WO2020254745A1 - Procédé sélectif de préparation de sulfones par catalyse enzymatique - Google Patents

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WO2020254745A1
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enzyme
sulfide
sulfone
oxidation
process according
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PCT/FR2020/051014
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Inventor
Georges Fremy
Hugo BRASSELET
Véronique ALPHAND
Katia DUQUESNE
Original Assignee
Arkema France
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite D'aix-Marseille
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13022—Cyclohexanone monooxygenase (1.14.13.22)

Definitions

  • the present invention relates to a selective process for the preparation of organic sulfones from organic sulfides by enzymatic catalysis, as well as a composition allowing in particular the implementation of this process, and its uses.
  • Mercaptans are of great industrial interest and are now widely used by the chemical industries, in particular as raw materials for the synthesis of more complex organic molecules.
  • methylmercaptan (CH 3 SH) is used as a raw material in the synthesis of methionine, an essential amino acid used in animal feed.
  • Methylmercaptan is also used in the synthesis of dialkyl disulphides, in particular in the synthesis of dimethyl disulphide (DMDS), a sulphurization additive for hydrotreatment catalysts of petroleum fractions, among other applications.
  • DMDS dimethyl disulphide
  • mercaptans can also be done from halogenated derivatives and alkali, alkaline earth or ammonium hydrosulphides according to equation (3) (example given with a chlorinated derivative and a sodium hydrosulphide):
  • dimethyl sulfide can be used as a food flavoring or as an anti-coking agent in the steam cracking of petroleum feedstocks.
  • dimethyl sulfide can be used as a food flavoring or as an anti-coking agent in the steam cracking of petroleum feedstocks.
  • the demand in these markets is much lower than the produced quantities of sulphides.
  • Sulfides can also be converted to the corresponding mercaptans by the sulfhydrolysis reaction. Nevertheless, the conditions required to carry out this reaction are relatively severe and generate new side reactions. This industrial application is therefore limited.
  • Another means of upgrading the sulphides produced relates to the oxidation reactions of sulphides in order to transform them into sulphoxides and / or sulphones.
  • Such chemical oxidation reactions are well known. They involve different types of oxidants such as bleach (sodium hypochlorite), hydrogen peroxide, oxygen, ozone or nitrogen oxides such as N 2 O 4 in the presence of catalysts or no.
  • sulfide oxidations can be catalyzed during so-called biological processes, by enzymatic catalysis in solution or in organisms, generally microorganisms.
  • these oxidations carried out by enzymatic catalysis are not selective as to the products obtained either; here too a mixture of sulfoxides and sulfones is obtained from the corresponding sulfides.
  • Bordewick et al. propose the use of Yarrowia monooxygenases A-H to catalyze sulfoxidation reactions of aromatic and asymmetric sulfides (S. Bordewick, Enzyme Microb. TechnoL, 2018, 109, 31-42.).
  • S. Bordewick, Enzyme Microb. TechnoL, 2018, 109, 31-42. the use of genetic mutation techniques to obtain variants of the starting enzyme reduces the production of dimethyl sulfone by almost 95%.
  • the present invention aims to meet all or part of the above needs.
  • the present invention relates to a process, preferably selective, for preparing a sulfone comprising the following steps:
  • composition M comprising:
  • step d) optional separation and / or optional purification of the sulfone recovered in step c); wherein said sulfide is completely consumed during step b) of conducting the enzymatic reaction.
  • the present inventors have discovered a selective process for the preparation of sulfones by enzymatic catalysis. Said process makes it possible to obtain sulfones from the corresponding sulfides, in particular without obtaining sulfoxides at the end of step b) (or in negligible quantity).
  • the oxidation of sulphides by enzymatic catalysis normally takes place according to the following reaction sequence:
  • the enzyme, possibly its cofactor (s), and the oxidant used are the same during the first step of forming the sulfoxide and during the second step of forming the sulfone.
  • the enzyme, possibly its cofactor (s) and the oxidant used are the same during the first step of forming the sulfoxide and during the second step of forming the sulfone.
  • the oxidant used are the same during the first step of forming the sulfoxide and during the second step of forming the sulfone.
  • it is therefore possible to obtain both sulfoxides and sulfones which is not desirable as indicated above.
  • the present inventors have discovered a process which makes it possible to selectively obtain sulfones, by reducing or even eliminating the by-products obtained and in particular the sulfoxides.
  • the inventors have thus determined the means of obtaining sulfones without obtaining sulfoxides at the end of step b).
  • the oxidation of sulfides to sulfoxides is prioritized and exclusive over the oxidation of sulfoxides to sulfones.
  • the reaction medium ie, for example in composition M as defined above
  • the sulfoxides are formed selectively, without formation of sulfones.
  • the sulfoxides are converted into sulfones when the reaction medium (ie for example composition M as defined above) no longer contains sulfides but only sulfoxides.
  • (C1-C20) alkyl denotes saturated aliphatic hydrocarbons, which may be linear or branched and comprise from 1 to 20 carbon atoms. Preferably, the alkyls comprise from 1 to 12 carbon atoms, or even from 1 to 4 carbon atoms. Mention may be made, for example, of methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl or tert-butyl.
  • branched is meant that an alkyl group is substituted on the main alkyl chain.
  • (C2-C2o) alkenyl denotes an alkyl as defined above, comprising at least one carbon-carbon double bond.
  • (C2-C20) alkynyl denotes an alkyl as defined above, comprising at least one carbon-carbon triple bond.
  • (C 6 -Cio) aryl denotes monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic hydrocarbon compounds, in particular phenyl and naphthyl.
  • (C3-Cio) cycloalkyl denotes saturated aliphatic hydrocarbons comprising from 3 to 10 carbon atoms, monocyclic or bicyclic, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • (C3-Cio) heterocycloalkane is meant a cycloalkane comprising from 3 to 10 carbon atoms and comprising at least one sulfur atom, preferably tetrahydrothiophene, and optionally at least one other heteroatom.
  • (C4-C-io) heteroarene is meant an arene comprising between 4 and 10 carbon atoms and comprising at least one sulfur atom, for example thiophene, and optionally at least one other heteroatom.
  • heteroatom is understood to mean in particular an atom chosen from O, N, S, Si, P and halogens.
  • catalyst is generally understood to mean a substance which accelerates a reaction and which is found unchanged at the end of this reaction.
  • said enzyme E catalyzes the oxidation reaction of sulfides to sulfones.
  • catalytic amount is meant in particular an amount sufficient to catalyze a reaction, in particular to catalyze the oxidation of sulfides to sulfones. More particularly, a reagent used in a catalytic amount is used in a smaller amount, for example between about 0.01% and 20% by weight, relative to the amount by weight of a reagent used in a stoichiometric proportion.
  • the selectivity of a reaction generally represents the number of moles of product formed, for example the number of moles of sulfone formed, relative to the number of moles of reagent consumed following the reaction, for example the number of moles of sulfide consumed.
  • the term “selective process for preparing sulfones” is understood to mean in particular a process consuming sulfides and producing sulfones, without obtaining sulfoxides at the end of the process, preferably without obtaining sulfoxides at the end of step. b) (or with formation of a negligible amount of sulfoxides).
  • the oxidation reaction of sulfides to sulfones is chemoselective.
  • the process according to the invention, in particular step b) makes it possible to obtain a selectivity of between 95% and 100%, preferably between 99% and 100% for the sulfones.
  • the process according to the invention can be a selective, or even chemoselective, process for preparing sulfones. Preferably, said process does not lead to the production of the corresponding sulfoxides.
  • step b) and more particularly the enzymatic reaction for the oxidation of sulfides to sulfones carried out in step b) which is selective, preferably chemoselective.
  • Step b) of carrying out the enzymatic reaction can in particular comprise the following two steps:
  • total oxidation of the sulphide is understood to mean the fact that the sulphide is completely consumed during step b1).
  • the sulfide is the limiting reagent (i.e. present in default) in composition M.
  • the amount of sulfide remaining after step b) of carrying out the enzymatic reaction may be between 0% and 20% by weight, preferably between 0% and 5% by weight, for example between 0% and 1% by weight, and even more preferably between 0% and 0.01% by weight relative to the amount of starting sulphide by weight, that is to say from step a) .
  • composition M comprises:
  • sulphide is understood in particular to mean an organic sulphide, ie any organic compound comprising at least one function of -C-S-C- type.
  • composition M comprises at least one sulphide. It can for example comprise one, two or more different sulphides. Said sulphide may be symmetrical, that is, the sulfur atom represents a center of symmetry with respect to the compound.
  • said sulphide is of the following general formula: R1-S-R2 (I)
  • Ri and R 2 may be the same or different and are chosen independently of one another from the group consisting of:
  • R 1 and R 2 form a ring with the sulfur atom to which they are attached, preferably a (C 3 -Cio) heterocycloalkane or (C 4 -Cio) heteroarene group;
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups possibly being optionally substituted by one or more substituent (s); and said alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl and aryl groups possibly comprising one or more heteroatom (s).
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups may optionally be substituted by one or more substituent (s) chosen from the group consisting of:
  • function (s) chosen, in a nonlimiting manner and by way of examples, from alcohol, aldehyde, ketone, acid, amide, nitrile, ester functions or else carrier functions of sulfur, phosphorus and silicon.
  • said alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups may optionally be substituted with one or more substituent (s) chosen from the group consisting of: (Ci-C 2 o) alkyl, (C 3 - Cio) cycloalkyl, (C 6 -Cio) aryl, -OH, -C (0) 0H, -C (0) H, -C (0) -NH 2 , -NH 2 , -NHR, -NRR ', -C (O) -, -C (0) -NHR', -C (0) -NRR ', -COOR and -CN;
  • substituent chosen from the group consisting of: (Ci-C 2 o) alkyl, (C 3 - Cio) cycloalkyl, (C 6 -Cio) aryl, -OH, -C
  • R and R ' represent, independently of one another, a (C 1 - C 2 o) alkyl group.
  • R 1 and R 2 can be identical or different and are chosen independently of one another from the group consisting of:
  • R 1 and R 2 are chosen from (C 1 -C 2 o) alkyls or R 1 and R 2 together with the sulfur atom which carries them form a (C 3 -Cio) heterocycloalkane.
