KR20220129024A - 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰의 공동생성을 위한 화학효소적 방법 - Google Patents

디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰의 공동생성을 위한 화학효소적 방법 Download PDF

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베로니크 알판드
카티아 듀케누
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아르끄마 프랑스
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위니베르시떼 덱스-마르세이유
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Abstract

본 발명은 1) 설파이드, 2) 임의적으로 산화제, 3) 적어도 하나의 티올 모이어티를 보유하는 유기 화합물, 4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E, 5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 모이어티를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이에 디설파이드 가교의 형성을 촉매하는 효소 D, 및 6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자를 포함하는 조성물 M으로부터 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰을 공동생성하기 위한 화학효소적 방법; 및 또한 특히 이러한 방법의 구현을 가능하게 하는 조성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 티올 모이어티를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이에 형성된 디설파이드 가교를 환원시키기 위한 메르캅탄의 용도, 및 더욱 특히, 상기 기재된 방법의 재생 기질로서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰의 공동생성을 위한 화학효소적 방법
본 발명은 각각 메르캅탄 및 설파이드로부터 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰을 공동생성하기 위한 화학효소적 방법, 및 특히 이 방법의 수행을 가능하게 하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이에 형성된 디설파이드 가교를 환원시키기 위한 메르캅탄의 용도, 및 더욱 특히 설파이드의 산화를 가능하게 하는 효소 캐스케이드의 재생 기질로서의 메르캅탄의 용도에 관한 것이다.
메르캅탄은 산업적으로 큰 관심을 받고 있으며, 현재 화학산업, 특히 더욱 복잡한 유기 분자의 합성에서 출발 물질로서 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 메틸 메르캅탄(CH3SH)은 동물 영양에 사용되는 필수 아미노산인 메티오닌 합성의 출발 물질로 사용된다. 메틸 메르캅탄은 또한 디알킬 디설파이드의 합성, 다른 적용분야 중에서도 특히 석유 분별용 촉매를 수소화 처리하기 위한 설파이딩 첨가제인 디메틸 디설파이드(DMDS)의 합성에 사용된다.
메르캅탄, 및 더욱 특히 메틸 메르캅탄은 일반적으로 하기 식 (1)에 따라 촉매의 존재 하에 승온에서 알콜 및 하이드로겐 설파이드로부터 출발하는 공지된 방법에 의해 산업적으로 합성된다:
Figure pct00001
그러나, 이 반응은 하기 식 (2)에 따라 설파이드와 같은 부산물의 형성을 초래한다:
Figure pct00002
메르캅탄은 또한 하기 식 (3)에 따라 할로겐화된 유도체 및 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄 하이드로설파이드로부터 합성될 수 있다(예를 들어, 염소화된 유도체 및 소듐 하이드로설파이드를 사용하여 주어진 예):
Figure pct00003
이러한 제2 합성 경로는 또한 원치 않는 설파이드의 존재를 발생시킨다.
마지막으로 메르캅탄은 올레핀과 하이드로겐 설파이드로부터 대상이 분지형 또는 비분지형 메르캅탄인지에 따라 광화학적으로 또는 산 촉매에 의해 하기 식 (4)에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00004
다시 한번, 이 합성은 부산물로서 설파이드를 발생시킨다.
이러한 설파이드는 산업적으로 대량으로 얻어지며, 주로 파기를 위해 보내진다. 이는 의도된 메르캅탄을 생산하는 과정에서 효율성 손실과 이를 파기하는 것과 관련된 추가 비용을 나타낸다. 이러한 방식의 폐기물 생성은 메르캅탄의 생산자에게 실제 산업적 문제가 되며, 따라서 이들은 이러한 부산물로부터 가치를 이끌어내려고 한다. 이를 수행하는 다양한 방법이 있다.
우선, 설파이드 자체에 대한 시장이 존재한다: 디메틸 설파이드는 석유 공급원료의 증기 분해에서 코킹 방지제로서 또는 식품 향미제로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 시장의 수요는 생성된 설파이드의 양보다 훨씬 더욱 적다. 설파이드는 또한 황가수분해 반응에 의해 상응하는 메르캅탄으로 전환될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 반응을 수행하는데 필요한 조건은 비교적 엄격하고 새로운 기생 반응을 일으키게 된다. 따라서, 이러한 산업적 적용은 제한적이다. 마지막으로, 생성된 설파이드로부터 가치를 도출하는 또 다른 수단은 설파이드를 설폭사이드 및/또는 설폰으로 전환시키는 설파이드의 산화 반응을 포함한다. 이러한 종류의 화학적 산화 반응은 잘 알려져 있다. 이들은 촉매의 존재 또는 부재하에 다양한 유형의 산화제, 예컨대 소듐 하이포클로라이트, 과산화수소, 산소, 오존 또는 질소 산화물, 예컨대 N2O4를 수반한다.
화학적 산화뿐만 아니라 설파이드 산화는 생물학적 과정에서 용액 또는 유기체, 일반적으로 미생물에서 효소 촉매작용에 의해 촉매될 수 있다.
특허 출원 FR1906488 및 FR1906489는 각각 효소 촉매작용에 의해 유기 설파이드로부터 설폭사이드 또는 설폰을 제조하기 위한 선택적 방법을 기술하고 있다. 이들 두 특허 출원의 내용은 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.
이와 같이, 이들 두 특허에 기술된 방법은 효소 반응 동안 존재하는 설파이드의 양에 따라 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소를 사용하여 설폭사이드 또는 설폰을 선택적으로 수득할 수 있게 한다. 효소적 설파이드 산화 반응을 수행하는 단계 동안 설파이드가 완전히 소모되지 않은 경우, 선택적으로 설폭사이드가 수득된다. 효소적 설파이드 산화 반응을 수행하는 단계 동안 설파이드가 완전히 소모되는 경우, 선택적으로 설폰이 수득된다.
그러나, 사용되는 효소는 효소 산화 반응이 다시 일어날 수 있도록 재활용(또는 재생)될 수 있어야 하는 보조인자의 사용을 필요로 할 수 있다.
이는 보조인자가 이들의 복잡성과 경제적인 이유로 산업적 효소 공정에 일반적으로 화학량론적 양으로 첨가되지 않는 이유이다. 따라서, 이들을 재활용하고 그로부터 생성되는 효소 캐스케이드를 재생하기 위한 다양한 접근 방식이 개발되었다.
- 보조인자와 유사한 분자의 사용. 이러한 접근법은 더 간단하고 따라서 비용이 덜 드는 분자를 사용하는 것을 포함한다. 그러나, 친화성이 생성되는 효소와 보조인자 사이의 친화성은 산업적 적용을 고려할 만큼 충분히 높지 않으며, 이러한 접근 방식은 저부가가치 생성물을 생성하기 위한 산업적 공정에 있어서 수용할 수 없는 비용을 나타낸다;
- 희생 기질의 사용과 함께 효소적 산화환원 시스템의 사용. 이러한 기술은 일반적으로 사용된 보조인자가 재활용되게 하는 제2 효소의 사용을 필요로 한다. 그러나 희생 기질의 비용은 이러한 공정의 경제적 실행 가능성에 큰 영향을 미친다. 이는 설파이드가 저부가가치의 설폭사이드 또는 설폰으로 산화되는 경우 특히 그러하다.
- 전세포의 사용. 이 경우 이는 사용된 보조인자 또는 보조인자들을 재생하는 세포 기계이다. 따라서, 이 공정은 발효 공정에 더 가깝다: 탄소-/수소-함유 분자(예컨대 글루코스 또는 글리세롤)는 일반적으로 이러한 시스템의 성능 특성을 향상시키기 위해 추가되며, 이는 추가 비용을 나타낸다.
결과적으로, 설파이드의 산화를 위한 효소적 공정에 사용되는 보조인자의 재생을 위한 산업적으로 실행가능한 경로가 필요하다.
또한, 산업적으로 및 경제적으로 실행 가능한 설파이드, 특히 메르캅탄 합성으로부터 발생하는 설파이드로부터 가치를 유도하는 방법이 또한 필요하다.
본 발명의 목적은 상기 요구의 전부 또는 일부를 충족시키는 것이다.
본 발명의 목적은 더욱 특히 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 효소적 산화에 사용되는 보조인자를 재생(또는 재순환)하기 위한 경로를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 설폭사이드 또는 설폰 및 디설파이드의 화학효소적 공동생성을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 특히 간단하고 효과적이며 경제적인 보조인자를 재활용하기 위한 경로를 포함하는, 산업적으로 실행가능한 설폭사이드 또는 설폰 및 디설파이드의 화학효소적 공동생성을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메르캅탄, 더욱 특히 메틸 메르캅탄의 생성 동안 생성된 설파이드로부터 가치가 유도되도록 하는 방법을 제안하는 것이다.
