CN115210384A - 共同生产二硫化物以及亚砜或砜的化学酶促方法 - Google Patents

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CN115210384A CN202180018140.XA CN202180018140A CN115210384A CN 115210384 A CN115210384 A CN 115210384A CN 202180018140 A CN202180018140 A CN 202180018140A CN 115210384 A CN115210384 A CN 115210384A
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Abstract

本发明涉及一种从组合物M共同生产二硫化物以及亚砜或砜的化学酶促方法，所述组合物M包含：1)硫化物，2)任选地氧化剂，3)带有至少一个硫醇部分的有机化合物，4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇部分的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，和6)两种酶E和D共同的辅因子；以及涉及特别地能够实施该方法的组合物。本发明还涉及硫醇用于还原在两个当量的所述带有至少一个硫醇部分的有机化合物之间形成的二硫桥键的用途，并且更特别地涉及其作为上述方法中的再生底物的用途。

Description

共同生产二硫化物以及亚砜或砜的化学酶促方法
本发明涉及分别从硫醇和硫化物(sulfide，硫醚)共同生产二硫化物(disulfide，二硫醚)和亚砜或砜的化学酶促方法，以及尤其能够实施该方法的组合物。本发明还涉及硫醇用于还原在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成的二硫桥键的用途，并且更特别地涉及硫醇作为能够氧化硫化物的酶促级联的再生底物的用途。
硫醇在工业上引起了极大的兴趣，并且目前在化学工业中广泛使用，尤其是作为合成更复杂有机分子的起始材料。例如，甲基硫醇(CH3SH)在蛋氨酸的合成中被用作起始材料，蛋氨酸是一种用于动物营养的必需氨基酸。甲基硫醇还用于二烷基二硫化物的合成中，特别是在二甲基二硫化物(DMDS)的合成中，DMDS是一种用于石油馏分的加氢处理催化剂的硫化添加剂，以及其他应用。
硫醇，并且更特别地甲基硫醇，通常在工业上通过已知的方法从醇和硫化氢开始，在升高的温度下在催化剂的存在下根据以下方程式(1)合成：
R-OH+H2S→R-SH+H2O (1)
然而，该反应导致形成副产物，例如根据以下方程式(2)的硫化物：
R-OH+R-SH→R-S-R+H2O (2)
硫醇也可从卤化衍生物和碱金属、碱土金属或铵氢硫化物根据以下方程式(3)合成(使用氯化衍生物和硫氢化钠给出示例)：
Figure BDA0003823572240000011
该第二合成途径也导致存在不想要的硫化物。
最后，硫醇可根据以下方程式(4)，根据目标是支链还是非支链硫醇而通过酸催化或光化学方式从烯烃和硫化氢合成：
RARBC＝CRCRD+H2S→RARB-CH-C(SH)RCRD (4)
再一次，该合成产生硫化物作为副产物。
这些硫化物在工业上以高量获得，并且主要送去销毁。这代表了生产预期硫醇的方法中的效率损失以及与销毁它们相关的额外成本。以这种方式生成废物对于硫醇生产商来说是一个真正的工业问题，因此他们希望从这些副产物获得价值。有各种方法做到这一点。
首先，硫化物本身是有市场的：二甲基硫化物可用作食物香料，或在石油原料的蒸汽裂解中用作防焦剂。然而，这些市场中的需求远低于所生产的硫化物的量。
硫化物也可通过磺基水解反应转化为相应的硫醇。然而，进行该反应所需的条件相对苛刻并且产生新的寄生反应。因此，该工业应用受到限制。
最后，从产生的硫化物获得价值的另一种方式涉及硫化物的氧化反应，以将它们转化成亚砜和/或砜。这些种类的化学氧化反应是众所周知的。在存在或不存在催化剂的情况下，它们需要不同类型的氧化剂例如次氯酸钠、过氧化氢、氧气、臭氧或氮氧化物例如N2O4。
除了化学氧化之外，硫化物氧化也可在生物过程中通过在溶液中或在生物体、通常是微生物中的酶促催化来催化。
专利申请FR1906488和FR1906489分别描述了通过酶促催化从有机硫化物制备亚砜或砜的选择性方法。这两个专利申请的内容通过引用的方式以其全文并入本文。
因此，在这两个专利申请中描述的方法能够根据在酶促反应期间存在的硫化物的量，通过使用催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶来选择性地获得亚砜或砜。当在进行酶促硫化物氧化反应的步骤期间硫化物没有被完全消耗时，则选择性地获得亚砜。当在进行酶促硫化物氧化反应的步骤期间硫化物被完全消耗时，则选择性地获得砜。
然而，所使用的酶可能需要使用必须能够再循环(或再生)的辅因子，使得酶促氧化反应可再次发生。
这是因为辅因子由于其复杂性和经济原因，在工业酶促方法中通常不以化学计量量添加。因此，已经开发了多种方法来再循环它们和使由其产生的酶促级联再生：
-使用类似于辅因子的分子。该方法涉及使用更简单且因此成本更低的分子。然而，这产生的酶和辅因子之间的亲和力不足够高以考虑工业应用，并且该方法对于生产低附加值产品的工业方法来说代表不可接受的成本；
-使用采用牺牲底物的酶促氧化还原体系。这些技术通常需要使用第二酶，从而允许所使用的辅因子再循环。然而，牺牲底物的成本极大地影响了这样的方法的经济可行性。当硫化物被氧化为低附加值的砜或亚砜时尤其如此；
-使用全细胞。在这种情况下，再生所使用的一种辅因子或多种辅因子的是细胞机制。因此，该方法更接近于发酵方法：通常添加含碳/氢分子(例如葡萄糖或甘油)以增强该系统的性能特征，并且这代表额外的成本。
因此，需要一种工业上可行的途径来再生在硫化物的氧化的酶促方法中使用的辅因子。
还需要一种从硫化物，尤其是从硫醇合成得到的硫化物获得价值的方法，该方法在工业上和经济上是可行的。
本发明的一个目的是满足以上全部或部分需求。
本发明的一个目的更特别地是提供再生(或再循环)用于硫化物到亚砜或砜的酶促氧化的辅因子的途径。
本发明的另一个目的是提供一种化学酶促共同生产亚砜或砜以及二硫化物的方法。
本发明的进一步的目的是提供一种工业上可行的化学酶促共同生产亚砜或砜以及二硫化物的方法，特别地结合了简单、有效和经济的再循环辅因子的途径。
本发明的另一个目的是提出一种方法，其允许从在硫醇、更具体地甲基硫醇的生产期间产生的硫化物获得价值。