  • the radicals R 1 and R 2 of said sulphide are preferably identical (ie thus forming a symmetrical sulphide).
  • the sulfide is chosen from dimethylsulfide, diethylsulfide, dipropylsulfide, dibutylsulfide, dioctylsulfide, didodecylsulfide, and tetrahydrothiophene.
  • Dimethylsulfide is particularly preferred according to the invention.
  • the sulfide is symmetrical and is therefore not prochiral.
  • the sulfide is not tert-butyl methyl sulfide (CAS Number 6163-64-0).
  • oxidant any compound capable of oxidizing a sulfide to a sulfone.
  • the oxidant can be selected from the group consisting of air, oxygen-depleted air, oxygen-enriched air, pure oxygen, and hydrogen peroxide.
  • the oxidant is chosen from the group consisting of air, air depleted in oxygen, air enriched in oxygen and pure oxygen when the enzyme E is a mono - or a dioxygenase and hydrogen peroxide when the enzyme E is a peroxidase.
  • the oxidant is in gaseous form, it is present in composition M as a dissolved gas.
  • the percentage of oxygen in the enriched or depleted air is chosen according to the reaction rate and the compatibility with the enzyme system in a manner known to those skilled in the art.
  • the oxidant may be in a stoichiometric amount or in excess in composition M.
  • the sulphide present is completely consumed with the oxidant during the enzymatic reaction carried out in step b).
  • the oxygen is generally transformed into water when the enzyme E used is a mono-oxygenase or completely consumed when the enzyme E is a dioxygenase.
  • Hydrogen peroxide is transformed into water by the action of peroxidase.
  • Said enzyme E can be an oxidoreductase, preferably an oxidoreductase chosen from the group consisting of monooxygenases, dioxygenases and peroxidases, even more preferably from monooxygenases.
  • said enzyme E is a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO).
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • the enzyme E can be a Cyclohexanone Monooxygenase (CHMO), and more particularly a Cyclohexanone-1, 2-MonoOxygenase or a Cyclopentanone Monooxygenase (CPMO), and more particularly a cyclopentanone 1, 2-monooxygenase .
  • CHMO Cyclohexanone Monooxygenase
  • CPMO Cyclopentanone Monooxygenase
  • cyclopentanone 1 2-monooxygenase
  • Cyclohexanone-1, 2-Monooxygenases are in particular of class EC 1.14.13.22.
  • the CHMO is a CHMO of Acinetobacter sp. (for example of strain NCIMB 9871) and / or a CHMO encoded by the chnB gene belonging to the cluster AB006902.
  • Cyclopentanone 1, 2-Monooxygenase are in particular of class EC 1.14.13.16.
  • the CPMO is a CPMO of Comamonas sp. (for example the strain NCIMB 9872) and / or a CHMO encoded by the cpnB gene.
  • the monooxygenase can also be a hydroxyacetophenone monooxygenase (HAPMO) and more particularly a 4-hydroxyacetophenone monooxygenase.
  • HAPMO hydroxyacetophenone monooxygenase
  • I ⁇ ARMO is a HAPMO of Pseudomonas fluorescens. encoded by the hapE gene.
  • oxidoreductase is a peroxidase
  • Said at least one cofactor C can be chosen from nicotinic cofactors and flavinic cofactors.
  • said at least one cofactor C can be chosen from the group consisting of: nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD) and / or their corresponding reduced form (namely NADH, H + NADPH, H +,
  • the cofactors C listed above are advantageously used in their reduced forms (for example NADPH, H +) and / or their oxidized forms (for example NADP +), that is to say that they can be added in these reduced forms. and / or oxidized in the composition M.
  • the enzyme E used is Cyclohexanone Monooxygenase, for example Cyclohexanone Monooxygenase from Acinetobacter sp.
  • the cofactor C used is NADP, optionally supplemented with FAD.
  • Composition M as defined above can also comprise at least one system for regenerating the cofactor (s) C.
  • system for regenerating the co- C factor (s) means any reaction or sequence of chemical and / or enzymatic reaction (s) allowing the reduced C cofactor (s) to be transformed back into oxidized C cofactor (s) ( s) or vice versa.
  • the regeneration systems can be known enzymatic redox systems with the use of a sacrificial substrate.
  • Such systems involve the use of a second enzyme (called a recycling enzyme) which allows the used C cofactor (s) to be recycled using a sacrificial substrate.
  • a recycling enzyme a second enzyme which allows the used C cofactor (s) to be recycled using a sacrificial substrate.
  • the hydrogen donor compounds are very particularly preferred, and among these, the most suitable compounds are the reducing organic hydrogen donor compounds carrying hydrogen.
  • hydroxyl function such as alcohols, polyols, sugars and others such as glucose or glycerol.
  • the recycling system enzyme reduces the NADP + cofactor in the form of NADPH, H + by oxidizing the sacrificial substrate.
  • Composition M according to the invention can also comprise:
  • solvents chosen from water, buffers such as phosphate buffers, Tris-HCl, Tris-base, ammonium bicarbonate, ammonium acetate, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 acid -piperazine ethane sulfonic), CHES (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), or salts such as sodium chloride, potassium chloride, or mixtures thereof;
  • buffers such as phosphate buffers, Tris-HCl, Tris-base, ammonium bicarbonate, ammonium acetate, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 acid -piperazine ethane sulfonic), CHES (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), or salts such as sodium chloride, potassium chloride, or mixtures thereof;
  • additives such as surfactants, in particular in order to promote the solubility of one or more reagent (s) or substrate (s) of the enzymatic reaction.
  • composition M is an aqueous solution.
  • said composition M comprises between 50% and 99% by weight of water, preferably between 80% and 97% by weight of water relative to the total weight of composition M.
  • composition M is considered to be the reaction mixture.
  • the various components of composition M prepared in step a) above are easily accessible commercially or can be prepared according to techniques well known to those skilled in the art. These various elements can be in solid, liquid or gaseous form and can very advantageously be put into solution or dissolved in water or any other solvent in order to be used in the process of the invention.
  • the enzymes used can also be grafted onto a support (case of supported enzymes).
  • the enzyme E, optionally said at least one cofactor C, optionally said at least one regeneration system are:
  • the ratio [sulphide] (in mmol / L) / [cells] (in g Cps .L 1 ) can be between 0.01 and 10, preferably between 0.01 and 3 mmol / g cs , preferably during l step b) of carrying out the enzymatic reaction.
  • the determination of the mass concentration in grams of dry cells is carried out according to conventional techniques.
  • Enzyme E may or may not be overexpressed in said cells, hereinafter referred to as host cells.
  • the host cell can be any suitable host for the production of an E enzyme from the expression of the corresponding encoding gene. This gene can then be found either in the genome of the host or carried by an expression vector such as those defined below.
  • the term “host cell” is understood in particular to mean a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • Host cells commonly used for the expression of proteins, whether recombinant or not include in particular cells of bacteria such as Escherichia coli or Bacillus sp., Or Pseudomonas, yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris, cells of fungi such as Aspergillus niger, Penicillium funiculosum or Trichoderma reesei, insect cells such as Sf9 cells, or even mammalian cells (in particular human) such as the HEK 293, PER-C6 or CHO cell lines.
  • Said host cells may be in the stationary or growth phase, for example removed from the culture medium.
  • the enzyme E and its optional at least one cofactor C are expressed in the bacterium Escherichia coli.
  • the CHMO is expressed inside a strain of Escherichia coli such as, for example, Escherichia coli BL21 (DE3).
  • I ⁇ ARMO is expressed inside a strain of Escherichia coli such as, for example, Escherichia coli BL21 (DE3).
  • the cellular machinery which regenerates the cofactor (s) C used (s).
  • the cofactor C is NADP.
  • the cofactor C1 is NADP, optionally with the cofactor C2 FAD.
  • the NADPH, H + cofactor is oxidized to NADP + , which will be regenerated by the cell and / or the regeneration system put in place.
  • the medium is supplemented with glycerol
  • enzymes naturally present in E. coli in particular the enzyme glycerol dehydrogenase
  • the enzymes of the pentose phosphate pathway in particular the enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase and / or acid-6-phosphogluconic dehydrogenase, naturally present in E. coli, will participate in the regeneration of the reduced cofactor C1.
  • biocatalyst is used to refer to the host cell comprising the enzyme E, optionally at least one cofactor C and optionally a system for regenerating the cofactor (s) C.
  • the enzyme E and / or the biocatalyst as defined above can be obtained according to various techniques known to those skilled in the art.
  • the transformation of prokaryotic and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art, for example by lipofection, electroporation, heat shock, or by chemical methods.
  • the expression vector and the method of introducing the expression vector into the host cell are selected depending on the host cell chosen.
  • a transformed cell expressing a gene encoding a recombinant enzyme E is obtained. It can be cultivated, in a culture / incubation step, to produce the enzyme E.
  • the incubation / culture of prokaryotic and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art who can determine, for example, the culture medium or also the time and temperature conditions.
  • an induction period - corresponding to an increased production of the enzyme E - can be observed.
  • the use of a weak inducer such as for example arabinose for the vector pBad
  • strong such as for example isopropyl bDl -thiogalactoside (IPTG) for the vectors pET22b, pRSF, etc.
  • IPTG isopropyl bDl -thiogalactoside
  • the SDS-PAGE electrophoresis technique or the Western blot technique can be used.
  • expression vector is understood to mean a DNA molecule of reduced size into which it is possible to insert a nucleotide sequence of interest. It is possible to choose between several known expression vectors such as plasmids, cosmids, phages, etc. The vector is chosen in particular as a function of the cellular host used.
  • the nucleotide sequence encoding the enzyme E can be integrated into the genome of the host cell by any known method such as for example homologous recombination or the CRISPR-Cas9 system, etc.
  • the SDS-PAGE electrophoresis technique or the Western blot technique can be used.
  • Isolation and / or purification of the enzyme E for use in isolated and / or purified form After transformation and cultivation / incubation of the transformed host cell, a step of isolation and optionally of purification of the enzyme E can be carried out. In this way, the method according to the invention is not carried out in the presence of the host cells but by the enzyme E in solution in composition M, preferably in aqueous solution.
  • the isolation and / or purification of said enzyme E produced can be carried out by any means known to those skilled in the art. It may for example be a technique chosen from electrophoresis, molecular sieving, ultracentrifugation, differential precipitation, for example with ammonium sulphate, ultrafiltration, membrane or gel filtration, exchange of ions, separation by hydrophobic interactions, or affinity chromatography, for example of IMAC type.
