KR20220020059A - 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트 - Google Patents

신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20220020059A
KR20220020059A KR1020200100523A KR20200100523A KR20220020059A KR 20220020059 A KR20220020059 A KR 20220020059A KR 1020200100523 A KR1020200100523 A KR 1020200100523A KR 20200100523 A KR20200100523 A KR 20200100523A KR 20220020059 A KR20220020059 A KR 20220020059A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
kit
porcine
nos
detection
Prior art date
Application number
KR1020200100523A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102382967B1 (ko
Inventor
왕혜영
신성호
김현일
Original Assignee
주식회사 옵티팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 옵티팜 filed Critical 주식회사 옵티팜
Priority to KR1020200100523A priority Critical patent/KR102382967B1/ko
Publication of KR20220020059A publication Critical patent/KR20220020059A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102382967B1 publication Critical patent/KR102382967B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 7 프라이머로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 서열번호 8로 구성된 프로브를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트 및 샘플로부터 DNA를 얻고, 그 DNA를 주형으로 하여서 실시간(real-time) PCR을 수행할 때, 프라이머로 서열번호 1 내지 4의 프라이머와 서열번호 6 내지 7의 프라이머를 그 DNA와 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 단계를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트{Novel diagnosing method for Porcine cytomegalovirus and a Kit therefor}
본 발명은 신규한 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트에 관한 것으로 더욱 상세하게는 One-tube nested real-time PCR assay 기반 Porcine cytomegalovirus의 검출진단법 및 그 키트에 관한 것이다.
돼지 거대세포바이러스 (porcine cytomegalovirus; 이하 'PCMV'라 함)는 Herpersviridae, Betaherpesvirinae에 속하는 바이러스로 돼지에서 임신돈의 번식장애와 자돈의 위축, 호흡기질병 등 다양한 병증을 유발할 뿐 아니라 돼지 장기의 이종동물 간 조직이식 이후 질병발생 가능성 때문에 중요시되고 있다.
특히, 돼지는 사람 장기의 형태와 기능적 유사성이 높아 이종장기이식 연구에서 가장 활발히 연구되고 있는 동물종이어서 인수공통전염병 관련 병원체와 더불어 공여 동물의 병원체 중에서 사람이 감염될 수 있고 감염을 통해 건강에 직접 혹은 간접적인 영향을 미칠 수 있는 잠재성 이종전염(potentially xenozoonosis)의 관심이 증대되고 있는 실정이다. PCMV는 최근 비인간영장류 실험에서 이종장기이식을 실시한 영장류의 생존시간을 단축시키는데 영향을 미친 것으로 보고되어 그 중요성이 증가되고 있음과 동시에 감염에 대한 모니터링 검사가 필수적인 실정이다.
돼지에 PCMV가 감염될 경우, 일반적으로 성돈이나 3주령 이상의 자돈에서는 특별한 임상증상을 유발하지 않지만, 임신돈에서는 유·사산 등 번식장애를 유발하며, 분만 직후에 감염된 어린 자돈에서는 전신병변을 유발하여 폐사하거나 다양한 호흡기증상을 나타낸다. 이로 인해 감염된 양돈장에서는 포유자돈의 폐사율이 증가하며 25%이상의 손실을 보이기도 하고 있다.
국내에서도 PCMV이 감염되어 평균 항체 양성률이 76.3%에 달하고 있어서 국내 양돈장에 상재화되었음이 확인되었다.
PCMV는 양돈장에 상재화되어 번식장애와 호흡기증상 등 다양한 병증을 유발한다는 점에서 양돈산업에서 가장 중요한 질병으로 다루고 있는 돼지 생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)이나 돼지 써코바이러스 감염증(porcine circovirus disease PCVD)과 유사한 점이 많아 감별진단해야 할 질병으로 지목되고 있다.
