KR20230116882A - H₂s 압력 하에 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 설프하이드릴라제 중에서 선택된 적어도 하나의 효소의 존재에서 화학식 R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응을 포함하는, 작용성화된 메르캅탄의 합성 방법에 관한 것이고; 상기 반응은 반응 온도에서 0.01 내지 4 bar, 바람직하게는 0.1 내지 3 bar, 예를 들어, 0.1 내지 2.5 bar, 및 더욱 바람직하게는 0.25 내지 2 bar의 반응기의 기체 헤드스페이스에서 H2S의 분압으로 반응기에서 수행된다.
Description
본 발명은 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 공정, 및 또한 특히 이러한 공정을 수행하는 것을 가능하게 하는 조성물에 관한 것이다.
메르캅탄은 수많은 산업 분야에서 사용되며, 알코올의 설프하이드레이션, 불포화 유기 화합물에 대한 황화수소의 촉매적 또는 광화학 첨가, 또는 황화수소를 사용한 할라이드, 에폭사이드 또는 유기 카보네이트의 치환과 같은 많은 합성 방법이 공지되어 있다.
그러나, 이러한 공정은 많은 단점을 가지며, 작용성화된 메르캅탄, 즉, 티올 기(-SH) 이외의 적어도 하나의 작용기를 포함하는 메르캅탄의 합성에 항상 적합한 것은 아니다. 이러한 유형의 메르캅탄은 많은 잠재성을 갖는 화학적 패밀리, 특히 티올 작용기를 갖는 아미노산 및 유도체, 특히 호모시스테인을 구성한다. 이들은, 예를 들어, 화장품 산업을 위한 합성 중간체로서 유용할 수 있다. 그러나, 현재, 특히 상품 화학 분야에 속하는 적용에 대해 산업적으로 실행 가능한 이러한 작용성화된 메르캅탄의 생산에 적합한 효율적인 합성 방법은 없다.
예를 들어, 통상적인 화학적 방법 중에서, 황화수소로의 치환은 종종 높은 온도 및 압력을 필요로 하고, 올레핀, 에테르, 설파이드 및/또는 폴리설파이드 유형의 원하지 않는 부산물을 초래한다. 불포화 화합물에 대한 황화수소의 촉매적 또는 광화학적 첨가는 일반적으로 약간 더 온화한 조건 하에 수행되지만, 마찬가지로 출발 물질의 이성질화, 비-위치선택적 첨가 또는 설파이드 및/또는 폴리설파이드의 생산을 초래하는 이중 첨가에 의해 형성되는 많은 부산물을 초래한다.
따라서, 이러한 통상적인 합성 방법은 작용성화된 메르캅탄과 같은 화합물에 대해 너무 가혹한 작동 조건을 필요로 하고, 업그레이드하기 어려운 상당한 양의 설파이드 및/또는 폴리설파이드의 공동생산을 초래한다는 것이다.
생물학적 경로를 통해 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 화학적 경로에 대한 공지된 대안이 있다. 예를 들어, 시스테인은 현재 발효 경로에 의해 생물학적으로 생산된다(Maier T., 2003. Nature Biotechnology, 21: 422-427). 이러한 생물학적 경로는 다작용성 분자에 더 온화하고 더 적합하다. 그러나, 이러한 생물학적 경로는 종종 낮은 수율을 갖고/거나 산업적 규모로 쉽게 전환될 수 없거나 실행 가능하지 않다. 또한, 여기서 다시, 관심 메르캅탄의 생산에는 상응하는 설파이드 및/또는 폴리설파이드, 예컨대, 디설파이드가 동반된다(예를 들어, 국제 출원 WO 2012/053777 참조).
따라서, 특히 생물학적 경로에 의해 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 개선된 공정이 필요하다.
특히, 만족스러운 수율, 또는 심지어 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 우선적으로는 적어도 90%의 수율을 수득하는 것을 가능하게 하는 작용성화된 메르캅탄의 합성하기 위한 공정이 필요하다.
또한, 온화한 작동 조건으로 산업 규모에서 실행 가능한 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 공정이 필요하다.
본 발명의 한 가지 목적은 특히 개선된 수율, 또는 심지어 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 우선적으로는 적어도 90%의 수율을 갖는 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 개선된 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 온화하고 다작용성 메르캅탄의 합성에 적합한 작업 조건을 갖는 산업적 공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 시약으로서 하이드로설파이드 염 및/또는 설파이드 염의 사용을 피하고, 따라서 보다 친환경적인 공정을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 완전히 또는 부분적으로 충족시킨다.
본 발명에 따르면, 하기에 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄, 특히 L-호모시스테인은 유리하게는 설프하이드릴라제 효소의 존재에서, 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응에 의해, 상기 반응이 일어나는 반응기에서 H2S의 특정 범위의 분압 하에 합성된다. 특히, H2S의 상기 분압은 0.01 내지 4 bar, 예를 들어, 0.01 내지 3 bar, 바람직하게는 0.1 내지 3 bar, 예를 들어, 0.1 내지 2.5 bar, 및 더욱 우선적으로는 0.25 내지 2 bar이다.
따라서, 본 발명자들은 화학식 (II)의 화합물의 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄으로의 전환이 반응기에서 H2S의 분압에 크게 의존함을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 반응기에서 H2S의 특정 범위의 분압에서, 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 우선적으로는 적어도 90%의 전환율 및/또는 수율이 얻어진다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 전환율 및/또는 수율은 80% 내지 100%, 또는 심지어 90% 내지 100%이다. 특히, 전환율 및/또는 수율은 100%이다.
실제로, 예상과 달리, 반응기에서 H2S의 분압을 특정 한계 이상으로 증가시키는 것은 반응의 전환율 및/또는 수율을 증가시키는 것을 가능하게 하지는 않지만 후자를 제한하거나 심지어 억제한다. 반응기에서 H2S의 분압이 더 많이 증가할수록 반응 매질에서(특히 액체 반응 매질에 용해된 형태로) H2S의 양이 더 많이 증가하여 반응을 촉진하는 것으로 예상될 수 있다. 그러나, H2S의 분압이 너무 높으면 실제로 반응에 유해하다.
또한, 본 발명에 따른 반응기에서 H2S의 특정 범위의 분압은 빠른 반응 동역학을 가능하게 한다. 예를 들어, 100% 수율은 1 시간 내에 달성될 수 있다. 따라서, 반응 시간은 0.15 h 내지 10 h, 예를 들어, 0.25 h 내지 4 h, 바람직하게는 0.5 h 내지 1 h일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 공정은 하이드로설파이드 염 및/또는 설파이드 염을 시약으로서 사용하는 공정보다 더 나은 수율을 수득하는 것을 가능하게 하는 것으로 관찰된다. 따라서, 하이드로젠 설파이드의 사용은 이러한 염이 사용될 때 필요한 유출물의 정제 및 관리 단계를 제한하거나 심지어 단순화하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 보다 친환경적이다.
