KR20220015483A - 곰취와 아로니아 혼합물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곰취추출물과 아로니아 추출물을 고형분 함량기준 9 : 1(w/w)로 배합한 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 식품 조성물 및 그 제조방법을 개시하고 이는 (a)건조된 천연물 원료를 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 단계; (b)상기 단계 (a)의 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하여 교반하면서 열수추출방법으로 추출한 후 추출액을 여과하고 농축하는 단계; (c)상기 단계 (b)에서 얻은 천연물의 농축물을 동결건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 천연물의 건조분말을 배합하여 혼합물을 얻는 단계; (f) 상기 단계 (b)단계에서 얻은 농축 물을 일정비율 가장 바람직하게는 9 : 1(w/w)로 배합한 다음 동결건조한 후 분쇄하여 건조 분말을 제조하는 단계로 이루어지고 본 발명의 제조방법에 따라 알코올 대사과정에 관여하는 기작이 각각 다르고 항산화효과가 뛰어난 곰취추출물과 아로니아추출물을 혼합 사용함으로써 알코올과 그의 대사산물 및 대사과정에서 발생되는 산화적스트레스를 경감시킬 수 있으며, 이를 활용한 단독소재보다 알코올성 간질환에 대한 예방효과가 뛰어난 식품소재의 개발이 가능한 각별한 장점이 있는 유용한 발명이다.

Description

곰취와 아로니아 혼합물 및 그 제조방법{Ligul aria fischeri and Aronia extract mixture and method of producing the same}
본 발명은 알코올성 간질환 예방 또는 개선 기능성 식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알코올성 손상으로부터 간을 보호할 수 있는 곰취추출물과 아로니아추출물을 일정비 유효성분으로 함유하는 혼합물을 제조하여 알코올성 간질환을 예방 또는 개선 기능성 곰취추출물과 아로니아 추출물을 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방 기능성 식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
과량의 알코올 섭취는 급성적으로는 숙취작용 등으로 인한 일상생활에 불편감을 주거나 탈수증상을 유발하며, 만성적으로 알코올을 과하게 섭취하게 될 경우 알코올성 지방간을 시작으로 간섬유화와 간견병 등의 넓은 범위의 간질환을 유발하게 된다. 특히 대한민국은 음주에 대한 관대한 문화적 특성으로 인해 전세계적으로 알코올을 많이 섭취하는 나라에 속하며, 미래사회 구성원의 초고령화와 중첩되어 사회적으로 국민보건에 큰 영향을 미칠 것으로 내다보고 있다.
알코올은 다른 영양성분과는 다르게 섭취 즉시, 확산을 통해 체내로 흡수가 매우 빠르게 이루어지며, 흡수된 알코올은 우선 간에서 일차적으로 대사가 이루어지고, 알코올 가수분해효소(alcohol dehydrogenase;ADH)와 카탈라아제(catalase), 및 알데히드 산화효소(aldehyde oxidase) 등에 의하여 산화적인 반응의 대사작용이 이루어져 아세트알데히드(acetaldehyde)와 함께 활성산소(reactive oxygen species
;ROS)를 대사산물로써 생산하게 된다. 아세트알데히드는 다시 아세트알데히드 가수분해효소(Acetaldehyde dehydrogenase)의 작용으로 과산화수소(H2O2)와 물(H2O)로 분해되어 알코올에 의한 해독작용이 완료되게 된다. 알코올의 대사과정에서 발생되는 산화적 스트레스 요인 분자들은 체내의 항산화 작용 기작이 발동되어 이들을 제거하게 되는데, 너무 과량의 알코올을 섭취하게 될 경우 이들의 체내 잔류 시간이 길어져 각종 부작용 등을 유발하게 되는 것이다.
곰취(Ligularia fischeri)는 국화과(Asteraceae)의 식물로 우리나라를 포함하는 동아시아의 서늘한 고산지대에서 자생하는 산나물이다. 우리나라에서는 전국적으로 고르게 분포하여 자생하고 있으며, 한국본초도감에 의하면 성질이 따뜻하고 이기, 활혈, 지통, 진해, 거담의 효능이 있어 해수, 천식, 백일해, 폐결핵으로 인한 각혈에 진해, 거담작용을 보이며, 타박상 및 허리와 다리의 동통을 완화시킨다고 전해지고 있다. 민간에서는 곰취의 전초를 황달, 단독, 관절염, 고름집, 고혈압, 치질, 간장병 등에 사용한다.