  • the cell lysate can be obtained according to various known techniques such as sonication, pressure (French press), via the use of chemical agents (eg triton), etc.
  • the lysate obtained corresponds to a crude extract of cells crushed.
  • step a) the addition of the different components of composition M can be done in any order.
  • the preparation of composition M can be done by simple mixing of the various components.
  • the method according to the invention comprises a step b '), between step b) and step c), stopping the enzymatic reaction by inactivation of the biocatalyst and / or of the enzyme.
  • This step b ') can be carried out by known means such as thermal shock (for example with a temperature of about 100 ° C) or osmotic, application a high pressure, the addition of a solvent allowing either to destroy and / or precipitate the cells and / or the enzymes E, the modification of the pH (either a low pH of about 2, or a high pH of 'around 10).
  • the sulfide can be introduced into composition M at a rate lower than the reaction rate of the enzymatic reaction according to step b).
  • step b) of carrying out the enzymatic reaction is carried out at a pH of between 4 and 10, preferably between 6 and 8 and even more preferably between 7 and 8, for example 7.
  • step b) of carrying out the enzymatic reaction is carried out at a temperature between 5 ° C and 100 ° C, preferably between 20 ° C and 80 ° C and even more preferably between 25 ° C. and 40 ° C.
  • the pressure used for said enzymatic reaction can range from reduced pressure relative to atmospheric pressure to several bars (several hundred kPa), depending on the reagents used and the equipment used.
  • the sulfone in step c), can be recovered in liquid or solid form.
  • the sulfone can be recovered in aqueous solution, or in liquid form by decantation, or even in solid form by precipitation depending on its solubility.
  • the purification methods depend on the characteristics of the sulfone considered.
  • distillation can allow the sulfone to be separated.
  • This distillation can be done at atmospheric pressure, reduced pressure (vacuum), or under higher pressure if a person skilled in the art sees an interest in it.
  • a membrane separation can also be envisaged to reduce the water content of the mixture to be distilled or to accelerate a crystallization process. If the sulfone has been recovered by decanting an aqueous reaction medium, drying over a molecular sieve (or any other drying method) may be considered.
  • Said process can be carried out in batch or continuously.
  • the method according to the invention can include the following steps:
  • composition comprising:
  • composition M as defined above by adding said sulphide, preferably by injection, into the composition obtained in step a-1);
  • the method may contain the following steps:
  • composition comprising:
  • composition M as defined above by adding said oxidant, in the composition obtained in step a-1);
  • step c) optional separation and / or optional purification of the sulfone recovered in step c).
  • the present invention also relates to composition M as defined above.
  • composition M as such and for its uses, are as defined for the above process.
  • composition M comprising:
  • an oxidoreductase enzyme as defined above, preferably a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO), more preferably a CycloHexanone Monooxygenase (CHMO), catalyzing the oxidation of said symmetrical sulphide to symmetrical sulphone;
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • CHMO CycloHexanone Monooxygenase
  • composition M comprising:
  • R1 and R2 are identical and as defined above;
  • an oxidoreductase enzyme as defined above, preferably a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO), more preferably a CycloHexanone Monooxygenase (CHMO), catalyzing the oxidation of said sulfide (I) to sulfone of general formula (II) below:
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • CHMO CycloHexanone Monooxygenase
  • the sulfide is chosen from dimethylsulfide, diethylsulfide, dipropylsulfide, dibutylsulfide, dioctylsulfide, didodecylsulfide, and tetrahydrothiophene.
  • a very particularly preferred sulfide is dimethylsulfide.
  • said composition corresponds to composition M as defined above, for the implementation of the process as defined above.
  • the present invention also relates to the use of an oxidoreductase enzyme, preferably a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO), more preferably a CycloHexanone Monooxygenase (CHMO) as defined above for the oxidation of a sulphide symmetrical in corresponding symmetrical sulfone.
  • an oxidoreductase enzyme preferably a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO), more preferably a CycloHexanone Monooxygenase (CHMO) as defined above for the oxidation of a sulphide symmetrical in corresponding symmetrical sulfone.
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • CHMO CycloHexanone Monooxygenase
  • the sulfide is of general formula R1-S-R2 (I) and is converted into a sulfone of general formula RI-S (0) 2-
  • Figure 1 represents the concentration (in mM) of diethylsulfide (DES), diethylsulfoxide (DESO) and diethylsulfone (DESO2) present in the reaction medium as a function of time (in hours), when the reaction is catalyzed by the enzyme CHMO .
  • Example 1 Selective synthesis of diethylsulfoxide from diethylsulfide according to the invention
  • said strain contains both CHMO, the cofactors of CHMO which are NADP and FAD, and its regenerative system.
  • IPTG isopropyl bDl -thiogalactoside
  • a certain volume of the culture is centrifuged (10 min, 5000 g, 4 ° C) in order to obtain the desired amount of cells.
  • a pellet of 300 UDO of fresh cells is then resuspended in 32 ml of a 0.1 mol / L phosphate buffer at pH 7 supplemented with 5 g / L of glycerol.
  • the cell concentration then obtained is 9.4 UDO / mL or even 3 gcps / L (with CPS: cells by dry weight).
  • DES diethyl sulfide
  • the reaction medium are taken and diluted in 1450 ⁇ L of an acetonitrile solution containing 25 mg / L of undecane (internal standard). After centrifugation (5 min, 12,500 g), the supernatant is injected by GC (gas chromatography) in order to quantitatively measure the diethylsulfoxide (DESO) and the diethylsulfone (DESO2) formed during the reaction. Under the conditions of the analysis carried out, the minimum concentration that can be measured is 30 pM.
  • the analyzes show a change in chemoselectivity at 2.5 h of reaction. Before this point, a linear increase in the amount of DESO is measured without the sulfone being detected. The sulphide oxidation rate on this part is then 4 mmol of DES oxidized per liter of medium and per hour.
  • the selectivity obtained is approximately 100%.
  • the ⁇ qboo is measured at 8.4 UDO / mL and a volume of 102 mL is taken in order to obtain after centrifugation (10 min, 5000 g, 4 ° C) a pellet containing 860 UDO of fresh cells. This pellet is then resuspended in 32 mL of 0.1 mol / L pH 7 phosphate buffer supplemented with 0.5 g / L of glycerol. A cell concentration of 27 UDO / mL (or approximately 9 gcps / L) is then obtained.
  • a concentration of diethylsulfoxide (DESO) of 1 1, 3 mmol / L is measured in the reaction medium.
  • DES in ethanolic solution is added: a DES concentration of 10.4 mmol / L is then measured.
  • the reaction is monitored by carrying out the two samples described in Example 1.
  • the analyzes show that between 0 and 2 hours of reaction, only DESO2 is produced from the DESO added initially (a concentration of 7.7 mmol / L is then obtained).
  • the DESO2 concentration does not vary until at least 4.5h while at the same time DESO is produced (10.4 mmol / L is produced).
  • the DESO2 is present (the DESO having been totally oxidized).
  • DESO2 the formation of the sulfone
  • This example shows that the oxidation of sulfide to sulfoxide is not only a priority but exclusive over the oxidation reaction of sulfoxide to sulfone.
  • the biocatalyst (CHMO) is identical to that of Example 1 and is produced under the conditions described in said Example 1.
  • Example 1 The bioconversion conditions presented in Example 1 are identical to those used for this example, unlike the sulphide used.
  • an ethanolic solution of DMS is used to obtain an initial sulphide concentration of 4.5 mM.
  • the biocatalyst used leads to the same oxidation characteristics. Namely, a chemoselective oxidation of DMS as long as the latter is present in the medium (no dimethylsulfone detected) then an oxidation of the sulfoxide occurs when the DMS is no longer detected in the medium.
  • Example 4 Enzymatic oxidation of methyl ethyl sulfide (MES)
  • the biocatalyst (CHMO) is identical to that of example 1 and is produced according to the conditions described in said example 1. II. Bioconversion
  • Example 1 The bioconversion conditions presented in Example 1 are identical to those used for this example, unlike the sulphide used.
  • an ethanolic solution of MES is used to obtain an initial sulphide concentration of 4.5 mM.
  • the biocatalyst used leads to the same oxidation characteristics. Namely, chemoselective oxidation of MES as long as it is present in the medium (no methyl ethyl sulfone detected) then oxidation of methyl ethyl sulfoxide occurs from the moment when MES is no longer detected in the medium.
  • the biocatalyst (CHMO) is identical to that of Example 1 and is produced under the conditions described in said Example 1.
  • Example 1 The bioconversion conditions presented in Example 1 are identical to those used for this example, unlike the sulphide used.
  • an ethanolic solution of THT is used to obtain an initial sulphide concentration of 4.5 mM.
  • the biocatalyst used leads to the same oxidation characteristics. Namely, a chemoselective oxidation of THT as long as the latter is present in the medium (no sulfolane detected, which is the corresponding sulfone) then an oxidation of tetrahydrothiophene-1 -oxide occurs from the moment when the THT is not no longer detected in the middle.
  • an oxidation rate of the same order of magnitude (with respect to the other sulphides) was obtained over the first reaction times: 3.4 mmol of THT are oxidized per liter of medium and per hour.
  • the rate of formation of the sulfone is 1.5 mmol / L / h.
  • Example 6 Enzymatic oxidation of a mixture of sulfides according to the invention
  • the ⁇ qboo is measured at 8.4 UDO / mL and a volume of 31 mL is taken in order to obtain, after centrifugation (10 min, 5000 g, 4 ° C) a pellet containing 300 UDO of fresh cells. This pellet is then resuspended in 32 mL of 0.1 mol / L pH 7 phosphate buffer supplemented with 0.5 g / L of glycerol. A cell concentration of 9.4 UDO / mL (or approximately 3 gcps / L) is then obtained.
  • a 250 mL flask containing 32 mL of the medium described above 75 ⁇ L of ethanolic solutions of diethylsulfide (DES), dimethylsulfide (DMS) and tetrahydrothiophene (THT) each at 3.64 M are introduced at the same time: c ' is the start of the reaction.
