WO2021181029A1 - Procédé chimio-enzymatique de coproduction d'un disulfure et d'un sulfoxyde ou d'une sulfone - Google Patents

Procédé chimio-enzymatique de coproduction d'un disulfure et d'un sulfoxyde ou d'une sulfone Download PDF

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WO2021181029A1
WO2021181029A1 PCT/FR2021/050362 FR2021050362W WO2021181029A1 WO 2021181029 A1 WO2021181029 A1 WO 2021181029A1 FR 2021050362 W FR2021050362 W FR 2021050362W WO 2021181029 A1 WO2021181029 A1 WO 2021181029A1
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WO
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enzyme
mercaptan
organic compound
disulfide
group
Prior art date
Application number
PCT/FR2021/050362
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English (en)
Inventor
Georges Fremy
Hugo BRASSELET
Jean-Christophe LEC
Véronique ALPHAND
Katia DUQUESNE
Original Assignee
Arkema France
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite D'aix-Marseille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C315/00—Preparation of sulfones; Preparation of sulfoxides
    • C07C315/02—Preparation of sulfones; Preparation of sulfoxides by formation of sulfone or sulfoxide groups by oxidation of sulfides, or by formation of sulfone groups by oxidation of sulfoxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C315/00—Preparation of sulfones; Preparation of sulfoxides
    • C07C315/06—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C315/00—Preparation of sulfones; Preparation of sulfoxides

Definitions

  • the present invention relates to a chemo-enzymatic process for the co-production of disulfide and sulfoxide or sulfone from mercaptan and sulfide respectively, as well as a composition allowing in particular the implementation of this process.
  • the present invention also relates to the use of a mercaptan for the reduction of a disulfide bridge formed between two equivalents of an organic compound carrying at least one thiol group, and more particularly the use of a mercaptan as as a substrate for the regeneration of an enzymatic cascade allowing the oxidation of sulphides.
  • Mercaptans are of great industrial interest and are now widely used by the chemical industries, in particular as raw materials for the synthesis of more complex organic molecules.
  • methylmercaptan (CH 3 SH) is used as a raw material in the synthesis of methionine, an essential amino acid used in animal feed.
  • Methylmercaptan is also used in the synthesis of dialkyl disulphides, in particular in the synthesis of dimethyl disulphide (DMDS), a sulphurization additive of hydrotreatment catalysts of petroleum fractions, among other applications.
  • DMDS dimethyl disulphide
  • mercaptans can also be done from halogenated derivatives and alkali, alkaline earth or ammonium hydrosulphides according to equation (3) (example given with a chlorinated derivative and a sodium hydrosulphide):
  • dimethyl sulfide can be used as a food flavoring or as an anti-coking agent in the steam cracking of petroleum feedstocks.
  • the demand in these markets is much lower than the produced quantities of sulphides.
  • Sulfides can also be converted to the corresponding mercaptans by the sulfhydrolysis reaction. Nevertheless, the conditions required to carry out this reaction are relatively severe and generate new side reactions. This industrial application is therefore limited.
  • sulphide oxidations can be catalyzed during so-called biological processes, by enzymatic catalysis in solution or in organisms, generally microorganisms.
  • the cofactors are generally not added in stoichiometric quantities in enzymatic industrial processes.
  • Different approaches have been developed in order to recycle them and regenerate the resulting enzymatic cascades: the use of a molecule similar to the cofactor. This approach consists in using molecules that are simpler and therefore less expensive.
  • it does not make it possible to obtain an enzyme / cofactor affinity high enough to consider industrial application and constitutes an unbearable cost for industrial processes for the production of low added value products; the use of enzymatic redox systems with the use of a sacrificial substrate.
  • These techniques generally require the use of a second enzyme which recycles the cofactor used.
  • the cost of the sacrificial substrate strongly impacts the economic viability of such a process. This is particularly true in the case of the oxidation of sulfide to sulfoxide or sulfone with low added value; the use of whole cells. In this case, it is the cellular machinery that regenerates the cofactor (s) used.
  • the process is then similar to fermentation processes: additions of carbonaceous / hydrogenated molecules (such as glucose or glycerol) are generally carried out to improve the performance of this system, which represents an additional cost.
  • the object of the present invention is to meet all or part of the above needs.
  • the present invention aims to provide a regeneration route (or recycling route) of the cofactor used for the enzymatic oxidation of sulfides to sulfoxides or sulfones.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the chemo-enzymatic co-production of sulfoxide or sulfone and disulfide.
  • Another objective of the present invention is to provide an industrially viable process for the chemo-enzymatic co-production of sulfoxide or sulfone and disulfide, integrating in particular a simple, efficient and economical way of recycling the cofactors.
  • Another objective of the invention is to provide a process for upgrading the sulphides produced during the production of mercaptans, more specifically methylmercaptan.
  • the present inventors have discovered a chemo-enzymatic process for the production of sulfoxide or sulfone, preferably selective, incorporating a recycling system of the enzyme cofactor catalyzing the oxidation of sulfides, with added value.
  • chemo-enzymatic cascade which is not only compatible with the process for producing sulfoxide or sulfone but which also makes it possible to co-produce a second product of interest, disulfide, instead of 'use a sacrificial substrate.
  • disulfide instead of 'use a sacrificial substrate.
  • it is the oxidation of a mercaptan to disulfide at the end of the cascade that will allow the cofactor used in the sulfoxidation to be recycled.
  • the enzymatic cascade according to the invention takes place in particular as follows.
  • enzyme E catalyzing the oxidation of sulfide to sulfoxide or sulfone
  • enzyme D catalyzing the formation of a disulfide bridge between two equivalents of an organic compound carrying at least one thiol group (hereinafter enzyme D) and of this organic compound:
  • a dimer is formed by a disulfide bridge between two equivalents of said organic compound (the organic compound changes from its reduced “monomer” form to its oxidized “dimer” form).
  • organic compound is meant a compound of formula R-SH and by “dimer” of this compound, a compound of formula RSSR (a well-known example is glutathione G-SH in dimeric form GSSG called glutathione disulfide).
  • the mercaptans can be used in stoichiometric amounts relative to the sulphides.
  • a sulfoxide equivalent two equivalents of mercaptans are used and for the formation of a sulfone equivalent, four equivalents of mercaptans are used.
  • the enzymatic cascade is functional until exhaustion of substrates, reagents or cofactors or else by inhibition, inactivation or destruction of the enzymes E and / or D.
  • This cascade allows a co-production of sulfoxide or sulfone and disulfide, while regenerating the cofactor and the organic compound used.
  • sulphides are by-products as mentioned above. Thanks to the invention, these sulphides are oxidized to sulphoxides or sulphones, preferably selectively, and the mercaptans produced can in part be used to regenerate the cofactors used during the sulphoxidation; while themselves being transformed into disulfides, other products of interest.
  • the present invention relates to a process for the co-production of a disulfide and a sulfoxide or a sulfone comprising the following steps: a) preparation of a composition M comprising:
  • step b) reduction of said dimer obtained in step b) by reaction, in particular by chemical reaction, with a mercaptan in order to obtain:
  • step b said mercaptan may be added in any of steps a), b) or c), preferably the mercaptan is added in step a).
  • (Ci-C 2 o) alkyl designates saturated aliphatic hydrocarbons, which can be linear or branched and comprise from 1 to 20 carbon atoms. Preferably, the alkyls comprise from 1 to 12 carbon atoms, or even from 1 to 4 carbon atoms. Mention may be made, for example, of methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl or tert-butyl.
  • branched is meant that an alkyl group is substituted on the main alkyl chain.
  • (C 2 -C 2 o) alkenyl denotes an alkyl as defined above, comprising at least one carbon-carbon double bond.
  • (C 2 -C 20 ) alkynyl denotes an alkyl as defined above, comprising at least one carbon-carbon triple bond.
  • (C 6 -Cio) aryl denotes monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic hydrocarbon compounds, in particular phenyl and naphthyl.
  • (C 3 -Cio) cycloalkyl denotes saturated aliphatic hydrocarbons comprising from 3 to 10 carbon atoms, monocyclic or bicyclic, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • (C 3 -Cio) heterocycloalkane is understood to mean a cycloalkane comprising from 3 to 10 carbon atoms and comprising at least one sulfur atom, preferably tetrahydrothiophene, and optionally at least one other heteroatom.
  • (C -Cio) heteroarene is understood to mean an arene comprising between 4 and 10 carbon atoms and comprising at least one sulfur atom, for example thiophene, and optionally at least one other heteroatom.
  • heteroatom is understood to mean in particular an atom chosen from O, N, S, Si, P and halogens.
  • catalyst is generally understood to mean a substance which accelerates a reaction and which is found unchanged at the end of this reaction.
  • said enzyme E catalyzes the oxidation reaction of sulfides to sulfoxides or to sulfones.
  • said enzyme D catalyzes the formation of a disulfide bridge between two equivalents of said organic compound carrying at least one thiol group to form a dimer.
  • catalytic amount is meant in particular an amount sufficient to catalyze a reaction, in particular to catalyze the oxidation of sulfides to sulfoxides or sulfones and / or to form a disulfide bridge. More particularly, a reagent used in a catalytic amount is used in a smaller amount, for example between about 0.01% and 20% by weight, relative to the amount by weight of a reagent used in a stoichiometric proportion.
  • the selectivity of a reaction generally represents the number of moles of product formed relative to the number of moles of reagent consumed following the reaction.
  • the term "selective process for the preparation of sulfoxides” is understood to mean in particular a process consuming sulfides and producing sulfoxides, without formation of sulfones (or with formation of a negligible amount of sulfones).
  • the oxidation reaction of sulfides to sulfoxides is chemoselective.
  • selective process for preparing sulfones is understood to mean in particular a process consuming sulfides and producing sulfones, without formation of sulfoxides (or with formation of a negligible amount of sulfoxides).
  • the oxidation reaction of sulfides to sulfones is chemoselective.
  • step b makes it possible to obtain a selectivity of between 95% and 100%, preferably between 99% and 100% for sulfoxides or sulfones.
  • the present invention relates to a process for the co-production of a disulfide and a sulfoxide or a sulfone comprising the following steps: a) preparation of a composition M comprising:
  • step b) reduction of the dimer obtained in step b) by reaction with a mercaptan of formula R 3 - SH in order to obtain:
  • step b said mercaptan being able to be added during any one of steps a), b) or c), preferably the mercaptan is added in step a); with Ri, R 2 and R 3 as defined below.
  • the sulfide is dimethylsulfide
  • the organic compound carrying at least one thiol group is glutathione
  • the enzyme E is a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO), preferably a Cyclohexanone Monooxygenase (CHMO);
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • CHMO Cyclohexanone Monooxygenase
  • the method according to the invention comprises in particular a step of carrying out the enzymatic reaction of oxidation of the sulfide to sulfoxide or to sulfone, said reaction preferably being selective.
  • said composition M always comprises an amount of sulfide sufficient for the enzyme E to convert the sulfide into sulfoxide, preferably without formation of sulfone.
  • the sulphide is provided in excess in the composition M.
  • the amount of sulphide remaining after step b) of carrying out the enzymatic reaction E can be between 0.0001% and 99.9% by weight, preferably between 0.1% and 99% by weight. , preferably between 1% and 50% by weight, for example between 1% and 10% by weight, relative to the amount of starting sulphide by weight, that is to say of step a).
  • the step of carrying out the enzymatic oxidation reaction can in particular comprise the following two steps: b1) total oxidation of the sulphide to sulphoxide; b2) oxidation of sulfoxide to sulfone.
  • total oxidation of the sulphide means the fact that the sulphide is completely consumed during step b1).
  • the sulphide is the limiting reagent (ie present in default) in the composition M.
  • completely consumed is meant in particular that the quantity of sulphide remaining after step b) of carrying out the enzymatic reaction may be between 0% and 20% by weight, preferably between 0% and 5% by weight, for example between 0% and 1% by weight, and even more preferably between 0% and 0.01% by weight relative to the starting quantity of sulphide by weight, that is to say from step a).
  • steps b) and c) or steps a), b) and c) are carried out in one and the same reactor; more preferably steps b) and c) take place simultaneously.
  • step a) the addition of the various components of composition M can be done in any order, for example by simply mixing the various components in any order.
  • Composition M can be prepared before introduction into the reactor or directly into the reactor (where step b) and optionally step c) takes place.
  • step b) the enzymatic reaction of sulfide oxidation can be carried out before or at the same time as the enzymatic reaction of formation of the disulfide bridge.
  • step b) the dimer of the organic compound obtained is in oxidized form while in step c) the organic compound is in reduced form.
  • Step b) can in particular be broken down into several steps which are as follows: i) carrying out the enzymatic reaction of oxidation of the sulfide with the enzyme E in order to obtain: a sulfoxide or a sulfone; and the cofactor common to enzymes E and D in oxidized form; ii) carrying out the enzymatic reaction for the formation of a disulfide bond with the enzyme D in order to obtain:
  • Step i) can be performed before or at the same time as step ii).
  • Step b) of carrying out the enzymatic reactions can be carried out at a pH of between 4 and 10, preferably between 6 and 8 and even more preferably between 7 and 8, for example 7.
