CN116601143A - 用于在h2s压力下合成官能化硫醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种合成官能化硫醇的方法，包括式R2‑X‑C*H(NR1R7)‑(CH2)n‑G(II)的化合物和H2S在至少一种选自硫化氢解酶的酶存在下的反应；所述反应在反应温度下在具有在0.01至4巴之间，优选在0.1至3巴之间，例如在0.1至2.5巴之间，更优选在0.25至2巴之间的所述反应器的气态顶部空间中的H2S的分压的反应器中进行。
Description
本发明涉及一种合成官能化硫醇的方法，并且还涉及一种使得可以特别地实施该方法的组合物。
硫醇被用于许多工业领域，并且许多合成方法是已知的，诸如醇的硫巯基化、硫化氢在不饱和有机化合物上的催化或光化学加成，或使用硫化氢取代卤化物、环氧化物或有机碳酸酯(盐)。
然而，这些方法具有许多缺点，并且并不总是适合于官能化硫醇(也就是说，包含除硫醇基团(-SH)之外的至少一个官能团的硫醇)的合成。这种类型的硫醇构成了一个具有巨大潜力的化学家族，尤其是具有硫醇官能团的氨基酸和衍生物，尤其是同型半胱氨酸。它们可以例如用作化妆品工业的合成中间体。然而，目前还没有适合生产这些官能化硫醇的有效合成方法，该方法在工业上是可行的，特别是对于落在商品化学品领域内的应用。
例如，在传统的化学方法中，用硫化氢取代经常需要高的温度和压力，并导致不希望的烯烃、醚、硫化物和/或多硫化物类型的副产物。硫化氢在不饱和化合物上的催化或光化学加成通常在稍微温和的条件下进行，但同样会导致许多通过起始材料的异构化、通过非区域选择性加成或通过导致产生硫化物和/或多硫化物的双重加成而形成的副产物。
因此，这些常规合成方法需要这样的运行条件，所述运行条件对化合物诸如官能化硫醇来说过于苛刻，并导致大量难以提质(upgrade)的硫化物和/或多硫化物的共同生产。
经由生物路线合成官能化硫醇是化学路线的已知替代方案。例如，半胱氨酸目前是通过发酵路线以生物方式产生的(Maier T.,2003.Nature Biotechnology,21:422-427)。这些生物路线更温和，并且更好地适合多官能分子。然而，这些生物路线通常具有低产率和/或在工业规模上不容易换位或不可行。此外，在这里再次，感兴趣的硫醇的生产伴随着相应的硫化物和/或多硫化物诸如二硫化物(参见例如国际申请WO 2012/053777)。
因此，需要一种改进的合成官能化硫醇的方法，特别是通过生物路线。
特别地，需要一种合成官能化硫醇的方法，该方法使得可以获得令人满意的产率，或甚至至少20％、优选至少60％、更优选至少80％、更优选至少90％的产率。
还需要一种在温和的运行条件下在工业规模上可行的合成官能化硫醇的方法。
本发明的一个目的是提供一种用于合成官能化硫醇的改进方法，该方法特别地具有提高的产率，或甚至具有至少20％、优选至少60％、更优选至少80％、更优选至少90％的产率。
本发明的另一个目的是提供一种具有温和的运行条件且适于合成多官能硫醇的的工业方法。本发明的另一个目的是提供一种避免使用氢硫化物盐和/或硫化物盐作为试剂的方法，并且因此是更加环境友好的。
本发明完全或部分地实现了上述目的。
根据本发明，如下定义的式(I)的官能化硫醇，特别是L-同型半胱氨酸，有利地通过在硫化氢解酶的存在下，在发生所述反应的反应器中的H2S的特定分压范围下，式(II)的化合物和H2S之间的反应而合成。特别地，所述H2S的分压在0.01至4巴之间，例如在0.01至3巴之间，优选在0.1至3巴之间，例如在0.1至2.5巴之间，更优选在0.25至2巴之间。
本发明人因此发现，式(II)的化合物转化为式(I)的官能化硫醇在很大程度上取决于反应器中H2S的分压。令人惊讶地，本发明人已经发现，在反应器中H2S的特定分压范围内，获得至少20％、优选至少60％、更优选至少80％、更优选至少90％的转化率和/或产率。例如，转化率和/或产率在80％和100％之间，或甚至在90％和100％之间。特别地，转化率和/或产率为100％。
事实上，与预期相反，使反应器中H2S分压增加超过某个极限并不能增加反应的转化率和/或产率，而是限制或甚至抑制了后者。可以预期，反应器中H2S分压增加得越多，反应介质中H2S的量增加得越多(特别是在液体反应介质中以溶解的形式)，从而促进反应。然而，过高的H2S分压实际上对反应是有害的。
此外，根据本发明的反应器中H2S特定分压范围允许快速反应动力学。例如，可以在一小时内实现100％的产率。因此，反应时间可以在0.15小时至10小时之间，例如在0.25小时至4小时之间，优选在0.5小时至1小时之间。
还观察到，根据本发明的方法使得可以获得比使用氢硫化物盐和/或硫化物盐作为试剂的方法更好的产率。因此，硫化氢的使用使得可以限制或甚至简化纯化和管理流出物的步骤，这些步骤在使用此类盐时是必要的。因此，根据本发明的方法更环境友好。
因此，本发明涉及一种合成至少一种以下通式(I)的官能化硫醇的方法：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH(I)
其中，
-R1和R7相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子；
-X选自–C(＝O)-、–CH2-或–CN；
-R2：
(i)当X表示-CN时不存在，
(ii)或是氢原子，
(iii)或是-OR3，R3是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子，
(iv)或是–NR4R5、R4和R5，它们相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子；
n等于1或2；并且*表示不对称碳；
所述方法包括以下阶段：
a)提供至少一种以下通式(II)的化合物：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G(II)
其中*、R1、R2、R7、X和n如针对式(I)所定义的，并且