  • DES diethylsulfide
  • DMS dimethylsulfide
  • TTT tetrahydrothiophene
  • the reaction is monitored by carrying out the same sampling described in Example 1.
  • the analyzes show that during a first period, the sulphides of the mixture are oxidized to sulphoxides without the sulphones being detected.
  • the oxidation rate of DES is greater than that of the other two sulphides present (DMS and THT) which both have the same oxidation rate (see Table 1 below).

Abstract

La présente invention concerne un procédé sélectif de préparation de sulfones à partir de sulfures par catalyse enzymatique, ainsi qu'une composition comprenant un sulfure symétrique, une enzyme oxydoréductase catalysant l'oxydation dudit sulfure symétrique en sulfone symétrique; éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E; et un oxydant, permettant notamment de mettre en œuvre ledit procédé.

Description

DESCRIPTION
.PROCEDE SELECTIF DE PREPARATION DE SULFONES PAR CATALYSE
ENZYMATIQUE
La présente invention concerne un procédé sélectif de préparation de sulfones organiques à partir de sulfures organiques par catalyse enzymatique, ainsi qu’une composition permettant notamment la mise en oeuvre de ce procédé, et ses utilisations.
Les mercaptans présentent un grand intérêt industriel et sont aujourd’hui très largement utilisés par les industries chimiques, notamment comme matières premières pour la synthèse de molécules organiques plus complexes. Par exemple, le méthylmercaptan (CH3SH) est utilisé comme matière première dans la synthèse de la méthionine, acide aminé essentiel utilisé dans l’alimentation animale. Le méthylmercaptan est également utilisé dans la synthèse de disulfures de dialkyles, en particulier dans la synthèse du disulfure de diméthyle (DMDS), additif de sulfuration de catalyseurs d’hydrotraitement de coupes pétrolières, entre autres applications.
La synthèse industrielle des mercaptans, et en particulier du méthylmercaptan, se fait généralement selon un procédé connu, à partir d’alcools et de sulfure d’hydrogène à température élevée en présence d’un catalyseur selon l’équation (1 ) suivante :
Figure imgf000003_0001
Cependant, cette réaction donne lieu à la formation de sous-produits, tels que les sulfures selon l’équation (2) suivante :
Figure imgf000003_0002
La synthèse de mercaptans peut également se faire à partir de dérivés halogénés et de sulfhydrates alcalins, alcalinoterreux ou d’ammonium selon l’équation (3) suivante (exemple donné avec un dérivé chloré et un sulfhydrate de sodium) :
Figure imgf000003_0003
Cette seconde voie de synthèse conduit également à la présence de sulfures non désirés. Enfin, la synthèse de mercaptans peut se faire à partir d’oléfines et de sulfure d’hydrogène par catalyse acide ou par photochimie suivant que l’on souhaite obtenir un mercaptan ramifié ou non selon l’équation (4) suivante :
Figure imgf000003_0004
Une nouvelle fois, cette synthèse donne lieu à des sulfures en tant que sous-produits. Ces sulfures sont obtenus en grande quantité au niveau industriel et sont principalement amenés à être détruits. Ceci représente une perte d’efficacité pour le procédé de production du mercaptan visé et un coût supplémentaire lié à leur destruction. Cette génération de déchets constitue un véritable problème industriel pour les producteurs de mercaptans qui cherchent donc à valoriser ces sous-produits. Cette valorisation peut être effectuée de différentes manières.
Les sulfures ont tout d’abord leur propre marché : le diméthylsulfure peut être utilisé en tant qu’arôme alimentaire ou en tant qu’agent anti-cokant dans le vapocraquage des charges pétrolières. Cependant, la demande dans ces marchés est très inférieure aux quantités produites de sulfures.
Les sulfures peuvent également être transformés en mercaptans correspondants par la réaction de sulfhydrolyse. Néanmoins, les conditions requises pour réaliser cette réaction sont relativement sévères et génératrices de nouvelles réactions parasites. Cette application industrielle est donc limitée.
Enfin, un autre moyen de valorisation des sulfures produits concerne les réactions d’oxydation des sulfures pour les transformer en sulfoxydes et/ou en sulfones. De telles réactions d’oxydation chimique sont bien connues. Elles font intervenir différents types d’oxydants tels que l’eau de Javel (hypochlorite de sodium), l’eau oxygénée, l’oxygène, l’ozone ou les oxydes d’azote tels que N2O4 en présence de catalyseurs ou non.
Les méthodes chimiques d’oxydation des sulfures présentent toutefois de réels problèmes industriels. Un des problèmes les plus critiques est la faible chimiosélectivité de la réaction d’oxydation. A ce jour, on ne dispose pas de moyen permettant au niveau industriel d’orienter l’oxydation de façon exclusive vers les sulfoxydes ou vers les sulfones : un mélange de sulfoxydes et de sulfones est toujours obtenu à l’issue de l’oxydation des sulfures. D’autres inconvénients de ces méthodes chimiques sont par exemple l’utilisation de réactifs très puissants conduisant à des problèmes de sécurité, ou encore la faible disponibilité des oxydes d’azote (il existe très peu de fournisseurs industriels). De plus, certains de ces procédés chimiques conduisent à des problèmes de rejets de polluants, tels que les procédés utilisant les oxydes d’azote.
Outre les oxydations chimiques, les oxydations de sulfures peuvent être catalysées lors de procédés dit biologiques, par catalyse enzymatique en solution ou dans des organismes, généralement des microorganismes. Néanmoins, ces oxydations réalisées par catalyse enzymatique ne sont pas non plus sélectives quant aux produits obtenus; on obtient là aussi un mélange de sulfoxydes et de sulfones à partir des sulfures correspondants.
Ainsi, la faible sélectivité de la réaction d’oxydation des sulfures en sulfones par rapport aux sulfoxydes pose problème au niveau industriel, que ce soit avec les procédés d’oxydation chimique ou enzymatique. Il est en effet souhaitable d’avoir la plus grande sélectivité possible envers le produit d’intérêt, que ce soit les sulfoxydes ou les sulfones, pour des raisons évidentes de coûts et de qualité.
Les travaux de Bordewick et al. proposent l'utilisation de Yarrowia monooxygénases A-H pour catalyser des réactions de sulfoxydation de sulfures aromatiques et asymétriques (S. Bordewick, Enzyme Microb. TechnoL, 2018, 109, 31-42.). Dans cette publication, l’utilisation de techniques de mutations génétiques pour obtenir des variants de l’enzyme de départ permet de diminuer la production de la diméthylsulfone de près de 95%.
L’utilisation de telles techniques de modifications génétiques est hasardeuse et coûteuse.
De plus, ces méthodes présentent un fort taux d’échec qui se traduit par une diminution de l’activité voire une perte d’activité de l’enzyme dans son intégralité et en particulier sur le substrat d’intérêt. Une bonne sélectivité n’est donc pas garantie par de telles modifications.
Il existe donc un besoin pour un procédé de valorisation des sulfures, notamment issus de la synthèse des mercaptans, qui soit industriellement et économiquement viable.
Il existe plus particulièrement un besoin pour un procédé d’oxydation des sulfures en sulfones qui soit applicable industriellement, plus économique et plus respectueux de l’environnement. Il existe un besoin pour un procédé d’oxydation des sulfures en sulfones qui soit sélectif et dont la mise en oeuvre soit simple et économique sur le plan industriel.
La présente invention a pour objectif de répondre en tout ou partie aux besoins ci-dessus.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé, de préférence sélectif, de préparation d’une sulfone comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d’une composition M comprenant :
un sulfure ;
une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfone ;
éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E ; et
un oxydant ;
b) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfone ;
c) récupération de la sulfone obtenue à l’étape b) ; et
d) éventuelle séparation et/ou éventuelle purification de la sulfone récupérée à l’étape c) ; dans lequel ledit sulfure est totalement consommé au cours de l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique.
De façon surprenante, les présents inventeurs ont découvert un procédé sélectif de préparation de sulfones par catalyse enzymatique. Ledit procédé permet l’obtention de sulfones à partir des sulfures correspondants, en particulier sans l’obtention de sulfoxydes à l’issue de l’étape b) (ou en quantité négligeable). En effet, l’oxydation des sulfures par catalyse enzymatique se fait normalement selon la séquence réactionnelle suivante :
O O O
Figure imgf000006_0001
""
y , "S:
y / \
R" R R R
Dans le schéma ci-dessus, l’enzyme, éventuellement son(ses) cofacteur(s), et l’oxydant utilisés sont les mêmes lors de la première étape de formation du sulfoxyde et lors de la seconde étape de formation de la sulfone. Au sein du même mélange réactionnel, il est donc possible d’obtenir à la fois des sulfoxydes et des sulfones, ce qui n’est pas souhaitable comme indiqué ci-dessus.
Les présents inventeurs ont découvert un procédé permettant d’obtenir sélectivement des sulfones, en diminuant voire en supprimant les sous-produits obtenus et en particulier les sulfoxydes. Les inventeurs ont ainsi déterminé le moyen d’obtenir des sulfones sans obtenir de sulfoxydes à l’issue de l’étape b).
De façon surprenante, il a été découvert que l’oxydation des sulfures en sulfoxydes est prioritaire et exclusive par rapport à l’oxydation des sulfoxydes en sulfones. Ainsi, tant que des sulfures sont présents dans le milieu réactionnel (soit par exemple dans la composition M telle que définie ci-dessus), les sulfoxydes sont formés sélectivement, sans formation de sulfones. Les sulfoxydes sont transformés en sulfones lorsque le milieu réactionnel (soit par exemple la composition M telle que définie ci-dessus) ne contient plus de sulfures mais uniquement des sulfoxydes.
Grâce à l’invention, il est donc possible de contrôler facilement la production de sulfoxydes ou de sulfones de façon sélective et ce sans avoir à modifier les conditions opératoires du procédé.
Définitions
Le terme « (Ci-C2o)alkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés, qui peuvent être linéaires ou ramifiés et comprennent de 1 à 20 atomes de carbone. De préférence, les alkyles comprennent de 1 à 12 atomes de carbone, voire de 1 à 4 atomes de carbone. On peut citer par exemple le méthyle, l’éthyle, le n-propyle, l’isopropyle, le n-butyle, l’isobutyle, le sec-butyle ou le tert-butyle. Par « ramifié », on entend qu’un groupement alkyle est substitué sur la chaîne alkyle principale.