本发明人发现了一种生产亚砜或砜的优选选择性的化学酶促方法，其结合了用于再循环催化硫化物的氧化的酶的辅因子的系统，具有附加值。
事实上，本发明人出人意料地发现了一种化学酶促级联，其不仅与亚砜或砜生产过程相容，而且还允许共同生产第二感兴趣的产物二硫化物，而不使用牺牲底物。因此，在级联结束时硫醇氧化为二硫化物，这将能够实现在磺化氧化中使用的辅因子的再循环。
例如，当氧化剂是氧气时，级联的总方程式可写成如下：
RSR'+O2+2R"SH->RS(O)R'+H2O+R"SSR"，对于亚砜
RSR'+2O2+4R”SH->RS(O)2R'+2H2O+2R”SSR”，对于砜。
因此硫醇可被认为是氢供体。
根据本发明的酶促级联更特别地如下文所述进行。
在催化硫化物到亚砜或砜的氧化的酶(下文称为酶E)、其辅因子和在适当情况下氧化剂的存在下，硫化物被转化为亚砜或砜，并且还原的辅因子以其氧化形式重新获得。
然后，在催化在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键的酶(下文称为酶D)和该有机化合物的存在下：
-所述氧化的辅因子被还原(并且因此凭借通过有机化合物供应的氢原子而被再循环)，和
-通过在两个当量的所述有机化合物之间的二硫桥键形成二聚体(有机化合物从其还原的“单体”形式转变成其氧化的“二聚体”形式)。
然后，根据本发明，“有机化合物”理解为式R-SH的化合物，并且该化合物的“二聚体”理解为式R-S-S-R的化合物(一个众所周知的实例是谷胱甘肽G-SH的二聚体形式G-S-S-G，称为谷胱甘肽二硫化物)。
然后级联通过化学平衡结束：氧化的二聚体通过与两个当量的硫醇反应而被还原，硫醇被转化为相应的二硫化物。
因此，硫醇的存在使得可通过由Le Chatelier原理控制的化学平衡：
-将二聚体还原为两个当量的有机化合物(因此后者也由于由硫醇供应的氢原子而被再循环)；和
-形成二硫化物。
正是酶促反应使化学平衡向形成二硫化物的方向移动。
硫醇可相对于硫化物以化学计量量使用。
更特别地，形成一亚砜当量使用两个当量的硫醇，并且形成一砜当量使用四个当量的硫醇。
酶促级联运行直到底物、反应物或辅因子耗尽或通过酶E和/或D的抑制、失活或破坏。
该级联能够共同生产亚砜或砜以及二硫化物，同时再生所使用的辅因子和有机化合物。
应该注意的是，级联很可能以相反的方向开始：上述所有反应都可能逆转。
以这种方式，理解本发明的优点之一：它可被插入到从由硫醇并且更特别地甲基硫醇的生产得到的副产物获得价值的整个过程中。如上所述，在硫醇的生产中，硫化物是副产物。通过本发明，这些硫化物被氧化(优选选择性地)为亚砜或砜，并且所产生的硫醇可部分地用于再生在磺化氧化中使用的辅因子，同时它们本身被转化为二硫化物，这是其他感兴趣的产物。
因此，本发明涉及一种共同生产二硫化物以及亚砜或砜的方法，其包括以下步骤：
a)制备组合物M，其包含：
1)硫化物，
2)任选地氧化剂，
3)带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，和
6)两种酶E和D共同的辅因子；
b)进行，优选同时地，硫化物氧化和二硫桥键形成的酶促反应，以获得：
-亚砜或砜；和
-(所述有机化合物的)二聚体；
c)通过与硫醇反应，尤其是通过与硫醇化学反应将在步骤b)中获得的所述二聚体还原，以获得：
-相应的二硫化物(对应于硫醇)；和
-所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物；和
d)任选地收取：
-在步骤c)中获得的二硫化物；和/或
-在步骤b)中获得的亚砜或砜；
所述硫醇可以在步骤a)、b)或c)中的任一个中添加，并且优选地硫醇在步骤a)中添加。
定义
术语“(C1-C20)烷基”表示可为直链或支链的并且包含1至20个碳原子的饱和脂族烃。优选地，烷基包含1至12个碳原子，或甚至1至4个碳原子。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。术语“支链(的)”理解为意指烷基沿主烷基链被取代。
术语“(C2-C20)烯基”表示包含至少一个碳-碳双键的如上所定义的烷基。
术语“(C2-C20)炔基”表示包含至少一个碳-碳三键的如上所定义的烷基。
术语“(C6-C10)芳基”表示单环、双环或三环芳族烃化合物，更特别是苯基和萘基。
术语“(C3-C10)环烷基”表示包含3至10个碳原子的单环或双环饱和脂族烃，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
“(C3-C10)杂环烷烃”理解为包含3至10个碳原子并且包含至少一个硫原子(优选四氢噻吩)和任选地至少一个其他杂原子的环烷烃。
“(C4-C10)杂芳烃”理解为包含在4和10之间个碳原子并且包含至少一个硫原子(例如噻吩)和任选地至少一个其他杂原子的芳烃。
杂原子特别地理解为选自O、N、S、Si、P和卤素的原子。
“催化剂”一般理解为加速反应并且在反应结束时不变的物质。根据一个实施方案，所述酶E催化硫化物到亚砜或砜的氧化反应。根据一个实施方案，所述酶D催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体。
“催化量”特别地理解为足以催化反应、更特别地催化硫化物氧化为亚砜或砜和/或形成二硫桥键的量。更特别地，以催化量使用的反应物以较小的量使用，例如在约0.01重量％和20重量％之间，相对于以化学计量比例使用的反应物的按重量计的量计。
反应的选择性通常代表所形成的产物的摩尔数相对于反应后消耗的反应物的摩尔数。
转化率、选择性和产率的常用定义如下：
转化率＝(初始状态的反应物的摩尔数–反应后剩余的反应物的摩尔数)/(初始状态的反应物的摩尔数)
选择性＝转化成期望产物的反应物的摩尔数/(初始状态的反应物的摩尔数–反应后剩余的反应物的摩尔数)
产率＝转化率×选择性
因此，“制备亚砜的选择性方法”尤其理解为消耗硫化物并且产生亚砜而不形成砜(或形成可忽略量的砜)的方法。根据一个实施方案，硫化物到亚砜的氧化反应是化学选择性的。
“制备砜的选择性方法”尤其理解为消耗硫化物并且产生砜而不形成亚砜(或形成可忽略量的亚砜)的方法。根据一个实施方案，硫化物到砜的氧化反应是化学选择性的。
例如，根据本发明的方法，更特别是步骤b)，对于亚砜或砜提供在95％和100％之间，优选在99％和100％之间的选择性。
在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体被认为特别地对应于在所述有机化合物的两个分子之间形成二硫桥键(即，2个R-SH得到R-S-S-R)。
共同生产二硫化物以及亚砜或砜的方法