G表示(i)R6-C(O)-O-、或(ii)(R7O)(R8O)-P(O)-O-、或(iii)R9O-SO2-O-；
其中
R6是氢原子或1至20个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可包含一个或多个芳族基团，并可被选自–OR10、(＝O)、-C(O)OR11、-NR12R13的一个或多个基团取代；
R10、R11、R12和R13独立地选自：
H，或1至20个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链；
R7和R8相同或不同，是质子、碱金属、碱土金属或铵；
R9选自质子、碱金属、碱土金属或铵；
b)提供H2S；
c)在选自硫化氢解酶、优选与所述式(II)的化合物相关联的硫化氢解酶的至少一种酶存在下的所述至少一种式(II)的化合物和H2S之间的反应；
所述反应在反应温度下在具有0.01至4巴之间，例如在0.01至3巴之间，优选在0.1至3巴之间，例如在0.1至2.5巴之间，更优选在0.25至2巴之间的所述反应器的气体顶部空间中的H2S的分压的反应器中进行；
d)获得至少一种式(I)的官能化硫醇；
e)任选分离在阶段d)中获得的所述至少一种式(I)的官能化硫醇；和
e)在阶段d)或e)中获得的式(I)的官能化硫醇的任选的额外官能化和/或任选的脱保护；并且
其中阶段a)和阶段b)任选地同时进行。
除非另有说明，否则表述“X至(和)X(之间)”包括所提及的端值。
不饱和烃链被理解为在两个碳原子之间包含至少一个双键或三键的烃链。
杂原子特别被理解为选自O、N、S、P和卤素的原子。
惰性气体特别地被理解为在根据本发明的方法的上下文中几乎没有或没有反应性的任何气体。以举例方式可以提及分子氮、氩气或甲烷，优选分子氮。
反应介质(或混合物)特别地理解为包含至少一种式(II)的化合物、H2S和所述至少一种硫化氢解酶的介质。
因此，所述反应介质可以包含：
-如下定义的至少一种式(II)的化合物，
-H2S，
-如下定义的至少一种硫化氢解酶，
-任选地如下定义的其辅因子，
-任选地如下定义的碱，以及
-任选地溶剂，优选水。
优选地，反应介质是液体，例如呈水溶液的形式，特别是在阶段c)的温度和压力条件下。
H2S是气态形式，特别是在阶段c)的温度和压力条件下。特别地，应理解的是，一部分H2S溶解在反应介质中，以便进行阶段c)的反应，而另一部分在所述分压下在反应器的气体顶部空间中呈气态形式。
“气体顶部空间”应理解为意指反应器中位于反应介质上方，优选位于液体反应介质上方的空间。更特别地，“气体顶部空间”应理解为意指位于液体反应介质的表面和反应器的顶部之间的空间(当反应器的下部包括液相时，包括气相的反应器的上部)。气体顶部空间特别地包括包含在所述分压下的H2S的气相。
反应介质和H2S特别地以使得气体顶部空间位于反应器中所含的反应介质上方的量引入反应器中。
或者，阶段c)可以描述如下：
c)在选自硫化氢解酶、优选与所述式(II)的化合物相关联的硫化氢解酶的至少一种酶存在下的所述至少一种式(II)的化合物和H2S之间的反应；
所述反应在反应温度下在具有0.01至4巴之间，例如在0.01至3巴之间，优选在0.1至3巴之间，例如在0.1至2.5巴之间，更优选在0.25至2巴之间的在反应介质上方的H2S的分压的反应器中进行。
根据一个实施方案，所述H2S的分压对应于存在于气体顶部空间中的气相的总压力(即，反应器的气体顶部空间仅存在H2S)。
根据一个实施方案，所述H2S的分压可以在阶段c)的整个持续时间内保持恒定。这可以通过在阶段c)期间将H2S连续引入反应器中或通过将H2S定期或不定期地分开(单独)添加到反应器中来获得。事实上，由于H2S在反应期间被消耗，因此可以补偿H2S分压的降低。
根据另一个实施方案，所述H2S分压可以在阶段c)之前或期间实现，然后停止将H2S引入反应器中。因此，H2S分压在阶段c)期间降低，优选地直到反应停止。
H2S分压可以在整个阶段c)中控制，特别是通过任何已知的技术，例如使用压力计。可以加入H2S，使得在反应器中达到液相(反应介质)和气相(包含在所述分压下的H2S)之间的平衡状态。
优选地，气体顶部空间中的气相的总压力(例如当H2S是唯一的气体时的H2S压力或H2S和惰性气体的混合物的总压力)大致对应于大气压(约1.01325巴)。根据所需的运行条件，也可以选择在相对于大气压力的负压或超压下工作。
例如，可以提及以下方法。
■根据一个实施方案，在反应器中产生真空，然后引入在根据本发明的分压下的H2S。例如，将真空降至-1巴，然后施加0.25巴的H2S压力。
■根据另一个实施方案，执行以下阶段：
-用惰性气体诸如N2吹扫反应器的顶部空间；然后
-产生部分真空；然后
-引入在根据本发明的分压下的H2S。
例如，在用N2吹扫反应器的顶部空间之后，抽真空至-0.25巴，然后加入0.25巴的H2S。
■根据另一个实施方案，可以将惰性气体(诸如N2)和在根据本发明的分压下的H2S的混合物引入反应器中。例如，可以引入0.25巴H2S和0.75巴N2的混合物。
■根据另一个实施方案，可以向反应器中引入惰性气体(吹扫气体顶部空间)诸如N2，然后加入在根据本发明的分压下的H2S。例如，可以施加1巴N2的压力，然后添加0.25巴H2S。
阶段c)期间的温度可以在10℃至60℃之间，优选地在20℃至40℃之间、更特别地在25℃至40℃之间。
用于阶段c)的反应器可以是任何类型的。它优选选自塞流反应器或连续反应器，优选被搅拌和/或具有气相再循环和/或液相再循环的塞流反应器或连续反应器。优选地，所述反应器能够使存在于气体顶部空间中的气相再循环(或回收利用)。
阶段a)和b)可以同时进行或以任何顺序进行。
所述反应介质可以通过以任何顺序加入所述式(II)的化合物、所述硫化氢解酶和任选的其辅因子来制备。接下来优选引入H2S。这特别地使得可以更容易地管理引入到反应器中的H2S压力。
优选地，式(II)的化合物和/或硫化氢解酶呈溶液形式，更优选呈水溶液形式。