본 발명자들은 부가가치와 함께 설파이드의 산화를 촉매하는 효소의 보조인자를 재활용하기 위한 시스템을 포함하는 설폭사이드 또는 설폰을 생성하기 위한, 바람직하게는 선택적인 화학효소적 방법을 발견하였다.
실제로, 본 발명자들은 놀랍게도 설폭사이드 또는 설폰 생성 공정과 양립할 수 있을 뿐만 아니라, 희생 기질을 사용하는 대신 제2 관심 생성물인 디설파이드의 공동생성을 허용하는 화학효소적 케스캐이드를 발견하였다. 따라서, 이는 설폭사이드화에 사용되는 보조인자의 재활용을 가능하게 할 캐스케이드의 말기에서 메르캅탄이 디설파이드로 산화되는 것이다.
예를 들어, 산화제가 산소인 경우, 캐스케이드에 대한 전체 식은 하기와 같이 쓸 수 있다:
설폭사이드에 있어서, RSR' + O2 + 2 R"SH -> RS(O)R' + H2O + R"SSR"
설폰에 있어서, RSR' + 2 O2 + 4 R"SH -> RS(O)2R' + 2 H2O + 2 R"SSR".
따라서, 메르캅탄은 수소 공여체로서 간주될 수 있다.
본 발명에 따른 효소 캐스케이드는 더욱 특히 하기에 제시된 바와 같이 진행된다.
설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소(이하 효소 E), 이의 보조인자 및 적절한 경우 산화제의 존재하에, 설파이드는 설폭사이드 또는 설폰으로 전환되며, 환원된 보조인자는 이의 산화된 형태로 회복된다.
그 후, 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소(이하 효소 D) 및 이러한 유기 화합물의 존재하에:
- 상기 산화된 보조인자는 환원되고(따라서 유기 화합물에 의해 공여된 수소 원자에 의해 재활용됨),
- 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교에 의해 이량체가 형성된다(유기 화합물은 이의 환원된 "단량체" 형태로부터 이의 산화된 "이량체" 형태로 이동함).
본 발명에 따르면, 그 후 "유기 화합물"은 화학식 R-SH의 화합물인 것으로 이해되며, 이러한 화합물의 "이량체"는 화학식 R-S-S-R의 화합물인 것으로 이해된다(하나의 잘 알려진 예는 글루타티온 디설파이드로 불리는 이량체 형태 G-S-S-G의 글루타티온 G-SH임).
그 후, 캐스케이드는 화학적 평형에 의해 종료된다: 산화된 이량체는 메르캅탄의 두 등가물의 반응에 의해 환원되고, 이는 상응하는 디설파이드로 전환된다.
메르캅탄의 존재는 르 샤틀리에의 원리에 의해 지배되는 화학적 평형에 의해
- 이량체를 유기 화합물의 두 등가물로 환원가능하게 하고(따라서, 후자는 또한 메르캅탄에 의해 공여된 수소 원자로 인해 재활용됨);
- 디설파이드를 형성가능하게 한다.
이는 화학적 평형을 디설파이드의 형성쪽으로 바꾸는 효소 반응이다.
메르캅탄은 설파이드에 대해 화학량론적 양으로 사용될 수 있다.
더욱 특히, 하나의 설폭사이드 등가물의 형성은 메르캅탄의 두 등가물을 사용하고, 하나의 설폰 등가물의 형성은 메르캅탄의 네 등가물을 사용한다.
효소 캐스케이드는 기질, 반응물 또는 보조인자의 고갈 때까지 또는 효소 E 및/또는 D의 억제, 비활성화 또는 파괴까지 작동성이다.
이러한 캐스케이드는 설폭사이드 또는 설폰 및 디설파이드의 공동생성을 가능하게 하면서, 사용되는 보조인자와 유기 화합물을 재생한다.
캐스케이드가 반대 방향으로 매우 잘 시작될 수 있다는 점에 주목해야 한다: 상기 설명된 모든 반응은 역전될 수 있다.
이러한 방식으로 본 발명의 이점 중 하나가 이해된다: 이는 메르캅탄 및 더욱 특히 메틸 메르캅탄의 생성으로부터 발생하는 부산물로부터의 가치를 유도하기 위한 전체 공정에 삽입될 수 있다. 메르캅탄의 생성에서, 설파이드는 상기 나타낸 바와 같이 부산물이다. 본 발명에 의해, 이들 설파이드는 바람직하게는 선택적으로 설폭사이드 또는 설폰으로 산화되고, 생성된 메르캅탄은 부분적으로 설폭사이드화에 사용되는 보조인자를 재생하는데 사용될 수 있는 반면, 그 자체는 다른 관심 생성물인 디설파이드로 전환된다.
따라서, 본 발명은 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰을 공동생성하기 위한 방법으로서,
a) 1) 설파이드,
2) 임의적으로 산화제,
3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물,
4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E,
5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소 D, 및
6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자를 포함하는 조성물 M을 제조하는 단계;
b) 바람직하게는 동시에 설파이드 산화 및 디설파이드 가교 형성의 효소 반응을 수행하여
- 설폭사이드 또는 설폰; 및
- (상기 유기 화합물의) 이량체를 수득하는 단계;
c) 반응에 의해, 특히 화학 반응에 의해 단계 b)에서 수득된 상기 이량체를 메르캅탄으로 환원시켜
- 상응하는 디설파이드(메르캅탄에 상응); 및
- 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물을 수득하는 단계; 및
d) 임의적으로
- 단계 c)에서 수득된 디설파이드; 및/또는
- 단계 b)에서 수득된 설폭사이드 또는 설폰을 회수하는 단계를 포함하며;
상기 메르캅탄은 단계 a), b) 또는 c) 중 어느 하나에서 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 메르캅탄은 단계 a)에서 첨가되는, 방법에 관한 것이다.
정의
용어 "(C1-C20)알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있으며, 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 포화 지방족 탄화수소를 나타낸다. 바람직하게는, 알킬은 1 내지 12개의 탄소 원자, 또는 심지어 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸이 포함된다. 용어 "분지형"은 주요 알킬 사슬을 따라 알킬 기가 치환됨을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "(C2-C20)알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 나타낸다.
용어 "(C2-C20)알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 나타낸다.
용어 "(C6-C10)아릴"은 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 방향족 탄화수소 화합물, 더욱 특히 페닐 및 나프틸을 나타낸다.
용어 "(C3-C10)사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 포화 지방족 탄화수소, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 나타낸다.
"(C3-C10)헤테로사이클로알칸"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고, 적어도 하나의 황 원자, 바람직하게는 테트라하이드로티오펜, 및 임의적으로 적어도 하나의 다른 헤테로원자를 포함하는 사이클로알칸인 것으로 이해된다.
"(C4-C10)헤테로아렌"은 4 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고 적어도 하나의 황 원자, 예를 들어 티오펜, 및 임의적으로 적어도 하나의 다른 헤테로원자를 포함하는 아렌인 것으로 이해된다.
헤테로원자는 특히 O, N, S, Si, P 및 할로겐으로부터 선택되는 원자인 것으로 이해된다.
"촉매"는 일반적으로 반응을 가속화하고 이 반응의 말기에 변하지 않는 물질로 이해된다. 일 구현예에 따르면, 상기 효소 E는 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화 반응을 촉매한다. 일 구현예에 따르면, 상기 효소 D는 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매한다.
"촉매량"은 특히 반응을 촉매하기에, 더욱 특히 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하고/거나 디설파이드 가교를 형성하기에 충분한 양인 것으로 이해된다. 더욱 특히, 촉매량으로 사용되는 반응물은 화학량론적 비율로 사용되는 반응물의 중량에 비해 더 적은 양, 예를 들어 약 0.01 중량% 내지 20 중량%로 사용된다.
반응의 선택성은 일반적으로 반응 후에 소비되는 반응물의 몰 수에 대해 형성된 생성물의 몰 수를 나타낸다.
전환율, 선택도 및 수율의 일반적인 정의는 다음과 같다:
전환율 = (초기 상태의 반응물의 몰 수 - 반응 후 남은 반응물의 몰 수) / (초기 상태의 반응물의 몰 수)
선택도 = 원하는 생성물로 전환된 반응물의 몰 수 / (초기 상태의 반응물의 몰 수 - 반응 후 남은 반응물의 몰 수)
수율 = 전환율 x 선택도
따라서 "설폭사이드를 제조하기 위한 선택적 방법"은 특히 설파이드를 소비하고 설폰이 형성되지 않으면서(또는 무시할 수 있는 양의 설폰이 형성되면서) 설폭사이드를 생성하는 방법으로 이해된다. 일 구현예에 따르면, 설파이드의 설폭사이드로의 산화 반응은 화학선택적이다.
