CN114174526A - 通过酶催化制备砜的选择性工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过酶催化由硫化物制备砜的选择性工艺，以及涉及包含如下的组合物：对称硫化物，催化所述对称硫化物至对称砜的氧化的氧化还原酶；任选地所述酶E的至少一种辅因子C；和氧化剂，其特别地允许实施所述工艺。

Description

通过酶催化制备砜的选择性工艺
本发明涉及通过酶催化由有机硫化物(硫醚，sulfide)制备有机砜的选择性工艺，并且还涉及特别地使得能够实施此工艺的组合物，及其用途。
工业上，硫醇具有很大意义，并且目前在化学工业中非常广泛的使用，尤其是作为更复杂的有机分子的合成中的起始材料。例如，甲硫醇(CH3SH)用作甲硫氨酸合成中的起始材料，甲硫氨酸是用于动物营养中的必需氨基酸。甲硫醇还用于二烷基二硫化物的合成中，更特别地用于二甲基二硫化物(DMDS)的合成中，二甲基二硫化物为用于石油分馏的加氢处理催化剂以及其他应用的硫化添加剂。
硫醇，并且更特别地甲硫醇，在工业上通常是通过如下的已知工艺合成的：其在存在催化剂的情况下，在升高温度下，从醇和硫化氢开始，根据以下方程式(1)：
R-OH+H2S→R-SH+H2O (1)
然而，此反应导致副产物的形成，例如根据以下方程式(2)的硫化物的形成：
R-OH+R-SH→R-S-R+H2O (2)
硫醇还可根据以下方程式(3)由卤化的衍生物和碱金属、碱土金属或铵硫氢化物合成(提供使用氯化的衍生物和硫氢化钠的实例)：
R-Cl+NaSH→R-SH+NaCl (3)
此第二合成途径还导致不期望的硫化物的存在。
最后，硫醇还可根据以下方程式(4)，根据目标是支化的还是非支化的硫醇，由烯烃和硫化氢通过酸催化作用或以光化学方式合成：
RARBC＝CRcRD+H2S→RARB-CH-C(SH)RcRo (4)
再一次地，此合成导致作为副产物的硫化物。
工业上，这些硫化物以高的量获得，并且主要送去销毁。这代表用于生产预期的硫醇的工艺中的效率损失和与销毁它们相关的增加的成本。以这种方式产生废物对于硫醇的生产者而言是真正的工业问题，因此生产者力求从这些副产物获得价值。有多种方法做到这一点。
首先，存在硫化物自身的市场：二甲基硫化物可用作食物香料，或用作石油原料的蒸汽裂化中的抗焦化剂。但是，这些市场中的需求远比所产生的硫化物的量低得多。还可通过硫氢解(sulfhydrolysis)反应将硫化物转化成对应的硫醇。然而，实施此反应所要求的条件相对苛刻，并且导致新的、寄生的反应。因此，此工业应用受限制。
最后，从产生的硫化物获得价值的另一种手段牵涉硫化物的氧化反应，以将硫化物转化为亚砜和/或转化为砜。这些种类的化学氧化反应是熟知的。它们在存在或不存在催化剂的情况下牵涉不同类型的氧化剂，诸如次氯酸钠、过氧化氢、氧、臭氧、或氮氧化物(诸如N2O4)。
但是，将硫化物氧化的化学方法的确存在真实的工业问题。最严重的问题之一是所述氧化反应的化学选择性低。目前，工业上不存在将氧化排他地朝着亚砜或砜引导的可用的手段：硫化物的氧化的结果总是获得亚砜和砜的混合物。这些化学方法的其它缺点为，例如，非常强的试剂的使用(其导致安全问题)，或者氮氧化物的不足的可得性(存在非常少的工业供应商)。此外，这些化学工艺的一些，诸如使用氮氧化物的工艺，导致污染物排放的问题。
除化学氧化之外，硫化物氧化还可如下催化：在生物工艺中，通过在溶液或在生物体(一般为微生物体)中的酶催化。然而，对于获得的产物来说，通过酶催化进行的这些氧化不再具有选择性；此时，同样，由对应的硫化物获得了亚砜和砜的混合物。
因而，硫化物至砜的氧化反应相对于至亚砜的低选择性导致工业前沿上的问题，无论所采用的氧化工艺如何——化学还是酶促。实际上，出于成本和品质的显然的原因，期望的是对于感兴趣的产物(或是亚砜或是砜)而言具有最大可能的选择性。
Bordewick等人的工作提出，使用耶氏酵母属(Yarrowia)单加氧酶A-H用于催化不对称芳族硫化物的磺化氧化反应(S.Bordewick,Enzyme Microb.Technol.,2018,109,31-42))。在该出版物中，使用用于获得起始酶的变体的基因突变技术将二甲基砜的产生降低了近95％。
使用这样的基因修饰技术是不确定的并且昂贵的。
这些方法还具有高失败率，这转变为整体并且更特别地在感兴趣的底物上的酶活性的降低或甚至失去(损失，loss)。因此，这样的修饰并非良好选择性的保证。
因此，存在对于如下工艺的需要：工业上和经济上切实可行的利用硫化物(尤其是来自硫醇合成的硫化物)的工艺。
更特别地，存在对于如下工艺的需要：工业上可应用的、更经济并且更环境友好的将硫化物氧化成砜的工艺。
存在对于如下工艺的需要：选择性的并且工业上操作起来简单并且经济的将硫化物氧化成砜的工艺。
本发明的一个目的是满足以上需要的全部或部分。
因此，本发明涉及用于制备砜的工艺、优选地选择性的工艺，其包含以下步骤：
a)制备组合物M，其包含：
-硫化物；
-酶E，其催化所述硫化物至砜的氧化；
-任选地所述酶E的至少一种辅因子C；以及
-氧化剂；
b)实施硫化物至砜的酶促氧化反应；
c)收取步骤b)中获得的砜；以及
d)步骤c)中收取的砜任选地分离和/或任选地纯化；
其中在实施酶促反应的步骤b)期间，所述硫化物被全部消耗。