H2S可以通过任何已知的方法引入反应器中，特别是通过鼓泡进入反应介质中，优选通过从反应器底部鼓泡进入到反应介质中。鼓泡可以通过将H2S与惰性气体(例如分子氮、氩气或甲烷，优选分子氮)混合来实现。优选地，引入纯的H2S(不与另一种气体混合)。H2S也可以经由反应器的顶部空间引入，并且例如然后可以与反应介质平衡，该反应介质优选被搅拌。
优选地，相对于式(II)的化合物，优选在阶段c)期间，更优选在步骤c)的整个持续时间期间，H2S过量，优选摩尔过量。因此，相对于式(II)的化合物的量，优选在阶段c)期间，并且更优选在阶段c)的整个持续时间期间，H2S可以是超化学计量的量。
特别地，优选在阶段c)期间，更优选在阶段c)的整个持续时间期间，H2S/式(II)的化合物的摩尔比在1.1至20之间，优选在1.1至10之间，优选地在2至8之间，例如在3.5至8之间，甚至更优选在3.5至5之间。所述比率可以在阶段c)的整个持续时间期间保持恒定。
阶段c)可以在溶液中，特别是在水溶液中进行。例如，相对于溶液的总重量，溶液包含在50重量％至99重量％之间的水，优选在75重量％至97重量％之间的水。
阶段c)中的反应介质的pH可以在4至9之间，例如在5至8之间，优选在6至7.5之间，更特别地在6.2至7.2之间，特别是当反应介质是水溶液时。
根据所选择的硫化氢解酶的最佳运行，pH特别可以在上述范围内调节。pH可以通过常规的已知方法来测定，例如用pH探针。pH特别地可以通过添加碱来调节，优选在步骤c)的整个反应过程中添加。可以使用任何类型的碱，优选包含硫原子的碱。碱特别地被理解为具有大于7、优选在8至14之间的pH的化合物或化合物的混合物。
碱可以选自氢硫化物盐和/或硫化物盐、氢氧化钠、氢氧化钾或氨。优选的碱是氢硫化铵(NH4SH)。
硫氢化物和/或硫化物盐可以选自：氢硫化铵、碱金属氢硫化物、碱土金属氢硫化物、碱金属硫化物和碱土金属硫化物。
碱金属被理解为锂、钠、钾、铷和铯，优选钠和钾。
碱土金属被理解为铍、镁、钙、锶和钡，优选钙。
特别地，氢硫化物盐和/或硫化物盐可以选自：
氢硫化铵NH4SH、氢硫化钠NaSH、氢硫化钾KSH、氢硫化钙Ca(SH)2、硫化钠Na2S、硫化铵(NH4)2S、硫化钾K2S和硫化钙CaS。优选的氢硫化物是氢硫化铵NH4SH。
碱可以以在0.1至10M之间，优选在0.5至10M之间，更优选在0.5至5M之间的浓度加入。将特别使用浓碱，以便在添加碱时限制反应介质的稀释。
阶段c)可以分批地、半连续地或连续地进行。
在基本上不存在氧气的情况下进行的阶段c)
氧气被特别理解为指分子氧O2。
优选地，阶段c)在基本上不存在氧气的情况下，或甚至在不存在氧气的情况下进行。当阶段c)在基本上不存在氧气的情况下(或甚至在不存在氧气O2的情况下)进行时，如果需要的话，这使得限制(或甚至防止)硫化物和/或多硫化物，特别是作为不需要的副产物的二硫化物的共同生产成为可能(参见申请FR2007577)。
更特别地，表述“基本上不存在氧气的情况下”被理解为指一定量的氧气可以保留在反应介质中和/或在气相中(包含在反应器的气体顶部空间中的)，使得所产生的硫化物和/或多硫化物的量相对于所产生的式(I)的化合物的总重量小于或等于5重量％。
例如，表述“基本上不存在氧气的情况下”被理解为指相对于反应介质的总重量，反应介质含有小于0.0015重量％的氧气(优选严格小于0.0015％)，和/或相对于气相的总体积，(包含在气体顶部空间中的)所述气相含有小于21体积％的氧气(优选严格小于21％)。
因此，相对于反应介质的总重量，反应介质可以含有在0至0.0015重量％之间的氧气(优选严格小于0.0015％)，和/或相对于气相的总体积，(包含在气体顶部空间中的)气相可以含有在0至21体积％之间的氧气(优选严格小于21％)。特别地，反应介质中和/或(包含在气体顶部空间中的)气相中的氧气的量使得所产生的硫化物和/或多硫化物的量相对于所产生的式(I)的化合物的总重量小于或等于5重量％。
例如，阶段c)可以在封闭的反应器中进行(即，没有来自空气的氧气供应)。
非常优选地，(包含在气体顶部空间中的)气相不包含氧气。优选地，(包含在气体顶部空间中的)气相不包含氧气，并且反应混合物包含相对于反应混合物的总重量的在0至0.0015重量％之间的氧气(优选严格小于0.0015％)。这是因为O2/H2S混合物可能存在爆炸风险，这显然暗示了对操作员的安全有风险。
更特别地，当阶段c)也在基本上不存在氧气的情况下(或甚至不存在氧气的情况下)进行时，如果需要的话，这使得生产L-同型半胱氨酸成为可能，同时限制(或甚至防止)作为不需要的副产物的L-同型胱氨酸和/或L-同型半胱氨酸硫化物(也称为4,4'-硫烷二基双(2-氨基丁酸)/L-高羊毛氨酸)的共同生产。
L-同型半胱氨酸硫化物具有下式：
L--同型胱氨酸具有下式：
在基本上不存在氧气的情况下，或甚至在不存在氧气的情况下进行，可以使用常规方法进行阶段c)。
根据一个实施方案，在阶段c)之前，例如通过脱气将氧气从反应介质中去除。
根据另一个实施方案，在阶段c)之前，将氧气从将要形成反应介质的每种组分或其中的至少两种组分的混合物中单独(分开)去除。例如，将包含式(II)的化合物、硫化氢解酶和任选的溶剂的每个溶液都脱气。
还可以优选通过脱气从反应器顶部空间的气相中去除氧气。
反应器也可以用惰性气体诸如分子氮、氩气或甲烷，优选分子氮进行惰性化。
各种技术也可以相互结合。
优选地，基本上或甚至完全不存在氧气是通过以下方式实现的：
-用惰性气体诸如分子氮、氩气或甲烷，优选分子氮使反应器惰性化；和
-将包含式(II)的化合物、硫化氢解酶和任选的溶剂的每个溶液都脱气。
工业脱气方法是众所周知的，并且可以例如提及以下方式：
-减压(真空脱气)，
-热调节(提高水性溶剂的温度并降低有机溶剂的温度)，
-膜脱气，
-通过交替的冷冻-泵-解冻循环进行脱气，
-通过用惰性气体(例如氩气、分子氮或甲烷)喷射来脱气。
根据一个实施方案，在阶段c)中，氧气既不以溶解在液体中的形式存在(特别是在反应介质中)，也不以气态形式存在(特别是在所述气相中)。
分离阶段e)可以根据本领域技术人员已知的任何技术进行。特别地，当最终产品是固体时：