"설폰을 제조하기 위한 선택적 방법"은 특히 설파이드를 소비하고 설폭사이드가 형성되지 않으면서(또는 무시할 수 있는 양의 설폭사이드가 형성되면서) 설폰을 생성하는 방법으로 이해된다. 일 구현예에 따르면, 설파이드의 설폰으로의 산화 반응은 화학선택적이다.
예를 들어, 본 발명에 따른 방법, 더욱 특히 단계 b)는 설폭사이드 또는 설폰에 대해 95% 내지 100%, 바람직하게는 99% 내지 100%의 선택성을 제공한다.
이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교의 형성은 특히, 상기 유기 화합물의 두 분자 사이의 디설파이드 가교의 형성에 상응하는 것으로 간주된다(즉, 2 R-SH는 R-S-S-R을 제공함).
디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰의 공동생성을 위한 방법
본 발명은 더욱 특히 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰을 공동생성하기 위한 방법으로서,
a) 1) 화학식 R1-S-R2의 설파이드,
2) 임의적으로 산화제,
3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물,
4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E,
5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소 D, 및
6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자를 포함하는 조성물 M을 제조하는 단계;
b) 바람직하게는 동시에 설파이드 산화 및 디설파이드 가교 형성의 효소 반응을 수행하여
- n = 1 또는 2인 화학식 R1-S(O)n-R2의 설폭사이드 또는 설폰; 및
- 이량체를 수득하는 단계;
c) 단계 b)에서 얻은 이량체를 화학식 R3-SH의 메르캅탄과의 반응에 의해 환원시켜
- 화학식 R3-S-S-R3의 디설파이드; 및
- 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물을 수득하는 단계; 및
d) 임의적으로
- 단계 c)에서 수득된 디설파이드; 및/또는
- 단계 b)에서 수득된 설폭사이드 또는 설폰을 회수하는 단계를 포함하며;
상기 메르캅탄은 단계 a), b) 또는 c) 중 어느 하나에서 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 메르캅탄은 단계 a)에서 첨가되며,
R1, R2 및 R3은 이하 정의된 바와 같은, 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에 따르면,
- 설파이드는 디메틸 설파이드이고;
- 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물이 글루타티온이며;
- 효소 E는 베이어-빌리거(Baeyer-Villiger) 모노옥시게나제(BVMO), 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)이고;
- 효소 D는 글루타티온 환원효소이고;
- 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자는 NADP이다.
설폭사이드 또는 설폰 생성
본 발명에 따른 방법은 특히 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 효소적 산화 반응을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 반응은 바람직하게는 선택적이다.
제1 구현예에서, 효소적 설파이드 산화 반응을 수행하는 단계 동안 설파이드가 완전히 소모되지 않은 경우, 선택적으로 설폭사이드가 수득된다. 따라서, 일 구현예에 따르면, 상기 조성물 M은 바람직하게는 설폰의 형성 없이, 효소 E가 설파이드를 설폭사이드로 전환하기에 충분한 양의 설파이드를 여전히 포함한다. 일 구현예에 따르면, 설파이드는 조성물 M에 과량으로 공급된다. 이 경우, 효소 반응 E를 수행하는 단계 b) 후에 남아있는 설파이드의 양은 설파이드의 출발 중량, 즉 단계 a)의 설파이드의 출발 중량에 대해 0.0001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%, 예를 들어, 1 중량% 내지 10 중량%일 수 있다.
제2 구현예에서, 효소적 설파이드 산화 반응을 수행하는 단계 동안 설파이드가 완전히 소모되는 경우, 선택적으로 설폰이 수득된다. 따라서, 효소적 산화 반응을 수행하는 단계는 특히 하기 두 단계를 포함할 수 있다:
b1) 설파이드의 설폭사이드로의 완전한 산화;
b2) 설폭사이드의 설폰으로의 산화.
"설파이드의 완전한 산화"는 설파이드가 단계 b1) 동안 완전히 소모됨을 의미한다. 일 구현예에 따르면, 설파이드는 조성물 M에서 제한적 반응물(즉, 부족하게 존재하는 반응물)이다. "완전히 소비된"은 특히 효소 반응을 수행하는 단계 b) 후에 남아 있는 설파이드의 양이 설파이드의 출발 중량, 즉 단계 a)의 설파이드의 출발 중량에 대해 0 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0 중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0 중량% 내지 1 중량%, 및 더욱더 바람직하게는 0 중량% 내지 0.01 중량%일 수 있음을 의미한다.
이 반응은 설폭사이드 형성에 대한 특허 출원 FR1906488 및 설폰 형성에 대한 FR1906489에 기술되어 있다.
디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰의 공동생성
단계 b) 및 c) 또는 단계 a), b) 및 c)는 바람직하게는 하나의 동일한 반응기에서 수행되며; 더욱 바람직하게는, 단계 b) 및 c)는 동시에 진행된다.
단계 a)에서, 조성물 M의 다양한 성분은 임의의 순서로, 예를 들어 어떤 순서로든 다양한 성분의 단순한 혼합에 의해 첨가될 수 있다. 조성물 M은 반응기 내로 도입되기 전에 또는 반응기에서 직접 제조될 수 있다(여기서 단계 b) 및 임의적으로 단계 c)가 진행됨).
단계 b)에서, 효소적 설파이드 산화 반응은 효소적 디설파이드 가교 형성 반응 이전 또는 이와 동시에 수행될 수 있다.
더욱 특히, 단계 b)에서 수득된 유기 화합물의 이량체는 산화된 형태인 반면, 단계 c)에서는 유기 화합물이 환원된 형태이다.
단계 b)는 특히 하기와 같이 복수의 단계로 세분될 수 있다:
i) 효소 E와의 효소적 설파이드 산화 반응을 수행하여
- 설폭사이드 또는 설폰; 및
- 산화된 형태의 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자를 제공하는 단계;
ii) 효소 D와의 효소적 이황화 가교 형성 반응을 수행하여
- 환원된 형태의 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자; 및
- 상기 유기 화합물의 이량체를 제공하는 단계.
단계 i)은 단계 ii) 이전 또는 이와 동시에 수행될 수 있다.
효소 반응을 수행하는 단계 b)는 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8, 및 더욱 바람직하게는 7 내지 8, 예를 들어 7의 pH에서 수행될 수 있다.
효소 반응을 수행하는 단계 b)는 5℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃, 및 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다.
하기에 정의된 바와 같은 세포는 임의의 처리 없이 직접 단계 b)에서 사용될 수 있다.
단계 c)는 단계 b)와 동일한 조건, 더욱 특히 동일한 pH 및 동일한 온도에서 수행될 수 있다.
상기 효소 반응 및/또는 단계 c)에 사용되는 압력은 사용되는 반응물 및 사용되는 장비에 따라 대기압에 비해 감압에서 수 bar(수백 kPa)까지의 범위일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 단계 b)와 단계 c) 사이에 단계 b')를 포함하며, 여기서 효소 반응은 효소 및/또는 효소 E 및/또는 D의 불활성화에 의해 중단된다. 이 단계 b')는 열 충격(예를 들어, 약 100℃의 온도) 또는 삼투압 충격, 고압 적용, 세포 및/또는 효소 E 및/또는 D의 파괴 및/또는 침전을 가능하게 하는 용매의 첨가 또는 pH 변경(약 2의 낮은 pH 또는 약 10의 높은 pH)과 같은 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다.
설파이드 및/또는 메르캅탄 및/또는 적절한 경우 상기 산화제가 바람직하게는, 단계 a)에서 연속적으로 첨가될 수 있다.
단계 d)에서, 설폭사이드 또는 설폰 및/또는 디설파이드는 액체 또는 고체 형태로 회수될 수 있다. 설폭사이드 또는 설폰 및/또는 디설파이드는 이들의 용해도에 따라 수용액으로, 경사분리에 의해 액체 형태로 또는 심지어 침전에 의해 고체 형태로 회수될 수 있다. 디설파이드는 유기상으로 추출되거나 당업자에게 잘 알려진 기술, 예를 들어 한외여과 또는 원심분리 후 증류에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다.