곰취를 활용한 전통적인 요리로는 곰취쌈, 곰취나물, 곰취차, 장아찌 등이 있으며, 최근에는 다양한 형태의 요리가 개발되어 쌈밥, 주먹밥, 머핀, 샐러드 등의 소재로도 활용되고 있다.
현대에 이르러 보고된 곰취의 효능으로는 항산화, 항염증, 항암 등이 있으며, 최근에는 알코올 대사에 관여하여 숙취증상 및 알코올에 의한 간수치 증가현상을 완화시켜주는 것으로 보고된 바가 있다(비특허문헌 1 참조).
한편 아로니아(Aronia melanocarpa)는 장미과의 다년생 식물로 북아메리카가 원산지이며, 자생하는 식물은 주로 습한 숲과 늪지 등에서 발견된다. 현재는 동아시아지역에 널리 보급되어 전 세계적으로 재배가 왕성하게 이루어지고 있다. 아로니아는 안토시아닌이 다량 함유되어 있어 건강 증진 효과에 대해서 수년간 많은 주목을 받고 있었으나 함유되어 있는 탄닌으로 인한 특유의 떫은맛으로 인해 소비자들이 기피하는 경향이 있다. 아로니아는 특히 다른 베리류의 열매에서는 검출이 잘 되지 않는 cyanidin-3-O-galactoside(C3G)가 다량함유되어 있어 여러 가지 생리활성에 대한 연구가 많이 이루어졌으며, 현재까지 항암효과, 당뇨병예방, 간손상예방, 시력개선, 심혈관계질환 예방, 항염작용, 체지방감소 효과 등에 대하여 보고된 바가 있다.
대한민국 특허공개 제10-2014-0090453호(특허문헌 1 참조)에는 아로니아 추출물을 함유하는 숙취예방, 숙취해소 또는 간 보호용 조성물이 기재되어 있으나 그 효과가 미비하고 이미 알코올로부터 간을 보호하는 효과가 입증되어 있는 성분인 루틴이 함유되어 있는 아로니아를 단독으로 사용함으로써 진보성이 인정되지 않은 사례이다.
특허공개 제10-2014-0090453호 공개특허공보, 특허 제1827326호 등록특허공보, 특허 제1464716호 등록특허공보, 특허 제0552398호 등록특허공보, 특허 제0372561호 등록특허공보, 특허 제0126421호 등록특허공보, 특허 제0608456호 등록특허공보, 특허 제1482719호 등록특허공보,
Yoo 등(2011)"effect of Handaeri-gomchi (Ligularia fischeri var. spiciformis Nakai) extract against chronic alcohol-induced liver damage in rats"Food Science and Biotechnology. 20(6). 1655-1661. Park 등(2014)"effect of Ligularia fischeri on inhibition of nitric oxide in lipopolysaccharide - stimulated RAW 264.7 macrophages depending on cooking method"Biological Research. 47(1): 69. Chen 등(2014)"effects from Houttuynia cordata aqueous extract against acetamiinophen-induced liver injury"Biomedicine (Taipei). 4(1), 5. McGregor(2007)"lobata(Kudzu root) hangover remedies and acetaldehyde-associated neoplasm risk"Alcohol. 31(7), 469-478. Lin et al.,(1996)"compounds extracted from Pueraria lobata suppress alcohol preference in a pharmacogenetic rat model of alcoholism"Alcoholism. 20(4), 659-663. Lee(2004)"of Pueraria radix water extract on changes of antioxidant enzymes and lipid profile in ethanol-treated rats"Clinica Chimica Acta. 347(1-2). 121-128.