Le terme « (C2-C2o)alcényle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une double liaison carbone-carbone. Le terme « (C2-C2o)alcynyle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone.
Le terme « (C6-Cio)aryle » désigne des composés aromatiques hydrocarbonés monocycliques, bicycliques ou tricycliques, en particulier le phényle et le naphtyle.
Le terme « (C3-Cio)cycloalkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, monocycliques ou bicycliques tels que le cyclopropyle, le cyclobutyle, le cyclopentyle ou le cyclohexyle.
On entend par (C3-Cio)hétérocycloalcane, un cycloalcane comprenant de 3 à 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, de préférence le tétrahydrothiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.
On entend par (C4-C-io)hétéroarène, un arène comprenant entre 4 et 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, par exemple le thiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.
On entend notamment par hétéroatome, un atome choisi parmi O, N, S, Si, P et les halogènes.
On entend généralement par « catalyseur » une substance accélérant une réaction et qui se retrouve inchangée à la fin de cette réaction. Selon un mode de réalisation, ladite enzyme E catalyse la réaction d’oxydation des sulfures en sulfones.
Par « quantité catalytique », on entend notamment une quantité suffisante pour catalyser une réaction, en particulier pour catalyser l’oxydation des sulfures en sulfones. Plus particulièrement, un réactif utilisé en quantité catalytique est utilisé en plus petite quantité, par exemple entre environ 0,01 % et 20 % en poids, par rapport à la quantité en poids d’un réactif utilisé en proportion stoechiométrique.
La sélectivité d'une réaction représente généralement le nombre de moles de produit formé, par exemple le nombre de moles de sulfone formée, par rapport au nombre de moles de réactif consommé suite à la réaction, par exemple le nombre de moles de sulfure consommé.
Les définitions usuelles de la conversion, de la sélectivité et du rendement sont les suivantes : Conversion = (nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction) / (Nombre de moles de réactif à l’état initial)
Sélectivité = Nombre de moles de réactif converti en produit souhaité / (Nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction)
Rendement = Conversion X Sélectivité
Ainsi, on entend notamment par « procédé sélectif de préparation de sulfones », un procédé consommant des sulfures et produisant des sulfones, sans obtention de sulfoxydes à l’issue du procédé, de préférence sans obtention de sulfoxydes à l’issue de l’étape b) (ou avec formation d’une quantité négligeable de sulfoxydes). Selon un mode de réalisation, la réaction d’oxydation des sulfures en sulfones est chimiosélective. Par exemple, le procédé selon l’invention, en particulier l’étape b), permet d’obtenir une sélectivité comprise entre 95% et 100%, de préférence entre 99% et 100% pour les sulfones.
Procédé
Le procédé selon l’invention peut être un procédé sélectif, voire chimiosélectif, de préparation de sulfones. De préférence, ledit procédé ne conduit pas à l’obtention des sulfoxydes correspondants.
Selon un mode de réalisation, c’est l’étape b) et plus particulièrement la réaction enzymatique d’oxydation des sulfures en sulfones conduite à l’étape b) qui est sélective, de préférence chimiosélective.
L’étape b) de conduite de la réaction enzymatique peut notamment comprendre les deux étapes suivantes :
b1 ) oxydation totale du sulfure en sulfoxyde ;
b2) oxydation du sulfoxyde en sulfone.
On entend par « oxydation totale du sulfure », le fait que le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape b1 ).
Selon un mode de réalisation, le sulfure est le réactif limitant (i.e. présent en défaut) dans la composition M.
Par « totalement consommé », on entend notamment que la quantité de sulfure restant après l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique peut être comprise entre 0% et 20% en poids, de préférence entre 0% et 5% en poids, par exemple entre 0% et 1 % en poids, et encore plus préférentiellement entre 0% et 0,01 % en poids par rapport à la quantité de sulfure de départ en poids, c’est-à-dire de l’étape a).
Plus particulièrement, la composition M comprend :
une quantité stoechiométrique d’un sulfure ;
une quantité catalytique de l’enzyme E ;
éventuellement une quantité catalytique d’au moins un cofacteur C ; et
une quantité stoechiométrique de l’oxydant.
Sulfure :
On entend notamment par sulfure un sulfure organique, soit tout composé organique comprenant au moins une fonction de type -C-S-C-.
Selon un mode de réalisation, la composition M comprend au moins un sulfure. Elle peut par exemple comprendre un, deux ou plusieurs sulfures différents. Ledit sulfure peut être symétrique, c’est-à-dire que l’atome de soufre représente un centre de symétrie par rapport au composé.
Selon un mode de réalisation, ledit sulfure est de formule générale suivante : R1-S-R2 (I)
dans laquelle,
Ri et R2 peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C2-C2o)alcényle, (C2-C2o)alcynyle, (C3-Cio)cycloalkyle et
(C6-Cio)aryle ou
Ri et R2 forment un cycle avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent, de préférence un groupement (C3-Cio)hétérocycloalcane ou (C4-Cio)hétéroarène ;
lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène pouvant éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) ; et lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle et aryle pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatome(s).
Lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C3-Cio)cycloalkyle et (C6-Cio)aryle ;
et peuvent être éventuellement fonctionnalisés par une ou plusieurs fonction(s) choisie(s), de manière non limitative et à titre d’exemples, parmi les fonctions alcool, aldéhyde, cétone, acide, amide, nitrile, ester ou encore les fonctions porteuses de soufre, phosphore et silicium.
Selon un mode de réalisation, lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de : (Ci-C2o)alkyle, (C3- Cio)cycloalkyle, (C6-Cio)aryle, -OH, -C(0)0H, -C(0)H, -C(0)-NH2, -NH2, -NHR, -NRR’, -C(O)- , -C(0)-NHR’, -C(0)-NRR’, -COOR et -CN ;
dans lesquels R et R’ représentent indépendamment l’un de l’autre un groupement (C1- C2o)alkyle.
Selon un mode de réalisation préféré, Ri et R2, peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C2-C2o)alcényle, (C2-C2o)alcynyle et (C3-Cio)cycloalkyle ou
Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent un groupement (C3-
Cio)hétérocycloalcane.
De préférence, Ri et R2 sont choisis parmi les (Ci-C2o)alkyle ou Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre qui les porte un (C3-Cio)hétérocycloalcane. Les radicaux Ri et R2 dudit sulfure sont de préférence identiques (i.e. formant ainsi un sulfure symétrique).
Plus préférentiellement, le sulfure est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Le diméthylsulfure est particulièrement préféré selon l’invention. Selon un mode de réalisation, le sulfure est symétrique et n’est donc pas prochiral. Selon un mode de réalisation, le sulfure n’est pas le tert-butyl méthyl sulfure (CAS Number 6163-64-0).
Oxydant :
On entend par oxydant tout composé pouvant oxyder un sulfure en sulfone.
L’oxydant peut être choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène, de l’oxygène pur et du peroxyde d’hydrogène. Selon un mode de réalisation particulier, l’oxydant est choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène et de l’oxygène pur lorsque l’enzyme E est une mono- ou une dioxygénase et du peroxyde d’hydrogène lorsque l’enzyme E est une peroxydase. Lorsque l’oxydant se présente sous forme gazeuse, il est présent dans la composition M sous forme de gaz dissout. Le pourcentage d’oxygène dans l’air enrichi ou appauvri est choisi en fonction de la vitesse de réaction et de la compatibilité avec le système enzymatique de façon connue de l’homme du métier.
L’oxydant peut être en quantité stoechiométrique ou en excès dans la composition M. Ainsi, le sulfure présent est totalement consommé avec l’oxydant lors de la réaction enzymatique conduite à l’étape b).
Lorsque de l’air (air qui peut être appauvri ou enrichi en oxygène) est utilisé, c’est évidemment l’oxygène compris dans l’air qui est consommé au cours de la réaction enzymatique conduite à l’étape b) en tant qu’oxydant.
A l’issue de ladite réaction, généralement l’oxygène est transformé en eau lorsque l’enzyme E utilisée est une mono-oxygénase ou totalement consommé lorsque l’enzyme E est une dioxygénase. Le peroxyde d’hydrogène est quant à lui transformé en eau suite à l’action de la peroxydase. Ainsi, le procédé selon l’invention est particulièrement avantageux en termes de rejet et de respect de l’environnement.
Enzyme E :
Ladite enzyme E peut être une oxydoréductase, de préférence une oxydoréductase choisie parmi le groupe constitué des monooxygénases, des dioxygénases et des peroxydases, encore plus préférentiellement parmi les monooxygénases.
De préférence, ladite enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO).
Encore plus préférentiellement et parmi les BVMOs, l’enzyme E peut être une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO), et plus particulièrement une Cyclohexanone-1 ,2-MonoOxygénase ou une Cyclopentanone Monooxygénase (CPMO), et plus particulièrement une cyclopentanone 1 ,2-monooxygénase.
Les Cyclohexanone-1 ,2-Monooxygénases sont notamment de classe EC 1.14.13.22. Selon un mode de réalisation particulier, la CHMO est une CHMO d’Acinetobacter sp. (par exemple de souche NCIMB 9871 ) et/ou une CHMO codée par le gène chnB appartenant au cluster AB006902.
Les Cyclopentanone 1 ,2-Monooxygénase sont notamment de classe EC 1.14.13.16.
Selon un mode de réalisation particulier, la CPMO est une CPMO de Comamonas sp. (par exemple la souche NCIMB 9872) et/ou une CHMO codée par le gène cpnB.
La monooxygénase peut également être une hydroxyacétophénone monooxygénase (HAPMO) et plus particulièrement une 4-hydroxyacétophénone monooxygénase.
Les hydroxyacétophénone monooxygénases sont notamment de la classe EC 1.14.13.84. Selon un mode de réalisation particulier, IΉARMO est une HAPMO de Pseudomonas fluorescens. codée par le gène hapE.
Cofacteur(s) C :
On entend notamment par « cofacteur C » un cofacteur nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme E telle que définie ci-dessus et/ou permettant d’améliorer son activité catalytique. Selon un mode de réalisation, un, deux cofacteurs C ou plus sont présents dans la composition M. Par exemple, il est possible d’ajouter à la composition M un cofacteur C déjà présent naturellement dans l’enzyme E, en supplément d’un autre cofacteur C.