  • Step b) of carrying out the enzymatic reactions can be carried out at a temperature between 5 ° C and 100 ° C, preferably between 20 ⁇ and 80 ° C and even more preferably between 25 ° C and 40 ° C.
  • the cells as defined below can be used in step b) directly in the absence of any treatment.
  • Step c) can be carried out under the same conditions, in particular at the same pH and at the same temperature, as step b).
  • the pressure used for said enzymatic reactions and / or step c) can range from reduced pressure relative to atmospheric pressure to several bars (several hundred kPa), depending on the reagents used and the equipment used.
  • the method according to the invention comprises a step b ′), between step b) and step c), stopping the enzymatic reactions by inactivation of the enzyme (s) E and / or D.
  • This step b ') can be carried out by known means such as thermal shock (for example with a temperature of about 100 ° C) or osmotic, the application of a high pressure, the addition of a solvent allowing either to destroy and / or to precipitate the cells and / or the enzymes E and / or D, the modification of the pH (either a low pH of approximately 2, or a high pH of approximately 10).
  • the sulfide and / or the mercaptan and / or optionally said oxidant can be added continuously, preferably in step a).
  • the sulfoxide or the sulfone and or the disulfide can be recovered in liquid or solid form.
  • the sulfoxide or the sulfone and / or the disulfide can be recovered in aqueous solution, in liquid form by decantation, or even in solid form by precipitation depending on their solubility.
  • the disulfide can be extracted in an organic phase or separated from the reaction medium by techniques well known to those skilled in the art; for example by distillation after ultrafiltration or centrifugation.
  • the products obtained can optionally be purified according to conventional methods.
  • a distillation can make it possible to separate the sulfoxide or the sulfone and disulfide. This distillation can be carried out at atmospheric pressure, reduced pressure (for example under vacuum), or under higher pressure if a person skilled in the art sees an interest in it.
  • a membrane separation can also be considered to reduce the water content of the mixture to be distilled or to accelerate a crystallization process. If the sulfoxide or the sulfone and / or the sulfide has been recovered by decanting an aqueous reaction medium, drying over a molecular sieve (or any other drying method) can be considered.
  • Said process can be carried out in batch or continuously.
  • the advantages provided by the process of the invention are numerous. Among these advantages, mention may be made of the possibility of working in aqueous solution, under very mild temperature and pressure conditions and under pH conditions close to neutrality. All of these conditions are typical of a so-called “green” or “sustainable” biocatalytic process.
  • Composition M can include the organic compound, the enzyme E, the enzyme D and the cofactor in a catalytic amount.
  • Composition M can comprise:
  • the mercaptan / sulphide molar ratio is between 0.1 and 100, more preferably between 1 and 5 and more preferably between 2 and 4, for example 2.
  • sulphide is understood in particular to mean an organic sulphide, ie any organic compound comprising at least one function of -C-S-C- type.
  • composition M comprises at least one sulphide. It can for example comprise one, two or more different sulphides.
  • Said sulphide may be symmetrical, that is, the sulfur atom represents a center of symmetry with respect to the compound.
  • said sulphide is of the following general formula:
  • Ri and R 2 may be the same or different and are chosen independently of one another from the group consisting of:
  • R 1 and R 2 form a ring with the sulfur atom to which they are attached, preferably a (C 3 -Cio) heterocycloalkane or (C -Cio) heteroarene group; said alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups possibly being optionally substituted by one or more substituent (s); and said alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl and aryl groups possibly comprising one or more heteroatom (s).
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups may optionally be substituted by one or more substituent (s) chosen from the group consisting of:
  • function (s) chosen, in a nonlimiting manner and by way of examples, from alcohol, aldehyde, ketone, acid, amide, nitrile, ester functions or else carrier functions sulfur, phosphorus and silicon.
  • said alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkane and heteroarene groups may optionally be substituted by one or more substituent (s) chosen from the group consisting of: (Ci-C 20 ) alkyl, (C 3 - Cio) cycloalkyl, (C 6 -C 10 ) aryl, -OH, -C (0) 0H, -C (0) H, -C (0) -NH 2 , -NH 2 , -NHR, -NRR ', -C (O) -, -C (0) -NHR', -C (0) -NRR ', -COOR and -CN; in which R and R 'represent, independently of one another, a (Cr C 20 ) alkyl group.
  • R 1 and R 2 can be identical or different and are chosen independently of one another from the group consisting of:
  • R 1 and R 2 are chosen from (Ci-C 20 ) alkyl or R 1 and R 2 together with the sulfur atom which carries them form a (C 3 -Ci 0 ) heterocycloalkane.
  • the radicals R 1 and R 2 of said sulphide are preferably identical (ie thus forming a symmetrical sulphide).
  • the sulfide is chosen from dimethylsulfide, diethylsulfide, dipropylsulfide, dibutylsulfide, dioctylsulfide, didodecylsulfide, and tetrahydrothiophene.
  • the sulfide can be chosen from dimethylsulfide, diethylsulfide, di-n-propylsulfide, di-iso-propylsulfide, di-n-butylsulfide, di-iso-butylsulfide, di-sec-butylsulfide, di- tert-butylsulfide, di-n-octylsulfide, di-n-dodecylsulfide, and tetrahydrothiophene.
  • Dimethylsulfide is particularly preferred according to the invention.
  • the sulphide is symmetrical.
  • mercaptan is understood to mean in particular an organic mercaptan, or any organic compound comprising at least one function of -C-SH type.
  • the mercaptan is of general formula R 3 -SH, in which R 3 is a hydrocarbon radical, saturated, linear, branched or cyclic, optionally substituted.
  • the mercaptan is of general formula R 3 -SH, in which R 3 is a saturated, linear, branched or cyclic hydrocarbon radical, optionally substituted by at least one group chosen from the group consisting of:
  • the mercaptan is of general formula R 3 -SH, in which R 3 is a hydrocarbon radical, saturated, linear, branched or cyclic, optionally substituted by at least one, for example one or two, group (s) chosen ( s) from the group consisting of: -OH, -C (0) 0H, -NH 2 and (C 6 -Cio) aryl; more preferably -OH, -C (0) 0H and -NH 2 .
  • R 3 is more particularly chosen from the group consisting of methyl, ethyl, octyl and dodecyl, preferably R 3 is methyl.
  • the mercaptan can be selected from the group consisting of: mercaptoethanol, methylmercaptan, ethylmercaptan, propylmercaptan, butylmercaptan, octylmercaptan, dodecylmercaptan, benzyl mercaptan, thioglycolic acid, 3-mercaptopropionic acid, cysteine and homocysteine.
  • the mercaptan is chosen in particular from the group consisting of: mercaptoethanol, methylmercaptan, ethylmercaptan, n-propyl mercaptan, isopropylmercaptan (or 2-propanethiol), n-butylmercaptan, sec-butylmercaptan, tert-butylmercaptan, n-octyl tert-mercaptan, - octylmercaptan, n-dodecyl mercaptan, tert-dodecylmercaptan, benzyl mercaptan, thioglycolic acid, 3-mercaptopropionic acid, cysteine and homocysteine.
  • the mercaptan is methylmercaptan.
  • oxidant any compound capable of oxidizing a sulfide to a sulfoxide or to a sulfone.
  • the oxidant can be selected from the group consisting of air, oxygen-depleted air, oxygen-enriched air and pure oxygen.
  • air air which can be depleted or enriched in oxygen
  • it is obviously the oxygen contained in the air which is consumed during the enzymatic oxidation reaction carried out in step b) as an oxidizer.
  • composition M When the oxidant is in gaseous form, it is present in composition M as a dissolved gas.
  • the percentage of oxygen in the enriched or depleted air is chosen according to the reaction rate and the compatibility with the enzyme system in a manner known to those skilled in the art.
  • the oxidant can be in a stoichiometric amount or in excess in composition M. In excess, the sulphide present is totally consumed with the oxidant during the enzymatic reaction of oxidation of the sulphide carried out in step b) (formation of sulphone ).
  • the oxidant can be in a substoichiometric amount in composition M.
  • the sulphide present is partly consumed with the oxidant during the enzymatic reaction for the oxidation of the sulphide carried out in step b) but not completely (formation sulfoxide).
  • oxygen is transformed into water when the enzyme E used is a mono-oxygenase or completely consumed when the enzyme E is a dioxygenase.
  • the process according to the invention is particularly advantageous in terms of rejection and respect for the environment.
  • oxidizing enzyme is understood to mean in particular the enzyme E, ie an enzyme allowing the oxidation of sulfides to sulfoxides and / or sulfones and requiring the use of a cofactor.
  • Said enzyme E can be an oxidoreductase, preferably an oxidoreductase chosen from the group consisting of monooxygenases and dioxygenases, even more preferably from monooxygenases.
  • said enzyme E is a Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO).
  • BVMO Baeyer-Villiger Monooxygenase
  • the enzyme E can be a Cyclohexanone Monooxygenase (CHMO), and more particularly a Cyclohexanone-1, 2-MonoOxygenase; a Cyclopentanone Monooxygenase (CPMO), more particularly a cyclopentanone 1, 2-monooxygenase; or a hydroxyacetophenone monooxygenase (HAPMO) and more particularly a 4-hydroxyacetophenone monooxygenase.
  • CHMO Cyclohexanone Monooxygenase
  • CPMO Cyclopentanone Monooxygenase
  • HAPMO hydroxyacetophenone monooxygenase
  • Cyclohexanone-1, 2-Monooxygenases are in particular of class EC 1 .14.13.22.
  • the CHMO is a CHMO of Acinetobacter sp. (for example of strain NCIMB 9871) and / or a CHMO encoded by the chnB gene belonging to the cluster AB006902.
  • Cyclopentanone 1, 2-Monooxygenase are in particular of class EC 1.14.13.16.
  • the CPMO is a CPMO of Comamonas sp. (for example the strain NCIMB 9872) and / or a CPMO encoded by the cpnB gene.
  • the hydroxyacetophenone monooxygenases are in particular of class EC 1.14.13.84.
  • I ⁇ ARMO is a HAPMO of Pseudomonas fluorescens. encoded by the hapE gene.
  • organic compound bearing a thiol group is understood to mean any hydrocarbon compound which may comprise heteroatoms and / or any type of known chemical function and bearing at least one —SH group (hereinafter organic compound).
  • organic compound according to the invention may comprise one or two thiol group (s) (-SH group).
  • This compound can exist in the form of a dimer, the dimer being formed by virtue of a disulfide bridge between two equivalents of said organic compound (2 R-SH give R-S-S-R).
  • the organic compound can be chosen from the group consisting of an amino acid bearing a thiol group, a peptide bearing a thiol group, mycothiol (CAS No. 192126- 76-4) and dihydrolipoic acid (no. ° CAS 462-20-4).
  • said organic compound is an amino acid bearing a thiol group or a peptide bearing a thiol group.
  • said organic compound is selected from the group consisting of: cysteine, homocysteine, glutathione, thioredoxin, mycothiol and dihydrolipoic acid.
  • the organic compound when the mercaptan according to the invention is cysteine or homocysteine, then said organic compound is different from cysteine or homocysteine (respectively). According to one embodiment, the organic compound and the mercaptan are different.
  • said organic compound is selected from the group consisting of: cysteine, homocysteine, glutathione and thioredoxin.
  • said organic compound is glutathione.
  • the glutathione (GSH) / glutathione disulfide (GSSG) couple is widely known in biology. This species in reduced (glutathione) or oxidized (glutathione disulfide) form forms an important redox couple in cells.
  • Enzyme D catalyzes the formation of a disulfide bridge between two equivalents of said organic compound to form a dimer (referred to as a or the dimer in the description). In particular, it catalyzes the formation of a disulfide bridge between two equivalents of an amino acid carrying a thiol group or between two equivalents of a peptide carrying a thiol group to form an amino diacid or a dipeptide.
  • Enzyme D can be defined as a "recycling enzyme" of the reduced or oxidized common cofactor, preferably it recycles the oxidized common cofactor into a reduced common cofactor.
  • It can be a reductase or a dehydrogenase, preferably it can be chosen from the group consisting of glutathione reductase, thioredoxin reductase, cysteine reductase, homocysteine reductase, mycothiol disulfide reductase and dihydrolipoyl dehydrogenase. More particularly, the enzyme D is chosen from the group consisting of glutathione reductase, thioredoxin reductase, cysteine reductase and homocysteine reductase.
  • Glutathione reductase can be represented by the enzyme classification numbers EC 1.8.1.7 or EC 1.6.4.2; cysteine reductase with the number EC 1 .8.1.6; thioredoxin reductase with the numbers EC 1.8.1 .9 or EC 1 .6.4.5; mycothione reductase with EC number 1.8.1.15 (this enzyme is also called mycothiol-disulfide reductase).
  • said enzyme D is glutathione reductase.
  • each organic compound is coupled with the corresponding D enzyme, thereby forming the corresponding dimer.
  • the following organic compound / enzyme D pairs or enzymatic complexes are therefore particularly useful for carrying out the process according to the invention:
  • cofactor is understood to mean in particular a cofactor necessary for the catalytic activity of the enzyme E and of the enzyme D as defined above and / or making it possible to improve their catalytic activity.
  • cofactor common to the enzymes E and D is preferably understood to mean a cofactor which can be reduced and / or oxidized by the action of these enzymes.
  • one, two or more cofactors are present in composition M.