-通过用在反应介质中不混溶的溶剂萃取和/或倾析，随后蒸发所述溶剂；
-通过沉淀(通过溶剂的部分蒸发或通过加入感兴趣的化合物在其中不易溶解的溶剂)。该沉淀之后通常是根据本领域技术人员已知的任何方法的过滤阶段。然后可以对最终产物进行干燥；或
-通过经由调节作为不同化合物的各自溶解度的函数的pH进行选择性沉淀。
同型半胱氨酸尤其可以以固体形式收取。
当最终产物为液体形式时，可以通过液体/液体萃取之后的蒸馏或蒸发或通过蒸馏进行分离。
额外的官能化和/或任选的脱保护的阶段f)使得可以通过常规方法获得额外的化学官能团和/或使某些化学官能团脱保护。例如，如果X-R2表示羧基官能团，则后者可以被酯化、还原为醛、还原为醇，然后被酯化、酰胺化、腈化或其他。根据所述式(I)的官能化硫醇所打算的最终用途，所有官能团都可以由本领域技术人员获得和/或脱保护。
因此，在阶段d)或e)结束时获得的式(I)的官能化硫醇可以经受一个或多个额外的化学反应，以获得一个或多种具有不同官能度的硫醇衍生物，所述化学反应是众所周知的反应。
通式(I)的官能化硫醇：
根据本发明的方法旨在获得以下通式(I)的官能化硫醇：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH (I)
其中，
-R1和R7相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子；
-X选自–C(＝O)-、–CH2-或–CN；
-R2：
(i)当X表示-CN时不存在，
(ii)或是氢原子，
(iii)或是-OR3，R3是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子，
(iv)或是–NR4R5、R4和R5，它们相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可以包含一个或多个杂原子；
n等于1或2；并且*表示不对称碳。
这些硫醇被称为官能化的，因为除了化学官能团-SH外，它们还包含至少一个胺型官能团–NR1R7。
优选地，n等于2。
优选地，X是-C(＝O)-。
优选地，R2是-OR3，其中R3如上所定义。R3可以特别地是氢原子或1至10个碳原子、优选1至5个碳原子的直链或支链饱和烃链。特别地，R3是H。
R1和R7相同或不同，优选是氢原子或1至10个碳原子、优选1至5个碳原子的直链或支链饱和烃链。优选地，R1和R7是H。
特别地，X是-C(＝O)-，并且R2是–OR3，其中R3如上所定义。
式(I)的官能化硫醇可以选自同型半胱氨酸、半胱氨酸和这些的衍生物。
特别地，式(I)的官能化硫醇是L-同型半胱氨酸和L-半胱氨酸。
优选的式(I)的官能化硫醇是同型半胱氨酸，非常特别地是下式的L-同型半胱氨酸：
对于L-同型半胱氨酸，n等于2，X是–C(＝O)-，R2是-OR3(其中R3是H)，并且R1和R7是H。
已经观察到，不对称碳原子的构型在整个阶段c)的反应中被保留。因此，根据本发明的方法获得的式(I)的官能化硫醇可以是对映体纯的。
式(I)的官能化硫醇是手性化合物。在本说明书中，当未指定对映体形式时，该化合物不论其对映体形式如何都包括在内。
根据一个实施方案，在阶段c)结束时的反应介质不包含硫化物或多硫化物，并且特别地不包含与所获得的式(I)的官能化硫醇相对应的硫化物或多硫化物。例如，相对于转化为式(I)的化合物的式(II)的化合物的总摩尔数，阶段c)结束时的反应介质包含小于10摩尔％、优选小于5摩尔％的硫化物和多硫化物。
硫化物特别地被理解为与式(I)的化合物相对应的硫化物，其是下式(III)的化合物：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-S-(CH2)n-(NR1R7)C*H-X-R2(III)
其中*、R1、R2、R7、X和n如上所定义。
多硫化物特别地被理解为与式(I)的化合物相对应的多硫化物，其是下式(IV)的化合物：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-(S)m-(CH2)n-(NR1R7)C*H-X-R2(IV)
其中*、R1、R2、R7、X和n如上所定义，并且m为在2至6之间的整数，包括端值，例如m等于2或3。
优选地，m等于2(其对应于二硫化物)。
特别地，当式(I)的化合物是L-同型半胱氨酸时，阶段c)结束时的反应介质不包含L-同型半胱氨酸硫化物或L-高半胱氨酸。
优选地，在阶段c)期间的式(II)的化合物与H2S反应后，获得如下：如上所定义的式(I)的官能化硫醇和式(V)GH的化合物，其中G如下所定义，即以下类型的化合物：(i')R6-C(O)-OH，(ii')(R7O)(R8O)-P(O)-OH或(iii')R9O-SO2-OH；其中R6、R7、R8和R9如下所定义。特别地，当化合物(II)是O-乙酰基-L-同型丝氨酸时，获得L-同型半胱氨酸和乙酸。式(V)的化合物可以负责在阶段c)期间反应介质的酸化。因此，可以将反应介质的pH保持在4至9之间，例如在5至8之间，优选在6至7.5之间，更特别地在6.2至7.2之间，特别是在如上所述的阶段c)期间，并且特别是通过添加如上所定义的碱。
通式(II)的化合物：
对于以下通式(II)的化合物：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G (II)
*、R1、R2、R7、X和n如以上针对式(I)的化合物所定义的，并且
G表示(i)R6-C(O)-O-、或(ii)(R7O)(R8O)-P(O)-O-、或(iii)R9O-SO2-O-；
其中R6是氢原子或1至20个、优选1至10个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，该烃链可包含一个或多个芳族基团，并可被选自–OR10、(＝O)、-C(O)OR11和-NR12R13的一个或多个基团取代；
R10、R11、R12和R13独立地选自：