更特别地，本发明涉及一种共同生产二硫化物以及亚砜或砜的方法，其包括以下步骤：
a)制备组合物M，其包含：
1)式R1-S-R2的硫化物，
2)任选地氧化剂，
3)带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，和
6)两种酶E和D共同的辅因子；
b)进行，优选同时地，硫化物氧化和二硫桥键形成的酶促反应，以获得：
-式R1-S(O)n-R2的亚砜或砜，其中n＝1或2；和
-二聚体；
c)通过与式R3-SH的硫醇反应将在步骤b)中获得的二聚体还原，以获得：
-式R3-S-S-R3的二硫化物；和
-所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物；和
d)任选地收取：
-在步骤c)中获得的二硫化物；和/或
-在步骤b)中获得的亚砜或砜；
所述硫醇可以在步骤a)、b)或c)中的任一个中添加，并且优选地硫醇在步骤a)中添加；
其中R1、R2和R3如下文所定义。
根据一个优选的实施方案：
-硫化物是二甲基硫化物；
-带有至少一个硫醇基团的有机化合物是谷胱甘肽；
-酶E是Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，优选环己酮单加氧酶(CHMO)；
-酶D是谷胱甘肽还原酶；和
-两种酶E和D共同的辅因子是NADP。
生产亚砜或砜
根据本发明的方法尤其包括进行硫化物到亚砜或到砜的酶促氧化反应的步骤，所述反应优选地是选择性的。
在第一实施方案中，当在进行酶促硫化物氧化反应的步骤期间硫化物没有被完全消耗时，则选择性地获得亚砜。因此，根据一个实施方案，所述组合物M仍包含足以使酶E将硫化物转化为亚砜(优选不形成砜)的量的硫化物。根据一个实施方案，硫化物在组合物M中过量供应。
在这种情况下，在进行酶促反应E的步骤b)之后剩余的硫化物的量可在0.0001重量％和99.9重量％之间，优选在0.1重量％和99重量％之间，优选在1重量％和50重量％之间，例如在1重量％和10重量％之间，相对于按重量计的硫化物的起始量(即步骤a)的)计。
在第二实施方案中，当在进行酶促硫化物氧化反应的步骤期间硫化物被完全消耗时，则选择性地获得砜。因此，进行酶促氧化反应的步骤可特别地包括以下两个步骤：
b1)硫化物到亚砜的完全氧化；
b2)亚砜到砜的氧化。
“硫化物的完全氧化”意指在步骤b1)期间硫化物被完全消耗。根据一个实施方案，硫化物是组合物M中的限制性反应物(即，以缺量(deficit)存在的反应物)。“完全消耗”特别地意指在进行酶促反应的步骤b)之后剩余的硫化物的量可在0重量％和20重量％之间，优选在0重量％和5重量％之间，例如在0重量％和1重量％之间，并且还更优选在0重量％和0.01重量％之间，相对于按重量计的硫化物的起始量(即步骤a)的)计。
该反应描述于专利申请FR1906488(用于形成亚砜)和FR1906489(用于形成砜)中。
共同生产二硫化物以及亚砜或砜
步骤b)和c)或步骤a)、b)和c)优选在同一反应器中进行；更优选地，步骤b)和c)同时地进行。
在步骤a)中，组合物M的各种组分可以任何顺序添加，例如通过以任意顺序简单地混合各种组分。组合物M可在引入到反应器中之前制备或直接在反应器中制备(步骤b)和任选地步骤c)在该反应器中进行)。
在步骤b)中，酶促硫化物氧化反应可在酶促二硫桥键形成反应之前进行预或酶促二硫桥键形成反应同时进行。
更特别地，在步骤b)中，获得的有机化合物的二聚体为氧化形式，而在步骤c)中，有机化合物为还原形式。
步骤b)可尤其细分成如下多个步骤：
i)与酶E进行酶促硫化物氧化反应，以得到：
-亚砜或砜；和
-氧化形式的酶E和D共同的辅因子；
ii)与酶D进行酶促二硫桥键形成反应，以得到：
-还原形式的酶E和D共同的辅因子；和
-所述有机化合物的二聚体。
步骤i)可在步骤ii)之前进行或与步骤ii)同时进行。
进行酶促反应的步骤b)可在4和10之间，优选6和8之间并且还更优选7和8之间，例如7的pH下进行。
进行酶促反应的步骤b)可在5℃和100℃之间，优选20℃和80℃之间并且还更优选25℃和40℃之间的温度下进行。
如下所定义的细胞可在没有任何处理的情况下直接用于步骤b)中。
步骤c)可在与步骤b)相同的条件下，更特别地在与步骤b)相同的pH和相同的温度下进行。
取决于所使用的反应物和所使用的设备，用于所述酶促反应和/或步骤c)的压力的范围可为从相对于大气压的减压到几巴(几百kPa)。
根据一个实施方案，根据本发明的方法在步骤b)和步骤c)之间包括步骤b')，其中酶促反应通过酶和/或酶E和/或D的失活而停止。该步骤b')可通过已知方法进行，例如热激(例如以约100℃的温度)或渗透激，施加高压，添加能够破坏和/或沉淀细胞和/或酶E和/或D的溶剂，或pH修改(约2的低pH或约10的高pH)。
可连续地添加硫化物和/或硫醇和/或在适当情况下所述氧化剂，优选在步骤a)中。
在步骤d)中，亚砜或砜和/或二硫化物可以液体或固体形式收取。亚砜或砜和/或二硫化物可以水溶液收取，通过倾析以液体形式收取，或者甚至通过沉淀以固体形式收取，这取决于它们的溶解度。二硫化物可通过本领域技术人员熟知的技术在有机相中提取或从反应混合物分离，例如通过超滤或离心后的蒸馏。
此后，所获得的产物可任选地通过常规方法纯化。例如，在通过超滤或离心分离细胞(含有酶E和D)之后，蒸馏能够实现亚砜或砜以及二硫化物的分离。如果本领域技术人员认为该蒸馏具有任何优点，则该蒸馏可在大气压、减压(例如真空下)或更高压力下进行。出于降低用于蒸馏的混合物的水含量或加速结晶过程的目的，也可考虑膜分离。如果亚砜或砜和/或硫化物已通过从水性反应混合物倾析而收取，则可考虑在分子筛上干燥(或任何其他干燥方法)。
所述方法可分批地或连续地进行。通过本发明的方法获得的优点很多。这些优点包括在水溶液中、在非常温和的温度和压力条件下以及在接近于中性的pH条件下工作的可能性。所有这些条件都是被称为“绿色”或“可持续”的生物催化方法的典型特征。
组合物M可以催化量包含有机化合物、酶E、酶D和辅因子。组合物M可包含：
1)化学计量量的硫化物，
2)化学计量量的氧化剂，
3)催化量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化量的催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化量的催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，
6)催化量的两种酶E和D共同的辅因子；和
7)化学计量量的硫醇。