Lorsque l’oxydoréductase est une peroxydase, il est possible de n’ajouter aucun cofacteur C dans la composition M. Les cofacteurs nicotiniques et/ou flaviniques peuvent être utilisés lorsque l’enzyme E appartient à la famille des mono ou di-oxygénases.
Ledit au moins un cofacteur C peut être choisi parmi les cofacteurs nicotiniques et les cofacteurs flaviniques. En particulier, ledit au moins un cofacteur C peut être choisi parmi le groupe constitué de : la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD) et/ou leur forme réduite correspondante (à savoir NADH,H+ NADPH,H+,
FMNH2, FADH2).
Les cofacteurs C listés ci-dessus sont avantageusement utilisés sous leurs formes réduites (par exemple NADPH, H+) et/ou leurs formes oxydées (par exemple NADP+), c’est-à-dire qu’ils peuvent être ajoutés sous ces formes réduites et/ou oxydées dans la composition M.
De préférence l’enzyme E utilisée est la Cyclohexanone Monooxygénase, par exemple la Cyclohexanone Monooxygénase d’Acinetobacter sp., et le cofacteur C utilisé est le NADP, éventuellement supplémenté de FAD.
Svstème(s) de régénération du(des) cofacteur(s) C :
La composition M telle que définie ci-dessus peut également comprendre au moins un système de régénération du ou des cofacteur(s) C. Par « système de régénération du ou des co- facteur(s) C », on entend toute réaction ou suite de réaction chimique(s) et/ou enzymatique(s) permettant de retransformer le(s) cofacteur(s) C réduit(s) en cofacteur(s) C oxydé(s) ou vice- versa.
Par exemple, les systèmes de régénération peuvent être des systèmes oxydo-réducteurs enzymatiques connus avec utilisation d’un substrat sacrificiel. De tels systèmes impliquent l’utilisation d’une seconde enzyme (dite enzyme de recyclage) qui permet de recycler le(s) cofacteur(s) C utilisé(s) en utilisant un substrat sacrificiel.
Parmi les enzymes de recyclage, on peut citer la glucose déshydrogénase, la formate déhydrogénase, la phosphite déhydrogénase (Vrtis, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41 (17), 3257-3259) ou encore les alcools déhydrogénases (Leuchs, Chem. Biochem. Eng. Q., 201 1 , 25(2), 267-281 ; Goldber, App. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76(2), 237).
Parmi les substrats sacrificiels qui peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, les composés donneurs d’hydrogène sont tout particulièrement préférés, et parmi ceux-ci, les composés tout à fait adaptés sont les composés organiques réducteurs donneurs d’hydrogène porteurs de fonction hydroxyle, tels que les alcools, les polyols, les sucres et autres tels que le glucose ou le glycérol.
Par exemple, dans le cas de la CHMO, l’enzyme du système de recyclage réduit le cofacteur NADP+ sous la forme NADPH,H+ en oxydant le substrat sacrificiel.
La composition M selon l’invention peut également comprendre :
- éventuellement un ou plusieurs solvants choisis parmi l’eau, les tampons tels que les tampons phosphates, Tris-HCI, Tris-base, bicarbonate d’ammonium, acétate d’ammonium, HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique), CHES (acide N-cyclohexyl-2- aminoéthanesulfonique), ou les sels tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, ou leurs mélanges ;
- éventuellement des additifs tels que des surfactants, afin notamment de favoriser la solubilité d’un ou plusieurs réactif(s) ou substrat(s) de la réaction enzymatique.
De préférence, la composition M est une solution aqueuse. Par exemple, ladite composition M comprend entre 50 % et 99 % en poids d’eau, de préférence entre 80 % et 97 % en poids d’eau par rapport au poids total de la composition M.
Selon un mode de réalisation, la composition M est considérée comme le mélange réactionnel. Les différents composants de la composition M préparée à l’étape a) ci-dessus sont aisément accessibles dans le commerce ou peuvent être préparés selon des techniques bien connues de l’homme du métier. Ces différents éléments peuvent se présenter sous forme solide, liquide ou gazeuse et peuvent très avantageusement être mis en solution ou dissous dans l’eau ou tout autre solvant pour être mis en oeuvre dans le procédé de l’invention. Les enzymes utilisées peuvent également être greffées sur support (cas des enzymes supportées). Selon un mode de réalisation, l’enzyme E, éventuellement ledit au moins un cofacteur C, éventuellement ledit au moins un système de régénération sont :
- soit sous forme isolée et/ou purifiée, par exemple en solution aqueuse ;
- soit compris dans un extrait brut, c’est-à-dire dans un extrait de cellules broyées ; ou
- soit compris dans des cellules entières.
De préférence, des cellules entières sont utilisées. Le ratio [sulfure] (en mmol/L) / [cellules] (en gCps.L 1) peut être compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,01 et 3 mmol/gc s, de préférence pendant l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique. La détermination de la concentration massique en grammes de cellules sèches (gcps pour Cellules en Poids Sec ou gcDw pour Cells Dry Weight en anglais) est réalisée selon des techniques classiques.
L’enzyme E peut être surexprimée ou non dans lesdites cellules, appelées ci-après cellules hôtes.
La cellule hôte peut être tout hôte approprié pour la production d’une enzyme E à partir de l’expression du gène codant correspondant. Ce gène pourra alors se trouver soit dans le génome de l’hôte, soit porté par un vecteur d’expression tels que ceux définis ci-après.
On entend notamment par « cellule hôte » au sens de la présente invention une cellule procaryote ou eucaryote. Des cellules hôtes couramment utilisées pour l’expression de protéines recombinantes ou non incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia coli ou Bacillus sp., ou Pseudomonas, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, des cellules de champignons tels que Aspergillus niger, Pénicillium funiculosum ou Trichoderma reesei, des cellules d’insectes telles que les cellules Sf9, ou encore des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées cellulaires HEK 293, PER-C6 ou CHO.
Lesdites cellules hôtes peuvent être en phase stationnaire ou de croissance, par exemple sorties du milieu de culture.
De préférence, l’enzyme E et son éventuel au moins un cofacteur C sont exprimés dans la bactérie Escherichia coli. Préférentiellement, la CHMO est exprimée à l’intérieur d’une souche d’Escherichia coli comme par exemple Escherichia coli BL21 (DE3).
Préférentiellement, IΉARMO est exprimée à l’intérieur d’une souche d’Escherichia coli comme par exemple Escherichia coli BL21 (DE3).
Dans le cas des cellules entières et/ou lysées, c’est par exemple la machinerie cellulaire qui régénère le ou les cofacteur(s) C utilisé(s). Par exemple, dans le cas d’une souche d’Escherichia coli exprimant la Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO) et/ou la cyclopentanone monooxygénase (CPMO), le cofacteur C est le NADP.
Selon un mode de réalisation, lorsque la CHMO transforme le sulfure en sulfone, le cofacteur C1 est le NADP, avec éventuellement le cofacteur C2 FAD. Lorsque la CHMO transforme le sulfure en sulfone, le cofacteur NADPH,H+ est oxydé en NADP+, qui sera régénéré par la cellule et/ou le système de régénération mis en place.
Par exemple si le milieu est supplémenté en glycérol, des enzymes naturellement présentes dans E. coli, notamment l’enzyme glycérol déshydrogénase, permettront la régénération du cofacteur réduit. Dans le cas d’un milieu supplémenté en glucose, les enzymes de la voie des pentoses phosphates, notamment les enzymes glucose-6-phosphate déshydrogénase et/ou acide-6-phosphogluconique déshydrogénase, naturellement présentes chez E. coli participeront à la régénération du cofacteur C1 réduit.
Selon l’invention, on appelle « biocatalyseur » la cellule hôte comprenant l’enzyme E, éventuellement au moins un cofacteur C et éventuellement un système de régénération du(des) cofacteur(s) C.
L’enzyme E et/ou le biocatalyseur tels que définis précédemment peuvent être obtenus selon différentes techniques connues de l’homme du métier.
Intégration d’un vecteur d’expression comprenant la séquence codante pour l’enzyme E dans l’hôte cellulaire
Lors de l’utilisation d’un vecteur d’expression tel qu’un plasmide, la transformation des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier, par exemple par lipofection, électroporation, choc thermique, ou par des méthodes chimiques. Le vecteur d’expression et la méthode d’introduction du vecteur d’expression au sein de la cellule hôte sont sélectionnés en fonction de la cellule hôte choisie. A l’issue de cette étape de transformation, une cellule transformée exprimant un gène codant une enzyme recombinante E est obtenue. Elle peut être cultivée, lors d’une étape de culture/d’incubation, afin de produire l’enzyme E.
L’incubation/la culture des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier qui peut déterminer par exemple, le milieu de culture ou encore les conditions de temps et de température. Selon le vecteur utilisé, une période d’induction - correspondant à une production accrue de l’enzyme E - peut être observée. L’utilisation d’inducteur faible (comme par exemple l’arabinose pour le vecteur pBad) ou fort (comme par exemple l’isopropyl b-D-l -thiogalactoside (IPTG) pour les vecteurs pET22b, pRSF, etc...) peut être envisagée. Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot. On entend par « vecteur d’expression », une molécule d’ADN de taille réduite dans laquelle il est possible d’insérer une séquence nucléotidique d’intérêt. Il est possible de choisir entre plusieurs vecteurs d’expression connus tels les plasmides, les cosmides, les phages, etc ... Le choix du vecteur se fait notamment en fonction de l’hôte cellulaire utilisé.
Il peut s’agir par exemple du vecteur d’expression décrit dans le document WO 83/004261.
Intégration de la séquence codante pour l’enzyme E dans le génome de la cellule hôte en l’absence de vecteur d’expression
La séquence nucléotidique codant l’enzyme E peut être intégrée dans le génome de la cellule hôte par toute méthode connue comme par exemple la recombinaison homologue ou encore le système CRISPR-Cas9 etc... Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot.
Isolation et/ou purification de l’enzyme E pour une utilisation sous forme isolée et/ou purifiée Après transformation et culture/incubation de la cellule hôte transformée, une étape d’isolation et éventuellement de purification de l’enzyme E peut être réalisée. De cette façon, le procédé selon l’invention n’est pas réalisé en présence des cellules hôtes mais par l’enzyme E en solution dans la composition M, de préférence en solution aqueuse.