预料不到的是，本发明人已经发现了用于通过酶催化制备砜的选择性工艺。通过所述工艺，可由对应的硫化物获得砜，更特别地在步骤b)结束时不获得亚砜(或以可忽略的量获得)的情况下。
原因是，通过酶催化进行的硫化物的氧化一般根据以下反应序列发生：
Figure BDA0003487610420000031
在以上方案中，在形成亚砜的第一步中和在形成砜的第二步中，所使用的酶、其任意辅因子、和氧化剂是相同的。因此在相同的反应混合物内可获得亚砜和砜两者，如上文所述这是不期望的。
本发明人已经发现了如下工艺：其通过减少或甚至抑制获得的副产物并且更特别地亚砜来允许选择性地获得砜。本发明人因而已经确定在步骤b)结束时不获得亚砜的情况下获得砜的手段。
预料不到的是，已经发现，相对于亚砜至砜的氧化，硫化物至亚砜的氧化是优先的(takes priority)并且排他地发生。因此，当反应混合物中(例如在如上文所定义的组合物M中)存在硫化物时，选择性地形成亚砜，而不形成砜。当反应混合物(例如如上文所定义的组合物M)不再含有任何硫化物而取而代之地仅含有亚砜时，亚砜被转化成砜。
由于本发明，从而可选择性地对亚砜或砜的生产施加容易的控制，并且可在不须要更改工艺的操作条件的情况下实现之。
定义
术语“(C1-C20)烷基”表示如下的饱和脂族烃：其可为线型或支化的，并且包含1至20个碳原子。优选地，所述烷基包含1至12个碳原子，或甚至1至4个碳原子。实例包括甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲丁基、和叔丁基。术语“支化(的)”理解为意指烷基基团是沿着主烷基链被取代的。
术语“(C2-C20)烯基”表示包含至少一个碳-碳双键的如上文所定义的烷基。
术语“(C2-C20)炔基”表示包含至少一个碳-碳三键的如上文所定义的烷基。
术语“(C6-C10)芳基”表示单环、双环、或三环芳族烃化合物，更特别地苯基和萘基。
术语“(C3-C10)环烷基”表示包含3至10个碳原子的单环或双环饱和脂族烃，诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基。
(C3-C10)杂环烷烃指如下的环烷烃：其包含3至10个碳原子，并且包含至少一个硫原子(优选地四氢噻吩)和任选地至少一个其他杂原子。
(C4-C10)杂环芳烃指如下的芳烃：其包含4和10之间的碳原子，并且包含至少一个硫原子(例如噻吩)和任选地至少一个其它杂原子。
杂原子特别地理解为选自O、N、S、Si、P和卤素的原子。
“催化剂”一般理解为如下物质：其加速反应，并且在此反应结束时不变。根据一种实施方式，所述酶E催化硫化物至亚砜的氧化反应。
“催化量”特别地指如下量：其足以催化反应，更特别地足以催化硫化物至砜的氧化。更特别地，以催化量使用的试剂是以较小量使用的，例如在约0.01重量％和20重量％之间，相对于以化学计量比例使用的试剂按重量计的量计。反应的选择性一般代表相对于遵循反应消耗的反应物的摩尔数(例如，消耗的硫化物的摩尔数)计的形成的产物的摩尔数(例如，形成的砜的摩尔数)。
常见的转化率、选择性和产率的定义如下：
转化率＝(初始态的反应物的摩尔数–反应之后剩余的反应物的摩尔数)/(初始态的反应物的摩尔数)
选择性＝转化为所需产物的反应物的摩尔数/(初始态的反应物的摩尔数–反应之后剩余的反应物的摩尔数)
产率＝转化率X选择性
因此，“用于制备砜的选择性工艺”尤其指如下工艺：其在工艺结束时不获得亚砜的情况下，优选地在步骤b)结束时不获得亚砜的情况下(或在形成可忽略量的亚砜的情况下)消耗硫化物并且产生砜。根据一种实施方式，硫化物至砜的氧化反应是化学选择性的。
例如，本发明的工艺(更特别地步骤b))提供对于砜而言在95％和100％之间、优选地在99％和100％之间的选择性。
工艺
本发明的工艺对于制备砜而言可为选择性的并且甚至化学选择性的工艺。优选地，所述工艺不导致获得对应的亚砜。
根据一种实施方式，步骤b)，并且更特别地在步骤b)中实施的硫化物至砜的酶促氧化反应是选择性的、优选地化学选择性的。
步骤b)(实施酶促反应的步骤)可特别地包含以下两个步骤：
b1)将硫化物完全氧化成亚砜；
b2)将亚砜氧化成砜。
“将硫化物完全氧化”意指在步骤b1)期间硫化物被全部消耗。
根据一种实施方式，在组合物M中硫化物是限制性反应物(limiting reactant)(即缺乏地(in defalt)存在的反应物)。
“全部消耗”特别地意指，步骤b)(实施酶促反应的步骤)之后剩余的硫化物的量可在0重量％和20重量％之间、优选地在0重量％和5重量％之间，例如在0重量％和1重量％之间，并且仍然更优选地在0重量％和0.01重量％之间，相对于起始硫化物(换言之来自步骤a)的硫化物)按重量计的量计。
更特别地，组合物M包含：
-化学计量量的硫化物；
-催化量的酶E；
-任选地催化量的至少一种辅因子C；和
-化学计量量的氧化剂。
硫化物：
硫化物特别为有机硫化物，其为包含至少一个-C-S-C-官能团的任意有机化合物。
根据一种实施方式，所述组合物M包含至少一种硫化物。其可例如包含一种、两种或多种不同的硫化物。所述硫化物可为对称的，意指硫原子代表相对于所述化合物而言的对称中心。根据一种实施方式，所述硫化物具有以下通式：
R1-S-R2 (I)
其中，