그 후 수득된 생성물은 임의적으로 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 한외여과 또는 원심분리에 의한 세포(효소 E 및 D 함유)의 분리 후, 증류는 설폭사이드 또는 설폰 및 디설파이드의 분리를 가능하게 할 수 있다. 이러한 증류는 대기압, 감압(예를 들어, 진공) 하에 또는 당업자가 그것이 임의의 이점을 보유하는 것으로 간주하는 경우 더 높은 압력 하에 발생할 수 있다. 막 분리는 또한 증류를 위해 혼합물의 수분 함량을 감소시키거나 결정화 공정을 가속화할 목적으로 고려될 수 있다. 설폭사이드 또는 설폰 및/또는 설파이드가 수성 반응 혼합물로부터 경사분리에 의해 회수된 경우, 분자체 상에서 건조(또는 임의의 다른 건조 방법)가 고려될 수 있다.
상기 공정은 회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 획득되는 이점은 많다. 이러한 이점에는 매우 온화한 온도 및 압력 조건 및 중성에 가까운 pH 조건 하에 수용액 중에서의 작업 가능성이 포함된다. 이러한 조건 모두는 "그린(green)" 또는 "지속가능한" 것으로 언급되는 생체촉매 과정의 전형이다.
조성물 M은 유기 화합물, 효소 E, 효소 D 및 보조인자를 촉매량으로 포함할 수 있다. 조성물 M은
1) 화학량론적 양의 설파이드,
2) 화학양론적 양의 산화제,
3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 촉매량의 유기 화합물,
4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 촉매량의 효소 E,
5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 촉매량의 효소 D,
6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 촉매량의 보조인자; 및
7) 화학량론적 양의 메르캅탄을 포함할 수 있다.
더욱 특히, 메르캅탄/설파이드 몰비는 0.1 내지 100, 더욱 바람직하게는 1 내지 5, 및 바람직하게는 2 내지 4, 예를 들어 2이다.
설파이드:
설파이드는 특히 적어도 하나의 -C-S-C- 작용기를 포함하는 임의의 유기 화합물인 유기 설파이드이다.
일 구현예에 따르면, 조성물 M은 적어도 하나의 설파이드를 포함한다. 이는 예를 들어 1개, 2개 또는 다수의 상이한 설파이드를 포함할 수 있다.
상기 설파이드는 대칭적일 수 있으며, 이는 황 원자가 화합물에 대해 대칭 중심을 나타냄을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 설파이드는 하기 일반식을 갖는다:
R1-S-R2
상기 식에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 선택되거나,
R1 및 R2는 이들이 부착되는 황 원자와 함께 고리, 바람직하게는 (C3-C10)헤테로사이클로알칸 또는 (C4-C10)헤테로아렌 기를 형성하고;
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 임의적으로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며;
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 아릴 기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다.
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 (C1-C20)알킬, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 임의적으로 치환될 수 있으며;
비제한적으로 예를 들어, 알콜, 알데하이드, 케톤, 산, 아미드, 니트릴 및 에스테르 작용기 또는 기타 황, 인 및 규소를 보유하는 작용기로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로 임의적으로 작용기화될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 임의적으로 (C1-C20)알킬, (C3-C10)사이클로알킬, (C6-C10)아릴, -OH, -C(O)OH, -C(O)H, -C(O)-NH2, -NH2, -NHR, -NRR', -C(O)-, -C(O)-NHR', -C(O)-NRR', -COOR 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며;
여기서 R 및 R'는 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬 기를 나타낸다.
한 바람직한 구현예에 따르면, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐 및 (C3-C10)사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되거나
R1 및 R2는 이들이 부착된 황 원자와 함께 (C3-C10)헤테로사이클로알칸 기를 형성한다.
R1 및 R2는 바람직하게는 (C1-C20)알킬로부터 선택되거나, R1 및 R2는 이들을 보유하는 황 원자와 함께 (C3-C10)헤테로사이클로알칸을 형성한다. 상기 설파이드의 라디칼 R1 및 R2는 바람직하게는 동일하다(즉, 대칭 설파이드를 형성한다).
설파이드는 더욱 바람직하게는 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜으로부터 선택된다. 설파이드는 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디-n-프로필 설파이드, 디이소프로필 설파이드, 디-n-부틸 설파이드, 디이소부틸 설파이드, 디-sec-부틸 설파이드, 디-tert-부틸 설파이드, 디-n-옥틸 설파이드, 디-n-도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜으로부터 선택될 수 있다. 디메틸 설파이드가 본 발명에 따라 특히 바람직하다. 일 구현예에 따르면, 설파이드는 대칭이다.
메르캅탄:
메르캅탄은 특히 유기 메르캅탄, 즉 -C-SH 유형의 적어도 하나의 작용기를 포함하는 임의의 유기 화합물을 의미한다.
한 구현에 따르면, 메르캅탄은 일반식 R3-SH이고, 여기서 R3은 임의적으로 치환된, 포화된, 선형, 분지형 또는 환형 탄화수소 라디칼이다.
더욱 특히, 메르캅탄은 일반식 R3-SH이고, 여기서 R3은 -OH, -C(O)OH, -NH2, -ORa, -C(O)ORa, -N(Ra)H, -NRaRb 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기로 임의적으로 치환되는 포화, 선형, 분지형 또는 환형 탄화수소 라디칼이며;
Ra 및 Rb는 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬로부터 선택된다.
메르캅탄은 바람직하게는 일반식 R3-SH이고, 여기서 R3은 OH, -C(O)OH, -NH2 및 (C6-C10)아릴, 더욱 바람직하게는 -OH, -C(O)OH 및 -NH2로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나, 예를 들어 1개 또는 2개의 기(들)에 의해 임의적으로 치환되는 포화, 선형, 분지형 또는 환형 탄화수소 라디칼이다.
R3은 더욱 특히 메틸, 에틸, 옥틸 및 도데실로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 R3은 메틸이다.
메르캅탄은 메르캅토에탄올, 메틸 메르캅탄, 에틸 메르캅탄, 프로필 메르캅탄, 부틸 메르캅탄, 옥틸 메르캅탄, 도데실 메르캅탄, 벤질 메르캅탄, 티오글리콜산, 3-메르캅토프로피온산, 시스테인 및 호모시스테인으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
메르캅탄은 특히 메르캅토에탄올, 메틸 메르캅탄, 에틸 메르캅탄, n-프로필 메르캅탄, 이소프로필 메르캅탄(또는 2-프로판티올), n-부틸 메르캅탄, sec-부틸 메르캅탄, tert-부틸 메르캅탄, n-옥틸 메르캅탄, tert-옥틸 메르캅탄, n-도데실 메르캅탄, tert-도데실 메르캅탄, 벤질 메르캅탄, 티오글리콜산, 3-메르캅토프로피온산, 시스테인 및 호모시스테인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
메르캅탄은 바람직하게는 메틸 메르캅탄이다.
산화제:
산화제는 설파이드를 설폭사이드 또는 설폰으로 산화시킬 수 있는 임의의 화합물로 이해된다.
산화제는 공기, 산소 결핍 공기, 산소 풍부 공기 및 순수 산소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
공기(산소가 고갈되거나 풍부할 수 있는 공기)가 사용될 때, 분명하게는 산화제로서 단계 b)에서 수행되는 효소적 산화 반응 동안 소모되는 것은 공기 내의 산소이다.
산화제가 기체 형태일 때, 이는 용해된 기체 형태로 조성물 M에 존재한다. 풍부하거나 고갈된 공기 중 산소의 백분율은 당업자에게 공지된 방식으로 효소 시스템과의 상용성 및 반응 속도에 따라 선택된다.
산화제는 화학량론적 양으로 또는 과량으로 조성물 M에 존재할 수 있다. 과량으로, 존재하는 설파이드는 단계 b)에서 수행되는 효소적 설파이드 산화 반응에서 산화제와 함께 완전히 소모된다(설폰의 형성).
산화제는 조성물 M에 아화학량론적 양으로 존재할 수 있다. 따라서, 존재하는 설파이드는 단계 b)에서 수행되는 효소적 설파이드 산화 반응에서 산화제와 함께 완전히가 아닌 부분적으로 소모된다(설폭사이드의 형성).
상기 산화 반응의 말기에 산소는 일반적으로 사용되는 효소 E가 모노옥시게나제일 때 물로 전환되거나, 효소 E가 디옥시게나제일 때 완전히 소모된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 특히 배출 및 환경 친화성의 면에서 특히 유리하다.
효소 E:
"산화 효소"는 특히 효소 E, 즉 설파이드의 설폭사이드 및/또는 설폰으로의 산화를 가능하게 하고 보조인자의 사용을 필요로 하는 효소인 것으로 이해된다.
상기 효소 E는 산화환원효소, 바람직하게는 모노옥시게나제 및 디옥시게나제로 구성된 군으로부터 선택되는 산화환원효소, 더욱 바람직하게는 모노옥시게나제일 수 있다.
상기 효소 E는 바람직하게는 바이엘-빌리거 모노옥시게나제(BVMO)이다.