현재 돼지질병 진단기법 상 PCMV에 대한 항체를 이용하는 ELISA 제품이 상용화되어 있긴 하나, PCR, real-time PCR 등의 방식을 이용한 PCMV 검출방법에 대한 논문은 있으나 고감도 분자생물학적 진단기술은 확보되어 있지 않으며, PCMV는 사람의 CMV나 영장류의 CMV와 염기서열 비교 시 72.7%나 68.9% 차이를 보이고 있어서 CMV에 감염된 돼지를 이용한 장기이식이 이루어질 경우 사람이나 영장류의 거대세포바이러스과는 감별이 필요한 진단검사키트는 전무한 실정이다.
따라서, 특이도와 민감도가 높으면서 임상진단실에서도 신속, 간편하게 진단할 수 있는 진단법의 개발이 요구되고 있다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 공개특허 10-2015-0111849
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 특이도와 민감도가 높으면서 임상진단실에서도 신속, 간편하게 진단할 수 있는 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특이도와 민감도가 높으면서 임상진단실에서도 신속, 간편하게 진단할 수 있는 진단법에 사용되는 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 7 프라이머로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 서열번호 8로 구성된 프로브를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 상기 프라이머 세트들을 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 원-튜브 네스티드 PCR용인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브의 5'말단 또는 3'말단은 형광물질로 표지된 것이 바람직하고,
상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하며,
상기 3' 말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 블랙 홀 켄처(black hole quencher)-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 샘플로부터 DNA를 얻고, 그 DNA를 주형으로 하여서 실시간(real-time) PCR을 수행할 때, 프라이머로 서열번호 1 내지 4의 프라이머와 서열번호 6 내지 7의 프라이머를 그 DNA와 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 단계를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 튜브는 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하고,
상기 프로브는 서열번호 5 및 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 프로브인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것이 바람직하고, 상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3' 말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 블랙 홀 켄처(black hole quencher)-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 one-tube nested real-time PCR 방식을 이용한 돼지 거대세포바이러스진단법을 개발하여 그 유용성을 확인해 보았다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 one-tube nested real-time PCR 방법이 conventional PCR과 nested PCR 검사방식보다 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 PCMV 제작을 위해 사용된 DNA polymerase 유전자의 위치
도 2는 One-tube nested real-time PCR방법에 의한 분석적 민감도
도 2A는 one-tube nested real-time PCR을 위한 특이프라이머 및 프로브에 대한 민감도 결과이며, 2B는 검출한계를 확인하는 standard 곡선결과이다 (R2 =0.999).
도 3은 임상검체를 이용하여 conventional PCR, nested PCR, one-tube nested real-time PCR 방법에 의한 PCMV 검출결과 그림 A는 conventional PCR 결과이며 413bp에서 양성밴드가 확인되며, 그림 B는 nested PCR결과로 160bp에서 양성밴드가 확인된다. 그림 C와 D는 one-tube nested real-time PCR에 의하여 PCMV 양성 검출결과(C), internal control (D) 검출결과가 확인된다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 재료
본 발명에서 개발된 프라이머와 프로브의 검증을 위해 ㈜옵티팜 병성감정평가센터에 의뢰되어 검증이 완료된 127검체를 제공받아 사용하였고, 특이도를 검증 하기 위해 19개의 세균과 21개의 바이러스 등을 이용하여 테스트하였다.
실시예 2. DNA 추출
180 검체의 DNA는 인트론바이오사의 DNA/RNA 추출 자동화장비((Miracle-AutoXT Automated Nucleic Acid Extraction System, intronbio, Seongnam, Republic of Korea)를 이용하여 핵산을 분리하였으며, 분리된 핵산은 one-tube nested real-time PCR법을 수행하기 위한 PCR의 주형으로 사용되었다.