R1和R2可为相同的或不同的，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基、(C2-C20)烯基、(C2-C20)炔基、(C3-C10)环烷基和(C6-C10)芳基，或者
R1和R2与其所连接的硫原子形成环，优选地(C3-C10)杂环烷烃或(C4-C10)杂芳烃基团；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个取代基取代；
并且所述烷基、烯基、炔基、环烷基和芳基基团可包含一个或多个杂原子。
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被选自如下的一个或多个取代基取代：(C1-C20)烷基、(C3-C10)环烷基和(C6-C10)芳基；
并且可任选地被选自如下的一个或多个官能团官能化(非限制性并且以实例的方式)：醇、醛、酮、酸、酰胺、腈和酯官能团，或者带有硫、磷和硅的官能团。
根据一种实施方式，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被选自如下的一个或多个取代基取代：(C1-C20)烷基、(C3-C10)环烷基、(C6-C10)芳基、-OH、-C(O)OH、-C(O)H、-C(O)-NH2、-NH2、-NHR、-NRR'、-C(O)-、-C(O)-NHR'、-C(O)-NRR'、-COOR和-CN；其中R和R’彼此独立地代表(C1-C20)烷基基团。
根据一种优选实施方式，R1和R2可为相同的或不同的，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基、(C2-C20)烯基、(C2-C20)炔基和(C3-C10)环烷基或者
R1和R2与其所连接的硫原子一起形成(C3-C10)杂环烷烃基团。
优选地，R1和R2选自(C1-C20)烷基，或者R1和R2与带有着它们的硫原子一起形成(C3-C10)杂环烷烃。优选地，所述硫化物的基团R1和R2是相同的(即，如此而形成对称硫化物)。
更优选地，所述硫化物选自：二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、二-十二烷基硫化物和四氢噻吩。根据本发明，二甲基硫化物是特别优选的。根据一种实施方式，所述硫化物为对称的，并且如此而不是前手性的。根据一种实施方式，所述硫化物不是叔丁基甲基硫化物(CAS号6163-64-0)。
氧化剂：
氧化剂是能够将硫化物氧化成砜的任意化合物。
所述氧化剂可选自空气、氧贫化的空气、氧富集的空气、纯氧、和过氧化氢。根据一种特定实施方式，当酶E为单加氧酶或二加氧酶时所述氧化剂选自空气、氧贫化的空气、氧富集的空气和纯氧，并且当酶E为过氧化物酶时所述氧化剂为过氧化氢。当所述氧化剂呈气态形式时，其作为溶解的气体存在于组合物M中。富集的或贫化的空气中氧的百分数是以技术人员已知的方式根据反应速率和与酶促系统的相容性选择的。
在组合物M中，氧化剂可呈化学计量量或过量。因而，在步骤b)中实施的酶促反应中，存在的硫化物被氧化剂全部消耗。
当使用空气(可为氧贫化的或富集的空气)时，在步骤b)中实施的酶促反应期间，显而易见的是空气内的氧作为氧化剂被消耗。在所述反应结束时，当使用的酶E为单加氧酶时，氧一般被转化成水，或者当酶E为二加氧酶时，氧被全部消耗。在过氧化物酶的作用之后，过氧化氢继而被转化成水。因此，就排放和环境友好性而言，本发明的工艺是特别有利的。
酶E：
所述酶E可为氧化还原酶，优选地选自单加氧酶、二加氧酶和过氧化物酶，更优选地选自单加氧酶的氧化还原酶。
优选地，所述酶E为Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)。
仍然更优选地，并且在BVMO之中，所述酶E可为环己酮单加氧酶(CHMO)，并且更特别地环己酮1,2-单加氧酶或者环戊酮单加氧酶(CPMO)，并且更特别地环戊酮1,2-单加氧酶。
所述环己酮1,2-单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.22类(class)。根据一种特定实施方式，所述CHMO是来自不动杆菌属(Acinetobacter sp.)(例如NCIMB 9871株系(strain))的CHMO和/或被属于AB006902群(cluster)的基因chnB编码的CHMO。
所述环戊酮1,2-单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.16类。根据一种特定实施方式，所述CPMO是来自丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)(例如NCIMB9872株系)的CPMO和/或被基因cpnB编码的CHMO。
所述单加氧酶还可为羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO)并且更特别地4-羟基苯乙酮单加氧酶。
所述羟基苯乙酮单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.84类。根据一种特定实施方式，所述HAPMO是被基因hapE编码的来自荧光假单胞菌属(pseudomonas fluorescens)的HAPMO。