더욱 바람직하게는, BVMO 중에서 효소 E는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO), 및 더욱 특히 사이클로헥사논 1,2-모노옥시게나제, 사이클로펜타논 모노옥시게나제(CPMO), 및 더욱 특히 사이클로펜타논 1,2-모노옥시게나제, 또는 하이드록시아세토페논 모노옥시게나제(HAPMO), 및 더욱 특히 4-하이드록시아세토페논 모노옥시게나제일 수 있다.
사이클로헥사논 1,2-모노옥시게나제는 특히 EC 1.14.13.22 부류에 속한다.
한 특정 구현예에 따르면, CHMO는 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.)으로부터의 CHMO (예를 들어, 균주 NCIMB 9871) 및/또는 클러스터 AB006902에 속하는 유전자 chnB에 의해 인코딩된 CHMO이다.
사이클로헥사논 1,2-모노옥시게나제는 특히 EC 1.14.13.16 부류에 속한다.
한 특정 구현예에 따르면, CPMO는 코마모나스 종(Comamonas sp.)으로부터의 CPMO(예를 들어, 균주 NCIMB 9872) 및/또는 유전자 cpnB 유전자에 의해 인코딩되는 CPMO이다.
하이드록시아세토페논 모노옥시게나제는 특히 EC 1.14.13.84 부류에 속한다. 한 특정 구현예에 따르면, HAPMO는 유전자 hapE에 의해 인코딩되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터의 HAPMO이다.
효소 D 및 티올 기를 보유하는 유기 화합물:
티올 기를 보유하는 유기 화합물은 적어도 하나의 -SH 기를 보유하는 임의의 유형의 공지된 화학적 작용기 및/또는 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 임의의 탄화수소 화합물인 것으로 이해된다(이하 유기 화합물). 본 발명에 따른 유기 화합물은 1개 또는 2개의 티올기(-SH 기)를 포함할 수 있다. 이 화합물은 이량체 형태로 존재할 수 있으며, 이량체는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교로 인해 형성된다(2 R-SH는 R-S-S-R을 제공함).
유기 화합물은 티올 기를 보유하는 아미노산, 티올 기를 보유하는 펩티드, 마이코티올(CAS No. 192126-76-4) 및 디하이드로리포산(CAS No. 462-20-4)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 유기 화합물은 바람직하게는 티올 기를 보유하는 아미노산 또는 티올 기를 보유하는 펩티드이다. 상기 유기 화합물은 더욱 특히 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온, 티오레독신, 마이코티올 및 디하이드로리포산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 메르캅탄이 시스테인 또는 호모시스테인인 경우, 상기 유기 화합물은 (각각) 시스테인 또는 호모시스테인과 상이하다. 일 구현예에 따르면, 유기 화합물 및 메르캅탄은 상이하다.
상기 유기 화합물은 더욱 특히 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온 및 티오레독신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특히 바람직하게는, 상기 유기 화합물은 글루타티온이다. 글루타티온(GSH)/글루타티온 디설파이드(GSSG) 커플은 생물학에서 널리 알려져 있다. 환원된 형태(글루타티온) 또는 산화된 형태(글루타티온 디설파이드)에서 이 물질은 세포에서 중요한 산화환원 커플을 형성한다.
효소 D는 이량체(설명에서 한, 하나 또는 이량체라고 함)를 형성하기 위해 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매한다. 특히, 이는 디아미노산 또는 디펩티드를 형성하기 위해 티올 기를 보유하는 펩티드의 두 등가물 사이 또는 티올 기를 보유하는 아미노산의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매한다. 효소 D는 환원된 또는 산화된 공통 보조인자에 대한 "재활용 효소"로 정의될 수 있으며, 바람직하게는 이는 산화된 공통 보조인자를 환원된 공통 보조인자로 재활용한다.
이는 환원효소 또는 탈수소효소일 수 있으며, 바람직하게는 이는 글루타티온 환원효소, 티오레독신 환원효소, 시스테인 환원효소, 호모시스테인 환원효소, 마이코티올 디설파이드 환원효소 및 디하이드로리포일 탈수소효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 효소 D는 더욱 특히 글루타티온 환원효소, 티오레독신 환원효소, 시스테인 환원효소 및 호모시스테인 환원효소로 구성된 군으로부터 선택된다.
글루타티온 환원효소는 효소 분류 번호 EC 1.8.1.7 또는 EC 1.6.4.2로 나타낼 수 있으며; 시스테인 환원효소는 번호 EC 1.8.1.6으로 나타낼 수 있으며; 티오레독신 환원효소는 번호 EC 1.8.1.9 또는 EC 1.6.4.5로 나타낼 수 있으며; 마이코티온 환원효소는 번호 EC 1.8.1.15으로 나타낼 수 있다(이 효소는 또한 마이코티올 디설파이드 환원효소라고도 함). 특히 바람직하게는, 상기 효소 D는 글루타티온 환원효소이다.
더욱 특히, 각각의 유기 화합물은 상응하는 효소 D와 커플링되어, 상응하는 이량체가 형성가능하게 할 수 있다. 따라서, 유기 화합물/효소 D 효소 커플 또는 복합체는 본 발명에 따른 방법을 실행하는데 특히 유용하다:
- 글루타티온/글루타티온 환원효소,
- 티오레독신/티오레독신 환원효소,
- 시스테인/시스테인 환원효소,
- 호모시스테인/호모시스테인 환원효소,
- 마이코티올/마이코티올 디설파이드 환원효소, 및
- 디하이드로리포산/디히드로리포일 탈수소효소.
공통 보조인자(들):
"공통 보조인자"는 특히 상기 정의된 바와 같은 효소 E 및 효소 D의 촉매 활성에 필요하고/거나 이들의 촉매 활성이 향상되도록 하는 데 필요한 보조인자로 이해된다. 효소 E 및 D에 대한 "공통 보조인자"는 바람직하게는 이들 효소의 작용에 의해 환원 및/또는 산화될 수 있는 보조인자로 이해된다.
일 구현예에 따르면, 1개 또는 2개 또는 그 초과의 보조인자가 조성물 M에 존재한다. 예를 들어, 다른 보조인자 외에 효소 E 및/또는 효소 D에 이미 자연적으로 존재하는 보조인자와 조성물 M을 혼합하는 것이 가능하다.
상기 보조인자는 니코틴 보조인자 및 플라빈 보조인자로부터 선택될 수 있다. 더욱 특히, 상기 보조인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD) 및/또는 이의 상응하는 환원된 형태(즉, NADH,H+, NADPH,H+, FMNH2, FADH2)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
위에 나열된 보조인자는 유리하게는 환원된 형태(예를 들어, NADPH, H+) 및/또는 산화된 형태(예를 들어, NADP+)로 사용되며, 즉 이들은 조성물 M에 이러한 환원된 및/또는 산화된 형태, 바람직하게는 환원된 형태로 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 사용된 효소 E는 사이클로헥사논 모노옥시게나제, 예를 들어 아시네토박터 종으로부터의 사이클로헥사논 모노옥시게나제이고, 사용된 보조인자는 임의적으로 FAD에 의해 보충된 NADP이고, 효소 D는 글루타티온 환원효소이다.
본 발명에 따른 조성물 M은 또한 하기를 포함할 수 있다:
- 임의적으로 물, 완충제, 예컨대 포스페이트 완충제, 트리스-HCl, 트리스 염기, 중탄산암모늄, 아세트산암모늄, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), CHES(N-사이클로헥실-2-아미노에탄설폰산), 또는 염, 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 용매;
- 임의적으로 특히 효소 반응의 하나 이상의 반응물 또는 기질의 용해성을 촉진하기 위해 첨가제, 예컨대 계면활성제.
바람직하게는, 조성물 M은 수용액이다. 예를 들어, 상기 조성물 M은 조성물 M의 총 중량에 대해 50 중량% 내지 99 중량%의 물, 바람직하게는 80 중량% 내지 97 중량%의 물을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 조성물 M은 반응 혼합물을 포함하는 것으로 간주된다.
상기 단계 a)에서 제조된 조성물 M의 다양한 성분은 시중에서 용이하게 수득가능하거나 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 다양한 요소는 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있으며, 매우 유리하게는 용액이 되게 하거나 물 또는 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 다른 용매에 용해될 수 있다. 사용되는 효소는 또한 지지체에 그래프팅될 수 있다(지지된 효소의 경우).
일 구현예에 따르면, 효소 E 및/또는 D, 임의적으로 유기 화합물 및 임의적으로로 공통 보조인자는
- 예를 들어 수용액에서 분리 및/또는 정제된 형태로 존재하거나;
- 조 추출물, 즉 밀링된 세포의 추출물 중에 존재하거나;
- 전세포에 존재할 수 있다.