실시예 3. Conventional PCR과 nested PCR
제작된 프라이머와 프로브의 유용성을 평가하기 위하여 Conventional PCR과 nested PCR 방식을 이용한 결과와 비교테스트를 진행하고자 하였다. 사용된 프라이머는 발표된 논문상의 정보(Hamel et al., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Nov. 1999, p. 3767-3768; Fryer et al, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 1155-1156.2001)를 이용하였고 사용된 온도조건 역시 논문상의 내용대로 수행하였다. Conventional PCR과 nested PCR 진행 후 증폭된 PCR 사이즈는 각각 413bp와 160bp로 확인된 경우 양성으로 판정하였다.
실시예 4. One-tube nested real-time PCR
PCMV 검출을 위한 프라이머와 프로브 제작을 위해 DNA polymerase 유전자를 NCBI에 등록되어 있는 표준 염기서열을 기초로 확보하였고, 이러한 염기서열들을 multi-align system을 통해 적절한 프라이머와 TaqMan 프로브 위치를 선정하고 이를 디자인하였다(그림 1).
추출한 각 균주의 genomic DNA를 주형으로 상용화된 Prime Taq Premix (2X) (Genet Bio, 논산, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 각 조성은 2 × Thunderbird probe qPCR mix (Toyobo, Osaka, Japan), 5 μL 및 primer 및 TaqMan probe mixture, 각 균주의 genomic DNA 5㎕로 총량을 20㎕로 하였다.
PCR 반응은 CFX 96(BioRad-USA)를 이용하여 변성 온도 95℃에서 3분 동안 1회 수행하고, 먼저 변성 온도 95℃에서 3초, 어닐링 온도 55℃에서 30초에 10회반복하고, 두번째 95℃에서 3초, 어닐링 온도 55℃에서 30초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였으며, 두번째 어닐링 과정에서 형광을 측정하는 과정을 추가 하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
실시예 5. 시퀀싱 분석
PCMV 양성여부를 확인하기 위하여 conventional PCR, nested PCR, one-tube nested real-time PCR방식을 통해 양성으로 검출된 검체들을 모두 시퀀싱을 진행하여 (코스모진텍, 대전) 결과를 검증하였다.
상기 실시예의 결과를 하기에서 기재한다
One-tube nested real-time PCR방법에 의한 분석적 민감도와 특이도
본 발명에서 제작된 프라이머와 프로브의 분석적 민감도를 확인하기 위하여 PCMV 양성표준물질 DNA를 이용하여 10배씩 희석하여(106 copy 에서 1 copy 사이) 측정하였다. 분석적 민감도는 각 농도별 20회 반복측정하여 평균값을 확인하였으며, 검출한계는 1copy/reaction로 확인되었고, Ct 측정값의 범위는 1.2에서 28.5로, 평균 2.1 ± 2.2 (95% CI, 1.2-3) 에서 27.1 ± 1.7 (95% CI, 26.4-27.8)로 검출되었다 (그림 2).
PCMV 을 검출하기 위한 one-tube nested real-time PCR 분자진단방법의 특이도를 측정하기 위하여, 세균 및 바이러스를 포함한 40균주에서 분리한 DNA를 이용하였으며, 그 결과 PCMV 양성균주를 제외한 모든 검체에서 교차반응이 없는 것으로 확인되었다 (표 1).