H，或1至20个、优选1至10个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链；
R7和R8相同或不同，是质子、碱金属、碱土金属或铵，优选质子或碱金属，更特别是H+或Na+；
R9选自质子、碱金属、碱土金属或铵，优选质子或碱金属，更特别是质子H+或Na+；
特别地，G表示R6-C(O)-O-或R9O-SO2-O-；优选地G是R6-C(O)-O-。
特别地，R6是氢原子或1至10个、优选1至5个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃链，该烃链可以被选自–OR10、(＝O)和-C(O)OR11的一个或多个基团取代；R10和R11独立地选自：
H或1至10个、优选1至5个碳原子的直链或支链的饱和或不饱和的烃链；
更特别地，R10和R11是H。特别地，R12和R13是H。
芳族基团优选被理解为苯基。
通式(II)的化合物特别是丝氨酸(当n等于1时)或同型丝氨酸(当n等于2时)的衍生物，特别是L-丝氨酸或L-同型丝氨酸的衍生物。例如，它可以选自：
O-磷酸基(phospho)-L-同型丝氨酸、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰乙酰基-L-同型丝氨酸、O-丙酸基-L-同型丝氨酸、O-香豆酰基-L-同型丝氨酸、O-丙二酰基-L-同型丝氨酸、O-羟甲基戊二酰基-L-同型丝氨酸、O-庚二酰基-L-同型丝氨酸、O-硫酸根合-L-同型丝氨酸、O-磷酸基-L-丝氨酸、O-琥珀酰基-L-丝氨酸、O-乙酰基-L-丝氨酸、O-乙酰乙酰基-L-丝氨酸、O-丙酸基-L-丝氨酸、O-香豆酰基-L-丝氨酸、O-丙二酰基-L-丝氨酸、O-羟甲基戊二酰基-L-丝氨酸、O-庚二酰基-L-丝氨酸、O-硫酸根合-L-丝氨酸。
更具体地，它可以选自：
O-磷酸基-L-同型丝氨酸、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰乙酰基-L-同型丝氨酸、O-丙酸基-L-同型丝氨酸、O-香豆酰基-L-同型丝氨酸、O-丙二酰基-L-同型丝氨酸、O-羟甲基戊二酰基-L-同型丝氨酸、O-庚二酰基-L-同型丝氨酸和O-硫酸根合-L-同型丝氨酸。
通式(II)的化合物可以选自：
O-磷酸基-L-同型丝氨酸、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰基-L-同型丝氨酸、O-硫酸根合-L-同型丝氨酸和O-丙酸基-L-同型丝氨酸。
通式(II)的化合物可以选自：
O-磷酸基-L-同型丝氨酸、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰基-L-同型丝氨酸。
非常特别优选的式(II)的化合物是O-乙酰基-L-同型丝氨酸(OAHS)，其中n等于2，X是-C(＝O)-，R2是-OR3(其中R3是H)，R1和R7是H，G是–O-C(O)-R6(其中R6是甲基)的一种化合物。
式(II)的化合物可商购或经由本领域技术人员已知的任何技术获得。
它们可以通过发酵过程从烃和氮的来源获得，例如如申请WO 2008/013432中所描述的。
它们可以通过例如可再生起始材料的发酵来获得。可再生起始材料可以选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、甘油和生物乙醇，优选葡萄糖。
L-丝氨酸衍生物也可以由L-丝氨酸的乙酰化产生，L-丝氨酸本身可能通过可再生起始材料的发酵获得。可再生起始材料可以选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、甘油和生物乙醇，优选葡萄糖。
L-同型丝氨酸衍生物也可以由L-同型丝氨酸的乙酰化产生，L-同型丝氨酸本身可能通过可再生起始材料的发酵获得。可再生起始材料可以选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、甘油和生物乙醇，优选葡萄糖。
硫化氢解酶：
在选自硫化氢解酶、优选与所述式(II)的化合物相关联的硫化氢解酶的至少一种酶存在下进行所述至少一种式(II)的化合物和H2S之间的反应。与式(II)的化合物相关的硫化氢解酶是容易识别的，因为它共享相同的名称，例如O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶(OAHS硫化氢解酶)与O-乙酰基-L-同型丝氨酸相关。
硫化氢解酶特别地能够催化所述式(II)的化合物和H2S之间的反应(酶促反应)。“催化剂”通常被理解为一种加速反应并在反应结束时保持不变的物质。硫化氢解酶和任选的其辅因子可以以催化量使用。“催化量”特别地被理解为足以催化反应的量。更具体地，相对于以化学计量比例使用的试剂的重量量，以催化量使用的试剂以较小的量使用，例如在约0.01％至20％重量之间的量。
所述硫化氢解酶优选属于转移酶类，尤其是由EC 2.X.X.XX(或记为EC 2)分类指定的转移酶类。《酶委员会编号(Enzyme Commission numbers)》的EC分类被广泛使用，并且可以在网站https://enzyme.expasy.org/上找到。特别地，所述酶选自EC 2.5.X.XX类的硫化氢解酶(或记为EC 2.5.)，这意味着转移甲基之外的烷基或芳基的转移酶。
硫化氢解酶特别地属于EC 2.5.1.XX类(其中XX根据酶的底物而变化)。
例如：
-O-乙酰基同型丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.49型。
-O-磷酸基丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.65型。
-O-琥珀酰基同型丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.49型。
例如：
-O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.49型。