更特别地，硫醇/硫化物摩尔比在0.1和100之间，更优选在1和5之间并且优选在2和4之间，例如2。
硫化物：
硫化物特别地为有机硫化物，这是包含至少一个-C-S-C-官能团的任何有机化合物。
根据一个实施方案，组合物M包含至少一种硫化物。其可例如包含一种、两种或多种不同的硫化物。
所述硫化物可为对称的，意味着硫原子代表相对于化合物的对称中心。
根据一个实施方案，所述硫化物具有以下通式：
R1-S-R2
其中，
R1和R2可相同或不同，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基，(C2-C20)烯基，(C2-C20)炔基，(C3-C10)环烷基和
(C6-C10)芳基或
R1和R2与它们所连接的硫原子形成环，优选(C3-C10)杂环烷烃或(C4-C10)杂芳烃基团；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个取代基取代；
并且所述烷基、烯基、炔基、环烷基和芳基可包含一个或多个杂原子。
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：
(C1-C20)烷基，(C3-C10)环烷基和(C6-C10)芳基；
并且可任选地用一个或多个(一种或多种)选自(非限制性地并且通过举例的方式)醇、醛、酮、酸、酰胺、腈和酯官能团或带有硫、磷和硅的官能团的官能团进行官能化。
根据一个实施方案，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C20)烷基，(C3-C10)环烷基，(C6-C10)芳基，-OH，-C(O)OH，-C(O)H，-C(O)-NH2，-NH2，-NHR，-NRR'，-C(O)-，-C(O)-NHR'，-C(O)-NRR'，-COOR和–CN；
其中R和R'彼此独立地代表(C1-C20)烷基。
根据一个优选的实施方案，R1和R2可相同或不同，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基，(C2-C20)烯基，(C2-C20)炔基和(C3-C10)环烷基或
R1和R2与它们所连接的硫原子一起形成(C3-C10)杂环烷烃基团。
R1和R2优选选自(C1-C20)烷基或R1和R2与带有它们的硫原子一起形成(C3-C10)杂环烷烃。所述硫化物的基团R1和R2优选是相同的(即，这样形成对称的硫化物)。
硫化物更优选选自二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、双十二烷基硫化物和四氢噻吩。硫化物可选自二甲基硫化物、二乙基硫化物、二正丙基硫化物、二异丙基硫化物、二正丁基硫化物、二异丁基硫化物、二仲丁基硫化物、二叔丁基硫化物、二正辛基硫化物、二正十二烷基硫化物和四氢噻吩。根据本发明，二甲基硫化物是特别优选的。根据一个实施方案，硫化物是对称的。
硫醇：
硫醇特别地意指有机硫醇，即包含至少一个-C-SH类型的官能团的任何有机化合物。
根据一个实施方案，硫醇具有通式R3-SH，其中R3是任选取代的、饱和的、直链的、支链的或环状的烃基团。
更特别地，硫醇具有通式R3-SH，其中R3是饱和的、直链的、支链的或环状的烃基团，任选地被至少一个选自以下的基团取代：
-OH，-C(O)OH，-NH2，-ORa，-C(O)ORa，-N(Ra)H，-NRaRb和(C6-C10)芳基；
其中Ra和Rb彼此独立地选自(C1-C20)烷基。
硫醇优选具有通式R3-SH，其中R3是饱和的、直链的、支链的或环状的烃基团，任选地被至少一个例如一个或两个选自以下的基团取代：-OH，-C(O)OH，-NH2和(C6-C10)芳基，更优选-OH，-C(O)OH和-NH2。
R3更特别地选自甲基、乙基、辛基和十二烷基，并且优选R3是甲基。
硫醇可选自：
巯基乙醇，甲基硫醇，乙基硫醇，丙基硫醇，丁基硫醇，辛基硫醇，十二烷基硫醇，苄基硫醇，巯基乙酸，3-巯基丙酸，半胱氨酸和高半胱氨酸。
硫醇尤其选自：
巯基乙醇，甲基硫醇，乙基硫醇，正丙基硫醇，异丙基硫醇(或2-丙硫醇)，正丁基硫醇，仲丁基硫醇，叔丁基硫醇，正辛基硫醇，叔辛基硫醇，正十二烷基硫醇，叔十二烷基硫醇，苄基硫醇，巯基乙酸，3-巯基丙酸，半胱氨酸和高半胱氨酸。
硫醇优选为甲基硫醇。
氧化剂：
氧化剂理解为能够将硫化物氧化为亚砜或砜的任何化合物。
氧化剂可选自空气、贫氧空气、富氧空气和纯氧气。
当使用空气(可能贫氧或富氧的空气)时，显然正是空气中的氧气在步骤b)中进行的酶促氧化反应期间作为氧化剂被消耗。
当氧化剂为气态时，其以溶解的气体的形式存在于组合物M中。以本领域技术人员已知的方式根据反应速率和与酶促系统的相容性来选择富集或贫化空气中的氧气的百分比。
氧化剂在组合物M中可为化学计量量或过量的。过量时，存在的硫化物在步骤b)中进行的酶促硫化物氧化反应中被氧化剂完全消耗(形成砜)。
氧化剂在组合物M中可为亚化学计量量。因此，存在的硫化物在步骤b)中进行的酶促硫化物氧化反应中被氧化剂部分地消耗但不是全部消耗(形成亚砜)。
在所述氧化反应结束时，当使用的酶E是单加氧酶时，氧气通常被转化为水，或者当酶E是双加氧酶时氧气被完全消耗。因此，根据本发明的方法在排放和环境友好方面是特别有利的。
酶E：
“氧化酶”特别地理解为酶E，即能够实现硫化物到亚砜和/或砜的氧化并且需要使用辅因子的酶。
所述酶E可为氧化还原酶，优选选自单加氧酶和双加氧酶、还更优选选自单加氧酶的氧化还原酶。
所述酶E优选地是Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)。
还更优选地，并且在BVMO中，酶E可为环己酮单加氧酶(CHMO)并且更特别为环己酮1,2-单加氧酶，环戊酮单加氧酶(CPMO)并且更特别为环戊酮1,2-单加氧酶，或羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO)并且更特别为4-羟基苯乙酮单加氧酶。
环己酮1,2-单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.22类。
根据一个特别的实施方案，CHMO是来自不动杆菌属种(Acinetobacter sp.)(例如，菌株NCIMB 9871的)的CHMO和/或由属于簇AB006902的基因chnB编码的CHMO。
环戊酮1,2-单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.16类。
根据一个特别的实施方案，CPMO是来自丛毛单胞菌属种(Comamonas sp.)(例如，菌株NCIMB 9872)的CPMO和/或由基因cpnB编码的CPMO。