  • Said cofactor can be chosen from nicotinic cofactors and flavinic cofactors.
  • said cofactor can be chosen from the group consisting of: nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD) and / or their form corresponding reduced (i.e. NADH, H + NADPH, H +, FMNH 2 , FADH 2 ).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • FMN flavin mononucleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the cofactors listed above are advantageously used in their reduced forms (for example NADPH, H +) and / or their oxidized forms (for example NADP +), that is to say they can be added in these reduced and / or oxidized forms in composition M, preferably in reduced form.
  • their reduced forms for example NADPH, H +
  • oxidized forms for example NADP +
  • the enzyme E used is Cyclohexanone Monooxygenase, for example Cyclohexanone Monooxygenase from Acinetobacter sp.
  • the cofactor used is NADP, optionally supplemented with FAD and the enzyme D is glutathione reductase.
  • Composition M according to the invention can also comprise:
  • solvents chosen from water, buffers such as phosphate buffers, Tris-HCl, Tris-base, ammonium bicarbonate, ammonium acetate, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 acid -piperazine ethanesulfonic), CHES (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), or salts such as sodium chloride, potassium chloride, or mixtures thereof;
  • buffers such as phosphate buffers, Tris-HCl, Tris-base, ammonium bicarbonate, ammonium acetate, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 acid -piperazine ethanesulfonic), CHES (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), or salts such as sodium chloride, potassium chloride, or mixtures thereof;
  • additives such as surfactants, in particular in order to promote the solubility of one or more reagent (s) or substrate (s) of the enzymatic reaction.
  • composition M is an aqueous solution.
  • said composition M comprises between 50% and 99% by weight of water, preferably between 80% and 97% by weight of water relative to the total weight of composition M.
  • composition M is considered to be the reaction mixture.
  • the various components of composition M prepared in step a) above are easily accessible commercially or can be prepared according to techniques well known to those skilled in the art. These various elements can be in solid, liquid or gaseous form and can very advantageously be dissolved or dissolved in water or any other solvent to be used in the process of the invention.
  • the enzymes used can also be grafted onto a support (case of supported enzymes).
  • the enzymes E and / or D, optionally the organic compound and optionally the common cofactor are:
  • the ratio [sulphide] (in mmol / L) / [cells] (in g cps .L -1 ) can be between 0.01 and 10, preferably between 0.01 and 3 mmol / g cps , preferably during step b) of carrying out the enzymatic reaction.
  • the determination of the mass concentration in grams of dry cells is carried out according to standard techniques.
  • the E and / or D enzymes may or may not be overexpressed in said cells, hereinafter called host cells.
  • the host cell can be any suitable host for the production of an E and / or D enzyme from the expression of the corresponding coding gene. This gene can then be found either in the genome of the host, or carried by an expression vector such as those defined below.
  • the term “host cell” is understood to mean in particular a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • Host cells commonly used for the expression of recombinant or non-recombinant proteins include in particular cells of bacteria such as Escherichia coli or Bacillus sp., Or Pseudomonas, yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris, cells of fungi such as Aspergillus niger, Penicillium funiculosum or Trichoderma reesei, insect cells such as Sf9 cells, or even mammalian cells (in particular human) such as the HEK 293, PER-C6 or CHO cell lines.
  • Said host cells may be in the stationary phase of growth, for example having left the culture medium.
  • the enzymes E and or D, optionally the organic compound and optionally the common cofactor are expressed in the bacterium Escherichia coli.
  • the CHMO and / or I ⁇ ARMO is expressed inside a strain of Escherichia coli such as, for example, Escherichia coli BL21 (DE3).
  • the transformation of prokaryotic and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art, for example by lipofection, electroporation, heat shock, or by chemical methods.
  • the expression vector and the method of introducing the expression vector into the host cell are selected depending on the chosen host cell.
  • a transformed cell expressing a gene encoding a recombinant enzyme E and or D is obtained. It can be cultivated, in a culture / incubation step, to produce the enzyme E and / or D.
  • the incubation / culture of prokaryotic and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art who can determine, for example, the culture medium or also the time and temperature conditions.
  • an induction period - corresponding to an increased production of the enzyme E and or D - can be observed.
  • a weak inducer such as for example arabinose for the vector pBad
  • strong such as for example isopropyl bDl-thiogalactoside (IPTG) for the vectors pET22b, pRSF, etc.
  • IPTG isopropyl bDl-thiogalactoside
  • the SDS-PAGE electrophoresis technique or the Western blot technique can be used.
  • expression vector is understood to mean a DNA molecule of reduced size into which it is possible to insert a nucleotide sequence of interest. It is possible to choose between several known expression vectors such as plasmids, cosmids, phages, etc. The vector is chosen in particular as a function of the cellular host used.
  • the nucleotide sequence encoding the enzyme E and / or D can be integrated into the genome of the host cell by any known method such as, for example, homologous recombination or even the CRISPR-Cas9 system, etc.
  • the SDS-PAGE electrophoresis technique or the Western blot technique can be used.
  • a step of isolation and possibly purification of the enzyme E and / or D can be carried out.
  • the method according to the invention is not carried out in the presence of the host cells but by the enzyme E and / or D in solution in composition M, preferably in aqueous solution.
  • the isolation and / or purification of said enzyme E and or D produced can be carried out by any means known to those skilled in the art. It may for example be a technique chosen from electrophoresis, molecular sieving, ultracentrifugation, differential precipitation, for example with ammonium sulphate, ultrafiltration, membrane or gel filtration, exchange of water. ions, separation by hydrophobic interactions, or affinity chromatography, for example of the IMAC type.
  • the cell lysate can be obtained according to various known techniques such as sonication, pressure (French press), via the use of chemical agents (eg . triton) etc ...
  • the lysate obtained corresponds to a crude extract of crushed cells.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising:
  • the invention also relates to the use of a mercaptan for the regeneration or recycling of a cofactor (enzymatic cofactor, in particular as defined above), preferably of a cofactor used in the enzymatic oxidation of a. sulfide.
  • a cofactor enzymatic cofactor, in particular as defined above
  • cofactor used in the enzymatic oxidation of a. sulfide.
  • regeneration or “recycling” is meant in particular the change from an oxidized form to a reduced form of the cofactor or vice versa.
  • the present invention also relates to the use of a mercaptan for the reduction of a disulfide bridge formed between two equivalents of an organic compound carrying at least one thiol group, said mercaptan preferably being converted into the corresponding disulfide.
  • said disulfide bridge is formed by enzymatic catalysis, in particular as defined above for the enzyme D.
  • the mercaptan is methylmercaptan and the organic compound is glutathione.
  • This use of mercaptan is in particular provided as a route for regenerating or recycling a cofactor, in particular a cofactor used in the enzymatic oxidation of a sulphide.
  • the invention also relates to a process for the enzymatic oxidation of a sulphide comprising a step of regeneration or recycling of a cofactor with a mercaptan.
  • the present invention also relates to a process for the reduction by a mercaptan of a disulfide bridge formed between two equivalents of an organic compound carrying at least one thiol group, said mercaptan preferably being converted into the corresponding disulfide.
  • a mercaptan of a disulfide bridge formed between two equivalents of an organic compound carrying at least one thiol group, said mercaptan preferably being converted into the corresponding disulfide.
  • the sulphide, the oxidant, the organic compound, the enzyme E, the enzyme D, the cofactor, the mercaptan, the enzymatic and chemical reactions are as defined above, in particular in the context of the process of co-production according to the invention.
  • Figure 1 represents the concentrations (in mM) of diethylsulfide (DES), of diethylsulfoxide (DESO) and of Bis (2-hydroxyethyl) disulfide (Disulfide) present in the reaction medium as a function of time (expressed in hours) , when the oxidation reaction is catalyzed by the enzyme CHMO.
  • the elements of the cascade allowing the recycling of the NADP cofactor have also been added: the cells overexpressing the glutathione reductase (GR) of E. coli were added at the same concentration as the cells expressing CHMO, oxidized glutathione (GSSG) was introduced in a catalytic amount and 2-mercaptoethanol at a double concentration relative to DES.
  • DES diethylsulfide
  • Disulfide Bis (2-hydroxyethyl) disulfide
  • Figure 2 represents the concentrations (in mM) of diethylsulfoxide (DESO), of diethylsulfone (DES0 2 ) and of Bis (2-hydroxyethyl) disulfide (Disulfide) present in the reaction medium as a function of time (expressed in hours ), when the oxidation reaction is catalyzed by the enzyme CHMO.
  • the elements of the cascade allowing the recycling of the NADP cofactor have also been added: cells overexpressing glutathione reductase (GR) d ⁇ . coli were added at the same concentration as the cells expressing CHMO, oxidized glutathione (GSSG) was introduced in a catalytic amount and 2-mercaptoethanol at a double concentration relative to DESO.
  • GR glutathione reductase
  • GSSG oxidized glutathione
  • Figure 3 shows the concentration (in mM) of diethyl sulfoxide (DESO) present in the reaction medium as a function of time (expressed in hours), when the reaction is catalyzed by the enzyme CHMO.
  • DSO diethyl sulfoxide
  • 2-mercaptoethanol was replaced by methylmercaptan (MeSH) as proton donor.
  • MeSH methylmercaptan
  • the elements of the cascade allowing the recycling of the NADP cofactor have also been added: the cells overexpressing the glutathione reductase (GR) of E.
  • coli were added at the same concentration as the cells expressing CHMO, oxidized glutathione (GSSG) was introduced in a catalytic amount and MeSH is gradually added to the reaction medium at a rate of approximately 4 mmol / L / h.
  • GSSG oxidized glutathione
  • Figure 4 is an illustration of an enzyme cascade such as according to the invention.
  • the mercaptan and the sulphide are introduced into a reaction medium comprising:
  • Glutathione or Glutathione disulphide (corresponding to the dimer or to the organic compound comprising at least one thiol group).
  • NADPH The common cofactor
  • NADPH The common cofactor, NADPH, is concomitantly with the formation of sulfoxide or sulfone, oxidized to NADP +.
  • the latter thanks to the presence of two molecules of Glutathione, is reduced again to NADPH, H +, the 2 molecules of Glutathione (2 GSH) giving Glutathione disulfide (GSSG).
  • Glutathione disulfide through a chemical equilibrium, allows 2 molecules of mercaptans to be oxidized to the corresponding disulfide, thus regenerating 2 molecules of Glutathione.
  • the following examples are given by way of illustration and are not limiting of the present invention.
  • Example 1 Selective synthesis of diethylsulfoxide from diethylsulfide via the use of 2-mercaptoethanol.
  • a strain of Escherichia coli BL21 (DE3) (sold by Merck Millipore) expressing the chnB gene inserted into the plasmid pET22b (sold by Promega, Qiagen) was constructed beforehand. It allows the heterologous expression of CycloHexanone MonoOxygenase (CHMO) from Acinetobacter sp.
  • CHMO CycloHexanone MonoOxygenase
  • said strain contains both CHMO, the cofactors of CHMO which are NADP and FAD.
  • IPTG isopropyl bDl-thiogalactoside
  • a strain of Escherichia coli BL21 (DE3) (sold by Merck Millipore) expressing the gor gene inserted on the plasmid pET26b + (sold by Promega, Qiagen) was designed according to techniques known to those skilled in the art. It allows the heterologous expression of glutathione reductase (GR) from Escherichia coli.
  • GR glutathione reductase
  • said strain contains both GR and the GR cofactor which is NADP.
  • the fresh cell pellets are taken up in 32 ml of a 0.1 mol / L phosphate buffer at pH 8.
  • the cell concentration then obtained is 62 UDO / ml or else 20 gcps / L (with CPS: cells by dry weight) for cells overexpressing CHMO and GR.
  • the reaction medium are taken and diluted in 1000 ⁇ L of an acetonitrile solution. After centrifugation (5 min, 12,500 g), the supernatant is injected in GC in order to quantitatively measure the diethylsulfoxide (DESO) and the Bis (2-hydroxyethyl) disulfide (Disulfide) formed during the reaction using a standard range beforehand. obtained. Under the conditions of the analysis carried out, the minimum concentration that can be measured is 50 pM.
  • DOSE diethylsulfoxide
  • Disulfide Bis (2-hydroxyethyl) disulfide
  • a linear increase in the amount of DESO is measured over time without the sulfone (DESO 2 ) being detected.
  • the initial sulphide oxidation rate is then 1 mmol of DES oxidized per liter of medium and per hour ( Figure 1).
  • a similar amount of Bis (2-hydroxyethyl) disulfide is produced concomitantly with the production of DESO, which attests to the correct operation of the coupled GSSG / GR system for recycling the cofactor.
  • the concentration of Bis (2-hydroxyethyl) disulfide as a function of time was determined after subtracting the background noise linked to the slow spontaneous oxidation of 2-mercaptoethanol (background noise determined in the presence of all the elements of the cascade (under the same conditions) with the exception of the cells overexpressing CHMO).
  • the reaction catalyzed by CHMO is chemoselective, since the reaction to convert DESO to DESO 2 only occurs when DES is completely consumed. In other words, the sulfone does not form when there is DES in the reaction medium.
  • the selectivity obtained is approximately 100%.
  • DES is still present in the reaction medium, the sulfone is not detected with the analytical tools used.
  • Example 2 Selective synthesis of diethylsulfone from diethylsulfoxide via the use of 2-mercaptoethanol as hydrogen donor.
  • Example 2 The same strains as those described in Example 1 were used in this example, i.e. the strains overexpressing CHMO and GR of E. coli.
  • Centrifugation is carried out (10 min, 5000 g, 4 ° C) and the pellets are then taken up in 32 mL of a 0.1 mol / L phosphate buffer, pH 8. A cell concentration of 62 UDO / mL (or approximately 20 gcps / L) of each strain is then used for the reaction assay.
  • reaction medium 200 ⁇ L of the reaction medium are taken and diluted in 1000 ⁇ L of an acetonitrile solution. After centrifugation (5 min, 12,500 g), the supernatant is injected in GC in order to quantitatively measure the diethylsulfone (DES02) and the Bis (2-hydroxyethyl) disulfide (Disulfide) formed during the reaction using a standard range obtained previously.
  • DES02 diethylsulfone
  • disulfide Bis (2-hydroxyethyl) disulfide
  • a linear increase in the quantity of DES0 2 is measured over time.
  • the initial rate of oxidation of the sulfoxide is then 0.75 mmol of DESO oxidized per liter of medium and per hour (FIG. 2).
  • a similar quantity of 2-bis (2-hydroxyethyl) disulfide is produced concomitantly with the production of DESO 2 . Therefore, the added 2-mercaptoethanol does allow the NADP cofactor to be recycled via a cascade-dependent route.
  • the background noise was deduced in the same way as in example 1.
  • Example 3 Selective synthesis of diethylsulfoxide from diethylsulfide via the use of methylmercaptan (MeSH) as hydrogen donor.
  • MeSH methylmercaptan
  • the fresh cell pellets are taken up in 200 ml of a 0.1 mol / L phosphate buffer at pH 8.
  • the cell concentration then obtained is 62 UDO / ml or else 20 gcps / L (with CPS: cells by dry weight) for cells overexpressing CHMO and GR.
  • DES diethyl sulfide
  • GSSG oxidized glutathione
  • methylmercaptan is gradually added to the reaction medium by acidification with sulfuric acid of sodium methyl mercaptan (flow rate adjusted to approximately 4 mmol / L / h).
  • pure diethylsulfide is gradually added at a rate of 40 pl_ h so as to ensure a constant concentration of DES and a bladder allows the regular addition of O 2 necessary for the conduct of the reaction.
  • the reaction is initiated with stirring at a controlled temperature of 30 ° C.
  • the reaction medium are taken and diluted in 1000 ⁇ L of an acetonitrile solution. After centrifugation (5 min, 12,500 g), the supernatant is injected in GC in order to quantitatively measure the diethylsulfoxide (DESO) and the diethylsulfone (DESO 2 ) potentially formed during the reaction using a standard range obtained previously. Under the conditions of the analysis carried out, the minimum concentration that can be measured is 50 pM.
  • DMDS Dimethyldisulphide
  • the reaction catalyzed by CHMO is chemoselective, because the reaction of transformation of DESO into DESO 2 does not occur since DES is present in the reaction medium throughout the reaction.

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Abstract

Procédé chimio-enzymatique de coproduction d'un disulfure et d'un sulfoxyde ou d'une sulfone La présente invention concerne un procédé chimio-enzymatique de coproduction de disulfure et de sulfoxyde ou de sulfone à partir d'une composition M comprenant : 1) un sulfure, 2) éventuellement un oxydant, 3) un composé organique porteur d'au moins un groupement thiol, 4) une enzyme E catalysant l'oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone, 5) une enzyme D catalysant la formation d'un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d'au moins un groupement thiol pour former un dimère, et 6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D; ainsi qu'une composition permettant notamment la mise en œuvre de ce procédé. La présente invention concerne également l'utilisation d'un mercaptan pour la réduction d'un pont disulfure formé entre deux équivalents d'un composé organique porteur d'au moins un groupement thiol, et plus particulièrement son utilisation en tant que substrat de régénération du procédé décrit ci-dessus.

Description

Procédé chimio-enzymatique de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone
La présente invention concerne un procédé chimio-enzymatique de coproduction de disulfure et de sulfoxyde ou de sulfone à partir de mercaptan et de sulfure respectivement, ainsi qu’une composition permettant notamment la mise en oeuvre de ce procédé. La présente invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la réduction d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, et plus particulièrement l’utilisation d’un mercaptan en tant que substrat de régénération d’une cascade enzymatique permettant l’oxydation des sulfures.
Les mercaptans présentent un grand intérêt industriel et sont aujourd’hui très largement utilisés par les industries chimiques, notamment comme matières premières pour la synthèse de molécules organiques plus complexes. Par exemple, le méthylmercaptan (CH3SH) est utilisé comme matière première dans la synthèse de la méthionine, acide aminé essentiel utilisé dans l’alimentation animale. Le méthylmercaptan est également utilisé dans la synthèse de disulfures de dialkyles, en particulier dans la synthèse du disulfure de diméthyle (DMDS), additif de sulfuration de catalyseurs d’hydrotraitement de coupes pétrolières, entre autres applications.
La synthèse industrielle des mercaptans, et en particulier du méthylmercaptan, se fait généralement selon un procédé connu, à partir d’alcools et de sulfure d’hydrogène à température élevée en présence d’un catalyseur selon l’équation (1) suivante :
R-OH + HzS R-SH + Hå0 (1)
Cependant, cette réaction donne lieu à la formation de sous-produits, tels que les sulfures selon l’équation (2) suivante :
R-OH ÷ R-SH - R-S-R + HzO (2)
La synthèse de mercaptans peut également se faire à partir de dérivés halogénés et de sulfhydrates alcalins, alcalinoterreux ou d’ammonium selon l’équation (3) suivante (exemple donné avec un dérivé chloré et un sulfhydrate de sodium) :
R-CI ÷ M¾Sfci R-SH + H¾Qi(3)
Cette seconde voie de synthèse conduit également à la présence de sulfures non désirés. Enfin, la synthèse de mercaptans peut se faire à partir d’oléfines et de sulfure d’hydrogène par catalyse acide ou par photochimie suivant que l’on souhaite obtenir un mercaptan ramifié ou non selon l’équation (4) suivante :
Figure imgf000003_0001
Une nouvelle fois, cette synthèse donne lieu à des sulfures en tant que sous-produits.
Ces sulfures sont obtenus en grande quantité au niveau industriel et sont principalement amenés à être détruits. Ceci représente une perte d’efficacité pour le procédé de production du mercaptan visé et un coût supplémentaire lié à leur destruction. Cette génération de déchets constitue un véritable problème industriel pour les producteurs de mercaptans qui cherchent donc à valoriser ces sous-produits. Cette valorisation peut être effectuée de différentes manières.
Les sulfures ont tout d’abord leur propre marché : le diméthylsulfure peut être utilisé en tant qu’arôme alimentaire ou en tant qu’agent anti-cokant dans le vapocraquage des charges pétrolières. Cependant, la demande dans ces marchés est très inférieure aux quantités produites de sulfures.
Les sulfures peuvent également être transformés en mercaptans correspondants par la réaction de sulfhydrolyse. Néanmoins, les conditions requises pour réaliser cette réaction sont relativement sévères et génératrices de nouvelles réactions parasites. Cette application industrielle est donc limitée.
Enfin, un autre moyen de valorisation des sulfures produits concerne les réactions d’oxydation des sulfures pour les transformer en sulfoxydes et/ou en sulfones. De telles réactions d’oxydation chimique sont bien connues. Elles font intervenir différents types d’oxydants tels que l’eau de Javel (hypochlorite de sodium), l’eau oxygénée, l’oxygène, l’ozone ou les oxydes d’azote tels que N 0 en présence de catalyseurs ou non.
Outre les oxydations chimiques, les oxydations de sulfures peuvent être catalysées lors de procédés dit biologiques, par catalyse enzymatique en solution ou dans des organismes, généralement des microorganismes.
Les demandes FR1906488 et FR1906489 décrivent respectivement un procédé sélectif de préparation de sulfoxydes ou de sulfones, à partir de sulfures organiques par catalyse enzymatique. Le contenu de ces deux demandes de brevet est intégré ici par référence dans leur intégralité.
Les procédés décrits dans ces deux demandes permettent ainsi l’obtention sélective de sulfoxyde ou de sulfone par l’utilisation d’une enzyme catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone, en fonction de la quantité de sulfure présente lors de la réaction enzymatique. Lorsque le sulfure n’est pas totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors le sulfoxyde est sélectivement obtenu. Lorsque le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors la sulfone est sélectivement obtenue. Toutefois, l’enzyme utilisée peut nécessiter l’utilisation d’un cofacteur qui doit pouvoir être recyclé (ou regénéré) pour que la réaction enzymatique d’oxydation puisse se produire à nouveau.
En effet, par leur complexité et pour des raisons économiques, les cofacteurs ne sont généralement pas ajoutés en quantités stoechiométriques dans les procédés industriels enzymatiques. Différentes approches ont ainsi été développées afin de les recycler et de régénérer les cascades enzymatiques en découlant : l’utilisation d’une molécule analogue au cofacteur. Cette approche consiste à utiliser des molécules plus simples et donc moins coûteuses. Cependant, elle ne permet pas l’obtention d’une affinité enzymes/cofacteur suffisamment élevée pour envisager une application industrielle et constitue un coût non supportable pour les procédés industriels de production de produits à faible valeur ajoutée ; l’utilisation de systèmes oxydo-réducteurs enzymatiques avec utilisation d’un substrat sacrificiel. Ces techniques nécessitent généralement l’utilisation d’une seconde enzyme qui permet de recycler le cofacteur utilisé. Cependant, le coût du substrat sacrificiel impacte fortement la viabilité économique d’un tel procédé. Ceci est vrai en particulier dans le cas de l’oxydation de sulfure en sulfoxyde ou en sulfone à faible valeur ajoutée ; l’utilisation de cellules entières. Dans ce cas, c’est la machinerie cellulaire qui régénère le ou les cofacteurs utilisés. Le procédé se rapproche alors des procédés fermentaires : des ajouts de molécules carbonées/hydrogénées (comme le glucose ou le glycérol) sont généralement réalisés pour améliorer les performances de ce système, ce qui représente un coût supplémentaire.
Il existe donc un besoin pour une voie de régénération industriellement viable des cofacteurs utilisés dans les procédés enzymatiques d’oxydation des sulfures.
Il existe également un besoin pour un procédé de valorisation des sulfures, notamment issus de la synthèse des mercaptans, qui soit industriellement et économiquement viable.
La présente invention a pour objectif de répondre en tout ou partie aux besoins ci-dessus.
En particulier, la présente invention a pour objectif de fournir une voie de régénération (ou voie de recyclage) du cofacteur utilisé pour l’oxydation enzymatique des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones.
La présente invention a également pour objectif de fournir un procédé de coproduction chimio- enzymatique de sulfoxyde ou de sulfone et de disulfure.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de coproduction chimio- enzymatique de sulfoxyde ou de sulfone et de disulfure industriellement viable, intégrant notamment une voie de recyclage des cofacteurs simple, efficace et économique. Un autre objectif de l’invention est de proposer un procédé permettant la valorisation des sulfures produits lors de la production de mercaptans, plus spécifiquement de méthylmercaptan.
Les présents inventeurs ont découvert un procédé chimio-enzymatique de production de sulfoxyde ou de sulfone, de préférence sélectif, intégrant un système de recyclage du cofacteur de l’enzyme catalysant l’oxydation des sulfures, à valeur ajoutée.
En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert une cascade chimio-enzymatique qui est non seulement compatible avec le procédé de production de sulfoxyde ou de sulfone mais qui permet aussi de coproduire un second produit d’intérêt, le disulfure, au lieu d’utiliser un substrat sacrificiel. Ainsi, c’est l’oxydation d’un mercaptan en disulfure en fin de cascade qui va permettre de recycler le cofacteur utilisé dans la sulfoxydation.
Par exemple, lorsque l’oxydant est l’oxygène, l’équation globale de la cascade peut s’écrire comme suit :
RSR’ + O2 + 2 R”SH -> RS(0) R’ + H20 + R”SSR”, pour les sulfoxydes RSR’ + 2 02 + 4 R”SH -> RS(0)2R’ + 2 H20 + 2 R”SSR”, pour les sulfones. Ainsi, on peut considérer le mercaptan comme un donneur d’hydrogène.
La cascade enzymatique selon l’invention se déroule en particulier comme suit.
En présence d’une enzyme catalysant l’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone (ci- après enzyme E), de son cofacteur et de l’oxydant éventuel, le sulfure est transformé en sulfoxyde ou en sulfone et le cofacteur réduit se retrouve sous sa forme oxydée.
Puis, en présence d’une enzyme catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol (ci-après enzyme D) et de ce composé organique :
- ledit cofacteur oxydé est réduit (et donc recyclé grâce aux atomes d’hydrogène donnés par le composé organique), et
- un dimère est formé par un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique (le composé organique passe de sa forme « monomère » réduite à sa forme « dimère » oxydée).
Ainsi, on entend selon l’invention par « composé organique », un composé de formule R-SH et par « dimère » de ce composé, un composé de formule R-S-S-R (un exemple bien connu est le glutathion G-SH sous forme dimérique G-S-S-G appelée disulfure de glutathion).
La cascade se termine alors grâce à un équilibre chimique : le dimère oxydé est réduit par réaction avec deux équivalents de mercaptan qui sont transformés en disulfure correspondant. En effet, la présence de mercaptan permet grâce un équilibre chimique régi par le principe de Le Chatelier, de : - réduire le dimère en deux équivalents de composé organique (ce dernier est donc également recyclé grâce aux atomes d’hydrogène donnés par le mercaptan) ; et
- de former un disulfure.
C’est la réaction enzymatique qui déplace l’équilibre chimique vers la formation du disulfure. Les mercaptans peuvent être utilisés en quantités stoechiométriques par rapport aux sulfures. En particulier, pour la formation d’un équivalent sulfoxyde, deux équivalents de mercaptans sont utilisés et pour la formation d’un équivalent sulfone, quatre équivalents de mercaptans sont utilisés.
La cascade enzymatique est fonctionnelle jusqu’à épuisement des substrats, réactifs ou cofacteurs ou alors par inhibition, inactivation ou destruction des enzymes E et/ou D.
Cette cascade permet une coproduction de sulfoxyde ou sulfone et de disulfure, tout en régénérant le cofacteur et le composé organique utilisés.
A noter que l’on peut très bien commencer la cascade en sens inverse : toutes les réactions précédemment décrites peuvent être inversées.
On comprend ainsi l’un des avantages de l’invention qui est de pouvoir s’insérer dans un procédé global de valorisation des sous-produits issus de la production de mercaptans et plus particulièrement de méthylmercaptan. Lors de la production de mercaptans, des sulfures sont sous-produits comme indiqué plus haut. Grâce à l’invention, ces sulfures sont oxydés en sulfoxydes ou sulfones, de préférence de façon sélective, et les mercaptans produits peuvent en partie être utilisés pour régénérer les cofacteurs utilisés lors de la sulfoxydation ; tout en étant eux-mêmes transformés en disulfures, autres produits d’intérêts.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone comprenant les étapes suivantes : a) préparation d’une composition M comprenant :
1) un sulfure,
2) éventuellement un oxydant,
3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,
4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère, et
6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; b) conduite, de préférence de façon simultanée, des réactions enzymatiques d’oxydation du sulfure et de formation du pont disulfure afin d’obtenir :
- un sulfoxyde ou une sulfone ; et
- un dimère (dudit composé organique) ; c) réduction dudit dimère obtenu à l’étape b) par réaction, notamment par réaction chimique, avec un mercaptan afin d’obtenir :
- le disulfure correspondant (au mercaptan) ; et
- ledit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol ; et d) éventuelle récupération :
- du disulfure obtenu à l’étape c) ; et/ou
- du sulfoxyde ou de la sulfone obtenu(e) à l’étape b) ; ledit mercaptan pouvant être ajouté lors de l’une quelconque des étapes a), b) ou c), de préférence le mercaptan est ajouté à l’étape a).
Définitions
Le terme « (Ci-C2o)alkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés, qui peuvent être linéaires ou ramifiés et comprennent de 1 à 20 atomes de carbone. De préférence, les alkyles comprennent de 1 à 12 atomes de carbone, voire de 1 à 4 atomes de carbone. On peut citer par exemple le méthyle, l’éthyle, le n-propyle, l’isopropyle, le n-butyle, l’isobutyle, le sec-butyle ou le tert-butyle. Par « ramifié », on entend qu’un groupement alkyle est substitué sur la chaîne alkyle principale.
Le terme « (C2-C2o)alcényle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une double liaison carbone-carbone.
Le terme « (C2-C20)alcynyle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone.
Le terme « (C6-Cio)aryle » désigne des composés aromatiques hydrocarbonés monocycliques, bicycliques ou tricycliques, en particulier le phényle et le naphtyle.
Le terme « (C3-Cio)cycloalkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, monocycliques ou bicycliques tels que le cyclopropyle, le cyclobutyle, le cyclopentyle ou le cyclohexyle.
On entend par « (C3-Cio)hétérocycloalcane », un cycloalcane comprenant de 3 à 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, de préférence le tétrahydrothiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.
On entend par « (C -Cio)hétéroarène », un arène comprenant entre 4 et 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, par exemple le thiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.
On entend notamment par hétéroatome, un atome choisi parmi O, N, S, Si, P et les halogènes. On entend généralement par « catalyseur » une substance accélérant une réaction et qui se retrouve inchangée à la fin de cette réaction. Selon un mode de réalisation, ladite enzyme E catalyse la réaction d’oxydation des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones. Selon un mode de réalisation, ladite enzyme D catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère.
Par « quantité catalytique », on entend notamment une quantité suffisante pour catalyser une réaction, en particulier pour catalyser l’oxydation des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones et/ou pour former un pont disulfure. Plus particulièrement, un réactif utilisé en quantité catalytique est utilisé en plus petite quantité, par exemple entre environ 0,01% et 20% en poids, par rapport à la quantité en poids d’un réactif utilisé en proportion stoechiométrique.
La sélectivité d’une réaction représente généralement le nombre de moles de produit formé par rapport au nombre de moles de réactif consommé suite à la réaction.
Les définitions usuelles de la conversion, de la sélectivité et du rendement sont les suivantes : Conversion = (nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction) / (Nombre de moles de réactif à l’état initial)
Sélectivité = Nombre de moles de réactif converti en produit souhaité / (Nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction)
Rendement = Conversion X Sélectivité
Ainsi, on entend notamment par « procédé sélectif de préparation de sulfoxydes », un procédé consommant des sulfures et produisant des sulfoxydes, sans formation de sulfones (ou avec formation d’une quantité négligeable de sulfones). Selon un mode de réalisation, la réaction d’oxydation des sulfures en sulfoxydes est chimiosélective.
On entend notamment par « procédé sélectif de préparation de sulfones », un procédé consommant des sulfures et produisant des sulfones, sans formation de sulfoxydes (ou avec formation d’une quantité négligeable de sulfoxydes). Selon un mode de réalisation, la réaction d’oxydation des sulfures en sulfones est chimiosélective.
Par exemple, le procédé selon l’invention, en particulier l’étape b), permet d’obtenir une sélectivité comprise entre 95% et 100%, de préférence entre 99% et 100% pour les sulfoxydes ou les sulfones.
On considère notamment que la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère correspond à la formation d’un pont disulfure entre deux molécules dudit composé organique (soit 2 R- SH donnent R-S-S-R).
Procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone comprenant les étapes suivantes : a) préparation d’une composition M comprenant :
1) un sulfure de formule R1-S-R2,
2) éventuellement un oxydant, 3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,
4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère, et
6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; b) conduite, de préférence de façon simultanée, des réactions enzymatiques d’oxydation du sulfure et de formation du pont disulfure afin d’obtenir :
- un sulfoxyde ou une sulfone de formule RrS(0)n-R2, avec n = 1 ou 2 ; et un dimère ; c) réduction du dimère obtenu à l’étape b) par réaction avec un mercaptan de formule R3- SH afin d’obtenir :
- un disulfure de formule R3-S-S-R3; et
- ledit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol; et d) éventuelle récupération :
- du disulfure obtenu à l’étape c) ; et/ou
- du sulfoxyde ou de la sulfone obtenu(e) à l’étape b) ; ledit mercaptan pouvant être ajouté lors de l’une quelconque des étapes a), b) ou c), de préférence le mercaptan est ajouté à l’étape a) ; avec Ri, R2 et R3 tels que définis ci-après.
Selon un mode de réalisation préféré :
- le sulfure est le diméthylsulfure ;
- le composé organique porteur d’au moins un groupement thiol est le glutathion ;
- l’enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO) ;
- l’enzyme D est une glutathion reductase ; et
- le cofacteur commun aux deux enzymes E et D est le NADP.
Production d’un sulfoxyde ou d’une sulfone
Le procédé selon l’invention comprend notamment une étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone, ladite réaction étant de préférence sélective.
Dans un premier mode de réalisation, lorsque le sulfure n’est pas totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors le sulfoxyde est sélectivement obtenu. Ainsi, selon un mode de réalisation, ladite composition M comprend toujours une quantité de sulfure suffisante pour que l’enzyme E transforme le sulfure en sulfoxyde, de préférence sans formation de sulfone. Selon un mode de réalisation, le sulfure est fourni en excès dans la composition M. Dans ce cas, la quantité de sulfure restant après l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique E peut être comprise entre 0,0001% et 99,9% en poids, de préférence entre 0,1% et 99% en poids, de préférence entre 1% et 50% en poids, par exemple entre 1% et 10% en poids, par rapport à la quantité de sulfure de départ en poids, c’est-à-dire de l’étape a).
Dans un second mode de réalisation, lorsque le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors la sulfone est sélectivement obtenue. Ainsi, l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation peut notamment comprendre les deux étapes suivantes : b1) oxydation totale du sulfure en sulfoxyde ; b2) oxydation du sulfoxyde en sulfone.
On entend par « oxydation totale du sulfure », le fait que le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape b1 ). Selon un mode de réalisation, le sulfure est le réactif limitant (i.e. présent en défaut) dans la composition M. Par « totalement consommé », on entend notamment que la quantité de sulfure restant après l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique peut être comprise entre 0% et 20% en poids, de préférence entre 0% et 5% en poids, par exemple entre 0% et 1% en poids, et encore plus préférentiellement entre 0% et 0,01% en poids par rapport à la quantité de sulfure de départ en poids, c’est-à-dire de l’étape a).
Cette réaction est décrite dans les demandes FR1906488 pour la formation de sulfoxydes et FR1906489 pour la formation de sulfones.
Coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone
De préférence, les étapes b) et c) ou les étapes a), b) et c) sont réalisées dans un seul et même réacteur ; de préférence encore les étapes b) et c) se déroulent simultanément.
Dans l’étape a), l’ajout des différents composants de la composition M peut se faire dans n’importe quel ordre, par exemple par simple mélange des différents composants dans un ordre indifférent. La composition M peut être préparée avant introduction dans le réacteur ou directement dans le réacteur (où se déroule l’étape b) et éventuellement l’étape c)).
A l’étape b), la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure peut être réalisée avant ou en même temps que la réaction enzymatique de formation du pont disulfure.
En particulier, à l’étape b), le dimère du composé organique obtenu est sous forme oxydée tandis qu’à l’étape c) le composé organique est sous forme réduite.
L’étape b) peut notamment se décomposer en plusieurs étapes qui sont les suivantes : i) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure avec l’enzyme E afin d’obtenir : un sulfoxyde ou une sulfone ; et le cofacteur commun aux enzymes E et D sous forme oxydée ; ii) conduite de la réaction enzymatique de formation d’un pont disulfure avec l’enzyme D afin d’obtenir :
- le cofacteur commun aux enzymes E et D sous forme réduite ; et
- un dimère dudit composé organique.
L’étape i) pouvant être effectuée avant ou en même temps que l’étape ii).
L’étape b) de conduite des réactions enzymatiques peut être réalisée à un pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 6 et 8 et encore plus préférentiellement entre 7 et 8, par exemple 7.
L’étape b) de conduite des réactions enzymatiques peut être réalisée à une température comprise entre 5°C et 100°C, de préférence entre 20Ό et 80 °C et encore plus préférentiellement entre 25 °C et 40 °C.
Les cellules telles que définies ci-après peuvent être utilisées à l’étape b) directement en absence de traitement quelconque.
L’étape c) peut être réalisée dans les mêmes conditions, en particulier au même pH et à la même température, que l’étape b).
La pression utilisée pour lesdites réactions enzymatiques et/ou l’étape c) peut aller d’une pression réduite par rapport à la pression atmosphérique à plusieurs bars (plusieurs centaines de kPa), selon les réactifs utilisés et le matériel utilisé.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape b’), entre l’étape b) et l’étape c), d’arrêt des réactions enzymatiques par inactivation de(s) enzyme(s) E et/ou D. Cette étape b’) peut être réalisée par des moyens connus tels que le choc thermique (par exemple avec une température d’environ 100°C)ou osmotique, l’application d’une forte pression, l’ajout d’un solvant permettant soit de détruire et/ou de précipiter les cellules et/ou les enzymes E et/ou D, la modification du pH (soit un pH bas d’environ 2, soit un pH élevé d’environ 10).
Le sulfure et ou le mercaptan et/ou éventuellement ledit oxydant peuvent être ajoutés en continu, de préférence à l’étape a).
A l’étape d), le sulfoxyde ou la sulfone et ou le disulfure peuvent être récupéré(e)s sous forme liquide ou solide. Le sulfoxyde ou la sulfone et/ou le disulfure peuvent être récupéré(e)s en solution aqueuse, sous forme liquide par décantation, voire sous forme solide par précipitation selon leur solubilité. Le disulfure peut être extrait dans une phase organique ou séparé du milieu réactionnel par des techniques bien connues de l’homme du métier ; par exemple par distillation après ultrafiltration ou centrifugation.