본 발명의 발명자들은 상기 언급한 천연물인 곰취(LF)와 아로니아(AM)로부터 추출된 각 추출물의 알코올 분해능을 조사하고 알코올성 간손상으로부터 간보호작용이 상이한, 즉 ADH 및 ALDH활성을 상승시키는 소재를 각각 선별하고 선별된 추출물을 활용한 다양한 비율의 혼합물을 조제하여 단독소재 추출물 각각 보다 알코올성 간손상으로부터 보호작용이 개선 여부를 확인 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 알코올로부터 간을 보호하는 작용이 증진된 곰취추출물(LF)과 아로니아 추출물(AM)의 혼합물을 함유하는 다양한 혼합물을 제조하여 이를 함유하는 알코올성 간질환을 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 아로니아 추출물과 곰취 추출물을 일정비로 배합한 혼합물을 유효성분으로 함유하는 신규한 소재를 제조하여 알코올성 손상으로부터 예방하고 간손상 기능개선을 증진하는 곰취추출물과 아로니아 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 또는 예방 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 곰취추출물과 아로니아 추출물을 일정비율 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물의 제조방법은 (a)건조된 곰취와 아로니아를 각각 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 단계; (b)상기 단계 (a)에서 얻은 각 건조원료분말에 친수성 용매를 가하여 교반하면서 추출한 추출액을 여과하고 농축하는 단계; (c)상기 단계 (b)에서 얻은 각 건조분말 추출액의 농축물을 동결건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 각 건조분말을 일정비율(w/w)로 배합하여 혼합물을 얻는 단계로 이루어진 곰취와 아로니아 혼합물의 제조방법에 있어서;
상기 건조된 천연물 원료는 곰취 및 아로니아를 건조시킨 것으로, 본 발명에 사용되는 건조곰취에는 플라보노이드 및 이의 배당체, 페놀류, 환원당, 다당, 유기산, 엽록소가 함유되어 있고, 곰취추출물에 함유되어 있는 플라보노이드에는 카페오일퀴닉산(caffeoylquinic acid)이 다량 함유되어 있으며, 주로 4-caffeoylquinic acid (4-CQA), 3, 4-dicaffeoylquinic acid (3,4-dCQA), 3, 4-dicaffeoylquinic acid (3,5-dCQA), 3, 4-dicaffeoylquinic acid (4,5-dCQA)로 구성이 되어 있다.
본 발명에 사용된 아로니아에는 베리류의 열매 중에서 안토시아닌이 가장 많이 함유되어 있으며, 특히 안토시아닌이 유효성분인 다른 종류의 천연물에서는 잘 발견이 되지 않는 cyanidin-3-O-galactoside의 함량이 월등히 높은 것이이고, 탄닌이 다량 함유되어 있어 이로 인한 쓴맛, 떫은 맛이 특징이다.
상기 단계 (b)에서 원료가 곰취 건조분말인 경우의 친수성 용매는 물 또는 알코올이거나 그 혼합물이고, 물의 경우 열수추출방법은 온도 40 ∼ 60℃에서 30분 ∼ 180분 동안 1 ∼ 3회 추출하되, 1회 추출시 사용되는 정제수의 양은 원료 중량대비(w/w) 5 ∼ 20배로 하는 것이 추출수율 등 공정의 안전성 및 곰취에 함유되어 있는 유효성분인 카페오일퀴닉산의 안정성 등을 고려할 때 가장 경제적이고 추출공정이 비교적 단순하여 가장 바람직하다.
상기 단계 (b)에서 원료가 아로니아 건조분말인 경우 아로니아 건조분말에 유기용매 중에서 가장 바람직하게는 30%의 에탄올(v/v)을 원료 중량대비(w/w) 10 ∼ 15배 가하고, 교반하면서 온도 15 ∼ 25℃에서 30분 ∼ 100분 동안 추출한다.
또한 상기 단계 (d)에서 곰취(LF)와 아로니아(AM)의 추출농축물의 배합 비율은 상기 (c)단계에서 얻은 각 분말을 고형분함량 기준으로 1 ∼ 9 : 9 ∼ 1(w/w) 비율로 혼합하며 가장 바람직하게는 9 : 1(w/w)로 배합한 혼합물을 조성한다.
본 발명에 있어서 상기 단계 (b)의 추출액은 원료를 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하여 얻어진 추출물을 의미한다. 추출방법은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 추출 대상인 곰취 및 아로니아에 상기 추출 용매를 침지시키는 단계를 통하여 냉침, 환류, 가온, 초음파, 고압분산 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 추출물은 이후 감압여과, 감압농축, 건조 등을 수행하여 용매를 제거하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 단계 (d)의 복합조성물은 곰취 추출물과 아로니아 추출물을 임의의 양으로 배합한 조성물을 의미하는 것이다. 바람직하게는 1:9(w/w) 내지 9:1(w/w)의 범위에서 선정이 되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기한 본 발명의 복합조성물 제조방법은 각각의 원료 추출물을 농축한 후 고형분 함량을 기준으로 중량부로 계산하여 혼합한 후 동결건조하고 분쇄하는 방법, 각각의 추출물을 따로 동결건조하고 분쇄하여 분말화한 후 혼합하는 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 건조 분말화된 각각의 추출물을 혼합한 후 분쇄기(blender) 등을 활용하여 균질화하는 방법이 효율적이나, 특별한 제한이 없다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 손상으로부터 간을 보호할 수 있는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 알코올성 간손상 보호용 식품 조성물은 그 유효성분인 상기 혼합물을 숙취해소 활성이 나타날 수 있는 임의의 양으로 조절할 수 있다.