羟基苯乙酮单加氧酶特别地来自EC 1.14.13.84类。根据一个特别的实施方案，HAPMO是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的由基因hapE编码的HAPMO。
酶D和带有硫醇基团的有机化合物：
带有硫醇基团的有机化合物理解为带有至少一个-SH基团的具有或不具有杂原子和/或任何类型的已知化学官能团的任何烃化合物(下文称为有机化合物)。根据本发明的有机化合物可包含一个或两个硫醇基团(-SH基团)。该化合物可以二聚体形式存在，该二聚体是由于在两个当量的所述有机化合物之间的二硫桥键而形成的(2个R-SH得到R-S-S-R)。
有机化合物可选自带有硫醇基团的氨基酸、带有硫醇基团的肽、霉菌硫醇(CASNo.192126-76-4)和二氢硫辛酸(CAS No.462-20-4)。所述有机化合物优选为带有硫醇基团的氨基酸或带有硫醇基团的肽。所述有机化合物更特别地选自：半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、霉菌硫醇和二氢硫辛酸。
根据一个实施方案，当根据本发明的硫醇是半胱氨酸或高半胱氨酸时，则所述有机化合物(分别地)不同于半胱氨酸或高半胱氨酸。根据一个实施方案，有机化合物和硫醇是不同的。
所述有机化合物更具体地选自：半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫氧还蛋白。
特别优选地，所述有机化合物是谷胱甘肽。谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽二硫化物(GSSG)对(couple)在生物学中广为人知。在还原形式(谷胱甘肽)或氧化形式(谷胱甘肽二硫化物)中，该实体在细胞中形成重要的氧化还原对。
酶D催化在两个当量的所述有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体(在描述中称为一个(a)、一种(one)或所述(the)二聚体)。特别地，其催化在两个当量的带有硫醇基团的氨基酸之间或在两个当量的带有硫醇基团的肽之间形成二硫桥键以形成二氨基酸或二肽。酶D可被定义为还原或氧化的共同辅因子的“再循环酶”，并且优选地将氧化的共同辅因子再循环为还原的共同辅因子。
它可为还原酶或脱氢酶，并且优选地其可选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、半胱氨酸还原酶、高半胱氨酸还原酶、霉菌硫醇二硫化物还原酶和二氢硫辛酰脱氢酶。酶D更特别地选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、半胱氨酸还原酶和高半胱氨酸还原酶。
谷胱甘肽还原酶可通过酶分类号EC 1.8.1.7或EC 1.6.4.2代表；半胱氨酸还原酶可通过号EC 1.8.1.6代表；硫氧还蛋白还原酶可通过号EC 1.8.1.9或EC 1.6.4.5代表；霉菌硫酮(mycothione)还原酶可通过号EC 1.8.1.15代表(该酶也称为霉菌硫醇二硫化物还原酶)。特别优选地，所述酶D是谷胱甘肽还原酶。
更具体地，每种有机化合物与其相应的酶D偶联，从而能够形成相应的二聚体。以下的有机化合物/酶D酶对或复合体(complex)因此对于实施根据本发明的方法特别有用：
-谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶，
-硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶，
-半胱氨酸/半胱氨酸还原酶，
-高半胱氨酸/高半胱氨酸还原酶，
-霉菌硫醇/霉菌硫醇二硫化物还原酶，和
-二氢硫辛酸/二氢硫辛酰脱氢酶。
共同辅因子：
“共同辅因子”尤其理解为是酶E和酶D的催化活性所需的(如上文所定义)和/或允许增强它们的催化活性的辅因子。酶E和D的“共同的辅因子”优选理解为能够通过这些酶的作用被还原和/或氧化的辅因子。
根据一个实施方案，组合物M中存在一种或两种或更多种辅因子。例如，可将组合物M与已经天然存在于酶E和/或酶D中的辅因子以及另外的辅因子混合。
所述辅因子可选自烟碱辅因子和黄素辅因子。更特别地，所述辅因子可选自：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，黄素单核苷酸(FMN)，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和/或其相应的还原形式(即，NADH,H+，NADPH,H+，FMNH2，FADH2)。
以上列出的辅因子有利地以其还原形式(例如，NADPH,H+)和/或它们的氧化形式(例如，NADP+)使用，也就是说，它们可以这些还原和/或氧化形式，优选以还原形式添加至组合物M。
优选地，使用的酶E是环己酮单加氧酶，例如来自不动杆菌属种的环己酮单加氧酶，并且使用的辅因子是NADP，任选地补充有FAD，并且酶D是谷胱甘肽还原酶。
根据本发明的组合物M还可包含：
-任选地一种或多种溶剂，其选自水，缓冲液例如磷酸盐缓冲液，Tris-HCl，Tris碱，碳酸氢铵，乙酸铵，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)，或盐例如氯化钠，氯化钾，或其混合物；
-任选地添加剂例如表面活性剂，以特别地促进酶促反应的一种或多种反应物或底物的溶解性。
优选地，组合物M是水溶液。例如，所述组合物M包含在50重量％和99重量％之间的水，优选在80重量％和97重量％之间的水，相对于组合物M的总重量计。
根据一个实施方案，组合物M被认为包含反应混合物。
在以上步骤a)中制备的组合物M的各种组分可容易地商购获得或可通过本领域技术人员熟知的技术制备。这些不同的要素可为固体、液体或气态形式，并且可非常有利地制成溶液或溶解在水或任何其他溶剂中以用于本发明的方法。也可将所使用的酶接枝到载体上(在负载酶的情形中)。
根据一个实施方案，酶E和/或D、任选地有机化合物和任选地共同辅因子是：
-呈分离和/或纯化的形式，例如在水溶液中；
-或在粗提物中，即在研磨的细胞的提取物中；或
-在全细胞中。
优选使用全细胞。[硫化物](以mmol/L为单位)/[细胞](以gcdw.L-1为单位)的比率可在0.01和10mmol/gcdw之间，优选在0.01和3mmol/gcdw之间，优选在进行酶促反应的步骤b)期间。以克数为单位的干细胞质量浓度(对于细胞干重的gCDW)通过常规技术确定。
酶E和/或D在所述细胞中可过表达或可不过表达，所述细胞在下文称为宿主细胞。