L’isolation et/ou la purification de ladite enzyme E produite peut être réalisée par tout moyen connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d’ammonium, une ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d’ions, une séparation par interactions hydrophobes, ou une chromatographie d’affinité, par exemple de type IMAC.
Mode de lyse de la cellule hôte, préparation d’un extrait brut de cellules broyées
Le lysat cellulaire peut être obtenu selon différentes techniques connues telles que la sonication, la pression (presse de French), via l’utilisation d’agents chimiques (ex. triton) etc... Le lysat obtenu correspond à un extrait brut de cellules broyées.
Dans l’étape a), l’ajout des différents composants de la composition M peut se faire dans n’importe quel ordre. La préparation de la composition M peut se faire par simple mélange des différents composants.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape b’), entre l’étape b) et l’étape c), d’arrêt de la réaction enzymatique par inactivation du biocatalyseur et/ou de l’enzyme E. Cette étape b’) peut être réalisée par des moyens connus tels que le choc thermique (par exemple avec une température d’environ 100°C) ou osmotique, l’application d’une forte pression, l’ajout d’un solvant permettant soit de détruire et/ou de précipiter les cellules et/ou les enzymes E, la modification du pH (soit un pH bas d’environ 2, soit un pH élevé d’environ 10).
Le sulfure peut être introduit dans la composition M à une vitesse inférieure à la vitesse de réaction de la réaction enzymatique selon l’étape b).
Selon un mode de réalisation, l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique est réalisée à un pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 6 et 8 et encore plus préférentiellement entre 7 et 8, par exemple 7.
Selon un mode de réalisation, l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique est réalisée à une température comprise entre 5°C et 100°C, de préférence entre 20°C et 80°C et encore plus préférentiellement entre 25°C et 40°C.
La pression utilisée pour ladite réaction enzymatique peut aller d’une pression réduite par rapport à la pression atmosphérique à plusieurs bars (plusieurs centaines de kPa), selon les réactifs utilisés et le matériel utilisé.
Les avantages que procure le procédé de l’invention sont nombreux. Parmi ces avantages, on peut citer la possibilité de travailler en solution aqueuse, dans des conditions très douces de température et de pression et dans des conditions de pH proches de la neutralité. Toutes ces conditions sont typiques d’un procédé biocatalytique dit « vert » ou « durable ».
A l’étape c), la sulfone peut être récupérée sous forme liquide ou solide. La sulfone peut être récupérée en solution aqueuse, ou sous forme liquide par décantation, voire sous forme solide par précipitation selon sa solubilité.
Pour l’étape d), les méthodes de purification dépendent des caractéristiques de la sulfone considérée. Ainsi, après séparation des cellules (contenant l’enzyme E) par ultrafiltration ou centrifugation, une distillation peut permettre de séparer la sulfone.
Cette distillation peut se faire à pression atmosphérique, pression réduite (vide), ou sous pression plus élevée si l’homme du métier y voit un intérêt.
Une séparation membranaire peut aussi être envisagée pour diminuer la teneur en eau du mélange à distiller ou accélérer un processus de cristallisation. Si la sulfone a été récupérée par décantation d’un milieu réactionnel aqueux, un séchage sur tamis moléculaire (ou tout autre méthode de séchage) peut être envisagé.
Ledit procédé peut être réalisé en batch ou en continu.
Le procédé selon l’invention peut comprendre les étapes suivantes :
a-1 ) préparation d’une composition comprenant :
- ladite enzyme E ;
- éventuellement ledit au moins un cofacteur C ; - ledit oxydant ;
a-2) préparation de la composition M telle que définie ci-dessus par ajout dudit sulfure, de préférence par injection, dans la composition obtenue à l’étape a-1 ) ;
b) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfone ;
c) récupération de la sulfone obtenue à l’étape b) ; et
d) éventuelle séparation et/ou éventuelle purification de la sulfone récupérée à l’étape c). Selon une autre mise en oeuvre, le procédé peut contenir les étapes suivantes :
a-1 ) préparation d’une composition comprenant :
- ledit sulfure ;
- ladite enzyme E ; et
- éventuellement ledit au moins un cofacteur C ;
a-2) préparation de la composition M telle que définie ci-dessus par ajout dudit oxydant, dans la composition obtenue à l’étape a-1 ) ;
b) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfone ;
c) récupération de la sulfone obtenue à l’étape b) ; et
d) éventuelle séparation et/ou éventuelle purification de la sulfone récupérée à l’étape c).
Composition M
La présente invention concerne également la composition M telle que définie ci-dessus.
Les différents éléments de la composition M, en tant que telle et pour ses utilisations, sont tels que définis pour le procédé ci-dessus.
En particulier, la présente invention concerne également une composition M comprenant :
- un sulfure symétrique tel que défini ci-dessus ;
- une enzyme oxydoréductase telle que définie ci-dessus, de préférence une Baeyer- Villiger Monooxygénase (BVMO), plus préférentiellement une CycloHexanone Monooxygénase (CHMO), catalysant l’oxydation dudit sulfure symétrique en sulfone symétrique ;
- éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E tel que défini ci-dessus ; et
- éventuellement un oxydant tel que défini ci-dessus.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition M comprenant :
un sulfure de formule générale (I) suivante : R1-S-R2 (I)
dans laquelle Ri et R2 sont identiques et tels que définis ci-dessus ;
une enzyme oxydoréductase telle que définie ci-dessus, de préférence une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), plus préférentiellement une CycloHexanone Monooxygénase (CHMO), catalysant l’oxydation dudit sulfure (I) en sulfone de formule générale (II) suivante :
RI-S(0)2-R2 (II) dans laquelle Ri et R2 sont identiques et tels que définis ci-dessus; éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E tel que défini ci- dessus ; et
éventuellement un oxydant tel que défini ci-dessus.
De préférence, le sulfure est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Un sulfure tout particulièrement préféré est le diméthylsulfure.
Selon un mode de réalisation, ladite composition correspond à la composition M telle que définie ci-dessus, pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus.
Utilisations
La présente invention concerne également l’utilisation d’une enzyme oxydoréductase, de préférence une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence encore une CycloHexanone Monooxygénase (CHMO) telle que définie ci-dessus pour l’oxydation d’un sulfure symétrique en sulfone symétrique correspondante. Ladite réaction enzymatique d’oxydation est notamment sélective au sens de l’invention. Selon un mode de réalisation, le sulfure est de formule générale R1-S-R2 (I) et est transformé en sulfone de formule générale RI-S(0)2-R2 (II), dans laquelle Ri et R2 sont identiques et tels que définis ci-dessus.
Description des Figures
Figure 1 :
La Figure 1 représente la concentration (en mM) de diéthylsulfure (DES), diéthylsulfoxyde (DESO) et de diéthylsulfone (DESO2) présente dans le milieu réactionnel en fonction du temps (en heure), lorsque la réaction est catalysée par l’enzyme CHMO.
L’expression « compris entre X et X » inclut les bornes limites données. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne sont pas limitatifs de la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse sélective du diéthylsulfoxyde à partir de diéthylsulfure selon l’invention
I. Préparation du biocatalvseur : Une souche d’Escherichia coli BL21 (DE3) (commercialisée par Merck Millipore) exprimant le gène chnB inséré sur le plasmide pET22b (commercialisé par Promega, Qiagen) a été construite. Elle permet l’expression hétérologue de la CycloHexanone MonoOxygénase (CH MO) d’Acinetobacter sp.
Il est entendu que ladite souche contient à la fois la CHMO, les cofacteurs de la CHMO qui sont le NADP et le FAD, et son système régénérateur.
Une pré-culture et une culture de cette souche ont été réalisées selon les techniques connues de l’homme de métier.
Après une phase d’induction déclenchée par l’ajout d’isopropyl b-D-l -thiogalactoside (IPTG) à 0,85 mmol/L en concentration finale, un certain volume de la culture est centrifugé (10 min, 5000 g, 4°C) afin d’obtenir la quantité souhaitée de cellules. Dans cet exemple, un culot de 300 UDO de cellules fraîches est alors resuspendu dans 32 ml_ d’un tampon phosphate 0,1 mol/L à pH 7 supplémenté de 5 g/L de glycérol. La concentration cellulaire alors obtenue est de 9,4 UDO/mL ou encore 3 gcps/L (avec CPS : cellules en poids sec).
II. Bioconversion :
Dans une fiole de 250 mL contenant 32 mL du milieu décrit ci-dessus, la concentration initiale de diéthylsulfure (DES) est mesurée à 4,5 mmol/L à t=0.
A des temps réguliers, 50 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1450 pL d’une solution d’acétonitrile contenant 25 mg/L d’undécane (étalon interne). Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG (chromatographie en phase gaz) afin de mesurer quantitativement le diéthylsulfoxyde (DESO) et la diéthylsulfone (DESO2) formés au cours de la réaction. Dans les conditions de l’analyse pratiquée, la concentration minimale pouvant être mesurée est de 30 pM.
Les analyses montrent un changement de chimio-sélectivité à 2,5 h de réaction. Avant ce point, une augmentation linéaire de la quantité de DESO est mesurée sans que la sulfone ne soit détectée. La vitesse d’oxydation du sulfure sur cette partie est alors de 4 mmol de DES oxydé par litre de milieu et par heure.
Après 3h, une augmentation linéaire de la quantité de DESO2 est observée en même temps que la consommation du DESO, le DESO2 se forme à une vitesse de 2,8 mmol/L/h. A 6h de réaction, seul le DESO2 est présent.
Ainsi la formation de DESO2 intervient lorsque le DES n’est plus détecté dans le milieu. Cet exemple montre que la réaction d’oxydation des sulfures en sulfoxydes est chimiosélective tant que le sulfure est présent dans le milieu réactionnel (cf. Figure 1 ).
La sélectivité obtenue est d’environ 100%.
D’une part, lorsque le DES est toujours présent dans le milieu réactionnel, la sulfone n’est pas détectée avec les outils analytiques utilisés.
D’autre part, lorsque le DES n’est plus détecté dans le milieu réactionnel, l’oxydation du DESO est totale. A la fin de la réaction (t=5h), environ 100% de DESO2 est obtenu sans que le DESO soit détecté par les outils analytiques utilisés.