No. Species Isolate Sample type One-tube nested real-time PCR
PCMV (Ct) IC (Ct)
1 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Field isolate Tissue N/A 20.58
2 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Field isolate Tissue N/A 21.46
3 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Field isolate Tissue N/A 20.38
4 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Field isolate Tissue N/A 20.54
5 Swine Influenza virus Field isolate Tissue N/A 19.72
6 Hemophilus parasuis Field isolate Tissue N/A 18.94
7 Hemophilus parasuis Field isolate Tissue N/A 20.7
8 Mycoplasma hyopneumoniae Field isolate Tissue N/A 22.2
9 Mycoplasma hyopneumoniae Field isolate Tissue N/A 20
10 Mycoplasma hyopneumoniae Field isolate Tissue N/A 22.28
11 Porcine rotavirus Field isolate Tissue N/A 20.66
12 Porcine rotavirus Field isolate Stool N/A 20.23
13 Actinobacillus pleuropneumoniae Field isolate Tissue N/A 20.31
14 Porcine epidemic diarrhea virus Field isolate Stool N/A 21.56
15 Porcine epidemic diarrhea virus Field isolate Sludge N/A 20.46
16 Porcine Parvovirus Field isolate Collagen N/A 22.21
17 Porcine Parvovirus Field isolate Collagen N/A 21.13
18 Porcine circovirus type 2 Field isolate Tissue N/A 21.07
19 Porcine circovirus type 2 Field isolate Tissue N/A 21.1
20 Porcine circovirus type 2 Field isolate Tissue N/A 22.78
21 Porcine circovirus type 2 Field isolate Tissue N/A 21.19
22 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 22.32
23 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 21.41
24 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 20.11
25 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 20.84
26 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 19.28
27 Porcine circovirus type 3 Field isolate Tissue N/A 22.45
28 Escherichia coli ATCC 25922 Culture N/A 21.33
29 Escherichia coli ATCC 35150 Culture N/A 21.1
30 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Culture N/A 19.36
31 Salmonella typhi ATCC 19430 Culture N/A 21.13
32 Salmonella paratyphi ATCC BAA-1250 Culture N/A 20.66
33 Salmonella newport ATCC 6962 Culture N/A 20.08
34 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Culture N/A 18.58
35 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Culture N/A 21.18
36 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Culture N/A 21.55
37 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Culture N/A 21.49
38 Clostridium perfringens ATCC 13124 Culture 5.13 21.66
39 Toxoplasma gondii ATCC 50853 Culture 10.74 21.9
40 Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 Culture N/A 20.61
41 Pocine cytomegalovirus PC Culture 10.38 20.24
42 Pocine cytomegalovirus PC Culture 10.74 20.61
43 NC - - N/A 19.8
표 1은 세균 및 바이러스를 포함한 40균주에서 PCMV 검출을 위한 one-tube nested real-time PCR방법의 분석적 특이도를 나타낸 표.
임상검체에서 conventional PCR, nested PCR, one-tube nested real-time PCR 방법에 의한 PCMV의 검출결과 비교
One-tube nested real-time PCR법의 성능을 평가하기 위해, 조직 (37개, 29.1%), 혈액 (30개, 23.6%)를 포함한 총 127개의 임상검체를 이용하여 conventional PCR (그림 3A), nested PCR (그림 3B), one-tube nested real-time PCR (그림 3C와 3D)의 3가지 방법을 이용하여 그 결과를 분석하였다.
그 결과 conventional PCR에서는 양성 16 (12.6%), 음성 111 (87.4)로, nested PCR에서는 양성 30 (23.6%), 음성 97 (76.4)으로 확인되었으며, 반면에 one-tube nested real-time PCR 방법에 의한 테스트 결과는 양성 (n=49, 38.6%), 음성 (n=78, 61.4%)로 확인되었다 (표 2).