辅因子C：
“辅因子C”尤其指如下的辅因子：其为如上文所定义的酶E的催化活性所需要的，和/或允许酶E的催化活性被增强。
根据一种实施方式，组合物M中存在一种或两种辅因子C或者更多。例如，可使组合物M掺混有已经天然存在于酶E中的辅因子C以及另外的辅因子C。
当氧化还原酶为过氧化物酶时，可不向组合物M添加辅因子C。当酶E属于单加氧酶或二加氧酶类时，可使用烟碱和/或黄素辅因子。
所述至少一种辅因子C可选自烟碱辅因子和黄素辅因子。更特别地，所述至少一种辅因子C可选自：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、和/或其对应的还原形式(即，NADH,H+、NADPH,H+、FMNH2、FADH2)。
有利地，上文所列举的辅因子C以其还原形式(例如NADPH,H+)和/或其氧化形式(例如NADP+)使用，意指它们可以这些还原和/或氧化形式添加至组合物M。
优选地，使用的酶E为环己酮单加氧酶，例如来自不动杆菌属的环己酮单加氧酶，并且使用的辅因子C为NADP，任选地被FAD补充。
用于使辅因子C再生的系统：
如上文所定义的组合物M还可包含至少一种用于使辅因子C再生的系统。“用于使辅因子C再生的系统”意指如下的任意化学和/或酶促反应或一连串反应：其允许还原的辅因子C被重新转化为氧化的辅因子C，或反之。
再生系统可例如为已知的酶促氧化还原系统，其中使用牺牲底物。此类系统牵涉使用第二酶(被称为再循环酶)，其使得能够通过使用牺牲底物将经使用的辅因子C再循环。
再循环酶包括葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、亚磷酸酯(盐)脱氢酶(Vrtis,Angew.Chem.Int.Ed.,2002,41(17),3257-3259)、或者脱氢酶醇(Leuchs,Chem.Biochem.Eng.Q.,2011,25(2),267-281；Goldber,App.Microbiol.Biotechnol.,2007,76(2),237)。
在可在本发明的上下文内使用的牺牲底物之中，给氢化合物是最特别优选的，并且在这些之中，完全合适的化合物是带有羟基官能团的给氢有机还原化合物，诸如醇、多元醇、糖等等，诸如葡萄糖或甘油。
例如，在CHMO的情形中，在牺牲底物被氧化的情况下，再循环系统的酶将辅因子NADP+还原为NADPH,H+形式。
根据本发明的组合物M还可包含：
-任选地选自如下的一种或多种溶剂：水，缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液，Tris-HCl，Tris-碱，碳酸氢铵，乙酸铵，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)，或者盐，诸如氯化钠、氯化钾、或其混合物；
-任选地添加剂，诸如表面活性剂，特别地为了促进酶促反应的一种或多种反应物或底物的溶解性。
任选地，组合物M为含水溶液。例如，所述组合物M包含在50重量％和99重量％之间的水、优选地在80重量％和97重量％之间的水，相对于组合物M的总重量计。
根据一种实施方式，组合物M被视为包含反应混合物。在上文步骤a)中制备的组合物M的各种组分是商业上容易获得的，或是可通过技术人员熟知的技术制备的。这些不同要素可呈固体、液体或气态形式，并且可非常有利地制成溶液或者溶解在水或将用于本发明的工艺中的任意其它溶剂中。使用的酶还可被接枝在载体上(载体上酶的情形中)。
根据一种实施方式，所述酶E、任选地所述至少一种辅因子C、任选地所述至少一种再生系统如下存在：
-以经分离和/或经纯化的形式，例如在含水溶液中；
-在粗提取物中，即，在经碾磨的细胞的提取物中；或者
-在完整细胞中。
优选地使用完整细胞。比率[硫化物](以mmol/L为单位)/[细胞](以gcdw·L-1为单位)可为在0.01和10mmol/gcdw之间、优选地在0.01和3mmol/gcdw之间，优选地在步骤b)(实施酶促反应的步骤)期间。按干细胞的质量(以克为单位)(gCDW代表细胞干重量)计的浓度是通过常规技术确定的。
在所述细胞(下文将其称为宿主细胞)中，酶E可或可不被过表达。
所述宿主细胞可为对于通过对应的编码基因的表达产生酶E而言恰当的任意宿主。此基因然后将或位于宿主的基因组中，或被表达载体(诸如下文所定义的)携带。
出于本发明的目的，“宿主细胞”特别地理解为是原核或真核细胞。常用于重组和非重组蛋白质的表达的宿主细胞特别地包括：细菌(诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、或假单胞菌属(pseudomonas))的细胞，酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris))的细胞，真菌(诸如黑曲霉菌(Aspergillus niger)、索状青霉(Penicillium funiculosum)、或里氏木霉(Trichoderma reesei))的细胞，昆虫细胞，诸如Sf9细胞，或者哺乳动物(特别地人类)细胞，诸如HEK 293、PER-C6或CHO细胞系。
所述宿主细胞可在静止生长期中，例如已经从培养介质移除。