-O-磷酸基-L-丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.65型。
-O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶属于EC 2.5.1.49型。
因此，特别是当式(II)的化合物是L-同型丝氨酸或L-丝氨酸的衍生物时，所用的硫化氢解酶可以选自O-磷酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-丙酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-香豆酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-丙二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-羟甲基戊二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-庚二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-硫酸根合-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-磷酸基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-琥珀酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-丙酸基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-香豆酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-丙二酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-羟甲基戊二酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶、O-庚二酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶和O-硫酸根合-L-丝氨酸硫化氢解酶。
更特别地，所用的硫化氢解酶可以选自O-磷酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-丙酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-香豆酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-丙二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-羟甲基戊二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-庚二酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-硫酸根合-L-同型丝氨酸硫化氢解酶。
特别地，该硫化氢解酶可以选自O-磷酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-硫酸根合-L-同型丝氨酸硫化氢解酶和O-丙酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶。
该硫化氢解酶可以选自O-磷酸基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶。
非常特别优选地，所述酶是O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶(OAHS硫化氢解酶)。
所述硫化氢解酶，特别是O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶，可以来源于或衍生自以下菌株：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、色素杆菌(Chromobacterium sp.)、钩端螺旋体(Leptospira sp.)或生丝单胞菌(Hyphomonas sp.)。
正如本领域技术人员完全已知的那样，在辅因子诸如5’-磷酸吡哆醛(也称为PLP)或其类似物之一，优选5’-磷酸吡哆醛的存在下，硫化氢解酶可以发挥作用。
在辅因子磷酸吡哆醛的类似物中，可以提及α5-甲基磷酸吡哆醛、5'-甲基吡哆醛-P、5'-硫酸吡哆醛、α5-吡哆醛乙酸或任何其他已知的衍生物(Groman et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USAVol.69,No.11,pp.3297-3300,November1972)。
根据一个实施方案，可以将硫化氢解酶的辅因子添加到反应介质中。因此，硫化氢解酶的辅因子，例如5’-磷酸吡哆醛，可以在阶段c)之前提供，或者可以在阶段c)期间添加。当阶段c)在水溶液中进行时，酶及其任选的辅因子可以在加入所述溶液之前预先溶解在水中。
根据另一个实施方案，细胞，例如细菌细胞或其他细胞，可以产生或甚至过度产生所述辅因子，同时表达或过度表达硫化氢解酶，以避免补充所述辅因子的步骤。
根据一个实施方案，硫化氢解酶及其任选的辅因子是：
-以分离和/或纯化的形式，例如在水溶液中；
所述产生的酶的分离和/或纯化可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行。例如，它可以涉及选自电泳、分子筛、超速离心、示差沉淀(例如利用硫酸铵)、超滤、膜过滤或凝胶过滤、离子交换、经由疏水相互作用的分离或亲和层析(例如IMAC型)的技术。