Ensuite, les produits obtenus peuvent éventuellement être purifiés selon des méthodes classiques. Par exemple, après séparation des cellules (contenant les enzymes E et D) par ultrafiltration ou centrifugation, une distillation peut permettre de séparer le sulfoxyde ou la sulfone et le disulfure. Cette distillation peut se faire à pression atmosphérique, pression réduite (par exemple sous vide), ou sous pression plus élevée si l’homme du métier y voit un intérêt. Une séparation membranaire peut aussi être envisagée pour diminuer la teneur en eau du mélange à distiller ou accélérer un processus de cristallisation. Si le sulfoxyde ou la sulfone et/ou le sulfure a été récupéré(e) par décantation d’un milieu réactionnel aqueux, un séchage sur tamis moléculaire (ou tout autre méthode de séchage) peut être envisagé.
Ledit procédé peut être réalisé en batch ou en continu. Les avantages que procure le procédé de l’invention sont nombreux. Parmi ces avantages, on peut citer la possibilité de travailler en solution aqueuse, dans des conditions très douces de température et de pression et dans des conditions de pH proches de la neutralité. Toutes ces conditions sont typiques d’un procédé biocatalytique dit « vert » ou « durable ».
La composition M peut comprendre le composé organique, l’enzyme E, l’enzyme D et le cofacteur en quantité catalytique. La composition M peut comprendre :
1 ) une quantité stoechiométrique d’un sulfure,
2) une quantité stoechiométrique d’un oxydant,
3) une quantité catalytique d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,
4) une quantité catalytique d’une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une quantité catalytique d’une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère,
6) une quantité catalytique d’un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; et
7) une quantité stoechiométrique d’un mercaptan.
En particulier, le ratio molaire mercaptan/sulfure est compris entre 0,1 et 100, plus préférentiellement entre 1 et 5 et de manière préférée entre 2 et 4, par exemple 2.
Sulfure :
On entend notamment par sulfure un sulfure organique, soit tout composé organique comprenant au moins une fonction de type -C-S-C-.
Selon un mode de réalisation, la composition M comprend au moins un sulfure. Elle peut par exemple comprendre un, deux ou plusieurs sulfures différents.
Ledit sulfure peut être symétrique, c’est-à-dire que l’atome de soufre représente un centre de symétrie par rapport au composé.
Selon un mode de réalisation, ledit sulfure est de formule générale suivante :
R1-S-R2 dans laquelle, Ri et R2 peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C2-C20)alcényle, (C2-C20)alcynyle, (C3-Cio)cycloalkyle et (C6-Cio)aryle ou
Ri et R2 forment un cycle avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent, de préférence un groupement (C3-Cio)hétérocycloalcane ou (C -Cio)hétéroarène ; lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène pouvant éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) ; et lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle et aryle pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatome(s).
Lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de :
(CrC2o)alkyle, (C3-Cio)cycloalkyle et (C6-Cio)aryle ; et peuvent être éventuellement fonctionnalisés par une ou plusieurs fonction(s) choisie(s), de manière non limitative et à titre d’exemples, parmi les fonctions alcool, aldéhyde, cétone, acide, amide, nitrile, ester ou encore les fonctions porteuses de soufre, phosphore et silicium.
Selon un mode de réalisation, lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de : (Ci-C20)alkyle, (C3- Cio)cycloalkyle, (C6-C10)aryle, -OH, -C(0)0H, -C(0)H, -C(0)-NH2, -NH2, -NHR, -NRR’, -C(O)- , -C(0)-NHR’, -C(0)-NRR’, -COOR et -CN ; dans lesquels R et R’ représentent indépendamment l’un de l’autre un groupement (Cr C20)alkyle.
Selon un mode de réalisation préféré, Ri et R2, peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C20)alkyle, (C2-C20)alcényle, (C2-C20)alcynyle et (C3-Ci0)cycloalkyle ou
Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent un groupement (C3-
Cio)hétérocycloalcane.
De préférence, Ri et R2 sont choisis parmi les (Ci-C20)alkyle ou Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre qui les porte un (C3-Ci0)hétérocycloalcane. Les radicaux Ri et R2 dudit sulfure sont de préférence identiques (i.e. formant ainsi un sulfure symétrique).
Plus préférentiellement, le sulfure est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Le sulfure peut être choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le di-n-propylsulfure, le di-iso-propylsulfure, le di-n-butylsulfure, le di-iso-butylsulfure, le di-sec- butylsulfure, le di-tert-butylsulfure, le di-n-octylsulfure, le di-n-dodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Le diméthylsulfure est particulièrement préféré selon l’invention. Selon un mode de réalisation, le sulfure est symétrique.
Mercaotan :
On entend notamment par mercaptan, un mercaptan organique, soit tout composé organique comprenant au moins une fonction de type -C-SH.
Selon un mode de réalisation, le mercaptan est de formule générale R3-SH, dans laquelle R3 est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué.
En particulier, le mercaptan est de formule générale R3-SH, dans laquelle R3 est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par au moins un groupement choisi parmi le groupe constitué de :
-OH, -C(0)0H, -NH2, -ORa, -C(0)0Ra, -N(Ra)H, -NRaR et (C6-C10)aryle ; avec Ra et Rb étant indépendamment l’un de l’autre choisi parmi les (CrC2o)alkyles.
De préférence, le mercaptan est de formule générale R3-SH, dans laquelle R3 est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par au moins un, par exemple un ou deux, groupement(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de : -OH, - C(0)0H, -NH2 et (C6-Cio)aryle ; plus préférentiellement -OH, -C(0)0H et -NH2 .
R3 est plus particulièrement choisi parmi le groupe constitué du méthyle, de l’éthyle, de l’octyle et du dodécyle, de préférence R3 est un méthyle.
Le mercaptan peut être choisi parmi le groupe constitué du : mercaptoéthanol, méthylmercaptan, éthylmercaptan, propylmercaptan, butylmercaptan, octylmercaptan, dodécylmercaptan, benzyl mercaptan, acide thioglycolique, acide 3- mercaptopropionique, la cystéine et l’homocystéine.
Le mercaptan est notamment choisi parmi le groupe constitué du : mercaptoéthanol, méthylmercaptan, éthylmercaptan, n-propyl mercaptan, iso- propylmercaptan (ou 2-propanethiol), n-butylmercaptan, sec-butylmercaptan, tert- butylmercaptan, n-octyl mercaptan, tert- octylmercaptan, n-dodécyl mercaptan, tert- dodécylmercaptan, benzyl mercaptan, acide thioglycolique, acide 3-mercaptopropionique, la cystéine et l’homocystéine.
De préférence, le mercaptan est le méthylmercaptan.
Oxydant :
On entend par oxydant tout composé pouvant oxyder un sulfure en sulfoxyde ou en sulfone. L’oxydant peut être choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène et de l’oxygène pur. Lorsque de l’air (air qui peut être appauvri ou enrichi en oxygène) est utilisé, c’est évidemment l’oxygène compris dans l’air qui est consommé au cours de la réaction enzymatique d’oxydation conduite à l’étape b) en tant qu’oxydant.
Lorsque l’oxydant se présente sous forme gazeuse, il est présent dans la composition M sous forme de gaz dissout. Le pourcentage d’oxygène dans l’air enrichi ou appauvri est choisi en fonction de la vitesse de réaction et de la compatibilité avec le système enzymatique de façon connue de l’homme du métier.
L’oxydant peut être en quantité stoechiométrique ou en excès dans la composition M. En excès, le sulfure présent est totalement consommé avec l’oxydant lors de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure conduite à l’étape b) (formation de sulfone).
L’oxydant peut être en quantité sous-stœchiométrique dans la composition M. Ainsi, le sulfure présent est en partie consommé avec l’oxydant lors de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure conduite à l’étape b) mais pas totalement (formation de sulfoxyde).
A l’issue de ladite réaction d’oxydation, généralement l’oxygène est transformé en eau lorsque l’enzyme E utilisée est une mono-oxygénase ou totalement consommé lorsque l’enzyme E est une dioxygénase. Ainsi, le procédé selon l’invention est particulièrement avantageux en termes de rejet et de respect de l’environnement.
Enzyme E :
On entend notamment par « enzyme oxydante », l’enzyme E, soit une enzyme permettant l’oxydation des sulfures en sulfoxydes et/ou sulfones et nécessitant l’utilisation d’un cofacteur. Ladite enzyme E peut être une oxydoréductase, de préférence une oxydoréductase choisie parmi le groupe constitué des monooxygénases et des dioxygénases, encore plus préférentiellement parmi les monooxygénases.
De préférence, ladite enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO).
Encore plus préférentiellement et parmi les BVMOs, l’enzyme E peut être une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO), et plus particulièrement une Cyclohexanone-1 ,2-MonoOxygénase ; une Cyclopentanone Monooxygénase (CPMO), plus particulièrement une cyclopentanone 1 ,2- monooxygénase ; ou une hydroxyacétophénone monooxygénase (HAPMO) et plus particulièrement une 4-hydroxyacétophénone monooxygénase.
Les Cyclohexanone-1 ,2-Monooxygénases sont notamment de classe EC 1 .14.13.22.
Selon un mode de réalisation particulier, la CHMO est une CHMO d ’Acinetobacter sp. (par exemple de souche NCIMB 9871 ) et/ou une CHMO codée par le gène chnB appartenant au cluster AB006902.
Les Cyclopentanone 1 ,2-Monooxygénase sont notamment de classe EC 1.14.13.16.
Selon un mode de réalisation particulier, la CPMO est une CPMO de Comamonas sp. (par exemple la souche NCIMB 9872) et/ou une CPMO codée par le gène cpnB. Les hydroxyacétophénone monooxygénases sont notamment de la classe EC 1.14.13.84. Selon un mode de réalisation particulier, IΉARMO est une HAPMO de Pseudomonas fluorescens. codée par le gène hapE.
Enzyme D et composé organique porteur d’un groupement thiol :
On entend par composé organique porteur d’un groupement thiol, tout composé hydrocarboné pouvant comprendre des hétéroatomes et/ou tout type de fonction chimique connue et porteur d’au moins un groupement -SH (ci-après composé organique). Le composé organique selon l’invention peut comprendre un ou deux groupement(s) thiol(s) (groupement -SH). Ce composé peut exister sous forme de dimère, le dimère étant formé grâce à un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique (2 R-SH donnent R-S-S-R).
Le composé organique peut être choisi parmi le groupe constitué d’un acide aminé porteur d’un groupement thiol, un peptide porteur d’un groupement thiol, le mycothiol (n°CAS 192126- 76-4) et l’acide dihydrolipoïque (n°CAS 462-20-4). De préférence, ledit composé organique est un acide aminé porteur d’un groupement thiol ou un peptide porteur d’un groupement thiol. En particulier, ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué de : la cystéine, l’homocystéine, le glutathion, la thiorédoxine, le mycothiol et l’acide dihydrolipoïque.
Selon un mode de réalisation, lorsque le mercaptan selon l’invention est la cystéine ou l’homocystéine, alors ledit composé organique est différent de la cystéine ou de l’homocystéine (respectivement). Selon un mode de réalisation, le composé organique et le mercaptan sont différents.
Plus spécifiquement, ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué de : la cystéine, l’homocystéine, le glutathion et la thiorédoxine.
De façon particulièrement préférée, ledit composé organique est le glutathion. Le couple glutathion (GSH)/disulfure de glutathion (GSSG) est largement connu en biologie. Cette espèce sous forme réduite (glutathion) ou oxydée (disulfure de glutathion) forme un couple d’oxydo-réduction important dans les cellules.
L’enzyme D catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique pour former un dimère (appelé un ou le dimère dans la description). En particulier, elle catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un acide aminé porteur d’un groupement thiol ou entre deux équivalents d’un peptide porteur d’un groupement thiol pour former un diacide aminé ou un dipeptide. L’enzyme D peut être définie comme une « enzyme de recyclage » du cofacteur commun réduit ou oxydé, de préférence elle recycle le cofacteur commun oxydé en cofacteur commun réduit.
Elle peut être une réductase ou une déshydrogénase, de préférence elle peut être choisie parmi le groupe constitué de la glutathion réductase, la thiorédoxine réductase, la cystéine réductase, l’homocystéine-réductase, la mycothiol disulfure réductase et la dihydrolipoyl déshydrogénase. Plus particulièrement, l’enzyme D est choisie parmi le groupe constitué de la glutathion réductase, la thiorédoxine réductase, la cystéine réductase et l’homocystéine- réductase.
La glutathion réductase peut être représentée par les numéros de classification enzymatique EC 1.8.1.7 ou EC 1.6.4.2 ; la cystéine-réductase par le numéro EC 1 .8.1.6 ; la thioredoxine réductase par les numéros EC 1.8.1 .9 ou EC 1 .6.4.5; la mycothione réductase par le numéro EC 1.8.1.15 (cette enzyme est également appelée mycothiol-disulfure réductase). De façon particulièrement préférée, ladite enzyme D est la glutathion réductase.
Plus spécifiquement, chaque composé organique est couplé avec l’enzyme D qui lui correspond, permettant de former ainsi le dimère correspondant. Les couples ou complexes enzymatiques composé organique/enzyme D suivants sont donc particulièrement utiles pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention :
- le glutathion/la glutathion réductase,
- la thiorédoxine/la thiorédoxine réductase,
- la cystéine/la cystéine réductase,
- l’homocystéine/rhomocystéine-réductase,
- le mycothiol/la mycothiol disulfure réductase, et
- l’acide dihydrolipoïque/la dihydrolipoyl deshydrogénase.
Cofacteur(s) commun(s) :
On entend notamment par « cofacteur commun » un cofacteur nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme E et de l’enzyme D telles que définies ci-dessus et/ou permettant d’améliorer leur activité catalytique. On entend de préférence par « cofacteur commun » aux enzymes E et D, un cofacteur pouvant être réduit et/ou oxydé par l’action de ces enzymes. Selon un mode de réalisation, un, deux cofacteurs ou plus sont présents dans la composition M. Par exemple, il est possible d’ajouter à la composition M un cofacteur déjà présent naturellement dans l’enzyme E et/ou dans l’enzyme D, en supplément d’un autre cofacteur. Ledit cofacteur peut être choisi parmi les cofacteurs nicotiniques et les cofacteurs flaviniques. En particulier, ledit cofacteur peut être choisi parmi le groupe constitué de : la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD) et/ou leur forme réduite correspondante (à savoir NADH,H+ NADPH,H+, FMNH2, FADH2).
Les cofacteurs listés ci-dessus sont avantageusement utilisés sous leurs formes réduites (par exemple NADPH, H+) et/ou leurs formes oxydées (par exemple NADP+), c’est-à-dire qu’ils peuvent être ajoutés sous ces formes réduites et/ou oxydées dans la composition M, de préférence sous forme réduite.
De préférence l’enzyme E utilisée est la Cyclohexanone Monooxygénase, par exemple la Cyclohexanone Monooxygénase d ’Acinetobacter sp., le cofacteur utilisé est le NADP, éventuellement supplémenté de FAD et l’enzyme D est la glutathion réductase.
La composition M selon l’invention peut également comprendre :
- éventuellement un ou plusieurs solvants choisis parmi l’eau, les tampons tels que les tampons phosphates, Tris-HCI, Tris-base, bicarbonate d’ammonium, acétate d’ammonium, HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique), CHES (acide N-cyclohexyl-2- aminoéthanesulfonique), ou les sels tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, ou leurs mélanges ;
- éventuellement des additifs tels que des surfactants, afin notamment de favoriser la solubilité d’un ou plusieurs réactif(s) ou substrat(s) de la réaction enzymatique.
De préférence, la composition M est une solution aqueuse. Par exemple, ladite composition M comprend entre 50 % et 99 % en poids d’eau, de préférence entre 80 % et 97 % en poids d’eau par rapport au poids total de la composition M.
Selon un mode de réalisation, la composition M est considérée comme le mélange réactionnel. Les différents composants de la composition M préparée à l’étape a) ci-dessus sont aisément accessibles dans le commerce ou peuvent être préparés selon des techniques bien connues de l’homme du métier. Ces différents éléments peuvent se présenter sous forme solide, liquide ou gazeuse et peuvent très avantageusement être mis en solution ou dissous dans l’eau ou tout autre solvant pour être mis en oeuvre dans le procédé de l’invention. Les enzymes utilisées peuvent également être greffées sur support (cas des enzymes supportées).
Selon un mode de réalisation, les enzymes E et/ou D, éventuellement le composé organique et éventuellement le cofacteur commun sont :
- soit sous forme isolée et/ou purifiée, par exemple en solution aqueuse ;
- soit compris dans un extrait brut, c’est-à-dire dans un extrait de cellules broyées ; ou
- soit compris dans des cellules entières.
De préférence, des cellules entières sont utilisées. Le ratio [sulfure] (en mmol/L) / [cellules] (en gcps.L-1) peut être compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,01 et 3 mmol/gcps, de préférence pendant l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique. La détermination de la concentration massique en grammes de cellules sèches (gcps pour Cellules en Poids Sec ou gcDw pour Cells Dry Weight en anglais) est réalisée selon des techniques classiques.
Les enzymes E et/ou D peuvent être surexprimée(s) ou non dans lesdites cellules, appelées ci-après cellules hôtes. La cellule hôte peut être tout hôte approprié pour la production d’une enzyme E et/ou D à partir de l’expression du gène codant correspondant. Ce gène pourra alors se trouver soit dans le génome de l’hôte, soit porté par un vecteur d’expression tels que ceux définis ci-après.
On entend notamment par « cellule hôte » au sens de la présente invention une cellule procaryote ou eucaryote. Des cellules hôtes couramment utilisées pour l’expression de protéines recombinantes ou non incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia coli ou Bacillus sp., ou Pseudomonas, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, des cellules de champignons tels que Aspergillus niger , Pénicillium funiculosum ou Trichoderma reesei, des cellules d’insectes telles que les cellules Sf9, ou encore des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées cellulaires HEK 293, PER-C6 ou CHO.
Lesdites cellules hôtes peuvent être en phase stationnaire de croissance, par exemple sorties du milieu de culture.
De préférence, les enzymes E et ou D, éventuellement le composé organique et éventuellement le cofacteur commun sont exprimés dans la bactérie Escherichia coli. Préférentiellement, la CHMO et/ou IΉARMO est exprimée à l’intérieur d’une souche d 'Escherichia coli comme par exemple Escherichia coli BL21 (DE3).
Intégration d’un vecteur d’expression comprenant la séquence codante pour l’enzyme E et/ou D dans l’hôte cellulaire
Lors de l’utilisation d’un vecteur d’expression tel qu’un plasmide, la transformation des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier, par exemple par lipofection, électroporation, choc thermique, ou par des méthodes chimiques. Le vecteur d’expression et la méthode d’introduction du vecteur d’expression au sein de la cellule hôte sont sélectionnés en fonction de la cellule hôte choisie. A l’issue de cette étape de transformation, une cellule transformée exprimant un gène codant une enzyme recombinante E et ou D est obtenue. Elle peut être cultivée, lors d’une étape de culture/d’incubation, afin de produire l’enzyme E et/ou D.
L’incubation/la culture des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier qui peut déterminer par exemple, le milieu de culture ou encore les conditions de temps et de température. Selon le vecteur utilisé, une période d’induction - correspondant à une production accrue de l’enzyme E et ou D - peut être observée. L’utilisation d’inducteur faible (comme par exemple l’arabinose pour le vecteur pBad) ou fort (comme par exemple l’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG) pour les vecteurs pET22b, pRSF, etc...) peut être envisagée. Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E et/ou D, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot. On entend par « vecteur d’expression », une molécule d’ADN de taille réduite dans laquelle il est possible d’insérer une séquence nucléotidique d’intérêt. Il est possible de choisir entre plusieurs vecteurs d’expression connus tels les plasmides, les cosmides, les phages, etc ... Le choix du vecteur se fait notamment en fonction de l’hôte cellulaire utilisé.
Il peut s’agir par exemple du vecteur d’expression décrit dans le document WO 83/004261 .
Intégration de la séquence codante pour l’enzyme E et/ou D dans le génome de la cellule hôte en l’absence de vecteur d’expression
La séquence nucléotidique codant l’enzyme E et/ou D peut être intégrée dans le génome de la cellule hôte par toute méthode connue comme par exemple la recombinaison homologue ou encore le système CRISPR-Cas9 etc... Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E et/ou D, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot.
Isolation et/ou purification de l’enzyme E et/ou D pour une utilisation sous forme isolée et/ou purifiée
Après transformation et culture/incubation de la cellule hôte transformée, une étape d’isolation et éventuellement de purification de l’enzyme E et/ou D peut être réalisée. De cette façon, le procédé selon l’invention n’est pas réalisé en présence des cellules hôtes mais par l’enzyme E et/ou D en solution dans la composition M, de préférence en solution aqueuse.
L’isolation et/ou la purification de ladite enzyme E et ou D produite peut être réalisée par tout moyen connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d’ammonium, une ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d’ions, une séparation par interactions hydrophobes, ou une chromatographie d’affinité, par exemple de type IMAC.
Mode de Ivse de la cellule hôte, préparation d’un extrait brut de cellules broyées Le lysat cellulaire peut être obtenu selon différentes techniques connues telles que la sonication, la pression (presse de French), via l’utilisation d’agents chimiques (ex. triton) etc... Le lysat obtenu correspond à un extrait brut de cellules broyées.
Composition et utilisations
La présente invention concerne également une composition comprenant :
1) un sulfure,
2) éventuellement un oxydant,
3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, 4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère,
6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D, et
7) un mercaptan.
L’invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la régénération ou le recyclage d’un cofacteur (cofacteur enzymatique, notamment tel que défini ci-dessus), de préférence d’un cofacteur utilisé dans l’oxydation enzymatique d’un sulfure. Par « régénération » ou « recyclage », on entend notamment le passage d’une forme oxydée à une forme réduite du cofacteur ou vice versa.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la réduction d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, ledit mercaptan étant de préférence transformé en disulfure correspondant. De préférence, ledit pont disulfure est formé par catalyse enzymatique, notamment telle que définie ci-dessus pour l’enzyme D. De préférence, le mercaptan est le méthylmercaptan et le composé organique est le glutathion. Cette utilisation du mercaptan est notamment prévue en tant que voie de régénération ou de recyclage d’un cofacteur, notamment d’un cofacteur utilisé dans l’oxydation enzymatique d’un sulfure.
L’invention concerne également un procédé d’oxydation enzymatique d’un sulfure comprenant une étape de régénération ou de recyclage d’un cofacteur par un mercaptan.
La présente invention concerne également un procédé de réduction par un mercaptan d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, ledit mercaptan étant de préférence transformé en disulfure correspondant. Plus particulièrement, le sulfure, l’oxydant, le composé organique, l’enzyme E, l’enzyme D, le cofacteur, le mercaptan, les réactions enzymatiques et chimiques sont tels que définis ci- dessus, notamment dans le cadre du procédé de coproduction selon l’invention.
Description des Figures
Figure 1 : La Figure 1 représente les concentrations (en mM) de diéthylsulfure (DES), de diéthylsulfoxyde (DESO) et de Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) présentes dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction d’oxydation est catalysée par l’enzyme CHMO. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d’E. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le 2-mercaptoéthanol à une concentration double par rapport au DES. Figure 2 : La Figure 2 représente les concentrations (en mM) de diéthylsulfoxyde (DESO), de diéthylsulfone (DES02) et de Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) présentes dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction d’oxydation est catalysée par l’enzyme CHMO. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d Έ. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le 2-mercaptoéthanol à une concentration double par rapport au DESO.
Figure 3 : La Figure 3 représente la concentration (en mM) de diéthylsulfoxyde (DESO) présente dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction est catalysée par l’enzyme CHMO. Dans cet exemple, le 2-mercaptoéthanol a été remplacé par le méthylmercaptan (MeSH) comme donneur de protons. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d’E. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le MeSH est ajouté progressivement dans le milieu réactionnel selon un débit d’environ 4 mmol/L/h.
Figure 4 : La Figure 4 est une illustration d’une cascade enzymatique telle que selon l’invention.
Le mercaptan et le sulfure sont introduits dans un milieu réactionnel comprenant :
- la CHMO (correspondant à l’enzyme E), du NADPH (cofacteur commun),
- la Glutathion réductase (correspondant à l’enzyme D),
- le disulfure de Glutathion ou du Glutathion (correspondant au dimère ou au composé organique comprenant au moins un groupement thiol).
De l’air est notamment introduit en continu permettant l’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone suivant le mode d’introduction du sulfure. La cascade enzymatique est alors engendrée.
Le cofacteur commun, le NADPH, est concomitamment à la formation de sulfoxyde ou sulfone, oxydé en NADP+. Ce dernier, grâce à la présence de deux molécules de Glutathion, est réduit à nouveau en NADPH, H+, les 2 molécules de Glutathion (2 GSH) donnant du disulfure de Glutathion (GSSG). Pour terminer la cascade, le disulfure de Glutathion, par un équilibre chimique, permet d’oxyder 2 molécules de mercaptans en disulfure correspondant, régénérant ainsi 2 molécules de Glutathion. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne sont pas limitatifs de la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse sélective du diéthylsulfoxyde à partir de diéthylsulfure via l’utilisation de 2-mercaptoéthanol.
I. Préparation du biocatalvseur :
Production de la CycloHexanone MonoOxygénase (CHMO)
Une souche d ’Escherichia coli BL21(DE3) (commercialisée par Merck Millipore) exprimant le gène chnB inséré dans le plasmide pET22b (commercialisé par Promega, Qiagen) a été préalablement construite. Elle permet l’expression hétérologue de la CycloHexanone MonoOxygénase (CHMO) d ’Acinetobacter sp.
Il est entendu que ladite souche contient à la fois la CHMO, les cofacteurs de la CHMO qui sont le NADP et le FAD.
Une pré-culture et une culture de cette souche ont été réalisées selon les techniques connues de l’homme de métier.
Après une phase d’induction déclenchée par l’ajout d’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG) à 0,85 mmol/L en concentration finale, un certain volume de la culture est centrifugé (10 min, 5000 g, 4°C) afin d’obtenir la quantité souhaitée de celLiles.
Production de la glutathion réductase (G R)
Une souche d ’Escherichia coli BL21(DE3) (commercialisée par Merck Millipore) exprimant le gène gor inséré sur le plasmide pET26b+ (commercialisé par Promega, Qiagen) a été conçue selon les techniques connues de l’homme du métier. Elle permet l’expression hétérologue de la glutathion réductase (GR) d ’Escherichia coli.
Il est entendu que ladite souche contient à la fois la GR et le cofacteur de la GR qui est le NADP.
Une pré-culture et une culture de cette souche ont été réalisées selon les techniques connues de l’homme du métier.
Après une phase d’induction déclenchée par l’ajout d’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG), un certain volume de la culture est centrifugé (10 min, 5000 g, 4°C) afin d’obtenir la quantité souhaitée de cellules. II. Bioconversion :
Dans cet exemple, les culots de cellules fraîches sont repris dans 32 ml_ d’un tampon phosphate 0,1 mol/L à pH 8. La concentration cellulaire alors obtenue est de 62 UDO/mL ou encore 20 gcps/L (avec CPS : cellules en poids sec) pour les cellules sur-exprimant la CHMO et la GR.
Dans une fiole de 250 mL, des concentrations initiales de 3 mmol/L de diéthylsulfure (DES), 6 mmol/L de 2-mercaptoéthanol et 0,25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) sont présentes à t=0 dans un volume final de 32 mL.
A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement le diéthylsulfoxyde (DESO) et le Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon préalablement obtenue. Dans les conditions de l’analyse pratiquée, la concentration minimale pouvant être mesurée est de 50 pM.
Une augmentation linéaire de la quantité de DESO est mesurée au cours du temps sans que la sulfone (DES02) ne soit détectée. La vitesse initiale d’oxydation du sulfure est alors de 1 mmol de DES oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 1 ). Une quantité analogue de Bis(2- hydroxyéthyl)disulfure est produite de manière concomitante à la production de DESO ce qui atteste du bon fonctionnement du système couplé GSSG/GR pour le recyclage du cofacteur. Il est à noter que la concentration en Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure en fonction du temps a été déterminée après soustraction du bruit de fond lié à l’oxydation spontanée lente du 2- mercaptoéthanol (bruit de fond déterminé en présence de tous les éléments de la cascade (dans les mêmes conditions) à l’exception des cellules sur-exprimant la CHMO).
La réaction catalysée par la CHMO est chimio-sélective, car la réaction de transformation du DESO en DES02 ne se produit que lorsque le DES est entièrement consommé. En d’autres termes, la sulfone ne se forme pas lorsqu’il y a du DES dans le milieu réactionnel.
La sélectivité obtenue est d’environ 100%. Lorsque le DES est toujours présent dans le milieu réactionnel, la sulfone n’est pas détectée avec les outils analytiques utilisés. A la fin de la réaction (t=4h), environ 100% de DESO est obtenu sans que le DES02 soit détecté par les outils analytiques utilisés. Exemple 2 : Synthèse sélective de diéthylsulfone à partir de diéthylsulfoxyde via l’utilisation de 2-mercaptoéthanol comme donneur d’hydrogènes.
I. Préparation du biocatalvseur :
Les mêmes souches que celles décrites dans l’exemple 1 ont été utilisées dans cet exemple, c’est-à-dire les souches sur-exprimant la CHMO et la GR d’E. coli.
Une centrifugation est réalisée (10 min, 5000 g, 4°C) et les culots sont ensuite repris dans 32 mL d’un tampon phosphate 0,1 mol/L pH 8. Une concentration cellulaire de 62 UDO/mL (ou environ 20 gcps/L) de chaque souche est alors utilisée pour l’essai réactionnel.
II. Bioconversion :
Dans une fiole de 250 mL, 3 mmol/L de diéthylsulfoxyde (DESO), 6 mmol/L de 2- mercaptoéthanol et 0,25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) sont ajoutés simultanément à t=0 dans un volume final de 32 mL.
A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement la diéthylsulfone (DES02) et le Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon obtenue précédemment.
Une augmentation linéaire de la quantité de DES02 est mesurée au cours du temps. La vitesse initiale d’oxydation du sulfoxyde est alors de 0,75 mmol de DESO oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 2). Parallèlement, une quantité analogue de 2- Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure est produite de manière concomitante à la production de DES02. Par conséquent, le 2- mercaptoéthanol ajouté permet bien de recycler le cofacteur NADP via une voie cascade- dépendante. Le bruit de fond a été déduit de la même façon que dans l’exemple 1 .
Exemple 3 : Synthèse sélective du diéthylsulfoxyde à partir de diéthylsulfure via l’utilisation de methylmercaptan (MeSH) comme donneur d’hydrogènes.
I. Préparation du biocatalvseur :
Les mêmes souches que celles décrites dans l’exemple 1 et 2 ont été utilisées dans cet exemple, c’est-à-dire les souches sur-exprimant la CHMO et la GR d’E. coli. Le 2- mercaptoéthanol a été remplacé par le MeSH dans cette réaction biocatalysée. II. Bioconversion :
Dans cet exemple, les culots de cellules fraîches sont repris dans 200 ml_ d’un tampon phosphate 0,1 mol/L à pH 8. La concentration cellulaire alors obtenue est de 62 UDO/mL ou encore 20 gcps/L (avec CPS : cellules en poids sec) pour les cellules sur-exprimant la CHMO et la GR.
Dans un réacteur de 1 L, sont ajoutés simultanément à t=0 : 10 mmol/L de diéthylsulfure (DES), 0.25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) ainsi que la solution enzymatique préalablement préparée. De plus, du methylmercaptan est ajouté progressivement au milieu réactionnel par acidification à l’acide sulfurique du sodium methyl mercaptan (débit ajusté à environ 4 mmol/L/h). Puis du diéthylsulfure pur est progressivement ajouté selon un débit de 40 pl_ h de manière à assurer une concentration constante de DES et une vessie permet l’ajout régulier d’02 nécessaire à la conduite de la réaction. La réaction est initiée sous agitation à température contrôlée de 30 °C.
A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement le diéthylsulfoxyde (DESO) et la diéthylsulfone (DES02) potentiellement formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon obtenue précédemment. Dans les conditions de l’analyse pratiquée, la concentration minimale pouvant être mesurée est de 50 pM.
Une augmentation linéaire de la quantité de DESO est mesurée au cours du temps sans que la sulfone (DES02) ne soit détectée. La vitesse initiale d’oxydation du sulfure est alors de 0,2 mmol de DES oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 3). Du diméthyldisulfure (DMDS) est produit concomitamment à la production de DESO ce qui atteste du bon fonctionnement du système couplé GSSG/GR pour le recyclage du cofacteur.
La réaction catalysée par la CHMO est chimio-sélective, car la réaction de transformation du DESO en DES02 ne se produit pas puisque du DES est présent dans le milieu réactionnel tout au long de la réaction.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone, comprenant les étapes suivantes : a) préparation d’une composition M comprenant :
1) un sulfure,
2) éventuellement un oxydant,
3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,
4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère, et
6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; b) conduite, de préférence de façon simultanée, des réactions enzymatiques d’oxydation du sulfure et de formation du pont disulfure afin d’obtenir :
- un sulfoxyde ou une sulfone ; et
- un dimère ; c) réduction du dimère obtenu à l’étape b) par réaction avec un mercaptan afin d’obtenir :
- le disulfure correspondant ; et
- ledit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol; et d) éventuelle récupération :
- du disulfure obtenu à l’étape c) ; et/ou
- du sulfoxyde ou de la sulfone obtenu(e) à l’étape b) ; ledit mercaptan pouvant être ajouté lors de l’une quelconque des étapes a), b) ou c), de préférence le mercaptan est ajouté à l’étape a).
2. Procédé de coproduction selon la revendication 1 , dans lequel le mercaptan est de formule générale R3-SH, dans laquelle R3 est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué.
3. Procédé de coproduction selon la revendication 2, dans lequel R3 est choisi parmi le groupe constitué du méthyle, de l’éthyle, de l’octyle et du dodécyle, de préférence R3 est un méthyle.
4. Procédé de coproduction selon la revendication 2, dans lequel le mercaptan est choisi parmi le groupe constitué du : mercaptoéthanol, méthylmercaptan, éthylmercaptan, n- propylmercaptan, /so-propylmercaptan (ou 2-propanethiol), n-butylmercaptan, sec- butylmercaptan, tert- butylmercaptan, n-octylmercaptan, tert- octylmercaptan, n-dodécyl mercaptan, te/t-dodécylmercaptan, benzyl mercaptan, acide thioglycolique, acide 3- mercaptopropionique, la cystéine et l’homocystéine.
5. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué d’un acide aminé porteur d’un groupement thiol, d’un peptide porteur d’un groupement thiol, du mycothiol et de l’acide dihydrolipoïque, de préférence ledit composé organique est un acide aminé porteur d’un groupement thiol ou un peptide porteur d’un groupement thiol.
6. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué de : la cystéine, l’homocystéine, le glutathion, la thiorédoxine, le mycothiol et l’acide dihydrolipoïque, de préférence le glutathion.
7. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme E est une oxydoréductase, de préférence une oxydoréductase choisie parmi le groupe constitué des monooxygénases et des dioxygénases, encore plus préférentiellement une monooxygénase.
8. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme D est une réductase ou une deshydrogénase, de préférence choisie parmi le groupe constitué de la glutathion réductase, la thiorédoxine réductase, la cystéine réductase, l’homocystéine-réductase, la mycothiol disulfure réductase et la dihydrolipoyl deshydrogénase, de préférence l’enzyme D est la glutathion réductase.
9. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit sulfure est de formule générale :
R1-S-R2 dans laquelle,
Ri et R2 peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :
(Ci-C2o)alkyle, (C2-C20)alcényle, (C2-C20)alcynyle, (C3-Cio)cycloalkyle et (C6-Cio)aryle ou
Ri et R2 forment ensemble avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent un hétérocycloalkane ou un hétéro-arène ; lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéro-arène pouvant éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) ; et lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle et aryle pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatome(s).
10. Procédé de coproduction selon la revendication 9, dans lequel les radicaux Ri et R2 dudit sulfure sont identiques.
11. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit sulfure est choisi parmi le groupe constitué du diméthylsulfure, diéthylsulfure, dipropylsulfure, dibutylsulfure, dioctylsulfure, didodécylsulfure et le tétrahydrothiophène, de préférence le diméthylsulfure.
12. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’oxydant est choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène et de l’oxygène pur.
13. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le cofacteur est choisi parmi les cofacteurs nicotiniques et les cofacteurs flaviniques.
14. Procédé de coproduction selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- le sulfure est le diméthylsulfure ;
- le composé organique porteur d’un moins un groupement thiol est le glutathion ;
- l’enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO) ;
- l’enzyme D est une glutathion reductase ; et
- le cofacteur commun aux deux enzymes E et D est le NADP.
15. Composition comprenant :
1) un sulfure,
2) éventuellement un oxydant,
3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,
4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,
5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère,
6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D, et
7) un mercaptan.
16. Utilisation d’un mercaptan pour la régénération ou le recyclage d’un cofacteur utilisé dans l’oxydation enzymatique d’un sulfure en sulfoxyde ou en sulfone.
17. Utilisation d’un mercaptan selon la revendication 16, pour la réduction d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, ledit mercaptan étant de préférence transformé en disulfure correspondant.
18. Utilisation selon la revendication 17, dans laquelle le mercaptan est le méthylmercaptan et le composé organique le glutathion.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983004261A1 (fr) 1982-06-02 1983-12-08 Elf Bio-Recherches Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure transformee par ce vecteur et leur application
US20150056668A1 (en) * 2009-12-08 2015-02-26 Codexis, Inc. Synthesis of prazole compounds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983004261A1 (fr) 1982-06-02 1983-12-08 Elf Bio-Recherches Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure transformee par ce vecteur et leur application
US20150056668A1 (en) * 2009-12-08 2015-02-26 Codexis, Inc. Synthesis of prazole compounds

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA RIOZ-MARTÍNEZ ET AL: "Enzymatic Synthesis of Novel Chiral Sulfoxides Employing Baeyer-Villiger Monooxygenases", EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 2010, no. 33, 15 October 2010 (2010-10-15), DE, pages 6409 - 6416, XP055753256, ISSN: 1434-193X, DOI: 10.1002/ejoc.201000890 *
ANTONIO ANGELASTRO ET AL: "A Versatile Disulfide-Driven Recycling System for NADP + with High Cofactor Turnover Number", ACS CATALYSIS, vol. 7, no. 2, 9 January 2017 (2017-01-09), US, pages 1025 - 1029, XP055753242, ISSN: 2155-5435, DOI: 10.1021/acscatal.6b03061 *
PENGFEI GAO ET AL: "Enhancing Enantioselectivity and Productivity of P450-Catalyzed Asymmetric Sulfoxidation with an Aqueous/Ionic Liquid Biphasic System", ACS CATALYSIS, vol. 4, no. 10, 23 September 2014 (2014-09-23), US, pages 3763 - 3771, XP055753263, ISSN: 2155-5435, DOI: 10.1021/cs5010344 *
T. GUL ET AL: "Microbial Flavoprotein Monooxygenases as Mimics of Mammalian Flavin-Containing Monooxygenases for the Enantioselective Preparation of Drug Metabolites", DRUG METABOLISM AND DISPOSITION, vol. 44, no. 8, 16 March 2016 (2016-03-16), pages 1270 - 1276, XP055753255, DOI: 10.1124/dmd.115.069104 *

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