전세포가 우선적으로 사용된다.
[설파이드](mmol/L)/[세포](gcdw.L-1) 비율은 바람직하게는, 효소 반응을 수행하는 단계 b) 동안 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.01 내지 3 mmol/gcdw이다. 건조 세포의 그램의 질량 농도(세포 건조 중량의 경우 gCDW)는 통상적인 기술에 의해 결정된다.
효소 E 및/또는 D는 하기에서 숙주 세포로 지칭되는 상기 세포에서 과발현되거나 과발현되지 않을 수 있다.
숙주 세포는 상응하는 코딩 유전자의 발현으로부터 효소 E 및/또는 D를 생성하기에 적절한 임의의 숙주일 수 있다. 그 후, 이러한 유전자는 숙주의 게놈에 위치하거나 하기 정의된 것과 같은 발현 벡터에 의해 운반된다.
본 발명의 목적에 있어서, "숙주 세포"는 특히 원핵 또는 진핵 세포인 것으로 이해된다. 재조합 또는 비-재조합 단백질의 발현에 일반적으로 사용되는 숙주 세포는 특히, 박테리아 세포, 예컨대 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 종(Bacillus sp.), 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 효모의 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 진균의 세포 예컨대, 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger), 페니실륨 퍼니쿨로섬(Penicillium funiculosum) 또는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 곤충 세포, 예컨대 Sf9 세포, 또는 기타 포유동물(특히, 인간) 세포, 예컨대 HEK 293, PER-C6 또는 CHO 세포주를 포함한다.
상기 숙주 세포는 예를 들어, 배양 배지로부터 제거시 정지 성장 기에 있을 수 있다.
바람직하게는, 효소 E 및/또는 D, 임의적으로 유기 화합물 및 임의적으로 공통 보조인자는 박테리아 에스체리치아 콜라이에서 발현된다. CHMO 및/또는 HAPMO는 바람직하게는 예를 들어, 에스체리치아 콜라이 BL21(DE3)과 같은 에스체리치아 콜라이의 균주 내에서 발현된다.
세포 숙주에서 효소 E 및/또는 D에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 통합
발현 벡터, 예컨대 플라스미드가 사용되는 경우, 원핵 및 진핵 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 기술, 예를 들어 리포펙션, 전기천공, 열충격 또는 화학적 방법이다. 발현 벡터 및 숙주 세포 내에서 발현 벡터를 도입하는 방법은 선택된 숙주 세포에 따라 선택된다. 이 형질전환 단계는 재조합 효소 E 및/또는 D를 인코딩하는 유전자를 발현하는 형질전환된 세포를 생성한다. 세포는 배양/인큐베이션 단계에서 배양되어 효소 E 및/또는 D를 생성할 수 있다.
원핵 및 진핵 세포의 인큐베이션/배양은 예를 들어, 배양 배지 또는 온도 및 시간 조건을 결정할 수 있는 당업자에게 잘 알려진 기술이다. 사용된 벡터에 따라, -효소 E 및/또는 D의 생성 증가에 상응하는- 유도 기간이 관찰될 수 있다. 약한(예를 들어, 벡터 pBad에 대한 아라비노스) 또는 강한(예를 들어, 벡터 pET22b, pRSF 등에 대한 이소프로필 β-D-1-티오갈락토사이드(IPTG)) 유도인자를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 숙주 세포에 의한 효소 E 및/또는 D의 생성은 SDS-PAGE 전기영동 기술 또는 웨스턴 블롯 기술을 사용하여 확인할 수 있다.
"발현 벡터"는 관심 뉴클레오티드 서열이 삽입될 수 있는 감소된 크기의 DNA 분자이다. 선택은 플라스미드, 코스미드, 파지 등과 같은 다수의 공지된 발현 벡터로부터 이루어질 수 있다.
벡터는 특히 사용되는 세포 숙주의 기능에 따라 선택된다.
해당 발현 벡터는 예를 들어, 문헌 WO 83/004261에 기재된 것일 수 있다.
발현 벡터의 부재 하에 숙주 세포의 게놈에서 효소 E 및/또는 D에 대한 코딩 서열의 통합
효소 E 및/또는 D를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 공지된 방법, 예를 들어 상동성 재조합에 의해 또는 시스템 CRISPR-Cas9 등에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 숙주 세포에 의한 효소 E 및/또는 D의 생성은 SDS-PAGE 전기영동 기술 또는 웨스턴 블롯 기술을 사용하여 확인할 수 있다.
분리된 및/또는 정제된 형태로 사용하기 위한 효소 E 및/또는 D의 분리 및/또는 정제
형질전환 및 형질전환된 숙주 세포의 배양/인큐베이션 후에, 효소 E 및/또는 D의 분리 및 임의적으로 정제 단계가 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 방법은 숙주 세포의 존재 하에 수행되지 않으나, 조성물 M 중의 용액, 바람직하게는 수용액 중의 효소 E 및/또는 D에 의해 수행된다.
생성된 상기 효소 E 및/또는 D의 분리 및/또는 정제는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어, 전기영동, 분자 체질, 초원심분리, 예를 들어 황산암모늄을 사용한 차등 침전, 한외여과, 막 또는 겔 여과, 이온 교환, 소수성 상호작용을 통한 분리, 또는 예를 들어 IMAC와 같은 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 기술을 포함할 수 있다.
숙주 세포, 밀링된 세포의 조 추출물 제조의 용해 방식
세포 용해물은 다양한 공지된 기술, 예컨대 초음파 처리, 압력(French 압력), 화학 작용제(예를 들어, 트리톤) 등의 사용을 통해 수득될 수 있다. 수득된 용해물은 밀링된 세포의 조 추출물에 해당한다.
조성물 및 용도
본 발명은 또한,
1) 설파이드,
2) 임의적으로 산화제,
3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물,
4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E,
5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소 D,
6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자, 및
7) 메르캅탄을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 보조인자(특히 상기 정의된 바와 같은 효소 보조인자), 바람직하게는 설파이드의 효소 산화에 사용되는 보조인자를 재생 또는 재활용하기 위한 메르캅탄의 용도에 관한 것이다. "재생" 또는 "재활용"은 특히 보조인자의 산화된 형태에서 환원된 형태로, 또는 그 반대의 이동으로 이해된다.
본 발명은 또한 적어도 1개의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이에 형성된 디설파이드 가교를 환원시키기 위한 메르캅탄의 용도에 관한 것으로, 상기 메르캅탄은 바람직하게는 상응하는 디설파이드로 전환된다. 상기 디설파이드 가교는 바람직하게는 특히 효소 D에 대해 상기에서 정의된 바와 같은 효소 촉매에 의해 형성된다. 바람직하게는, 메르캅탄은 메틸 메트캅탄이며, 유기 화합물은 글루타티온이다. 메르캅탄의 이러한 용도는 보조인자, 특히 설파이드의 효소적 산화에 사용되는 보조인자를 재생 또는 재활용하기 위한 경로로서 특히 구상된다.
본 발명은 또한 메르캅탄에 의해 보조인자를 재생 또는 재활용시키는 단계를 포함하는, 설파이드의 효소적 산화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이에 형성된 디설파이드 가교를 환원시키기 위한 메르캅탄를 사용하는 방법에 관한 것으로, 상기 메르캅탄은 바람직하게는 상응하는 디설파이드로 전환된다.
더욱 특히, 설파이드, 산화제, 유기 화합물, 효소 E, 효소 D, 보조인자, 메르캅탄 및 효소 및 화학 반응은 특히 본 발명에 따른 공동생산 방법의 맥락에서 상기 정의된 바와 같다.
도 1: 도 1은 산화 반응이 효소 CHMO에 의해 촉매되는 경우 시간(시(hour)로 표시됨)의 함수로서 반응 매질 중에 존재하는 디에틸 설파이드(DES), 디에틸 설폭사이드(DESO) 및 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드(디설파이드)의 농도 (mM)를 나타낸다. 보조인자 NADP의 재활용을 가능하게 하는 캐스케이드의 요소 또한 추가되었다: E. 콜라이로부터의 글루타티온 환원효소(GR)를 과발현하는 세포는 CHMO를 발현하는 세포와 동일한 농도로 첨가하고, 산화된 글루타티온(GSSG)은 촉매량으로 도입하고, DES에 비해 2배 농도의 2-메르캅토에탄올을 도입하였다.