상기 식품이라 함은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 각종 식품류, 음료수, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 각종 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 및 비타민 복합제 등이 될 수 있으며, 그 외에도 통상적인 의미에서의 건강식품, 기능성식품 등을 포함한다.
상기 식품으로 제조시 본 발명의 숙취 해소용 복합조성물에 정제수, 감미료, 산미료, 증점제, 향료, 색소 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 예컨대 감미료는 설탕, 과당, 올리고당, 포도당, 아스파탐, 솔비톨, 자일리톨, 스테비오사이드 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 산미료는 구연산, 비타민C, 비타민B6, 사과산 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한 증점제는 펙틴, 덱스트린, 검류 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 향료는 딸기농축과즙, 사과농축과즙 등의 각종 과일농축 과즙을 하나 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 알코올 대사과정에 관여하는 기작이 각각 다르고 항산화효과가 뛰어난 곰취추출물과 아로니아추출물을 복합적으로 사용함으로써 알코올과 그의 대사산물 및 대사과정에서 발생되는 산화적스트레스를 경감시킬 수 있으며, 이를 활용한 단독소재보다 알코올성 간질환에 대한 예방효과가 뛰어난 식품소재의 개발이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 동물에게 투여하여 혈청 알코올 농도에 미치는 영향을 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 알코올성 간손상 동물모델에게 투여하고 혈청 간손상지표에 미치는 영향을 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 알코올성 간손상 동물모델에게 투여하고 간의 조직학적 영향을 조사하기위해 Accustain Hematoxylin and Eosin Stains (Sigma-Aldrich Co.)으로 조직을 염색 후, 광학현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 간조직의 조직학적 변화를 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 현미경사진,
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 알코올성 간손상 동물모델에게 투여하고 간 조직중에서 알코올대사에 관여하는 효소인 ADH 및 ALDH의 활성에 미치는 영향을 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 알코올성 간손상 동물모델에게 투여하고 간 조직중에서 지질과산화 지표인 TBARS와 항산화효소인 CAT, SOD, GPx 등의 활성에 미치는 영향을 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 및 예방용 신규한 혼합물을 알코올성 간손상 동물모델에게 투여하고 간 조직중에서 염증성지표인 COX-2, IL-6, iNOS, MCP-1, 및 TNF-α 등과 알코올대사에 관여하는 효소인 CYP2E1의 mRNA발현에 미치는 영향을 양성대조군인 헛개나무과병추출물과 비교하여 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.
실시예1. 천연물 추출물의 제조 및 이들의 복합조성물의 제조
1-1.곰취 추출물의 제조
상기 곰취는 온라인 판매상을 통하여 건조물을 구매하였다. 구매한 천연소재 곰취는 분쇄기(blender)를 이용하여 분쇄하여 분말형태의 곰취 원료로 제조한 후 추출기에 넣고 곰취원료 중량대비(w/w) 수율, 효능면에서 가장 바람직하게는 11배의 정제수를 가한 다음 60℃에서 60분간 추출하여 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 종이여과한 후 얻어진 여액을 동결건조하고 건조물을 분쇄하여 건조 곰취 추출물을 수득하였다.
1-2.아로니아 추출물의 제조
상기 아로니아는 온라인 판매상을 통하여 건조물을 구매하였다. 구매한 천연소재 아로니아는 분쇄기(blender)를 이용하여 분쇄하여 분말형태의 아로니아 원료로 제조한 후 추출기에 넣고 수율, 효능면에서 가장 바람직하게는 30%의 에탄올(v/v)을 아로니아 원료 중량대비(w/w) 13배 가하고, 상온인 25℃에서 66분간 추출하여 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 종이여과한 후 얻어진 여액을 동결건조하고 건조물을 분쇄하여 건조 아로니아 추출물을 수득하였다.