优选地，酶E及其至少一种辅因子C(当相关时)是在细菌大肠杆菌中表达的。优选地，CHMO是在大肠杆菌的株系(例如大肠杆菌BL21(DE3))内表达的。
优选地，HAPMO是在大肠杆菌的株系(例如大肠杆菌BL21(DE3))内表达的。
例如，在完整和/或经溶胞的(lyzed)细胞的情形中，使经使用的辅因子C再生的是细胞机器(细胞机制，cellular machinery)。例如在表达环己酮单加氧酶(CHMO)和/或环戊酮单加氧酶(CPMO)的大肠杆菌株系的情形中，所述辅因子C是NADP。
根据一种实施方式，当CHMO将硫化物转化为砜时，辅因子C1为NADP，任选地伴随辅因子C2 FAD。当CHMO将硫化物转化为砜时，辅因子NADPH,H+被氧化成NADP+，NADP+将通过细胞和/或通过安装的再生系统再生。
还原的辅因子的再生将通过天然存在于大肠杆菌中的酶，特别是酶甘油脱氢酶(例如若介质补充有甘油)来实现。在介质补充有葡萄糖的情形中，戊糖磷酸途径的酶，并且尤其是天然存在于大肠杆菌中的酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶，将参与还原的辅因子C1的再生中。
根据本发明，包含酶E、任选地至少一种辅因子C和任选地用于使辅因子C再生的系统的宿主细胞被称为“生物催化剂”。
如上文所定义的酶E和/或生物催化剂可通过技术人员已知的各种技术获得。
将包含酶E的编码序列的表达载体整合在细胞宿主中
当使用表达载体诸如质粒时，原核和真核细胞的转化是技术人员熟知的技术，例如通过脂质转染、电穿孔、热激，或者通过化学方法。表达载体和将所述表达载体引入宿主细胞内的方法是根据所选择的宿主细胞而选择的。此转化步骤得到经转化的细胞，其表达重组的酶E的基因编码。可将细胞在培养/培育步骤中培养，以产生酶E。
原核和真核细胞的培育/培养是技术人员熟知的技术，他们能够确定例如培养介质或者温度和时间条件。取决于使用的载体，可观察到诱导期间——其对应于增加的酶E的产生。可考虑使用弱(例如用于载体pBad的阿拉伯糖)或强(例如用于载体pET22b、pRSF等等的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG))诱导体。通过宿主细胞产生酶E可使用SDS-PAGE电泳或蛋白质印迹法(Western Blot)技术来验证。
“表达载体”是尺寸降低的DNA分子，可向其中插入感兴趣的核苷酸序列。可选自多种已知表达载体，诸如质粒、粘粒、噬菌体等等。
所述载体特别地根据所使用的细胞宿主而选择。
考虑的表达载体可为例如在文献WO 83/004261中描述的载体。
在不存在表达载体的情况下将酶E的编码序列整合在宿主细胞的基因组中
酶E的核苷酸序列编码可通过任意已知方法(例如，通过同源重组，或者通过系统CRISPR-Cas9等等)整合至宿主细胞的基因组中。通过宿主细胞产生酶可使用SDS-PAGE电泳或蛋白质印迹法技术的技术来验证。
酶E的分离和/或纯化用于以经分离和/或经纯化的形式使用
在转化和经转化的宿主细胞的培养/培育后，可实施酶E的分离和任选地纯化步骤。以此方式，本发明的工艺不是在存在宿主细胞的情况下而是通过溶解在组合物M中(优选地在含水溶液中)的酶E来实施的。
产生的所述酶E的分离和/或纯化可通过技术人员已知的任意手段来实施。这可例如牵涉选自如下的技术：电泳，分子筛分，超速离心，示差沉淀(例如使用硫酸铵)，超滤，膜或凝胶过滤，离子交换，经由疏水相互作用分离，或者亲和层析，例如IMAC。
宿主细胞的溶胞模式，经碾磨的细胞的粗提取物的制备
细胞溶胞产物可通过各种已知技术，诸如超声、压碎(弗氏压碎器)、经由化学试剂(例如Triton)的使用等等来获得。获得的溶胞产物对应于经碾磨的细胞的粗提取物。
在步骤a)中，可以任意所需的次序添加组合物M的各种组分。所述组合物M可通过简单地将各种组分混合来制备。
根据一种实施方式，本发明的工艺在步骤b)和步骤c)之间包含步骤b')，其中通过生物催化剂和/或酶E的失活来终止酶促反应。此步骤b')可通过诸如以下的已知手段来实施：热激(例如，使用约100℃的温度)或渗压震扰(osmotic shock)，施加高压，添加使得能够将细胞和/或酶E破坏和/或沉淀的溶剂，pH调节(或者约2的低pH，或者约10的高pH)。
在根据步骤b)的酶促反应中，可以低于反应速率的速率将硫化物引入至组合物M中。
根据一种实施方式，步骤b)(实施酶促反应的步骤)在如下的pH下实施：在4和10之间、优选地在6和8之间并且更优选地在7和8之间，例如7。
根据一种实施方式，步骤b)(实施酶促反应的步骤)在如下的温度下实施：在5℃和100℃之间、优选地在20℃和80℃之间并且更优选地在25℃和40℃之间。
用于所述酶促反应的压力可范围从与大气压相比降低的压力至数巴(数百kPa)，取决于使用的反应物和设备。
通过本发明的工艺取得许多优点。这些优点包括如下操作的可能性：在含水溶液中，在非常温和的温度和压力条件下，并且在近中性的pH条件下。所有这些条件是被称为“绿色(的)”或“可持续(的)”生物催化工艺的典型。
在步骤c)中，可以液体或固体形式收取砜。砜可如下收取：以含水溶液，或通过倾析以液体形式，或甚至通过沉淀以固体性质，这取决于亚砜的溶解性。