Par extrapolation, le ratio [sulfure] (en mmol/L) / [cellules] (en gcps.L-1 ) calculé est de 0,06 mmol/gcps à t=2,5.
Exemple 2 :
I. Préparation du biocatalvseur :
La même souche que celle décrite dans l’exemple 1 a été utilisée dans cet exemple.
Cette fois-ci une plus grande quantité de cellules a été utilisée.
A l’issue de l’étape d’induction, la ϋqboo est mesurée à 8,4 UDO/mL et un volume de 102 mL est prélevé afin d’obtenir après centrifugation (10 min, 5000 g, 4°C) un culot contenant 860 UDO de cellules fraîches. Ce culot est alors resuspendu dans 32 mL d’un tampon phosphate 0,1 mol/L pH 7 supplémenté de 0,5 g/L de glycérol. Une concentration cellulaire de 27 UDO/mL (ou environ 9 gcps/L) est alors obtenue.
II. Bioconversion :
Dans une fiole de 250 mL contenant 32 mL du milieu décrit ci-dessus, une concentration en diéthylsulfoxyde (DESO) de 1 1 ,3 mmol/L est mesurée dans le milieu réactionnel. A t=2h, le DES en solution éthanolique est ajoutée : une concentration en DES de 10,4 mmol/L est alors mesurée.
Le suivi de la réaction se fait en pratiquant les deux échantillonnages décrits dans l’exemple 1 . Les analyses montrent qu’entre 0 et 2h de réaction, seul le DESO2 est produit à partir du DESO ajouté initialement (une concentration de 7,7 mmol/L est alors obtenue). Après l’ajout de DES à t=2h, la concentration de DESO2 ne varie plus jusqu’au moins 4,5 h alors que dans le même temps le DESO est produit (10,4 mmol/L sont produits). A 16,5h de réaction, seul le DESO2 est présent (le DESO ayant été totalement oxydé). Ainsi, en ajoutant le DES, la formation de la sulfone (ici le DESO2) s’interrompt.
Cet exemple montre que l’oxydation du sulfure en sulfoxyde est non seulement prioritaire mais exclusive par rapport de la réaction d’oxydation du sulfoxyde en sulfone.
Exemple 3 : Oxydation enzymatique de diméthylsulfure (DMS)
I. Préparation du biocatalvseur :
Le biocatalyseur (CHMO) est identique à celui de l’exemple 1 et est produit selon les conditions décrites dans ledit exemple 1.
II. Bioconversion
Les conditions de bioconversion présentées dans l’exemple 1 sont identiques à celles utilisées pour cet exemple à la différence du sulfure utilisé. Dans cet exemple, une solution éthanolique de DMS est utilisée pour obtenir une concentration en sulfure initiale de 4,5 mM.
Le suivi de la réaction se fait selon la méthode présentée en exemple 1.
De manière surprenante, le biocatalyseur utilisé conduit aux mêmes caractéristiques d’oxydation. A savoir, une oxydation chimiosélective du DMS tant que ce dernier est présent dans le milieu (pas de diméthylsulfone détectée) puis une oxydation du sulfoxyde se produit à partir du moment où le DMS n’est plus détecté dans le milieu.
Outre cette chimiosélectivité, une vitesse d’oxydation du sulfure du même ordre de grandeur (par rapport au DES) a été obtenue sur les premiers temps de réaction : 3,9 mmol de DMS sont oxydées par litre de milieu et par heure. De plus, la vitesse de formation de la sulfone est de 1 mmol/L/h.
Exemple 4 : Oxydation enzymatique du méthyléthylsulfure (MES)
I. Préparation du biocatalvseur :
Le biocatalyseur (CHMO) est identique à celui de l’exemple 1 et est produit selon les conditions décrites dans ledit exemple 1 . II. Bioconversion
Les conditions de bioconversion présentées dans l’exemple 1 sont identiques à celles utilisées pour cet exemple à la différence du sulfure utilisé. Dans cet exemple, une solution éthanolique de MES est utilisée pour obtenir une concentration en sulfure initiale de 4,5 mM.
Le suivi de la réaction se fait selon la méthode présentée en exemple 1.
De manière surprenante, le biocatalyseur utilisé conduit aux mêmes caractéristiques d’oxydation. A savoir, une oxydation chimiosélective du MES tant que ce dernier est présent dans le milieu (pas de méthyléthylsulfone détectée) puis une oxydation du méthyléthylsulfoxyde se produit à partir du moment où le MES n’est plus détecté dans le milieu.
Outre cette chimiosélectivité, une vitesse d’oxydation du même ordre de grandeur (par rapport aux autres sulfures) a été obtenue sur les premiers temps de réaction : 3,6 mmol de MES sont oxydées par litre de milieu et par heure. De plus, la vitesse de production de la sulfone est de 3,5 mmol/L/h.
Exemple 5 : Oxydation enzymatique du tétrahydrothiophène (THT)
I. Préparation du biocatalvseur :
Le biocatalyseur (CHMO) est identique à celui de l’exemple 1 et est produit selon les conditions décrites dans ledit exemple 1.
II. Bioconversion
Les conditions de bioconversion présentées dans l’exemple 1 sont identiques à celles utilisées pour cet exemple à la différence du sulfure utilisé. Dans cet exemple, une solution éthanolique de THT est utilisée pour obtenir une concentration en sulfure initiale de 4,5 mM.
Le suivi de la réaction se fait selon la méthode présentée en exemple 1.
De manière surprenante, le biocatalyseur utilisé conduit aux mêmes caractéristiques d’oxydation. A savoir, une oxydation chimiosélective du THT tant que ce dernier est présent dans le milieu (pas de sulfolane détecté, qui est la sulfone correspondante) puis une oxydation du tétrahydrothiophène-1 -oxyde se produit à partir du moment où le THT n’est plus détecté dans le milieu. Outre cette chimiosélectivité, une vitesse d’oxydation du même ordre de grandeur (par rapport aux autres sulfures) a été obtenue sur les premiers temps de réaction : 3,4 mmol de THT sont oxydés par litre de milieu et par heure. De plus, la vitesse de formation de la sulfone est de 1 ,5 mmol/L/h.
Exemple 6 : Oxydation enzymatique d’un mélange de sulfures selon l’invention
I. Préparation du biocatalvseur :
La même souche que celle décrite dans l’exemple 1 a été utilisée dans cet exemple.
A l’issue de l’étape d’induction, la ϋqboo est mesurée à 8,4 UDO/mL et un volume de 31 mL est prélevé afin d’obtenir après centrifugation (10 min, 5000 g, 4°C) un culot contenant 300 UDO de cellules fraîches. Ce culot est alors resuspendu dans 32 mL d’un tampon phosphate 0,1 mol/L pH 7 supplémenté de 0,5 g/L de glycérol. Une concentration cellulaire de 9,4 UDO/mL (ou environ 3 gcps/L) est alors obtenue.
II. Bioconversion :
Dans une fiole de 250 mL contenant 32 mL du milieu décrit ci-dessus, 75 pL de solutions éthanoliques de diéthylsulfure (DES), diméthylsulfure (DMS) et tétrahydrothiophène (THT) chacun à 3,64 M sont introduits en même temps : c’est le début de la réaction.
Le suivi de la réaction se fait en pratiquant le même échantillonnage décrit dans l’exemple 1 . Les analyses montrent que durant une première période, les sulfures du mélange sont oxydés en sulfoxydes sans que les sulfones ne soient détectées. De manière surprenante la vitesse d’oxydation du DES est supérieure à celles des deux autres sulfures présents (le DMS et le THT) qui ont tous deux la même vitesse d’oxydation (cf. tableau 1 ci-dessous).
Figure imgf000023_0001
Ce n’est que dans un second temps, quand les sulfures ne sont plus détectés dans le milieu réactionnel que les sulfones correspondantes sont obtenues, à l’exception du DMSO2 qui n’a pas été détecté dans ces conditions en mélangeant les différents sulfures.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’une sulfone comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d’une composition M comprenant :
- un sulfure ;
- une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfone ;
- éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E ; et
- un oxydant ;
b) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfone ; c) récupération de la sulfone obtenue à l’étape b) ; et
d) éventuelle séparation et/ou éventuelle purification de la sulfone récupérée à l’étape c) ; dans lequel ledit sulfure est totalement consommé au cours de l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique.
2. Procédé de préparation selon la revendication 1 , dans lequel ladite enzyme E est une oxydoréductase, de préférence une oxydoréductase choisie parmi le groupe constitué des monooxygénases, des dioxygénases et des peroxydases, encore plus préférentiellement parmi les monooxygénases.
3. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO).
4. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit sulfure est de formule générale suivante :
R1-S-R2 (I)
dans laquelle,
Ri et R2 peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C2-C2o)alcényle, (C2-C2o)alcynyle, (C3-Cio)cycloalkyle et (C6-Cio)aryle ou
Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent un hétérocycloalkane ou un hétéro-arène ;
lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéro-arène pouvant éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) ; et lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle et aryle pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatome(s).
5. Procédé de préparation selon la revendication 4, dans lequel les radicaux Ri et R2 dudit sulfure sont identiques.
6. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit sulfure est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène, de préférence le diméthylsulfure.
7. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ratio [sulfure] (en mmol/L) / [cellules] (en gc s.L 1) est compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,01 et 3 mmol/gcps.
8. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’oxydant est choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène, de l’oxygène pur et du peroxyde d’hydrogène.
9. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le cofacteur C est choisi parmi les cofacteurs nicotiniques et les cofacteurs flaviniques.
10. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’enzyme E est la Cyclohexanone Monooxygénase et le cofacteur C est le NADP et éventuellement le FAD.
11. Composition comprenant :
- un sulfure symétrique ;
- une enzyme oxydoréductase, de préférence une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), plus préférentiellement une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO), catalysant l’oxydation dudit sulfure symétrique en sulfone symétrique ;
- éventuellement au moins un cofacteur C de ladite enzyme E ;
- éventuellement un oxydant.
12. Composition selon la revendication 1 1 , dans laquelle le sulfure (I) est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène, de préférence le diméthylsulfure.
13. Utilisation d’une enzyme oxydoréductase, de préférence une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence encore une Cyclohexanone Monooxygénase (CH MO) pour l’oxydation d’un sulfure symétrique en sulfone symétrique.
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