1-3. 복합조성물의 제조
상기 곰취 추출물의 제조와 아로니아 추출물의 제조에서 제조된 곰취(LF)와 아로니아(AM)의 추출농축물을 고형분함량 기준으로 1 : 9 ∼ 9 : 1(w/w)의 다양한 배합비율로 혼합하여 동결건조하였다(표 1).
곰취와 아로니아 추출물 배합특성
구분 Total phenolics
compounds(mg/g)
DPPH(%)
ADH(mg/mL)
ALDH(mg/mL)
아로니아 113.02±1.63 49.26±0.96 230.30±8.6 240.13±8.28
곰취 181.38±0.48 59.14±1.16 289.30±15.4 179.46±6.31
아로니아9:곰취1 177.87±17.40 50.44±1.66 162.59±4.07 226.93±2.78
아로니아8:곰취2 205.13±2.95 61.34±0.72 252.72±15.13 246.20±4.29
아로니아7:곰취3 201.54±10.21 63.46±1.66 261.77±9.31 247.42±3.43
아로니아6:곰취4 202.93±2.91 65.28±0.66 243.25±16.88 278.22±5.79
아로니아5:곰취5 201.60±2.09 66.56±0.39 240.37±2.33 257.43±1.71
아로니아4:곰취6 211.32±2.84 68.09±0.37 252.72±12.8 272.30±2.57
아로니아3:곰취7 203.12±14.30 67.45±1.53 245.31±8.15 252.42±1.07
아로니아2:곰취8 182.29±2.57 65.33±0.69 253.95±16.88 288.99±0.00
아로니아1:곰취9 212.39±9.40 65.58±0.37 311.98±2.33 297.19±3.00
실험결과, 곰취와 아로니아 추출물을 고형분 함량 기준 9 : 1(w/w) 배합비에서 단독 추출물 보다 ADH 및 ALDH 활성에서 각각 최대 35.6% 및 7.3% 그리고 최대 60.3% 및 1.1%의 상승적으로 각각 증가하는 예상치 못한 결과를 얻었다.실시예2. 알코올성 간질환 예방효과를 확인하기 위한 동물실험
특정병원체가 없는(specific pathogen free; SPF) 5주령의 수컷ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 입하된 동물을 새로운 환경에서 1주일간의 적응기간을 주고 체중감소 등의 증상이 없는 건강한 개체를 선별하여 실험에 사용하였다. 동물 사육실은 23 ±3℃, 상대습도 50 ±10%, 환기회수 10 ∼ 15회/시간, 조명시간 12시간(08:00 ∼ 20:00), 조도 150 ∼ 300 Lux로 설정하여 사육하였다. 시험 전 기간 동안 모든 동물은 일반 설치류용 고형사료 ((주)카길애그리퓨리나)와 음수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
1주일간의 적응기간 후 선별된 건강한 개채들을 난괴법에 의해 5개의 군으로 분류하였다. 즉 (G1) 정상대조군, (G2) 알코올대조군, (G3) 알코올 + 250mg/kg BW 시험물질(LF+AM)투여군, (G4) 알코올 + 500mg/kg BW 시험물질 투여군, (G5) 알코올 + 250mg/kg BW 양성대조물질(HDT) 투여군으로 분류하였다(표 2 참조). 각 시험군에는 총 10 마리의 동물을 사용하였으며, 각각의 시험물질은 음수에 녹여 4주 동안 매일 일정한 시간에 존데(sonde)를 이용하여 위내 투여를 하였다. 알코올의 투여량은 50% 에탄올을 10mg/kg BW용량으로 시험물질 투여 1시간 후 같은 방법으로 투여하였다.
G1 G2 G3 G4 G5
실험동물 ICR
알코올 - ＋ ＋ ＋ ＋
시험물질
(mg/kg BW)
-
-		 LF＋AM
250		 LF＋AM
500
-
양성대조군
(mg/kg BW)
-
-
-
-		 HDT
250
실험동물수 10 10 10 10 10
실시예3. 혈청 에탄올 농도 측정
트리브롬에타놀(Tribromoethanol)을 삼차 아밀알코올(tertiary amyl alcoho l)로 희석하여 만든 마취제로 동물을 마취하고 안와채혈을 하였다. 채취한 혈액샘플을 혈청분리용 튜브(serum separate tube; Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 5,000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 모든 혈액 샘플은 분석에 이용하기 전까지 -70℃의 디프 프리저(deep freezer)에 보존하였다. 혈청 내의 에탄올 농도는 에탄올 측정 키트(kit)를 이용하여 제조회사(Abcam)에서 제시하고 있는 방법에 따라 측정하였다. 즉, 혈청을 분석 버퍼(assay buffer)를 이용하여 적절하게 희석하고 50uL를 취한후 reaction mic preparation을 50uL를 가하여 1시간 동안 반응시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 에탄올 표준용액을 사용하여 작성한 표준곡선식에 흡광도 값을 대입하여 혈청 중의 에탄올 농도를 측정하였다.
혈중 에탄올 농도 측정 결과 알코올대조군인 G2에서 정상대조군에 비해 현저하게 높은 혈중 에탄올 농도가 나타났으며, LF+AM을 저용량과 고용량으로 투여하였을 때 양성대조물질인 헛개나무과병추출물을 투여한 군(G5)와 같이 G2군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 나타냈다(도 1).
도 1로부터 상기 곰취추출물과 아로니아추출물을 유효성분으로 함유하는 복합조성물이 알코올의 섭취로 인한 간의 손상을 보호할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예4. 간기능 지표 효소 활성 측정
혈청 내 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT), 아스파라긴산 아미노기전이효소(aspartate aminotransferase; AST), 알칼리 포스포타아제 (alkaline phosphatase; ALP), 감마-글루타밀 펩티드전이효소(gamma-glutamyl transpeptidase; γ-GTP) 활성을 혈액 생화학 분석기(KoneLab 20, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다.
혈청 중에 간기능 지표로써 ALP, AST, ALT 및 γ-GTP 등의 활성을 측정한 결과 알코올대조군에서 ALP와 AST의 활성이 유의적으로 증가하였는데, LE+AM 저용량 (G2) 및 고용량(G3) 투여군에서 알코올의 섭취로 인해 증가한 ALP 및 AST의 활성을 유의적으로 감소시켰으며, 이는 헛개나무과병추출물을 투여한 양성대조군(G5)보다 낮은 수치로 나타났다(도 2).
도 2로부터 본 발명 상기 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 신규한 혼합물이 알코올의 섭취로 인해 증가한 혈중 알코올 농도를 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예5. 간의 조직형태학적 관찰
4% PFA로 고정된 간조직을 파라핀에 포매하고 포매된 조직들로부터 5um의 조직절편을 제작하였다. 파라핀 제거 후, 100% 알코올에서 시작하여 0% 에탄올(H2O)까지 순차적으로 알코올의 %를 낮춤으로 조직을 수화하였다. 간조직의 조직형태학적 관찰을 위해 Accustain Hematoxylin and Eosin Stains(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 조직을 염색 후, 광학현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 간조직의 조직학적 변화를 관찰하였다.
정상대조군(G1)에 비해서 알코올 투여군(G2)에서 일부 부위에 섬유화 및 염증이 관찰되어 간 손상이 다소 관찰되었으며, 시험물질인 LE+AM과 양성대조물질을 투여한 군(G3, G4, G5)은 일부 간조직에서 림프구의 침투 및 염증이 관찰되었으나 알코올대조군(G2)과 비교하여 다소 약한 병변으로 관찰되었다(도 3).
도 3으로부터 이들 혼합물의 알코올기인성 산화적 스트레스로부터 간을 보호할 수 있는 사실을 확인하였다.
실시예 6. 간조직액 제조
본 발명에 따라 제조되고 배합된 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 하는 신규한 혼합물의 알코올 대사관련 효소의 활성, 항산화 관련 효소의 활성 및 지질과산화물양에 미치는 영향을 조사하기 위해 동물로부터 채취한 간조직액을 제조하였다. 약 100mg의 간 조직에 1,000uL의 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH7.4)을 가하고 균질기(homogenizer)로 균질화한 균질액을 5,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 위해 실험에 사용하였다. 간조직액의 단백질 함량은 BCA protein assay kit(Thermo scientific)을 사용하여 측정하였다.
실시예 7. 간조직 중 alcohol dehydrogenase(ADH), acetaldehyde dehydrogen ase(ALDH) 활성 측정
간조직 내 ADH와 ALDH활성은 각각의 측정 kit을 사용하여 제조회사(biovisi on)에서 제공하고 있는 방법에 따라 측정하였다.
체내로 들어온 알코올은 간에서 1차적으로 ADH에 의해 아세트알데히드로 분해가 되고 이는 다시 ALDH에 의해 아세트산을 생성하고 결과적으로 이산화탄소와 물로 분해가 되는 과정으로 대사가 이루어진다.
도 4에 나타낸 바와 같이 ADH활성은 알코올대조군 (G2)에서 정상대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 시험물질인 LF+AM의 혼합물과 양성 대조물질인 HDT의 투여가 G2군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으며, ALDH활성은 G2군에 비해 G3, G4, G5에서 모두 유의적으로 증가하였는데, 특히 LF+AM을 고용량으로 투여한 군에서 현저하게 많이 증가하였다. ADH와 ALDH의 결과를 종합하였을 때 LF+AM의 혼합물 섭취가 체내로 들어온 알코올의 대사작용을 촉진하여 LF 또는 AM 단독물질 보다 알코올 및 그의 대사산물로 인한 심각한 간 손상을 획기적으로 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
도 4로부터 본 발명의 상기 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 본 발명 신규한 혼합물은 ADH 및 ALDH의 활성을 촉진함과 동시에 항산화효과를 나타내어 알코올의 섭취로 인해 증가할 수 있는 염증 관련 유전자의 발현을 억제하는 것이 확인되어 알코올의 섭취로 인해 손상 입을 수 있는 동물의 조직을 획기적으로 LF 또는 AM 단독물질 보다 높은 수준으로 유효하게 보호할 수 있음이 확인되었다.
실시예 8. 간 조직의 항산화 효소 활성 측정
간조직 내의 슈퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase; SOD),카탈라아제(catalase; CAT) 및 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase; GPx) 활성을 측정하기 위해 상기 실시예 6에서 제조한 간조직액을 Cayman Chemical사에서 구입하여 제조사에서 제공하고 있는 방법에 따라 측정하였다.
알코올의 섭취시 이를 대사하는 과정에서 활성산소가 증가하며, 이들로부터 세포와 조직을 보호하기 위해 항산화체계가 작용을 하게 된다. 하지만 과다한 알코올의 섭취시 항산화체계의 한계 이상으로 활성산소가 발생하게 되면 이들 활성산소가 체내에 작용하여 세포나 조직의 손상을 주게 된다. 체내에서 항산화 체계에 관여하는 효소로는 SOD, CAT 및 GPx를 들 수 있는데, 본 발명에서 사용된 시험물질인 LF+AM의 9 : 1(w/w) 혼합물을 투여한 군(G3, G4)에서 알코올투여군(G2)에 비하여 SOD의 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 간조직 내 CAT와 GPx활성은 정상대조군(G1)과 알코올대조군(G2)에서 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 LF+AM 혼합물을 고용량으로 투여한 군(G4)에서 알코올대조군(G2)에 비해 유의적으로 활성이 증가하였다(도 5).
도 5로부터 본 발명의 상기 곰취추출물(LF)과 아로니아추출물(AM)을 유효성분으로 함유하는 신규한 혼합물이 알코올의 대사에 관여하는 효소인 CYP2E1의 활성을 유용하게 높여주는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 간 조직의 mRNA 발현 조사(real-time RT-PCR)
채취한 동물의 간조직으로부터 total RNA를 TRIzol Reagent(써모피셔사이언티픽;Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분리하였다. Total RNA(2ug)로부터 HyperScriptTM RT master mix kit(GeneAll biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 염증관련 유전자인 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6, MCP-1과 알코올의 대사에 크게 관여하는 효소인 CYP2E1 등의 활성을 확인하였다. 사용한 프라이머(primer)의 정보는 표 2에 정리하였다. 유전자의 정량분석은 Rotor gene 6000 series system software 1.7 protram(Corbett Research)을 이용하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6, MCP-1 등의 mRNA 발현은 정상대조군(G1)가 비교하여 알코올대조군(G2)에서 현저하게 증가하였다. COX-2와 IL-6의 경우 LE+AM 고용량 투여군(G4)와 양성대조군(G5)에서 알코올대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소하였으며, TNF-α와 MCP-1의 mRNA발현은 시험물질을 고용량으로 투여한 군(G4)에서만 유의적으로 감소하였다. iNOS의 mRNA발현은 시험물질 LE+AM을 투여한 모든 군(G3, G4)과 양성대조군(G5)에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
생체에 남은 잔여의 알코올은 마이크로좀 에탄올 산화계에 존재하는 CYP2E1이라는 효소에 의해서 알코올을 최종적으로 무독화 시키는데, 본 발명에서 알코올대조군(G2)에서 정상대조군(G1)에 비해 이 활성이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 시험물질인 본 발명 LF+AM의 신규한 혼합물을 고용량으로 투여한 군(G4) 및 양성대조물질을 투여한 군(G5)에서 유의적으로 활성이 증가하여 정상대조군 수준으로 회복되는 것을 확인하였다.

mRNA		 Primer sequences
Forward Reverse
COX-2 5'-AACCGCATTGCCTCTGAAT-3' 5'-CATGTTCCAGGAGGATGGAG-3'
iNOS 5'-CGAAACGCTTCACTTCCAA-3' 5'-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3'
TNF-a 5'-ATGAGCACAGAAAGCATGA-3' 5'-AGTAGACAGAAGAGCGTGGT-3'
IL-6 5'-CCTCTGGTCTTCTGGAGTACC-3' 5'-ACTCCTTCTGTGACTCCAGC-3'
MCP-1 5'-TCCCACTCACCTGCTGCTACTCA-3' 5'-GCTTCTTTGGGACACCTGCTG-3'
CYP2E1 5'-GTTGCCTTGCTTGTCTGGAT-3' 5'-AGGATTGGGAAAGGTCCTG-3'
GAPDH 5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3' 5'-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3'
실시예 10. 통계처리
모든 결과는 평균 ±평균의 표준오차(Standard Error of the mean; SEM)로 나타내었다. 시험물질 투여군과 대조군의 차이를 비교하기 위해서 Student’t-test 및 one-way analysis variance(ANOVA)를 이용하였다. 또한, 대조군과 시험물질 투여군 간의 차이를 비교하기 위해 ANOVA로 분석 후 Duncan’multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다. p<0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이상 실시예 1 내지 실시예 10으로 부터 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 LF + AM의 일정 비율의 신규한 혼합물에 대하여 항산화활성을 DPPH라디칼소거능 및 폴리페놀함량 측정을 통해 확인하고, HepG2 cell을 활용한 ADH, ALDH활성에 미치는 영향을 헛개나무과병추출분말과 비교하여 조사하였으며, 상기 결과를 통해 LF : AM = 9 : 1(w/w)의 신규한 혼합물로 제조한 시료물질에 대해서 동물실험을 통하여 알코올 투여후 혈중 알코올농도 및 아세트알데하이드 농도가 감소되는 경향을 조사함으로써 본 발명에서 제시한 상기 신규한 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물의 숙취해소 및 숙취예방 효능도 입증하였다.
지금까지 본 발명을 바람직한 실시 예로서 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 발명의 요지를 이탈하지 않는 범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있음은 물론이다.

Claims (2)

  1. (a)건조된 곰취와 아로니아를 각각 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 단계와;
    (b)상기 단계 (a)에서 얻은 각 건조원료분말에 친수성 용매를 가하여 교반하면서 추출한 추출액을 여과하고 농축하는 단계와;
    (c)상기 단계 (b)에서 얻은 각 건조분말 추출액의 농축물을 동결건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계와;
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 각 건조분말을 일정비율 배합한 혼합물을 얻는 단계를 포함하여 제조된 곰취와 아로니아 혼합물에 있어서;
    상기 단계(b)의 곰취 건조분말에는 정제수를 가하여 온도 40 ∼ 60℃에서 30분 ∼ 180분 동안 1 ∼ 3회 추출하되, 1회 추출시 사용되는 정제수의 양은 원료 중량대비(w/w) 5 ∼ 20배로 하고, 아로니아 건조분말에는 30%의 에탄올(v/v)을 원료 중량대비(w/w) 10 ∼ 15배 가하고, 교반하면서 온도 15 ∼ 25℃에서 30분 ∼ 100분 동안 추출하고,
    상기 단계 (d)에서 곰취와 아로니아의 각 동결건조분말의 배합비는 상기 (c)단계에서 얻은 각 분말을 고형분 함량 기준으로 9 : 1(w/w)의 비율로 배합된 것이 특징인 곰취와 아로니아의 혼합물.
  2. 제 1항의 곰취와 아로니아의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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