对于步骤d)，纯化的方法取决于所讨论的砜的特性。因此，在通过超滤或离心将细胞(其含有酶E)分离之后，蒸馏可使得能够将砜分离。
此蒸馏可如下发生：在大气压下，在降低的压力(真空)下，或者在更高压力下，若技术人员认为其拥有优点。
出于降低用于蒸馏的混合物的水含量或者加速结晶过程的目的，还可考虑膜分离。若砜是通过从含水反应混合物倾析收取的，则可考虑在分子筛上干燥(或任意其它干燥方法)。
所述工艺可间歇或连续地实施。
本发明的工艺可包含以下步骤：
a-1)制备包含如下的组合物：
-所述酶E；
-任选地所述至少一种辅因子C；
-所述氧化剂；
a-2)通过向步骤a-1)中获得的组合物添加所述硫化物(优选地通过注射)来制备如上文所定义的组合物M；
b)实施硫化物至砜的酶促氧化反应；
c)收取步骤b)中获得的砜；以及
d)将步骤c)中收取的砜任选地分离和/或任选地纯化。
根据另一种实施方式，所述工艺可含有以下步骤：
a-1)制备包含如下的组合物：
-所述硫化物；
-所述酶E；以及
-任选地所述至少一种辅因子C；
a-2)通过向步骤a-1)中获得的组合物添加所述氧化剂来制备如上文所定义的组合物M；
b)实施硫化物至砜的酶促氧化反应；
c)收取步骤b)中获得的砜；以及
d)将步骤c)中收取的砜任选地分离和/或任选地纯化。
组合物M
本发明还涉及如上文所定义的组合物M。
组合物M本身的各种要素及其用途是如对于上文工艺所定义的。
更特别地，本发明还涉及包含如下的组合物M：
-如上文所定义的对称硫化物；
-如上文所定义的氧化还原酶，优选地Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，更优选地环己酮单加氧酶(CHMO)，所述氧化还原酶催化所述对称硫化物至对称砜的氧化；
-任选地如上文所定义的所述酶E的至少一种辅因子C；以及
-任选地如上文所定义的氧化剂。
仍然更特别地，本发明涉及包含如下的组合物M：
-以下通式(I)的硫化物：R1-S-R2(I)
其中R1和R2是相同的并且是如上文所定义的；
-如上文所定义的氧化还原酶、优选地Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，更优选地环己酮单加氧酶(CHMO)，所述氧化还原酶催化所述硫化物(I)至以下通式(II)的砜的氧化：R1-S(O)2-R2(II)，
其中R1和R2是相同的并且是如上文所定义的；
-任选地如上文所定义的所述酶E的至少一种辅因子C；以及
-任选地如上文所定义的氧化剂。
所述硫化物优选地选自：二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、二-十二烷基硫化物和四氢噻吩。二甲基硫化物是特别优选的硫化物。
根据一种实施方式，所述组合物对应于如上文所定义的组合物M，用于实施如上文所定义的工艺。
用途
本发明还涉及如上文所定义的氧化还原酶、优选地Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、更优选地环己酮单加氧酶(CHMO)用于将对称硫化物氧化成对应的对称砜的用途。特别地，在本发明的意义中，所述酶促氧化反应是选择性的。根据一种实施方式，所述硫化物具有通式R1-S-R2(I)并且被转化为通式R1-S(O)2-R2(II)的砜，其中R1和R2是相同的并且是如上文所定义的。
附图说明
图1：
图1代表当反应通过酶CHMO催化时，作为时间(以小时为单位)的函数的存在于反应混合物中的二乙基硫化物(DES)、二乙基亚砜(DESO)和二乙基砜(DESO2)的浓度(以mM为单位)。
表述“在X和X之间”包括所声明的端点。以下实施例是出于说明性目的提供的，并且不限制本发明。
实施例
实施例1：根据本发明从二乙基硫化物选择性合成二乙基亚砜
I.制备生物催化剂：
构建如下的大肠杆菌BL21(DE3)(由Merck Millipore出售)的株系：其表达chnB基因，该基因被插入到质粒pET22b(由Promega,Qiagen出售)中。其使得能够异源表达来自不动杆菌属的环己酮单加氧酶(CHMO)。
将理解，所述株系包含CHMO、CHMO的辅因子(即NADP和FAD)、及其再生系统。
此株系是通过技术人员已知的技术预先培养和培养的。
在通过以0.85mmol/L的最终浓度添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来触发的诱导期之后，将一定体积的培养物离心(10min,5000g,4℃)以提供所需量的细胞。在此实施例中，随后将300ODU的新鲜细胞的团(pellet)再悬浮于补充有5g/L的甘油的在pH 7下的32mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。随后获得的细胞浓度为9.4ODU/mL，或者3gCDW/L(其中CDW代表细胞干重量)。
II.生物转化：
在含有32mL的上文所描述的混合物的250mL烧瓶中，二乙基硫化物(DES)的初始浓度在t＝0时测量在4.5mmol/L。
以有规律的间隔，将50μL的反应混合物取出并且稀释在含有25mg/L的十一烷(内标)的1450μL的乙腈溶液中。在离心(5min,12500g)之后，将上清液注射在GC(气相色谱)中，用于对在反应期间形成的二乙基亚砜(DESO)和二乙基砜(DESO2)进行定量测量。在进行的分析的条件下，最小可测量浓度为30μM。
分析显示在反应2.5h时的化学选择性的改变。在此点之前，测到DESO的量的线性增加，而未检测到砜。在此部分期间硫化物的氧化速率则为每小时每升混合物4mmol的DES被氧化。
在3h之后，在DESO的消耗同时观察到DESO2量的线性增加，其中DESO2以2.8mmol/L/h的速率形成。在反应6h时，仅DESO2存在。
因此，当混合物中不再检测到DES时，形成DESO2。
此实施例显示，当硫化物存在于反应混合物中时，硫化物至亚砜的氧化反应是化学选择性的(参见图1)。
获得的选择性为约100％。
首先，当DES仍然存在于反应混合物中时，通过使用的分析工具未检测到砜。
其次，当反应混合物中不再检测到DES时，DESO的氧化是完全的。在反应结束时(t＝5h)，获得约100％的DESO2，通过使用的分析工具未监测到DESO。
通过外推，计算出比率[硫化物](以mmol/L为单位)/[细胞](以gCDW·L-1为单位)为在t＝2.5时0.06mmol/gCDW。
实施例2：
I.制备生物催化剂：
在此实施例中，使用与实施例1中描述的株系相同的株系。
此次使用更大量的细胞。
在诱导步骤结束时，测量OD600在8.4ODU/mL，并且取出102mL的体积以在离心(10min,5000g,4℃)之后提供含有860ODU的新鲜细胞的团。随后将此团再悬浮于补充有0.5g/L的甘油的在pH 7下的32mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。则获得的细胞浓度为27ODU/mL(或者约9gCDW/L)。
II.生物转化：
在含有32mL的上文所描述的混合物的250mL烧瓶中，在反应混合物中测量的二乙基亚砜(DESO)的浓度为11.3mmol/L。在t＝2h时，添加在乙醇溶液中的DES：随后测量了10.4mmol/L的DES浓度。
通过进行在实施例1中描述的两种取样操作来监测反应。分析显示，在反应0和2h之间，由最初添加的DESO(随后获得7.7mmol/L的浓度)仅产生DESO2。在t＝2h时添加DES之后，直至至少4.5h DESO2的浓度不再变化，而与此同时产生DESO(产生10.4mmol/L)。在反应16.5h时，仅DESO2存在(DESO已经完全被氧化)。
因此，添加DES中断了砜(在此情形中DESO2)的形成。
此实施例显示，相对于亚砜至砜的氧化反应而言，硫化物至亚砜的氧化不仅是优先反应，而且也是排他的。
实施例3：二甲基硫化物(DMS)的酶促氧化
I.制备生物催化剂：
生物催化剂(CHMO)与实施例1中的相同，并且是在所述实施例1中描述的条件下产生的。
II.生物转化：
除了所使用的硫化物以外，实施例1中呈现的生物转化条件与用于此实施例的生物转化条件相同。在此实施例中，使用DMS的乙醇溶液以获得4.5mM的最初硫化物浓度。
反应是通过实施例1中呈现的方法来监测的。
预料不到的是，使用的生物催化剂导致相同的氧化特性。具体地，当DMS存在于混合物中时，DMS被化学选择性地氧化(未检测到二甲基砜)，并且随后从混合物中不再检测到DMS的时刻起亚砜被氧化。
除了此化学选择性之外，在反应的早期阶段获得了(相对于DES而言)相同数量级的硫化物氧化速率：每小时每升混合物3.9mmol的DMS被氧化。此外，砜的形成速率为1mmol/L/h。
实施例4：甲基乙基硫化物(MES)的酶促氧化
I.制备生物催化剂
生物催化剂(CHMO)与实施例1中的相同，并且是在所述实施例1中描述的条件下产生的。
II.生物转化：
除了所使用的硫化物以外，实施例1中呈现的生物转化条件与用于此实施例的生物转化条件相同。在此实施例中，使用MES的乙醇溶液以获得4.5mM的最初硫化物浓度。
反应是通过实施例1中呈现的方法来监测的。
预料不到的是，使用的生物催化剂导致相同的氧化特性。具体地，当MES存在于混合物中时，MES被化学选择性地氧化(未检测到甲基乙基砜)，并且随后从混合物中不再检测到MES的时刻起甲基乙基亚砜被氧化。
除了此化学选择性之外，在反应的早期阶段获得了(相对于其它硫化物而言)相同数量级的氧化速率：每小时每升混合物3.6mmol的MES被氧化。此外，砜的产生速率为3.5mmol/L/h。
实施例5：四氢噻吩(THT)的酶促氧化
I.制备生物催化剂：
生物催化剂(CHMO)与实施例1中的相同，并且是在所述实施例1中描述的条件下产生的。
II.生物转化
除了所使用的硫化物以外，实施例1中呈现的生物转化条件与用于此实施例的生物转化条件相同。在此实施例中，使用THT的乙醇溶液以获得4.5mM的最初硫化物浓度。
反应是通过实施例1中呈现的方法来监测的。
预料不到的是，使用的生物催化剂导致相同的氧化特性。具体地，当THT存在于混合物中时，THT被化学选择性地氧化(未检测到作为对应的砜的环丁砜)，并且随后从混合物中不再检测到THT的时刻起四氢噻吩1-氧化物被氧化。
除了此化学选择性之外，在反应的早期阶段获得了(相对于其它硫化物而言)相同数量级的氧化速率：每小时每升混合物3.4mmol的THT被氧化。此外，砜的产生速率为1.5mmol/L/h。
实施例6：根据本发明的硫化物的混合物的酶促氧化
I.制备生物催化剂：
在此实施例中，使用与实施例1中描述的株系相同的株系。