宿主细胞可为适合于由相应编码基因的表达产生酶E和/或D的任何宿主。然后该基因将位于宿主的基因组中或由表达载体(例如下文定义的那些)携带。
出于本发明的目的，“宿主细胞”特别地理解为原核或真核细胞。通常用于表达重组或非重组蛋白的宿主细胞特别地包括细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)或假单胞菌属(Pseudomonas))的细胞，酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris))的细胞，真菌(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)或里氏木霉(Trichodermareesei))的细胞，昆虫细胞例如Sf9细胞，或者哺乳动物(特别地，人)细胞例如HEK 293、PER-C6或CHO细胞系。
所述宿主细胞可处于稳定生长期，例如已经从培养介质移出。
优选地，酶E和/或D、任选地有机化合物和任选地共同辅因子在大肠杆菌中表达。CHMO和/或HAPMO优选在大肠杆菌的菌株(例如大肠杆菌BL21(DE3))内表达。
将包含酶E和/或D的编码序列的表达载体整合在细胞宿主中当使用诸如质粒的表达载体时，原核和真核细胞的转化是本领域技术人员熟知的技术，例如通过脂转染、电穿孔、热激或通过化学方法。根据选择的宿主细胞选择表达载体和将表达载体引入宿主细胞内的方法。该转化步骤产生表达编码重组酶E和/或D的基因的经转化的细胞。可在培养/温育步骤中培养细胞以产生酶E和/或D。
原核和真核细胞的温育/培养是技术人员熟知的技术，技术人员能够确定例如培养介质或者温度和时间条件。取决于所使用的载体，可观察到诱导期——对应于酶E和/或D的增加的产生。可考虑使用弱的(例如对于载体pBad而言的阿拉伯糖)或强的(例如对于载体pET22b、pRSF等而言的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG))诱导剂(inductor)。可使用SDS-PAGE电泳技术或Western印迹技术验证宿主细胞产生酶E和/或D。
“表达载体”是一种尺寸减小的DNA分子，可向其中插入感兴趣的核苷酸序列。可从许多已知的表达载体(例如质粒、粘粒、噬菌体等)中进行选择。
载体特别地根据所使用的细胞宿主来选择。
所讨论的表达载体可为，例如，在文献WO 83/004261中描述的那些。
在不存在表达载体的情况下，将酶E和/或D的编码序列整合在宿主细胞的基因组 中
编码酶E和/或D的核苷酸序列可通过任何已知方法整合到宿主细胞的基因组中，例如通过同源重组或者通过系统CRISPR-Cas9等。可使用SDS-PAGE电泳技术或Western印迹技术验证宿主细胞产生酶E和/或D。
酶E和/或D的分离和/或纯化用于以分离和/或纯化的形式使用
在转化的宿主细胞的转化和培养/温育之后，可进行酶E和/或D的分离和任选地纯化的步骤。以此方式，根据本发明的方法不是在宿主细胞的存在下进行，而是通过溶解在组合物M中的酶E和/或D，优选地在水溶液中的酶E和/或D进行。
产生的所述酶E和/或D的分离和/或纯化可通过本领域技术人员已知的任何方式进行。这可例如涉及选自以下的技术：例如，电泳，分子筛分，超速离心，差示沉淀，例如用硫酸铵，超滤，膜或凝胶过滤，离子交换，通过疏水相互作用的分离，或亲和色谱，例如IMAC。
宿主细胞的裂解方式，研磨的细胞的粗提物的制备
细胞裂解物可通过各种已知技术获得，例如超声处理、压力(French压机)、通过使用化学试剂(例如，Triton)等。获得的裂解物对应于研磨的细胞的粗提物。
组合物和用途
本发明还涉及一种组合物，其包含：
1)硫化物，
2)任选地氧化剂，
3)带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，
6)两种酶E和D共同的辅因子，和
7)硫醇。
本发明还涉及硫醇用于再生或再循环辅因子(酶辅因子，尤其如上文所定义)，优选用于硫化物的酶促氧化的辅因子的用途。“再生”或“再循环”尤其理解为辅因子从氧化形式到还原形式的转变，或反之。
本发明还涉及硫醇用于还原在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成的二硫桥键的用途，所述硫醇优选被转化为相应的二硫化物。所述二硫桥键优选通过酶促催化形成，尤其是如上文对酶D所定义的。优选地，所述硫醇是甲基硫醇并且所述有机化合物是谷胱甘肽。硫醇的该用途尤其被设想为再生或再循环辅因子、尤其是在硫化物的酶促氧化中使用的辅因子的途径。
本发明还涉及硫化物的酶促氧化的方法，包括通过硫醇再生或再循环辅因子的步骤。
本发明还涉及使用硫醇还原在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成的二硫桥键的方法，所述硫醇优选被转化为相应的二硫化物。
更特别地，硫化物、氧化剂、有机化合物、酶E、酶D、辅因子、硫醇以及酶促和化学反应如上文所定义，尤其是在根据本发明的共同生产方法的上下文中。
附图说明
图1：图1代表，当氧化反应通过酶CHMO催化时，存在于反应介质中的二乙基硫化物(DES)、二乙基亚砜(DESO)和双(2-羟乙基)二硫化物(二硫化物)的浓度(以mM为单位)作为时间(以小时表示)的函数。还添加了能够实现辅因子NADP的再循环的级联的要素：以与表达CHMO的细胞相同的浓度添加来自大肠杆菌的过表达谷胱甘肽还原酶(GR)的细胞，以催化量引入氧化的谷胱甘肽(GSSG)，以及以相对于DES两倍的浓度引入2-巯基乙醇。
图2：图2代表，当氧化反应通过酶CHMO催化时，存在于反应介质中的二乙基亚砜(DESO)、二乙基砜(DESO2)和双(2-羟乙基)二硫化物(二硫化物)的浓度(以mM为单位)作为时间(以小时表示)的函数。还添加了能够实现辅因子NADP的再循环的级联的要素：以与表达CHMO的细胞相同的浓度添加来自大肠杆菌的过表达谷胱甘肽还原酶(GR)的细胞，以催化量引入氧化的谷胱甘肽(GSSG)，以及以相对于DESO两倍的浓度引入2-巯基乙醇。
图3：图3代表，当反应通过酶CHMO催化时，存在于反应介质中的二乙基亚砜(DESO)的浓度(以mM为单位)作为时间(以小时表示)的函数。在该实(施)例中，2-巯基乙醇被甲基硫醇(MeSH)替代作为质子供体。还添加了能够实现辅因子NADP的再循环的级联的要素：以与表达CHMO的细胞相同的浓度添加来自大肠杆菌的过表达谷胱甘肽还原酶(GR)的细胞，以催化量引入氧化的谷胱甘肽(GSSG)，以及将MeSH以约4mmol/L/h的流速逐渐添加至反应介质。