도 2: 도 2는 산화 반응이 효소 CHMO에 의해 촉매되는 경우 시간(시로 표시됨)의 함수로서 반응 매질 중에 존재하는 디에틸 설파이드(DESO), 디에틸 설폰(DESO2) 및 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드(디설파이드)의 농도 (mM)를 나타낸다. 보조인자 NADP의 재활용을 가능하게 하는 캐스케이드의 요소 또한 첨가되었다: E. 콜라이로부터의 글루타티온 환원효소(GR)를 과발현하는 세포는 CHMO를 발현하는 세포와 동일한 농도로 첨가하고, 산화된 글루타티온(GSSG)은 촉매량으로 도입하고, DESO에 비해 2배 농도의 2-메르캅토에탄올을 도입하였다.
도 3: 도 3은 반응이 효소 CHMO에 의해 촉매되는 경우 시간(시로 표시됨)의 함수로서 반응 매질에 존재하는 디에틸 설폭사이드(DESO)의 농도(mM)를 나타낸다. 이 예에서, 2-메르캅토에탄올은 양성자 공여체로서 메틸 메르캅탄(MeSH)으로 대체되었다. 보조인자 NADP의 재활용을 가능하게 하는 캐스케이드의 요소 또한 첨가되었다: E. 콜라이로부터의 글루타티온 환원효소(GR)를 과발현하는 세포는 CHMO를 발현하는 세포와 동일한 농도로 첨가하고, 산화된 글루타티온(GSSG)은 촉매량으로 도입하고, MeSH는 약 4 mmol/L/h의 유속으로 반응 매질에 점차적으로 첨가된다.
도 4: 도 4는 본 발명에 따른 효소 캐스케이드의 예시이다.
메르캅탄 및 설파이드는
- CHMO(효소 E에 상응),
- NADPH(공통 보조인자),
- 글루타티온 환원효소(효소 D에 상응),
- 글루타티온 디설파이드 또는 글루타티온(적어도 하나의 티올 기를 포함하는 유기 화합물 또는 이량체에 상응)을 포함하는 반응 매질에 도입된다.
특히, 공기가 도입되어 설파이드의 도입 방식에 따라 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 연속적으로 가능하게 한다. 그 후, 효소 캐스케이드가 생성된다.
공통 보조인자인 NADPH는 설폭사이드 또는 설폰의 형성과 동시에 NADP+로 산화된다. 글루타티온 두 분자의 존재로 인해 NADP+는 다시 NADPH, H+로 환원되며, 2 글루타티온 분자(2 GSH)는 글루타티온 디설파이드(GSSG)를 제공한다. 캐스케이드를 종료하기 위해, 화학적 평형을 통해 글루타티온 디설파이드는 2 분자의 메르캅탄의 상응하는 디설파이드로의 산화를 가능하게 하여 2 분자의 글루타티온을 재생한다.
하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 : 2-메르캅토에탄올의 사용을 통한 디에틸 설파이드로부터 디에틸 설폭사이드의 선택적 합성.
I. 생체촉매의 제조:
사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)의 생성
플라스미드 pET22b(Promega, Qiagen에서 판매)에 삽입된 chnB 유전자를 발현하는 에스체리치아 콜라이 BL21(DE3)(Merck Millipore에서 판매)의 균주를 미리 작제하였다. 이는 아시네토박터 종으로부터 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)의 이종 발현을 가능하게 한다.
상기 균주는 CHMO 및 CHMO의 보조인자, 즉 NADP 및 FAD 둘 모두를 함유하는 것으로 이해된다.
이러한 균주는 당업자에게 공지된 기술에 의해 사전배양되고 배양되었다.
0.85 mmol/L 최종 농도의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 촉발된 유도 단계 후, 특정 부피의 배양물을 원심분리(10분, 5000 g, 4℃)하여 원하는 양의 세포를 제공하였다.
글루타티온 환원효소(GR)의 생성
플라스미드 pET26b+(Promega, Qiagen에서 판매)에 삽입된 gor 유전자를 발현하는 에스체리치아 콜라이 BL21(DE3) 균주(Merck Millipore에서 판매)를 당업자에게 공지된 기술에 따라 설계하였다. 이는 에스체리치아 콜라이로부터의 글루타티온 환원효소(GR)의 이종 발현을 허용한다.
상기 균주는 GR 및 GR의 보조인자, 즉 NADP 둘 모두를 함유하는 것으로 이해된다.
이러한 균주는 당업자에게 공지된 기술에 의해 사전배양되고 배양되었다.
이소프로필 β-D-1-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 촉발된 유도 단계 후, 특정 부피의 배양물을 원심분리(10분, 5000 g, 4℃)하여 원하는 양의 세포를 제공하였다.
II. 생물전환:
이 실시예에서 신선한 세포의 펠릿은 pH 8에서 0.1 mol/L 인산염 완충액 32 mL에 재현탁시켰다. 그런 다음 수득된 세포 농도는 CHMO 및 GR을 과발현하는 세포에 있어서 62 ODU/mL 또는 20 gCDW/L(여기서 CDW는 세포 건조 중량을 나타냄)였다.
250 mL 플라스크에서 초기 농도 3 mmol/L의 디에틸 설파이드(DES), 6 mmol/L의 2-메르캅토에탄올 및 0.25 mmol/L의 산화된 글루타티온(GSSG)이 t=0에서 32 mL의 최종 부피로 존재하였다.
일정한 간격으로 200 μL의 반응 혼합물을 빼내고 1000 μL의 아세토니트릴 용액에 희석하였다. 원심분리(5분, 12,500 g) 후, 사전에 수득된 보정 표준 범위를 사용하여 반응 동안 형성된 디에틸 설폭사이드(DESO) 및 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드(디설파이드)의 정량적 측정을 위해 상청액을 GC에 주입하였다. 수행된 분석 조건 하에, 최소 측정 가능한 농도는 50 μM였다.
DESO 양의 선형 증가는 시간 경과에 따라 측정하였으며, 설폰(DESO2)은 검출되지 않았다. 그 후, 설파이드의 초기 산화 속도는 시간 당 배지 리터 당 산화된 DES 1 mmol였다(도 1). 유사한 양의 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드가 DESO의 생성과 동시에 생성되었으며, 이에 의해 보조인자를 재활용하기 위한 커플링된 GSSG/GR 시스템의 적절한 작용을 검증하였다. 시간의 함수로서 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드의 농도는 2-메르캅토에탄올의 느린 자발적 산화와 관련된 배경 잡음을 뺀 후 결정되었다는 점에 주목해야 한다(CHMO를 과발현하는 세포를 제외하고 (동일한 조건 하에) 캐스케이드의 모든 요소의 존재하여 배경 잡음이 결정됨).
CHMO에 의해 촉매된 반응은 화학선택적인데, 이는 DESO가 DESO2로 전환되는 반응이 DES가 완전히 소모되는 경우에만 발생하기 때문이다. 다르게 표현하면, 설폰은 반응 매질 중에 DES가 존재하는 경우에는 형성되지 않는다.
획득된 선택도는 약 100%이다. DES가 반응 매질에 여전히 존재하는 경우, 사용되는 분석 도구로 설폰은 검출되지 않았다. 반응 말기에 (t = 4h), 약 100%의 DESO가 수득되었으며, DESO2는 사용되는 분석 도구에 의해 검출되지 않았다.
실시예 2: 수소 공여체로서 2-메르캅토에탄올을 사용한 디에틸 설폭사이드로부터의 디에틸 설폰의 선택적 합성.
I. 생체촉매의 제조:
실시예 1에 기술된 것과 동일한 균주를 본 실시예에 사용하였으며, 즉 E. 콜라이로부터 GR 및 CHMO를 과발현하는 균주를 사용하였다.
원심분리를 수행하고(10분, 5000 g, 4℃), 그 후 펠렛을 32 mL의 0.1 mol/L 인산염 완충액(pH 8)에 재현탁하였다. 그런 다음 각 균주의 62 ODU/mL(또는 약 20 gCDW/L)의 세포 농도를 반응 테스트에 사용하였다.
II. 생물전환:
250 mL 플라스크에서 3 mmol/L의 디에틸 설폭사이드(DESO), 6 mmol/L의 2-메르캅토에탄올 및 0.25 mmol/L의 산화된 글루타티온(GSSG)을 t=0에서 32 mL의 최종 부피로 동시에 첨가하였다.
일정한 간격으로 200 μL의 반응 혼합물을 빼내고 1000 μL의 아세토니트릴 용액에 희석하였다. 원심분리(5분, 12,500 g) 후, 사전에 수득된 보정 표준 범위를 사용하여 반응 동안 형성된 디에틸 설폰(DESO2) 및 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드(디설파이드)의 정량적 측정을 위해 상청액을 GC에 주입하였다.