따라서, 본 발명은 하기 일반식 (I)의 적어도 하나의 작용성화된 메르캅탄을 합성하기 위한 공정에 관한 것이고:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH (I)
(상기 식에서,
-
동일하거나 상이한 R1 및 R7은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
-
X는 -C(=O)-, -CH2- 또는 -CN으로부터 선택되고;
-
R2는
(i) X가 -CN을 나타낼 때 부재하고,
(ii) 또는 수소 원자이고,
(iii) 또는 -OR3이고, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
(iv) 또는 -NR4R5이고, 동일하거나 상이한 R4 및 R5는 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
n은 1 또는 2이고; *는 비대칭 탄소를 나타냄);
상기 공정은
a)
하기 일반식 (II)의 적어도 하나의 화합물의 제공 단계:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G (II)
(상기 식에서, *, R1, R2, R7, X 및 n은 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같고,
G는 (i) R6-C(O)-O-, 또는 (ii) (R7O)(R8O)-P(O)-O-, 또는 (iii) R9O-SO2-O-를 나타내고;
R6은 수소 원자 또는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고, 이는 하나 이상의 방향족 기를 포함할 수 있고 -OR10, (=O), -C(O)OR11, -NR12R13으로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있고;
R10, R11, R12 및 R13은
H 또는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고;
동일하거나 상이한 R7 및 R8은 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄이고;
R9는 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄으로부터 선택됨);
b)
H2S의 제공 단계;
c)
설프하이드릴라제, 바람직하게는 상기 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제로부터 선택된 적어도 하나의 효소의 존재에서 상기 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응 단계로서,
상기 반응은 반응 온도에서 0.01 내지 4 bar, 예를 들어, 0.01 내지 3 bar, 바람직하게는 0.1 내지 3 bar, 예를 들어, 0.1 내지 2.5 bar, 및 더욱 우선적으로는 0.25 내지 2 bar의 상기 반응기의 기체 헤드스페이스에서 H2S의 분압으로 반응기에서 수행되는, 단계;
d)
화학식 (I)의 적어도 하나의 작용성화된 메르캅탄의 수득 단계;
e)
단계 d)에서 수득되는 상기 적어도 하나의 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄의 임의의 분리 단계; 및
f)
단계 d) 또는 e)에서 수득되는 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄의 임의의 추가 작용성화 및/또는 임의의 탈보호 단계를 포함하고,
여기서 단계 a) 및 b)는 임의로 동시에 수행된다.
표현 "X 내지 X"는 달리 명시되지 않는 한 언급된 한계를 포함한다.
불포화 탄화수소 사슬은 2 개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 탄화수소 사슬인 것으로 이해된다.
헤테로원자는 특히 O, N, S, P 및 할로겐으로부터 선택된 원자인 것으로 이해된다.
불활성 기체는 특히 본 발명에 따른 공정과 관련하여 반응성이 거의 또는 전혀 없는 임의의 기체인 것으로 이해된다. 예로서, 이질소, 아르곤 또는 메탄, 바람직하게는 이질소가 언급될 수 있다.
반응 매질(또는 혼합물)은 특히 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물, H2S, 및 상기 적어도 하나의 설프하이드릴라제를 포함하는 매질인 것으로 이해된다.
따라서, 상기 반응 매질은 하기를 포함할 수 있다:
-
하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물,
-
H2S,
-
하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 설프하이드릴라제,
-
임의로 하기 정의된 바와 같은 이의 보조인자,
-
임의로 하기 정의된 바와 같은 염기, 및
-
임의로 용매, 바람직하게는 물.
바람직하게는, 반응 매질은, 특히 단계 c)의 온도 및 압력 조건 하에서, 예를 들어, 수용액 형태의 액체이다.
H2S는 특히 단계 c)의 온도 및 압력 조건 하에 기체 형태이다. 특히, H2S의 일부는 단계 c)의 반응이 일어나기 위해 반응 매질에 용해되는 한편, 다른 일부는 상기 분압에서 반응기의 기체 헤드스페이스에서 기체 형태로 존재하는 것으로 이해된다.
"기체 헤드스페이스"는 반응 매질 위에, 바람직하게는 액체 반응 매질 위에 위치한 반응기 내의 공간을 의미하는 것으로 이해된다. 더욱 특히, "기체 헤드스페이스"는 액체 반응 매질의 표면과 반응기의 상단(반응기의 하부가 액체 상을 포함할 때 기체 상을 포함하는 반응기의 상부) 사이에 위치한 공간을 의미하는 것으로 이해된다. 기체 헤드스페이스는 특히 상기 분압에서 H2S를 포함하는 기체 상을 포함한다.
반응 매질 및 H2S는 특히 기체 헤드스페이스가 반응기에 함유된 반응 매질 위에 위치하도록 하는 양으로 반응기에 도입된다.
대안적으로, 단계 c)는 하기와 같이 기술될 수 있다:
c) 설프하이드릴라제, 바람직하게는 상기 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제로부터 선택된 적어도 하나의 효소의 존재에서 상기 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응으로서,
상기 반응은 반응 온도에서 0.01 내지 4 bar, 예를 들어, 0.01 내지 3 bar, 바람직하게는 0.1 내지 3 bar, 예를 들어, 0.1 내지 2.5 bar, 및 더욱 우선적으로는 0.25 내지 2 bar의 반응 매질 상에서 H2S의 분압으로 반응기에서 수행된다.
일 구현예에 따르면, H2S의 상기 분압은 기체 헤드스페이스에 존재하는 기체 상의 총 압력에 상응한다(즉, H2S만이 반응기의 기체 헤드스페이스에 존재한다).
일 구현예에 따르면, H2S의 상기 분압은 단계 c)의 전체 지속기간 동안 일정하게 유지될 수 있다. 이는 단계 c) 동안 반응기에 H2S를 연속적으로 도입하거나 H2S를 반응기에 규칙적으로 또는 불규칙적으로 단리 첨가함으로써 수득될 수 있다. 실제로, H2S는 반응 동안 소비되기 때문에, 따라서 H2S의 분압의 감소를 보상하는 것이 가능하다.
또 다른 구현예에 따르면, H2S의 상기 분압은 단계 c) 전 또는 그 동안 달성될 수 있고, 이후 반응기로의 H2S의 도입이 중단된다. 따라서, H2S의 분압은 단계 c) 동안, 바람직하게는 반응이 정지될 때까지 감소한다.
H2S의 분압은 특히 임의의 공지된 기술에 의해, 예를 들어, 압력계를 사용하여 단계 c) 전체에 걸쳐 제어될 수 있다. H2S는 반응기에서 액체 상(반응 매질)과 기체 상(상기 분압의 H2S 포함) 사이의 평형 상태에 도달하도록 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 기체 헤드스페이스에서 기체 상의 총 압력(예를 들어, H2S가 유일한 기체인 경우의 H2S의 압력 또는 H2S와 불활성 기체의 혼합물의 총 압력)은 대략 대기압(약 1.01325 bar)에 상응한다. 또한, 요망되는 작동 조건에 따라 대기압에 대해 저압 또는 과압에서 작업하도록 선택하는 것이 가능하다.
예를 들어, 하기 방법이 언급될 수 있다.
■
일 구현예에 따르면, 반응기에 진공이 생성된 후, 본 발명에 따른 분압에서 H2S가 도입된다. 예를 들어, 진공을 -1 bar 아래로 유도한 다음 0.25 bar의 H2S 압력을 가한다.
■
또 다른 구현예에 따르면, 하기 단계가 수행된다:
-
반응기의 헤드스페이스를 N2와 같은 불활성 기체로 퍼징하는 단계; 이후
-
부분 진공을 생성하는 단계; 이후
-
본 발명에 따른 분압에서 H2S를 도입하는 단계.
예를 들어, 반응기의 헤드스페이스를 N2로 퍼징한 후, 진공을 -0.25 bar로 유도한 다음 0.25 bar의 H2S를 첨가한다.
■
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 분압에서 N2와 같은 불활성 기체와 H2S의 혼합물을 반응기에 도입하는 것이 가능하다. 예를 들어, 0.25 bar의 H2S와 0.75 bar의 N2의 혼합물을 도입하는 것이 가능하다.
■
또 다른 구현예에 따르면, N2와 같은 불활성 기체(기체 헤드스페이스의 퍼징)를 반응기에 도입한 다음, 본 발명에 따른 분압에서 H2S를 첨가하는 것이 가능하다. 예를 들어, 1 bar의 N2의 압력을 가한 후 0.25 bar의 H2S를 첨가하는 것이 가능하다.
단계 c) 동안의 온도는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃, 및 더욱 특히 25℃ 내지 40℃일 수 있다.
단계 c)에 사용되는 반응기는 임의의 유형일 수 있다. 이는 바람직하게는 교반되고/거나 기체 상의 재순환 및/또는 액체 상의 재순환을 갖는 플러그-플로우 반응기 또는 연속식 반응기로부터 바람직하게 선택된다. 바람직하게는, 상기 반응기는 기체 헤드스페이스에 존재하는 기체 상의 재순환(또는 리사이클링)을 가능하게 한다.
단계 a) 및 b)는 동시적이거나 임의의 순서로 수행될 수 있다.
상기 반응 매질은 상기 화학식 (II)의 화합물, 상기 설프하이드릴라제 및 임의로 이의 보조인자를 임의의 순서로 첨가함으로써 제조될 수 있다. 다음에 H2S를 도입하는 것이 바람직하다. 이는 특히 반응기에 도입된 H2S 압력을 보다 용이하게 관리하는 것을 가능하게 한다.
바람직하게는, 화학식 (II)의 화합물 및/또는 설프하이드릴라제는 용액의 형태, 더욱 우선적으로는 수용액의 형태이다.
H2S는 임의의 공지된 방법에 의해, 특히 반응 매질로의 버블링에 의해, 바람직하게는 반응기의 바닥으로부터 반응 매질로의 버블링에 의해 반응기에 도입될 수 있다. 버블링은 H2S를 불활성 기체, 예를 들어, 이질소, 아르곤 또는 메탄, 바람직하게는 이질소와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 우선적으로는, H2S는 순수하게 도입된다(또 다른 기체와 혼합되지 않으면서). H2S는 또한 반응기의 헤드스페이스를 통해 도입될 수 있고, 예를 들어, 이후 반응 매질과 평형화될 수 있고, 반응 매질은 바람직하게는 교반된다.
바람직하게는, H2S는 바람직하게는 단계 c) 동안 및 더욱 우선적으로는 단계 c)의 전체 기간 동안 화학식 (II)의 화합물에 비해 과량, 바람직하게는 몰 과량이다. 따라서, H2S는 바람직하게는 단계 c) 동안 및 더욱 우선적으로는 단계 c)의 전체 기간 동안 화학식 (II)의 화합물의 양에 비해 초화학량론적 양일 수 있다.
특히, H2S/화학식 (II)의 화합물의 몰 비율은 바람직하게는 단계 c) 동안 및 더욱 우선적으로는 단계 c)의 전체 기간 동안 1.1 내지 20, 바람직하게는 1.1 내지 10, 우선적으로는 2 내지 8, 예를 들어, 3.5 내지 8, 및 훨씬 더 우선적으로는 3.5 내지 5이다. 상기 비율은 단계 c)의 전체 기간 동안 일정하게 유지될 수 있다.
단계 c)는 용액, 특히 수용액에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 용액은 용액의 총 중량에 대해 50 중량% 내지 99 중량%의 물, 바람직하게는 75 중량% 내지 97 중량%의 물을 포함한다.
단계 c)에서 반응 매질의 pH는, 특히 반응 매질이 수용액인 경우, 4 내지 9, 예를 들어, 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7.5, 및 더욱 특히 6.2 내지 7.2일 수 있다.
pH는 특히 선택된 설프하이드릴라제의 작동 최적에 따라 상기 언급된 범위 내에서 조정될 수 있다. pH는, 예를 들어, pH 프로브로 통상적으로 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. pH는 특히 염기를 첨가함으로써, 바람직하게는 단계 c)의 반응 전반에 걸쳐 조정될 수 있다. 임의의 유형의 염기, 바람직하게는 황 원자를 포함하는 염기가 사용될 수 있다. 염기는 특히, 7 초과, 바람직하게는 8 내지 14의 pH를 갖는 화합물 또는 화합물들의 혼합물인 것으로 이해된다.
염기는 하이드로설파이드 염 및/또는 설파이드 염, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드 또는 암모니아로부터 선택될 수 있다. 바람직한 염기는 암모늄 하이드로설파이드(NH4SH)이다.
하이드로설파이드 및/또는 설파이드 염은 암모늄 하이드로설파이드, 알칼리 금속 하이드로설파이드, 알칼리 토금속 하이드로설파이드, 알칼리 금속 설파이드 및 알칼리 토금속 설파이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
알칼리 금속은 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐 및 세슘, 바람직하게는 나트륨 및 칼륨인 것으로 이해된다.
알칼리 토금속은 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬 및 바륨, 바람직하게는 칼슘인 것으로 이해된다.
특히, 하이드로설파이드 염 및/또는 설파이드 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
암모늄 하이드로설파이드 NH4SH, 소듐 하이드로설파이드 NaSH, 포타슘 하이드로설파이드 KSH, 칼슘 하이드로설파이드 Ca(SH)2, 소듐 설파이드 Na2S, 암모늄 설파이드 (NH4)2S, 포타슘 설파이드 K2S 및 칼슘 설파이드 CaS. 바람직한 하이드로설파이드는 암모늄 하이드로설파이드 NH4SH이다.
염기는 0.1 내지 10 M, 바람직하게는 0.5 내지 10 M, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 M의 농도로 첨가될 수 있다. 염기를 첨가할 때 반응 매질의 희석을 제한하기 위해 특히 농축된 염기가 사용될 것이다.
단계 c)는 배치식, 반-연속식 또는 연속식으로 수행될 수 있다.
본질적으로 산소의 부재에서 수행되는 단계 c):
산소는 특히 이산소 O2를 의미하는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 단계 c)는 본질적으로 산소의 부재에서, 또는 심지어 산소의 부재에서 수행된다. 단계 c)가 본질적으로 산소의 부재에서(또는 심지어 산소 O2의 부재에서) 수행되는 경우, 이는 필요에 따라, 원치 않는 부산물인, 설파이드 및/또는 폴리설파이드, 특히 디설파이드의 공동생성을 제한할 수 있다(출원 FR2007577 참조).
더욱 특히, 표현 "본질적으로 산소의 부재에서"는 생성된 설파이드 및/또는 폴리설파이드의 양이 생성된 화학식 (I)의 화합물의 총 중량에 대해 5 중량% 이하가 되도록 산소의 양이 반응 매질 및/또는 기체 상(반응기의 기체 헤드스페이스에 함유된)에 남아 있을 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다.
예를 들어, 표현 "본질적으로 산소의 부재에서"는 반응 매질이 반응 매질의 총 중량에 대해 0.0015 중량% 미만(바람직하게는, 엄격하게 0.0015 중량% 미만)의 산소를 함유하고/하거나 기체 상(기체 헤드스페이스에 함유된)이 상기 기체 상의 총 부피에 대해 21 부피% 미만(바람직하게는, 엄격하게 21 부피% 미만)의 산소를 함유함을 것을 의미하는 것으로 이해된다.
따라서, 반응 매질은 반응 매질의 총 중량에 대해 0 내지 0.0015 중량%(바람직하게는, 엄격하게 0.0015 중량% 미만)의 산소를 함유하고/하거나 기체 상(기체 헤드스페이스에 함유된)은 기체 상의 총 부피에 대해 0 내지 21 부피%(바람직하게는, 엄격하게 21 부피% 미만)의 산소를 함유할 수 있다. 특히, 반응 매질 및/또는 기체 상(기체 헤드스페이스에 함유된) 중 산소의 양은 생성된 설파이드 및/또는 폴리설파이드의 양이 생성된 화학식 (I)의 화합물의 총 중량에 대해 5 중량% 이하가 되도록 하는 양이다.
예를 들어, 단계 c)는 폐쇄된 반응기에서(즉, 공기로부터 산소의 공급 없이) 수행될 수 있다.
매우 바람직하게는, 기체 상(기체 헤드스페이스에 함유된)은 산소를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 기체 상(기체 헤드스페이스에 함유된)은 산소를 포함하지 않고, 반응 매질은 반응 매질의 총 중량에 대해 0 내지 0.0015 중량%(바람직하게는, 엄격하게 0.0015 중량% 미만)의 산소를 포함한다. 이는 O2/H2S 혼합물이 작업자의 안전에 대한 위험을 분명히 내포하는 폭발 위험을 나타낼 수 있기 때문이다.
더욱 특히, 단계 c)가 또한 본질적으로 산소의 부재에서(또는 심지어 산소의 부재에서) 수행될 때, 이는 필요한 경우, 원치 않는 부산물인, L-호모시스테인 및/또는 L-호모시스테인 설파이드(4,4'-설판디일비스(2-아미노부탄산)/L-호모란티오닌으로도 지칭됨)의 공동생성을 제한(또는 심지어 방지)하면서 L-호모시스테인을 생성하는 것을 가능하게 한다.
L-호모시스테인 설파이드는 하기 화학식을 갖는다:
L-호모시스테인은 하기 화학식을 갖는다:
통상적인 방법은 본질적으로 산소의 부재에서 또는 심지어 산소의 부재에서 단계 c)를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 c) 전에, 산소는, 예를 들어, 탈기에 의해 반응 매질로부터 제거된다.
또 다른 구현예에 따르면, 단계 c) 전에, 산소는 반응 매질을 형성하게 될 각각의 성분 또는 이들의 적어도 둘의 혼합물로부터 별개로 제거된다. 예를 들어, 화학식 (II)의 화합물, 설프하이드릴라제 및 임의로 용매를 포함하는 각각의 용액은 탈기된다.
바람직하게는 탈기에 의해 반응기의 헤드스페이스의 기체 상으로부터 산소를 제거하는 것이 또한 가능하다.
반응기는 또한 이질소, 아르곤 또는 메탄, 바람직하게는 이질소와 같은 불활성 기체로 불활성화될 수 있다.
다양한 기술이 또한 서로 조합될 수 있다.
바람직하게는, 산소의 상당한 또는 심지어 완전한 부재가 하기 방식으로 달성된다:
-
반응기는 이질소, 아르곤 또는 메탄, 바람직하게는 이질소와 같은 불활성 기체로 불활성화됨; 및
-
화학식 (II)의 화합물, 설프하이드릴라제 및 임의로 용매를 포함하는 각각의 용액이 탈기됨.
산업적 탈기 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 하기가 언급될 수 있다:
-
감압(진공 탈기),
-
열 조절(수성 용매의 경우 온도를 증가시키고 유기 용매의 경우 온도를 낮춤),
-
막 탈기,
-
교대 동결-펌프-해동 사이클에 의한 탈기,
-
불활성 기체(예를 들어, 아르곤, 이질소 또는 메탄)로의 살포에 의한 탈기.
일 구현예에 따르면, 단계 c)에서, 산소는 액체(특히 반응 매질)에 용해된 형태로도 또한 기체 형태(특히 상기 기체 상)로도 존재하지 않는다.
분리 단계 e)는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 따라 수행될 수 있다. 특히, 최종 생성물이 고체인 경우:
-
반응 매질에서 비혼화성인 용매로 추출 및/또는 디캔테이션(decantation)한 후, 상기 용매의 증발에 의해;
-
침전에 의해(용매의 부분 증발에 의해 또는 관심 화합물이 덜 용해되는 용매의 첨가에 의해). 이러한 침전 후에 일반적으로 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따른 여과 단계가 이어진다. 최종 생성물은 이후 건조될 수 있다; 또는
-
상이한 화합물의 각각의 용해도의 함수로서 pH의 조정을 통한 선택적 침전에 의해.
호모시스테인은 특히 고체 형태로 회수될 수 있다.
최종 생성물이 액체 형태인 경우, 분리는 증류에 의해 또는 액체/액체 추출에 선행하는 증류 또는 증발에 의해 수행될 수 있다.
추가 작용성화 및/또는 임의의 탈보호의 단계 f)는 통상적인 방법에 의해 추가적인 화학적 작용기를 수득하고/거나 특정 화학적 작용기를 탈보호하는 것을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, X-R2가 카르복실 작용기를 나타내는 경우, 후자는 에스테르화되고, 알데히드로 환원되고, 알코올로 환원된 다음, 에스테르화, 아미드화, 니트릴화 등이 될 수 있다. 모든 작용기는 화학식 (I)의 상기 작용성화된 메르캅탄에 대해 의도되는 최종 용도에 따라 당업자에 의해 수득되고/되거나 탈보호될 수 있다.
따라서, 단계 d) 또는 e)의 종결 시 수득된 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 상이한 작용기를 갖는 하나 이상의 메르캅탄 유도체를 수득하기 위해 하나 이상의 추가적인 화학 반응을 거칠 수 있고, 상기 화학 반응은 널리 공지된 반응이다.
일반식 (I)의 작용성화된 메르캅탄:
본 발명에 따른 공정은 하기 일반식 (I)의 작용성화된 메르캅탄을 수득하는 것을 목표로 한다:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH (I)
(상기 식에서,
-
동일하거나 상이한 R1 및 R7은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
-
X는 -C(=O)-, -CH2- 또는 -CN으로부터 선택되고;
-
R2는
(i) X가 -CN을 나타낼 때 부재하고,
(ii) 또는 수소 원자이고,
(iii) 또는 -OR3이고, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
(iv) 또는 -NR4R5, 동일하거나 상이한 R4 및 R5는 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
n은 1 또는 2이고; *는 비대칭 탄소를 나타냄).
이러한 메르캅탄은 화학적 작용기 -SH 이외에, 이들은 또한 적어도 하나의 아민-유형 작용기 -NR1R7을 포함하기 때문에 작용성화된 것으로 지칭된다.
바람직하게는, n은 2이다.
바람직하게는, X는 -C(=O)-이다.
바람직하게는, R2는 상기 정의된 바와 같은 R3를 갖는 -OR3이다. R3는 특히 수소 원자, 또는 1 내지 10 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 5 개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 사슬일 수 있다. 특히, R3는 H이다.
동일하거나 상이한 R1 및 R7은 바람직하게는 수소 원자, 또는 1 내지 10 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 5 개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 사슬이다. 바람직하게는, R1 및 R7은 H이다.
특히, X는 -C(=O)-이고, R2는 상기 정의된 바와 같은 R3를 갖는 -OR3이다.
화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 호모시스테인, 시스테인, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 L-호모시스테인 및 L-시스테인이다.
화학식 (I)의 바람직한 작용성화된 메르캅탄은 호모시스테인, 및 매우 특히 하기 화학식의 L-호모시스테인이다:
L-호모시스테인의 경우, n은 2이고, X는 -C(=O)-이고, R2는 -OR3이고, 여기서 R3는 H이고, R1 및 R7은 H이다.
비대칭 탄소 원자의 배열은 단계 c)의 반응 전반에 걸쳐 유지되는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 거울상이성질체적으로 순수할 수 있다.
화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 키랄 화합물이다. 본 발명의 설명에서, 거울상이성질체 형태가 특정되지 않은 경우, 화합물은 이의 거울상이성질체 형태가 무엇이든 포함된다.
일 구현예에 따르면, 단계 c)의 말미에서 반응 매질은 설파이드 또는 폴리설파이드를 포함하지 않고, 특히 수득된 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄에 상응하는 설파이드 또는 폴리설파이드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 단계 c)의 말미에서 반응 매질은 화학식 (I)의 화합물로 전환된 화학식 (II)의 화합물의 총 몰 수에 대해 10 mol% 미만, 바람직하게는 5 mol% 미만의 설파이드 및 폴리설파이드를 포함한다.
설파이드는 특히 하기 화학식 (III)의 화합물인 화학식 (I)의 화합물에 상응하는 설파이드인 것으로 이해된다:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-S-(CH2)n-(NR1R7)C*H-X-R2 (III)
(여기서, *, R1, R2, R7, X 및 n은 상기 정의된 바와 같음).
폴리설파이드는 특히 하기 화학식 (IV)의 화합물인 화학식 (I)의 화합물에 상응하는 폴리설파이드인 것으로 이해된다:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-(S)m-(CH2)n-(NR1R7)C*H-X-R2 (IV)
(여기서, *, R1, R2, R7, X 및 n은 상기 정의된 바와 같고, m은 한계를 포함하여 2 내지 6의 정수이고, 예를 들어, m은 2 또는 3임).
바람직하게는, m은 2이다(이는 디설파이드에 상응함).
특히, 단계 c)의 말미에 반응 매질은 화학식 (I)의 화합물이 L-호모시스테인인 경우 L-호모시스테인 설파이드 또는 L-호모시스틴을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 단계 c) 동안 화학식 (II)의 화합물과 H2S의 반응 후에, 하기 정의되는 바와 같은 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄 및 화학식 (V) GH의 화합물(여기서, G는 상기 정의된 바와 같음), 즉, (i') R6-C(O)-OH, (ii') (R7O)(R8O)-P(O)-OH, 또는 (iii') R9O-SO2-OH 유형의 화합물이 수득되며; 여기서, R6, R7, R8 및 R9은 하기에 정의되는 바와 같다. 특히, 화합물 (II)가 O-아세틸-L-호모세린인 경우, L-호모시스테인 및 아세트산이 수득된다. 화학식 (V)의 화합물은 단계 c) 동안 반응 매질의 산성화를 담당할 수 있다. 따라서, 상기 언급된 바와 같이 및 특히 상기 정의된 바와 같은 염기의 첨가에 의해 특히 단계 c) 동안 반응 매질의 pH를 4 내지 9, 예를 들어, 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7.5, 및 더욱 특히 6.2 내지 7.2로 유지하는 것이 가능하다.
하기 화학식 (II)의 화합물 :
하기 일반식 (II)의 화합물의 경우:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G (II)
*, R1, R2, R7, X 및 n은 화학식 (I)의 화합물에 대해 상기 정의된 바와 같고,
G는 (i) R6-C(O)-O-, 또는 (ii) (R7O)(R8O)-P(O)-O-, 또는 (iii) R9O-SO2-O-를 나타내고;
R6은 수소 원자 또는 1 내지 20 개, 바람직하게는 1 내지 10 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고, 이는 하나 이상의 방향족 기를 포함할 수 있고 -OR10, (=O), -C(O)OR11, 및 -NR12R13으로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있고;
R10, R11, R12 및 R13은 하기로부터 독립적으로 선택되고:
H 또는 1 내지 20 개, 바람직하게는 1 내지 10 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬;
동일하거나 상이한 R7 및 R8은 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄, 바람직하게는 양성자 또는 알칼리 금속, 더욱 특히 H+ 또는 Na+이고;
R9은 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄, 바람직하게는 양성자 또는 알칼리 금속, 더욱 특히 양성자 H+ 또는 Na+로부터 선택되고;
특히, G는 R6-C(O)-O- 또는 R9O-SO2-O-를 나타내고; 바람직하게는 G는 R6-C(O)-O-이다.
특히, R6는 수소 원자, 또는 -OR10, (=O) 및 -C(O)OR11로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있는 1 내지 10 개, 바람직하게는 1 내지 5 개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고; R10 및 R11은 H, 또는 1 내지 10 개, 바람직하게는 1 내지 5 개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택된다.
더욱 특히, R10 및 R11은 H이다. 특히, R12 및 R13은 H이다.
방향족 기는 우선적으로 페닐 기인 것으로 이해된다.
일반식 (II)의 화합물은 특히 세린(n이 1인 경우) 또는 호모세린(n이 2인 경우), 특히 L-세린 또는 L-호모세린의 유도체이다. 이는, 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
O-포스포-L-호모세린, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린, O-아세토아세틸-L-호모세린, O-프로피오-L-호모세린, O-쿠마로일-L-호모세린, O-말로닐-L-호모세린, O-하이드록시메틸글루타릴-L-호모세린, O-피멜릴-L-호모세린, O-설페이토-L-호모세린, O-포스포-L 세린, O-숙시닐-L-세린, O-아세틸-L-세린, O-아세토아세틸-L-세린, O-프로피오-L-세린, O-쿠마로일-L-세린, O-말로닐-L-세린, O-하이드록시메틸글루타릴-L-세린, O-피멜릴-L-세린 및 O-설페이토-L-세린.
더욱 특히, 이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
O-포스포-L-호모세린, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린, O-아세토아세틸-L-호모세린, O-프로피오-L-호모세린, O-쿠마로일-L-호모세린, O-말로닐-L-호모세린, O-하이드록시메틸글루타릴-L-호모세린, O-피멜릴-L-호모세린 및 O-설페이토-L-호모세린.
일반식 (II)의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
O-포스포-L-호모세린, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린, O-설페이토-L-호모세린 및 O-프로피오-L-호모세린.
일반식 (II)의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
O-포스포-L-호모세린, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린.
매우 특히 바람직한 화학식 (II)의 화합물은 O-아세틸-L-호모세린(OAHS)이며, 이러한 화합물에서 n은 2이고, X는 -C(=O)-이고, R2는 -OR3이고, 여기서 R3는 H이고, R1 및 R7은 H이고, G는 -O-C(O)-R6이고, 여기서 R6는 메틸이다.
화학식 (II)의 화합물은 상업적으로 입수 가능하거나 당업자에게 공지된 임의의 기술을 통해 수득된다.
이들은, 예를 들어, 출원 WO 2008/013432호에 기재된 바와 같이 탄화수소 및 질소의 공급원으로부터 발효 공정에 의해 수득될 수 있다.
이들은, 예를 들어, 재생 가능한 출발 물질의 발효에 의해 수득될 수 있다. 재생 가능한 출발 물질은 글루코스, 수크로스, 전분, 당밀, 글리세롤 및 바이오에탄올, 바람직하게는 글루코스로부터 선택될 수 있다.
L-세린 유도체는 또한 L-세린의 아세틸화로부터 생산될 수 있으며, L-세린 자체는 가능하게는 재생 가능한 출발 물질의 발효에 의해 수득된다. 재생 가능한 출발 물질은 글루코스, 수크로스, 전분, 당밀, 글리세롤 및 바이오에탄올, 바람직하게는 글루코스로부터 선택될 수 있다.
L-호모세린 유도체는 또한 L-호모세린의 아세틸화로부터 생산될 수 있으며, L-호모세린 자체는 가능하게는 재생 가능한 출발 물질의 발효에 의해 수득될 수 있다. 재생 가능한 출발 물질은 글루코스, 수크로스, 전분, 당밀, 글리세롤 및 바이오에탄올, 바람직하게는 글루코스로부터 선택될 수 있다.
설프하이드릴라제:
설프하이드릴라제, 바람직하게는 상기 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제로부터 선택된 적어도 하나의 효소의 존재에서 상기 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응이 수행된다. 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제는 동일한 명칭을 공유하기 때문에 용이하게 식별가능하며, 예를 들어, O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제(OAHS 설프하이드릴라제)는 O-아세틸-L-호모세린과 결합된다.
설프하이드릴라제는 특히 상기 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응(효소 반응)의 촉매작용을 가능하게 한다. "촉매"는 일반적으로, 반응을 가속화하고 이러한 반응의 말미에 변하지 않는 물질인 것으로 이해된다. 설프하이드릴라제, 및 임의로 이의 보조인자는 촉매량으로 사용될 수 있다. "촉매량"은 특히 반응을 촉매작용하기에 충분한 양인 것으로 이해된다. 더욱 특히, 촉매량으로 사용되는 시약은 화학량론적 비율로 사용되는 시약의 중량 기준의 양에 대해 더 적은 양, 예를 들어, 약 0.01 중량% 내지 20 중량%로 사용된다.
상기 설프하이드릴라제 효소는 바람직하게는 특히 EC 2.X.X.XX(또는 EC 2로 언급됨) 분류에 의해 지정된 트랜스퍼라제 부류에 속한다. ≪ 효소 위원회 번호 ≫에 대한 EC 분류가 널리 사용되며 웹사이트 https://enzyme.expasy.org/에서 찾아볼 수 있다. 특히, 상기 효소는 EC 2.5.X.XX 분류(또는 EC 2.5로 언급됨)의 설프하이드릴라제 중에서 선택되며, 이는 메틸 기가 아닌 알킬 또는 아릴 기를 전달하는 트랜스퍼라제를 의미한다.
설프하이드릴라제는 특히 부류 EC 2.5.1.XX이다(XX는 효소의 기질에 따라 다름).
예를 들어:
- O-아세틸호모세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.49이다.
- O-포스포세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.65이다.
- O-숙시닐호모세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.49이다.
예를 들어:
- O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.49이다.
- O-포스포-L-세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.65이다.
- O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제는 유형 EC 2.5.1.49이다.
따라서, 특히 화학식 (II)의 화합물이 L-호모세린 또는 L-세린의 유도체인 경우, 사용되는 설프하이드릴라제는 O-포스포-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-아세토아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-프로피오-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-쿠마로일-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-말로닐-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-하이드록시메틸글루타릴-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-피멜릴-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-설페이토-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-포스포-L-세린 설프하이드릴라제, O-숙시닐-L-세린 설프하이드릴라제, O-아세틸-L-세린 설프하이드릴라제, O-아세토아세틸-L-세린 설프하이드릴라제, O-프로피오-L-세린 설프하이드릴라제, O-쿠마로일-L-세린 설프하이드릴라제, O-말로닐-L-세린 설프하이드릴라제, O-하이드록시메틸글루타릴-L-세린 설프하이드릴라제, O-피멜릴-L-세린 설프하이드릴라제 및 O-설페이토-세린 설프하이드릴라제로부터 선택될 수 있다.
더욱 특히, 사용되는 설프하이드릴라제는 O-포스포-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-아세토아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-프로피오-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-쿠마로일-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-말로닐-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-하이드록시메틸글루타릴-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-피멜릴-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-설페이토-L-호모세린 설프하이드릴라제로부터 선택될 수 있다.
특히, 설프하이드릴라제는 O-포스포-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-설페이토-L-호모세린 설프하이드릴라제 및 O-프로피오-L-호모세린 설프하이드릴라제로부터 선택될 수 있다.
설프하이드릴라제는 O-포스포-L-호모세린 설프하이드릴라제, O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제 및 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제로부터 선택될 수 있다.
매우 특히 바람직하게는, 효소는 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제(OAHS 설프하이드릴라제)이다.
상기 설프하이드릴라제, 및 특히 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제는 하기 박테리아 균주로부터 기원하거나 유래될 수 있다: 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 크로모박테리움 종(Chromobacterium sp.), 렙토스피라 종(Leptospira sp.) 또는 하이포모나스 종(Hyphomonas sp.).
설프하이드릴라제는 당업자에게 완전히 공지된 바와 같이, 피리독살 5'-포스페이트(PLP로도 공지됨) 또는 이의 유사체 중 하나, 바람직하게는 피리독살 5'-포스페이트와 같은 보조인자의 존재 하에 기능할 수 있다.
보조인자 피리독살 포스페이트의 유사체 중에서, α5-피리독살메틸포스페이트, 5'-메틸피리독살-P, 피리독살 5'-설페이트, α5-피리독살아세트산 또는 임의의 다른 공지된 유도체가 언급될 수 있다(Groman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 69, No. 11, pp. 3297-3300, November 1972).
일 구현예에 따르면, 설프하이드릴라제의 보조인자는 반응 매질에 첨가될 수 있다. 따라서, 설프하이드릴라제의 보조인자, 예를 들어, 피리독살 5'-포스페이트는 단계 c) 전에 제공될 수 있거나, 단계 c) 동안 첨가될 수 있다. 단계 c)가 수용액에서 수행되는 경우, 효소 및 임의로 이의 보조인자는 상기 용액에 첨가되기 전에 미리 물에 용해될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 세포, 예를 들어, 박테리아 세포 또는 다른 세포는 상기 보조인자를 보충하는 단계를 피하기 위해 설프하이드릴라제 효소를 동시에 발현 또는 과발현하면서 상기 보조인자를 생산하거나 심지어 과잉생산할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 설프하이드릴라제, 및 임의로 이의 보조인자는 다음과 같다:
-
예를 들어, 수용액 내의 분리된 및/또는 정제된 형태;
상기 생산된 효소의 분리 및/또는 정제는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어, 전기영동, 분자 체질, 초원심분리, 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 차등 침전, 초미세여과, 막 또는 겔 여과, 이온 교환, 소수성 상호작용을 통한 분리, 또는 예를 들어, IMAC 유형의 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 기술을 포함할 수 있다.
- 또는 미정제 추출물, 즉, 밀링된 세포의 추출물(용해질)에 존재함; 관심 효소는 상기 세포에서 과발현되거나 과발현되지 않을 수 있으며, 이하에서 숙주 세포로 지칭된다. 숙주 세포는 상응하는 코딩 유전자의 발현으로부터 관심 효소의 생산에 적합한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 이 유전자는 이후 숙주의 게놈에 위치하거나 발현 벡터에 의해 운반될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "숙주 세포"는 특히 원핵 또는 진핵 세포인 것으로 이해된다. 재조합 또는 비-재조합 단백질의 발현에 일반적으로 사용되는 숙주 세포는 특히 박테리아의 세포, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 종(Bacillus sp.), 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 효모의 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 진균의 세포, 예컨대, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum) 또는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 곤충 세포, 예컨대, Sf9 세포, 또는 다른 포유동물(특히, 인간) 세포, 예컨대, HEK 293, PER-C6 또는 CHO 세포주를 포함한다.
바람직하게는, 관심 효소 및 임의로 보조인자는 박테리움 에스케리키아 콜라이에서 발현된다. 우선적으로는, 관심 효소는, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3)과 같은 에스케리키아 콜라이의 균주 내에서 발현된다.
세포 용해질은 초음파 처리, 압력(프렌치 프레스(French press)), 화학적 제제(예를 들어, 자일렌, 트리톤)의 사용 등을 통함과 같은 다양한 공지된 기술에 따라 수득될 수 있다. 수득된 용해질은 밀링된 세포의 미정제 추출물에 해당한다.
- 또는 전체 세포에 존재함. 이를 위해, 세포 용해 단계를 수행하지 않고 상기와 동일한 기술이 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 설프하이드릴라제 효소를 발현하는 바이오매스의 양은, 화학식 (II)의 화합물의 질량에 대해, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%이고/이거나, 화학식 (II)의 화합물에 대한 보조인자의 양은 0.1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 5 중량%이다.
반응 매질은 또한 하기를 포함할 수 있다:
- 임의로, 물, 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충제, Tris-HCl, Tris 염기, 암모늄 바이카르보네이트, 암모늄 아세테이트, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), CHES (N-사이클로헥실-2-아미노에탄설폰산), 또는 염, 예컨대, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 또는 이들의 매질로부터 선택된 하나 이상의 용매;
- 임의로, 특히 하나 이상의 시약 또는 기질의 용해도를 촉진시키기 위한 첨가제, 예컨대, 계면활성제.
상기 단계 c)의 반응에 사용될 수 있는 다양한 성분은 용이하게 상업적으로 수득 가능하거나 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 상이한 요소는 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 매우 유리하게는 용액으로 제공되거나 본 발명의 공정에서 사용되는 물 또는 임의의 다른 용매에 용해될 수 있다. 사용되는 효소는 또한 지지체 상에 그래프팅될 수 있다(지지된 효소의 경우).
바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 (II)의 화합물은 O-아세틸-L-호모세린이고, 사용되는 효소는 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제이고, 수득되는 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄은 L-호모시스테인이다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 조성물, 바람직하게는 수용액에 관한 것이다:
-
상기 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물;
-
설프하이드릴라제, 바람직하게는 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제(상기 설프하이드릴라제는 상기 정의된 바와 같음); 및
-
바람직하게는 과량의 용존 H2S.
바람직하게는, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
-
O-아세틸-L-호모세린;
-
O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제; 및
-
바람직하게는 과량의 용존 H2S.
상기 조성물은 특히 상기 정의된 바와 같은 반응 매질에 상응한다.
조건, 특성 및 선택적인 추가 성분은 상기 정의된 바와 같은 반응 매질에 대해 정의된 것과 동일하다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 용존 산소를 포함하지 않는다. 바람직하게는, H2S는 화학식 (II)의 화합물에 비해 과량, 바람직하게는 몰 과량이다. 따라서, H2S는 화학식 (II)의 화합물의 양에 비해 초화학량론적 양일 수 있다.
특히, H2S/화학식 (II)의 화합물의 몰 비율은 1.1 내지 20, 바람직하게는 1.1 내지 10, 우선적으로는 2 내지 8, 예를 들어, 3.5 내지 8, 및 훨씬 더 우선적으로는 3.5 내지 5이다.
조성물은 또한 상기 정의된 바와 같은 설프하이드릴라제의 보조인자를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 공정을 수행하는 것을 가능하게 한다.
도 1: 도 1은 H2S의 분압(bar)의 함수로서 1 시간의 반응 후 L-호모시스테인의 효소적 합성 반응의 수율(%)을 나타낸 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것을 가능하게 하지만, 어떠한 상황에서도 제한적이지 않다.
실시예
전환율, 선택성 및 수율의 통상적인 정의는 하기와 같다:
전환율 = (초기 상태의 반응물의 몰수 - 반응 후 남은 반응물의 몰수) / (초기 상태의 반응물의 몰수)
선택성 = 요망되는 생성물로 전환된 반응물의 몰수 / (초기 상태의 반응물의 몰수 - 반응 후 남은 반응물의 몰수)
수율 = 전환 X 선택성
실시예 1
: H
2
S 분압 하에서 O-아세틸-L-호모세린으로부터 L-호모시스테인의 효소적 제조
단계 1: O-아세틸-L-호모세린(OAHS)의 제조
O-아세틸-L-호모세린을 문헌[Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press (1971), vol. 17, p. 423-424]에 기재된 프로토콜에 따라 L-호모세린과 아세트산 무수물로부터 합성하였다.
단계 2: 반응 매질의 제조
단계 1)에서 유래된 10 g/l의 O-아세틸-L-호모세린(이 생성물을 250 ml의 물에 용해시킴)을 자동 온도 조절식으로 제어되는 500 ml 스테인리스 강 반응기에 도입하였다. 용액을 기계적 교반과 함께 37℃로 야기하였다.
5 g/l의 OAHS 설프하이드릴라제 및 0.4 g/l의 피리독살 포스페이트 보조인자를 반응 매질에 300 ml의 총 부피에 도달하도록 첨가하였다. pH는 암모니아 수용액(4 M)을 사용하여 6.5의 설정점 값으로 유지하였다.
이어서, 반응 매질을 약 10 분 동안 질소 버블링에 의해 탈기시켰다.
단계 3: 압력 하에 H
2
S의 첨가
반응기 헤드 스페이스에 존재하는 모든 기체를 제거하고 이에 따라 첨가되는 하이드로젠 설파이드의 압력을 미세하게 제어하기 위해 반응기를 진공 하에 두었다.