-或存在于粗提取物中，也就是说存在于磨碎细胞的提取物(裂解物)中；感兴趣的酶可以或不可以在所述细胞(下文中称为宿主细胞)中过表达。宿主细胞可以是适合于从相应编码基因的表达产生感兴趣的酶的任何宿主细胞。然后，该基因要么位于宿主的基因组中，要么由表达载体携带。
出于本发明的目的，“宿主细胞”特别地被理解为原核或真核细胞。通常用于表达重组或非重组蛋白的宿主细胞特别地包括细菌诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌(Bacillus sp.)或假单胞菌(Pseudomonas)的细胞，酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)的细胞，真菌诸如黑曲霉(Aspergillus niger)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)或里氏木霉(Trichodermareesei)的细胞，昆虫细胞诸如Sf9细胞，或哺乳动物(特别是人类)细胞诸如HEK 293、PER-C6或CHO细胞系。
优选地，感兴趣的酶和任选的辅因子在大肠杆菌中表达。优先地，感兴趣的酶在大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)的菌株中表达。
细胞裂解物可以根据各种已知的技术获得，诸如超声处理、压力(法压壶(Frenchpress))、经由化学试剂(例如二甲苯、特里顿(triton))等的使用。所获得的裂解物对应于磨碎细胞的粗提取物。
-或存在于整个细胞中。为此，可以使用与上述相同的技术，而不进行细胞裂解步骤。
根据一个实施方案，表达硫化氢解酶的生物质相对于式(II)的化合物的质量的量在0.1重量％至10重量％之间、优选在1重量％至5重量％之间，和/或辅因子相对于式(II)的化合物的量在0.1重量％至10重量％之间、优选在0.5重量％至5重量％之间。
反应介质还可以包含：
-任选地一种或多种溶剂，其选自水、缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂、Tris-HCl、Tris碱、碳酸氢铵、乙酸铵、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)或盐诸如氯化钠、氯化钾或其介质；
-任选的添加剂诸如表面活性剂，以特别地促进一种或多种试剂或底物的溶解(度)。
可用于上述阶段c)的反应的各种组分是容易商业获得的，或者可根据本领域技术人员熟知的技术制备。这些不同的元素可以是固体、液体或气态形式，并且可以非常有利地转化到溶液中或溶解在水或用于本发明的方法的任何其他溶剂中。所使用的酶也可以接枝到载体上(在负载的酶的情况下)。
根据一个优选的实施方案，所述式(II)的化合物是O-乙酰基-L-同型丝氨酸，所使用的酶是O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶，并且获得的式(I)的官能化硫醇是L-同型半胱氨酸。
本发明还涉及一种组合物，优选水溶液，其包含：
-如上所定义的式(II)的化合物；
-硫化氢解酶，优选与式(II)的化合物相关联的硫化氢解酶，所述硫化氢解酶如上所定义；和
-溶解的H2S，优选过量。
优选地，所述组合物包含：
-O-乙酰基-L-同型丝氨酸；
-O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶；和
-溶解的H2S，优选过量。
所述组合物特别对应于如上所定义的反应介质。
条件、特性和任选的额外组分与以上针对以上所定义的反应介质所定义的那些相同。
特别地，根据本发明的组合物不包含溶解氧。优选地，相对于式(II)的化合物，H2S过量，优选摩尔过量。因此，相对于式(II)的化合物的量，H2S可以是超化学计量的量。
特别地，H2S/式(II)的化合物的摩尔比在1.1至20之间，优选在1.1至10之间，优选地在2至8之间，例如在3.5至8之间，甚至更优选在3.5至5之间。
该组合物还可以包含如上所定义的硫化氢解酶的辅因子。
特别地，根据本发明的组合物使实施根据本发明的方法成为可能。
附图说明
图1：图1显示了反应1小时后作为H2S分压(巴)的函数的L-同型半胱氨酸的酶促合成反应的产率(％)。
下面的实施例可以说明本发明，但在任何情况下都不是限制性的。
实施例
转化率、选择性和产率的通常定义如下：
转化率＝(初始状态下的反应物的摩尔数–反应后剩余的反应物的摩尔数)/(初始状态下的反应物的摩尔数)
选择性＝转化为所需产物的反应物的摩尔数/(初始状态下的反应物的摩尔数–反应后剩余的反应物的摩尔数)
产率＝转化率X选择性
实施例1：在H2S分压下由O-乙酰基-L-同型丝氨酸酶促制备L-同型半胱氨酸
阶段1：O-乙酰基-L-同型丝氨酸(OAHS)的制备
根据Sadamu Nagai,"Synthesis of O-acetyl-L-homoserine",Academic Press(1971),vol.17,p.423-424的工作中描述的方案由L-同型丝氨酸和乙酸酐合成O-乙酰基-L-同型丝氨酸。
阶段2：反应介质的制备
将源自阶段1)的10g/l O-乙酰基-L-同型丝氨酸(该产物溶于250ml水中)引入恒温控制的500ml不锈钢反应器中。在机械搅拌下使溶液达到37℃。
将5g/l的OAHS硫化氢解酶和0.4g/l的磷酸吡哆醛辅因子加入到反应介质中，以达到300ml的总体积。使用氨水溶液(4M)将pH维持在6.5的设定点值。
然后通过氮气鼓泡将反应介质脱气约10分钟。
阶段3：在压力下加入H2S
将反应器置于真空下，以消除反应器的顶部空间中存在的所有气体，并且从而精细地控制添加的硫化氢的压力。
然后施加一定的H2S压力(PH2S＝P总)。反应的开始是通过反应介质的逐渐酸化(由于乙酸共同产物的逐渐释放)来确定的，并且经由逐渐加入氢氧化铵(4M)将溶液的pH保持在6.5左右。
分析.
反应1小时后，经由由银量电位滴定形成的硫醇的定量方法来测量反应的产率(结果也由NMR和HPLC分析证实)。
结果.