DESO2 양의 선형 증가는 시간 경과에 따라 측정하였다. 그 후, 설폭사이드의 초기 산화 속도는 시간 당 배지 리터 당 산화된 DESO 0.75 mmol였다(도 2). 동시에 DESO2의 생성과 동시에 유사한 양의 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이가 생성되었다. 결과적으로, 첨가된 2-메르캅토에탄올은 실제로 캐스케이드 의존적 경로를 통해 보조인자 NADP를 재활용하는 것을 가능하게 한다. 실시예 1과 동일한 방식으로 배경 잡음을 차감하였다.
실시예 3: 수소 공여체로서 메틸 메르캅탄(MeSH)을 사용한 디에틸 설파이드로부터의 디에틸 설폭사이드의 선택적 합성.
I. 생체촉매의 제조:
실시예 1 및 2에 기술된 것과 동일한 균주를 본 실시예에 사용하였으며, 즉 E. 콜라이로부터 GR 및 CHMO를 과발현하는 균주를 사용하였다. 이 생체촉매 반응에서 2-메르캅토에탄올을 MeSH로 대체하였다.
II. 생물전환:
이 실시예에서 신선한 세포의 펠릿은 pH 8에서 0.1 mol/L 인산염 완충액 200 mL에 재현탁시켰다. 그런 다음 수득된 세포 농도는 CHMO 및 GR을 과발현하는 세포에 있어서 62 ODU/mL 또는 20 gCDW/L(여기서 CDW는 세포 건조 중량을 나타냄)였다.
1L 반응기에 10 mmol/L의 디에틸 설파이드(DES), 0.25 mmol/L의 산화된 글루타티온(GSSG) 및 또한 사전에 제조된 효소 용액으로 t = 0에서 동시에 충전하였다. 추가로, 메틸 메르캅탄은 소듐 메틸 메르캅탄의 황산 산성화에 의해 반응 매질에 점진적으로 첨가되었다(유속은 약 4 mmol/L/h로 조정됨). 그런 다음 순수한 디에틸 설파이드를 40 μL/h의 유속으로 점진적으로 첨가하여 DES의 일정한 농도를 보장하고 블래더를 통해 반응을 수행하는 데 필요한 O2를 규칙적으로 추가할 수 있게 하였다. 반응은 30℃의 제어된 온도에서 교반하면서 개시되었다.
일정한 간격으로 200 μL의 반응 혼합물을 빼내고 1000 μL의 아세토니트릴 용액에 희석하였다. 원심분리(5분, 12,500 g) 후, 사전에 수득된 보정 표준 범위를 사용하여 반응 동안 잠재적으로 형성된 디에틸 설폰(DESO2) 및 디에틸 설폭사이드(DESO)의 정량적 측정을 위해 상청액을 GC에 주입하였다. 수행된 분석 조건 하에, 최소 측정 가능한 농도는 50 μM였다.
DESO 양의 선형 증가는 시간 경과에 따라 측정하였으며, 설폰(DESO2)은 검출되지 않았다. 그 후, 설파이드의 초기 산화 속도는 시간 당 배지 리터 당 산화된 DES 0.2 mmol였다(도 3). 디메틸 디설파이드(DMDS)는 DESO의 생성과 동시에 생성되며, 이에 의해 보조인자를 재활용하기 위한 커플링된 GSSG/GR 시스템의 적절한 작용을 검증하였다.
CHMO에 의해 촉매되는 반응은 화학선택적인데, 이는 DES가 반응 전반에 걸쳐 반응 매질에 존재하기 때문에 DESO가 DESO2로 전환되는 반응이 일어나지 않기 때문이다.

Claims (18)

  1. 디설파이드 및 설폭사이드 또는 설폰을 공동생성하기 위한 방법으로서,
    a) 1) 설파이드,
    2) 임의적으로 산화제,
    3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물,
    4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E,
    5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소 D, 및
    6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자를 포함하는 조성물 M을 제조하는 단계;
    b) 바람직하게는 동시에 설파이드 산화 및 디설파이드 가교 형성의 효소 반응을 수행하여
    - 설폭사이드 또는 설폰; 및
    - 이량체를 수득하는 단계;
    c) 메르캅탄과의 반응에 의해 단계 b)에서 수득된 이량체를 환원시켜
    - 상응하는 디설파이드; 및
    - 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물을 수득하는 단계; 및
    d) 임의적으로
    - 단계 c)에서 수득된 디설파이드; 및/또는
    - 단계 b)에서 수득된 설폭사이드 또는 설폰을 회수하는 단계를 포함하며;
    상기 메르캅탄은 단계 a), b) 또는 c) 중 어느 하나에서 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 메르캅탄은 단계 a)에서 첨가되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 메르캅탄이 일반식 R3-SH을 가지며, 여기서 R3은 임의적으로 치환된, 포화된, 선형, 분지형 또는 환형 탄화수소 라디칼인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, R3이 메틸, 에틸, 옥틸 및 도데실로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 R3이 메틸인, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 메르캅탄이 메르캅토에탄올, 메틸 메르캅탄, 에틸 메르캅탄, n-프로필 메르캅탄, 이소프로필 메르캅탄(또는 2-프로판티올), n-부틸 메르캅탄, sec-부틸 메르캅탄, tert-부틸 메르캅탄, n-옥틸 메르캅탄, tert-옥틸 메르캅탄, n-도데실 메르캅탄, tert-도데실 메르캅탄, 벤질 메르캅탄, 티오글리콜산, 3-메르캅토프로피온산, 시스테인 및 호모시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 화합물이 티올 기를 보유하는 아미노산, 티올 기를 보유하는 펩티드, 마이코티올 및 디하이드로리포산으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 유기 화합물이 티올 기를 보유하는 아미노산 또는 티올 기를 보유하는 펩티드인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 화합물이 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온, 티오레독신, 마이코티올 및 디하이드로리포산으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 글루타티온인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 E가 산화환원효소, 바람직하게는 모노옥시게나제 및 디옥시게나제로 구성된 군으로부터 선택되는 산화환원효소, 더욱 바람직하게는 모노옥시게나제인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 D가 바람직하게는 글루타티온 환원효소, 티오레독신 환원효소, 시스테인 환원효소, 호모시스테인 환원효소, 마이코티올 디설파이드 환원효소 및 디하이드로리포일 탈수소효소로 구성된 군으로부터 선택되는 환원효소 또는 탈수소효소이며, 바람직하게는 효소 D는 글루타티온 환원효소인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설파이드가 하기 일반식을 갖는, 방법:
    R1-S-R2
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 서로 독립적으로 (C1-C20)알킬, (C2-C20)알케닐, (C2-C20)알키닐, (C3-C10)사이클로알킬 및 (C6-C10)아릴로 구성된 군으로부터 선택되거나,
    R1 및 R2는 이들이 부착되는 황 원자와 함께 헤테로사이클로알칸 또는 헤테로아렌을 형성하며;
    상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클로알칸 및 헤테로아렌 기는 임의적으로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며;
    상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 아릴 기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 설파이드의 라디칼 R1 및 R2가 동일한, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설파이드가 디메틸 설파이드, 디에틸 설파이드, 디프로필 설파이드, 디부틸 설파이드, 디옥틸 설파이드, 디도데실 설파이드 및 테트라하이드로티오펜으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 디메틸 설파이드인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 공기, 산소 결핍 공기, 산소 풍부 공기 및 순수 산소로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보조인자가 니코틴 보조인자 및 플라빈 보조인자로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 설파이드가 디메틸 설파이드이며;
    - 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물은 글루타티온이며;
    - 효소 E는 베이어-빌리거(Baeyer-Villiger) 모노옥시게나제(BVMO), 바람직하게는 사이클로헥사논 모노옥시게나제(CHMO)이며;
    - 효소 D는 글루타티온 환원효소이며;
    - 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자는 NADP인, 방법.
  15. 1) 설파이드,
    2) 임의적으로 산화제,
    3) 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물,
    4) 상기 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 산화를 촉매하는 효소 E,
    5) 이량체를 형성하기 위해 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 상기 유기 화합물의 두 등가물 사이의 디설파이드 가교 형성을 촉매하는 효소 D,
    6) 두 효소 E 및 D에 공통적인 보조인자, 및
    7) 메르캅탄을 포함하는 조성물.
  16. 설파이드의 설폭사이드 또는 설폰으로의 효소적 산화에 사용되는 보조인자를 재생하거나 재활용하기 위한 메르캅탄의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 티올 기를 보유하는 유기 화합물의 두 등가물 사이에 형성된 디설파이드 가교를 환원시키기 위한 메르캅탄의 용도로서, 상기 메르캅탄이 바람직하게는 상응하는 디설파이드로 전환되는, 용도.
  18. 제17항에 있어서, 메르캅탄이 메틸 메르캅탄이며, 유기 화합물이 글루타티온인, 용도.
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