在诱导步骤结束时，测量OD600在8.4ODU/mL，并且取出31mL的体积以在离心(10min,5000g,4℃)之后提供含有300ODU的新鲜细胞的团。随后将此团再悬浮于补充有0.5g/L的甘油的在pH 7下的32mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。则获得的细胞浓度为9.4ODU/mL(或者约3gCDW/L)。
II.生物转化：
在含有32mL的以上所描述的混合物的250mL烧瓶中，同时引入各自在3.64M的二乙基硫化物(DES)、二甲基硫化物(DMS)和四氢噻吩(THT)的75μL的乙醇溶液：此为反应的开始。
通过进行与实施例1中描述的相同的取样操作来监测反应。
分析显示在第一阶段期间，混合物中的硫化物被氧化成亚砜，而未检测到砜。预料不到的是，DES的氧化速率比存在的其他两种硫化物(DMS和THT)的氧化速率更高，DMS和THT两者具有相同的氧化速率(参见以下表1)。
[表1]
底物 DMS DES THT
亚砜形成速率(mmol/L/h) 0.5 2.5 0.55
砜形成速率(mmol/L/h) - 1.5 0.6
只有在第二阶段中，当在反应混合物中不再检测到硫化物时，获得了对应的砜，其中例外是DMSO2，在混合不同的硫化物的情况下在这些条件下未检测到DMSO2。

Claims (13)

1.砜的制备工艺，其包含以下步骤：
a)制备组合物M，其包含：
-硫化物；
-酶E，其催化所述硫化物至砜的氧化；
-任选地所述酶E的至少一种辅因子C；以及
-氧化剂；
b)实施硫化物至砜的酶促氧化反应；
c)收取步骤b)中获得的砜；以及
d)将步骤c)中收取的砜任选地分离和/或任选地纯化；
其中，在实施酶促反应的步骤b)期间，所述硫化物被全部消耗。
2.如权利要求1中所述的制备工艺，其中所述酶E为氧化还原酶，优选地选自单加氧酶、二单加酶和过氧化物酶，更优选地选自单加氧酶的氧化还原酶。
3.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述酶E为Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，优选地环己酮单加氧酶(CHMO)。
4.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述硫化物具有以下通式：
R1-S-R2(I)
其中，
R1和R2可为相同的或不同的，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基、(C2-C20)烯基、(C2-C20)炔基、(C3-C10)环烷基和(C6-C10)芳基
或者
R1和R2与其所连接的硫原子一起形成杂环烷烃或杂芳烃；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个取代基取代；
并且所述烷基、烯基、炔基、环烷基和芳基基团可包含一个或多个杂原子。
5.如权利要求4中所述的制备工艺，其中所述硫化物的基团R1和R2是相同的。
6.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述硫化物选自：二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、二-十二烷基硫化物和四氢噻吩，优选地二甲基硫化物。
7.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中比率[硫化物](以mmol/L为单位)/[细胞](以gcdw·L-1为单位)在0.01和10mmol/gcdw之间，优选地在0.01和3mmol/gcdw之间。
8.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述氧化剂选自空气、氧贫化的空气、氧富集的空气、纯氧和过氧化氢。
9.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述辅因子C选自烟碱辅因子和黄素辅因子。
10.如前述权利要求任一项中所述的制备工艺，其中所述酶E是环己酮单加氧酶，并且辅因子C是NADP和任选地FAD。
11.组合物，其包含：
-对称硫化物；
-氧化还原酶，优选地Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，更优选地环己酮单加氧酶(CHMO)，所述氧化还原酶催化所述对称硫化物至对称砜的氧化；
-任选地所述酶E的至少一种辅因子C；
-任选地氧化剂。
12.如权利要求11中所述的组合物，其中所述硫化物(I)选自：二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、二-十二烷基硫化物和四氢噻吩，优选地二甲基硫化物。
13.氧化还原酶、优选地Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)、更优选地环己酮单加氧酶(CHMO)用于将对称硫化物氧化成对称砜的用途。
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