图4：图4是根据本发明的酶促级联的图示。
将硫醇和硫化物引入到反应介质中，所述反应介质包含：
-CHMO(对应于酶E)，
-NADPH(共同辅因子)，
-谷胱甘肽还原酶(对应于酶D)，
-谷胱甘肽二硫化物或谷胱甘肽(对应于二聚体或包含至少一个硫醇基团的有机化合物)。
特别地，取决于硫化物的引入方式，连续引入空气，从而能够实现硫化物到亚砜或砜的氧化。然后产生酶促级联。
与形成亚砜或砜同时地，共同辅因子NADPH被氧化为NADP+。由于两个谷胱甘肽分子的存在，NADP+再次被还原为NADPH,H+，2个谷胱甘肽分子(2GSH)得到谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。为了终止级联，谷胱甘肽二硫化物通过化学平衡能够使2分子的硫醇氧化为相应的二硫化物，从而再生2分子的谷胱甘肽。
以下实施例是出于说明的目的而给出的，并且不限制本发明。
实施例
实施例1：通过使用2-巯基乙醇从二乙基硫化物选择性合成二乙基亚砜。
I.生物催化剂的制备：
环己酮单加氧酶(CHMO)的生产
预先构建表达插入到质粒pET22b(由Promega,Qiagen销售)中的chnB基因的大肠杆菌BL21(DE3)(由Merck Millipore销售)菌株。它能够实现来自不动杆菌属种的环己酮单加氧酶(CHMO)的异源表达。
理解的是，所述菌株同时含有CHMO和CHMO的辅因子，即NADP和FAD。
该菌株通过本领域技术人员已知的技术进行预培养和培养。
在通过以0.85mmol/L的终浓度添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)触发的诱导阶段之后，将一定体积的培养物离心(10min，5000g，4℃)以得到期望量的细胞。
谷胱甘肽还原酶(GR)的生产
根据本领域技术人员已知的技术设计表达插入到质粒pET26b+(由Promega,Qiagen销售)上的gor基因的大肠杆菌BL21(DE3)(由Merck Millipore销售)菌株。其允许来自大肠杆菌的谷胱甘肽还原酶(GR)的异源表达。
理解的是，所述菌株同时含有GR和GR的辅因子，即NADP。
该菌株通过本领域技术人员已知的技术进行预培养和培养。
在通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)触发的诱导阶段之后，将一定体积的培养物离心(10min，5000g，4℃)以得到期望量的细胞。
II.生物转化：
在该实施例中，将新鲜细胞的沉淀(pellets，团块)重悬在32mL的pH 8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。对于过表达CHMO和GR的细胞，随后获得的细胞浓度为62ODU/mL或20gCDW/L(其中CDW代表细胞干重)。
在250mL烧瓶中，在t＝0时，存在的初始浓度为3mmol/L的二乙基硫化物(DES)、6mmol/L的2-巯基乙醇和0.25mmol/L的氧化的谷胱甘肽(GSSG)，最终体积为32mL。
以规律的间隔，取出200μL的反应混合物并且在1000μL的乙腈溶液中稀释。在离心(5min，12 500g)之后，将上清液注射在GC中，使用预先获得的校准标准范围，对反应期间形成的二乙基亚砜(DESO)和双(2-羟乙基)二硫化物(二硫化物)进行定量测量。在进行分析的条件下，最小可测量浓度为50μM。
随着时间的推移，测得DESO量的线性增加，没有检测到砜(DESO2)。然后硫化物的初始氧化速率为每小时每升介质氧化1mmol的DES(图1)。类似量的双(2-羟乙基)二硫化物与DESO的产生同时产生，从而验证偶联的GSSG/GR系统用于再循环辅因子的功能适当。应注意，在减去与2-巯基乙醇的缓慢自发氧化相关的背景噪声(在级联的所有要素，除了过表达CHMO的细胞之外，均存在的情况下确定的背景噪声(在相同条件下))之后，确定作为时间的函数的双(2-羟乙基)二硫化物的浓度。
通过CHMO催化的反应是化学选择性的，因为只有当DES已经被完全消耗时，将DESO转化成DESO2的反应才发生。替代地表述，当反应介质中存在DES时，不形成砜。
获得的选择性为大约100％。当DES仍然存在于反应介质中时，使用所使用的分析工具未检测到砜。在反应结束时(t＝4h)，获得大约100％的DESO，通过所使用的分析工具未检测到DESO2。
实施例2：通过使用2-巯基乙醇作为氢供体从二乙基亚砜选择性合成二乙基砜。
I.生物催化剂的制备：
在该实施例中使用了与实施例1中描述的那些相同的菌株，即来自大肠杆菌的过表达CHMO和GR的菌株。
进行离心(10min，5000g，4℃)，并且然后将沉淀重悬在32mL的pH 8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。然后使用每个菌株62ODU/mL(或大约20gCDW/L)的细胞浓度用于反应测试。
II.生物转化：
在250mL烧瓶中，在t＝0时，同时添加3mmol/L的二乙基亚砜(DESO)、6mmol/L的2-巯基乙醇和0.25mmol/L的氧化的谷胱甘肽(GSSG)，最终体积为32mL。
以规律的间隔，取出200μL的反应混合物并且在1000μL的乙腈溶液中稀释。在离心(5min，12 500g)之后，将上清液注射在GC中，使用先前获得的校准标准范围，对反应期间形成的二乙基砜(DESO2)和双(2-羟乙基)二硫化物(二硫化物)进行定量测量。
随着时间的推移，测得DESO2的量线性增加。然后亚砜的初始氧化速率为每小时每升介质氧化0.75mmol的DESO(图2)。平行地，类似量的双(2-羟乙基)二硫化物与DESO2的产生同时产生。因此，添加的2-巯基乙醇确实使得可通过级联依赖性途径再循环辅因子NADP。背景噪声以与实施例1相同的方式扣除。
实施例3：通过使用甲基硫醇(MeSH)作为氢供体从二乙基硫化物选择性合成二乙基亚砜。
I.生物催化剂的制备：
在该实施例中使用了与实施例1和2中描述的那些相同的菌株，即来自大肠杆菌的过表达CHMO和GR的菌株。在该生物催化的反应中，2-巯基乙醇被MeSH替代。
II.生物转化：
在该实施例中，将新鲜细胞的沉淀(pellets，团块)重悬在200mL的pH 8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。对于过表达CHMO和GR的细胞，然后获得的细胞浓度为62ODU/mL或20gCDW/L(其中CDW代表细胞干重)。
