在30℃、200rpm下進一步溫育一小時或直至OD達到1。在目標OD下，向細胞中添加各種亞生長抑制濃度的2,6-二甲吡啶II，並進一步溫育培養物直至實現了完全的底物轉化，並且細胞生長停滯持續至少2小時。使用配備有270nm的C18柱的RP-HPLC監測和量化反應進程，計算全細胞催化的各個反應的比活性範圍為0.3-0.6g/g CDW/h。結果表明形成了1.25g/L羥基化產物(93%的
2,6-二(羥甲基)吡啶I；5-7%的6-甲基-2-吡啶甲酸V)。
圖1顯示了野生型單加氧酶(圖1a中的正方形和圖1b中的三角形)催化反應時，與不同單加氧酶突變體相比，實驗室規模反應進程和目標產物積累速率。圖1a顯示了具有從M到G的胺基酸交換的突變體的結果，其中所需的反應產物2,6-二(羥甲基)吡啶開始更早地積累並且也更快地達到最大濃度(大約提前2小時)。圖1b顯示了單個較佳的突變單加氧酶之間的比較，其中具有胺基酸序列SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的突變體的反應速率和最終產率更高。雖然，另外兩個具有胺基酸序列SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5的突變體具有較低的產率和較低的反應速率，但與野生型相比，毒性副產物的量仍然顯著減少，因此這些突變體相對於WT仍然是較佳的。
圖2展示了最終產物分佈圖的差異，即，由野生型單加氧酶(左)和具有M到G胺基酸交換(因此具有序列SEQ ID NO：2)(右)的突變單加氧酶生成的HPLC-UV色譜圖。色譜圖是從如上所述的過夜搖瓶生物轉化中獲得的。對應於副產物6-甲基-2-吡啶甲酸V的峰的峰面積在用突變酶獲得的產物分佈圖中遠不那麼顯著，表明了優異的催化作用、提高的效率和較低的毒性。
圖3說明了XylMA野生型(上圖)和XylMA突變體(SEQ ID NO：2；下圖)將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的反應方案的這些差異，與野生型不同，XylMA突變體經由6-甲基-2-羥吡啶III的直接羥基化有效地催化反應。
實施例3：在生物反應器中通過表現XylMA蛋白的重組大腸桿菌轉化2,6-二甲吡啶
接種主要培養物之前的微生物菌株、培養基和生長條件與實施例1相同。然而，在本實施例中，在生物反應器中製備主培養物，其中可以控制諸如溫度、pH、溶解氧張力、混合和葡萄糖可用性等參數，從而允許補料分批發酵。通過適當添加氫氧化銨或由pH-stat控制的硫
酸來維持pH值的波動。對於發酵的分批階段，以0.025的起始OD600接種1L生長培養基(如實施例1)，並且細胞在30℃下生長12-13h或直到它們完全消耗掉最初提供的碳源(例如，葡萄糖或甘油)，這由生物反應器中溶解氧的急劇上升表示。在此階段，通過以適當的進料速率從補充有1×微量元素、1×卡那黴素和240mg/L的MgSO4的500g/L的葡萄糖儲備液中添加適當的葡萄糖來啟動發酵的補料分批階段，使得在添0.05%的DCPK時，保持0.31h-1的生長速率直至OD600達到35。用DCPK誘導1小時後，將2,6-二甲吡啶II添加到生物反應器中(進料速率：0.1mL/L的肉湯/min)，並且使反應進行14-18h。一旦最初供應的量轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I，就可以進行2,6-二甲吡啶II的第二次添加，並使反應繼續，直到轉化完成或只要細胞的生長速率維持高於0.025h-1。生物轉化20小時內可產生高達20g/L的總產物(90%的2,6-二(羥甲基)吡啶I；10%的6-甲基-2-吡啶甲酸V)。
圖4顯示了XylMA野生型(左)和XylMA突變體(右)製備合成2,6-二(羥甲基)吡啶I中間體和產物的積累。分別顯示了野生型單加氧酶和單加氧酶突變體M116G催化2,6-二甲吡啶II生物轉化過程中形成的主產物、副產物和中間體的形成。在未優化的生物工藝條件下，用突變體M116G催化的製備反應多產生了約30%的產物。生物工藝條件的優化和突變體M116G的使用預計帶來>50%。此外，目標產物形成的平均速率從0.8g/L/h(單加氧酶野生型)增加到1g/L/h(單加氧酶M116G突變體)，並且化合物II和III由突變體同時轉化，而不是分級轉化。最後，用突變體實現了顯著減少的副產物形成(從~5%(野生型)到<1%(突變體M116G))。
實施例4：通過表現XylMA樣蛋白的重組大腸桿菌轉化2,6-二甲吡啶
在惡臭假單胞菌中M116的功能等效位置處引入交換對生物轉化效率具有相似的影響。我們用來自H.aromaticivorans的
xylM樣基因顯示了這一點。在等效於M116的位置具有突變的H.aromaticivorans突變體顯示出反應提高的速率、更高的產率以及式II和式III化合物的同時(非分級)轉化。
圖5顯示了多序列比對，表明來自惡臭假單胞菌的XylM中M116周圍的區域(圖中用框突出顯示)在相關序列中高度保守，其序列與來自惡臭假單胞菌的XylM具有超過50%的同一性。
為了顯示取代第116位或等效位置處的甲硫胺酸會在相關酶中引起相同的效果，通過靶向誘變，並在具有降低的芳香醛還原能力的大腸桿菌宿主(大腸桿菌RARE)中表現製備了兩種突變酶。顯示了通過兩種相關蛋白質(GenBank：BBB44451.1(hoXMO WT)和GenBank：AAC38359.1(ntnMO WT)和兩種在位置116處具有突變的側向誘變突變體的0.5g/L的化合物III的過夜(即，1020分鐘反應)轉化的HPLC色譜圖。提及的大腸桿菌宿主允許所需的產物I只能經由測試酶(兩個WT和兩個突變體)催化的化合物III的游離甲基的直接羥基化形成。在這兩種情況下，突變酶中的胺基酸交換顯著改善了所需產物的形成，就像來自惡臭假單胞菌的突變XylM的情況一樣。只有對應於底物(灰色箭頭)和所需產物(黑色箭頭)的峰顯示在圖中。對應於過氧化產物(醛、酸)的額外的峰未明確突出顯示。兩種突變體都顯示所需產物的增加，而反應物的量顯著降低。
圖6和圖7顯示了與惡臭假單胞菌酶具有至少50%的同源性的各種XylM樣酶的結果。如圖6所示，顯示了通過兩種相關蛋白(GenBank：BBB44451.1(hoXMO WT)和GenBank：AAC38359.1(ntnMA WT)和兩種在位置116處具有突變的側向誘變突變體的0.5g/L的化合物III的過夜轉化的HPLC色譜圖具有提高的產物產率和更少的副產物。類似地，圖7顯示了更多XylM樣酶的數據，即來自以下種類：海洋生絲單胞菌、鞘脂菌屬某種、昆明新鞘氨醇菌、假單胞菌TW3、食芳香性鹽嗜異生質菌、麥氏交替單胞菌和Tepidiphilus succinatimandens都顯示出與惡臭假單胞菌的XylM相
似的酶活性。由於胺基酸序列的同源性為至少為50%，這些結果表明這是保持酶活性並顯示出用上述突變的提高的產率的足夠的同源性。
這些結果證實了在野生型酶中存在甲硫胺酸或色胺酸的位置116或等效位置處胺基酸交換的重要性和影響。
序列表
SEQ ID NO 1：
SEQ ID NO 2：
SEQ ID NO 3：
SEQ ID NO 4：
SEQ ID NO 5：
SEQ ID NO 6：
Claims (16)
- 一種具有序列SEQ ID NO：1或在胺基酸水平上與該序列至少50%同源性的酶，該同源性確保該酶的酶促活性，該蛋白質在位置116或等效位置處具有突變，其中該突變是甲硫胺酸(M)或色胺酸(W)被不同的胺基酸取代。
- 如請求項1所述的酶，其中位置116或等效位置的M或W被選自G、N、R或K的胺基酸取代，較佳地被G取代。
- 如請求項1或2的酶，其具有進一步的突變和/或缺失。
- 如前述請求項中任一項所述的酶，其中該酶是：- 惡臭假單胞菌的XylMA酶，或- 以下中的XylMA樣酶˙麥氏交替單胞菌(Alteromonas macleodii)，或˙Tepidiphilus succinatimandens，或˙昆明新鞘氨醇菌(Novosphingobium kunmingense)，或˙海洋生絲單胞菌(Hyphomonas oceanitis)，或˙鞘氨醇菌屬(Sphingobium)sp.32-64-5或˙食芳香性鹽嗜異生質菌(Halioxenophilus aromaticivorans) 或- 在胺基酸水平上與SEQ ID NO：1具有超過50%序列同一性的XylMA樣酶。
- 一種核酸，其編碼如前述請求項中任一項所述的酶。
- 一種表現載體，包括根據前述請求項所述的核酸的。
- 一種宿主細胞，其具有表現根據前述請求項中任一項所述的酶的核酸和/或表現載體。
- 如前述請求項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是微生物細胞，較佳地是細菌細胞。
- 如前述請求項中所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)、谷胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)、普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)、貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)、嗜鹽單胞菌的細胞(Halomonas bluephagenesis)，最佳地是大腸桿菌細胞(E.coli cell)。
- 如前述請求項中任一項所述的酶、所述的核酸和/或所述的宿主細胞在將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的方法中的用途。
- 一種將2,6-二甲吡啶II轉化為2,6-二(羥甲基)吡啶I的方法，
其中該轉化在酶存在下進行，其特徵在於使用如前述請求項中任一項所述的酶或所述的宿主細胞。 - 如前述請求項所述的方法，其中調節反應介質中2,6-二甲吡啶II的進料速率使得反應介質中2,6-二甲吡啶II的濃度不超過1g/L，較佳地0.1g/L，更佳地0.02g/L的值，並且其中調節反應介質中2,6-二甲吡啶II的進料速率使得2,6-二甲吡啶II的濃度不低於10mg/L，較佳地0.1mg/L，更佳地0.01mg/L的值。
- 如請求項8-12所述的方法，其中使用脫氫酶，其中該脫氫酶較佳在該微生物宿主中共表現。
- 如請求項13所述的方法，其中該脫氫酶是NADH依賴性、NADP依賴性、NADPH依賴性或GDH依賴性的，其中該脫氫酶較佳地選自來自乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)的AKR、 來自貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)ADP1的XylB和來自馬裡斯假絲酵母(Candida maris)的AFPDH的列表。
- 如請求項13至14中任一項所述的方法，其中NADH再生系統、NADP再生系統、NADPH再生系統或GDH再生系統在該微生物宿主中共表現，其中該NADH再生系統較佳是基於甲酸鹽脫氫酶的系統，其中該NADH再生系統較佳地由對NAD+種類具有活性並且具有細菌或真菌來源的不依賴金屬的甲酸鹽脫氫酶組成。
- 如請求項12至15中任一項所述的方法，其中甲酸鹽的進料速率使得反應介質中甲酸鹽的濃度不超過150mM、較佳地100mM、更佳地50mM的值，並且其中在反應介質中甲酸鹽的進料速率使得甲酸鹽的濃度不低於50mM，較佳地25mM，更佳地5mM的值。
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