이후, 특정 압력의 H2S를 적용하였다(PH2S = P전체). 반응의 시작을 반응 매질의 점진적인 산성화(아세트산 부산물의 점진적인 방출로 인한)에 의해 확인하고, 용액의 pH를 암모늄 하이드록사이드(4 M)의 점진적인 첨가를 통해 약 6.5로 유지하였다.
분석.
반응 수율을 아르젠토메트릭 전위차 적정에 의해 형성된 메르캅탄의 정량화 접근법을 통해 1 시간의 반응 후에 측정하였다(결과는 또한 NMR 및 HPLC 분석에 의해 확인함).
결과.
1 시간의 반응 후 L-호모시스테인의 수율을 사용된 반응기의 기체 헤드스페이스에서 H2S의 상이한 분압으로 여러 시험에 대해 결정하였다.
결과는 세 가지 단계가 있음을 보여준다(도 1 참조):
- 0 내지 0.25 bar 분압의 H2S의 수율 증가;
- 90% 내지 100%의 수율, 0.25 내지 2 bar 분압의 H2S를 갖는 안정기;
- 2 bar 초과 내지 4 bar 이하의 H2S의 분압에 대한 이러한 수율의 감소.
실시예 2:
H
2
S 분압 하에서 및 비-탈기된 반응 매질에서 O-아세틸-L-호모세린으로부터 L-호모시스테인의 효소적 제조
단계 1: O-아세틸-L-호모세린(OAHS)의 제조
O-아세틸-L-호모세린을 문헌[Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press (1971), vol. 17, p. 423-424]에 기재된 프로토콜에 따라 L-호모세린과 아세트산 무수물로부터 합성하였다.
단계 2: 반응 매질의 제조
단계 1)에서 유래된 10 g/l의 O-아세틸-L-호모세린(이 생성물을 250 ml의 물에 용해시킴)을 자동 온도 조절식으로 제어되는 500 ml 스테인리스 강 반응기에 도입하였다. 용액을 기계적 교반과 함께 37℃로 야기하였다.
5 g/l의 OAHS 설프하이드릴라제 및 0.4 g/l의 피리독살 포스페이트 보조인자를 반응 매질에 300 ml의 총 부피에 도달하도록 첨가하였다. pH를 암모니아 수용액(4 M)을 사용하여 6.5의 설정점 값으로 유지하였다.
단계 3: 압력 하에 H
2
S의 첨가
반응기 헤드 스페이스에 존재하는 모든 기체를 제거하고 이에 따라 첨가되는 하이드로젠 설파이드의 압력을 미세하게 제어하기 위해 반응기를 진공 하에 두었다.
이후, 0.25 bar의 H2S의 압력을 가했다. 반응의 시작을 반응 매질의 점진적인 산성화(아세트산 부산물의 점진적인 방출로 인한)에 의해 확인하고, 용액의 pH를 암모늄 하이드록사이드(4 M)의 점진적인 첨가를 통해 약 6.5로 유지하였다.
분석.
반응 수율을 아르젠토메트릭 전위차 적정에 의해 형성된 메르캅탄의 정량화 접근법을 통해 1 시간의 반응 후에 측정하였다(결과는 또한 NMR 및 HPLC 분석에 의해 확인함).
결과.
T최종에서 L-호모시스테인의 수율: 88.4%
Claims (12)
- 하기 일반식 (I)의 적어도 하나의 작용성화된 메르캅탄의 합성 방법으로서:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH (I)
(상기 식에서,
- 동일하거나 상이한 R1 및 R7은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
- X는 -C(=O)-, -CH2- 또는 -CN으로부터 선택되고;
- R2는
(i) X가 -CN을 나타낼 때 부재하고,
(ii) 또는 수소 원자이고,
(iii) 또는 -OR3이고, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
(iv) 또는 -NR4R5이고, 동일하거나 상이한 R4 및 R5는 수소 원자, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 방향족 또는 비방향족, 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고;
n은 1 또는 2이고; *는 비대칭 탄소를 나타냄);
상기 방법이
a) 하기 일반식 (II)의 적어도 하나의 화합물의 제공 단계:
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G (II)
(상기 식에서, *, R1, R2, R7, X 및 n은 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같고,
G는 (i) R6-C(O)-O-, 또는 (ii) (R7O)(R8O)-P(O)-O-, 또는 (iii) R9O-SO2-O-를 나타내고;
R6은 수소 원자 또는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬이고, 이는 하나 이상의 방향족 기를 포함할 수 있고 -OR10, (=O), -C(O)OR11, -NR12R13으로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있고;
R10, R11, R12 및 R13은
H 또는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 환형의 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬로부터 독립적으로 선택되고;
동일하거나 상이한 R7 및 R8은 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄이고;
R9는 양성자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄으로부터 선택됨);
b) H2S의 제공 단계;
c) 설프하이드릴라제, 바람직하게는 상기 화학식 (II)의 화합물과 결합된 설프하이드릴라제로부터 선택된 적어도 하나의 효소의 존재에서 상기 적어도 하나의 화학식 (II)의 화합물과 H2S 사이의 반응 단계로서,
상기 반응이 반응 온도에서 0.01 내지 4 bar, 예를 들어, 0.01 내지 3 bar, 바람직하게는 0.1 내지 3 bar, 예를 들어, 0.1 내지 2.5 bar의 상기 반응기의 기체 헤드스페이스에서 H2S의 분압으로 반응기에서 수행되는, 단계;
d) 화학식 (I)의 적어도 하나의 작용성화된 메르캅탄의 수득 단계;
e) 단계 d)에서 수득되는 상기 적어도 하나의 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄의 임의의 분리 단계; 및
f) 단계 d) 또는 e)에서 수득되는 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄의 임의의 추가 작용성화 및/또는 임의의 탈보호 단계를 포함하고,
여기서 단계 a) 및 b)가 임의로 동시에 수행되는, 합성 방법. - 제1항에 있어서, 상기 반응기의 기체 헤드스페이스에서 H2S의 분압이 0.25 내지 2 bar인, 합성 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, H2S가 화학식 (II)의 화합물에 비해 과량인, 합성 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 수용액에서 수행되는, 합성 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, H2S의 분압이 상기 기체 헤드스페이스의 총 압력에 상응하는, 합성 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, H2S의 분압이 단계 c)의 전체 기간 동안 일정하게 유지되는, 합성 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II)의 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 합성 방법:
O-포스포-L-호모세린, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린, O-아세토아세틸-L-호모세린, O-프로피오-L-호모세린, O-쿠마로일-L-호모세린, O-말로닐-L-호모세린, O-하이드록시메틸글루타릴-L-호모세린, O-피멜릴-L-호모세린 및 O-설페이토-L-호모세린, 바람직하게는 O-아세틸-L-호모세린. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄이 L-호모시스테인인, 합성 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물이 O-아세틸-L-호모세린이고, 사용되는 효소가 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제이고, 화학식 (I)의 작용성화된 메르캅탄이 L-호모시스테인인, 합성 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 본질적으로 산소의 부재에서, 바람직하게는 산소의 부재에서 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 동안의 온도가 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃, 및 더욱 특히 25℃ 내지 40℃인, 방법.
- - 제1항에 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물;
- 설프하이드릴라제; 및
- 용존 H2S
를 포함하는, 조성물.
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