1L反应器在t＝0时同时装入：10mmol/L的二乙硫化物(DES)、0.25mmol/L的氧化的谷胱甘肽(GSSG)以及预先制备的酶溶液。另外，通过甲基硫醇钠的硫酸酸化将甲基硫醇逐渐添加至反应介质(流速调节至大约4mmol/L/h)。然后以40μL/h的流速逐渐添加纯二乙基硫化物，以确保DES浓度恒定，并且气囊(bladder)能够定期添加进行反应所需的O2。通过在30℃的受控温度下搅拌来引发反应。
以规律的间隔，取出200μL的反应混合物并且在1000μL的乙腈溶液中稀释。在离心(5min，12 500g)之后，将上清液注射在GC中，使用先前获得的校准标准范围，对反应期间潜在地形成的二乙基亚砜(DESO)和二乙基砜(DESO2)进行定量测量。在进行分析的条件下，最小可测量浓度为50μM。
随着时间的推移，测得DESO的量线性增加，没有检测到砜(DESO2)。然后硫化物的初始氧化速率为每小时每升介质氧化0.2mmol的DES(图3)。二甲基二硫化物(DMDS)与DESO的产生同时产生，从而验证偶联的GSSG/GR系统用于再循环辅因子的功能适当。
通过CHMO催化的反应是化学选择性的，因为由于DES在整个反应过程中存在于反应介质中，因此不发生将DESO转化成DESO2的反应。

Claims (18)

1.共同生产二硫化物以及亚砜或砜的方法，其包括以下步骤：
a)制备组合物M，其包含：
1)硫化物，
2)任选地氧化剂，
3)带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，和
6)两种酶E和D共同的辅因子；
b)进行，优选同时地，硫化物氧化和二硫桥键形成的酶促反应，以获得：
-亚砜或砜；和
-二聚体；
c)通过与硫醇反应将在步骤b)中获得的二聚体还原，以获得：
-相应的二硫化物；和
-所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物；和
d)任选地收取：
-在步骤c)中获得的二硫化物；和/或
-在步骤b)中获得的亚砜或砜；
所述硫醇可以在步骤a)、b)或c)中的任一个中添加，并且优选地硫醇在步骤a)中添加。
2.如权利要求1所述的共同生产方法，其中硫醇具有通式R3-SH，其中R3是任选取代的、饱和的、直链的、支链的或环状的烃基团。
3.如权利要求2所述的共同生产方法，其中R3选自甲基、乙基、辛基和十二烷基，并且优选R3是甲基。
4.如权利要求2所述的共同生产方法，其中硫醇选自：巯基乙醇，甲基硫醇，乙基硫醇，正丙基硫醇，异丙基硫醇(或2-丙硫醇)，正丁基硫醇，仲丁基硫醇，叔丁基硫醇，正辛基硫醇，叔辛基硫醇，正十二烷基硫醇，叔十二烷基硫醇，苄基硫醇，巯基乙酸，3-巯基丙酸，半胱氨酸和高半胱氨酸。
5.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述有机化合物选自带有硫醇基团的氨基酸、带有硫醇基团的肽、霉菌硫醇和二氢硫辛酸，并且优选地所述有机化合物为带有硫醇基团的氨基酸或带有硫醇基团的肽。
6.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述有机化合物选自：半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、霉菌硫醇和二氢硫辛酸，优选谷胱甘肽。
7.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述酶E为氧化还原酶，优选选自单加氧酶和双加氧酶的氧化还原酶，更优选单加氧酶。
8.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述酶D为还原酶或脱氢酶，优选选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、半胱氨酸还原酶、高半胱氨酸还原酶、霉菌硫醇二硫化物还原酶和二氢硫辛酰脱氢酶，并且优选地酶D为谷胱甘肽还原酶。
9.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述硫化物具有通式：
R1-S-R2
其中，
R1和R2可相同或不同，并且彼此独立地选自：
(C1-C20)烷基，(C2-C20)烯基，(C2-C20)炔基，(C3-C10)环烷基和(C6-C10)芳基
或
R1和R2与它们所连接的硫原子一起形成杂环烷烃或杂芳烃；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷烃和杂芳烃基团可任选地被一个或多个取代基取代；
并且所述烷基、烯基、炔基、环烷基和芳基可包含一个或多个杂原子。
10.如权利要求9所述的共同生产方法，其中所述硫化物的基团R1和R2是相同的。
11.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述硫化物选自二甲基硫化物、二乙基硫化物、二丙基硫化物、二丁基硫化物、二辛基硫化物、双十二烷基硫化物和四氢噻吩，优选二甲基硫化物。
12.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中所述氧化剂选自空气、贫氧空气、富氧空气和纯氧气。
13.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中辅因子选自烟碱辅因子和黄素辅因子。
14.如前述权利要求中任一项所述的共同生产方法，其中：
-硫化物是二甲基硫化物；
-带有至少一个硫醇基团的有机化合物是谷胱甘肽；
-酶E是Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)，优选环己酮单加氧酶(CHMO)；
-酶D是谷胱甘肽还原酶；和
-两种酶E和D共同的辅因子是NADP。
15.组合物，其包含：
1)硫化物，
2)任选地氧化剂，
3)带有至少一个硫醇基团的有机化合物，
4)催化所述硫化物到亚砜或砜的氧化的酶E，
5)催化在两个当量的所述带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成二硫桥键以形成二聚体的酶D，
6)两种酶E和D共同的辅因子，和
7)硫醇。
16.硫醇用于再生或再循环在硫化物到亚砜或砜的酶促氧化中使用的辅因子的用途。
17.如权利要求16所述的硫醇的用途，用于还原在两个当量的带有至少一个硫醇基团的有机化合物之间形成的二硫桥键，所述硫醇优选被转化为相应的二硫化物。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述硫醇为甲基硫醇并且所述有机化合物为谷胱甘肽。
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