对于在所使用的反应器的气体顶部空间中具有不同H2S分压的若干试验，测定了在反应1小时后L-同型半胱氨酸的产率。
结果显示存在三个阶段(参见图1)：
-H2S分压在0至0.25巴之间的产率增加；
-H2S分压在0.25至2巴之间的平台阶段，产率在90％至100％之间；
-当H2S分压大于2巴至4巴时该产率的降低。
实施例2：在H2S分压下并且在未脱气的反应介质中由O-乙酰基-L-同型丝氨酸酶促制备L-同型半胱氨酸
阶段1：O-乙酰基-L-同型丝氨酸(OAHS)的制备
根据Sadamu Nagai,"Synthesis of O-acetyl-L-homoserine",Academic Press(1971),vol.17,p.423-424的工作中描述的方案由L-同型丝氨酸和乙酸酐合成O-乙酰基-L-同型丝氨酸。
阶段2：反应介质的制备
将源自阶段1)的10g/l O-乙酰基-L-同型丝氨酸(该产物溶于250ml水中)引入恒温控制的500ml不锈钢反应器中。在机械搅拌下使溶液达到37℃。
将5g/l的OAHS硫化氢解酶和0.4g/l的磷酸吡哆醛辅因子加入到反应介质中，以达到300ml的总体积。使用氨水溶液(4M)将pH维持在6.5的设定点值。
阶段3：在压力下加入H2S
将反应器置于真空下，以消除反应器的顶部空间中存在的所有气体，并且从而精细地控制添加的硫化氢的压力。
然后施加0.25巴的H2S压力。反应的开始是通过反应介质的逐渐酸化(由于乙酸共同产物的逐渐释放)来确定的，并且经由逐渐加入氢氧化铵(4M)将溶液的pH保持在6.5左右。
分析.
反应1小时后，经由由银量电位滴定形成的硫醇的定量方法来测量反应的产率(结果也由NMR和HPLC分析证实)。
结果.
在Tfinal下L-同型半胱氨酸的产率：88.4％。
Claims (12)
1.一种合成至少一种以下通式(I)的官能化硫醇的方法：R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-SH(I)
其中，
-R1和R7相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，所述烃链可以包含一个或多个杂原子；
-X选自–C(＝O)-、–CH2-或–CN；
-R2：
(i)当X表示-CN时不存在，
(ii)或是氢原子，
(iii)或是-OR3，R3是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，所述烃链可以包含一个或多个杂原子，(iv)或是–NR4R5、R4和R5，它们相同或不同，是氢原子或1至20个碳原子的芳族或非芳族、直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，所述烃链可以包含一个或多个杂原子；
n等于1或2；并且*表示不对称碳；
所述方法包括以下阶段：
a)提供至少一种以下通式(II)的化合物：
R2-X-C*H(NR1R7)-(CH2)n-G(II)
其中*、R1、R2、R7、X和n如针对式(I)所定义的，并且
G表示(i)R6-C(O)-O-、或(ii)(R7O)(R8O)-P(O)-O-、或(iii)R9O-SO2-O-；其中
R6是氢原子或1至20个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链，所述烃链可包含一个或多个芳族基团，并可被选自–OR10、(＝O)、-C(O)OR11、-NR12R13的一个或多个基团取代；
R10、R11、R12和R13独立地选自：
H，或1至20个碳原子的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烃链；
R7和R8相同或不同，是质子、碱金属、碱土金属或铵；
R9选自质子、碱金属、碱土金属或铵；
b)提供H2S；
c)在选自硫化氢解酶、优选与所述式(II)的化合物相关联的硫化氢解酶的至少一种酶存在下的所述至少一种式(II)的化合物和H2S之间的反应；
所述反应在反应温度下在具有0.01至4巴之间，例如在0.01至3巴之间，优选在0.1至3巴之间，例如在0.1至2.5巴之间的所述反应器的气体顶部空间中的H2S的分压的反应器中进行；
d)获得至少一种式(I)的官能化硫醇；
e)任选分离在阶段d)中获得的所述至少一种式(I)的官能化硫醇；和
e)在阶段d)或e)中获得的式(I)的官能化硫醇的任选的额外官能化和/或任选的脱保护；并且
其中阶段a)和阶段b)任选地同时进行。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其中所述反应器的气体顶部空间中H2S的分压在0.25至2巴之间。
3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其中相对于所述式(II)的化合物，H2S是过量的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中阶段c)在水溶液中进行。
5.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中所述H2S的分压对应于所述气体顶部空间中的总压力。
6.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中所述H2S的分压在阶段c)的整个持续时间内保持恒定。
7.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中所述式(II)的化合物选自：
O-磷酸基-L-同型丝氨酸、O-琥珀酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰基-L-同型丝氨酸、O-乙酰乙酰基-L-同型丝氨酸、O-丙酸基-L-同型丝氨酸、O-香豆酰基-L-同型丝氨酸、O-丙二酰基-L-同型丝氨酸、O-羟甲基戊二酰基-L-同型丝氨酸、O-庚二酰基-L-同型丝氨酸和O-硫酸根合-L-同型丝氨酸，优选O-乙酰基-L-同型丝氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中所述式(I)的官能化硫醇是L-同型半胱氨酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中所述式(II)的化合物是O-乙酰基-L-同型丝氨酸，所使用的酶是O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶，并且式(I)的官能化硫醇是L-同型半胱氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中阶段c)在基本上不存在氧气的情况下，优选在不存在氧气的情况下进行。
11.根据前述权利要求中任一项所述的合成方法，其中阶段c)期间的温度在10℃至60℃之间、优选在20℃至40℃之间、更优选在25℃至40℃之间。
12.一种组合物，其包含：
-如权利要求1所定义的式(II)的化合物；
-硫化氢解酶；和
-溶解的H2S。
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