Sample Total no. (%) of
samples		 Detection of PCMV, no. (%) of isolates
Conventional PCR Nested PCR One-tube nested real-time PCR
Positive (%) Negative (%) Positive (%) Negative (%) Positive (%) Negative (%) IC ranged
CT value (mean ± SD)		 PCMV ranged
CT value (mean ± SD)
Tissue 37 (29.1) 16 (43.2) 21 (56.8) 25 (67.6) 12 (32.4) 32 (86.5) 5 (13.5) 17.6-22.1 (20.5 ± 0.9) 14-27.3 (21.1 ± 3.9)
Blood 30 (23.6) 0 (0) 30 (100) 1 (3.3) 29 (96.7) 6 (20) 24 (80) 19.3-21.7 (21.1 ± 0.5) 23.1-28.1 (26.6 ± 1.8)
Serum 30 (23.6) 0 (0) 30 (100) 2 (6.7) 28 (93.3) 6 (20) 24 (80) 20.5-22.5 (21.6 ± 0.5) 20-28.5 (21.6 ± 0.5)
Feces 30 (23.6) 0 (0) 30 (100) 2 (6.7) 28 (93.3) 5 (16.7) 25 (83.3) 17.7-21.2 (20.1 ± 0.9) 25.4-28.8 (27.3 ± 1.4)
Total 127 (100) 16 (12.6) 111 (87.4) 30 (23.6) 97 (76.4) 49 (38.6) 78 (61.4) 17.6-22.5 (20.8 ± 0.9) 14-28.8 (22.8 ± 4.1)
표 2는 127검체에서 conventional PCR, nested PCR, one-tube nested real-time PCR 방법에 의한 PCMV의 검출결과 비교
One-tube nested real-time PCR 방법을 통해 분리된 PCMV 양성검체에 대한 시퀀싱 결과의 비교
one-tube nested real-time PCR 방법을 통해 분리된 PCMV 양성검체에 대한 결과를 확인하기 위하여 동일 검체를 이용하여 시퀀싱을 진행하였다. one-tube nested real-time PCR 방법을 통해 양성으로 분리된 49검체는 conventional PCR과 nested PCR 검사방식으로 양성으로 검출되었던 샘플이 모두 포함되어 있다.
시퀀싱 결과 49 검체 모두 PCMV 양성으로 확인되어 one-tube nested real-time PCR 방법에 의한 일치도는 100%로 확인되었다 (표 3). 이 결과로 one-tube nested real-time PCR 방법이 conventional PCR과 nested PCR 검사방식보다 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
Molecular assays One-tube nested
real-time PCR		 Sensitivity, % (n)
(95% CI)		 Specificity, % (n)
(95% CI)		 PPV, % (n)
(95% CI)		 NPV, % (n)
(95% CI)		 Agreement, % (n)
(95% CI)		 κcoefficient
(95% CI)
Positive Negative
Conventional PCR 　 　 　 　 　 　 　 　
Positive 16 0 32.7 (16/49)
(0.199-0.475)		 100 (78/78)
(0.959-1.000)		 100 (16/16)
(0.829-1.000)		 70.3 (78/111)
(0.608-0.785)		 74 (94/127)
(0.654-0.813)		 0.373
(0.1893-0.5573)
Negative 33 78
Nested PCR
Positive 30 0 61.2 (30/49)
(0.462-0.748)		 100 (78/78)
(0.959-1.000)		 100 (30/30)
(0.905-1.000)		 80.4 (78/97)
(0.711-0.877)		 85 (108/127)
(0.776-0.907)		 0.659
(0.518-0.800)
Negative 19 78
서열분석
Positive 49 0 100 (49/49)
(0.947-1.000)		 100 (78/78)
(0.959-1.000)		 100 (49/49)
(0.947-1.000)		 100 (78/78)
(0.959-1.000)		 100 (127/127)
(0.976-1.000)		 1
(0.963-1.000)
Negative 0 78
표 3은 임상검체에서 One-tube nested real-time PCR 과 conventional PCR, nested PCR, 시퀀싱분석결과간의 민감도와 특이도 분석결과
서열번호 Oligo Sequence (5'-3') 　Modification 비고
서열번호1 PCMV-1945F AGGACCCTATGTTGGCAYTGATAC 　 qPCR용
서열번호2 PCMV-1956F TTGGCAYTGATACTTGACAAGCAG qPCR용
서열번호3 PCMV-2106R TCGTCTGCCTRAGCATGTCC qPCR용
서열번호4 PCMV-2060R TAGAGGGAGACACGGCAGCA qPCR용
서열번호5 PCMV-1985P TGCCCTCAAGGTGACGTGCAATG FAM-BHQ1 qPCR용
서열번호6 ICGAP-544F GGGAAGCTTGTCATCAATGGAAA qPCR용
서열번호7 ICGAP-665R ATGGTCGTGAAGACACCAGTG qPCR용
서열번호8 ICGAP-641P TCCACGACATACTCAGCACCAGCA HEX-BHQ1 qPCR용
표 4는 본 발명에서 사용된 Primer와 Probe 서열
<110> OPTIPHARM CO.,LTD <120> Novel diagnosing method for Porcine cytomegalovirus and a Kit therefor <130> P20-0116HS <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aggaccctat gttggcaytg atac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ttggcaytga tacttgacaa gcag 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tcgtctgcct ragcatgtcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tagagggaga cacggcagca 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 5 tgccctcaag gtgacgtgca atg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gggaagcttg tcatcaatgg aaa 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atggtcgtga agacaccagt g 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 8 tccacgacat actcagcacc agca 24

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 7 프라이머로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 서열번호 8로 구성된 프로브를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키트는 상기 프라이머 세트들을 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 원-튜브 네스티드 PCR용인 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로브의 5'말단 또는 3'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 3' 말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 블랙 홀 켄처(black hole quencher)-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단용 키트.
  6. 샘플로부터 DNA를 얻고, 그 DNA를 주형으로 하여서 실시간(real-time) PCR을 수행할 때, 프라이머로 서열번호 1 내지 4의 프라이머와 서열번호 6 내지 7의 프라이머를 그 DNA와 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 단계를 포함하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 튜브는 프로브를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 5 및 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 프로브인 것을 특징으로 하는 돼지 거대세포바이러스 검출진단 방법.
KR1020200100523A 2020-08-11 2020-08-11 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트 KR102382967B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200100523A KR102382967B1 (ko) 2020-08-11 2020-08-11 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200100523A KR102382967B1 (ko) 2020-08-11 2020-08-11 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220020059A true KR20220020059A (ko) 2022-02-18
KR102382967B1 KR102382967B1 (ko) 2022-04-05

Family

ID=80495190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200100523A KR102382967B1 (ko) 2020-08-11 2020-08-11 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102382967B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160053214A (ko) * 2014-10-31 2016-05-13 경북대학교 산학협력단 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160053214A (ko) * 2014-10-31 2016-05-13 경북대학교 산학협력단 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102382967B1 (ko) 2022-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3194942B2 (ja) ライム病スピロヘータ検出のための核酸プローブ
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN113403424B (zh) 基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒
CN110106285B (zh) 一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法
CN110804669A (zh) 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途
CN113718045A (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
AU770994B2 (en) Diagnostic assays of secreted biological fluids for detection of infection and inflammatory conditions
KR101518872B1 (ko) 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트
CN112941211A (zh) 猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
KR102382967B1 (ko) 신규한 돼지 거대세포바이러스 검출진단법 및 그 키트
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
KR101498705B1 (ko) 결핵 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 결핵 진단 방법
EP2009118A2 (en) Method of the detection and the quantification of Mycobacterium avium subspeceis paratuberculosis on the base of the polymer chain reaction in the real time
CN114934043A (zh) 检测犬立克次氏体和犬埃立克体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法
JP4497846B2 (ja) ヒトアデノウイルスの検出法
CN108315480B (zh) 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒
CN108660229B (zh) 评价脓毒症的生物标志物
CN112899406A (zh) 一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法
CN113122660A (zh) 人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用
KR20210073220A (ko) 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트
KR102334994B1 (ko) 돼지 써코바이러스 2형의 검출과 유전형을 확인하는 방법 및 그 조성물
RU2731716C1 (ru) Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота
CN109234418B (zh) 一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法
KR102496413B1 (ko) 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 d68 동시 검출용 프라이머 세트
KR102675157B1 (ko) Pna 프로브를 이용한 소 결핵병 진단방법 및 키트

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant