KR20220005556A - Masp 억제성 화합물 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 만노스-결합 렉틴 (MBL)-연관 세린 프로테아제 (MASP) 억제성 화합물, 뿐만 아니라 그의 유사체 및 유도체, 그의 제조 방법, 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 단독 또는 조합으로의 그의 용도 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 특히 신장 및 심혈관 장애 및 허혈 재관류 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 만노스-결합 렉틴 (MBL)-연관 세린 프로테아제 (MASP) 억제성 화합물, 뿐만 아니라 그의 유사체 및 유도체, 그의 제조 방법, 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 단독 또는 조합으로의 그의 용도, 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 특히 신장 및 심혈관 장애 및 허혈 재관류 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
보체계는 단백질, 수용체 및 효소의 복잡한 캐스케이딩 네트워크로 이루어지며, 이들 중 다수는 혈류에서 순환한다. 보체계는 선천성 면역의 중요한 구성성분이고, 침입 병원체에 대한 방어와 사멸 세포 및 바이러스 감염된 세포의 클리어런스에 필수적이다. 이는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응 사이의 가교를 형성한다. 보체계의 활성화는 또한, 예를 들어 심근경색, 허혈성 신장 손상 또는 기관 이식 후의, 패혈증 및 허혈 재관류 손상의 병리상태와 관련된다. 보체계의 3개의 가지가 확인되었다: 렉틴 경로, 고전 경로 및 대체 경로 (Dunkelberger and Song, Complement and its role in innate and adaptive immune responses. Cell Res. 2010; 20 (1): 34-50). 렉틴 경로는 혈류에서 순환하는 렉틴의 침착에 의해 활성화되며, 정상 조건 하에 외래 및 변경된 탄수화물 표면 패턴을 각각 인식하고 그의 표면을 장식함으로써 침입 병원체 및 사멸 세포에 대한 감시 기능을 갖는다. 만노스-결합 렉틴 (MBL)인 피콜린과 콜렉틴이 간, 신장 및 다른 기관에서 생산되는 이들 렉틴의 주요 대표물이다 (Garred et al., A journey through the lectin pathway of complement-MBL and beyond. Immunol Rev. 2016;274(1):74-97). 이들의 침착에 이어서, 본질적으로 2종의 밀접 관련 세린 프로테아제인 만노스-결합 렉틴-연관 세린 프로테아제 1 및 2 (MASP-1 및 MASP-2)의 지모겐이 혈류로부터 추가로 동원되어 복합체를 형성하고, 여기서 지모겐이 서로 근접하게 된다. 현재 개념은 생체내 조건 하에 동원 후 MASP-1 지모겐이 자기-활성화되고, 이어서 절단에 의해 MASP-2 지모겐을 활성화시킨다는 것이다. 활성화된 MASP-1은 또한 보체 인자 C2를 C2a 및 C2b로 절단한다. 활성화된 MASP-2는 또한 C2 및 보체 인자 C4를 C4a 및 C4b로 절단하고, 이는 C2a와 함께 C4bC2a 복합체를 형성하며, 이는 보체 인자 C3 컨버타제로서 작용한다. C3 컨버타제 활성의 구성 및 표적 세포 표면에 대한 연속적인 C3 침착은 공통적인 하류 캐스케이드를 활성화시키는 모든 3개의 보체 경로의 수렴점을 나타내며, 이는 염증 매개체의 생성 및 표적 세포 용해를 일으킨다. 무손상 인간 혈청에서, 두 MASP-효소 모두의 활성은 C3 컨버타제 형성에 필수적이다 (Heja et al., Revised mechanism of complement lectin-pathway activation revealing the role of serine protease MASP-1as the exclusive activator of MASP-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(26):10498-503).
미세혈관계는 염증성 및 허혈성 기관 장애 동안 결정적인 역할을 한다. 장벽 기능, 백혈구 트래픽킹 및 응고 제어는 소혈관 내의 관강내 내피 세포 표면의 완전성에 밀접하게 의존적이다. 관강내 내피 표면은 막 통합 당단백질, 프로테오글리칸 및 당지질로부터의 글리코실화 연장체의 조밀한 코트 (전체적으로 글리코칼릭스로 불림)로 라이닝된다. 동물 실험 및 인간 병리상태로부터의 샘플의 전자 현미경 분석은 특히 내피 글리코칼릭스가 허혈성 챌린지 시 뿐만 아니라 패혈증에서와 같은 염증성 상태 하에 신속하고 완전히 분해된다는 것을 제시하였다. 이들 변화는 정상 조건 하에 검출가능하지 않은 혈류에 대한 탄수화물 잔기의 노출로 이어진다 (검토를 위해 문헌 [Sieve et al., Regulation and function of endothelial glycocalyx layer in vascular diseases. Vascul Pharmacol. 2018; 100: 26-33] 참조). 세포 표면의 다른 변화 이외에도, 특히 변경된 탄수화물 패턴은 렉틴 경로를 활성화시켜 패턴 인식 렉틴의 침착, 후속적인 C3 침착 및 세포 용해의 개시를 유발하는 것으로 여겨진다. MBL 및 C3 침착은 인간을 포함한 종에 걸쳐 허혈 및 급성 신장 손상 후에 발생하는 것으로 나타났다. 렉틴 경로 활성화는 MBL 및 MASP-2의 표적화된 결실이 마우스를 신장, 심장 및 장에서의 허혈 재관류 손상으로부터 보호한 것과 같이, 재관류 손상에 특히 관련성이 있었다 (Moeller-Kristensen et al., Mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury. Scand J Immunol. 2005; 61(5): 426-34; Schwaeble et al., Targeting of mannan-binding lectin-associated serine protease-2 confers protection from myocardial and gastrointestinal ischemia/reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(18): 7523-8). 더욱이, 신장에서 우세하게 발현되는 또 다른 MASP 활성화 렉틴인 콜렉틴 11의 결실은 마우스를 허혈성 급성 신장 손상에 대해 저항성으로 만들었다 (Farrar et al., Collectin-11 detects stress-induced L-fucose pattern to trigger renal epithelial injury. J Clin Invest. 2016; 126(5): 1911-1925). MASP-1 및 MASP-2의 선택적 펩티드 억제제는 해바라기 또는 메뚜기로부터의 천연 트립신 억제제를 출발점으로서 사용하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 확인되었다. 이들 펩티드는 시험관내에서 렉틴 경로 의존성 C3 컨버타제 형성을 억제하는 것으로 나타났다 (Kocsis et al., Selective inhibition of the lectin pathway of complement with phage display selected peptides against mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP)-1 and -2: significant contribution of MASP-1 to lectin pathway activation. J Immunol. 2010; 185(7): 4169-78; Heja et al., Monospecific inhibitors show that mannan-binding lectin-associated serine protease-1 (MASP-1) and are essential for lectin pathway activation and reveal structural plasticity of MASP-2. J Biol Chem. 2012; 287(24): 20290-300). 그러나, 이들 펩티드 억제제의 제약 유용성 및 생체내 효능에 대한 증거는 아직 이용가능하지 않다. 유사하게, MASP 지모겐 상호작용을 방해하는 MASP-2에 대해 지시된 항체가 확인되었고, 비정형 용혈성 요독성 증후군 및 다른 염증성 신장 장애를 위한 임상 개발이 이루어졌다 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03205995; NCT02682407; NCT03608033). 그러나, 급성, 특히 허혈성 기관 손상의 예방 또는 치료에서의 유용성에 대한 임상 증거는 여전히 누락되어 있다.
WO 2004/075837은 보체계의 억제에 의한 TAAA 복구 또는 허혈-재관류 손상과 연관된 조직 손상에 의해 유발되는 이환율 및 사망률을 감소시키기 위한 항-MASP 항체, 그의 기능적 등가 단편 및 MASP 결합 펩티드를 개시한다. 보체계, 주로 렉틴 경로와 관련된 질환의 치료를 위한 소형 펩티드, 예컨대 해바라기 MASP 억제제-1 (SFMI-1) 및 해바라기 MASP 억제제-2 (SFMI-2) 뿐만 아니라 그의 유도체가 WO 2010/136831에 처음 기재되었다.
WO 2015/054298은 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3의 활성을 감소시킴으로써 대상체에서 시력을 보존하거나 시각 상실을 감소시키는 방법 및 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 억제하거나 감소시키는 방법을 개시한다. WO 2004/106384, WO 2005/123128, WO 2007/117996 및 WO 2014/144542는 MASP-2-의존성 보체 활성화와 연관된 질환의 요법을 위한 항-MASP-2 항체를 개시한다.
본 발명의 목적은 MASP-1 및/또는 MASP-2 효소에 대한 억제 효과 및 하기 정의된 바와 같은 MASP-1 및/또는 MASP-2-연관 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 효율적이고 안전한 대안으로서 적합하게 하는 다른 유익한 특성을 갖는 신규 펩티드를 제공하는 것이었다. 추가의 목적은 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2 효소 및/또는 래트 MASP-1 및/또는 MASP-2 효소에 대한 개선된 억제 효과를 갖는 신규 펩티드를 제공하는 것이었다.
본 발명은 일반적으로 MASP-1 및/또는 MASP-2 효소의 억제제로서 작용하는 펩티드 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 하기 구조 화학식 (I)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며:
(X0)p(X1)q(X2)rX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(X13)s(X14)t(X15)u (I),
여기서
X0은 하기 화학식 (IIa)의 기를 나타내고:
여기서
*는 인접한 아미노산의 말단 아미노 기에 대한 결합을 표시하고,
A는 결합 또는 C1-C6-알킬렌이며, 여기서 C1-C6-알킬렌 내의 1개의 CH2 기는 -O- 또는 -S-로 교환될 수 있고, C1-C6-알킬렌은 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르복시, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환되고,
B는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, C3-C8-시클로알킬 또는 C3-C7-헤테로시클로알킬이며,
여기서 아릴, 헤테로아릴, C3-C8-시클로알킬 및 C3-C7-헤테로시클로알킬은 C1-C4-알킬, 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르보닐, 카르복시, 아미노 및 할로겐의 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환될 수 있고,
R1은 수소, 할로겐, 아미노, 히드록실 또는 C1-C20-알킬이고, 여기서 C1-C20-알킬은 히드록실, 카르복시, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환되고,
p는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X1은 임의의 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 임의의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D- 또는 L-입체배위일 수 있고,
p가 0이고 q가 0이 아닌 경우에, X1의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
q는 0 내지 5의 정수를 나타내고,
X2는 I, L, M, V 및 A로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), (2S,3S)-2-[(3R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[(3S)-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산, L-메티오닌-L-술폭시드, L-메티오닌-술폰 및 L-tert-부틸글리신으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
p 및 q가 둘 다 0이고 r이 1인 경우에, X2의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 L-페니실라민 (Pen) 및 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
p 및 q 및 r이 모두 0인 경우에, X3의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
X4는 S, C, T, R 또는 K로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T), L-호모세린 (hSer) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 S, C 또는 T로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T) 및 L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X7은 L, F 또는 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-4-브로모페닐알라닌 ((4-브로모)F), 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), (S)-2-(아미노)-1,6-헥산디오산 (AAD), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-2-아미노-4-시아노부티르산 (Cnba), 4-플루오로-류신 ((4-플루오로)L), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산, L-tert-부틸글리신 ((tBu)G), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌, 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌, 2-아미노-7-(tert-부톡시)-7-옥소헵탄산, 5,5,5-트리플루오로-L-류신 ((트리플루오로)L), 2-메틸-L-페닐알라닌 ((2-Me)F), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-시클로펜틸알라닌 (Cpa), L-시클로프로필메틸알라닌, L-트리플루오로메틸알라닌, L-디플루오로메틸알라닌, 2-플루오로-L-페닐알라닌 ((2-플루오로)F), (2S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-2-아미노프로판산, (2S)-3-(3-시아노페닐)-2-아미노프로판산 및 (2S)-3-(인돌-4-일)-2-(아미노)프로판산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, L-히드록시프롤린 (Hyp), (3S)-모르폴린-3-카르복실산 (모르폴린-3-카르복실산), L-피페콜산 (Pip), (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P) 및 (1R,2S,5S)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-히드록시프롤린 (Hyp), (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-트랜스-3-히드록시프롤린 ((3S-OH)P), (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), L-4,4-디플루오로프롤린 ((디플루오로)P), rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I 또는 L-시클로펜틸글리신 (Cpg), L-시클로헥실글리신 (Chg), (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, 3-클로로페닐글리신 ((3-클로로-Ph)G), L-tert-부틸글리신, 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸글리신, L-노르발린 (Nva) 및 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I 또는 알로-L-이소류신 (알로-I), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg), (2S,3S)-2-((아미노)메틸)-3-메틸펜탄산, L-페닐글리신 (Phg), 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산, 2-메틸-D-알로이소류신, L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), L-tert-부틸글리신 및 아미노이소부티르산 (Aib)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
u 및 t 및 s가 모두 0인 경우에, X12의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
X13은 P, A, S, T, G, D, E, Q 또는 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, L-2-아미노부티르산 (Abu), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P), 히드록시프롤린 (Hyp), 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), L-4,4-디플루오로프롤린 ((디플루오로)P), L-시클로펜틸글리신 (Cpg), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg) 및 (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
u 및 t가 둘 다 0이고 s가 0이 아닌 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
s는 0 내지 3의 정수를 나타내고,
X14는 임의의 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 임의의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D- 또는 L-입체배위일 수 있고,
u가 0이고 t가 0이 아닌 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되며,
t는 0 내지 4의 정수를 나타내고,
X15는 화학식 (IIb)의 기를 나타내고:
여기서
*는 인접한 아미노산의 말단 카르복실 기에 대한 결합을 표시하고,
A1은 결합 또는 C1-C6-알킬렌이며, 여기서 C1-C6-알킬렌 내의 1개의 CH2 기는 -O- 또는 -S-로 교환될 수 있고, C1-C6-알킬렌은 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르복시, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환되고,
B1은 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, C3-C8-시클로알킬 또는 C3-C7-헤테로시클로알킬이며,
여기서 아릴, 헤테로아릴, C3-C8-시클로알킬 및 C3-C7-헤테로시클로알킬은 C1-C4-알킬, 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르보닐, 카르복시, 아미노 및 할로겐의 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환될 수 있고,
R2는 수소, 할로겐, 아미노, 히드록실 또는 C1-C20-알킬이고, 여기서 C1-C20-알킬은 히드록실, 카르복시, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 라디칼에 의해 동일하거나 상이하게 최대 삼치환되고,
u는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
단, X1 내지 X14 중 적어도 1개는 비천연 아미노산이다.
본 발명은 하기 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 추가로 제공하며:
(X1)q(X2)rX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(X13)s(X14)t (II)
여기서
X1은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내며,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 바람직하게는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 화학, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 면역학, 미생물학, 약리학, 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서 전반에서, 단어 "포함하다" 또는 그의 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 (또는 성분) 또는 정수 (또는 성분)의 군을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 정수 (또는 성분) 또는 정수 (또는 성분)의 군을 제외하는 것은 아님이 이해될 것이다. 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미하는데 사용되며, 이러한 표현은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 특히, 표현 "펩티드를 함유하는 화합물"은 정의된 펩티드 서열을 함유하고, 펩티드에 공유 결합된 추가의 화학적 기 또는 치환기, 예를 들어 아미노산, 지방산, 펩티드의 약역학적 또는 약동학적 특성을 증진시키는 화학적 기, 또는 임의의 다른 화학적 기를 임의로 함유할 수 있는 화합물을 의미한다. 또한, 표현 "펩티드를 함유하는 화합물"은 그 펩티드에 공유 결합된 임의의 추가의 화학적 기 또는 치환기가 없는 정의된 펩티드 서열을 명백하게 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 그에 대해 부여된 의미를 갖는다. "로 본질적으로 이루어진"은 그것이 비교되는 펩티드와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 펩티드로서 이해된다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 상호교환가능하게 사용되며, 바람직하게는 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 2개 이상의 아미노산의 서열을 광범위하게 지칭한다. 펩티드 (아미드) 결합은 한 아미노산의 카르복실 기가 또 다른 아미노산의 아미노 기와 반응할 때 형성된다. 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산의 중합체의 특정 길이를 나타내지도 않고, 폴리펩티드가 재조합 기술, 화학적 또는 효소적 합성을 사용하여 생산되는지 또는 자연 발생인지 여부를 암시하거나 구별하도록 의도되지도 않는다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 펩티드는 본 출원의 정의 하에 아미노산이 아닌 1개 이상의 부분을 함유할 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 이들 부분은 바람직하게는 펩티드의 N- 및 C-말단 단부에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "아미노산" 또는 "임의의 아미노산"은 측쇄와 함께 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 관능기를 함유하는 유기 화합물을 지칭하고, 자연 발생 아미노산 (예를 들어, α-L-아미노산), 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함한 임의의 및 모든 아미노산을 지칭한다. "천연 아미노산"은 자연에서 발견되는 것, 예컨대, 예를 들어 펩티드 쇄로 조합되어 방대한 단백질 어레이의 빌딩-블록을 형성하는 23종의 아미노산을 포함한다. 이들은 주로 L 입체이성질체이지만, 소수의 D-아미노산이 박테리아 외피 및 일부 항생제에 존재한다. 표준 유전자 코드의 20종의 단백질생성 천연 아미노산이 표 2에서 열거된다. "비-표준" 천연 아미노산은 피롤리신 (메탄생성 유기체 및 다른 진핵생물에서 발견됨), 셀레노시스테인 (많은 비-진핵생물 뿐만 아니라 대부분의 진핵생물에 존재함), 및 N-포르밀메티오닌 (박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체에서 출발 코돈 AUG에 의해 코딩됨)이다.
"비천연" 또는 "비-천연" 아미노산은 자연적으로 발생하거나 또는 화학적으로 합성되는 비-단백질생성 아미노산 (즉, 자연 코딩되지 않거나 또는 유전자 코드에서 발견되지 않는 것)이다. 140종 초과의 천연 아미노산이 공지되어 있고, 수천가지 이상의 조합이 가능하다. "비천연" 아미노산의 예는 β-아미노산 (β3 및 β2), 호모-아미노산, 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, 디아미노산, D-아미노산 및 N-메틸 아미노산을 포함한다. 비천연 또는 비-천연 아미노산은 또한 변형된 아미노산을 포함한다. "변형된" 아미노산은 아미노산에 자연적으로 존재하지 않는 기, 기들 또는 화학적 모이어티를 포함하도록 화학적으로 변형된 아미노산 (예를 들어, 천연 아미노산)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 바람직한 비천연 아미노산은 표 1에 열거된다. 표 1은 비천연 아미노산을 D- 및/또는 L-입체이성질체로 나타내고 있지만, 본 발명에 따른 바람직한 비천연 아미노산은 표 1에 열거된 비천연 아미노산의 D- 및 L-입체이성질체 둘 다이다.
표 1: 바람직한 비천연 아미노산
보다 바람직한 비천연 아미노산은 N-메틸-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산, L-3-브로모페닐알라닌 ((3-브로모)F), L-N,N-디메틸알라닌 ((N,N-diMe)A), N,N-디메틸글리신 ((N,N-diMe)G), N-페닐글리신 ((N-Ph)G), (R)-피페리딘-3-카르복실산, (S)-피페리딘-3-카르복실산, L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), L-2-피리딜알라닌 (2-Pal), L-3-피리딜알라닌 (3-Pal), L-4-피리딜알라닌 (4-Pal), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-아미노-2,2-디메틸프로피온산, 3-아미노-3-메틸부티르산, 4-(아미노메틸)벤조산, L-2-아미노부티르산 (Abu), 1-아미노시클로부탄-1-카르복실산 (ACBA), 6-아미노헥산산 (Ahx), 2-아미노이소부티르산 (Aib), L-2-티에닐알라닌 (베타-2-티에닐알라닌), 베타-알라닌 (베타-A), 베타-프롤린 (베타-P), L-시트룰린 (Cit), L-2,4-디아미노부티르산 (Dab), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), 감마-아미노부티르산 (감마-Abu), L-3-메틸히스티딘 (3-Me)H), L-디히드로오로트산 (Hoo), L-노르류신 (Nle), N-메틸-L-프롤린 ((N-Me)P), L-노르발린 (Nva), L-오르니틴 (Orn), L-피페콜산 (Pip), (2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산; 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C), N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R), L-페니실라민 (Pen) 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
가장 바람직한 비천연 아미노산은 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva), L-오르니틴 (Orn), N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 펩티드는 본 발명의 정의 하에 아미노산이 아닌 1개 이상의 화학적 기를 함유할 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 이들 화학적 기는 펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부에 존재할 수 있고, 화학식 X0 및 X15에 의해 나타내어진다. 본 발명의 펩티드의 모든 아미노산 및 화학적 기는 펩티드 (아미드) 결합을 통해 연결되는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 펩티드는 α-아미노산의 α-아미노 기 및 카르복시 기를 연결한 후, α-펩티드 결합에 의해 연결함으로써 형성된다. 본 발명에 따르면, 펩티드 결합은 각각의 천연 또는 비천연 아미노산에 존재하는 임의의 카르복실- 및 아미노 기에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, α-아미노 기 이외에 제2 아미노 기를 함유하는 α-아미노산 (예를 들어 L-리신) 또는 α-카르복시 기 이외에 제2 카르복시 기를 함유하는 α-아미노산 (예를 들어 L-아스파르트산 및 L-글루탐산)은 추가의 아미노- 또는 카르복시 기를 통해 연결될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해에 따라, 본원에 개시된 펩티드 서열은 α-펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산의 서열을 나타낸다. α-펩티드 결합이 아닌 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산은 "*"로 표시된다. "*"는 아미노산의 좌측 또는 우측 상에 존재하여, 그 아미노산의 추가의 아미노 기 또는 추가의 카르복시 기가 인접한 아미노산에 대한 펩티드 결합에 사용되는지 여부를 예시한다 (예를 들어 (*L), (E*), (*Dap) 등).
관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해에 따라, 본원에 개시된 펩티드 서열은 좌측에서 우측으로 진행하여 제시되고, 여기서 서열의 좌측 말단은 펩티드의 "N-말단" ("아미노 말단", "N-말단 단부")이고, 서열의 우측 말단은 펩티드의 "C-말단" ("카르복시 말단", "C-말단 단부")이다. 이러한 용어 "N-말단 (아미노 말단, N-말단 단부)"은 펩티드가 실제로 N-말단에 아미노 기를 함유하는지 여부에 관계없이 적용된다. 이러한 용어 C-말단 (카르복시 말단, C-말단 단부)은 펩티드가 실제로 C-말단에 카르복시 기를 함유하는지 여부에 관계없이 적용된다. 용어 "말단 아미노 기"는 N-말단에 존재하는 임의의 아미노 기를 지칭한다. 용어 "말단 카르복실 기"는 C-말단에 존재하는 임의의 카르복실 기를 지칭한다.
본 발명에 따르면, N-말단은 p가 1을 나타내는 경우에 X0에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, q가 적어도 1을 나타내고, p가 0을 나타내는 경우에, N-말단은 X1에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, N-말단은 r이 1을 나타내고, p 및 q가 둘 다 0을 나타내는 경우에 X2에 의해 형성될 수 있다. p, q 및 r이 모두 0을 나타내는 경우에, N-말단은 선형 펩티드의 경우에 X3에 의해 형성된다. 본 발명의 펩티드가 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화되고, p, q 및 r이 모두 0을 나타내는 경우에, 펩티드는 N-말단을 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, C-말단은 u가 1을 나타내는 경우에 X15에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, C-말단은 t가 적어도 1의 정수를 나타내고, u가 0을 나타내는 경우에 X14에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, C-말단은 s가 1을 나타내고, t 및 u가 둘 다 0을 나타내는 경우에 X13에 의해 형성될 수 있다. s, t 및 u가 모두 0을 나타내는 경우에, C-말단은 X12에 의해 형성된다.
본 발명에서, 본원에 사용된 자연 발생 및 비-자연 발생 아미노아실 잔기의 명칭은 바람직하게는 유기 화학 명명법 IUPAC 위원회(IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry) 및 생화학 명명법 IUPAC-IUB 위원회(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)에 의해 문헌 [Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974), Biochemistry, 14(2), (1975)]에 제시된 바와 같이 제시된 명명 규정에 따른다.
본 명세서에서, 자연 발생 단백질생성 아미노산은 통상적으로 그의 통상적인 단일-문자 약어에 의해 지정된다. 대안적으로, 이들은 또한 그의 3-문자 약어에 의해 (예를 들어 특히 서열 목록에서) 또는 하기 표 2에 제시된 바와 같은 그의 전체 명칭에 의해 지칭될 수 있다:
표 2: 천연 아미노산에 대한 표준 약어
비-단백질생성 또는 비-자연 발생 아미노산의 경우에, 이들이 그의 전체 명칭 (예를 들어 오르니틴 등)에 의해 지칭되지 않는 한, 하기 약어 목록 (표 3)에 나타낸 바와 같은 약어를 비롯한 빈번하게 사용되는 3- 내지 6-특징 코드가 그의 잔기에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "L-아미노산"은 아미노산의 "L" 이성질체 형태를 지칭하고, 반대로 용어 "D-아미노산"은 아미노산의 "D" 이성질체 형태를 지칭한다. 추가로, L-아미노산을 Ala / A, Arg / R 등과 같이 대문자로, 그리고 D-아미노산을 ala / a, arg / r 등과 같이 소문자로 나타내는 것이 통상적인 방식이다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같은 형태, 즉 Ala, Arg, Asn 등의 본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 3-문자 코드는, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 일반적으로 D- 및 L-형태 뿐만 아니라 호모- 및 노르-형태를 포함할 것이다. 접두어 "노르"는 모 화합물로부터 1개의 탄소 원자와 동반 수소 원자의 제거에 의해 유도될 수 있는 구조적 유사체를 지칭한다. 접두어 "호모"는 동족 계열에서 다음의 높은 순위 구성원을 나타낸다. 구체적 이성질체 형태에 대한 언급은 상기 기재된 바와 같이 대문자 접두어 L- 또는 D-에 의해 나타내어질 것이다 (예를 들어 D-Arg, L-Arg 등). 따라서, 호모- 또는 노르-형태에 대한 구체적 언급은 각각의 접두어에 의해 명백하게 나타내어질 것이다 (예를 들어 호모-Arg, 호모-R, 노르-Arg, 노르-R, 호모-Cys, 호모-C 등).
용어 "C1-C6-알킬"은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 포화 1가 탄화수소 기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 네오-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸 또는 1,3-디메틸부틸 기 또는 그의 이성질체를 의미한다. 특히, 상기 기는 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자 ("C1-C4-알킬")를 가지며, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸 이소부틸 또는 tert-부틸 기이고, 보다 특히 1, 2 또는 3개의 탄소 원자 ("C1-C3-알킬")를 가지며, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필 기이다. 메틸, 에틸, n-프로필이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 것은 메틸이다.
용어 "C1-C20-알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 포화 1가 탄화수소 기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸 이소부틸, tert-부틸 또는 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 이소헵틸, 옥틸 및 이소옥틸, 노닐, 데실, 도데실 또는 에이코실을 의미한다.
용어 "C1-C4-알킬렌"은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 가교, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, α-메틸에틸렌, β-메틸에틸렌, α-에틸에틸렌, β-에틸에틸렌, 부틸렌, α-메틸프로필렌, β-메틸프로필렌 및 γ-메틸프로필렌을 의미한다.
용어 "C1-C6-알킬렌"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 가교, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, α-메틸에틸렌, β-메틸에틸렌, α-에틸에틸렌, β-에틸에틸렌, 부틸렌, α-메틸프로필렌, β-메틸프로필렌, γ-메틸프로필렌, α-에틸프로필렌, β-에틸프로필렌, γ-에틸프로필렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 의미한다.
용어 "C3-C8-시클로알킬"은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화 탄화수소 고리를 의미한다. 상기 C3-C8-시클로알킬 기는, 예를 들어 모노시클릭 탄화수소 고리, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 또는 시클로옥틸 기, 비시클릭 탄화수소 고리, 예를 들어 비시클로[4.2.0]옥틸 또는 옥타히드로펜탈레닐, 또는 가교된 또는 케이징된 포화 고리 기, 예컨대 노르보란 또는 아다만탄, 및 큐반이다.
용어 "C3-C7-헤테로시클로알킬"은 시리즈 N, O 및 S로부터의 1 또는 2개의 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자를 함유하는 4, 5, 6 또는 7개의 포화 헤테로사이클을 의미하며, 상기 헤테로시클로알킬 기는 탄소 원자 중 어느 하나, 또는 존재하는 경우에 질소 원자를 통해 분자의 나머지에 부착되는 것이 가능하다. 상기 C3-C7-헤테로시클로알킬 기는 4-원 고리, 예컨대 예를 들어 아제티디닐, 옥세타닐 또는 티에타닐; 또는 5-원 고리, 예컨대 예를 들어 테트라히드로푸라닐, 1,3-디옥솔라닐, 티올라닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 1,1-디옥시도티올라닐, 1,2-옥사졸리디닐, 1,3-옥사졸리디닐 또는 1,3-티아졸리디닐; 또는 6-원 고리, 예컨대 예를 들어 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 디티아닐, 티오모르폴리닐, 피페라지닐, 헥사히드로피리미디닐, 1,3-디옥사닐, 1,4-디옥사닐 또는 1,2-옥사지나닐, 또는 7-원 고리, 예컨대 예를 들어 아제파닐, 1,4-디아제파닐 또는 1,4-옥사제파닐일 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.
용어 "아릴"은 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 불포화 또는 부분 불포화 사이클을 의미한다. 바람직한 아릴 라디칼은 페닐 및 나프틸이다.
용어 "헤테로아릴"은 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 고리 원자 ("5 내지 14원 헤테로아릴" 기), 특히 5, 6, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖고, 적어도 1개의 고리 헤테로원자 및 임의로 시리즈: N, O 및/또는 S로부터의 1, 2 또는 3개의 추가의 고리 헤테로원자를 함유하고, 고리 탄소 원자를 통해 또는 임의로 고리 질소 원자를 통해 (원자가에 의해 허용되는 경우에) 결합된 1가 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 방향족 고리를 의미한다. 상기 헤테로아릴 기는 5-원 헤테로아릴 기, 예컨대, 예를 들어 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴 또는 테트라졸릴; 또는 6-원 헤테로아릴 기, 예컨대, 예를 들어 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 또는 트리아지닐; 또는 트리시클릭 헤테로아릴 기, 예컨대, 예를 들어 카르바졸릴, 아크리디닐 또는 페나지닐; 또는 9-원 헤테로아릴 기, 예컨대, 예를 들어 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조트리아졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리지닐 또는 퓨리닐; 또는 10-원 헤테로아릴 기, 예컨대, 예를 들어 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐 또는 프테리디닐일 수 있다.
일반적으로 및 달리 언급되지 않는 한, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴렌 기는 그의 모든 가능한 이성질체 형태, 예를 들어: 분자의 나머지 부분에 대한 연결 지점과 관련하여 호변이성질체 및 위치 이성질체를 포함한다. 따라서, 일부 예시적인 비제한적 예의 경우, 용어 피리디닐은 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 및 피리딘-4-일을 포함하거나; 또는 용어 티에닐은 티엔-2-일 및 티엔-3-일을 포함한다.
본원에 개시된 서열 중에는 서열의 카르복시 말단 (C-말단)에 "-OH" 모이어티 또는 "-NH2" 모이어티를 혼입시킨 서열이 있다. 서열의 C-말단에서의 "-OH" 또는 "-NH2" 모이어티는 각각 C-말단에서의 카르복시 기 또는 아미도 (-(C=O)-NH2) 기의 존재에 상응하는 히드록시 기 또는 아미노 기를 나타낸다. 본 발명의 각각의 서열에서, C-말단 "-OH" 모이어티는 본 발명에서 "아미드화된 C-말단"으로도 지칭되는 C-말단 "-NH2" 모이어티로 치환될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다. 그러나, 상기 대안 중에서 C-말단 "-OH" 모이어티가 바람직하다.
용어 "아세틸화" ("Ac"로도 약칭됨)는 펩티드의 N-말단의 아세틸화 (펩티드의 N-말단이 아세틸화됨)를 통한 N-말단 모이어티의 아세틸 보호를 지칭한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서
X0은 (1S,2S,4S)-비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일아세트산, (2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)아세트산, 2-(티오모르폴린)아세트산 ((2-티오모르폴린)아세틸), 2-(N-이소프로필-N-메틸아미노)아세트산, (S)-3-메틸발레르산 ((S)-3-메틸펜탄산), 2-(3-피리딜)아세트산, 2-(시클로헥실아미노)아세트산 (2-(시클로헥실아미노)아세틸), 2-(디에틸아미노)아세트산 (2-(디에틸아미노)아세틸), 2-(모르폴린)아세트산 (2-(모르폴린)아세틸), 2-(N-메틸-N-시클로프로필아미노)아세트산 (2-(N-메틸-N-시클로프로필아미노)아세틸), 2-(피페리딘)아세트산 (2-(피페리딘)아세틸), 2-(피롤리딘)아세트산 (2-(피롤리딘)아세틸), 2-히드록시아세트산 (2-히드록시아세틸), 2-히드록시이소부티르산 (2-히드록시이소부티르산), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-메톡시프로피온산, 4-(아미노메틸)벤조산, 4-메틸펜탄산 (4-메틸발레르산), 5-클로로티오펜-카르복실산, 1-(아미노메틸)-시클로프로필-1-카르복실산 (ACMP), 아디프산, (S)-아제티딘-2-카르복실산, 벤조산 (벤조산), 4-(3,5-디메틸-1,2-옥사졸-4-일)-L-페닐알라닌, 시클로부탄카르복실산 (시클로부탄카르복실산), 2-(시클로부틸)아세트산 (시클로부틸아세트산), 시클로부틸아세트산 (시클로부틸아세트산), 시클로헥실아세트산 (시클로헥실아세트산), 시클로헥산카르복실산 (시클로헥실카르복실산), 시클로펜탄카르복실산, 시클로펜틸아세트산 (시클로펜틸아세트산), 시클로프로판카르복실산 (시클로프로판카르복실산), 시클로프로필아세트산, D-(+)비오틴, 푸마르산, 3-페닐프로판산 (히드로신남산), 이소부티르산, 이소발레르산 (이소발레르산), L-(+)-락트산 (락트산), 페닐아세트산, 피페리딘-4-일아세트산, 피발산 (피발산), 수베르산, tert-부틸아세트산, 테트라히드로피라닐-4-아세트산, 테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산 및 트랜스-2-(3-((t-부톡시)카르보닐아미노)시클로헥실)아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기이고,
p는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X1은 A, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산, L-3-브로모페닐알라닌 ((3-브로모)F), L-N,N-디메틸알라닌 ((N,N-diMe)A), N,N-디메틸글리신 ((N,N-diMe)G), N-페닐글리신 ((N-Ph)G), (R)-피페리딘-3-카르복실산, (S)-피페리딘-3-카르복실산, L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), L-2-피리딜알라닌 (2-Pal), L-3-피리딜알라닌 (3-Pal), L-4-피리딜알라닌 (4-Pal), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-아미노-2,2-디메틸프로피온산, 3-아미노-3-메틸부티르산, 4-(아미노메틸)벤조산, L-2-아미노부티르산 (Abu), 1-아미노시클로부탄-1-카르복실산 (ACBA), 6-아미노헥산산 (Ahx), 2-아미노이소부티르산 (Aib), L-2-티에닐알라닌 (베타-2-티에닐알라닌), 베타-알라닌 (베타-A), 베타-프롤린 (베타-P), L-시트룰린 (Cit), L-2,4-디아미노부티르산 (Dab), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), 감마-아미노부티르산 (감마-Abu), L-3-메틸히스티딘 (3-Me)H), L-디히드로오로트산 (Hoo), L-노르류신 (Nle), N-메틸-L-프롤린 ((N-Me)P), L-노르발린 (Nva), L-오르니틴 (Orn), L-피페콜산 (Pip), (2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
q는 0 내지 5의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), (2S,3S)-2-[(3R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산 및 (2S,3S)-2-[(3S)-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 S, C, T, R 및 K로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T) 및 L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X7은 L 및 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), L-4-브로모페닐알라닌 ((4-브로모)F), 4-플루오로-L-류신 ((4-플루오로)L), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), L-tert-부틸글리신 ((tBu)G), 5,5,5-트리플루오로-L-류신 ((트리플루오로)L), (S)-2-(아미노)-1,6-헥산디오산 (AAD), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-2-아미노-4-시아노부티르산 (Cnba), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산, (2S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-2-아미노프로판산, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌 및 2-아미노-7-(tert-부톡시)-7-옥소헵탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, (1R,2S,5S)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-히드록시프롤린 (Hyp), (3S)-모르폴린-3-카르복실산 (모르폴린-3-카르복실산), L-피페콜산 (Pip) 및 (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-트랜스-3-히드록시프롤린 ((3S-OH)P), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-히드록시프롤린 (Hyp), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I 또는 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산, 3-클로로페닐글리신 ((3-클로로-Ph)G), (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로헥실글리신 (Chg), L-시클로펜틸글리신 (Cpg), L-시클로부틸글리신 및 L-노르발린 (Nva)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I 또는 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산, (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-페닐글리신 (Phg), 2-메틸-D-알로이소류신 및 (2S,3S)-2-((아미노)메틸)-3-메틸펜탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
u 및 t 및 s가 모두 0인 경우에, X12의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
X13은 P, A 및 D로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-2-아미노부티르산 (Abu), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 히드록시프롤린 (Hyp) 및 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
u 및 t가 둘 다 0이고 s가 0이 아닌 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
s는 0 내지 3의 정수를 나타내고,
X14는 D, E, G, K, N, P 및 Q로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 3-카르복시페닐알라닌 ((3-카르복시)F), (2S)-2-아미노-4-(벤질아미노)-4-옥소부탄카르복실산 ((N-벤질)D), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 6-아미노헥산산 (Ahx), (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), L-오르니틴 (Orn) 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
u가 0이고 t가 0이 아닌 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
t는 0 내지 4의 정수를 나타내고,
X15는 (1R,3S)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (1S,3R)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (R)-4-아미노-6-메틸헵탄산, (S)-(1-피페리딘-3-일)-아세트산, (S)-3-(1-피롤리딘-2-일)-프로피온산, (S)-3-(2H-테트라졸-5-일)프로판산, (S)-피롤리딘-3-카르복실산, 5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산 및 (2S)-3-(트리아졸-1-일)-2-(아미노)프로판산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기이고,
u는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
단, 펩티드는 적어도 1개의 비천연 아미노산을 함유한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서
X0은 (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산, (2-티오모르폴린)아세트산, (N-이소프로필-N-메틸아미노)아세트산, 2-(3-피리딜)아세트산, 2-(시클로헥실아미노)아세트산, 2-(디에틸아미노)아세트산, 2-(모르폴린)아세트산, 2-(피페리딘)아세트산, 2-(피롤리딘)아세트산, 3-(아미노메틸)벤조산, 4-(아미노메틸)벤조산, 1-(아미노메틸)-시클로프로필-1-카르복실산 (ACMP), 아제티딘-2-카르복실산, 벤조산, 시클로부틸아세트산, 시클로프로필아세트산, 페닐아세트산, 피페리딘-4-일아세트산, 테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산, 트라넥삼산 및 트랜스-2-(3-((t-부톡시)카르보닐아미노)시클로헥실)아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기이고,
p는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X1은 A, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 L-N,N-디메틸알라닌 ((N,N-diMe)A), N-메틸-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-2-피리딜알라닌 (2-Pal), L-3-피리딜알라닌 (3-Pal), L-4-피리딜알라닌 (4-Pal), L-2-아미노부티르산 (Abu), 6-아미노헥산산 (Ahx), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-아미노-2,2-디메틸프로피온산, 3-아미노-3-메틸부티르산, 4-(아미노메틸)벤조산, 베타-2-티에닐알라닌, (S)-피롤리딘-2-카르복실산 (베타-P), L-시트룰린 (Cit), L-2,4-디아미노부티르산 (Dab), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), 감마-아미노부티르산 (감마-Abu), L-3-메틸히스티딘 (H(3-Me)), L-디히드로오로트산 (Hoo), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva), L-오르니틴 (Orn), L-피페콜산 (Pip), N-메틸-L-프롤린 ((N-Me)P), 트라넥삼산 (트라넥삼산), (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산 및 (2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
q는 0 내지 5의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva) 및 L-2-아미노부티르산 (Abu)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 S 및 T로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S 또는 비천연 아미노산 알로-L-트레오닌 (알로-T)을 나타내고,
X7은 N 및 L로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), 4-플루오로-L-류신 ((4-플루오로)L), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산 및 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산 및 (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I 또는 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산, (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, L-시클로헥실글리신 (Chg) 및 L-시클로펜틸글리신 (Cpg)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I 또는 알로-L-이소류신 (알로-I), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg) 및 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
u 및 t 및 s가 모두 0인 경우에, X12의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
X13은 P 및 D로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2-아미노이소부티르산 (Aib), 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P) 및 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
u 및 t가 둘 다 0이고 s가 0이 아닌 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
s는 0 내지 3의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q, N, E 및 P로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 3-카르복시페닐알라닌 ((3-카르복시)F), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), L-오르니틴 (Orn) 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며,
한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있고,
u가 0이고 t가 0이 아닌 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되며,
t는 0 내지 4의 정수를 나타내고,
X15는 (1R,3S)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (1S,3R)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (R)-4-아미노-6-메틸헵탄산, (S)-(1-피페리딘-3-일)-아세트산, (S)-3-(1-피롤리딘-2-일)-프로피온산, (S)-3-(2H-테트라졸-5-일)프로판산, (S)-피롤리딘-3-카르복실산, 5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산 및 (2S)-3-(트리아졸-1-일)-2-(아미노)프로판산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기이고,
u는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
단, 펩티드는 적어도 1개의 비천연 아미노산을 함유한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서
p는 0의 정수를 나타내고,
X1은 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P를 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
u 및 t 및 s가 모두 0인 경우에, X12의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
u 및 t가 둘 다 0이고 s가 0이 아닌 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
u가 0이고 t가 0이 아닌 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화되고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
u는 0의 정수를 나타내고,
단, 펩티드는 적어도 1개의 비천연 아미노산을 함유한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며:
(X1)q(X2)rX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(X13)s(X14)t (II)
여기서
X1은 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다.
추가의 실시양태에 따라, 본 발명은 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서
X1은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다.
추가의 실시양태에 따라, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서
X1은 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나 또는 아세틸화되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다.
특히, 본 발명은 화학식 (I)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물을 제공한다.
본 발명에 따르면, X1 내지 X14의 하기 정의는 화학식 (I)의 펩티드 및 화학식 (II)의 펩티드에 적용되고, 위치 X0 및 X15의 정의는 화학식 (I)의 펩티드에 적용된다.
본 발명에 따르면, X0은, 존재하는 경우, 본원의 정의에 따라 아미노산이 아닌 화학적 기일 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X0은 2-시아노벤조산, (1S,2S,4S)-비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일아세트산, (2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)아세트산, 2-(티오모르폴린)아세트산 ((2-티오모르폴린)아세틸), 2-(N-이소프로필-N-메틸아미노)아세트산, (S)-3-메틸발레르산 ((S)-3-메틸펜탄산), 2-(3-피리딜)아세트산, 2-(시클로헥실아미노)아세트산 (2-(시클로헥실아미노)아세틸), 2-(디에틸아미노)아세트산 (2-(디에틸아미노)아세틸), 2-(모르폴린)아세트산 (2-(모르폴린)아세틸), 2-(N-메틸-N-시클로프로필아미노)아세트산 (2-(N-메틸-N-시클로프로필아미노)아세틸), 2-(피페리딘)아세트산 (2-(피페리딘)아세틸), 2-(피롤리딘)아세트산 (2-(피롤리딘)아세틸), 2-히드록시아세트산 (2-히드록시아세틸), 2-히드록시이소부티르산 (2-히드록시이소부티르산), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-메톡시프로피온산, 4-(아미노메틸)벤조산, 4-메틸펜탄산 (4-메틸발레르산), 5-클로로티오펜-카르복실산, 1-(아미노메틸)-시클로프로필-1-카르복실산 (ACMP), 아디프산, (S)-아제티딘-2-카르복실산, 벤조산 (벤조산), 4-(3,5-디메틸-1,2-옥사졸-4-일)-L-페닐알라닌, 시클로부탄카르복실산 (시클로부탄카르복실산), 2-(시클로부틸)아세트산 (시클로부틸아세트산), 시클로부틸아세트산 (시클로부틸아세트산), 시클로헥실아세트산 (시클로헥실아세트산), 시클로헥산카르복실산 (시클로헥실카르복실산), 시클로펜탄카르복실산, 시클로펜틸아세트산 (시클로펜틸아세트산), 시클로프로판카르복실산 (시클로프로판카르복실산), 시클로프로필아세트산, D-(+)비오틴, 푸마르산, 3-페닐프로판산 (히드로신남산), 이소부티르산, 이소발레르산 (이소발레르산), L-(+)-락트산 (락트산), 페닐아세트산, 피페리딘-4-일아세트산, 피발산 (피발산), 수베르산, tert-부틸아세트산, 테트라히드로피라닐-4-아세트산, 테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산 및 트랜스-2-(3-((t-부톡시)카르보닐아미노)시클로헥실)아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X0은 2-시아노벤조산, (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산, (2-티오모르폴린)아세트산, (N-이소프로필-N-메틸아미노)아세트산, 2-(3-피리딜)아세트산, 2-(시클로헥실아미노)아세트산, 2-(디에틸아미노)아세트산, 2-(모르폴린)아세트산, 2-(피페리딘)아세트산, 2-(피롤리딘)아세트산, 3-(아미노메틸)벤조산, 4-(아미노메틸)벤조산, 1-(아미노메틸)-시클로프로필-1-카르복실산 (ACMP), 아제티딘-2-카르복실산, 벤조산, 시클로부틸아세트산, 시클로프로필아세트산, 페닐아세트산, 피페리딘-4-일아세트산, 테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산, 트라넥삼산 및 트랜스-2-(3-((t-부톡시)카르보닐아미노)시클로헥실)아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X0은 상기 정의된 바와 같은 비천연 아미노산, 2-시아노벤조산, 치환된 벤조산 또는 페닐 아세트산으로부터 선택된 화학적 기이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X0은 Hoo, ODD 또는 Ahx이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, p는 1의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, p는 0의 정수를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X1은 임의의 천연 아미노산 또는 바람직하게는 표 1에 열거된 비천연 아미노산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 A, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), (1R,3S,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵탄-3-카르복실산, L-3-브로모페닐알라닌 ((3-브로모)F), L-N,N-디메틸알라닌 ((N,N-diMe)A), N,N-디메틸글리신 ((N,N-diMe)G), N-페닐글리신 ((N-Ph)G), (R)-피페리딘-3-카르복실산, (S)-피페리딘-3-카르복실산, L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), L-2-피리딜알라닌 (2-Pal), L-3-피리딜알라닌 (3-Pal), L-4-피리딜알라닌 (4-Pal), 3-(아미노메틸)벤조산, 3-아미노-2,2-디메틸프로피온산, 3-아미노-3-메틸부티르산, 4-(아미노메틸)벤조산, L-2-아미노부티르산 (Abu), 1-아미노시클로부탄-1-카르복실산 (ACBA), 6-아미노헥산산 (Ahx), 2-아미노이소부티르산 (Aib), L-2-티에닐알라닌 (베타-2-티에닐알라닌), 베타-알라닌 (베타-A), 베타-프롤린 (베타-P), L-시트룰린 (Cit), L-2,4-디아미노부티르산 (Dab), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), 감마-아미노부티르산 (감마-Abu), L-3-메틸히스티딘 (3-Me)H), L-디히드로오로트산 (Hoo), L-노르류신 (Nle), N-메틸-L-프롤린 ((N-Me)P), L-노르발린 (Nva), L-오르니틴 (Orn), L-피페콜산 (Pip), (2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배열의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배열의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 (N-Me)A, N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 천연 아미노산 A 또는 비천연 아미노산 N-메틸-글리신 ((N-Me)G)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, p가 0이고 q가 0이 아닌 경우에, X1의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C4-알킬로 일치환 또는 이치환되고, 바람직하게는 C1-C20-알킬로 일치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 메틸화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X1은 아세틸화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 0의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 1의 정수를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X2는 I, L, M, V 및 A로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), (2S,3S)-2-[(3R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[(3S)-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산, L-메티오닌-L-술폭시드, L-메티오닌-술폰 및 L-tert-부틸글리신으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배열의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배열의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X2는 천연 아미노산 I 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), (2S,3S)-2-[(3R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일]-3-메틸펜탄산, (2S,3S)-2-[2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산 및 (2S,3S)-2-[(3S)-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X2는 천연 아미노산 I 또는 L-N-메틸이소류신 ((N-Me)I), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-노르발린 (Nva) 및 L-2-아미노부티르산 (Abu)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X2는 천연 아미노산 I를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, p 및 q가 둘 다 0이고 r이 1인 경우에, X2의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고, 바람직하게는 C1-C4-알킬로 일치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, r은 0의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, r은 1의 정수를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X3은 천연 아미노산 C 또는 L-페니실라민 (Pen) 및 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X3은 천연 아미노산 C를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, p 및 q 및 r이 모두 0인 경우에, X3의 말단 아미노 기는 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C4-알킬로 일치환 또는 이치환되고, 바람직하게는 C1-C20-알킬로 일치환된다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X4는 S, C, T, R 또는 K로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T), L-호모세린 (hSer) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X4는 S, C, T, R 및 K로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X4는 S 또는 T로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X4는 천연 아미노산 S를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X5는 천연 아미노산 R을 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X6은 S, C 또는 T로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T) 및 L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X6은 천연 아미노산 S 또는 알로-L-트레오닌 (알로-T) 및 L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X6은 천연 아미노산 S 또는 비천연 아미노산 알로-L-트레오닌 (알로-T)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X6은 천연 아미노산 S를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X7은 L, F 또는 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-4-브로모페닐알라닌 ((4-브로모)F), 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), (S)-2-(아미노)-1,6-헥산디오산 (AAD), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-2-아미노-4-시아노부티르산 (Cnba), 4-플루오로-류신 ((4-플루오로)L), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산, L-tert-부틸글리신 ((tBu)G), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌, 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌, 2-아미노-7-(tert-부톡시)-7-옥소헵탄산, 5,5,5-트리플루오로-L-류신 ((트리플루오로)L), 2-메틸-L-페닐알라닌 ((2-Me)F), L-시클로부틸알라닌 (Cba), L-시클로펜틸알라닌 (Cpa), L-시클로프로필메틸알라닌, L-트리플루오로메틸알라닌, L-디플루오로메틸알라닌, 2-플루오로-L-페닐알라닌 ((2-플루오로)F), (2S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-2-아미노프로판산, (2S)-3-(3-시아노페닐)-2-아미노프로판산, 2-아미노-5,5,5-트리플루오로-4-메틸-펜탄산, (2S)-2-아미노-5-메틸-헥산산 및 (2S)-3-(인돌-4-일)-2-(아미노)프로판산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X7은 L 및 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), L-4-브로모페닐알라닌 ((4-브로모)F), 4-플루오로-L-류신 ((4-플루오로)L), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), L-tert-부틸글리신 ((tBu)G), 5,5,5-트리플루오로-L-류신 ((트리플루오로)L), (S)-2-(아미노)-1,6-헥산디오산 (AAD), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-2-아미노-4-시아노부티르산 (Cnba), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산, (2S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-2-아미노프로판산, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌 및 2-아미노-7-(tert-부톡시)-7-옥소헵탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X7은 N 또는 L로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌 ((2,5-디플루오로)F), L-2-브로모페닐알라닌 ((2-브로모)F), 2-클로로-L-페닐알라닌 ((2-클로로)F), 4-플루오로-L-류신 ((4-플루오로)L), L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A), (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산 및 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X7은 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X7은 천연 아미노산 L을 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X8은 천연 아미노산 P 또는 L-프롤린 (3,4-2H), (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, (1R,2S,5S)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, L-히드록시프롤린 (Hyp), (3S)-모르폴린-3-카르복실산 (모르폴린-3-카르복실산), L-피페콜산 (Pip), (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P) 및 (1R,2S,5S)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X8은 천연 아미노산 P 또는 L-프롤린 (3,4-2H), (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-히드록시프롤린 (Hyp), (3S)-모르폴린-3-카르복실산 (모르폴린-3-카르복실산), L-피페콜산 (Pip) 및 (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X8은 천연 아미노산 P 또는 L-프롤린 (3,4-2H), (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산 및 (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X8은 천연 아미노산 P를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), L-히드록시프롤린 (Hyp), (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-트랜스-3-히드록시프롤린 ((3S-OH)P), (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), L-4,4-디플루오로프롤린 ((디플루오로)P), rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, L-트랜스-3-히드록시프롤린 ((3S-OH)P), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-히드록시프롤린 (Hyp), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 천연 아미노산 P 또는 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), (2S,4S)-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카르복실산 ((4-CF3)P), (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산, rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 rel-(3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X10은 천연 아미노산 I 또는 L-시클로펜틸글리신 (Cpg), L-시클로헥실글리신 (Chg), (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, 3-클로로페닐글리신 ((3-클로로-Ph)G), L-tert-부틸글리신, 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로부틸글리신, L-노르발린 (Nva) 및 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X10은 천연 아미노산 I 또는 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산, 3-클로로페닐글리신 ((3-클로로-Ph)G), (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, 알로-L-이소류신 (알로-I), L-시클로헥실글리신 (Chg), L-시클로펜틸글리신 (Cpg), L-시클로부틸글리신 및 L-노르발린 (Nva)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X10은 천연 아미노산 I 또는 (2S)-2-(아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산, (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, L-시클로헥실글리신 (Chg) 및 L-시클로펜틸글리신 (Cpg)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X10은 천연 아미노산 I를 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X11은 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X11은 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고, X11은 비천연 아미노산 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고, X11은 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고, X11은 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X12는 천연 아미노산 I 또는 알로-L-이소류신 (알로-I), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg), (2S,3S)-2-((아미노)메틸)-3-메틸펜탄산, L-페닐글리신 (Phg), 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산, 2-메틸-D-알로이소류신, L-노르발린 (Nva), L-2-아미노부티르산 (Abu), L-tert-부틸글리신 및 아미노이소부티르산 (Aib)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X12는 천연 아미노산 I 또는 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산, (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg), 알로-L-이소류신 (알로-I), L-페닐글리신 (Phg), 2-메틸-D-알로이소류신 및 (2S,3S)-2-((아미노)메틸)-3-메틸펜탄산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X12는 천연 아미노산 I 또는 알로-L-이소류신 (알로-I), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg) 및 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X12는 천연 아미노산 I를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, u 및 t 및 s가 모두 0인 경우에, X12의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화된다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있는, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X13은 P, A, S, T, G, D, E, Q 또는 N으로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, L-2-아미노부티르산 (Abu), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P), 히드록시프롤린 (Hyp), 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), (2S,4S)-4-플루오로프롤린 ((시스-4-플루오로)P), L-4,4-디플루오로프롤린 ((디플루오로)P), L-시클로펜틸글리신 (Cpg), (S)-2-아미노-2-시클로부틸아세트산 (Cbg) 및 (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배열의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배열의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X13은 P, A 및 D로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P), L-2-아미노부티르산 (Abu), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 히드록시프롤린 (Hyp) 및 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X13은 P 또는 D로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 2-아미노이소부티르산 (Aib), 2-메틸-L-프롤린 ((2-Me)P) 및 트랜스-4-플루오로프롤린 ((트랜스-4-플루오로)P)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X13은 천연 아미노산 P를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, s는 0의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, s는 1의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, u 및 t가 둘 다 0이고 s가 0이 아닌 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, t가 0이고 s가 1인 경우에, X13의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화된다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 X14는 임의의 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 임의의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D- 또는 L-입체배위로 존재할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X14는 D, E, G, K, N, P 및 Q로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 3-카르복시페닐알라닌 ((3-카르복시)F), (2S)-2-아미노-4-(벤질아미노)-4-옥소부탄카르복실산 ((N-벤질)D), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), 6-아미노헥산산 (Ahx), (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), L-오르니틴 (Orn) 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X14는 D, Q, N, E 및 P로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 3-카르복시페닐알라닌 ((3-카르복시)F), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), (2S)-피롤리딘-2-일아세트산 (베타-호모-P), L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), L-오르니틴 (Orn) 및 트라넥삼산 (트라넥삼산)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내며, 한편 L-입체배위의 각각의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산은 D-입체배위의 입체이성질체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X14는 D, Q 또는 I로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X14는 천연 아미노산 D를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X14에서의 C-말단 "-OH" 모이어티는 C-말단 "-NH2" 모이어티로 대체된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 0의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 1의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, s 및 t가 정수 1을 나타내는 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환되거나 또는 아미드화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, s 및 t가 정수 1을 나타내는 경우에, X14의 말단 카르복실 기는 비치환된다.
본 발명에 따르면, X15는 존재하는 경우에 아미노산이 아닌 화학적 기일 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X15는 -NH2, -NH-C1-C6-알킬, (1R,3S)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (1S,3R)-3-(아미노)시클로펜탄카르복실산, (R)-4-아미노-6-메틸헵탄산, (S)-(1-피페리딘-3-일)-아세트산, (S)-3-(1-피롤리딘-2-일)-프로피온산, (S)-3-(2H-테트라졸-5-일)프로판산, (S)-피롤리딘-3-카르복실산, 5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산 및 (2S)-3-(트리아졸-1-일)-2-(아미노)프로판산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 화학적 기이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, X15는 -NH2 또는 -NH-C1-C6-알킬로부터 선택된 화학적 기, 바람직하게는 -NH2이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 0의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, q는 1의 정수를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C4-알킬로 일치환 또는 이치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드의 N-말단은 비치환되거나 또는 아세틸화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, N-말단 및 C-말단은 비치환된다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 실시예 29, 44, 45, 67, 75, 109, 166, 185, 443 및 466으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 실시예 29, 44, 45, 67, 75, 109, 166, 185, 443, 466 및 499로 이루어진 군으로부터 선택된, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다.
화학식 (I) 또는 (II)의 펩티드는 선형이거나 또는 고리화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "고리화된"은 폴리펩티드 분자의 한 부분 (예를 들어 Cys, (N-Me)Cys 또는 Pen)이 폴리펩티드 분자의 또 다른 부분 (예를 들어 또 다른 Cys, (N-Me)Cys 또는 Pen)에 연결되어, 예컨대 디술피드 가교 (-S-S-) 또는 다른 유사한 결합, 예컨대 탄소-황 결합 (예를 들어 (-CH2-S-) 또는 (-(CH2)2-S-)), 황-탄소 결합 (예를 들어 (-S-CH2-) 또는 (-S-(CH2)2-)), 탄소-황-탄소 결합 (-CH2-S-CH2-) 또는 탄소-탄소 결합 (예를 들어 (-CH2-CH2-))을 형성함으로써 폐쇄 고리를 형성하는 반응을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 펩티드의 위치 X3과 X11 사이의 연결이 바람직하다. 본 발명에 따른 펩티드의 서열에서 "+"가 뒤따르는 아미노산은, 상기 아미노산이 "+"가 뒤따르는 또 다른 아미노산에 디술피드 가교에 의해 연결되어 폐쇄 고리를 형성한 시클릭 펩티드를 지칭한다. 대안적으로, 폴리펩티드 분자의 2개의 연결된 화학적 기는 연결선에 의해 도시될 수 있다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 펩티드는 고리화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화되며, 여기서 X3 및 X11은 화학식 -S-S-, -CH2-S-, -S-CH2-, -CH2-CH2-, -S-(CH2)2-, -(CH2)2-S- 또는 -CH2-S-CH2-의 링커를 통해 연결된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화되며, 여기서 X3 및 X11은 화학식 -S-S-의 디술피드 결합을 통해 연결된다.
본 발명의 펩티드는 반복 단위를 특징으로 하는 적합한 수용성 중합체로 치환될 수 있다. 적합한 중합체는 폴리알킬옥시 중합체, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리비닐 알콜, 폴리옥사졸린, 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리오르가노포스파젠, 폴리실록산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리시아노아크릴레이트 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 적어도 1개의 폴리에틸렌 기 (PEG 기)로 치환될 수 있다. 적어도 1개의 PEG 기는 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단 단부에 결합된다. PEG 기는 펩티드의 화학적 기 및/또는 아미노산의 임의의 적합한 관능기, 예를 들어 히드록실 기, 카르복실 기, 아미노 기, 티올 기, 바람직하게는 아미노 또는 카르복시 기에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 N-말단 단부에 결합된 1개의 PEG 기 또는 C-말단 단부에 결합된 1개의 PEG 기를 함유한다. 보다 바람직하게는 1개의 PEG 기는 아미드 결합을 통해 N-말단 또는 C-말단 단부에 결합된다.
펩티드의 PEG화는 1980년대 초반부터 널리 공지된 개념인 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 그의 용해도를 증진시키고/거나, 면역원성을 감소시키고/거나, 안정성을 개선시키고/거나, 반감기를 증가시킬 수 있다 (Caliceti P., Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev.2003, 55, 1261-1277). 몇몇 약물의 경우에, 이는 성공적으로 사용되어 왔지만, 다수의 예에서 PEG화는 약물 물질의 효능을 이 개념이 더 이상 적합하지 않은 범위로 감소시킨다 (T. Peleg-Shulman et al., J. Med.Chem., 2004, 47, 4897-4904).
본 발명에 따른 PEG 기는 올리고머 또는 중합체 에틸렌 옥시드를 형성하는 적어도 2개의 에틸렌 옥시드 단위를 함유하는 임의의 기이다. PEG 기는 본 발명의 펩티드에 공유 커플링되고 (PEG화), 이는 이어서 PEG화 펩티드로 지칭된다. 일반적으로, 분자에 대한 이러한 유형의 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
PEG 기는 상호연결 모이어티, 중합체 모이어티 및 말단 기로 이루어질 수 있다. 상호연결 모이어티는 -O-, -S-, N(RX), C(O), C(O)RX, C(O)N(RX), N(RX)C(O), 1개 이상의 C3-C8-시클로알킬, C3-C7-헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자 또는 관능기에 의해 임의로 개재되거나 종결된 C1-C20 알킬로 이루어질 수 있으며, 여기서 RX는 수소, 또는 말단 원자로서 수소를 추가로 갖는 상기 언급된 원자 또는 기 중 1개 이상에 의해 임의로 개재되거나 종결된 C1-C6-알킬이다. 중합체 모이어티는 -O-, -S-, N(RX), C(O), C(O)RX, C(O)N(RX), N(RX)C(O), C1-C6-알킬, C3-C8-시클로알킬, C3-C7-헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 헤테로 원자 또는 관능기에 의해 임의로 개재되거나 종결된 적어도 2개의 에틸렌 옥시드 단위로 이루어지며, 여기서 RX는 수소 또는 C1-C6-알킬이다. 말단 기는 OH, SH, N(RX)2, C(O)RX; CORX, COORX, C(O)N(RX), N(RX)C(O)NH2로부터 선택된 헤테로 원자 또는 관능기로 이루어질 수 있으며, 여기서, RX는 수소 또는 C1-C6-알킬이다. 바람직한 말단 기는 COOH 및 C(O)NH2이다.
본 발명에 따른 PEG 스페이서의 예는 1개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=1; 10개 원자)를 갖는 PEG1(10개 원자), 2개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=2; 13개 원자)를 갖는 PEG2(13개 원자), 3개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=3; 16개 원자)를 갖는 PEG3(16개 원자), 4개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=4; 19개 원자)를 갖는 PEG4(19개 원자), 5개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=5; 22개 원자)를 갖는 PEG5(22개 원자), 6개의 에틸렌 글리콜 단위 (n=6; 25개 원자)를 갖는 PEG6(25개 원자) 등을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 PEG 기는 상업적 공급업체에 의해 상이한 명칭으로 표시될 수 있으며, 이는 본 발명으로부터 상이한 명칭을 갖는 이러한 동일한 화합물을 배제하지 않을 것임을 주목한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 여기서 펩티드는 적어도 1개의 PEG 기에 의해 치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드는 1개의 PEG 기에 의해 치환된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드는 1개의 PEG 기에 의해 치환되며, 여기서 PEG 기는 바람직하게는 아미드 결합을 통해 C-말단 단부에 결합된다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드는 적어도 1개의 PEG 기에 의해 치환되며, 한편 적어도 1개 이상의 PEG 기는 화학식 (IIIa)의 기이거나:
(여기서
*는 질소 또는 산소 원자에 대한 부착을 표시하고,
D는 C1-C4-알킬렌이고,
Y는 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르복시, 카르복스아미드 또는 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n은 2 내지 15의 정수를 나타냄)
또는 하기 화학식 (IIIb)의 기이거나:
(여기서
*는 카르보닐 기에 대한 결합을 표시하고,
D1은 C1-C4-알킬렌이고,
Y1은 히드록실, 메톡시, 에톡시, 카르복시, 카르복스아미드 또는 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m은 2 내지 15의 정수를 나타냄)
또는 TTDS이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 펩티드는 적어도 1개의 PEG 기에 의해 치환되며, 한편 적어도 1개 이상의 PEG 기는 PEG1(10개 원자), PEG2(13개 원자), PEG3(16개 원자), PEG4(19개 원자), PEG4-CH2CO2H(15개 원자), PEG5(22개 원자), PEG5-CH2CO2H(18개 원자), PEG7(25개 원자), PEG8(28개 원자), PEG9(31개 원자) 및 TTDS로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 펩티드는 적어도 1개의 C8-C20 지방산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 지방산은 분지형 또는 시클릭일 수 있다. 상기 적어도 1개의 C8-C20 지방산은 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단에 결합된다. 상기 C8-C20 지방산은 펩티드의 화학적 기 및/또는 아미노산의 임의의 적합한 관능기, 예를 들어 히드록실 기, 카르복실 기, 아미노 기, 티올 기, 바람직하게는 아미노 또는 카르복시 기에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 N-말단 단부에 결합된 1개의 C8-C20 지방산 또는 C-말단 단부에 결합된 1개의 C8-C20 지방산을 함유한다. 보다 바람직하게는, 상기 1개의 C8-C20 지방산은 아미드 결합을 통해 N-말단 또는 C-말단 단부에 결합된다. 바람직하게는 X0 또는 X15에 의해 형성된 지방산 측쇄는 지방산 ＞ C8, 보다 바람직하게는 지방산 ≥ C12, 보다 바람직하게는 지방산 ≥ C14이다. X0 또는 X15에 의해 형성된 지방산 측쇄가 C12-C18 지방산, 바람직하게는 C12-C16 지방산, 또는 C14-C18 지방산, 또는 C14-C16 지방산인 것이 추가로 바람직하다. C16 지방산, 예컨대 팔미트산 (팔미토일, Palm) 및 C18 지방산, 예컨대 1,18-옥타데칸디오산 (ODD)이 가장 바람직하다.
추가로, N-말단 또는 C-말단에서의 모이어티는 특히 아미노 말단 또는 카르복시 말단이 링커 또는 또 다른 화학적 모이어티에 결합되는 상황에서 결합, 예를 들어 공유 결합일 수 있는 것으로 이해된다.
화학적 기, 비천연 아미노산 또는 모이어티는 표 3에 제시된 바와 같이 본원에서 약칭될 수 있다.
표 3: 서열에서 화학적 기, 비천연 아미노산 또는 추가의 모이어티에 대해 사용된 약어/표현 및 명명법
본 발명의 화학식 (I) 또는 화학식 (II)에 따른 펩티드의 몇몇 잔기의 정의에서 일부 아미노산과 관련하여 사용된 용어 "모방체"는 예를 들어 아르기닌 모방체, 이소류신 모방체 또는 프롤린 모방체와 같은 각각의 아미노산 모방체를 나타낸다. 일반적으로, "단백질 모방체"는 일부 다른 단백질의 작용 또는 활성을 생물학적으로 모방하는 분자, 예컨대 펩티드, 변형된 펩티드 또는 임의의 다른 분자를 나타낸다. 특정 아미노산과 관련된 용어 "모방체"의 사용과 관련하여, 상기 용어 "모방체"는 유사하게 각각의 아미노산의 작용 또는 활성을 생물학적으로 모방하는 임의의 다른 아미노산, 아미노산 유사체, 아미노산 유도체, 아미노산 접합체 등을 나타낸다.
본 발명에 따른 프롤린 모방체는 특히 (1S,2S,5R)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, Hyp, 모르폴린-3-카르복실산, Pip, (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산 또는 (트랜스-4-플루오로)P, (1R,2S,5S)-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산, Oic, Hyp, (4-CF3)P, (시스-4-플루오로)P, 3,3-디메틸-1,3-아자실롤리딘-5-카르복실산, (3S-OH)P, (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산, rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산, (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산 또는 디플루오로프롤린, (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1), (3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 2) 및 치환된 프롤린을 포함한다.
본 발명에 따른 이소류신 모방체는 특히 (N-메틸)-I, 알로-Ile, Cba, Nva, Abu, Leu, Cpg, 시클로헥실-Gly, (S)-2-아미노-3-에틸-펜탄산, 3-클로로-Phg, 알로-Ile, Chg, 시클로부틸글리신, 알로-Ile, Cbg, (2S,3S)-2-((아미노)메틸)-3-메틸펜탄산, Phg, 2-[(1S,2S)-1-(아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산, 2-메틸-D-알로이소류신, Nva, Abu 또는 Ala를 포함한다.
본 발명에 따른 류신 모방체는 특히 (tBu)A, (2-클로로)F, (2-브로모)F, AAD, (2S)-2-아미노-4,4,4-트리플루오로부탄산, Cnba, (4-플루오로)L, (S)-(트리플루오로메틸)-L-시스테인, (2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산, Gly (tBu), 3-(트리메틸실릴)-L-알라닌, 2,5-디플루오로-L-페닐알라닌, 2-아미노-7-(tert-부톡시)-7-옥소헵탄산, 5,5,5-트리플루오로-L-류신 ((트리플루오로)L), (2-Me)F, Cba, Cpa, 시클로프로필메틸알라닌, 트리플루오로메틸알라닌 또는 디플루오로메틸알라닌, (2-플루오로)F, (2S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-2-아미노프로판산, (2S)-3-(3-시아노페닐)-2-아미노프로판산, 2-아미노-5,5,5-트리플루오로-4-메틸-펜탄산, (2S)-2-아미노-5-메틸-헥산산 또는 (2S)-3-(인돌-4-일)-2-(아미노)프로판산을 포함한다.
본 발명은 상기 기재된 펩티드의 유사체 및 유도체를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 아미노산 서열의 "유사체" 또는 "유도체"라는 용어는 특히 상기 서열에 대해 적어도 80% 또는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성 및 동일하거나 유사한 특성 또는 활성을 갖는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 동일성은 통상의 기술, 예컨대 시각적 비교에 의해 또는 관련 기술분야에서 일반적으로 사용되는 임의의 컴퓨터 도구에 의해 결정될 수 있다. 예는 디폴트 파라미터와 함께 사용되는 BLAST 프로그램을 포함한다.
본 발명의 펩티드 또는 아미노산 서열의 유사체 또는 유도체는 1개 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입 또는 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 본 발명의 펩티드의 서열에서의 돌연변이 또는 변이, 또는 심지어 선택적 스플라이싱으로부터 유래된 변화로부터 생성될 수 있다. 이들 변형 중 몇몇은 조합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 아미노산 서열의 유사체는 아미노산의 서열에 관해 보존적 치환을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 1개 이상의 아미노산이 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 대체된 것을 나타낸다. 예는 유사한 특징을 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 소형 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향족 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 보존적 치환을 물리화학적 특성에 의해 그룹화한 하기 표 4의 분류표를 참조한다. I: 중성, 친수성; II: 산 및 아미드; III: 염기성; IV: 소수성; V: 방향족 거대 아미노산, VI: 중성 또는 소수성; VII: 산성; VIII: 극성.
표 4: 그의 물리화학적 특성에 따라 분류된 아미노산
펩티드 유사체 또는 유도체는 또한 예를 들어 또 다른 화합물과 접합하여 아미노산 접합체를 형성하는 것과 같은 1개 이상의 추가의 변형을 포함할 수 있다.
이러한 변형은, 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 펩티드 내의 1개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 화학적 기 X0과 관련하여 상기 정의된 바와 같은 화학적 기 또는 중합체 모이어티, 예컨대 PEG 기의 측쇄에의 접합으로부터 발생할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 펩티드의 생체내 (예를 들어 혈장 중) 용해도 및/또는 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킬 수 있고, 또한 치료 단백질 및 펩티드의 클리어런스 (예를 들어 신장 클리어런스)를 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 적합한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 특히 본 발명의 펩티드의 1개 이상의 측쇄의 PEG화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 여기서, "PEG화"는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 구조를 본 발명의 펩티드에 (예를 들어, 공유적으로) 커플링시키는 작용을 나타낸다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 접합체를 형성하기 위해 소형 펩티드의 아미노산 측쇄에 커플링시키기 위한 가능한 PEG를, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2015/200916 A1로부터 잘 알고 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 모든 펩티드는 TFA 염이다. 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 펩티드의 추가의 제약상 허용되는 염 및 염 유리 형태를 포함한다. 여기서, 제약상 허용되는 염은, 과도한 독성, 자극 및 알레르기 반응 없이 질환의 치료에 적합하고 합리적인 이익/위험 비에 상응하며 그의 의도된 용도에 효과적인, 수용성 또는 유용성 또는 수분산성 또는 유분산성인 본 발명의 펩티드 또는 화합물의 염 또는 쯔비터이온 형태를 나타낸다. 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 또는 아미노 기를 적합한 산과 반응시킴으로써 개별적으로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 카르보네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트 (이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌술포네이트, 메탄술포네이트, 나프틸렌술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로프리오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보네이트, 파라-톨루엔술포네이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 바람직한 산 부가염은 트리플루오로아세테이트, 포르메이트, 히드로클로라이드 및 아세테이트를 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물 중 아미노 기는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 및 벤질 및 페네틸 브로마이드로 4급화될 수 있다. 치료상 허용되는 부가염을 형성하는데 사용될 수 있는 산의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산 및 인산, 및 유기 산, 예컨대 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산을 포함한다. 제약상 허용되는 염은 적합하게는, 예를 들어 산 부가염 및 염기성 염 중에서 선택된 염일 수 있다. 산 부가염의 예는 클로라이드 염, 시트레이트 염 및 아세테이트 염을 포함한다.
염기성 염의 예는 양이온이 알칼리 금속 양이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 이온, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 이온, 뿐만 아니라 치환된 암모늄 이온, 예컨대 유형 N(R1)(R2)(R3)(R4)+의 이온으로부터 선택된 염을 포함하며, 여기서 R1, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 전형적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬 또는 임의로 치환된 C2-6-알케닐을 나타낼 것이다. 관련된 C1-6-알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필 및 2-프로필 기를 포함한다. 관련된 가능한 C2-6-알케닐 기의 예는 에테닐, 1-프로페닐 및 2-프로페닐을 포함한다. 여기서, 양이온이 나트륨, 칼륨 및 칼슘 중에서 선택된 염이 바람직하다.
제약상 허용되는 염의 다른 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (및 그의 보다 최신판)], ["Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007]에 기재되어 있다. 또한, 적합한 염에 대한 검토를 위해, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth Wiley-VCH, 2002)]을 참조한다. 다른 적합한 염기 염은 비-독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 대표적인 예는 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글리신, 리신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민 및 아연 염, 바람직하게는 콜린을 포함한다. 산 및 염기의 헤미염, 예를 들어 헤미술페이트 및 헤미칼슘 염이 또한 형성될 수 있다.
본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 펩티드의 용매화물을 추가로 포함한다. 본원에서 용어 "용매화물"은 용질 (예를 들어, 본 발명에 따른 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염)과 용매 사이에 형성된 규정된 화학량론의 복합체를 지칭한다. 이와 관련하여 용매는, 예를 들어 물, 에탄올 또는 또 다른 제약상 허용되는, 전형적으로 소분자 유기 종, 예컨대 비제한적으로, 아세트산 또는 락트산일 수 있다. 해당 용매가 물인 경우에, 이러한 용매화물은 통상적으로 수화물로 지칭된다.
본 발명에 따른 화합물은 유용한 약리학적 특성을 가지며, 인간 및 동물에서 장애의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 질환, 병태, 장애, 손상 또는 건강 장애, 이러한 상태 및/또는 이러한 상태의 증상의 발병, 경과 또는 진행의 억제, 지연, 저지, 호전, 감쇠, 제한, 감소, 저해, 역전 또는 치유를 포함한다. 여기서, 용어 "요법"은 용어 "치료"와 동의어인 것으로 이해된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "예방", "방지" 또는 "예방조치"는 동의어로 사용되며, 질환, 병태, 장애, 손상 또는 건강 장애, 이러한 상태 및/또는 이러한 상태의 증상의 발병 또는 진행을 얻거나, 이에 걸리거나, 이를 앓거나 또는 이를 가질 위험의 회피 또는 감소를 지칭한다.
질환, 병태, 장애, 손상 또는 건강 장애의 치료 또는 예방은 부분적으로 또는 완전히 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 심혈관, 심폐, 신장, 폐, 섬유화, 혈전색전성 및 염증성 장애의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 심혈관 및 심폐 장애 및 그의 후유증, 예컨대, 예를 들어 염증성 심장 질환, 심근염, 심내막염, 심막염, 심장 침범을 수반하지 않은 및 수반한 류마티스성 열, 급성 류마티스성 심막염, 급성 류마티스성 심내막염, 급성 류마티스성 심근염, 심내막염을 수반한 및 수반하지 않은 만성 류마티스성 심장 질환, 판막염, 심막염, 허혈성 심장 질환, 예컨대 불안정형 협심증 및 급성 심근경색, 심방성 및 심실성 부정맥 및 전도 장애, 예컨대, 예를 들어 등급 I-III 방실 차단, 심실상성 부정빈맥, 심방 세동, 심방 조동, 심실 세동, 심실 조동, 심실성 부정빈맥, 토르사드 드 포인트 빈맥, 심방성 및 심실성 기외수축, AV-접합부 기외수축, 동기능 부전 증후군, 뇌 동맥의 폐쇄 및 협착으로 인한 졸중 (예를 들어 혈전색전성, 아테롬성동맥경화성, 감염성 및 염증성 혈관 병변 후의 뇌경색)의 치료 및/또는 예방, 뇌내 또는 두개내 출혈로 인한 졸중, 동맥, 세동맥 및 모세혈관의 질환 (예를 들어 혈전색전성, 아테롬성동맥경화성, 감염성 및 염증성 혈관 병변, 변형성 또는 폐쇄성 동맥내막염 및 동맥류 박리)으로 인한 말초 허혈성 조직 손상 (예를 들어 아테롬성동맥경화성 괴저), 정맥염 및 혈전정맥염의 치료 및/또는 예방, 순환계의 시술후 장애, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군, 수술 후 혈관마비, 심장절개후 증후군, 시술후 저혈압 및 심부전의 예방, 예를 들어 혈전용해 요법, 경피 경관 혈관성형술 (PTA), 경피 경관 관상 동맥성형술 (PTCA), 우회로 수술 및 심장, 폐, 간 및 신장 이식 후의 허혈 재관류 손상 및 기관 기능장애의 예방 및 치료, 및 신장 이식 후의 이식편 기능 지연의 예방 및 치료를 위한 의약에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 MASP 매개 말단 기관 손상을 예방함으로써 쇼크, 예컨대 심인성 쇼크, 패혈성 쇼크 및 아나필락시스성 쇼크의 치료에 적합하다.
더욱이, 본 발명에 따른 화합물은 항염증 작용을 가지며, 따라서 패혈증 (SIRS), 다발성 기관 부전 (MODS, MOF), 신장의 염증성 장애, 만성 장 염증 (IBD, 크론병, UC), 췌장염, 복막염, 류마티스 장애, 염증성 피부 장애 및 염증성 안장애의 치료 및/또는 예방을 위한 항염증제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 그의 활성 프로파일로 인해, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증 및 전신 염증 반응 증후군의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 소생술 및 외과적 개입, 예컨대 비제한적으로, 우회로 수술, 심장 판막 수술 및 대동맥류 수술과 관련하여 심장 및 신장 및 다른 기관에 대한 허혈 및/또는 재관류-관련 손상의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 추가로 또한, 기관 또는 조직에 대한 허혈성 및/또는 재관류-관련 손상을 예방하기 위해, 또한 인간 또는 동물 기원의 기관, 기관 부분, 조직 또는 조직 부분의 관류 및 보존 용액을 위한 첨가제로서 특히 외과적 개입을 위해 또는 이식 의약의 분야에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 후천성 용혈성 빈혈, 용혈성-요독성 증후군, 발작성 야간 혈색소뇨증 [마르키아파바-미켈리(Marchiafava-Micheli)], 응고 결함, 자반증 및 다른 출혈성 상태, 파종성 혈관내 응고 [탈섬유소 증후군], 본태성 (출혈성) 혈소판혈증, 전격성 자반증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 알레르기성 자반증, 알레르기성 혈관염, 림프구감소증 및 과립구증, 및 사르코이드증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 당뇨병의 후유증, 예컨대 당뇨병의 신장 합병증, 당뇨병성 신병증, 모세관내 사구체신증, 당뇨병의 안과 합병증, 당뇨병성 망막병증, 신경계 합병증, 당뇨병성 다발신경병증 및 순환계 합병증, 예컨대 미세혈관병증 및 괴저의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 신경계의 염증성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 수막염 및 뇌염, 박테리아성 및 바이러스성 수막염 및 뇌염, 면역화후 뇌염, 염증성 다발신경병증, 및 감염성 및 기생충성 질환에서의 다발신경병증의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 눈 및 그의 부속기의 질환, 예컨대 급성 및 아급성 홍채모양체염, 맥락막 변성, 맥락망막 염증, 감염성 및 기생충성 질환에서의 맥락망막 염증, 배경 망막병증 및 망막 혈관 변화, 증식성 망막병증, 황반 및 후극의 변성, 말초 망막 변성, 연령-관련 황반 변성 (AMD) (건성 (비-삼출성) 및 습성 (삼출성, 신생혈관성) AMD 포함), 맥락막 신생혈관화 (CNV), 맥락막 신생혈관막 (CNVM), 낭포양 황반 부종 (CME), 망막전막 (ERM) 및 황반 천공, 근시-연관 맥락막 신생혈관화, 혈관양 및 혈관 선조, 망막 박리, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막 색소 상피에서의 위축성 및 비대성 병변, 망막 정맥 폐쇄, 맥락막 망막 정맥 폐쇄, 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄와 연관된 황반 부종, 눈 및 부속기의 시술후 장애, 예를 들어 백내장 수술 후의 각막병증의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 호흡기계의 질환, 예컨대 비제한적으로, 바이러스, 박테리아 및 진균성 폐렴, 방사선 폐장염, 진폐증, 알레르기성 폐포염, 특정 유기물 먼지에 의한 기도 질환, 예를 들어 농부 폐, 기관지염, 화학물질, 기체, 흄 및 증기로 인한 폐장염 및 폐 부종, 약물-유발 간질성 폐 장애, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 급성 폐 손상 (ALI), 폐의 급성 부종, 섬유증을 동반한 간질성 폐 질환, 류마티스 폐 질환, 다른 미만성 결합 조직 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 경피증 및 베게너 육아종증에서의 호흡기 장애의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
추가로, 본 발명에 따른 화합물은 바이러스 감염, 예컨대 비제한적으로, 인플루엔자 바이러스 (예를 들어 혈청형 H1N1, H5N1, H7N9의 균주에 의해 유발됨), 및 코로나 바이러스 (예를 들어 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)의 병원체인 SARS-CoV, 중동 호흡기 증후군 (MERS)의 병원체인 MERS-CoV, 및 COVID-19 범유행성 병원체인 SARS-CoV-2)에 의해 유발된 미세혈관 손상, 혈전증 및 연속적 혈전색전성 사건의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 소화기계 질환, 예컨대 비제한적으로, 비감염성 장염 및 결장염, 예컨대 크론병 및 궤양성 결장염, 췌장염 (급성 알콜- 및 약물 유발 췌장염 포함), 담낭염, 염증성 간 질환, 간신증후군, 예를 들어 간 수술 후의 간의 시술후 장애의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 그의 활성 프로파일로 인해, 비뇨생식기계의 질환, 예컨대 비제한적으로, 급성 신부전, 급성 신장 손상 (AKI), 수술 연관 AKI, 패혈증 연관 AKI, 조영제 및 화학요법 유발 AKI, 신장의 허혈 및 경색, 혈액투석 및 혈액투석여과와 관련된 합병증, 예컨대 과민증, 방광염, 방사선방광염, 전립선의 염증성 질환 및 자궁내막증의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 화상 및 손상의 후유증, 예컨대 비제한적으로, 외상의 초기 합병증, 외상성 무뇨증, 압궤 증후군, 압궤후 신부전, 외상성 근육 허혈, 외상성 뇌 손상, 전류, 방사선 및 극단적 주위 기온 및 압력에의 노출 후, 연기, 불 및 불꽃에 노출 후, 독액성 동물 및 식물과의 접촉 후 기관 손상의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 그의 활성 프로파일로 인해, 또한 염증성 피부 질환, 예를 들어 피부 홍반성 루푸스, 수포성 장애 및 극세포해리 피부 질환, 예컨대 천포창 하위유형, 구진설 장애, 예컨대 건선, 피부염 및 습진, 두드러기 및 홍반의 치료에 적합하다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 MASP-연관 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 MASP-연관 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 이는 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제제로서 작용하고/거나 C3 침착을 억제한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 비뇨생식기계의 질환, 예컨대 비제한적으로, 급성 신부전, 급성 신장 손상 (AKI), 수술 연관 AKI, 패혈증 연관 AKI, 조영제 및 화학요법 유발 AKI, 신장의 허혈 및 경색, 혈액투석 및 혈액투석여과와 관련된 합병증, 예컨대 과민증, 방광염, 방사선방광염, 전립선의 염증성 질환 및 자궁내막증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 정의된 바와 같은 MASP-연관 장애의 치료 또는 개선을 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 상기 정의된 바와 같은 복합체 또는 제약 조성물을 투여함으로써 상기 대상체 또는 환자에서 상기 정의된 바와 같은 MASP-연관 장애를 치료하거나 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "환자", "대상체" 또는 "개체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 이들 용어는 포유동물, 예컨대 인간, 영장류, 가축 동물 (예를 들어, 소, 돼지), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 가축 등을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 상기 정의된 바와 같은 복합체는 환자 또는 대상체에게 치료 유효량으로 투여되며, 여기서 본 발명의 화합물의 "치료 유효량"은 본원에 정의된 바와 같은 MASP-연관 장애를 치료하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 기재하는 것으로 의도된다. 특정한 실시양태에서, 치료 유효량은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 목적하는 이익/위험 비를 달성할 것이다.
본 발명은 특히 하기 실시양태를 포함하며, 여기서 하기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)에 따른 펩티드의 치환기 또는 모이어티는 독립적으로 하기 기재된 바와 같은 의미를 가질 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 펩티드를 함유하는 화합물, 또는 그의 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 복합체 또는 제약 조성물 (하기 정의된 바와 같음)은 하기에서 통상적으로 또한 "본 발명의 MASP 억제성 펩티드"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 MASP-1 및/또는 MASP-2, 예를 들어 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는 특이적 결합제가 샘플 내의 다른 작용제보다 주어진 리간드와 우선적으로 상호작용하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 리간드에 특이적으로 결합하는 특이적 결합제는, 적합한 조건 하에, 샘플 내 다른 성분과의 임의의 비특이적 상호작용의 양 또는 정도보다 더 관찰가능한 양 또는 정도로 주어진 리간드에 결합한다. 적합한 조건은 주어진 특이 결합제와 주어진 리간드 사이의 상호작용을 허용하는 조건이다. 이들 조건은 pH, 온도, 농도, 용매, 인큐베이션 시간 등을 포함하며, 주어진 특이적 결합제 및 리간드 쌍에 따라 상이할 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물 (예를 들어 본원에 제공된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물 중 어느 1종)보다 더 큰 특이성으로 MASP-1 및/또는 MASP-2에 결합한다.
따라서, 본 발명은 추가로 MASP-1 또는 MASP-2에 결합된, 본원에 정의된 1종 이상의 펩티드 또는 펩티드를 함유하는 화합물, 유도체 또는 유사체를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 높은, MASP-1 및/또는 MASP-2, 특히 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 특이적 결합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5배 또는 적어도 약 10, 20, 50 또는 100배 더 높은, MASP-1 및/또는 MASP-2, 특히 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 특이적 결합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 높은, MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5배 또는 적어도 약 10, 20, 50, 100 또는 1000배 더 높은, MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 MASP-1 및/또는 MASP-2 (예를 들어, 래트 또는 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2) 활성의 억제를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 활성은 시험관내 또는 생체내 활성, 예를 들어 본원에 기재된 시험관내 또는 생체내 활성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물에 의해 억제된 MASP-1 및/또는 MASP-2 활성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000%를 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 또는 200배 더 큰 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제를 나타낸다.
추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 MASP 억제성 펩티드의 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제 활성은 MASP-1 및/또는 MASP-2 (예를 들어, 래트 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2)에 대한 그의 IC50의 측정에 의해 결정된다. MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 IC50의 결정은 본원에 제시된 생화학적 검정으로 수행될 수 있다. 본 발명의 MASP 억제성 펩티드가 ＜ 1,000 nM, 바람직하게는 ≤ 500 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 300 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 250 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 200 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 150 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 75 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 50 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 45 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 40 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 35 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 30 nM의 MASP-1 및/또는 MASP-2에 대한 IC50을 나타내는 것이 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물과 비교하여 MASP-1 및/또는 MASP-2 (예를 들어, 래트 또는 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2)에 대해 더 낮은 IC50 (즉, 더 높은 결합 친화도)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 MASP 억제성 펩티드는 MASP-1 및/또는 MASP-2 경쟁적 결합 검정에서 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물의 IC50보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 낮은 IC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물의 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2 활성의 시험관내 억제에 비해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 큰 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2 활성의 시험관내 억제를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물의 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2 활성의 생체내 억제에 비해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 큰 인간 MASP-1 및/또는 MASP-2 활성의 생체내 억제를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 실시양태에서, "MASP-1 및/또는 MASP-2 억제 활성"을 갖는 MASP 억제성 펩티드는, 화합물이 (예를 들어, 비경구 경로에 의해, 예를 들어 주사에 의해 또는 폐, 비강, 설하, 설측, 협측, 피부, 경피, 결막, 시신경 경로에 의해 또는 경구로 투여되는 이식물 또는 스텐트로서) 투여되는 경우에, 시험관내에서 또는 대상체 (예를 들어, 마우스 또는 인간)에서 C3 침착을 용량-의존성 및 시간-의존성 방식으로 억제하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 C3 침착 (예를 들어, 인간 C3 침착)의 억제를 나타낸다. 일부 실시양태에서, C3 침착의 억제는 시험관내 또는 생체내 억제에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물에 의해 억제된 C3 침착의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000%를 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물보다 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 또는 200배 더 큰 C3 침착 억제를 나타낸다.
추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 MASP 억제성 펩티드의 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제 활성은 시험관내 또는 대상체 (예를 들어 마우스 또는 인간)에서 C3 침착의 억제에 대한 그의 IC50의 측정에 의해 결정된다. C3-침착에 대한 IC50의 결정은 본원에 제시된 C3 인간 침착 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 MASP 억제성 펩티드가 ＜ 1,000 nM, 바람직하게는 ≤ 500 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 300 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 250 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 200 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 150 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 75 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 50 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 45 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 40 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 35 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 30 nM의 C3 침착에 대한 IC50을 나타내는 것이 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물의 시험관내 C3-침착의 억제에 비해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과, 100%, 200% 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 큰 시험관내 C3-침착의 억제를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 선택된 MASP 억제성 펩티드 참조 화합물의 생체내 C3-침착의 억제에 비해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과, 100%, 200% 300%, 400%, 500%, 700%, 1000% 또는 10000% 더 큰 생체내 C3-침착의 억제를 나타낸다.
본 발명에 따른 펩티드는 MASP 억제성 펩티드로서 작용하며, 그의 활성은 본 발명의 실시예에 따른 구체적 검정 및/또는 생체내 연구 중 적어도 하나에 따라 결정되는 것이 특히 바람직하다.
이들의 상기 언급된 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제 활성 및 C3-침착의 억제 활성으로 인해, 본 발명의 펩티드 함유 화합물 또는 펩티드 (그의 유사체, 유도체 및 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 뿐만 아니라 상기 언급된 복합체 포함)는 MASP-1 및/또는 MASP-2-연관 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기에 적합하다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제공하며, 이는 MASP-1 및/또는 MASP-2 억제제로서 작용하고/거나 C3 침착을 억제한다.
본 발명에 따른 화합물은 단독으로 또는 필요한 경우에 다른 활성 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 특히 상기 언급된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 적어도 1종의 화합물 및 1종 이상의 추가의 활성 화합물을 함유하는 의약에 관한 것이다. 적합한 조합 활성 화합물로서, 본 발명자들은 예를 들어 및 바람직하게는 하기를 언급할 수 있다:
· 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP) 및/또는 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)의 분해를 억제하는 화합물, 예를 들어 포스포디에스테라제 (PDE) 1, 2, 3, 4 및/또는 5의 억제제, 특히 PDE 4 억제제, 예컨대 로플루밀라스트 또는 레바밀라스트 및 PDE 5 억제제, 예컨대 실데나필, 바르데나필, 타달라필, 우데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필 또는 로데나필;
· 구아닐레이트 시클라제의 NO-비의존성이나 헴-의존성인 자극제, 특히 리오시구아트, 넬로시구아트, 베리시구아트 및 WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301, WO 03/095451, WO 2011/147809, WO 2012/004258, WO 2012/028647 및 WO 2012/059549에 기재된 화합물;
· 구아닐레이트 시클라제의 NO-비의존성 및 헴-비의존성 활성화제, 특히 룬카시구아트, BI 703704 및 WO 2012/139888, WO 2001/019780 및 WO 2014/012934에 기재된 화합물;
· 프로스타시클린 유사체 및 IP 수용체 효능제, 예를 들어 및 바람직하게는 일로프로스트, 베라프로스트, 트레프로스티닐, 에포프로스테놀, NS-304, 셀렉시팍 또는 랄리네팍;
· 엔도텔린 수용체 길항제, 예를 들어 및 바람직하게는 보센탄, 다루센탄, 암브리센탄, 마시센탄 또는 시탁센탄;
· 바소프레신 수용체 길항제, 예를 들어 톨밥탄, 코니밥탄, 렐코밥탄;
· 인간 호중구 엘라스타제 (HNE) 억제제, 예를 들어 및 바람직하게는 시베레스타트 또는 DX-890 (렐트란(Reltran));
· 신호 전달 캐스케이드를 억제하는 화합물, 특히 티로신 키나제 억제제의 군으로부터의 것, 예를 들어 및 바람직하게는 다사티닙, 닐로티닙, 보수티닙, 레고라페닙, 소라페닙, 수니티닙, 세디라닙, 악시티닙, 텔라티닙, 이마티닙, 브리바닙, 파조파닙, 바탈라닙, 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 카네르티닙, 레스타우르티닙, 펠리티닙, 세막사닙, 마시티닙 또는 탄두티닙;
· ASK1 키나제 억제제의 군으로부터의 신호 전달 조정제, 예를 들어 세론세르팁;
· Rho 키나제 억제제, 예를 들어 및 바람직하게는 파수딜, Y-27632, SLx-2119, BF-66851, BF-66852, BF-66853, KI-23095 또는 BA-1049;
· 혈관벽 투과성 (부종 형성)을 감소시키는 활성 성분, 예를 들어 그리고 바람직하게는 ALK1-Smad1/5 신호절달 경로의 억제제, VEGF 및/또는 PDGF 신호전달 경로의 억제제, 시클로옥시게나제 억제제, 칼리크레인-키닌 계의 억제제 또는 스핑고신-1-포스페이트 신호전달 경로의 억제제;
· 코르티코스테로이드, 예를 들어 코르티손, 코르티솔, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론 또는 덱사메타손;
· 산화성 스트레스 하의 기관에 대한 손상을 감소시키는 활성 성분, 예로서 및 바람직하게는 보체계의 억제제, 특히 보체 C5a 수용체의 길항제, 항 C5 항체 또는 5-HT1A 수용체의 효능제;
· 전사 인자 Nrf2의 조정제, 자극제 및 증진제, 예를 들어 CXA-10, 올티프라즈(Oltipraz), 디메틸 푸마레이트 또는 바르독솔론;
· 아드레노메둘린 및 아드레노메둘린 유도체, 예를 들어 PEG화 아드레노메둘린 및 아드레노메둘린 안정화제, 예를 들어 아드레시주맙;
· 저산소증 유도성 인자 프롤릴 히드록실라제를 억제하는 화합물 (HIF-PH 억제제), 예를 들어 몰리두스타트, 바다두스타트, 록사두스타트, 다프로두스타트 또는 데시두스타트;
· 세포 사멸의 유도 및 아폽토시스 경로를 억제하는 화합물, 예를 들어 QPI-1002;
· c-Met 효능제 및 간세포 성장 인자 모방체, 예를 들어 레파날린;
· 알칼리성 포스파타제 및 재조합 알칼리성 포스파타제;
· 염증 반응 및 T 세포 증식을 억제하는 화합물, 예를 들어 CD28 길항성 화합물, 예컨대 렐테시모드;
· Th17 T 세포의 활성화를 조정하는 화합물, 예를 들어 RORc/ROR-감마 전사 인자의 조정제;
· Th17 T 세포 반응을 길항하는 화합물, 예를 들어 항 IL-17 및 항 IL-23 항체, 예를 들어 익세키주맙, 세쿠키누맙, 브로달루맙, 우스테키누맙, 구셀쿠맙 또는 PTG-200;
· 항혈전제, 예를 들어 및 바람직하게는 혈소판 응집 억제제, 항응고제 또는 전섬유소용해 물질의 군으로부터의 항혈전제;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 혈소판 응집 억제제, 예를 들어 및 바람직하게는 아스피린, 클로피도그렐, 티클로피딘 또는 디피리다몰과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 트롬빈 억제제, 예를 들어 및 바람직하게는 크시멜라가트란, 멜라가트란, 다비가트란, 비발리루딘 또는 크렉산과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 GPIIb/IIIa 길항제, 예를 들어 및 바람직하게는 티로피반 또는 압식시맙과 조합되어 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 인자 Xa 억제제, 예를 들어 및 바람직하게는 리바록사반, 아픽사반, 피덱사반, 라작사반, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, DU-176b, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 또는 SSR-128428과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 헤파린 또는 저분자량 (LMW) 헤파린 유도체와 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 응고 인자 XI의 직접 억제제, 응고 인자 XI 발현의 억제제 및 항응고 인자 XI 항체, 예컨대 크시소맙 3G3과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 미네랄로코르티코이드-수용체 길항제, 예를 들어 및 바람직하게는 스피로노락톤, 에플레레논 또는 피네레논과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 이뇨제, 예를 들어 및 바람직하게는 푸로세미드, 부메타니드, 토르세미드, 벤드로플루메티아지드, 클로르티아지드, 히드로클로르티아지드, 히드로플루메티아지드, 메티클로티아지드, 폴리티아지드, 트리클로르메티아지드, 클로르탈리돈, 인다파미드, 메톨라존, 퀴네타존, 아세타졸아미드, 디클로르페나미드, 메타졸아미드, 글리세롤, 이소소르비드, 만니톨, 아밀로리드 또는 트리암테렌과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 PPAR-감마 효능제, 예를 들어 및 바람직하게는 피오글리타존 또는 로시글리타존과 조합하여 투여된다;
· 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 PPAR-델타 효능제, 예를 들어 및 바람직하게는 GW 501516 또는 BAY 68-5042와 조합하여 투여된다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을, 포스포디에스테라제의 억제제, 구아닐레이트 시클라제의 자극제 또는 활성화제, IP 수용체 효능제, 미네랄로코르티코이드-수용체 길항제, 이뇨제, PPAR-감마 효능제, PPAR-델타 효능제, 코르티코스테로이드, 산화성 스트레스 하의 기관에 대한 손상을 감소시키는 활성 성분, 세포 사멸의 유도 및 아폽토시스 경로를 억제하는 화합물, 염증 반응 및 T 세포 증식을 억제하는 화합물, 항혈전제, 혈소판 응집 억제제, 트롬빈 억제제, GPIIb/IIIa 길항제, 인자 Xa 억제제, 헤파린 또는 저분자량 (LMW) 헤파린 유도체 및 응고 인자 XI의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 활성 성분과 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 상기 정의된 바와 같은 복합체 또는 제약 조성물, 및 시약, 의료 장치, 지침서 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 1종을 포함하는 부분품-키트(kit-of-parts) 조합물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 상기 정의된 바와 같은 복합체 또는 제약 조성물을 포함하는, 대상체에게 상기 펩티드, 유도체, 유사체 또는 그의 복합체 또는 제약 조성물을 전달하기 위한 의료 장치에 관한 것이다.
상기 정의된 바와 같은 제약 조성물, 부분품-키트 조합물 또는 의료 장치는 특히 본원에 정의된 바와 같은 장애 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 전신 및/또는 국부 활성을 가질 수 있다. 이를 위해, 이들은 적합한 방식으로, 예컨대, 예를 들어 경구, 비경구, 폐, 코, 설하, 설측, 협측, 직장, 질, 피부, 경피, 결막, 귀 경로를 통해, 또는 이식물 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.
이들 투여 경로의 경우, 본 발명에 따른 화합물은 적합한 투여 형태로 투여될 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 화합물을 신속하게 및/또는 변형된 방식으로 전달하는 관련 기술분야에 공지된 투여 형태, 예컨대, 예를 들어 정제 (비코팅되거나 또는 예를 들어 지연 용해되거나 불용성인 장용 또는 제어 방출 코팅으로 코팅된 정제), 경구-붕해 정제, 필름/웨이퍼, 필름/동결건조물, 캡슐 (예를 들어 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐), 당-코팅된 정제, 과립, 펠릿, 분말, 에멀젼, 현탁액, 에어로졸 또는 용액으로 본 발명에 따른 화합물을 제제화할 수 있다. 결정질 및/또는 무정형 및/또는 용해된 형태인 본 발명에 따른 화합물을 상기 투여 형태 내로 혼입시키는 것이 가능하다.
비경구 투여는 흡수 단계를 회피하면서 (예를 들어 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수내 또는 요추내) 또는 흡수를 포함하면서 (예를 들어 근육내, 피하, 피내, 경피 또는 복강내, 안내) 실시될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태는, 특히, 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물 또는 멸균 분말 형태의 주사 및 주입을 위한 제제이다.
다른 투여 경로에 적합한 예는 흡입을 위한 제약 형태 [특히 분말 흡입기, 네뷸라이저], 점비제, 비강 용액, 비강 스프레이; 설측, 설하 또는 협측 투여를 위한 정제/필름/웨이퍼/캡슐; 좌제; 점안제, 안연고, 눈 배스, 안구 삽입물, 점이제, 귀 스프레이, 귀 분말, 귀-린스, 귀 탐폰; 질 캡슐, 국소 적용, 수현탁액 (로션, 진탕 혼합물), 친지성 현탁액, 에멀젼, 연고, 크림, 경피 치료 시스템 (예컨대, 예를 들어 패치), 유액, 페이스트, 발포체, 산포제, 이식물 또는 스텐트이다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 1종 이상의 불활성 비독성 제약상 적합한 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물은 언급된 투여 형태 내로 혼입될 수 있다. 이는 제약상 적합한 부형제와 혼합함으로써 그 자체로 공지된 방식으로 실시될 수 있다. 제약상 적합한 부형제는 특히, 하기를 포함한다:
· 충전제 및 담체 (예를 들어 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 (예컨대, 예를 들어 아비셀(Avicel)®), 락토스, 만니톨, 전분, 인산칼슘 (예컨대, 예를 들어 디-카포스(Di-Cafos)®)),
· 연고 베이스 (예를 들어 석유 젤리, 파라핀, 트리글리세리드, 왁스, 울 왁스, 울 왁스 알콜, 라놀린, 친수성 연고, 폴리에틸렌 글리콜),
· 좌제 베이스 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 카카오 버터, 경질 지방),
· 용매 (예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 중쇄-길이 트리글리세리드 지방 오일, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀),
· 계면활성제, 유화제, 분산제 또는 습윤제 (예를 들어, 소듐 도데실 술페이트), 레시틴, 인지질, 지방 알콜 (예컨대, 예를 들어 라네트(Lanette)®), 소르비탄 지방산 에스테르 (예컨대, 예를 들어 스판(Span)®), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (예컨대, 예를 들어 트윈(Tween)®), 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 (예컨대, 예를 들어 크레모포르(Cremophor)®), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴록사머 (예컨대, 예를 들어 플루로닉(Pluronic)®),
· 완충제, 산 및 염기 (예를 들어 포스페이트, 카르보네이트, 시트르산, 아세트산, 염산, 수산화나트륨 용액, 탄산암모늄, 트로메타몰, 트리에탄올아민),
· 등장화제 (예를 들어 글루코스, 염화나트륨),
· 흡수제 (예를 들어 고분산 실리카),
· 점도-증가제, 겔 형성제, 증점제 및/또는 결합제 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스-소듐, 전분, 카르보머, 폴리아크릴산 (예컨대, 예를 들어 카르보폴(Carbopol)®); 알기네이트, 젤라틴),
· 붕해제 (예를 들어 변형된 전분, 카르복시메틸셀룰로스-소듐, 소듐 스타치 글리콜레이트 (예컨대, 예를 들어 엑스플로탑(Explotab)®), 가교된 폴리비닐피롤리돈, 크로스카르멜로스-소듐 (예컨대, 예를 들어 액디솔(AcDiSol)®)),
· 유동 조절제, 윤활제, 활택제 및 이형제 (예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 활석, 고분산 실리카 (예컨대, 예를 들어 에어로실(Aerosil)®)),
· 신속하게 또는 변형된 방식으로 용해되는 코팅 물질 (예를 들어 당, 쉘락) 및 필름 형성제 또는 확산 막 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈 (예컨대, 예를 들어 콜리돈(Kollidon)®), 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 예컨대, 예를 들어 유드라짓(Eudragit)®)),
· 캡슐 물질 (예를 들어 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로스),
· 합성 중합체 (예를 들어 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 (예컨대, 예를 들어 유드라짓®), 폴리비닐피롤리돈 (예컨대, 예를 들어 콜리돈®), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 아세테이트, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 공중합체 및 블록공중합체),
· 가소제 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 트리아세틴, 트리아세틸 시트레이트, 디부틸 프탈레이트),
· 침투 증진제,
· 안정화제 (예를 들어 항산화제 예컨대, 예를 들어 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르브산나트륨, 부틸히드록시아니솔, 부틸히드록시톨루엔, 프로필 갈레이트),
· 보존제 (예를 들어 파라벤, 소르브산, 티오메르살, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로르헥시딘 아세테이트, 벤조산나트륨),
· 착색제 (예를 들어 무기 안료 예컨대, 예를 들어 산화철, 이산화티타늄),
· 향미제, 감미제, 향- 및/또는 냄새-차폐제.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 상기 정의된 바와 같은 복합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 상기 정의된 바와 같은 복합체를, 통상적으로 1종 이상의 제약상 적합한 부형제(들)와 함께 포함하는 제약 조성물, 및 본 발명에 따른 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 적어도 1종의 추가의 활성 성분, 예컨대 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 장애 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 활성인 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 상기 정의된 바와 같은 복합체 또는 제약 조성물은 경장으로, 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하, 피내 및 관절내 주사 및 주입을 포함하여 비경구로, 경구로, 질내로, 복강내로, 직장내로, 국소로 또는 협측으로 투여될 수 있다. 각각의 투여 경로에 적합한 제제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 경구 투여를 위한 환제, 정제, 장용-코팅된 정제, 필름 정제, 층 정제, 지속-방출 또는 연장-방출 제제, 플라스터, 국소 연장-방출 제제, 당의정, 페사리, 겔, 연고, 시럽, 과립, 좌제, 에멀젼, 분산액, 마이크로캡슐, 마이크로제제, 나노제제, 리포솜 제제, 캡슐, 장용-코팅된 캡슐, 분말, 흡입 분말, 미세결정질 제제, 흡입 스프레이, 분말, 점적제, 점비제, 비강 스프레이, 에어로졸, 앰플, 용액, 주스, 현탁액, 주입 용액 또는 주사 용액 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병의 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을, 1종 이상의 불활성 비독성 제약상 적합한 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을, 포스포디에스테라제의 억제제, 구아닐레이트 시클라제의 자극제 또는 활성화제, IP 수용체 효능제, 미네랄로코르티코이드-수용체 길항제, 이뇨제, PPAR-감마 효능제, PPAR-델타 효능제, 코르티코스테로이드, 산화성 스트레스 하의 기관에 대한 손상을 감소시키는 활성 성분, 세포 사멸의 유도 및 아폽토시스 경로를 억제하는 화합물, 염증 반응 및 T 세포 증식을 억제하는 화합물, 항혈전제, 혈소판 응집 억제제, 트롬빈 억제제, GPIIb/IIIa 길항제, 인자 Xa 억제제, 헤파린 또는 저분자량 (LMW) 헤파린 유도체 및 응고 인자 XI의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 활성 성분과 조합하여 포함하는, 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병의 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 포함하는 유효량의 제약 조성물, 또는 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 1종 이상의 불활성 비독성 제약상 적합한 부형제 및/또는 1종 이상의 추가의 활성 성분과 조합하여 포함하는 유효량의 제약 조성물을 투여함으로써, 인간 및 동물에서 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 MASP 억제성 펩티드의 적합한 투여량은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 담당의에 의해 결정될 수 있다. 임의의 특정한 대상체에 대한 구체적 치료 유효 용량 수준은: a) 치료될 장애 및 장애의 중증도; b) 사용되는 구체적 화합물의 활성; c) 사용되는 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; d) 사용되는 구체적 헵시딘 유사체의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; e) 치료 지속기간; f) 사용되는 MASP 억제성 펩티드와 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 인자를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
특정한 실시양태에서, 대상체 또는 환자에게 단일 또는 분할 용량으로 투여되는 본 발명의 MASP 억제성 펩티드의 총 1일 용량은, 예를 들어 1일 0.0001 내지 300 mg/kg 체중, 또는 1일 1 내지 300 mg/kg 체중, 또는 1일 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg 체중, 예컨대 1일 약 0.0005 내지 약 50 mg/kg 체중, 예컨대 1일 약 0.001 내지 약 10 mg/kg 체중, 예를 들어 1일 약 0.01 내지 약 1 mg/kg 체중의 양일 수 있고, 이는 1회 이상의 용량, 예컨대 1 내지 3회 용량으로 투여된다. 일반적으로, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 연속적으로 (예를 들어 정맥내 투여 또는 또 다른 연속 약물 투여 방법에 의해) 투여될 수 있거나, 또는 특정 대상체에 대해 숙련된 진료의에 의해 선택된 목적하는 투여량 및 제약 조성물에 따라, 간격을 두고, 전형적으로 규칙적인 시간 간격으로 대상체에게 투여될 수 있다. 규칙적 투여 간격은, 예를 들어 1일 1회, 1일 2회, 2, 3, 4, 5 또는 6일마다 1회, 매주 1 또는 2회, 매월 1 또는 2회 등을 포함한다.
본 발명은 의약의 제조를 위한, 특히 본원에 정의된 바와 같은 장애 또는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 MASP 억제성 펩티드의 용도를 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 각각이 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 복합체를 제조하는 방법을 포함한다. 제조 방법은 본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같은 단계를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 MASP 억제성 펩티드는 합성적으로 또는 반-재조합적으로 제조될 수 있다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 고체 상 펩티드 합성을 사용함으로써 제조하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물의 제조 방법을 제공하며, 하기 단계를 포함한다:
1. 2-클로로트리틸-유형 수지를 0.2-1.0 mmol/g의 로딩으로 사용하거나 또는 왕(Wang)-유형 수지를 0.2-1.0 mmol/그램의 로딩으로 사용함,
2. 서열의 c-말단 아미노산을 수지 상에 로딩함,
3. DMF 또는 NMP 중 15-25% 피페리딘 용액을 사용하여 fmoc 보호를 제거함,
4. 3-8 당량의 화학량론을 사용하여 서열 내 다음 아미노산을 커플링 시약, 예컨대 HBTU, HATU 또는 DIC/옥시마를 사용하여 커플링시킴,
5. 서열이 완료될 때까지 단계 3 및 4를 반복함,
6. TFA 및 티올 스캐빈저를 수반하는 절단 칵테일을 사용하여 고체 지지체로부터 펩티드를 절단함,
7. 산화 조건 (공기 또는 I2) 하에 서열 내의 2개의 시스테인을 고리화함,
8. 절단된 펩티드를 역상 HPLC를 사용하여 정제함.
추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 화학식 (I) 또는 화학식 (II)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진, 단리 및/또는 정제될 수 있는 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물의 제조 방법을 제공하며, 하기 단계를 포함한다:
1. 2-클로로트리틸-유형 수지를 0.2-1.0 mmol/g의 로딩으로 사용하거나 또는 왕-유형 수지를 0.2-1.0 mmol/그램의 로딩으로 사용함,
2. 서열의 c-말단 아미노산을 수지 상에 로딩함,
3. DMF 또는 NMP 중 15-25% 피페리딘 용액을 사용하여 fmoc 보호를 제거함,
4. 3-8 당량의 화학량론을 사용하여 서열 내 다음 아미노산을 커플링 시약, 예컨대 HBTU, HATU 또는 DIC/옥시마를 사용하여 커플링시킴,
5. 서열이 완료될 때까지 단계 3 및 4를 반복함,
6. TFA 및 티올 스캐빈저를 수반하는 절단 칵테일을 사용하여 고체 지지체로부터 펩티드를 절단함,
7. 산화 조건 (공기 또는 I2) 하에 서열 내의 2개의 시스테인을 고리화함,
8. 절단된 펩티드를 역상 HPLC를 사용하여 정제함,
9. HCl 염으로 전환시킴.
본원에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 유도체 또는 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 또는 본원에 정의된 바와 같은 복합체는 또한 생화학적 검정에서, 예컨대 예를 들어 MASP 억제제에 대한 반응성을 측정하기 위한 진단 검정에서 또는 MASP 억제제 결합에 기초한 임의의 생화학적 검정에서 생화학적 작용제로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 MASP 억제성 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 MASP 억제성 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 특정 구체적 실시양태에 관한 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 달리 나타내지 않는 한, 실시예를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용인 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 본 발명의 조건 또는 범주에 대해 완전히 한정적인 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실험 섹션에 사용된 약어의 목록:
Å
옹스트롬
aq.
수성, 수용액
bar
압력 단위
BPR
배압 조절제
conc
진한
d
이중선 (NMR)
dd
이중선의 이중선 (NMR)
DCM
디클로로메탄
DEA
디에틸아민
DIPEA
N,N,-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기(Huenig's base))
DMAP
4-디메틸아미노피리딘
DMF
N,N-디메틸포름아미드
DMSO
디메틸술폭시드
dt
삼중선의 이중선 (NMR)
EA
에틸 아세테이트
ee
거울상이성질체 과잉률
ent
거울상이성질체
eq
당량
equiv
당량 (이온 크로마토그래피)
ESI
전기분무-이온화 (질량 분광분석법)
Fmoc-OSu
1-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온
GC-MS
질량 분광측정법과 커플링된 기체 크로마토그래피
h
시간
HATU
O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트
HPLC
고압 액체 크로마토그래피
IC
이온 크로마토그래피
ID
내부 직경
L
리터
LC-MS
질량 분광분석법과 커플링된 액체 크로마토그래피
LiHMDS
리튬 비스(트리메틸실릴)아미드
lit.
문헌
m
다중선 (NMR)
MALDI
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 (질량 분광측정법)
Me
메틸
min
분
mm
밀리미터
μm
마이크로미터 (마이크로미터)
M
몰
MPLC
중압 액체 크로마토그래피
MS
질량 분광분석법
MTBE
tert-부틸 메틸 에테르
MTP
마이크로타이터 플레이트
m/z
질량-대-전하 비 (질량 분광측정법)
nm
나노미터
NMP
N-메틸-2-피롤리돈
NMR
핵 자기 공명 분광분석법
PBS
포스페이트 완충 염수
PE
석유 에테르
PEG
폴리에틸렌 글리콜
pos
양성
ppm
백만분율
Pr
프로필
Psi
제곱 인치당 파운드 (압력)
q / quart
사중선 (NMR)
qd
이중선의 사중선 (NMR)
quint
오중선 (NMR)
rac
라세미
Rf
체류 인자 (TLC)
RP
역상 (액체 크로마토그래피)
Rt
체류 시간 (크로마토그래피)
s
단일선 (NMR)
s
초 (시간)
SPPS
고체 상 펩티드 합성
t
삼중선 (NMR)
TBTU
O (벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
tBu
tert-부틸
TEA
트리에틸아민
THF
테트라히드로푸란
TLC
박층 크로마토그래피
UPLC
초성능 액체 크로마토그래피
UV
자외선
추가의 약어는 표 2 및 3에서 찾아볼 수 있다.
분석용 LC-MS 방법
방법 1
장비 유형 MS: 써모피셔사이언티픽(ThermoFisherScientific) LTQ-오비트랩(Orbitrap)-XL; 장비 유형 HPLC: 애질런트(Agilent) 1200SL; 칼럼: 애질런트, 포로쉘(POROSHELL) 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 구배: 0.0분 2% B → 1.5분 2% B → 15.5분 98% B → 18.0분 98% B; 오븐: 40℃; 유량: 0.75 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 2
장비 유형 MS: 써모피셔사이언티픽 LTQ-오비트랩-XL; 장비 유형 HPLC: 애질런트 1200SL; 칼럼: 애질런트, 포로쉘 120; 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 구배: 0.0분 5% B → 0.3분 5% B → 7.0분 98% B → 10분 98% B; 오븐: 40℃; 유량: 0.75 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 3
장비 유형 MS: 워터스(Waters) TOF 기기; 장비 유형 UPLC: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: YMC, 트리아트(TRIART) C18, 75 x 1 mm, 3.0 μm x 12 nm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 1% B → 2.0분 1% B → 8.0분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.63 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 4
장비 유형 MS: 워터스 TOF 기기; 장비 유형 UPLC: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: YMC, 트리아트 C18, 75 x 1 mm, 3.0 μm 12 nm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 1% B → 1.0분 1% B → 15.0분 50% B → 18.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.63 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 5
장비 유형 MS: 워터스 TOF 기기; 장비 유형 UPLC: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 0.5분 2% B → 7.5분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 1.00 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 6
장비 유형 MS: 워터스 시냅트(Waters Synapt) G2S; 장비 유형 UPLC: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 1.5분 2% B → 8.5분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.50 mL/분; UV-검출: 220 nm
방법 7
기기 유형 MS: 애질런트 6410 삼중 사중극자(Triple Quad); 기기 유형 HPLC: 애질런트 1200; 칼럼: 제미니(Gemini)-NX C18 5 μm 110 Å 150 x 4.6 mm; 용리액 A: H2O 중 0.1%TFA; 용리액 B: ACN 중 0.1%TFA; 구배: 0.0분 20% B → 20분 50% B → 20.1분 90% B → 23분 90% B; 오븐 온도: 50℃; 유량: 1.0 mL/분; UV-검출: 220 nm
방법 8
기기 유형 MS: 애질런트 6410 삼중 사중극자; 기기 유형 HPLC: 애질런트 1200; 칼럼: 디스커버리 바이오 와이드 포어(Discovery BIO Wide Pore) C18 5 μm 300 Å x 4.6 mm; 용리액 A: H2O 중 0.1%TFA; 용리액 B: ACN 중 0.1%TFA; 구배: 0.0분 10% B → 20분 80% B → 20.1분 90% B → 23분 90% B; 오븐 온도: 50℃; 유량: 1.0 mL/분; UV-검출: 220 nm
방법 9
기기: 워터스 액퀴티 SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μm 50 x 1 mm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.25 mL 99% 포름산, 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.25 mL 99% 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 1.2분 5% A → 2.0분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.40 mL/분; UV-검출: 210 nm
방법 10
기기 MS: 써모 사이언티픽 FT-MS; 기기 UHPLC: 써모 사이언티픽 얼티메이트(UltiMate) 3000; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 μm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 10% B → 2.5분 95% B → 3.5분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.90 mL/분; UV-검출: 210 nm/최적 통합 경로 210-300 nm
방법 11
MS 기기: 애질런트 MS 사중극자 6150; HPLC: 애질런트 1290; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μm 50 x 2.1 mm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.25 mL 포름산, 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.25 mL 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 0.3분 90% A → 1.7분 5% A → 3.0분 5% A 오븐: 50℃; 유량: 1.20 mL/분; UV-검출: 205-305 nm.
방법 12
기기: 워터스 액퀴티 SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSST3 1.8 μm 50 x 1 mm; 용리액 A: 1 L 물 + 0.25 mL 99% 포름산, 용리액 B: 1 L 아세토니트릴 + 0.25 mL 99% 포름산; 구배: 0.0분 95% A → 6.0분 5% A → 7.5분 5% A 오븐: 50℃; 유량: 0.35 mL/분; UV-검출: 210 nm.
방법 13
기기: 워터스 단일 사중극자 MS 시스템; 기기 워터스 UPLC 액퀴티; 칼럼: 워터스 BEH C18 1.7 μm 50 x 2.1 mm; 용리액 A: 1 L 물 + 1.0 mL (25% 암모니아)/L, 용리액 B: 1 L 아세토니트릴; 구배: 0.0분 92% A → 0.1분 92% A → 1.8분 5% A → 3.5분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.45 mL/분; UV-검출: 210 nm.
방법 14
시스템 MS: 워터스 TOF 기기; 시스템 UPLC: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC 펩티드 BEH C18 300 Å, 1.7 μm 150 x 2.1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.100 ml 99% 포름산, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.100 ml 99% 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 0.25분 90% A → 8.0분 45% A → 10.0분 2% → 12.0분 2% A 오븐: 50℃; 유량: 0.475 ml/분; UV-검출: 210 nm.
방법 15
MS 기기 유형: 애질런트 G6110A; HPLC 기기 유형: 애질런트 1200 시리즈 LC; UV DAD; 칼럼: 크로모리스 플래쉬(Chromolith Flash) RP-18e 25 x 2.0 mm; 이동상 A: 물 중 0.0375% TFA (v/v), 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.01875% TFA (V/V); 구배: 0.01분 5% B → 0.80분 95% B → 1.20분 95% B → 1.21분 5% B → 1.5분 5% B; 유량: 1.50 mL/분; 오븐 온도: 50℃; UV 검출: 220 nm & 254 nm.
MALDI 방법
정확한 질량 측정은 선택된 펩티드에 대해 브루커 오토플렉스(Bruker autoflex) maX LRF MALDI MS 비행 시간 (ToF-MS) 시스템 상에서 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 질량 분광측정 방법을 사용하여 수행하였다. 브루커 MALDI 표적 플레이트 상에서 매트릭스로서 α-시아노-4-히드록시신남산 (CAS 28166-41-8)을 사용하여 샘플을 제조하였다. 1.0 mL 아세토니트릴-물 (50/50 또는 30/70) 중 샘플 펩티드 0.1 내지 1.0 mg의 용액 및 0.05% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물 중 50% 아세토니트릴 중 매트릭스의 원액 (10 mg/mL)을 제조하였다. 각각의 용액 1.0 uL를 MALDI 표적 플레이트 상에 놓고, 건조시켰다. 이어서, 샘플을 분석을 위해 준비한다. MALDI 표적 플레이트에 대해 권장되는 샘플 제제는 브루커에 의해 제공된 문서에서 찾아볼 수 있다.
분석용 이온 크로마토그래피 방법
방법: IC - 정량적
외부 표준을 사용한 양이온 및 음이온의 정량적 측정; 기기: 써모 사이언티픽 ICS 5000+; 모세관 IC 칼럼: 이온팩(IonPac) AS11-HC 및 이온팩 CS16; 용리액: 구배 용리액 [H]+ [OH]-; 검출기: 전도도 검출; 가능한 상용 음이온: 아세테이트, 브로마이드, 시트레이트, 클로라이드, 플루오라이드, 포르메이트, 락테이트, 메실레이트, 포스페이트, 술페이트, 타르트레이트, 트리플루오로아세테이트; 가능한 상용 양이온: 암모늄, 바륨, 칼슘, 칼륨, 리튬, 나트륨, 마그네슘, 콜린.
분석용 기체 크로마토그래피 질량 분광측정 방법
GC-MS 방법 1
기기: 써모 사이언티픽 DSQII, 써모 사이언티픽 트레이스 GC 울트라(Trace GC Ultra); 칼럼: 레스텍(Restek) RTX-35MS, 15 m x 200 μm x 0.33 μm; 일정한 헬륨 유량: 1.20 mL/분; 오븐: 60℃; 유입구: 220℃; 구배: 60℃, 30℃/분 → 300℃ (3.33분 유지).
NMR
선택된 화합물의 1H NMR 데이터는 1H NMR 피크목록의 형태로 열거된다. 여기서, 각각의 신호 피크에 대해, ppm 단위의 δ 값에 이어서 둥근 괄호 안에 보고된 신호 강도가 주어진다. 상이한 피크로부터의 δ 값-신호 강도 쌍은 콤마에 의해 분리된다. 따라서, 피크목록은 하기 화학식에 의해 기재된다: δ1 (강도1), δ2 (강도2), ... δi (강도i), ... δn (강도n).
예리한 신호의 강도는 출력된 NMR 스펙트럼에서 신호의 높이 (cm 단위)와 상관관계가 있다. 다른 신호와 비교 시에, 이러한 데이터는 신호 강도의 실제 비와 상관관계가 있을 수 있다. 넓은 신호의 경우에는, 1개 초과의 피크, 또는 신호의 중심이, 스펙트럼에 표시된 가장 강력한 신호에 비한 그의 상대 강도와 함께 제시되어 있다. 1H NMR 피크목록은 전형적 1H NMR 판독과 유사하며, 따라서 통상적으로는 전형적 NMR 해석에 열거된 모든 피크를 함유한다. 더욱이, 전형적 1H NMR 출력물과 유사하게, 피크목록은 용매 신호, 특정한 목적 화합물의 입체이성질체로부터 유래된 신호, 불순물의 피크, 13C 위성 피크 및/또는 회전 측파대를 제시할 수 있다. 입체이성질체의 피크 및/또는 불순물의 피크는 전형적으로 (예를 들어, ＞90%의 순도를 갖는) 목적 화합물의 피크와 비교하여 더 낮은 강도로 표시된다. 이러한 입체이성질체 및/또는 불순물은 특정한 제조 공정에 대해 전형적일 수 있으며, 따라서 그의 피크는 "부산물 핑거프린트"에 기초하여 제조 공정의 재현을 확인하는 것을 도울 수 있다. 공지된 방법 (MestReC, ACD 시뮬레이션, 또는 실험적으로 평가된 기대값의 사용에 의함)에 의해 목적 화합물의 피크를 계산하는 전문가는 임의로 추가의 강도 필터를 사용하여, 필요에 따라 목적 화합물의 피크를 단리시킬 수 있다. 이러한 작업은 전형적 1H NMR 해석에서의 피크-선별과 유사할 것이다. NMR 데이터를 피크목록 형태로 보고하는 것에 관한 상세한 설명은 간행물 ["Citation of NMR Peaklist Data within Patent Applications"] (http://www.researchdisclosure.com/searching-disclosures, Research Disclosure Database Number 605005, 2014, 01 Aug 2014 참조)에서 살펴볼 수 있다. 연구 개시내용 데이터베이스 번호 605005에 기재된 바와 같은 피크 선별 상용법에서, 파라미터 "최소높이"는 1% 내지 4%로 조정될 수 있다. 그러나, 화학 구조에 따라 및/또는 측정된 화합물의 농도에 따라 파라미터 "최소높이"를 ＜1%로 설정하는 것이 합리적일 수 있다.
제조 실시예
합성을 위한 일반적 방법
고체 상 펩티드 합성 (SPPS)을 자동 펩티드 합성기를 사용하여 수행하거나 또는 수동으로 수행하였다. 펩티드 합성을 전형적으로 0.1 내지 1.0 mmol의 규모 범위로 수행하였다. 펩티드 합성을 수동으로 수행한 경우, 하기 기재된 일반적 절차 방법 C, D 및 E를 사용하였다. 자동화 펩티드 합성을 심포니 X(Symphony X) 펩티드 합성기 (자이로스 프로테인 테크놀로지스(Gyros Protein Technologies)) 상에서 수행하였다.
Fmoc-보호된 아미노산 (또는 Fmoc 아미노산을 제조하는데 사용된 중간체 아미노산)은 노바바이오켐(Novabiochem), 바켐(Bachem), 아이리스 바이오테크(Iris Biotech), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 알파(Alfa), 엔아민(Enamine), 아마텍(Amatek), 아니켐(Anichem), ACBR, ABC 래보러토리(ABC Laboratory), AP 바이오사이언스(AP Bioscience), 콤비블록스(Combiblocks), 아르자 바이오사이언스(ArZa Bioscience), 아크 팜(Ark Pharm), 아크로테인켐(Acroteinchem), 아폴로 사이언티픽(Apollo Scientific), 바이오파인(Biofine), 브로드팜(Broadpharm), VWR, 또는 자이로스 프로테인 테크놀로지스 (플루오레닐메톡시카르보닐 = Fmoc), GL 바이오켐 (상하이) 리미티드(GL Biochem (Shanghai) Ltd), 청두 아미노트프 파마슈티칼 테크놀로지 리미티드(Chengdu Aminotp Pharmaceutical Technology Ltd), 쑤저우 하이파인 바이오테크 캄파니, 리미티드(Suzhou Highfine Biotech Co., Ltd), 우시 앱텍(WuXi AppTec)으로부터 구입하거나 또는 다른 중국 판매업체를 통해 공급받았다. 일부 특별한 fmoc-보호된 아미노산을 내부적으로 합성하였고, 이들 합성 방법은 본원에 기재되어 있다. 내부적으로 합성된 fmoc 아미노산 중 일부는 또한 상업적으로 입수가능하다. Fmoc-보호된 아미노산이 상업적으로 입수가능하지 않지만 Boc-보호된 (tert-부틸옥시카르보닐 = Boc) 비천연 아미노산이 상업적으로 입수가능한 일부 경우에, 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용한 탈보호 및 재보호에 의해 Boc-보호된 아미노산으로부터 fmoc-보호된 아미노산을 제조하였다. 본 발명의 펩티드의 합성에 사용된 상업적으로 입수가능한 비천연 아미노산에 대한 CAS 번호는 대부분의 경우에 표 5에 포함되었다. 라세미 아미노산 (Fmoc 또는 Boc)을 구입한 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 거울상이성질체를 키랄 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있고, 이는 실제로 때때로 펩티드 합성 전에 거울상이성질체적으로 순수한 아미노산을 수득하기 위해 수행되었음을 인식하여야 한다.
하기 비천연 아미노산이 본 발명의 펩티드를 제조하는데 사용되었다. Fmoc- 또는 Boc-보호된 아미노산은 상업적 공급원 (CAS 번호가 이용가능함)을 통해 수득하거나 또는 본원에 기재된 방법에 의해 내부적으로 합성하였다. 표 5는 펩티드 합성에 사용된 화학적 기 / 아미노산의 CAS 번호 (우측 칼럼) 및 펩티드에 존재하는 상응하는 화학적 기 / 아미노산 (좌측 칼럼)을 제시한다.
표 5: 본 발명의 비천연 아미노산 및 화학적 기의 이용가능성
고체-상 수지는 노바바이오켐, 바켐, 아이리스 바이오테크, Pcas 바이오매트릭스(Pcas Biomatrix), GL 바이오켐 (상하이) 리미티드, CEM 또는 프로테인 테크놀로지스(Protein Technologies)로부터 구입하였다. 수지 로딩은 0.3 - 1.0 mmol/g이었다. 펩티드를 목적하는 C-말단에 따라 2-클로로트리틸 수지, 왕(Wang) 수지 또는 링크 아미드-유형 수지 상에서 합성하였다. 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 보호기의 절단은 실온에서 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘을 사용하여 달성하였다. 각각의 Fmoc 절단 단계를 2회 수행하였다. 아미노산을 자동화 합성기 (심포니 X) 상에서 8 당량의 Fmoc-아미노산을 8 당량의 DIC (디이소프로필카르보디이미드) (DMF 중 0.5 M) 및 8 당량의 옥시마(Oxyma) (에틸 시아노히드록시이미노아세테이트) (DMF 중 0.5 M)와 함께 사용하여 커플링시켰다. 심포니 X를 사용한 경우, 아미노산 커플링을 실온에서 질소 분위기 하에 수행하였다. 고가의 또는 자가-제조된 fmoc-아미노산을 사용한 경우, 커플링을 3 당량의 Fmoc-아미노산을 3 당량의 DIC (DMF 중 0.5 M) 및 3 당량의 옥시마 (DMF 중 0.5 M)와 함께 사용하여 수동으로 수행하였다. 각각의 아미노산 커플링 단계를 2회 수행하였다 (이중 커플링). 대안적으로, 3 당량의 Fmoc-아미노산, 2.85 당량의 HBTU ((2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄) (DMF 중 0.5 M) 및 6 당량의 DIPEA (DMF 중 0.5 M)를 사용하여 SPPS에 의해 펩티드를 수동으로 제조하였다. 커플링 반응을 닌히드린 시험을 사용하여 모니터링하였다.
펩티드를 트리플루오로아세트산 (TFA)/티오아니솔 (TA)/1,2-에탄디티올 (EDT) (90:7:3)을 사용하여 또는 92.5%TFA/2.5%EDT/2.5%TIS (트리이소프로필실란)/2.5%H2O로 완전히 탈보호하였다. 메티오닌을 함유하는 펩티드의 경우, 펩티드를 TFA 중 1.6% EDT 및 1.2% 트리메틸실릴브로마이드의 용액으로 실온에서 2시간 동안 처리하여 산화된 메티오닌을 환원시켰다.
디술피드 고리화:
펩티드를 0.1 M 중탄산암모늄 완충제 (pH 7.83) 중에서 0.5 mg/mL의 농도로 밤새 진탕시킴으로써 디술피드 가교를 형성하였다. 이어서, 상기 용액을 동결건조시켰다. 대안적으로, 고체 중탄산암모늄 완충제를 사용하여 pH 9.0으로 조정된 아세토니트릴/물 (종종 3:7)의 혼합물 중에서 펩티드를 1-3 mg/mL의 농도로 밤새 진탕시킴으로써 디술피드 가교를 형성하였다. 대안적으로, 20℃에서 2분 동안 아세토니트릴/물 (1:1) 중 1-1.3 mg/mL의 농도의 아이오딘 (I2) (MeOH 중 0.1 M)을 사용한 산화에 이어서 티오황산나트륨 (물 중 0.1 M)에 의한 처리에 이어서 동결건조에 의해 디술피드 가교를 제조하였다.
임의적인 아세틸화:
N-말단 아세틸화를 DMF (2 mL) 중 10 당량 아세트산 무수물 및 2.5 당량 DIPEA를 사용하여, 현탁액을 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 진탕시킴으로써 수행하였다. 용매를 제거하고, 수지를 DMF (5x) 및 DCM (5x)으로 세척하였다. 이어서, 절차를 다시 반복하였다. 대안적으로, N-말단 아세틸화를 아세트산 무수물/N-메틸 모르폴린 (NMM)/DMF (10:5:85)로 이루어진 캡핑 용액 10 mL를 사용하여, 현탁액을 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 30분 동안 진탕시킴으로써 수행하였다.
펩티드 절단:
TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)을 함유하는 절단 칵테일을 제조하였다. 절단 칵테일 (2 mL)을 펩티드 함유 수지에 첨가하고, 현탁액을 오비탈 진탕기 상에서 2.5시간 동안 진탕시켰다. 차가운 에테르 (-20℃)를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 생성된 용액을 질소 하에 원심분리하고 (시그마 2-16KL), 경사분리 후에 수득된 생성 고체를 차가운 에테르로 3회 더 원심분리 및 경사분리에 의해 세척하였다. 생성된 고체를 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
대안적으로, TFA/EDT/TIS/H2O (92.5:2.5:2.5:2.5)를 함유하는 절단 칵테일을 제조하였다. 절단 칵테일 (6 mL (0.3 mmol 규모))을 펩티드 함유 수지에 첨가하고, 현탁액을 오비탈 진탕기 상에서 2.5시간 동안 진탕시켰다. 차가운 tert-부틸 메틸 에테르 (-20℃)를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 생성된 용액을 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 경사분리 후에 수득된 생성 고체를 차가운 tert-부틸 메틸 에테르로 3회 더 (20 mL x 3) 원심분리 및 경사분리에 의해 세척하였다. 생성된 조 펩티드를 진공 하에 2시간 동안 건조시킨 다음, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
정제용 HPLC:
애질런트 1260 정제용 역상 HPLC 또는 크나우어 아주라(Knauer AZURA) 정제용 역상 HPLC를 정제에 사용하였다. 칼럼은 칼럼 스크린의 결과에 기초하여 선택된다. 펩티드를 10-30% ACN/물 (전형적으로 구배의 출발점) 중에 용해시킨다. 물 및 아세토니트릴은 둘 다 0.1% TFA를 함유한다. 유량 20 mL/분, 10-30% ACN/물에서 85-90% ACN/물을 전형적으로 사용하였다. 분획을 크로모리스 스피드로드(Chromolith Speedrod) 칼럼, 8분에 걸쳐 5-95% ACN/물 구배를 사용하여 HPLC (애질런트 1260 인피니티(Infinity))에 의해 및 하기 LC-MS 방법: 방법 1, 방법 2, 방법 3, 방법 4, 방법 5, 방법 6 중 하나 이상에 의해 분석하였다.
대안적으로, 길슨(Gilson) GX-281 정제용 역상 HPLC를 정제에 사용하였다. 칼럼은 칼럼 스크린의 결과에 기초하여 선택하였다. 펩티드를 10-30% ACN/물 (전형적으로 구배의 출발점) 중에 용해시킨다. 물은 0.075% TFA를 함유하였다. 통상적으로 루나(Luna) 칼럼 (25 x 200 mm, C18 10 μm, 110 Å) 또는 제미니 칼럼 (30 x 150 mm, C18 5 μm, 110 Å)을 사용하였다. 정제용 HPLC에 대한 조건: 유량 20 mL/분, 10-30% ACN/물에서 85-90% ACN/물, 파장 214/254 nm, 오븐 온도 30℃. 분획을 방법 W1 또는 방법 7을 사용하여 HPLC (애질런트 1260 인피니티)에 의해 분석하였다. 그 후, 펩티드를 하기 방법: 방법 1, 방법 2, 방법 3, 방법 4, 방법 5, 방법 6 중 하나 이상에 의해 분석하였다.
-S-S-디술피드 결합이 -CH2-S-, -S-CH2-, -CH2-CH2-, -S-(CH2)2-, -(CH2)2-S- 또는 -CH2-S-CH2-에 의해 대체된 디술피드 모방체는 하기 참고문헌에 기재된 절차에 따라 본원에 기재된 방법과 조합하여 제조될 수 있다: (1) Hong-Kui Cui, Ye Guo, Yao He, Feng-Liang Wang, Hao-Nan Chang, Yu-Jia Wang, Fang-Ming Wu, Chang-Lin Tian, Lei Liu Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 9558-9562; (2) Ye Guo, De-Meng Sun, Feng-Liang Wang, Yao He, Lei Liu, Chang-Lin Tian Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 14276-14281; (3) Yang Xu, Tao Wang, Chao-Jian Guan, Yi-Ming Li, Lei Liu, Jing Shi, Donald Bierer Tetrahedron Letters 2017, 58, 1677-1680; (4) Tao Wang, Yi-Fu Kong, Yang Xu, Jian Fan, Hua-Jian Xu, Donald Bierer, Jun Wang, Jing Shi, Yi-Ming Li Tetrahedron Letters 2017, 58, 3970-3973; (5) Tao Wang, Jian Fan, Xiao-Xu Chen, Rui Zhao, Yang Xu, Donald Bierer, Lei Liu, Yi-Ming Li, Jing Shi, Ge-Min Fang Org. Lett. 2018, 20, 6074-6078; (6) Jan-Patrick Fischer, Ria Schoenauer, Sylvia Els-Heindl, Donald Bierer, Johannes Koebberling, Bernd Riedl, Annette G. Beck-Sickinger J Pep Sci. 2019; e3147; (7) Dong-Liang Huang, Jing-Si Bai, Meng Wu, Xia Wang, Bernd Riedl, Elisabeth Pook, Carsten Alt, Marion Erny, Yi-Ming Li, Donald Bierer, Jing Shi, Ge-Min Fang Chem. Commun., 2019, 55, 2821-2824; (8) Shuai-Shuai Sun, Junyou Chen, Rui Zhao, Donald Bierer, Jun Wang, Ge-Min Fang, Yi-Ming Li Tetrahedron Letters 2019, 60, 1197-1201; (9) C. M. B. K. Kourra and N. Cramer Chem. Sci., 2016, 7, 7007-7012.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 모든 펩티드는 TFA 염이다.
Masp 펩티드의 자동화 SPPS에 대한 일반적 방법 (방법 A)
((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-NH2 (실시예 165)의 합성이 대표적이다.
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
자동화 SPPS를 심포니 X 펩티드 합성기 (프로테인 테크놀로지스) 상에서 수행하였다. 켐매트릭스 링크 아미드 수지를 전형적으로 0.1 mmol 규모로 사용하였다 (0.5 mmol/그램 로딩). 수지를 반응 용기에 넣고, 기기 상에 넣었다. 합성 동안 하기 용액을 제조하고 사용하였다:
1) Fmoc 아미노산: 0.2 M (8 당량)
2) 활성화제 1: DMF 중 0.5 M DIC (7.5 당량)
3) 활성화제 2: DMF 중 0.5 M 옥시마 (7.5 당량)
4) Fmoc 탈보호: DMF 중 20% 피페리딘
5) DMF 2 mL 중 아세트산 무수물 (10 당량)
각각의 아미노산에 대해 이중 커플링을 전형적으로 수행하였다. 고가의 비천연 Fmoc 또는 Boc 아미노산, 사내 합성된 Fmoc 아미노산 또는 N-메틸화 아미노산의 경우, 서열을 개재시키고, 이 아미노산을 수동으로 커플링시켰다 (이중 커플링, 그러나 전형적으로 보다 적은 시약 (3-5 당량)을 사용함). 이 커플링을 완료한 후, 합성을 전형적으로 합성기 상에서 계속하였다. N-메틸 아미노산이 서열에 첨가되는 경우, 전형적으로 다음 아미노산을 또한 수동으로 커플링시켰다. 모든 단계는 질소 하에 실온에서 수행하였다. Fmoc-Pen 및 Fmoc-Oic를 전형적으로 자동화 SPPS를 사용하여 커플링시켰다. Fmoc(N-Me)G를 전형적으로 수동으로 커플링시켰다. Ahx는 항상 수동으로 커플링시켰다.
수지를 팽윤시키고, DMF (3 x 3 mL, 10분)로 세척하였다. 수지가 Fmoc를 함유한 경우, Fmoc를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)으로 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Asp(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Asp(Ot-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Pen(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Pen(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Oic (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Oic (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Leu (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Leu (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Arg(Pbf) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Arg(Pbf) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Cys(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Cys(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
자동화 SPPS 동안의 수동 커플링:
Fmoc-(N-Me)G (DMF 중 0.2 M, 5 당량)를 수지에 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 2시간 동안 진탕시키면서 (써모믹서(Thermomixer), 실온) 진행되도록 하였다. 용액을 여과하고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-(N-Me)G (DMF 중 0.2 M, 5 당량)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 2시간 동안 진탕시키면서 (써모믹서, 실온) 진행되도록 하였다. 용액을 여과하고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
추가의 아미노산이 서열에 존재하는 경우, 이들을 상기 단계를 사용하여 커플링시켰다.
시험 절단:
수동 커플링을 수행하는 경우, 시험 절단을 전형적으로 수행하여 반응을 모니터링하였다. 시험 절단 칵테일은 TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)이었고; 실온 및 750 rpm에서 써모믹서 상에서 1.5시간 진탕시켰다. 분석을 상기 방법 중 하나를 사용하여 LC-MS에 의해 수행하였다.
완전 절단:
펩티드를 함유하는 수지를 시린지 내에 넣고, 3.0 mL의 절단 완충제 TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)을 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 진탕시켰다. 용액을 여과에 의해 수집하고, 펩티드를 차가운 디에틸 에테르 (-20℃)를 첨가하여 침전시켰다. 용액을 질소 분위기 하에 팔콘 튜브 (60 mL)에서 원심분리하였다 (3000 rpm). 에테르를 경사분리하고, 고체 잔류물을 차가운 디에틸 에테르 (5 x 10 mL)로 반복해서 세척하였다. 이어서, 고체 잔류물을 건조시켰다.
디술피드 고리화:
조 펩티드를 0.1 M 중탄산암모늄 (pH 7.8-8.2) 중에 1 mg/2 mL의 농도로 용해시켰다. 용액을 공기에 개방된 둥근 바닥 플라스크에서 오비탈 진탕기 상에서 밤새 진탕되도록 하였다. 이어서, 용액을 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
HPLC 정제를 위한 칼럼 스크리닝:
펩티드를 5% CH3CN 및 95% 물 중에 용해시켰다. 각각의 펩티드에 대해 칼럼 스크리닝을 수행하여 정제에 사용할 정제용 HPLC 방법을 결정하였다. 하기 분석 칼럼을 스크리닝하였다.
2가지 방법이 칼럼 스크리닝에 이용가능하다:
1) 5-60% ACN_8분_1 mL/분_25℃
2) 30-85% ACN_8분_1 mL/분_25℃
입수가능한 칼럼 (50 mm x ID 4.6 mm) (또한 정제용 칼럼으로서 입수가능함):
1) 아에리스(Aeris) C18 (페노메넥스(Phenomenex))
2) X-브릿지(X-Bridge) C18 (워터스)
3) 키네텍스(Kinetex) C18 (코어쉘 재료) (페노메넥스)
4) YMC 트리아트(Triart) C18 (100% 물로 용리 가능)
5) 키네틱스 비페닐(Kinetix Biphenyl) (페노메넥스)
6) X-셀렉트(X-Select) C18 (양전하)
7) 주피터 프로테오(Jupiter Proteo) C18 (페노메넥스)
8) 루나 C18 (페노메넥스)
본 발명의 펩티드의 경우, 하기 5개의 정제용 칼럼 중 1개를 사용하였다:
1) 칼럼: 페노메넥스, 아에리스 펩티드 5 μ XB-C18, 악시아(AXIA) 패킹됨, 21.2 x 250 mm + 카트리지 5 μ
2) 칼럼: 페노메넥스, 키네텍스 C18 5 μ 21.5 x 250 mm + 카트리지 5 μ
3) 칼럼: 페노메넥스, 키네텍스 5 μ 비페닐 100A, 악시아 패킹됨, 21.2 x 250 mm + 카트리지 5 μ
4) 칼럼: YMC 악투스(Actus) 트리아트 정제용 C18 12 nm, S-10 μm 250 x 20 mm + 카트리지 3 μm (10 x 4 mm)
5) 칼럼: 워터스, 엑스브리지 정제용 C18 5 μ OBD 19 x 250 mm + 카트리지 10 μ
칼럼이 선택되면, 하기 방법 중 하나를 사용하였다:
1) 방법: 구배 물 중 5-60% ACN (0.10% TFA)
2) 방법: 구배 물 중 30-85% ACN (0.10% TFA)
3) 칼럼 스크리닝의 결과에 기초한 집중 구배.
유량 20 mL/분
합한 분획을 HPLC (5-95, 8in 크로모리스 스피드로드 & YMC C18 5-95, 18분)에 의해 및 상기 기재된 LC-MS 방법 중 하나를 사용하여 분석하였다.
실시예 165에 대해, 조 펩티드를 CH3CN/물 (1:1) 중에 용해시키고, 페노메넥스 키네텍스 칼럼 C18 5 μ, 21.5 x 250 mm + 5 μ 카트리지 상에서 정제하였다 (유량: 20 mL/분, 방법: 48분에 걸쳐 물 중 5-60% ACN (각각 0.10% TFA 함유)). 합한 분획을 동결건조시켜 실시예 165 39 mg (95% 순도)을 수득하였다.
표 6: 사용된 물질 및 조건의 기록
Masp 펩티드의 자동화 SPPS에 대한 일반적 방법 (방법 B)
((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+I-((5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산)-OH (실시예 164)의 합성이 대표적이다.
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
가능한 경우에, 제1 아미노산이 사전로딩된 왕 수지 (예를 들어, Fmoc-Asp(t-Bu)-OH, Fmoc-Pro-OH 등이 사전로딩된 것)를 0.55 - 0.7 mmol/g의 전형적인 로딩으로 사용하였다. 제1 아미노산이 이용가능하지 않은 경우, 이를 수동으로 첨가하였다.
제1 아미노산이 사전로딩된 수지로서 이용가능하지 않은 경우에, 이를 수동으로 첨가하고, 클로로트리틸 수지를 합성에 사용하였다.
2-클로로트리틸 수지 상의 제1 아미노산의 로딩:
2-클로르트리틸수지 (500 mg, 0.775 mmol)를 50 mL 팔콘 튜브에서 15분 동안 DCM 10 mL로 팽윤되도록 하고, 5-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산 (281 mg, 0.775 mmol)을 DCM 중에 용해시키고, DIEA (6 당량, 0.81 mL)를 첨가하고, 용액을 수지에 첨가하였다. 용액을 아르곤으로 퍼징하고, 실온에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 여과하고, DMF (3 x 5 mL) 및 DCM (3 x 5 mL)으로 세척하였다. 메탄올 (5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 진탕시킨 다음, 여과하였다. 수지를 DMF (3 x 5 mL) 및 DCM (3 x 5 mL)으로 세척하였다. 메탄올 (5 mL)을 다시 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 진탕시킨 다음, 여과하였다. 수지를 DMF (3 x 5 mL) 및 DCM (3 x 5 mL)으로 세척하였다. 로딩은 하기 기재된 로딩 절차의 결정에 기초하여 0.42 mmol/g인 것으로 결정되었다.
이어서, 수지를 0.1 mmol 규모로 프로테인 테크놀로지스로부터의 심포니 X 합성기 상에서 자동화 SPPS에 사용하였다.
수지 로딩의 결정:
수지의 로딩을 결정하기 위해, FMOC 보호기를 한정된 양의 수지로부터 절단한 후, 상청액 절단 용액 중 생성된 플루오레닐 화합물의 농도를 301 nm에서 광도측정법을 통해 측정하였다. 이는 수지 상에 로딩된 아미노산의 양과 직접적으로 상관된다.
1) 1-3 mg의 수지를 2 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 또는 유사한 것에 칭량 투입하였다 (정확한 양을 주목함).
2) DMF 중 20% 피페리딘의 용액 1000 μL를 첨가하였다.
3) 혼합물을 30분 동안 교반하여 FMOC 기를 절단하였다.
4) 이어서, 상청액 용액 100 μL를 석영 유리 큐벳으로 옮기고, 20% 피페리딘 / DMF 900 μL로 희석하였다.
5) 1000 μl 피페리딘 / DMF의 블랭크 샘플을 제2 큐벳에서 제조하였다.
6) 참조 샘플로부터 블랭크 값을 측정한 후, 이어서 λ = 301 nm에서의 시험 샘플의 흡광도를 UV-Vis 광도계 (써모 사이언티픽 에볼루션 201)에서 측정하였다.
7) 보다 큰 정확도를 위해, 다수의 시험 샘플 (전형적으로 2개)을 만들 수 있고; 이어서 측정된 흡광도의 산술 평균을 계산에 사용하였다.
수지 로딩의 계산:
수지 로딩 L301 (mmol/g)은 하기 식에 의해 계산하였다:
E = 흡광도
ε = 301 nm 파장에서의 흡광 계수 (7800 L/mol*cm)
m = 사용된 수지의 양 (g)
V = 샘플의 부피 (L)
D = 큐벳의 층 두께 (cm)
VF = 희석 계수 (= 10)
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
후속 Fmoc 아미노산의 커플링을 방법 A에 기재된 바와 같이 진행하였다.
하기 용액을 합성 동안 제조하고 사용하였다:
1) Fmoc 아미노산: 0.2 M (8 당량)
2) 활성화제 1: DMF 중 0.5 M DIC (7.5 당량)
3) 활성화제 2: DMF 중 0.5 M 옥시마 (7.5 당량)
4) Fmoc 탈보호: DMF 중 20% 피페리딘
5) DMF 2 mL 중 아세트산 무수물 (10 당량)
이중 커플링을 전형적으로 각각의 아미노산에 대해 수행하였다. 고가의 비천연 Fmoc 또는 Boc 아미노산, 사내 합성된 Fmoc 아미노산 또는 N-메틸화 아미노산의 경우, 서열을 개재시키고, 이 아미노산을 수동으로 커플링시켰다 (이중 커플링, 그러나 전형적으로 보다 적은 시약 (3-5 당량)을 사용함). 이 커플링을 완료한 후, 합성을 전형적으로 합성기 상에서 계속하였다. N-메틸 아미노산이 서열에 첨가되는 경우, 전형적으로 다음 아미노산을 또한 수동으로 커플링시켰다. 모든 단계는 질소 하에 실온에서 수행하였다. Fmoc-Pen 및 Fmoc-Oic를 전형적으로 자동화 SPPS를 사용하여 커플링시켰다. Fmoc(N-Me)G를 전형적으로 수동으로 커플링시켰다. Ahx는 항상 수동으로 커플링시켰다.
Fmoc 절단:
수지를 팽윤시키고, DMF (3 x 3 mL, 10분)로 세척하였다. 수지가 Fmoc를 함유한 경우, Fmoc를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)으로 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Pen(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Pen(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Oic (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Oic (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Pro (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Leu (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Leu (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Arg(Pbf) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Arg(Pbf) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ser(t-Bu) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Cys(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Cys(Trt) (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
커플링:
Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-Ile (4.0 mL)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 질소 버블링 하에 2시간 동안 진행되도록 하였다. 용액을 배수시키고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
자동화 SPPS 동안의 수동 커플링:
Fmoc-(N-Me)G (DMF 중 0.2 M, 5 당량)를 수지에 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 2시간 동안 진탕시키면서 (써모믹서, 실온) 진행되도록 하였다. 용액을 여과하고, DMF (1 x 3 mL, 30초)로 세척하였다. 커플링 단계를 반복하였다. Fmoc-(N-Me)G (DMF 중 0.2 M, 5 당량)를 첨가하였다. 활성화제 1 용액 (DIC, 1.5 mL) 및 활성화제 2 용액 (옥시마, 1.5 mL)을 첨가하고, 커플링을 2시간 동안 진탕시키면서 (써모믹서, 실온) 진행되도록 하였다. 용액을 여과하고, DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 20% 피페리딘 용액 (2 x 3 mL, 10분)을 첨가함으로써 제거하였다. 수지를 DMF (6 x 3 mL, 30초)로 세척하였다.
추가의 아미노산이 서열에 존재하는 경우, 이들을 상기 단계를 사용하여 커플링시켰다.
시험 절단:
수동 커플링을 수행하는 경우, 시험 절단을 전형적으로 수행하여 반응을 모니터링하였다. 시험 절단 칵테일은 TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)이었고; 실온 및 750 rpm에서 써모믹서 상에서 1.5시간 진탕시켰다. 분석을 상기 방법 중 하나를 사용하여 LC-MS에 의해 수행하였다.
완전 절단:
펩티드를 함유하는 수지를 시린지 내에 넣고, 3.0 mL의 절단 완충제 TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)을 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 진탕시켰다. 용액을 여과에 의해 수집하고, 펩티드를 차가운 디에틸 에테르 (-20℃)를 첨가하여 침전시켰다. 용액을 질소 분위기 하에 팔콘 튜브 (60 mL)에서 원심분리하였다 (3000 rpm). 에테르를 경사분리하고, 고체 잔류물을 차가운 디에틸 에테르 (5 x 10 mL)로 반복해서 세척하였다. 이어서, 고체 잔류물을 건조시켰다.
디술피드 고리화:
조 펩티드를 0.1 M 중탄산암모늄 (pH 7.8-8.2) 중에 1 mg/2 mL의 농도로 용해시켰다. 용액을 공기에 개방된 둥근 바닥 플라스크에서 오비탈 진탕기 상에서 밤새 진탕되도록 하였다. 이어서, 용액을 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
HPLC 정제를 위한 칼럼 스크리닝:
펩티드를 5% CH3CN 및 95% 물 중에 용해시켰다. 각각의 펩티드에 대해 칼럼 스크리닝을 수행하여 정제에 사용할 정제용 HPLC 방법을 결정하였다. 하기 분석 칼럼을 스크리닝하였다.
2가지 방법이 칼럼 스크리닝에 이용가능하다:
1) 5-60% ACN_8분_1 mL/분_25℃
2) 30-85% ACN_8분_1 mL/분_25℃
입수가능한 칼럼 (50 mm x ID 4.6 mm) (또한 정제용 칼럼으로서 입수가능함):
1) 아에리스 C18 (페노메넥스)
2) X-브릿지 C18 (워터스)
3) 키네텍스 C18 (코어쉘 재료) (페노메넥스)
4) YMC 트리아트 C18 (100% 물로 용리 가능)
5) 키네틱스 비페닐 (페노메넥스)
6) X-셀렉트 C18 (양전하)
7) 주피터 프로테오 C18 (페노메넥스)
8) 루나 C18 (페노메넥스)
본 발명의 펩티드의 경우, 하기 5개의 정제용 칼럼 중 1개를 사용하였다:
1) 칼럼: 페노메넥스, 아에리스 펩티드 5 μ XB-C18, 악시아 패킹됨, 21.2 x 250 mm + 카트리지 5 μ
2) 칼럼: 페노메넥스, 키네텍스 C18 5 μ 21.5 x 250 mm + 카트리지 5 μ
3) 칼럼: 페노메넥스, 키네텍스 5 μ 비페닐 100A, 악시아 패킹됨, 21.2 x 250 mm + 카트리지 5 μ
4) 칼럼: YMC 악투스 트리아트 정제용 C18 12 nm, S-10 μm 250 x 20 mm + 카트리지 3 μm (10 x 4 mm)
5) 칼럼: 워터스, 엑스브리지 정제용 C18 5 μ OBD 19 x 250 mm + 카트리지 10 μ
칼럼이 선택되면, 하기 방법 중 하나를 사용하였다:
1) 방법: 구배 물 중 5-60% ACN (0.10% TFA)
2) 방법: 구배 물 중 30-85% ACN (0.10% TFA)
3) 칼럼 스크리닝의 결과에 기초한 집중 구배.
유량 20 mL/분
합한 분획을 HPLC (5-95, 8in 크로모리스 스피드로드 & YMC C18 5-95, 18분)에 의해 및 상기 기재된 LC-MS 방법 중 하나를 사용하여 분석하였다.
실시예 164에 대해, 조 펩티드를 CH3CN/물 (1:1) 중에 용해시키고, 페노메넥스 키네텍스 칼럼 C18 5 μ, 21.5 x 250 mm + 5 μ 카트리지 상에서 정제하였다 (유량: 20 mL/분, 방법: 48분에 걸쳐 물 중 5-60% ACN (각각 0.10% TFA 함유)). 합한 분획을 동결건조시켜 실시예 164 29.8 mg (98.3% 순도)을 수득하였다.
표 7: 사용된 물질 및 조건의 기록
Masp 펩티드의 수동 SPPS에 대한 일반적 방법 (방법 C)
서열 AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPN-OH (실시예 418)의 합성이 대표적이다.
펩티드 합성:
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
1) 수지 제조: 클로로트리틸 수지 (CTC 수지) (0.3 mmol, 0.3 g, 1.0 mmol/g)에 DCM (6.0 mL) 중 Fmoc-Asn(Trt)-OH (0.3 mmol, 0.18 g, 1.0 당량) 및 DIEA (0.21 mL, 1.2 mmol, 4.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 2시간 동안 교반한 다음, MeOH (0.3 mL)를 첨가하고, N2와 함께 추가로 30분 동안 교반하였다. 수지를 DMF (6.0 mL x 3)로 세척하였다. 이어서, DMF 중 20% 피페리딘 (6.0 mL)을 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하여 수지를 수득하였다. 수지를 DMF (6.0 mL x3)로 세척하고, 여과하여 수지를 수득하였다.
2) 커플링: DMF (3.0 mL) 중 Fmoc-Pro-OH (0.30 g, 0.9 mmol, 3.0 당량), HBTU (0.32 g, 0.85 mmol, 2.85 당량) 및 DIEA (1.80 mmol, 0.32 mL, 6.00 당량)를 수지에 첨가하고, N2와 함께 20℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 DMF (6.0 mL x 5)로 세척하였다.
3) 탈보호: DMF 중 20% 피페리딘 (6.0 mL)을 수지에 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다.
4) 모든 다른 아미노산에 대해 단계 2 내지 3을 반복한다:
표 8: 사용된 물질 및 조건의 기록
DMF 중 20% 피페리딘을 30분 동안 Fmoc 탈보호에 사용하였다. 커플링 반응을 닌히드린 (Pro를 제외한 모든 아미노산) 및 클로라닐 시험 (Pro)에 의해 모니터링하고, 수지를 DMF (5.0 mL)로 5회 세척하였다.
펩티드 절단 및 정제:
1) 수지를 MeOH (6.0 mL x 5)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 0.62 g 펩티드 수지를 수득하였다. 이어서, 6.0 mL의 절단 완충제 (92.5%TFA/2.5%EDT/2.5%TIS/2.5%H2O)를 20℃에서 측쇄 보호된 펩티드 수지를 함유하는 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다.
2) 펩티드를 차가운 tert-부틸 메틸 에테르 (50 mL)로 침전시키고, 원심분리 (3000 rpm에서 3분)하여 고체 조 물질을 수득하였다. 조 펩티드 침전물을 tert-부틸 메틸 에테르로 2회 더 세척하였다 (20.0 mL x 3). 조 펩티드를 진공 하에 2.0시간 동안 건조시켜 0.4 g 조 펩티드를 수득하였다.
3) 조 물질 (0.4 g)을 CH3CN (150 mL) 및 물 (150 mL) 중에 용해시켰다. 아이오딘 (I2) (MeOH 중 0.1 M, 1.5 mL)를 황색이 지속될 때까지 20℃에서 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 20℃에서 2분 동안 교반하였다. 이어서, 티오황산나트륨 (물 중 0.1 M, 0.05 mL)을 황색이 사라질 때까지 적가하였다. 혼합물을 동결건조시켜 조 분말 (0.41 g)을 수득하였다.
4) 조 펩티드를 정제용 HPLC (조건: A: 물 중 0.075% TFA B: CH3CN)에 의해 정제하고, 동결건조시켜 목적 펩티드 (실시예 418) (108.1 mg, 23.0% 수율, 방법 W1에 의해 97.3% 순도; 방법 7에 의해 97.4% 순도)를 백색 고체 및 TFA 염으로서 수득하였다. 정제 조건: 펩티드를 TFA/H2O (7:3) 중에 용해시킴; 유량 20 mL/분; 구배 60분에 걸쳐 12-42%; 체류 시간 = 42분; 루나 25 x 200 mm, C18 10 um, 110 Å 칼럼에 이어서 다시 제미니 150 x 30 mm, C18 5um, 110 Å 칼럼 상에서 정제하여 목적 순도에 도달함.
이 방법에 따라 C-말단 아미드를 제조하는 경우, 링크 아미드 MBHA 수지 (전형적으로 대략 0.4-0.6 mmol/g 로딩, 상기 단계와 동일함)로 합성을 시작하였다.
Masp 펩티드의 수동 SPPS에 대한 일반적 방법 (방법 D)
C-말단 아미드를 제조하는 경우, 링크 아미드 MBHA 수지 (전형적으로 대략 0.4-0.6 mmol/g 로딩)로 합성을 시작하였다. 서열 PIC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IPD-NH2 (실시예 9)의 합성이 대표적이다.
C-말단 산을 제조하는 경우, 합성을 2-클로로트리틸 수지로 시작하였으며, 제1 Fmoc 아미노산을 방법 C에 기재된 방법에 따라 첨가하였다.
펩티드 합성:
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
1) 수지 제조: DMF (10.0 mL) 중 링크 아미드 MBHA 수지 (0.66 g, 0.30 mmol, 로딩 = 0.45 mmol/g)를 N2와 함께 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, DMF 중 20% 피페리딘 (10 mL)을 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하여 수지를 수득하였다. 수지를 DMF (10 x 5 mL)로 세척하고, 여과하여 수지를 수득하였다.
2) 커플링: DMF (3.0 mL) 중 Fmoc-Asn(Trt)-OH (0.9 mmol, 0.37 g, 3.0 당량), HBTU (0.32 g, 0.85 mmol, 2.95 당량) 및 DIEA (1.80 mmol, 0.32 mL, 6.00 당량)를 수지에 첨가하고, N2와 함께 20℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 DMF (10.0 mL x 3)로 세척하였다.
3) 탈보호: DMF 중 20% 피페리딘 (10.0 mL)을 수지에 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다.
4) 모든 다른 아미노산에 대해 단계 2 내지 3을 반복하였다.
표 9: 사용된 물질 및 조건의 기록
DMF 중 20% 피페리딘을 30분 동안 Fmoc 탈보호에 사용하였다. 커플링 반응을 닌히드린 (Pro를 제외한 모든 아미노산) 및 클로라닐 시험 (Pro)에 의해 모니터링하고, 수지를 DMF (5.0 mL)로 5회 세척하였다.
펩티드 절단 및 정제:
1) 수지를 MeOH (6.0 mL x 5)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 0.66 g 펩티드 수지를 수득하였다. 이어서, 6.0 mL의 절단 완충제 (90%TFA/5%EDT/2.5%TIS/2.5%H2O)를 20℃에서 측쇄 보호된 펩티드 수지를 함유하는 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다.
2) 펩티드를 차가운 tert-부틸 메틸 에테르 (50 mL)로 침전시키고, 원심분리 (3000 rpm에서 3분)하여 고체 조 물질을 수득하였다. 조 펩티드 침전물을 tert-부틸 메틸 에테르로 3회 더 세척하였다 (20.0 mL x 3). 조 펩티드를 진공 하에 2.0시간 동안 건조시켜 0.4 g 조 펩티드를 수득하였다.
3) 조 물질 (0.4 g)을 CH3CN (15 mL) 및 물 (15 mL) 중에 용해시켜 0.1 mM 농도를 달성하였다. NH4HCO3 용액 (1 M)을 첨가하여 pH를 약 8-9로 조정하였다. 용액을 실온에서 약 8시간 동안 진탕되도록 하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응이 완결된 후, 반응물을 아세트산으로 켄칭하여 pH를 약 6으로 조정하였다. 이어서, 반응 혼합물을 동결건조시키고, 생성된 고체를 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
4) 조 펩티드를 정제용 HPLC (조건: A: 물 중 0.075% TFA B: CH3CN)에 의해 정제하고, 동결건조시켜 목적 펩티드 (실시예 9) (202.40 mg, 41.4.0% 수율, 방법 W1에 의해 93.7% 순도; 방법 7에 의해 95.1% 순도)를 백색 고체 및 TFA 염으로서 수득하였다. 정제 조건: 펩티드를 TFA/H2O (7:3) 중에 용해시킴; 유량 20 mL/분; 구배 60분에 걸쳐 12-42%; 체류 시간 = 42분; 루나 25 x 200 mm, C18 10 μm, 110 Å 칼럼 상에서 정제함.
Masp 펩티드의 수동 SPPS에 대한 대안적 일반적 방법 (방법 E)
서열 ((2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산)-IC+SRSLP-(Oic)-IC+I-OH (실시예 184)의 합성이 대표적이다.
펩티드 합성:
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
하기 화학 구조에서 암색 볼은 고체-상 펩티드 합성 (SPPS)에 사용된 고체 중합체 지지체, 예를 들어 2-클로로트리틸 수지, 링크 아미드 수지 등을 나타낸다.
실시예 1A
(2S)-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)(옥산-4-일)아세트산 (단일 입체이성질체)
아세톤/물 (15 mL/10 mL) 중 (2S)-아미노(옥산-4-일)아세트산 (950 mg, 5.97 mmol)에 중탄산나트륨 (5.01 g, 59.7 mmol) 및 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (2.11 g, 6.27 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 주말에 걸쳐 실온에서 교반하였다. 현탁액을 물로 처리하고, MBTE로 2회 더 추출하였다. 수성 상을 1 M 수성 염산을 사용하여 산성화시키고, 디클로로메탄으로 3회 더 추출하였다. 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (이솔레라(Isolera); 50 g 스냅 울트라(SNAP Ultra); 구배: 시클로헥산 50%/에틸 아세테이트 50% + 1% 아세트산에서 시클로헥산 20%/에틸 아세테이트 80% + 1% 아세트산)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔에 녹이고, 2회 더 증발시킨 다음, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 1.08 g (100% 순도, 47% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.90분; MS (ESIpos): m/z = 382 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.150 (0.43), -0.008 (4.33), 0.008 (3.74), 0.146 (0.43), 1.280 (1.03), 1.300 (2.26), 1.309 (2.36), 1.331 (2.75), 1.341 (2.92), 1.371 (2.77), 1.401 (2.54), 1.411 (2.32), 1.430 (1.49), 1.464 (6.34), 1.496 (3.49), 1.932 (1.76), 1.942 (2.14), 1.951 (1.93), 1.960 (2.08), 2.327 (0.64), 2.366 (0.64), 2.670 (0.64), 2.710 (0.65), 3.169 (2.11), 3.212 (2.67), 3.237 (6.32), 3.265 (6.90), 3.704 (0.49), 3.715 (0.49), 3.840 (4.66), 3.854 (5.62), 3.867 (4.30), 3.879 (6.28), 3.899 (5.14), 3.918 (3.56), 4.201 (2.11), 4.218 (5.83), 4.237 (9.07), 4.263 (8.42), 4.274 (9.80), 4.293 (5.14), 4.318 (1.05), 7.309 (6.35), 7.328 (15.12), 7.347 (9.86), 7.400 (9.65), 7.419 (15.88), 7.437 (7.02), 7.652 (5.77), 7.674 (5.52), 7.735 (8.21), 7.740 (8.28), 7.754 (7.63), 7.883 (16.00), 7.902 (14.80), 12.609 (0.56).
실시예 2A
반응을 아르곤 분위기 하에 수행하였다. 53 mL 디클로로메탄 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류신 (9.40 g, 26.6 mmol)에 N,N-디이소프로필에틸아민 (19 mL, 110 mmol) 및 2-클로로트리틸클로라이드 수지 (10.0 g, 13.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 수집된 수지를 디클로로메탄/메탄올 1:1과 함께 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 메탄올 및 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 3A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 2A (15.2 g, 6.82 mmol)를 실온에서 15분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 4A
실시예 3A (11.4 g, 5.13 mmol)를 100 mL DMF 중에서 실온에서 5분 동안 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-S-(트리페닐메틸)-L-시스테인 (6.01 g, 10.3 mmol), DIC (1.5 mL, 10 mmol) 및 옥시마 (1.42 g, 10.0 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 커플링 단계를 밤새 반복하였다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 150 mL DMF로 3회 세척한 다음, 150 mL 메탄올 및 150 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 5A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 4A (18.9 g, 8.51 mmol)를 실온에서 15분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 6A
실시예 5A (16.3 g, 7.32 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류신 (5.18 g, 14.6 mmol), DIC (2.2 mL, 14 mmol) 및 옥시마 (2.03 g, 14.3 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 커플링 단계를 밤새 반복하였다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 7A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 6A (20.0 g, 8.98 mmol)를 실온에서 15분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 8A
실시예 7A (17.8 g, 7.99 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 (2S,3aS,7aS)-1-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥타히드로-1H-인돌-2-카르복실산 (6.25 g, 16.0 mmol), DIC (2.4 mL, 16 mmol) 및 옥시마 (2.21 g, 15.6 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 커플링 단계를 주말에 걸쳐 반복하였다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 9A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 8A (21.5 g, 9.68 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지에 DMF/피페리딘 4:1 200 mL를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 10A
실시예 9A (18.1 g, 8.13 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 1-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-프롤린 (11.0 g, 32.5 mmol), DIC (4.9 mL, 32 mmol) 및 옥시마 (4.51 g, 31.7 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 11A
DMF/피페리딘 4:1 150 mL 중 실시예 10A (20.4 g, 9.16 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 12A
실시예 11A (18.2 g, 8.18 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-류신 (11.6 g, 32.7 mmol), DIC (4.9 mL, 32 mmol) 및 옥시마 (4.53 g, 31.9 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 13A
DMF/피페리딘 4:1 150 mL 중 실시예 12A (20.9 g, 9.42 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 14A
실시예 13A (18.0 g, 8.11 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 O-tert-부틸-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-세린 (12.4 g, 32.4 mmol), DIC (4.9 mL, 32 mmol) 및 옥시마 (4.49 g, 31.6 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 15A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 14A (21.4 g, 9.64 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 16A
실시예 15A (18.9 g, 8.51 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N2-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-N5-[N-(2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디히드로-1-벤조푸란-5-술포닐)카르밤이미도일]-L-오르니틴 (22.1 g, 34.0 mmol), DIC (5.1 mL, 33 mmol) 및 옥시마 (4.72 g, 33.2 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 17A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 16A (23.8 g, 10.7 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 18A
실시예 17A (22.1 g, 9.95 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 O-tert-부틸-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-세린 (15.3 g, 39.8 mmol), DIC (6.0 mL, 39 mmol) 및 옥시마 (5.51 g, 38.8 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 19A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 18A (24.7 g, 11.1 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 20A
실시예 19A (22.2 g, 9.99 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-S-(트리페닐메틸)-L-시스테인 (23.4 g, 40.0 mmol), DIC (6.0 mL, 39 mmol) 및 옥시마 (5.54 g, 39.0 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 21A
DMF/피페리딘 4:1 200 mL 중 실시예 20A (24.5 g, 11.0 mmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 22A
실시예 21A (22.3 g, 10.0 mmol)를 실온에서 5분 동안 150 mL DMF 중에서 팽윤시켰다. 50 mL DMF 중 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류신 (14.2 g, 40.1 mmol), DIC (6.0 mL, 39 mmol) 및 옥시마 (5.55 g, 39.0 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 200 mL DMF로 3회에 이어서 200 mL 메탄올 및 200 mL 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 23A
DMF/피페리딘 4:1 7.5 mL 중 실시예 22A (1.00 g, 250 μmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 메탄올 및 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 24A
실시예 23A (1.00 g, 250 μmol)를 5 mL DMF 중에서 5분 동안 실온에서 팽윤시켰다. 1 mL DMF 중 (2S)-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)(옥산-4-일)아세트산 (381 mg, 1.00 mmol), DIC (150 μL, 980 μmol) 및 옥시마 (139 mg, 975 μmol)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회에 이어서 메탄올 및 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 더 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 25A
7.5 mL DMF/피페리딘 4:1 중 실시예 24A (1.00 g, 250 μmol)를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, DMF로 3회 세척하였다. 두 단계 모두를 반복하고, 수집된 수지를 메탄올 및 디클로로메탄으로 회전 하에 3회 세척하였다. 수집된 수지를 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 26A
(2S,3S)-2-{[(2R)-2-{[(2S,3S)-2-{[(2S,3aS,7aS)-1-{(2S)-1-[(2S,5S,8S,11S,14R,17S,20S)-20-아미노-17-[(2S)-부탄-2-일]-8-(3-카르밤이미드아미도프로필)-5,11-비스(히드록시메틸)-2-(2-메틸프로필)-20-(옥산-4-일)-4,7,10,13,16,19-헥사옥소-14-(술파닐메틸)-3,6,9,12,15,18-헥사아자이코사난-1-오일]피롤리딘-2-카르보닐}옥타히드로-1H-인돌-2-카르보닐]아미노}-3-메틸펜타노일]아미노}-3-술파닐프로파노일]아미노}-3-메틸펜탄산 (단일 입체이성질체)
실시예 25A (1.00 g, 250 μmol)에 TFA/EDT/티오아니솔 (90:3:7)의 절단 칵테일을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 여과물을 수집하고, 수지를 디클로로메탄으로 세척하였다. 합한 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 교반하고, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 디에틸 에테르로 수회 세척하고, 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 184
((2S)-2[(아미노)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)]아세트산)-IC+SRSLP-(Oic)-IC+I-OH (실시예 184)
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-18-({N-[(2S)-2-아미노-2-(옥산-4-일)아세틸]-L-이소류실}아미노)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류신 (단일 입체이성질체)
실시예 26A (425 mg, 304 μmol)에 850 mL 0.1 M 수성 중탄산암모늄 용액 (pH 7.86)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 통해 공기를 5분 동안 버블링하였다. 반응 혼합물을 개방 플라스크에서 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 동결건조시켜 백색 고체 580 mg을 수득하였다. 상기 기재된 바와 같은 역상 HPLC (방법 B)를 사용하여 정제하여 3개의 분획 7.4 mg (＞ 99%), 24.5 mg (98%) 및 15 mg (95%)의 목적 실시예 184를 수득하였다.
일반적 방법 F: 펩티드 TFA 염의 HCl 염으로의 전환
AIC+SRS-((tBu)A)-PPI-((N-Me)C)+IPD-NH2 (HCl 염) (실시예 30)의 합성이 대표적이다.
자동 이온 교환 스테이션의 절차:
히르슈만(Hirschmann) 사의 연동 펌프 (로타루스(Rotarus) 부피 50), 튜브: 타이곤(Tygon) 2001 (ID 0.64 mm)
설정:
H2O로의 세척: 실행-시간 1200초; 80분-1; 1 주기 (35 mL 부피임)
펩티드로의 샘플 순환: 실행-시간 1200초; 80분-1; 1 주기 (70 mL 부피임)
H2O (또는 H2O 중 %ACN)로의 세척: 실행-시간 1200초; 80분-1; 1 주기 (35 mL 부피임)
앰버라이트(Amberlite) IRA 410 (HCl 형태)을 사용하였다. 1500 mg의 수지를 2개의 필터 카트리지에 넣고, 탈이온수로 세척하였다 (10회).
5% ACN/H2O 용액 3 mL 중에 용해된 펩티드를 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 통해 10회 순환시켰다. 칼럼을 물로 세척하고, 용액을 팔콘 튜브 내로 수집하고, 동결건조시켰다.
72.83 mg의 목적 펩티드를 HCl 염으로서 수득하였다: LC-MS (＞ 99%); 이온 크로마토그래피 분석: 3.7 wt% Cl- (1.57 당량 Cl-), ＜ 1 wt% TFA.
이온 교환 공정은 또한 하기 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다:
앰버라이트 IRA 410 수지 (HCl 형태) (1-2 g)를 10 mL 프릿-시린지 (100 mg 펩티드는 1 g IRA 410 수지를 필요로 함)에 넣었다.
1) 수지를 물 (10회 x 3 mL)로 세척한다.
2) 수지를 물 중 5% ACN (1회 x 3 mL)으로 세척한다.
3) 펩티드를 물 중 5% ACN 중에 용해시킨다.
4) 펩티드를 시린지에 첨가하고, 용액을 칼럼을 통해 10-20회 순환시킨다. 용리액을 팔콘 튜브에 수집한다.
5) 수지를 물 중 5% ACN으로 세척하고 (10회 x 3 mL); 이 용액을 팔콘-튜브 중 용액에 첨가한다.
6) 합한 용액을 동결건조시킨다.
일반적 방법 FA: 펩티드 TFA 염의 다른 염으로의 전환
다른 염 형태:
클로라이드 반대 이온은 목적하는 염 형태 (예를 들어 아세트산나트륨)의 용액을 칼럼을 통해 반복적으로 통과시킨 다음, 칼럼을 물로 반복적으로 세척함으로써 다른 반대 이온과 교환될 수 있다. 이어서, 펩티드를 로딩하고, 상기 절차가 뒤따른다. 이에 따라, 펩티드 아세테이트, 타르트레이트, 시트레이트 및 락테이트 염이 제조되었다. 하기 3가지 실시예가 대표적이다:
실시예 249
서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2 (아세테이트 염) (실시예 249)
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-18-[(N-메틸글리실-L-이소류실)아미노]-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤린아미드, 아세트산 염
IRA 410 클로라이드 수지 (12 g)를 비어있는 20 mL 바이오타지 칼럼에 넣고, 수지를 ACN-물의 5% 용액으로 세척하였다 (10회). 카트리지를 자동 이온 교환 스테이션에 부착하였다. 수지를 20 칼럼 부피의 1 M NaOH 용액 (2 x 1800s 회전 속도 80분-1)으로 세척하였다. 용리액의 pH가 ＜ pH 9 (10 칼럼 부피)가 될 때까지 칼럼을 물로 세척하였다. 이어서, 칼럼을 1 M 아세트산 용액 (10 칼럼 부피)으로 용리시킨 다음, 용리액의 pH가 ＞ 5 (약 10 칼럼 부피)가 될 때까지 물로 세척하였다. 펩티드 (N-Me)GIC+SRSLP-(Oic)-I-Pen+IP-NH2 (TFA 염) (1200 mg)를 5% ACN/물 12 mL 중에서 칼럼 상에 로딩하고, 일반적 방법 F에 따라 칼럼을 통해 10회 순환되도록 하였다. 이어서, 수지를 5% ACN/물 용액으로 10회 세척하고, 용리액을 50 mL 팔콘 튜브 내로 수집하였다. 이 규모에 사용된 파라미터 설정은 다음과 같았다:
H2O로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (90 mL 부피임)
펩티드로의 샘플 순환: 실행-시간 3085초; 80분-1; 주기 (180 mL 부피임)
H2O (또는 H2O 중 %ACN)로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 주기 (90 mL 부피임).
합한 용리액을 동결건조시켜 표적 아세테이트 염 1120 mg (100% 순도, 97% 수율)을 수득하였다.
이온 크로마토그래피 (클로라이드 함량): ＜ 1% 클로라이드
이온 크로마토그래피 (TFA 함량): ＜ 1% TFA
이온 크로마토그래피 (아세테이트 함량): 7.1% 아세테이트 = 1.84 당량
LC-MS (MCW-TOF-AQ-YMC-18min): Rt = 7.74분; MS (ESIpos): m/z = 725 [M+2H]+
실시예 264
서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2 (L-타르타르산 염) (실시예 264)
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-18-[(N-메틸글리실-L-이소류실)아미노]-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤린아미드 (2R,3R)-2,3-디히드록시부탄디오산 (L-(+) 타르타르산) 염
IRA 410 클로라이드 수지 (12.5 g)를 비어있는 20 mL 바이오타지 칼럼에 넣고, 수지를 ACN-물의 5% 용액으로 세척하였다 (10회). 카트리지를 자동 이온 교환 스테이션에 부착하였다. 수지를 20 칼럼 부피의 1 M NaOH 용액 (2 x 1800s 회전 속도 80분-1)으로 세척하였다. 용리액의 pH가 ＜ pH 9 (10 칼럼 부피)가 될 때까지 칼럼을 물로 세척하였다. 이어서, 칼럼을 1 M L-타르타르산 용액 (10 칼럼 부피)으로 용리시킨 다음, 용리액의 pH가 ＞ 5 (약 10 칼럼 부피)가 될 때까지 물로 세척하였다. 펩티드 ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2 (TFA 염) (1200 mg)를 5% ACN/물 12 mL 중에서 칼럼 상에 로딩하고, 일반적 방법 F에 따라 칼럼을 통해 10회 순환되도록 하였다. 이어서, 수지를 5% ACN/물 용액으로 10회 세척하고, 용리액을 50 mL 팔콘 튜브 내로 수집하였다. 이 규모에 사용된 파라미터 설정은 다음과 같았다:
H2O로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (90 mL 부피임)
펩티드로의 샘플 순환: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (180 mL 부피임)
H2O (또는 H2O 중 %ACN)로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (90 mL 부피임).
합한 용리액을 동결건조시켜 표적 L-타르타르산 염 1170 mg (100% 순도, 91% 수율)을 수득하였다.
이온 크로마토그래피 (클로라이드 함량): ＜ 1% 클로라이드
이온 크로마토그래피 (TFA 함량): ＜ 1% TFA
이온 크로마토그래피 (아세테이트 함량): 13.4% 아세테이트 = 1.49 당량
LC-MS (MCW-TOF-AQ-YMC-18min): Rt = 7.62분; MS (ESIpos): m/z = 725 [M+2H]+
실시예 376
서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2 (시트르산 염) (실시예 376)
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-18-[(N-메틸글리실-L-이소류실)아미노]-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤린아미드, 2-히드록시프로판-1,2,3-트리카르복실산 (시트르산) 염
IRA 410 클로라이드 수지 (26 g)를 비어있는 20 mL 바이오타지 칼럼에 넣고, 수지를 ACN-물의 5% 용액으로 세척하였다 (10회). 카트리지를 자동 이온 교환 스테이션에 부착하였다. 수지를 20 칼럼 부피의 1 M NaOH 용액 (2 x 1800s 회전 속도 80분-1)으로 세척하였다. 용리액의 pH가 ＜ pH 9 (10 칼럼 부피)가 될 때까지 칼럼을 물로 세척하였다. 이어서, 칼럼을 1 M 시트르산 용액 (10 칼럼 부피)으로 용리시킨 다음, 용리액의 pH가 ＞ 5 (약 10 칼럼 부피)가 될 때까지 물로 세척하였다. 펩티드 (N-Me)GIC+SRSLP-(Oic)-I-Pen+IP-NH2 (TFA 염) (1200 mg)를 5% ACN/물 12 mL 중에서 칼럼 상에 로딩하고, 일반적 방법 F에 따라 칼럼을 통해 10회 순환시켰다. 이어서, 수지를 5% ACN/물 용액으로 10회 세척하고, 용리액을 50 mL 팔콘 튜브 내로 수집하였다. 이 규모에 사용된 파라미터 설정은 다음과 같았다:
H2O로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (90 mL 부피임)
펩티드로의 샘플 순환: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (180 mL 부피임)
H2O (또는 H2O 중 %ACN)로의 세척: 실행-시간 3085초; 80분-1; 1 주기 (90 mL 부피임)
합한 용리액을 동결건조시켜 표적 L-타르타르산 염 1370 mg (100% 순도, 97% 수율)을 수득하였다.
이온 크로마토그래피 (클로라이드 함량): ＜ 1% 클로라이드
이온 크로마토그래피 (TFA 함량): ＜ 1% TFA
이온 크로마토그래피 (아세테이트 함량): 19.0% 아세테이트 = 1.77 당량
LC-MS (MCW-TOF-AQ-YMC-18min): Rt = 7.6분; MS (ESIpos): m/z = 725 [M+2H]+
관련 기술분야의 통상의 기술자는 이온 크로마토그래피에 의한 화학량론이 항상 화학량론적 (예를 들어 1:2 또는 1:1)인 것은 아니지만, 물 함량이 고려되지 않았으며, 이는 측정된 몇몇 경우에 8-15% 물 함량일 수 있음을 인식할 것이다.
일반적 방법 G: 염-유리 형태의 제조
AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-NH2 (염 유리 형태) (실시예 27)의 제조가 대표적이다.
TFA 염 (실시예 75) 5 그램을 산 개질제 없이 70℃에서 아세토니트릴 물 구배를 사용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 동결건조시켰다. 염-유리 형태 (실시예 27) 2.2 그램을 수득하였다; LC-MS (＞ 99% 순도); 이온 크로마토그래피 (＜ 1% TFA).
일반적 방법 H: 대규모 합성
AIC+SRS-((tBu)A)-PPI-((N-Me)C)+IPD-NH2 (실시예 48)의 합성이 대표적이다.
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
1) DMF를 MBHA 수지 (180 mmol)를 함유하는 용기에 첨가하고, 수지를 2시간 동안 팽윤되도록 하였다.
2) Fmoc-링크 아미드 링커를 첨가하고, 30초 동안 혼합한 다음, 활성화 완충제를 첨가하였다. 혼합을 N2 버블링을 사용하여 약 1시간 동안 수행하였다.
3) 용액을 수지로부터 배수시키고, 수지를 DMF 세척액으로 세척하였다 (30초 x 3회).
4) 20% 피페리딘/DMF의 용액을 첨가하고, 질소 버블링 하에 30분 동안 혼합하였다.
5) 용액을 배수시키고, 수지를 DMF로 세척하였다 (5회).
6) Fmoc-아미노산 용액을 첨가하고, 30초 동안 혼합한 다음, 활성화 완충제를 첨가하였다. 혼합을 N2 버블링을 사용하여 약 1시간 동안 수행하였다.
7) 단계 3 내지 6을 각각의 아미노산 커플링에 대해 반복하였다.
표 10: 사용된 물질 및 조건의 기록
DMF 중 20% 피페리딘의 용액을 30분 동안 Fmoc 탈보호에 사용하였다. 커플링 반응을 닌히드린 시험에 의해 모니터링하고, 수지를 DMF로 5회 세척하였다.
펩티드 절단 및 정제:
1) 절단 완충제 (92.5% TFA: 2.5% EDT: 2.5% TIS: 2.5% H2O)를 실온에서 측쇄 보호된 펩티드를 함유하는 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다.
2) 펩티드를 차가운 이소프로필 에테르로 침전시키고, 원심분리하였다 (5000rpm에서 2분).
3) 펩티드를 이소프로필 에테르로 2회 더 세척하였다.
4) 조 펩티드를 진공 하에 2시간 동안 건조시켰다.
디술피드 형성
H2O/I (3 L 2:1) 중 조 선형 펩티드 (15 g, 9.92 mmol, 1.0 당량) (20개 배치)의 용액에 NH4HCO3 (7.84 g, 99.2 mmol, 10 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하고, HCl을 PH~6까지 첨가하여 켄칭한 다음, 혼합물을 동결건조시켰다. 동결건조물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 목적 실시예 48 (41.8 g, 95.8%, 13.3% 수율)을 백색 고체로서, 총 156.8 그램을 수득하였다.
정제 조건
장비: 시마즈(Shimadzu) 10A; 펩티드를 DMF/H2O 중에 용해시켰다. 이동상: A H2O (H2O 중 0.075% TFA), B EtOH; 구배: 10-50%-60분. 체류 시간: 47분; 칼럼: 루나, C18, 10 μm, 100A, 25 cm x 50 mm; 유량: 80 mL/분; 파장: 220/254 nm; 오븐 온도: 실온.
방법 I: ((N-Me)A)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-((N-벤질)D)-NH2 (실시예 462)의 제조
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-18-[(N-메틸-L-알라닐-L-이소류실)아미노]-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤릴-N4-벤질-L-아스파르트아미드
펩티드를 링크 아미드 MBHA 수지 (전형적으로 대략 0.4-0.6 mmol/g 로딩) 상에서 0.3 mmol 규모로 제조하였다. 제1 아미노산 Fmoc-Asp(2-페닐이소프로필 에스테르)-OH (CAS 200336-86-3)를 방법 C에 기재된 방법을 사용하여 수지에 첨가하였다. 펩티드 서열을 방법 C에 기재된 단계를 사용하여 구축하였다. 서열의 완료 시, 2-OPP 보호기를 DCM 중 1%TFA를 사용하여 30분간 제거하였다. N-벤질 아민 (3 당량), DIC (3 당량) 및 옥시마 (3 당량)를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 펩티드를 절단하고, 디술피드 결합을 형성하고, 펩티드를 방법 C에 따라 정제하였다.
일반적 방법 J. ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-(*Dap)-OH (실시예 467)의 제조
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-18-[(N-메틸글리실-L-이소류실)아미노]-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-N-[(2S)-2-아미노-2-카르복시에틸]-L-프롤린아미드
펩티드를 방법 C에 따라 2-클로로트리틸 수지 상에서 제조하였다. BOC-Dap (Fmoc)-OH (CAS 122235-70-5)를 방법 C에 따라 수지 상에 첨가하였다. 펩티드를 구축하고, 방법 C에 따라 정제하였다.
일반적 방법 K. (2-(모르폴린)아세틸)-IC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IPD-NH2 (실시예 283)의 제조
실시예 27A
N-(브로모아세틸)-L-이소류실-L-시스테이닐-L-세릴-L-아르기닐-L-세릴-4-메틸-L-류실-L-프롤릴-L-프롤릴-L-이소류실-3-술파닐-L-발릴-L-이소류실-L-프롤릴-L-알파-아스파라긴
서열 IC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IPD-NH2를 방법 A에 따라 링크아미드 켐매트릭스 수지 상에서 0.1 mmol 규모로 12회 제조하였다. 수지-함유 펩티드 (200 mg 100 μmol)에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (31 μL, 200 μmol), 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 (28.4 mg, 200 μmol) 및 브로모아세트산 (14 μL, 200 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 5 mL DMF 중에서 밤새 실온에서 써모믹서 진탕기 상에서 진탕시켰다. 수지를 여과하고, DMF (6 x 5 mL)로 세척하고, DCM (6 x 5 mL)으로 세척한 다음, 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 283
N-[(5aS,11S,14S,17S,20S,23R,28R,31S,33aS)-31-[(2S)-부탄-2-일]-17-(3-카르밤이미드아미도프로필)-11-(2,2-디메틸프로필)-14,20-비스(히드록시메틸)-27,27-디메틸-23-({N-[(모르폴린-4-일)아세틸]-L-이소류실}아미노)-5,10,13,16,19,22,30,33-옥타옥소옥타코사히드로-1H,5H,10H-디피롤로[2,1-j:2',1'-m][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코신-28-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤릴-L-알파-아스파라긴
NMP (10 mL) 중 실시예 27a (200 mg, 74% 순도, 77.7 μmol)에 모르폴린 (34 μl, 390 μmol)을 첨가하고, 현탁액을 써모믹서에서 37℃에서 진탕시켰다. 고체 수지를 여과에 의해 수집하고, 10 mL DMF 및 10 mL 디클로로메탄으로 각각 2회 세척하였다. 잔류물을 TFA/EDT/티오나이솔 (90:3:7)로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 차가운 디에틸 에테르 (-10℃)로 처리한 다음, 현탁액을 질소 하에 원심분리하고, 차가운 디에틸에테르로 3회 (3 x 30 mL) 세척하였다. 잔류물에 0.1 M 수성 중탄산암모늄 용액 (400 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 공기에 개방된 둥근 바닥 플라스크에서 밤새 진탕시켰다. 용액을 동결건조시키고, 동결건조된 분말을 방법 A에 따라 정제하여 실시예 283 20.4 mg (98% 순도, 16% 수율)을 수득하였다.
실시예 300 (2-히드록시아세틸)-IC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IPD-NH2를 부산물로서 단리하였다.
일반적 방법 L. 나트륨 및 콜린 염 형태의 제조
이들 염은 염-유리 형태의 펩티드로부터 제조하였다. 하기 두 실시예는 일반적인 방법을 대표한다:
실시예 431
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-18-[(L-알라닐-L-이소류실)아미노]-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-N-[(1S)-1,2-디카르복실레이토에틸]-L-프롤린아미드, 나트륨 염
서열: AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (나트륨 염) (실시예 431)
20 mL 아세토니트릴/물 1:1 중 AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (염-유리 형태) (100 mg)의 용액에 1.3 mL의 0.1 M 수산화나트륨 용액을 첨가하였다. 혼합물을 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 109 mg (104% 수율, 99% 순도)을 수득하였다.
LC-MS (MCW-TOF-AQ-YMC-18min): Rt = 8.62분; MS (ESIpos): m/z = 783 [M+2H]2+
이온 크로마토그래피 (나트륨 함량): 2.9% 나트륨 = 2.03 당량
실시예 432
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,29aS,33aS,35aS)-18-[(L-알라닐-L-이소류실)아미노]-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-N-[(1S)-1,2-디카르복실레이토에틸]-L-프롤린아미드, 2-히드록시-N,N,N-트리메틸에탄-1-암모늄) (콜린) 염
20 mL 아세토니트릴/물 1:1 중 AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (염-유리 형태) (100 mg)의 용액에 511 μL의 0.25 M 콜린 히드록시드 용액을 첨가하였다. 혼합물을 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 122 mg (105% 수율, 99% 순도)을 수득하였다.
LC-MS (MCW-TOF-AQ-YMC-18min): Rt = 8.65분; MS (ESIpos): m/z = 783 [M+2H]2+
이온 크로마토그래피 (콜린 함량): 11.7% 콜린 = 1.97 당량
실시예 13
AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (실시예 13)
(3S)-4-아미노-3-({(2S)-1-[(2S,3S)-2-{[(2R)-2-{[(2S,3S)-2-{[(2S,3aS,7aS)-1-{(2S)-1-[(2S,5S,8S,11S,14R,17S,20S)-20-아미노-17-[(2S)-부탄-2-일]-8-(3-카르밤이미드아미도프로필)-5,11-비스(히드록시메틸)-2-(2-메틸프로필)-4,7,10,13,16,19-헥사옥소-14-(술파닐메틸)-3,6,9,12,15,18-헥사아자헤니코산-1-오일]피롤리딘-2-카르보닐}옥타히드로-1H-인돌-2-카르보닐]아미노}-3-메틸펜타노일]아미노}-3-메틸-3-술파닐부타노일]아미노}-3-메틸펜타노일]피롤리딘-2-카르보닐}아미노)-4-옥소부탄산
펩티드 합성
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
1) 수지 제조: CTC 수지 (15.0 mmol, 15.0 g, 1.0 mmol/g)에 DCM (300 mL) 중 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (15.0 mmol, 6.17 g, 1.0 당량) 및 DIEA (10.4 mL, 60.0 mmol, 4.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 메탄올 (15.0 mL)을 첨가하고, 수지를 N2와 함께 추가로 30분 동안 교반하였다. 수지를 DMF (300 mL x 3)로 세척하였다. 이어서, DMF 중 20% 피페리딘의 용액 (300 mL)을 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하여 수지를 수득하였다. 수지를 DMF (300 mL x 3)로 세척하고, 여과하여 수지를 수득하였다.
2) 커플링: DMF (100 mL) 중 Fmoc-Pro-OH (15.2 g, 45.0 mmol, 3.0 당량), HBTU (16.2 g, 42.8 mmol, 2.85 당량) 및 DIEA (90.0 mmol, 15.6 mL, 6.00 당량)를 수지에 첨가하고, 수지를 N2와 함께 20℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 DMF (300 mL x 5)로 세척하였다.
3) 탈보호: DMF 중 20% 피페리딘 (300 mL)을 수지에 첨가하고, 혼합물을 N2와 함께 20℃에서 20분 동안 교반하였다.
4) 단계 2 및 3을 모든 다른 아미노산에 대해 반복하였다:
표 11: 실시예 13에 사용된 시약
DMF 중 20% 피페리딘을 30분 동안 Fmoc 탈보호에 사용하였다. 커플링 반응을 닌히드린 (Pro를 제외한 모든 아미노산) 및 클로라닐 시험 (Pro)에 의해 모니터링하고, 수지를 DMF (300 mL)로 5회 세척하였다.
HBTU, DIEA 공급업체: 쑤저우 하이파인 바이오테크 캄파니, 리미티드
펩티드 절단 및 정제
5) 수지를 MeOH (300 mL x 5)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 41.5 g의 펩티드 수지를 수득하였다. 이어서, 400 mL의 절단 완충제 (92.5%TFA/2.5%3-메르캅토프로피온산/2.5%TIS/2.5%H2O)를 20℃에서 측쇄 보호된 펩티드 수지를 함유하는 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 교반한 다음, 여과하였다.
6) 펩티드를 차가운 tert-부틸 메틸 에테르 (4000 mL)로 침전시키고, 원심분리 (3000 rpm에서 3분)하여 조 고체 펩티드를 수득하였다. 조 펩티드 침전물을 tert-부틸 메틸 에테르로 3회 더 세척하였다 (1000 mL x 3). 이어서, 조 펩티드를 진공 하에 2.0시간 동안 건조시켜 조 펩티드 21.8 g을 수득하였다.
7) 조 펩티드 (21.8 g)를 CH3CN (6.5 L) 및 물 (6.5 L)에 용해시켰다. I2 (MeOH 중 0.1 M, 55 mL)를 황색이 지속될 때까지 20℃에서 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 20℃에서 2분 동안 교반하였다. 티오황산나트륨 용액 (물 중 0.1 M, 15 mL)을 이어서 황색이 사라질 때까지 적가하였다. 이어서, 혼합물을 동결건조시켜 조 분말 (22.7 g)을 수득하였다.
8) 정제용 HPLC (조건: A: 물 중 0.075% TFA B: CH3CN)에 의한 조 펩티드의 정제, 생성물-함유 분획의 수집 및 동결건조로 표적 펩티드 (서열 ID 13); (4305.1 mg, 18.3% 수율, 110 Å C18 RP-HPLC 칼럼에 의해 99.1% (제미니 C18 5 μm 110 Å 150 x 4.6 mm); 300 Å C18 RP-HPLC 칼럼에 의해 97.8% (디스커버리 바이오 와이드 포어 C18 5 μm 300 Å 150 x 4.6 mm), TFA 염)를 백색 고체로서 수득하였다.
표 12: 정제 조건
LC-MS: Rt = 1.369분; 1564 [M+2H]+
Rt = 8.72분 (99.1% 순도) 제미니 C18 5 μm 110 Å 150 x 4.6 mm
Rt = 9.42분 (97.8%) 디스커버리 바이오 와이드 포어 C18 5 μm 300 Å 150 x 4.6 mm
실시예 13 (TFA 염)으로부터, 실시예 29 (HCl 염)를 일반적 방법 F를 사용하여 제조할 수 있고; 실시예 5 (염-유리 형태)를 일반적 방법 G를 사용하여 제조할 수 있다. 실시예 5로부터의 실시예 431 (나트륨 염) 및 실시예 432 (콜린 염)의 제조를 각각 실시예 431 및 실시예 432로서 하기에 나타냈다.
실시예 237
AIC+SRSL-(L-데히드로프롤린)-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (실시예 237)
N-[(6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,35aS)-18-[(L-알라닐-L-이소류실)아미노]-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,23,24,25,26,27,28,28a,29,29a,30,31,32,33,33a,35,35a-트리아콘타히드로-3H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤릴-L-아스파르트산
펩티드를 방법 C에 따라 제조하였다 (3.12 g). 이러한 펩티드에 대한 분석 데이터가 표 16 및 표 17에서 제시된다.
실시예 142
AIC+SRSL-(Pro-D2)-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (실시예 142)
N-[(1R,2S,6S,9S,12S,15S,18R,23R,26S,28aS,35aS)-18-[(L-알라닐-L-이소류실)아미노]-26-[(2S)-부탄-2-일]-12-(3-카르밤이미드아미도프로필)-9,15-비스(히드록시메틸)-22,22-디메틸-6-(2-메틸프로필)-5,8,11,14,17,25,28,35-옥타옥소(1,2-2H2)도트리아콘타히드로-1H,5H,22H-피롤로[2',1':13,14][1,2,5,8,11,14,17,20,23,26]디티아옥타아자시클로노나코시노[11,10-a]인돌-23-카르보닐]-L-이소류실-L-프롤릴-L-아스파르트산
실시예 237로부터의 펩티드 (30 mg, 19.2 μmol)를 메탄올-d4 (3 mL) (99.8% 순도의 D) 중에 용해시켰다. 로듐 블랙 (CAS 7440-16-6, ACBR, 물품 번호 AB25746) (10 mol%, 1.9 μmol)을 M-브라운 글로브박스(M-Braun Glovebox)에서 아르곤 하에 용액에 첨가하였다. 8 mL 반응 바이알 혼합물을 켐스피드 스윙 XL(Chemspeed Swing XL) 플랫폼 상에 위치하고 엠-브라운 글로브박스 (켐스피드 테크놀로지스 아게, 스위스 4414 퓔린스도르프 뵐페스트라쎄 8, chemspeed@chemspeed.com) 내부에 봉입된 MTP 압력 반응기 블록에 넣었다. 반응물을 중수소 기체 3 bar의 압력 하에 실온에서 650 rpm의 궤도 속도로 16시간 동안 밤새 진탕시켰다. 압력 블록을 아르곤으로 퍼징하고, 바이알을 반응기 블록으로부터 제거하였다. 메탄올-d4를 회전 증발기로 증발시키고, 생성된 고체를 물 (2 mL) 중에 용해시키고, 1시간 동안 교반하여 교환가능한 중수소 원자를 수소로 교환하였다. 1시간 후, 아세토니트릴을 첨가하고, 생성물을 역상 HPLC [칼럼: 페노메넥스 아에리스 펩티드 5 μ XB-C18, 악시아 패킹됨, 21.2 x 250 mm + 카트리지 5 μ, 유량: 20 mL/분, 산성 개질제로서 0.1% TFA를 함유하는 H2O/ACN을 사용한 집중 구배] [FOK30-40: 0분 5% ACN, 0-13분 30% ACN으로 상승, 13-39분 40% ACN으로 편평 상승, 39-46분 등용매 40% ACN]에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 크로마토그래피 분획을 분석용 HPLC (집중 구배) 및 LC-MS에 의해 분석한 다음, 그에 따라 풀링하여 2개 분획의 순수한 생성물을 수득하였다: 11.4 mg (90% 순도, 34% 수율) 및 4.2 mg (99% 순도, 14% 수율). 이 펩티드에 대한 분석 데이터는 표 16에 있다.
생성물 펩티드를 트립신 소화에 적용한 후, 디티오트레이톨과 반응시키고, 생성된 단편을 TOF-MS-MS에 의해 분석하였다. 트립신 소화는 아르기닌과 세린 사이의 펩티드를 절단하였다 (정확한 질량 1583.8384, 실측치 1583.852 [M+2H]2+). 디티오트레이톨과의 반응은 2개의 단편, AICSR-OH (정확한 질량 548.2741, 실측치 548.283 [M+H]+) 및 SL-(Pro-D2)-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (정확한 질량 1037.5800, 실측치 1038.587 [M+H]+)를 생성하였고, 838.47 amu ((Pro-D2)-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH) 및 738.40 amu SL-((Oic)-I-(Pen)+IPD-OH)에서의 단편이 중수소 원자의 위치를 입증하였다.
실시예 28A
(2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산-히드로겐 클로라이드 (1/1) (단일 입체이성질체)
반응을 아르곤 분위기 하에 수행하였다. 탄소 상 팔라듐 (200 mg, 10%)에 20 mL 메탄올 및 벤질 (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실레이트-히드로겐 클로라이드 (1/1) (1.00 g, 3.55 mmol)를 첨가하였다. 반응 플라스크에 수소 기체 (1 atm)를 채우고, 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 규조토 상에서 여과하고, 필터 케이크를 메탄올로 세척하였다. 여과물을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 698 mg을 수득하였다.
(2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산은 또한 염 유리 형태로서 상업적으로 입수가능하다.
실시예 29A
(2S,3aS,6aS)-1-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산 (단일 입체이성질체)
12 mL 물 중 (2S,3aS,6aS)-옥타히드로시클로펜타[b]피롤-2-카르복실산-히드로겐 클로라이드 (1/1) (680 mg, 3.55 mmol)에 중탄산나트륨 (2.98 g, 35.5 mmol) 및 18 mL 아세톤 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (Fmoc-OSu) (1.26 g, 3.73 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 처리하고, 1 M 염산으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지 이솔레라, 칼럼: 50 g 스냅 울트라; 용리액: 디클로로메탄 / 메탄올 100:2 - 100:5)를 통해 분리하였다. 적절한 분획을 합하고, 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 1.27 g (99% 순도, 94% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.08분; MS (ESI pos): m/z = 378 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.260 (1.76), 1.274 (1.85), 1.299 (1.78), 1.321 (2.09), 1.335 (2.38), 1.440 (0.92), 1.455 (1.10), 1.473 (0.87), 1.521 (3.61), 1.537 (3.86), 1.551 (2.28), 1.607 (4.53), 1.620 (3.68), 1.640 (3.08), 1.653 (1.66), 1.712 (2.02), 1.781 (1.38), 1.816 (2.30), 1.827 (2.26), 1.839 (2.37), 1.855 (1.68), 2.073 (1.20), 2.305 (0.83), 2.328 (1.99), 2.351 (1.35), 2.360 (1.64), 2.384 (0.92), 2.468 (0.60), 2.606 (1.50), 2.670 (1.11), 3.860 (0.94), 3.874 (1.94), 3.893 (1.95), 3.907 (0.92), 4.143 (2.61), 4.156 (3.68), 4.167 (5.16), 4.186 (5.89), 4.266 (1.43), 4.280 (3.20), 4.294 (2.11), 4.345 (1.31), 4.371 (3.19), 4.386 (3.83), 4.396 (4.39), 4.411 (3.74), 4.422 (2.40), 4.437 (0.98), 7.292 (0.97), 7.311 (3.89), 7.329 (6.99), 7.346 (6.08), 7.363 (2.49), 7.395 (9.91), 7.414 (16.00), 7.432 (6.98), 7.663 (9.73), 7.680 (6.46), 7.879 (12.31), 7.897 (11.49), 12.586 (0.80).
실시예 30A
(1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (단일 입체이성질체)
(1R,3S,5R)-2-(tert-부톡시카르보닐)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (CAS RN: 197142-34-0, 500 mg)을 4 M HCl-디옥산 용액 (3 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조 생성물을 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 31A
(1R,3S,5R)-2-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (단일 입체이성질체)
3 mL 물 중 (1R,3S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (실시예 30A, 280 mg, 2.20 mmol)의 용액에 중탄산나트륨 (1.85 g, 22.0 mmol) 및 4.5 mL 아세톤 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (0.78 g, 2.31 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 처리하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 역상 HPLC (칼럼: 레프로실(Reprosil); C18; 10 μm; 125 x 30 mm; 용리액 A: CAN, 용리액 B: 0.1% 포름산을 함유하는 물)에 의해 정제하고, 생성물-함유 분획을 합하고, 동결건조시켜 목적 화합물 88.0 mg (96% 순도, 11% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.32분; MS (ESI pos): m/z = 372 [M+Na]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.149 (1.15), -0.008 (10.73), 0.008 (9.13), 0.146 (1.21), 0.468 (1.54), 0.534 (3.66), 0.803 (4.38), 1.682 (2.68), 2.072 (0.75), 2.128 (2.19), 2.142 (2.32), 2.223 (1.05), 2.293 (2.19), 2.327 (4.45), 2.349 (2.68), 2.366 (2.75), 2.523 (3.89), 2.670 (1.44), 2.710 (1.31), 2.816 (0.82), 3.413 (3.93), 3.757 (1.83), 4.010 (2.91), 4.140 (2.39), 4.211 (3.11), 4.285 (12.30), 6.929 (0.43), 6.950 (0.43), 7.340 (9.91), 7.358 (6.02), 7.406 (10.08), 7.425 (16.00), 7.443 (7.10), 7.650 (2.85), 7.702 (4.52), 7.724 (5.53), 7.746 (3.40), 7.892 (12.40), 7.910 (9.85), 12.680 (0.65).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다. 상기 fmoc 아미노산은 또한 상업적으로 입수가능하다.
실시예 32A
벤질 (2R,4R)-4-[(2S)-부탄-2-일]-2-tert-부틸-5-옥소-1,3-옥사졸리딘-3-카르복실레이트 (단일 입체이성질체)
120 mL 에탄올 중 D-알로이소류신 (8.06 g, 61.4 mmol)의 현탁액에 11 mL 물 중 2.45 g 수산화나트륨으로부터 제조된 수산화나트륨 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반한 다음, 증발시켰다. 잔류물을 195 mL 펜탄으로 처리한 다음, 2,2-디메틸프로판알 (10 mL, 92 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 둥근 바닥 플라스크에 부착된 딘-스타크(Dean-Stark) 트랩으로 45℃에서 24시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 톨루엔으로 수회 건조시켰다 (공비 증류). 잔류물을 165 mL 디클로로메탄으로 처리하고, 0℃로 냉각시켰다. 벤질 카르보노클로리데이트 (13 mL, 92 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0-4℃에서 1주 동안 교반하였다. 4-디메틸아미노피리딘 (375 mg, 3.1 mmol) 및 65 mL 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온이 되도록 한 다음, 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 수회 처리하고, 추출하였다. 합한 유기 상을 10% 수성 시트르산으로 2회 및 이어서 포화 수성 중탄산나트륨 용액으로 2회 세척하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (이솔레라; 용리액: 시클로헥산 / 에틸 아세테이트 100:3-100:7)를 통해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 8.71 g을 수득하였다.
실시예 33A
벤질 (2R,4R)-4-[(2S)-부탄-2-일]-2-tert-부틸-4-메틸-5-옥소-1,3-옥사졸리딘-3-카르복실레이트 (단일 입체이성질체)
반응을 아르곤 분위기 하에 수행하였다. 100 mL 건조 THF 중 벤질 (2R,4R)-4-[(2S)-부탄-2-일]-2-tert-부틸-5-옥소-1,3-옥사졸리딘-3-카르복실레이트 (실시예 32A, 8.12 g, 24.4 mmol)를 -78℃로 냉각시켰다. 포타슘 헥사메틸디실라지드 (44 mL, 29 mmol)를 적가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 아이오도메탄 (2.3 mL, 37 mmol)을 반응 혼합물에 적가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄 용액 (20 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온이 되도록 한 다음, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (이솔레라, 칼럼: 100 g 스냅 울트라; 용리액: 시클로헥산 / 에틸 아세테이트 100:3-100:7)를 통해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 3.2 g을 수득하였다.
실시예 34A
N-[(벤질옥시)카르보닐]-2-메틸-D-알로이소류신 (단일 입체이성질체)
메탄올 (40 mL) 중 벤질 (2R,4R)-4-[(2S)-부탄-2-일]-2-tert-부틸-4-메틸-5-옥소-1,3-옥사졸리딘-3-카르복실레이트 (실시예 33A, 3.20 g, 9.21 mmol)의 용액에 1 M 수산화나트륨 용액 (40 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 메탄올을 증발시켰다. 잔류물을 10% 시트르산 용액으로 처리하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 2회 더 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 2.77 g을 수득하였다.
실시예 35A
2-메틸-D-알로이소류신 (단일 입체이성질체)
반응을 아르곤 분위기 하에 수행하였다. 190 mL 메탄올 중 N-[(벤질옥시)카르보닐]-2-메틸-D-알로이소류신 (실시예 34A, 2.57 g, 9.20 mmol)에 탄소 상 팔라듐 (390 mg, 10%)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 실온 및 정상 압력에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 규조토 상에서 여과하고, 여과물을 농축시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 1.32 g (98% 수율)을 수득하였다.
실시예 36A
N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-2-메틸-D-알로이소류신 (단일 입체이성질체)
물 (20 mL) 및 아세톤 (29 mL)의 혼합물 중 2-메틸-D-알로이소류신 (실시예 35A, 1.32 g, 9.09 mmol)의 용액에 중탄산나트륨 (7.64 g, 90.9 mmol)을 첨가한 다음, 아세톤 (20 mL) 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (3.22 g, 9.55 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 MTBE로 처리하고, 추출하였다. 수성 상을 진한 염산 (pH 1)을 사용하여 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 더 추출하였다. 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (이솔레라, 칼럼: 50 g 스냅 울트라; 용리액: 디클로로메탄 / 메탄올 100:3-100:5)를 통해 분리하였다. 적절한 분획을 합하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켰다.
MTBE 상을 후속적으로 5% 중탄산나트륨 용액으로 처리하고, 에틸 아세테이트 (600 mL)로 추출하였다. 수성 상을 진한 염산 (pH 1)을 사용하여 산성화시키고, 매회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켰다. 합한 조 생성물 수율은 2.53 g이었다.
잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (이솔레라, 칼럼: 50 g 스냅 울트라; 용리액: 디클로로메탄 / 메탄올 97:3-97:5)를 통해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 967.4 mg을 수득하였다. 생성물을 물/아세토니트릴 중에 추가로 용해시키고, 사용 전에 동결건조시켰다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.10분; MS (ESI pos): m/z = 368.1857 [M+H]+
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 37A
(6S)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (입체이성질체의 혼합물)
85 mL 디클로로메탄 중 (6S)-5-(tert-부톡시카르보닐)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (오메가(Omega), CAS 1357482-03-1) (2.50 g, 9.02 mmol)에 트리플루오로아세트산 (15 mL, 250 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 후속 단계를 위해 진공 하에 건조시켰다.
실시예 38A
(6S)-5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (입체이성질체의 혼합물)
물 (13 mL) 중 (6S)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (입체이성질체의 혼합물) (실시예 37A, 1.60 g, 9.03 mmol)의 용액에 중탄산나트륨 (7.59 g, 90.3 mmol)에 이어서 아세톤 (20 mL) 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (3.20 g, 9.48 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 처리하고, MTBE로 2회 추출하였다. 수성 상을 염산을 사용하여 pH 3으로 산성화시키고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 3.31 g (92% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.99분; MS (ESI pos): m/z = 400 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.106 (16.00), 1.589 (0.92), 1.605 (1.39), 1.619 (1.06), 1.627 (1.11), 1.655 (0.62), 1.682 (1.25), 1.703 (1.21), 1.916 (0.49), 1.949 (0.86), 1.978 (0.91), 2.012 (0.85), 2.042 (0.52), 2.086 (11.35), 2.558 (0.83), 2.568 (0.67), 2.591 (0.67), 2.645 (0.52), 2.670 (0.56), 3.077 (5.29), 3.442 (0.43), 3.452 (0.50), 3.471 (1.17), 3.479 (1.13), 3.500 (1.39), 3.527 (0.51), 3.562 (1.21), 3.627 (1.20), 3.652 (1.65), 3.677 (0.78), 4.186 (1.02), 4.200 (2.72), 4.223 (2.09), 4.238 (2.18), 4.257 (1.63), 4.279 (2.63), 4.294 (2.46), 4.306 (1.36), 4.322 (1.56), 4.348 (2.13), 4.359 (1.17), 4.372 (1.33), 4.382 (0.84), 4.477 (0.57), 4.499 (0.61), 4.510 (0.69), 4.518 (0.72), 4.533 (0.73), 4.541 (0.64), 5.754 (0.94), 7.300 (0.77), 7.316 (3.26), 7.334 (5.65), 7.353 (3.32), 7.406 (4.71), 7.425 (7.78), 7.443 (3.45), 7.640 (4.69), 7.659 (4.35), 7.683 (0.73), 7.884 (5.08), 7.903 (4.79).
실시예 39A
(6S)-5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1) 및 (거울상이성질체 2)
부분입체이성질체 혼합물을 키랄셀 AD-H (SFC) 5 μm, 250 x 30 mm 칼럼을 사용하는 THAR 초임계 유체 크로마토그래피 정제용 200 기기를 사용하여 분리하였다; 용리액: CO2/이소-프로판올 (83:17); 압력: 135 bar; 용리액 온도: 38℃; 지클론 온도: 40℃; 지클론 압력: 24 bar; 유량: 100 g/분; 검출: UV 210 nm; 주입 부피 0.4 mL/주입; 일반적 작업 조건 하에 CO2 1 g/분은 1 mL/분과 대략 동등함.
순서 설정: 주기 시간 = 11.2분
분획 1을 5.85분 내지 8.0분에 수집하였다 (거울상이성질체 1).
분획 2를 8.4분 내지 10.25분에 수집하였다 (거울상이성질체 2).
분획을 농축시켰다.
분획을 분석용 SFC-MS (애질런트, 칼럼: 키랄팩 AD-3 3 μm 100 x 4.6 mm, 용리액: CO2/이소-프로판올 (85:15); BPR 압력: 130 bar; BPR 온도: 60℃; 칼럼 온도: 40℃; 유량: 3 mL/분; UV 210 nm)를 사용하여 분석하였다.
분획 1 (Rt = 2.081분)을 추가로 "(거울상이성질체 1)"로 할당하였다.
분획 2 (Rt = 2.838분)에 추가로 "(거울상이성질체 2)"로 할당하였다.
2종의 거울상이성질체의 입체화학은 할당하지 않았다.
실시예 40A
(3R*,6S)-5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (단일 거울상이성질체, 거울상이성질체 1, 3 위치에서의 입체화학은 정의되지 않음)
키랄 SFC 정제용 정제로부터, 표제 화합물 2.015 g, 100% ee를 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.99분; MS (ESI pos): m/z = 400 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (0.70), 0.008 (0.74), 1.032 (15.85), 1.047 (16.00), 1.285 (1.59), 1.568 (0.69), 1.589 (1.52), 1.617 (1.57), 1.635 (0.96), 1.656 (0.63), 1.686 (1.36), 1.702 (1.37), 1.941 (0.90), 1.974 (1.05), 2.008 (0.87), 2.041 (0.90), 2.073 (1.11), 2.557 (1.08), 2.566 (0.95), 2.591 (0.80), 2.645 (0.71), 2.670 (0.95), 2.701 (0.65), 3.451 (0.87), 3.468 (1.64), 3.479 (1.88), 3.495 (1.12), 3.505 (1.17), 3.626 (2.11), 3.651 (2.91), 3.677 (1.38), 3.770 (0.41), 3.778 (0.42), 4.169 (0.43), 4.186 (1.17), 4.200 (3.11), 4.221 (2.05), 4.238 (1.40), 4.256 (1.57), 4.279 (3.79), 4.293 (3.74), 4.304 (1.62), 4.322 (2.70), 4.336 (1.12), 4.348 (2.93), 4.358 (1.92), 4.371 (1.64), 4.381 (1.52), 4.509 (1.14), 4.517 (1.25), 4.531 (1.28), 4.540 (1.12), 7.300 (0.91), 7.315 (3.87), 7.334 (7.04), 7.350 (3.82), 7.352 (4.21), 7.406 (5.88), 7.424 (9.76), 7.443 (4.35), 7.640 (7.54), 7.658 (6.74), 7.885 (6.80), 7.904 (6.34), 10.194 (0.55), 10.991 (0.42).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 41A
(3S*,6S)-5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (단일 거울상이성질체, 거울상이성질체 2, 시클로프로필 중심에서의 입체화학은 할당하지 않음)
키랄 SFC 정제용 정제로부터, 표제 화합물 1.041 g, 94.58% ee를 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.93분; MS (ESI pos): m/z = 400 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (1.19), 0.008 (1.31), 1.031 (0.55), 1.047 (0.56), 1.285 (0.60), 1.583 (1.53), 1.604 (4.87), 1.627 (5.45), 1.650 (3.25), 1.673 (2.78), 1.682 (3.76), 1.704 (3.11), 1.718 (0.95), 1.915 (3.17), 1.949 (3.55), 1.979 (3.13), 2.012 (3.33), 2.073 (3.85), 2.526 (1.60), 2.590 (1.44), 2.626 (1.61), 2.649 (0.89), 2.659 (0.80), 3.471 (2.04), 3.498 (5.50), 3.527 (3.26), 3.561 (7.96), 3.570 (4.68), 3.598 (0.84), 4.167 (0.94), 4.183 (2.75), 4.199 (6.46), 4.223 (7.75), 4.238 (9.60), 4.258 (5.95), 4.277 (4.06), 4.290 (3.98), 4.306 (3.80), 4.319 (4.63), 4.340 (4.17), 4.346 (4.47), 4.354 (2.34), 4.367 (3.96), 4.477 (3.66), 4.497 (3.66), 7.300 (1.97), 7.318 (8.34), 7.334 (11.70), 7.337 (12.42), 7.352 (6.35), 7.355 (6.41), 7.407 (9.62), 7.425 (16.00), 7.444 (7.11), 7.633 (6.46), 7.651 (10.65), 7.666 (6.62), 7.683 (4.36), 7.883 (9.71), 7.893 (10.32), 7.901 (9.57), 7.912 (8.99), 12.802 (0.79), 12.984 (0.67).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 42A
3-[4-(tert-부톡시카르보닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-알라닌 (단일 입체이성질체)
27 mL 물/tert. 부탄올/디클로로메탄 (1:1:1)의 혼합물 중 3-아지도-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-알라닌 (1.00 g, 2.84 mmol)에 tert-부틸 프로프-2-이노에이트 (580 μL, 4.3 mmol), 황산구리 (II) 5수화물 (709 mg, 2.84 mmol) 및 14 mL 물 중 아스코르브산나트륨 (1.41 g, 7.10 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 처리하고, 묽은 시트르산으로 산성화시키고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴/물에 녹이고, 정제용 HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18 10 μm 125 x 40 mm; 0.05% TFA를 함유하는 물-아세토니트릴-구배: 0-2분 25% 아세토니트릴, 2-22분 25-75% 아세토니트릴, 23-26분 75% 아세토니트릴, 26-28분 다시 25% 아세토니트릴; 유량 100 mL/분)를 통해 2 부분으로 분리하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 1.02 g (100% 순도, 75% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.30분; MS (ESI neg): m/z = 477 [M-H]-
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 43A
5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산-트리플루오로아세트산 (1/1)
25 mL 디클로로메탄 중 5-(tert-부톡시카르보닐)-5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산 (1.00 g, 4.14 mmol)의 용액에 TFA (960 μL, 12 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 0.80 g (76% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.18분; MS (ESI pos): m/z = 142 [M+H]+
실시예 44A
5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산
5 mL 아세토니트릴 및 5 mL 물의 혼합물 중 5-아자스피로[2.4]헵탄-1-카르복실산-트리플루오로아세트산 (1/1) (실시예 43A, 994 mg, 3.90 mmol)의 용액에 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (2.63 g, 7.79 mmol) 및 트리에틸아민 (2.2 mL, 16 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 처리하고, 1 M 염산을 사용하여 pH 4로 산성화시킨 다음, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴로 연화처리한 다음, 침전물을 여과에 의해 수집하고, 아세토니트릴로 세척하였다. 여과물을 정제용 HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18 10 μm 125 x 40 mm; 0.05% TFA를 함유하는 물-아세토니트릴-구배: 0-2분 25% 아세토니트릴, 2-22분 25-75% 아세토니트릴, 23-26분 75% 아세토니트릴, 26-28분 다시 25% 아세토니트릴; 유량 100 mL/분)를 통해 3 부분으로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 목적 화합물 1.16 g (95% 순도, 78% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.99분; MS (ESI pos): m/z = 364 [M+H]+
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 45A
tert-부틸 (3S,5S,6R)-3-(2-메틸알릴)-2-옥소-5,6-디페닐-모르폴린-4-카르복실레이트
2개의 배치를 병행하여 실행하였다: THF (1.8 L) 및 HMPA (180 mL) 중 tert-부틸 (2R,3S)-6-옥소-2,3-디페닐-모르폴린-4-카르복실레이트 (90.0 g, 255 mmol) 및 3-브로모-2-메틸-프로프-1-엔 (37.0 g, 27.6 mL, 274 mmol)의 용액에 질소 분위기 하에 -70℃에서 60분의 기간에 걸쳐 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드 (279 mL, THF 중 1 M)를 적가하였다. 이어서, 용액을 -70℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 합하고, 포화 수성 염화암모늄 용액 (2.5 L)에 의해 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (2.0 L x 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액 (1.5L x 2)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 10/1)에 의해 정제하여 잔류물을 수득하고, 잔류물 및 석유 에테르/EtOAc (2.0 L/0.2 L)의 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반한 다음, 여과하여 목적 화합물 145 g (89% 순도, 62% 수율)을 수득하였다.
LC-MS: Rt = 1.027분, MS+Na = 430.2
1H NMR: CDCl3: 7.35-7.00 (m, 8H), 6.52 (m, 2H), 6.35-6.28 (m, 1H), 5.15-4.82 (m, 4H), 2.95-2.70 (m, 2H), 1.87 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.03 (s, 6H)
실시예 46A
(3S,5S,6R)-3-[(1-메틸시클로프로필)메틸]-5,6-디페닐-모르폴린-2-온
3개의 배치를 병행하여 실행하였다. 1.3 L 디클로로메탄 중 tert-부틸 (3S,5S,6R)-3-(2-메틸알릴)-2-옥소-5,6-디페닐-모르폴린-4-카르복실레이트 (실시예 45A, 35.0 g, 76 mmol)의 용액에 디에틸아연 (400 mL, 톨루엔 중 1 M)을 0℃에서 30분에 걸쳐 첨가한 다음, 클로로(아이오도)메탄 (140 g, 793 mmol, 57.6 mL)을 0℃에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 합하고, 2.0 L 포화 수성 중탄산나트륨 용액에 붓고, 용액을 여과한 다음, 여과물을 디클로로메탄 (1.0 L x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 1.5 L 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카의 짧은 조각을 통해 여과하였다. 이어서, 여과물을 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물 및 석유 에테르/에틸 아세테이트/디클로로메탄 (10/1/1, 400 mL)의 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 여과하였다. 여과물을 약 120 mL로 농축시킨 다음, 여과하여 목적 화합물 20 g (92% 순도, 25% 수율)을 수득하였다.
LC/MS: Rt = 0.909분, M+H+ = 322.2
실시예 47A
(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산
-70℃로 냉각시킨 에탄올 (50 mL), 액체 암모니아 (600 mL), THF (500 mL) 및 (3S,5S,6R)-3-[(1-메틸시클로프로필)메틸]-5,6-디페닐-모르폴린-2-온 (실시예 46A, 57.4 g)을 함유하는 교반 용액에 리튬 (8 g, 1.15 mol)을, -70℃에서 10분 동안 진청색이 지속될 때까지 -70℃에서 0.5시간에 걸쳐 작은 조각으로 첨가하였다. 반응물을 20% 수성 염화암모늄 용액 50 mL를 조심스럽게 첨가하여 켄칭하고, 냉각 조를 제거하고, 반응물을 25℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 300 mL 물로 희석하고, MTBE (200 mL x 2)로 추출하였다. 수성 상을 얼음에서 냉각시키고, 1 M 수성 염산을 사용하여 pH= 1로 산성화시키고, 즉시 에틸 아세테이트 (800 mL x 2)로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 상을 300 mL 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 목적 화합물 24 g (99 mmol)을 수득하였다.
실시예 48A
(2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산 히드로클로라이드
디클로로메탄 (60 mL) 중 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산 (실시예 47A, 24.0 g, 99 mmol)의 용액에 염산/디옥산 (200 mL, 4 M)을 25℃에서 15분에 걸쳐 첨가한 다음, 용액을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MTBE 150 mL로 처리하고, 25℃에서 15분 동안 교반한 다음, 여과하여 목적 화합물 16 g (90% 수율)을 수득하였다.
1H NMR: DMSO-d6: 0.21-0.33 (3H, m), 0.37-0.51 (1H, m), 1.64-1.81 (2H, d), 3.88-3.92 (1H, t), 8.41 (3H, s), 13.73 (1H, s)
실시예 49A
(2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산
THF (200 mL) 및 물 (200 mL) 중 ((2S)-2-아미노-3-(1-메틸시클로프로필)프로판산 히드로클로라이드 (실시예 48A, 14 g, 77.9 mmol) 및 탄산나트륨 (25 g, 236 mmol)의 용액에 0℃에서 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (25 g, 74.1 mmol)을 30분에 걸쳐 첨가한 다음, 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 100 mL 물을 첨가하였다. 용액을 MTBE (300 mL x 2)로 추출한 후, 수성 상의 pH를 2 M 수성 염산을 사용하여 2로 조정하였다. 합한 유기 상을 150 mL 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카의 작은 칼럼을 통해 여과하였다. 여과물을 농축시켜 잔류물을 제공하였다. 합한 잔류물 (이전 실행으로부터의 것)을 실리카 겔 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 (10:1, 3:1))에 의해 정제하여 반-순수한 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 250 x 50 mm, 10 μm; 이동상: [물 (0.05% HCl)-ACN]; B%: 38%-68%, 31분, 50% 분)에 의해 정제하여 목적 화합물 24.4 g (97% 순도, 74% 수율)을 수득하였다.
LC-MS: Rt = 0.914분, [M+H]+ = 366.1
1H NMR: CDCl3: δ ppm 0.23-0.40 (4H, m), 1.02-1.20 (3H, m), 1.48-1.95 (2H, m), 4.22-4.33 (1H, m), 4.39-4.61 (3H, m), 5.26-5.33 (1H, m), 7.31-7.49 (4H, m), 7.56-7.81 (4H, m).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 50A
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-D-메티오닐-L-이소류시네이트
N-(tert-부톡시카르보닐)-D-메티오닌 (2.42 g, 9.71 mmol), 메틸 L-이소류시네이트-히드로겐 클로라이드 (1/1) (1.76 g, 9.71 mmol), 1H-벤조트리아졸-1-올 (1.78 g, 11.6 mmol), 3-{[(에틸이미노)메틸렌]아미노}-N,N-디메틸프로판-1-아민 히드로클로라이드 (1:1) (2.23 g, 11.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (3.5 mL, 20 mmol)을 DMF (30 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 물 (100 mL)을 첨가하고, 혼합물을 2 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염산, 물 (10 mL), 포화 수성 중탄산나트륨 용액 (10 mL) 및 염수로 순차적으로 세척한 다음, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 유기 층을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 에테르 중에 용해시키고, 생성물을 결정화시켰다. 고체를 여과하고, 에테르 및 펜탄으로 순차적으로 세척하였다. 표제 화합물 3.13 g (99% 순도, 86% 수율)을 수득하였다.
실시예 51A
메틸 (2S,3S)-2-{(3R)-3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-옥소피롤리딘-1-일}-3-메틸펜타노에이트
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-D-메티오닐-L-이소류시네이트 (실시예 50A, 2.85 g, 7.57 mmol)를 디클로로메탄 (40 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트 (1.12 g, 7.57 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 탄산칼륨 (3.13 g, 22.71 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 환류 하에 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 50 mL 디클로로메탄에 붓고, 5 부분의 물로 세척하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 헥산으로부터 결정화시켜 표제 화합물 2.01 g (100% 순도, 81% 수율)을 수득하였다.
실시예 52A
(2S,3S)-2-{(3R)-3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-옥소피롤리딘-1-일}-3-메틸펜탄산
메틸 (2S,3S)-2-{(3R)-3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-옥소피롤리딘-1-일}-3-메틸펜타노에이트 (실시예 51A, 1.96 g, 5.97 mmol)를 THF (7.8 mL) 및 메탄올 (7.8 mL) 중에 용해시켰다. 물 8 mL 중 수산화리튬 (300 mg, 12.5 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 백색 잔류물을 물 (40 mL) 중에 용해시키고, DCM (6 mL)으로 세척한 다음, 1 M 염산 (12 mL)으로 산성화시켰다. 혼합물을 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 헥산으로부터 결정화시켜 표제 화합물 1.3 g (100% 순도, 67% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.09분; MS (ESI neg): m/z = 313 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.810 (0.96), 0.829 (2.41), 0.847 (1.25), 0.889 (2.53), 0.906 (2.59), 1.387 (16.00), 3.260 (0.71), 3.274 (0.56), 3.283 (0.75), 3.298 (0.64), 4.200 (0.97), 4.225 (0.94).
실시예 53A
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-L-이소류시네이트
메틸 L-이소류시네이트 (3.00 g, 20.7 mmol) 및 N-(tert-부톡시카르보닐)글리신 (3.98 g, 22.7 mmol)을 DMF (20 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액을 빙조에서 0-5℃로 냉각시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (3.6 mL, 21 mmol), 1H-벤조트리아졸-1-올 수화물 (316 mg, 2.07 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드히드로클로라이드 (4.36 g, 22.7 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산 / 에틸 아세테이트 0%에서 10%)에 의해 정제하여, 표제 화합물 5.40 g (90% 순도, 78% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.13분; MS (ESI pos): m/z = 247 [M-tBu]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.819 (4.90), 0.835 (8.09), 0.853 (2.63), 1.152 (0.40), 1.174 (0.45), 1.354 (1.52), 1.375 (16.00), 1.459 (0.46), 3.561 (0.84), 3.571 (0.98), 3.577 (1.45), 3.594 (0.81), 3.630 (11.35), 4.220 (0.63), 4.237 (0.78), 4.240 (0.82), 4.257
실시예 54A
메틸 글리실-L-이소류시네이트
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-L-이소류시네이트 (실시예 53A, 1.50 g, 4.96 mmol)를 DCM (27 mL) 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (3.0 mL, 39 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 조 생성물을 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 55A
메틸 N-(4-니트로벤젠-1-술포닐)글리실-L-이소류시네이트
메틸 글리실-L-이소류시네이트 (실시예 54A, 1.00 g, 4.96 mmol)를 디클로로메탄 (40 mL, 620 mmol) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (2.4 mL, 17 mmol)을 첨가한 다음, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 4-니트로벤젠-1-술포닐 클로라이드 (1.21 g, 5.46 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 1.70 g (71% 수율)을 수득하였다. 생성물을 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 56A
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[4-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트
메틸 N-(4-니트로벤젠-1-술포닐)글리실-L-이소류시네이트 (실시예 55A, 1.92 g, 4.96 mmol) 및 1,2-디브로모에탄 (4.3 mL, 50 mmol)을 DMF 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (6.86 g, 49.6 mmol)을 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 60℃로 가열하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 3 부분의 에테르로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 6:1)에 의해 정제하여 표제 화합물 1.40 g (97% 순도, 66% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.30분; MS (ESI pos): m/z = 414 [M+H]+
실시예 57A
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-(2-옥소피페라진-1-일)펜타노에이트
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[4-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트 (실시예 56A, 1.40 g, 3.39 mmol) 및 벤젠티올 (1.0 mL, 10 mmol)을 아세토니트릴 (20 mL) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (936 mg, 6.77 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 디클로로메탄 / 메탄올 100:0에서 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물 310 mg (40% 수율)을 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 58A
tert-부틸 4-[(2S,3S)-1-메톡시-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일]-3-옥소피페라진-1-카르복실레이트
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-(2-옥소피페라진-1-일)펜타노에이트 (실시예 57A, 310 mg, 1.36 mmol)를 디클로로메탄 (1.7 mL, 26 mmol) 중에 용해시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (370 μL, 1.6 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭한 다음, 3 부분의 DCM (20 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 440 mg (99% 순도, 98% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (§방법 11): Rt = 1.27분; MS (ESI pos): m/z = 273 [M+H-tBu]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.807 (0.86), 0.826 (2.27), 0.844 (1.20), 0.870 (2.25), 0.887 (2.30), 1.410 (16.00), 3.645 (6.00), 3.963 (0.63), 3.970 (0.62), 4.766 (0.82), 4.792 (0.80), 5.754 (0.87).
실시예 59A
(2S,3S)-2-[4-(tert-부톡시카르보닐)-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산
tert-부틸 4-[(2S,3S)-1-메톡시-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일]-3-옥소피페라진-1-카르복실레이트 (실시예 58A, 440 mg, 80% 순도, 1.07 mmol)를 THF (1.4 mL) 및 메탄올 (1.4 mL) 중에 용해시켰다. 물 (1.4 mL) 중 수산화리튬 (53.9 mg, 2.25 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 중에 용해시킨 다음, DCM으로 세척하였다. 수성 층을 분리하고, 1 M 염산을 사용하여 pH 3-4로 산성화시킨 다음, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 310 mg (95% 순도, 87% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.11분; MS (ESI neg): m/z = 313 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.809 (0.81), 0.827 (2.06), 0.845 (1.12), 0.908 (2.11), 0.924 (2.09), 1.411 (16.00), 3.438 (0.43), 3.968 (0.78), 4.688 (0.79), 4.713 (0.77).
실시예 60A
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-L-이소류시네이트
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닌 (1.50 g, 7.93 mmol) 및 메틸 L-이소류시네이트-히드로겐 클로라이드 (1/1) (1.58 g, 8.72 mmol)를 DMF (7.7 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액을 빙조에서 0-5℃로 냉각시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (1.4 mL, 7.9 mmol), 1H-벤조트리아졸-1-올 수화물 (121 mg, 793 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드히드로클로라이드 (1.67 g, 8.72 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산 / 에틸 아세테이트 0%에서 15%)에 의해 정제하여 표제 화합물 2.12 g (100% 순도, 84% 수율)을 수득하였다.
LC LC-MS (방법 10): Rt = 1.70분; MS (ESI pos): m/z = 317 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (1.00), 0.008 (0.77), 0.818 (3.17), 0.825 (4.25), 0.836 (7.51), 0.842 (4.72), 0.855 (3.30), 1.144 (4.07), 1.161 (4.10), 1.179 (0.54), 1.200 (0.53), 1.371 (16.00), 1.398 (13.44), 1.775 (0.49), 2.523 (0.85), 3.621 (15.73), 4.021 (0.46), 4.039 (0.60), 4.207 (1.06), 4.223 (1.19), 4.228 (1.22), 4.244 (1.06), 6.908 (0.61), 6.928 (0.58), 7.886 (0.57), 7.907 (0.60).
실시예 61A
메틸 L-알라닐-L-이소류시네이트
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-L-이소류시네이트 (실시예 60A, 2.10 g, 6.64 mmol)를 DCM (20 mL) 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (20 mL, 260 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 조 디펩티드를 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 62A
메틸 N-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-L-알라닐-L-이소류시네이트
메틸 L-알라닐-L-이소류시네이트 (실시예 61A, 1.44 g, 6.64 mmol)를 디클로로메탄 (54 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (3.2 mL, 23 mmol)을 첨가한 다음, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 4-니트로벤젠-1-술포닐 클로라이드 (1.62 g, 7.30 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 2 부분의 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 포화 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물 1.65 g (95% 순도, 59% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.18분; MS (ESI neg): m/z = 400 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.008 (0.40), 0.676 (6.59), 0.693 (6.80), 0.740 (2.79), 0.758 (6.99), 0.777 (3.46), 1.013 (0.52), 1.025 (0.62), 1.047 (0.69), 1.066 (0.50), 1.117 (6.09), 1.135 (6.12), 1.175 (0.51), 1.192 (0.64), 1.203 (0.60), 1.210 (0.56), 1.222 (0.67), 1.237 (0.48), 1.243 (0.42), 1.551 (0.53), 1.568 (0.61), 1.578 (0.45), 1.584 (0.47), 1.988 (0.64), 3.577 (16.00), 3.933 (1.14), 3.948 (1.32), 3.953 (1.31), 3.968 (1.12), 4.056 (0.61), 4.073 (0.82), 4.091 (0.54), 7.994 (4.08), 7.999 (1.44), 8.012 (1.63), 8.016 (4.58), 8.135 (1.41), 8.155 (1.39), 8.365 (4.39), 8.383 (1.48), 8.388 (3.90), 8.463 (1.04), 8.482 (0.99).
실시예 63A
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[(3S)-3-메틸-4-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트
메틸 N-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-L-알라닐-L-이소류시네이트 (실시예 62A, 1.65 g, 4.11 mmol) 및 1,2-디브로모에탄 (3.5 mL, 41 mmol)을 DMF (35 mL) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (5.68 g, 41.1 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃로 3시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 3 부분의 에테르로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산 / 에틸 아세테이트 6:1)에 의해 정제하여 표제 화합물 1.60 g (70% 순도, 64% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.30분; MS (ESI pos): m/z = 428 [M+H]+
실시예 64A
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[(3S)-3-메틸-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[(3S)-3-메틸-4-(4-니트로벤젠-1-술포닐)-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트 (실시예 63A, 900 mg, 2.11 mmol) 및 벤젠티올 (650 μL, 6.3 mmol)을 아세토니트릴 (12 mL) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (582 mg, 4.21 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 디클로로메탄 / 메탄올 100:0에서 95:5)에 의해 정제하여 표제 화합물 336 mg (100% 순도, 66% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 1.09분; MS (ESI pos): m/z = 243 [M+H]+
실시예 65A
tert-부틸 (2S)-4-[(2S,3S)-1-메톡시-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일]-2-메틸-3-옥소피페라진-1-카르복실레이트
메틸 (2S,3S)-3-메틸-2-[(3S)-3-메틸-2-옥소피페라진-1-일]펜타노에이트 (실시예 64A, 736 mg, 3.04 mmol)를 디클로로메탄 (8 mL) 중에 용해시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (1.0 mL, 4.6 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 2 부분의 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산 / 에틸 아세테이트 3:1)에 의해 정제하여 표제 화합물 1.08 g (100% 순도, 104% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.98분; MS (ESI pos): m/z = 343 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.800 (0.95), 0.818 (2.41), 0.837 (1.25), 0.875 (2.38), 0.892 (2.43), 1.305 (2.02), 1.323 (2.06), 1.414 (16.00), 3.645 (6.08), 4.769 (0.88), 4.795 (0.86).
실시예 66A
(2S,3S)-2-[(3S)-4-(tert-부톡시카르보닐)-3-메틸-2-옥소피페라진-1-일]-3-메틸펜탄산
tert-부틸 (2S)-4-[(2S,3S)-1-메톡시-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일]-2-메틸-3-옥소피페라진-1-카르복실레이트 (실시예 65A, 1.08 g, 3.15 mmol)를 THF (4.5 mL) 및 메탄올 (4.5 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 물 (4.5 mL) 중 수산화리튬 (159 mg, 6.62 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 진한 수성 염화암모늄 중에 용해시켰다. 수성 층을 1 M 염산을 사용하여 pH 3-4로 산성화시켜 사용하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 952 mg (100% 순도, 92% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.87분; MS (ESI pos): m/z = 329 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.802 (1.09), 0.820 (2.24), 0.838 (1.18), 0.911 (2.22), 0.927 (2.28), 1.295 (0.50), 1.308 (2.03), 1.326 (1.99), 1.415 (16.00), 3.342 (0.65), 4.691 (0.84), 4.717 (0.82).
실시예 67A
(2R,5R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-5-[(트리메틸실릴)메틸]-2,5-디히드로피라진
(2R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (2.9 mL, 16 mmol)을 THF (58 mL) 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (10 mL, 1.6 M, 16 mmol)을 교반하면서 적가하였다. 교반을 -78℃에서 15분 동안 계속하였다. (클로로메틸)(트리메틸)실란 (5.0 mL, 36 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산 / 에틸 아세테이트 2%)에 의해 정제하여 표제 화합물 3.0 g (87% 순도, 60% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.47분; MS (ESI pos): m/z = 271 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.036 (0.45), -0.028 (9.14), -0.020 (0.46), -0.008 (1.38), 0.580 (3.69), 0.597 (3.75), 0.737 (0.61), 0.762 (0.63), 0.773 (0.73), 0.798 (0.73), 0.959 (3.60), 0.977 (3.69), 1.107 (0.73), 1.119 (0.75), 1.143 (0.66), 1.148 (0.47), 1.155 (0.63), 1.370 (1.30), 2.512 (16.00), 3.574 (8.95), 3.582 (8.85), 3.885 (0.64), 3.894 (1.26), 3.903 (0.72), 3.999 (0.49), 4.023 (0.47).
실시예 68A
메틸 3-(트리메틸실릴)-L-알라니네이트
(2R,5R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-5-[(트리메틸실릴)메틸]-2,5-디히드로피라진 (실시예 67A, 3.00 g, 11.1 mmol)을 메탄올 (30 mL, 740 mmol) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 염산 (10 mL, 10%)을 첨가하고, 용액을 2시간 동안 교반하였다. 용액을 증발시키고, 잔류물을 DCM 및 탄산나트륨 용액 (100 mL, 2.0 M, 200 mmol) 중에 용해시켰다. 수성 층을 2 부분의 DCM으로 추출하였다. DCM 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (2% 메탄올: (DCM 중 1% N,N-디에틸에탄아민))에 의해 정제하여 표제 화합물 2.83 g (68% 순도, 99% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.010 (3.10), 0.008 (1.81), 0.736 (0.85), 0.759 (0.89), 0.772 (1.48), 0.795 (1.56), 0.803 (1.89), 0.820 (1.90), 0.841 (1.84), 0.858 (2.43), 0.875 (1.64), 0.900 (4.19), 0.911 (1.07), 0.918 (8.65), 0.936 (4.28), 1.682 (1.42), 2.384 (1.35), 2.402 (4.11), 2.420 (4.02), 2.438 (1.25), 3.088 (0.55), 3.102 (0.54), 3.302 (1.19), 3.306 (1.81), 3.321 (1.27), 3.330 (1.15), 3.345 (1.03), 3.583 (16.00), 3.591 (0.48), 3.605 (4.33), 5.742 (4.37).
실시예 69A
N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-3-(트리메틸실릴)-L-알라닌
메틸 3-(트리메틸실릴)-L-알라니네이트 (실시예 68A, 2.83 g, 68% 순도, 11.0 mmol)를 메탄올 (44 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액 (11 mL, 1.0 M, 11 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (40 mL), 탄산수소나트륨 (922 mg, 11.0 mmol) 및 탄산나트륨 (1.53 g, 14.4 mmol)을 첨가하였다. 메탄올을 감압 하에 제거한 다음, 1,4-디옥산 (32 mL)을 수용액에 첨가하였다. 이 용액을 빙조에서 0℃로 냉각시켰다. 이어서, (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (Fmoc-Cl) (4.26 g, 16.5 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 추가의 Fmoc-Cl (1.42 g, 5.5 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 동일한 분분의 물 및 tert-부틸 메틸 에테르를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수성 상을 분리하고, tert-부틸 메틸 에테르로 추가로 세척한 다음, 1 M 염산 (pH 3-4)으로 산성화시켰다. 산성화된 혼합물을 3 부분의 MTBE로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용리액: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 10:90; 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로; 17.65-19.48분 95:5; 19.48-19.66분 10:90으로; 19.66-20.72분 10:90)에 의해 정제하여 표제 화합물 1.65 g (99% 순도, 39% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.20분; MS (ESI pos): m/z = 384 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.006 (16.00), 0.987 (3.81), 1.006 (3.64), 3.309 (2.95), 3.950 (0.67), 3.970 (1.71), 3.991 (1.59), 4.010 (0.53), 4.182 (0.67), 4.199 (1.66), 4.217 (1.67), 4.228 (1.08), 4.253 (2.79), 4.268 (3.86), 4.287 (1.60), 4.293 (0.85), 4.313 (0.41), 7.286 (1.24), 7.291 (1.27), 7.293 (1.31), 7.302 (2.68), 7.304 (2.70), 7.309 (2.55), 7.321 (1.75), 7.323 (1.70), 7.328 (1.57), 7.389 (2.90), 7.408 (4.73), 7.426 (2.11), 7.566 (1.81), 7.587 (1.74), 7.697 (2.14), 7.714 (3.62), 7.731 (1.81), 7.872 (4.43), 7.891 (4.02), 12.451 (0.54).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 70A
디-tert-부틸 (2S)-5-히드록시피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
디-tert-부틸 (2S)-5-옥소피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (CAS-RN: 91229-91-3, 21.0 g, 73.6 mmol)를 250 mL THF 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 디이소부틸 알루미늄 히드라이드 (160 mL, 1.0 M, 160 mmol)를 적가하고, 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 2-프로판올 (25 mL)로 켄칭하였다. 포타슘 소듐 (2R,3R)-2,3-디히드록시부탄디오에이트 용액 (200 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반한 다음, 반응 혼합물을 MTBE 및 물로 희석하였다. 수층을 분리하고, 2 부분의 MTBE로 추가로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 19.53 g (79% 순도, 73% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
실시예 71A
디-tert-부틸 (2S,)-5-메톡시피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
디-tert-부틸 (2S)-5-히드록시피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 70A, 19.5 g, 67.9 mmol)를 메탄올 (160 mL) 중에 용해시켰다. 피리디늄 파라-톨루엔술포네이트 (341 mg, 1.36 mmol)를 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산-시클로헥산 에틸 아세테이트 7:3)에 의해 정제하여 표제 화합물 14.4 g (90% 순도, 64% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.363 (9.51), 1.375 (8.10), 1.393 (2.67), 1.419 (16.00), 1.756 (0.58), 1.775 (0.93), 1.781 (0.88), 1.807 (0.46), 3.225 (3.77), 3.240 (1.93), 3.261 (2.02), 3.307 (4.01), 4.059 (0.64), 4.081 (0.82), 5.128 (0.56).
실시예 72A
디-tert-부틸 (2S)-5-시아노피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
디-tert-부틸 (2S,)-5-메톡시피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 71A, 14.4 g, 47.8 mmol)를 DCM (125 mL) 중에 용해시키고, 용액을 -40℃로 냉각시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (1.3 mL) (1 부피%)를 첨가한 다음, 트리메틸실란카르보니트릴 (7.0 mL, 53 mmol)을 40분 기간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 후속적으로 -40℃에서 추가로 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올 (19 mL)로 켄칭한 다음, 농축시켜, 단리된 표제 화합물 14.87 g (86% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): 195.2 (M+-Boc), 139.1 (-Boc, -t-Bu)
실시예 73A
디-tert-부틸 (2S)-5-포르밀피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
디-tert-부틸 (2S)-5-시아노피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 72A, 14.0 g, 47.2 mmol)를 피리딘 (250 mL), 아세트산 (130 mL) 및 물 (130 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 라니-니켈(Raney-Nickel)-물 현탁액 (70.0 g, 50% 순도)을 첨가하고, 혼합물을 주위 압력에서 80℃에서 7시간에 걸쳐 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 규조토 층 상에서 여과에 의해 제거하고, 용매를 물 250 mL로 세척하였다. 수성 상을 MTBE (650 mL)로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 3회 세척하고, 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산 - 시클로헥산/에틸 아세테이트 7:3)에 의해 정제하여 점성 오일 7.40 g (85% 순도, 44% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): (M+ - CO); (M+ - CO, - Boc)
실시예 74A
디-tert-부틸 (2S)-5-에테닐피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
메틸(트리페닐)포스포늄 브로마이드 (17.7 g, 49.4 mmol)를 THF 180 mL 중에 현탁시켰다. 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드 용액 (톨루엔 중 1 M, 75 mL, 15% 용액, 49 mmol)을 실온에서 적가하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. 디-tert-부틸 (2S)-5-포르밀피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 73A, 7.40 g, 24.7 mmol)를 THF (60 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포타슘 소듐 (2R,3R)-2,3-디히드록시부탄디오에이트 (140 mL) 및 물 (85 mL)의 용액에 붓고, 3 부분의 MTBE (210 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산 - 시클로헥산 에틸 아세테이트 (9:1))에 의해 정제하여 표제 화합물 4.25 g (100% 순도, 58% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): Rt = 5.07분, 5.17분; 197.3 (M+-Boc)
실시예 75A
tert-부틸 5-비닐-L-프롤리네이트 (이성질체의 혼합물)
디-tert-부틸 (2S)-5-에테닐피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 74A, 4.25 g, 14.3 mmol)를 45 mL DCM 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (2.6 mL, 14 mmol)를 적가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 진한 수성 탄산수소나트륨 용액 (21 mL)으로 켄칭하고, 2 부분의 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 메탄올 - 디클로로메탄 (100:2))에 의해 정제하여 표제 화합물 2.09 g (100% 순도, 74% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): Rt = 3.37분, 3.50분; 197.3 (M+)
실시예 76A
tert-부틸 (5R)-5-에테닐-L-프롤리네이트 (단일 입체이성질체)
실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산 - 에틸 아세테이트 - 트리메틸아민 (70:30:1))에 의해 tert-부틸-5-에테닐-L-프롤리네이트 (부분입체이성질체 혼합물) (실시예 75A, 2.55 g, 12.9 mmol)를 이성질체 분리하여 표제 화합물 1.35 g (100% 순도, 53% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): Rt = 3.50분; 197.3 (M+)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.3-1.4 (1H), 1.40 (9H), 2.4 (1H), 3.5 (2H), 4.9 (1H), 5.15 (1H), 5.8 (1H).
실시예 77A
1-tert-부틸 2-메틸-3-에테닐피페리딘-1,2-디카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
무수 THF (20 mL) 중 에테닐마그네슘 브로마이드 (39 mL, 0.70 M, 27 mmol)의 용액을 -35℃로 냉각시킨 다음, 브로민화구리 (I) - 디메틸 술피드 (1:1)의 용액 (741 mg, 3.61 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -35℃에서 1시간 동안 교반하였다. THF (10 mL) 중 1-tert-부틸 2-메틸 5,6-디히드로피리딘-1,2(4H)-디카르복실레이트 (CAS-RN: 155905-80-9, 4.35 g, 18.0 mmol)의 용액을 혼합물에 첨가한 다음, 반응 혼합물을 -35℃에서 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 수성 염화암모늄 (85 mL) 및 수성 암모니아 (85 mL)의 혼합물로 켄칭하고, 2 부분의 MTBE (285 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 수성 염화암모늄 (570 mL) 및 염수 (570 mL)로 순차적으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (구배: 시클로헥산-에틸 아세테이트 (2%-20%))에 의해 정제하여 표제 화합물 1.59 g (100% 순도, 33% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 3.33분; MS (ESI pos): m/z = 270 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.038 (0.51), 1.087 (0.77), 1.382 (16.00), 1.419 (0.83), 1.429 (0.59), 1.448 (0.73), 1.459 (0.80), 1.466 (0.54), 1.479 (1.01), 1.485 (1.09), 1.496 (0.73), 1.502 (0.66), 1.506 (0.59), 1.514 (0.47), 1.532 (0.47), 1.544 (0.42), 1.600 (0.64), 1.627 (0.61), 2.899 (0.88), 3.690 (13.11), 3.817 (0.47), 3.849 (0.45), 5.120 (2.03), 5.148 (0.90), 5.164 (1.49), 5.869 (0.57).
실시예 78A
1-(tert-부톡시카르보닐)-3-에테닐피페리딘-2-카르복실산 (이성질체의 혼합물)
1-tert-부틸 2-메틸 3-에테닐피페리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 77A, 1.59 g, 5.90 mmol)를 메탄올 (5.9 mL) 및 THF (17.7 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 수산화리튬 용액 (5.9 mL, 2.0 M, 12 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 5시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 MTBE (7.5 mL)로 세척하고, 0℃로 냉각시키고, 1 M 염산 (14.5 mL)으로 산성화시킨 다음, DCM (15 mL)으로 5회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 1.39 g (100% 순도, 92% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.381 (16.00), 1.423 (0.70), 1.434 (0.57), 1.455 (0.77), 1.465 (1.32), 1.473 (0.93), 1.488 (1.66), 1.495 (1.29), 1.519 (0.46), 1.530 (0.40), 1.608 (0.80), 1.632 (0.75), 2.911 (0.96), 3.815 (0.50), 3.842 (0.47), 5.113 (1.95), 5.140 (0.73), 5.156 (1.59), 5.753 (0.50), 5.874 (0.51), 12.910 (0.69).
실시예 79A
tert-부틸 2-{[(2S,5R)-2-(tert-부톡시카르보닐)-5-비닐피롤리딘-1-일]카르보닐}-3-비닐피페리딘-카르복실레이트 (이성질체의 혼합물)
1-(tert-부톡시카르보닐)-3-에테닐피페리딘-2-카르복실산 (라세미체) (실시예 78A, 1.35 g, 5.30 mmol) 및 tert-부틸 (5R)-5-에테닐-L-프롤리네이트 (실시예 76A, 950 mg, 4.82 mmol)를 아세토니트릴 (60 mL) 중에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (2.5 mL, 14 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 (30 mL) 중 1H-(벤조트리아졸-1-일옥시)(트리피롤리딘-1-일)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (3.26 g, 6.26 mmol)의 용액을 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, MTBE 중에 재용해시키고, 물로 세척하였다. 수성 상을 MTBE로 재추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 (85:15))에 의해 정제하여 표제 화합물 2.03 g (88% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (0.60), 1.373 (10.15), 1.392 (16.00), 1.396 (14.53), 1.458 (0.57), 1.489 (0.46), 1.763 (0.46), 1.780 (0.56), 2.105 (0.42), 2.122 (0.42), 2.524 (0.41), 5.050 (0.44), 5.090 (0.70), 5.116 (0.79), 5.754 (1.04).
실시예 80A
디-tert-부틸 (4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-1,9-디카르복실레이트 (단일 입체이성질체)
tert-부틸 2-{[(2S,5R)-2-(tert-부톡시카르보닐)-5-비닐피롤리딘-1-일]카르보닐}-3-비닐피페리딘-카르복실레이트(실시예 79A, 2.00 g, 4.60 mmol)를 DCM (100 mL) 중에 용해시키고, [1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)이미다졸리딘-2-일리덴](디클로로)(페닐메틸리덴)루테늄-트리시클로헥실포스판 (1:1) (781 mg, 920 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 48시간 동안 교반한 다음, 이것을 실온으로 냉각시켰다. DMSO (2.0 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 (25%-50%))에 의해 정제하여 표제 화합물 805 mg (99% 순도, 42% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.12분; MS (ESI pos): m/z = 407 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.296 (5.30), 1.361 (16.00), 1.378 (2.93), 5.540 (0.72), 5.562 (0.51).
실시예 81A
(4aR,6aR,9S,11aS)-1-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-9-카르복실산 (단일 입체이성질체)
디-tert-부틸-(4aR,6aR,9S,11aS)-11-옥소-2,3,4,4a,6a,7,8,9,11,11a-데카히드로-1H-피리도[3,2-e]피롤로[1,2-a]아제핀-1,9-디카르복실레이트 (실시예 80A, 800 mg, 1.97 mmol)를 8 mL DCM 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 트리플루오로아세트산 (8.0 mL, 100 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 탄산수소나트륨 용액 (20 mL, pH=8)으로 희석하였다. THF (24 mL) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (CAS-RN: 28920-43-6, 764 mg, 2.95 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (100 mL)으로 희석하고, 1 M 염산 (40 mL) (pH=1)으로 산성화시켰다. 용액을 DCM (50 mL)으로 2회 추출하고, 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH 95/5)에 의해 정제하여 표제 화합물 676 mg (100% 순도, 73% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.86분; MS (ESI pos): m/z = 473 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (2.87), 0.008 (2.54), 0.778 (0.66), 0.800 (1.51), 0.808 (1.58), 0.832 (2.85), 0.856 (1.93), 0.865 (2.01), 0.889 (0.79), 1.125 (0.77), 1.157 (1.38), 1.182 (0.90), 1.215 (0.50), 1.235 (1.06), 1.517 (2.61), 1.538 (3.44), 1.563 (6.49), 1.593 (6.17), 1.610 (5.67), 1.636 (4.98), 1.660 (3.92), 1.684 (2.46), 1.719 (2.25), 1.747 (2.01), 1.846 (4.49), 1.858 (7.62), 1.868 (6.96), 1.901 (3.19), 2.010 (0.57), 2.073 (9.83), 2.189 (2.95), 2.200 (3.74), 2.241 (3.30), 2.276 (2.71), 2.307 (1.21), 2.327 (1.10), 2.366 (0.52), 2.398 (0.80), 2.428 (1.41), 2.456 (0.84), 2.670 (0.63), 2.710 (0.50), 2.816 (1.60), 2.833 (1.66), 2.849 (2.51), 2.862 (2.28), 2.877 (2.34), 2.895 (1.47), 3.040 (0.69), 3.075 (1.10), 3.086 (1.04), 3.101 (1.03), 3.121 (0.69), 3.690 (1.24), 3.724 (4.64), 3.744 (6.62), 3.756 (6.47), 3.777 (4.44), 3.823 (8.20), 3.852 (7.84), 4.120 (4.36), 4.137 (4.86), 4.148 (4.24), 4.191 (3.57), 4.202 (7.64), 4.212 (4.19), 4.261 (1.02), 4.276 (2.33), 4.291 (4.52), 4.316 (4.20), 4.328 (5.37), 4.346 (4.61), 4.370 (3.31), 4.383 (5.08), 4.395 (4.54), 4.411 (5.53), 4.422 (5.83), 4.456 (3.22), 4.595 (1.63), 4.761 (4.95), 4.773 (5.04), 4.788 (4.59), 4.800 (4.19), 5.364 (2.72), 5.393 (7.67), 5.422 (7.48), 5.451 (2.73), 5.510 (0.98), 5.540 (4.23), 5.553 (4.14), 5.585 (0.91), 7.282 (3.12), 7.300 (7.84), 7.319 (10.54), 7.337 (13.57), 7.355 (9.71), 7.366 (2.95), 7.377 (5.06), 7.399 (12.17), 7.420 (16.00), 7.438 (6.68), 7.521 (8.10), 7.539 (6.98), 7.613 (12.53), 7.631 (11.16), 7.646 (3.71), 7.665 (3.16), 7.847 (8.31), 7.865 (15.04), 7.884 (10.42), 7.908 (4.87), 12.429 (2.52).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
실시예 82A
(6S)-5-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산
(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (CAS-RN: 152723-57-4, 1.38 g, 9.79 mmol)을 물 (14 mL) 중에 용해시키고, 탄산수소나트륨 (8.23 g, 97.9 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 아세톤 (21 mL) 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (CAS-RN: 82911-69-1, 3.47 g, 10.3 mmol)으로부터의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, MTBE로 2회 추출하였다. 수성 층을 1 M 염산을 사용하여 pH 3-4로 산성화시키고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 3.3 g (100% 순도, 93% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.04분; MS (ESI pos): m/z = 364 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.497 (1.67), 0.510 (2.34), 0.527 (5.55), 0.559 (3.82), 0.567 (5.51), 0.590 (9.33), 0.598 (11.21), 0.619 (1.87), 0.636 (0.58), 1.106 (9.23), 1.714 (2.14), 1.723 (2.15), 1.745 (2.40), 1.755 (2.50), 1.764 (1.94), 1.772 (1.85), 1.796 (2.02), 1.804 (1.93), 2.086 (7.36), 2.280 (2.12), 2.301 (2.47), 2.311 (2.21), 2.333 (2.24), 2.390 (1.75), 2.412 (2.07), 2.421 (1.87), 2.443 (1.71), 2.524 (0.88), 2.594 (3.10), 3.076 (2.73), 3.219 (3.24), 3.245 (4.13), 3.283 (3.41), 3.309 (5.19), 3.385 (5.05), 3.403 (4.32), 3.410 (3.56), 3.429 (3.16), 3.747 (1.01), 4.160 (0.68), 4.175 (1.57), 4.187 (3.09), 4.192 (3.69), 4.209 (6.08), 4.218 (4.18), 4.224 (3.09), 4.237 (2.43), 4.247 (1.22), 4.254 (2.15), 4.272 (16.00), 4.284 (3.83), 4.297 (4.75), 4.306 (2.72), 4.427 (2.10), 4.435 (2.31), 4.449 (2.34), 4.457 (2.02), 5.754 (0.45), 7.301 (1.47), 7.318 (5.18), 7.320 (5.43), 7.325 (2.74), 7.336 (7.24), 7.339 (7.37), 7.344 (4.81), 7.348 (3.25), 7.352 (3.50), 7.354 (3.84), 7.357 (3.67), 7.403 (9.03), 7.422 (14.80), 7.440 (6.64), 7.640 (8.10), 7.647 (7.82), 7.658 (7.43), 7.666 (6.87), 7.884 (10.09), 7.902 (9.58).
상기 아미노산을 Fmoc SPPS에 사용하였다.
이 Fmoc 아미노산을 또한 실시예 124A에서 제조된 (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산으로부터 제조하였다.
실시예 83A
(1S,3S,5S,6S)-2-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 및 rel-(1R,3R,5R,6R)-2-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산
(1S,3S,5S,6S)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (450 mg, 2.31 mmol)을 물 (6 mL) 중에 용해시키고, 탄산수소나트륨 (1.94 g, 23.1 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 아세톤 (9 mL) 중 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (CAS-RN: 82911-69-1, 817 mg, 2.42 mmol)으로부터의 용액을 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, MTBE로 2회 추출하였다. 수성 층을 1 M 염산을 사용하여 pH 3-4로 산성화시키고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 10:90; 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 95:5; 19.48-19.66분 10:90으로; 19.66-20.72분 10:90)에 의해 정제하여 표제 화합물 571 mg (96% 순도, 57% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.06분; MS (ESI pos): m/z = 418 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 2.073 (0.99), 2.203 (4.88), 2.345 (2.00), 2.366 (1.94), 3.755 (2.94), 4.078 (1.74), 4.221 (1.50), 4.253 (4.04), 4.270 (5.55), 4.290 (4.95), 4.337 (2.21), 7.293 (3.93), 7.301 (4.07), 7.312 (9.32), 7.319 (8.88), 7.330 (6.19), 7.337 (5.57), 7.407 (9.40), 7.425 (16.00), 7.444 (7.29), 7.695 (5.70), 7.887 (13.98), 7.906 (12.87), 12.866 (0.63).
물질은 또한 상업적으로 입수가능하다 (CAS RN: 1986905-54-7).
rel-(1R,3R,5R,6R)-6-(트리플루오로메틸)-2-아자바이시클로[3.1.0]헥산-3-카르복실산 (엔아민)을 사용하여 유사한 방식으로 라세미 아미노산을 제조하였다.
이들 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 84A
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류실세리네이트 (부분입체이성질체의 혼합물)
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류신 (7.50 g, 32.4 mmol) 및 메틸 DL-세리네이트-히드로겐 클로라이드 (1/1) (5.05 g, 32.4 mmol)를 디클로로메탄 (65 mL) 중에 용해시켰다. (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (14.9 g, 33.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (11 mL, 65 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 디클로로메탄 (250 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 물, 수성 염산 (1 M) 및 수성 탄산수소나트륨 용액으로 순차적으로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중에 용해시키고, 물로 완전히 세척하고, 다시 수성 염산 (1 M)으로 2회 및 이어서 수성 탄산수소나트륨으로 2회 더 세척하였다. 후속적으로 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 직접 후속 단계에 사용하였다.
LC-MS (방법 11): 355.2 (M+Na+)
실시예 85A
메틸 2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-4,5-디히드로-1,3-옥사졸-4-카르복실레이트 (부분입체이성질체의 혼합물)
메틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류실세리네이트 (실시예 84A, 4.62 g, 13.9 mmol)를 디클로로메탄 (51 mL) 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. N-에틸-N-(트리플루오로-람다4-술파닐)에탄아민 (2.2 mL, 17 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 탄산칼륨 (7.68 g, 55.6 mmol)으로 켄칭한 다음, 실온으로 냉각되도록 하였다. 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 용액을 DCM (50 mL)으로 희석하고, 포화 수성 탄산수소나트륨 용액으로 3회 세척하였다. 수성 상을 추가로 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 목적 생성물 5.75 g을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): 315.2 (M+H+), 337.2 (M+Na+)
실시예 86A
메틸 2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-1,3-옥사졸-4-카르복실레이트
메틸 2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-4,5-디히드로-1,3-옥사졸-4-카르복실레이트 (실시예 85A, 4.37 g, 13.9 mmol)를 디클로로메탄 (35 mL, 540 mmol) 중에 용해시키고, 용액을 -40℃에서 냉각시켰다. 브로모(트리클로로)메탄 (2.7 mL, 27 mmol)을 첨가한 다음, 2,3,4,6,7,8,9,10-옥타히드로피리미도[1,2-a]아제핀 (4.6 mL, 31 mmol)을 또한 첨가하였다. 반응 용액을 0℃에서 2.5시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석하였다. 반응 혼합물을 10% 시트르산 용액으로 5회 세척하였다. 합한 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (구배: 시클로헥산/에틸 아세테이트 (4:1))에 의해 정제하여 표제 화합물 2.2 g (50.7% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): 335.15 (M+Na+)
실시예 87A
2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-1,3-옥사졸-4-카르복실산
메틸 2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-1,3-옥사졸-4-카르복실레이트 (실시예 86A, 2.21 g, 7.06 mmol)를 메탄올 (13.5 mL) 중에 용해시켰다. 수성 수산화나트륨 용액 (4.3 mL, 3 M)을 첨가하고, 반응 혼합물을 40분 동안 교반한 다음, 농축시켜 메탄올을 제거하였다. 수용액을 수성 1 M 염산 (14 mL)으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 12.0 g (95% 순도, 51% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (MCW_OA_S1): Rt = 1.13분; MS (ESI neg): m/z = 297 [M+H]-
실시예 88A
(4R)-3-[(3S)-3-메틸펜타노일]-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-2-온
무수 THF (50 mL) 중 (3S)-3-메틸펜탄산 (867 mg, 7.46 mmol)의 용액을 -30℃로 냉각시켰다. 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드 (920 μl, 7.5 mmol)를 적가하고, 반응 혼합물을 -30℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 건조 염화리튬 (347 mg, 8.17 mmol) 및 (4R)-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-2-온 (2.00 g, 7.11 mmol) ((R)-DIOZ)을 순차적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 천천히 실온이 되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 수층을 분리하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 층을 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 백색 고체 2.87 g을 수득하였다. 조 생성물을 소량의 메탄올을 함유하는 DCM 중에 용해시키고, 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (바이오타지 이솔레라, 50 g 카트리지)에 의해 용리액으로서 시클로헥산/에틸 아세테이트 (80:20)를 사용하여 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 농축시키고, 건조시켜, 목적 화합물 2.25 g (98% 순도, 82% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.69분; MS (ESI pos): m/z = 380 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.616 (13.33), 0.633 (13.58), 0.650 (7.84), 0.660 (16.00), 0.668 (15.61), 0.676 (15.27), 0.686 (7.40), 0.719 (0.40), 0.875 (12.87), 0.893 (12.59), 0.940 (0.92), 0.958 (1.50), 0.975 (2.08), 0.993 (2.23), 1.011 (1.38), 1.028 (0.84), 1.045 (1.41), 1.061 (1.93), 1.079 (1.89), 1.095 (1.16), 1.112 (0.62), 1.541 (0.55), 1.557 (1.29), 1.574 (1.91), 1.590 (1.82), 1.607 (1.10), 1.623 (0.40), 2.020 (0.71), 2.036 (1.44), 2.049 (1.78), 2.065 (1.28), 2.082 (0.50), 2.449 (2.60), 2.468 (2.84), 2.755 (2.63), 2.771 (2.50), 2.793 (2.05), 2.808 (1.92), 5.557 (5.98), 5.563 (5.64), 7.271 (2.61), 7.289 (6.37), 7.307 (5.02), 7.352 (5.04), 7.368 (10.74), 7.385 (9.60), 7.403 (3.47), 7.557 (8.45), 7.577 (6.54), 7.639 (8.45), 7.659 (6.92).
실시예 89A
벤질 {(2S,3S)-3-메틸-2-[(4R)-2-옥소-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-3-카르보닐]펜틸}카르바메이트
문헌 절차 (Sebesta and Seebach, Helv. Chim. Acta 2003, 86, 4061-4072)에 따랐다. (4R)-3-[(3S)-3-메틸펜타노일]-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-2-온 (실시예 88A, 2.20 g, 5.80 mmol)을 DCM (20 mL) 중에 용해시키고, 용액을 -15℃로 냉각시켰다. 온도를 -15℃에서 유지하면서 염화티타늄 (IV)의 용액 (6.1 mL, DCM 중 1.0 M, 6.1 mmol)을 적가하였다. 이어서, 트리에틸아민 (890 μl, 6.4 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 -15℃에서 30분 동안 교반하였다.
별개의 둥근 바닥 플라스크에서, DCM (10 mL) 중 벤질 (메톡시메틸)카르바메이트 (1.24 g, 6.38 mmol, CAS RN: 94471-35-9)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 염화티타늄 (IV)의 용액 (6.4 mL, DCM 중 1.0 M, 6.4 mmol)을 적가한 다음, (4R)-3-[(3S)-3-메틸펜타노일]-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-2-온을 함유하는 플라스크에 전체 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한 다음, 이것을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 반응물을 수성 염화암모늄 용액을 첨가하여 켄칭한 다음, 추가의 DCM으로 희석하였다. 분리된 유기 층을 수성 1 M HCl 용액, 수성 1 M NaOH 용액에 이어서 수성 염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 층을 여과한 다음, 농축시켜 황색 오일 3.39 g을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (바이오타지 이솔레라 100 g 카트리지)에 의해 시클로헥산/에틸 아세테이트 (85:15) 용리액을 사용하여 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 농축시킨 다음, 건조시켜 96.3% (문헌 96%)의 부분입체선택성을 갖는 표제 화합물 1.50 g (96% 순도, 46% 수율, 선택성)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.63분; MS (ESI pos): m/z = 543 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.429 (3.22), 0.446 (3.32), 0.480 (1.44), 0.498 (3.18), 0.516 (1.79), 0.595 (4.27), 0.611 (4.65), 0.643 (0.49), 0.663 (0.46), 0.768 (0.45), 0.786 (0.46), 0.874 (3.86), 0.891 (4.01), 1.098 (0.48), 1.397 (16.00), 1.993 (0.45), 2.010 (0.57), 2.023 (0.45), 3.146 (0.44), 3.169 (0.66), 3.180 (1.02), 3.192 (0.63), 3.206 (0.44), 3.222 (0.53), 3.243 (0.48), 3.816 (0.57), 4.920 (0.59), 4.952 (1.85), 4.978 (2.04), 5.010 (0.65), 5.539 (1.70), 5.544 (1.73), 7.187 (0.53), 7.201 (0.87), 7.282 (3.41), 7.289 (5.28), 7.306 (4.14), 7.322 (1.84), 7.342 (2.69), 7.362 (3.73), 7.385 (3.47), 7.405 (1.52), 7.566 (3.08), 7.584 (2.46), 7.662 (2.88), 7.681 (2.48).
실시예 90A
(2S,3S)-2-({[(벤질옥시)카르보닐]아미노}메틸)-3-메틸펜탄산
THF (15 mL) 중 벤질 {(2S,3S)-3-메틸-2-[(4R)-2-옥소-5,5-디페닐-4-(프로판-2-일)-1,3-옥사졸리딘-3-카르보닐]펜틸}카르바메이트 (실시예 89A, 1.49 g, 2.75 mmol)의 용액을 제조하였다. 물 (5 mL) 중 LiOH (105 mg, 4.39 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 반응이 완결되지 않았음을 나타냈고, 따라서 물 (3 mL) 중 LiOH (65.8 mg, 2.75 mmol)의 추가의 당량을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 희석하고, 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 필터 케이크를 물 및 에테르로 세척한 다음, 층을 분리하였다. 수성 층을 수성 1 M HCl 용액을 사용하여 pH 1로 산성화시키고, 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 합한 에테르 상을 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 고진공 하에 건조시킨 후, 표제 화합물 715 mg (100% 순도, 93% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.71분; MS (ESI pos): m/z = 280 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.837 (6.34), 0.856 (14.23), 0.863 (13.72), 0.880 (12.65), 1.098 (0.91), 1.117 (1.35), 1.133 (1.47), 1.151 (1.49), 1.170 (0.95), 1.348 (0.42), 1.367 (1.02), 1.380 (1.33), 1.398 (1.53), 1.414 (1.09), 1.431 (0.72), 1.596 (0.82), 1.611 (1.42), 1.627 (1.61), 1.644 (1.16), 1.660 (0.53), 1.908 (3.41), 2.396 (1.17), 2.413 (2.79), 2.429 (2.67), 2.445 (1.07), 2.501 (16.00), 3.139 (4.27), 3.155 (7.41), 3.171 (4.60), 5.000 (15.52), 7.221 (1.46), 7.234 (2.66), 7.248 (1.41), 7.283 (0.89), 7.290 (0.97), 7.300 (2.98), 7.318 (5.22), 7.332 (11.34), 7.339 (12.29), 7.356 (5.30), 7.375 (1.45), 12.135 (3.58).
실시예 91A
(2S,3S)-2-(아미노메틸)-3-메틸펜탄산
탄소 상 10% 팔라듐 (100 mg)을 둥근 바닥 플라스크에 칭량하고, 플라스크를 아르곤으로 플러싱하였다. 메탄올 (40 mL) 중 (2S,3S)-2-({[(벤질옥시)카르보닐]아미노}메틸)-3-메틸펜탄산 (실시예 90A, 710 mg, 2.54 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 H2 기체의 정상 압력 하에 실온에서 교반하였다. HPLC 분석은 실온에서 2시간 후, 반응이 완결되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실리카 겔의 플러그를 통해 여과하고, 필터 케이크를 메탄올로 수회 세척하였다. 합한 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 345 mg (93%)을 수득하였다. 화합물을 직접 후속 단계에 사용하였다.
실시예 92A
(2S,3S)-2-[({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)메틸]-3-메틸펜탄산
(2S,3S)-2-(아미노메틸)-3-메틸펜탄산 (실시예 91A, 344 mg, 2.37 mmol)을 수성 탄산나트륨 용액 (32 mL, 0.15 M, 4.7 mmol) 중에 용해시켰다. 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (959 mg, 2.84 mmol)을 아세톤 (30 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 이전 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 아세톤을 제거하였다. 수용액을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 1 M 수성 염산을 사용하여 pH 3-4로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 30 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 75 mL/분; 구배: 0-5.50분 (10:90); 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 (95:5); 19.48-19.66분 10:90으로의 구배; 19.66-20.72분 (10:90))에 의해 정제하여 표제 화합물 795 mg (96% 순도, 88% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.06분; MS (ESI pos): m/z = 368 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (1.04), 0.008 (0.54), 0.752 (0.73), 0.841 (7.69), 0.860 (16.00), 0.870 (15.28), 0.878 (10.54), 0.887 (13.22), 1.085 (0.41), 1.103 (0.99), 1.123 (1.45), 1.139 (1.58), 1.157 (1.60), 1.176 (1.00), 1.371 (1.16), 1.384 (1.50), 1.403 (1.71), 1.418 (1.23), 1.435 (0.83), 1.604 (0.88), 1.619 (1.50), 1.636 (1.70), 1.651 (1.23), 2.408 (1.27), 2.425 (2.91), 2.441 (3.13), 2.458 (1.88), 2.524 (0.87), 2.749 (0.82), 3.143 (4.18), 3.158 (6.08), 3.174 (3.40), 4.176 (1.25), 4.194 (3.04), 4.211 (4.04), 4.241 (8.74), 4.255 (4.27), 4.263 (3.35), 7.303 (5.42), 7.322 (12.94), 7.340 (10.81), 7.353 (1.98), 7.394 (7.49), 7.413 (11.83), 7.431 (5.34), 7.673 (5.88), 7.683 (5.84), 7.691 (5.19), 7.701 (4.30), 7.876 (12.54), 7.895 (11.30), 12.176 (1.21).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 93A
2-[(1S,2S)-1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-2-메틸부틸]-1,3-옥사졸-4-카르복실산
2-{(1S,2S)-1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-2-메틸부틸}-1,3-옥사졸-4-카르복실산 (실시예 87A, 1.85 g, 6.21 mmol)을 트리플루오로아세트산 (7.6 mL, 99 mmol) 중에 용해시키고, 용액을 15분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 톨루엔으로 희석하고, 증발시켰다. 이 단계를 다시 반복하였다. 조 생성물을 1,4-디옥산 (20 mL, 230 mmol) 및 물 (20 mL) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (1.60 g, 11.6 mmol) 및 1-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (2.35 g, 6.96 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (65 mL)로 희석하고, 10% 수성 시트르산 용액을 사용하여 pH 2-3으로 산성화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (3회)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (디클로로메탄-메탄올 (3-7% + 1% 아세트산)에 의해 정제하고, 생성물-함유 분획을 합하고, 톨루엔으로 희석한 다음, 농축시켰다. 이어서, 톨루엔을 다시 첨가한 다음, 용액을 농축시켜 표제 화합물 2.09 g (100% 순도, 80% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (MCW_FT_MS_M1): Rt = 2.01분; MS (ESI pos): m/z = 421 [M+H]+
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 94A
디(프로프-2-엔-1-일)아미노](1-메틸-1H-인다졸-5-일)아세트산 (라세미체)
(1-메틸-1H-인다졸-5-일)보론산 (CAS-RN: 590418-08-9, 500 mg, 2.84 mmol), 옥소아세트산 (CAS-RN: 298-12-4, 310 μl, 50% 순도, 2.8 mmol) 및 N-(프로프-2-엔-1-일)프로프-2-엔-1-아민 (CAS-RN: 124-02-7, 350 μl, 2.8 mmol)을 아세토니트릴 (7.5 mL) 중에 용해시키고, 반응 혼합물을 60℃에서 40시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 생성된 고체를 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 740 mg (100% 순도, 91% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.44분; MS (ESI neg): m/z = 284 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.008 (1.87), 2.073 (0.51), 3.110 (0.68), 3.125 (0.77), 3.147 (2.14), 3.161 (2.16), 3.176 (2.32), 3.193 (2.28), 3.213 (0.90), 3.230 (0.96), 4.030 (16.00), 4.531 (3.61), 5.110 (2.47), 5.134 (4.58), 5.174 (2.56), 5.752 (0.60), 5.768 (1.07), 5.778 (0.73), 5.783 (0.73), 5.794 (1.49), 5.810 (1.35), 5.820 (0.63), 5.826 (0.67), 5.837 (0.87), 5.852 (0.49), 6.514 (1.52), 7.432 (1.39), 7.435 (1.47), 7.454 (1.77), 7.457 (1.87), 7.602 (2.26), 7.624 (1.75), 7.699 (3.10), 8.041 (4.18).
실시예 95A
({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)(1-메틸-1H-인다졸-5-일)아세트산 (라세미체)
1,3-디메틸-1,3-디아지난-2,4,6-트리온 (CAS-RN: 769-42-6, 1.97 g, 12.6 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (48.6 mg, 42.1 μmol)을 둥근 바닥 플라스크에 아르곤 하에 넣었다. 이어서, 건조 DCM 중 [디(프로프-2-엔-1-일)아미노](1-메틸-1H-인다졸-5-일)아세트산 (실시예 94A, 600 mg, 2.10 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 35℃에서 2시간 동안 교반하였다. 현탁액을 물 아세톤 및 물로 희석한 다음, 반응 혼합물을 농축시켜 DCM을 제거하였다. 탄산수소나트륨 (2.65 g, 31.5 mmol)을 첨가하였다 (기체 형성 주의). 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (780 mg, 2.31 mmol)을 현탁액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 및 탄산나트륨의 수용액 (10%)을 첨가하고, 용액을 MTBE로 2회 추출하였다. 수성 상을 수성 시트르산 용액을 사용하여 산성화시킨 다음, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 (10:90); 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 (95:5); 19.48-19.66분 10:90으로의 구배; 19.66-20.72분 (10:90))에 의해 정제하여 표제 화합물 422 mg (100% 순도, 47% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.94분; MS (ESI pos): m/z = 428 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 2.073 (0.59), 4.041 (16.00), 4.198 (0.63), 4.215 (1.87), 4.231 (3.51), 4.253 (1.84), 4.269 (1.50), 4.280 (1.92), 4.298 (1.70), 4.319 (0.59), 5.256 (1.81), 5.276 (1.80), 7.275 (0.90), 7.293 (2.03), 7.320 (2.08), 7.339 (1.26), 7.388 (1.98), 7.406 (3.38), 7.424 (1.73), 7.445 (1.60), 7.467 (1.96), 7.621 (2.30), 7.643 (1.76), 7.744 (3.56), 7.763 (3.31), 7.792 (3.19), 7.875 (4.81), 7.893 (4.48), 8.063 (4.53), 8.213 (1.70), 8.232 (1.65), 12.835 (1.03).
실시예 96A
({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)(1-메틸-1H-인다졸-5-일)아세트산 (거울상이성질체 1)
부분입체이성질체 혼합물 (실시예 95A, 600 mg)을 메탄올/아세토니트릴 (60 mL) 중에 용해시키고, 키랄팩 AD-H (SFC) 5 μm, 250 x 30 mm 칼럼을 사용하는 THAR 초임계 유체 크로마토그래피 정제용 200 기기를 사용하여 분리하였다; 용리액: CO2/이소-프로판올 (80:20); 압력: 135 bar; 용리액 온도: 38℃; 유량: 100 g/분; 검출: UV 210 nm; 주입 부피 0.4 mL/주입; 일반적 작업 조건 하에 CO2 1 g/분은 1 mL/분과 대략 동등함.
순서 설정: 주기 시간 = 11.2분
분획 1을 5.8분에 수집하고 (거울상이성질체 1); 분획 2를 7.7분 사이에 수집하였다 (거울상이성질체 2). 분획을 농축시켰다.
분획을 분석용 SFC-MS (애질런트, 칼럼: 다이셀 AD-3 3 μm 100 x 4.6 mm, 용리액: CO2/메탄올 (80:20); BPR 압력: 130 bar; BPR 온도: 60℃; 칼럼 온도: 40℃; 유량: 3 mL/분; UV 210 nm)를 사용하여 분석하였다.
2종의 거울상이성질체의 입체화학은 할당하지 않았다.
거울상이성질체 1 (100% 순도, 99.5% ee) 185 mg을 수득하였다 (입체화학은 결정되지 않음).
LC-MS (방법 10): Rt = 1.80분; MS (ESI pos): m/z = 428 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 4.040 (16.00), 4.197 (0.54), 4.214 (1.44), 4.230 (2.80), 4.251 (1.59), 4.268 (1.38), 4.278 (1.68), 4.295 (1.46), 4.316 (0.48), 5.241 (1.20), 5.261 (1.19), 7.275 (0.78), 7.294 (1.73), 7.321 (1.78), 7.339 (1.11), 7.386 (1.77), 7.394 (1.54), 7.405 (2.97), 7.412 (2.26), 7.423 (1.63), 7.444 (1.36), 7.466 (1.53), 7.617 (1.85), 7.638 (1.42), 7.742 (3.01), 7.761 (2.84), 7.787 (2.53), 7.874 (4.50), 7.893 (4.19), 8.058 (4.56), 8.183 (0.93), 8.201 (0.92).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 97A
({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)(1-메틸-1H-인다졸-5-일)아세트산 (거울상이성질체 2)
실시예 96A에 기재된 키랄 분리 방법을 이용하여, 거울상이성질체 2 145 mg (100% 순도, 94.3%)을 수득하였다 (입체화학은 결정하지 않음).
LC-MS (방법 10): Rt = 1.80분; MS (ESI pos): m/z = 428 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (0.78), 0.008 (0.70), 4.040 (16.00), 4.198 (0.41), 4.214 (1.16), 4.230 (2.33), 4.252 (1.27), 4.268 (1.03), 4.278 (1.36), 4.295 (1.14), 4.300 (0.99), 5.243 (0.98), 5.262 (0.98), 7.276 (0.59), 7.294 (1.34), 7.313 (1.11), 7.321 (1.38), 7.340 (0.86), 7.387 (1.36), 7.394 (1.12), 7.406 (2.32), 7.413 (1.70), 7.424 (1.22), 7.431 (0.89), 7.444 (1.06), 7.466 (1.21), 7.618 (1.52), 7.640 (1.16), 7.743 (2.38), 7.762 (2.23), 7.787 (2.02), 7.875 (3.68), 7.894 (3.45), 8.059 (3.94), 8.188 (0.73), 8.207 (0.72).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 98A
벤질 N-[(벤질옥시)카르보닐]-3-브로모-L-페닐알라니네이트
N-[(벤질옥시)카르보닐]-3-브로모-L-페닐알라닌 (15.3 g, 40.5 mmol)을 메탄올 (113 mL) 중에 용해시켰다. 탄산세슘 (6.59 g, 20.2 mmol)을 첨가하고, 기체 발생이 멈출 때까지 혼합물을 교반하였다. 용액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (140 mL, 1.8 mol) 중에 용해시키고, (브로모메틸)벤젠 (5.3 mL, 44 mmol)을 적가하였다. 잠시 후, 고체가 침전되었다. 현탁액을 에테르 및 물로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, 염수로 세척한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 결정질 잔류물을 에테르 중에 용해시키고, 펜탄을 첨가한 후, 침전물이 형성되었다. 고체를 여과하고 건조시켰다. 에테르/펜탄 용액을 증발시키고, 에테르 중에 용해시키고; 펜탄을 첨가한 후, 침전물이 형성되었다. 고체를 여과하고, 건조시켜 표제 화합물 16.0 g (100% 순도, 84% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.42분; MS (ESI pos): m/z = 468 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 2.874 (2.41), 2.895 (2.86), 2.902 (3.10), 2.923 (2.76), 3.071 (2.84), 3.082 (2.96), 3.099 (2.26), 3.109 (2.09), 3.636 (0.82), 4.336 (1.73), 4.347 (2.20), 4.353 (2.43), 4.357 (2.48), 4.363 (2.48), 4.373 (1.83), 4.383 (1.37), 4.921 (0.55), 4.963 (1.81), 4.989 (12.84), 4.994 (11.01), 5.020 (1.18), 5.043 (0.96), 5.093 (1.11), 5.119 (12.74), 5.139 (0.55), 5.147 (0.97), 7.174 (0.85), 7.211 (3.13), 7.226 (9.23), 7.241 (11.35), 7.248 (16.00), 7.263 (11.82), 7.298 (10.22), 7.313 (14.37), 7.316 (14.35), 7.321 (12.62), 7.332 (10.08), 7.336 (11.10), 7.344 (8.08), 7.351 (11.64), 7.366 (7.19), 7.379 (2.35), 7.414 (5.80), 7.429 (4.73), 7.499 (7.87), 7.880 (4.47), 7.896 (4.30).
실시예 99A
3-[(2S)-3-(벤질옥시)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-3-옥소프로필]벤조산
반응물을 아르곤 하에 설정하였다. 2L 오토클레이브 (교반 속도 750 rpm)에 팔라듐(II)아세테이트 (2.16 g, 9.61 mmol), 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 (10.63 g, 19.22 mmol) 및 아세트산칼륨 (47.1 g, 480 mmol)을 첨가하였다. 오토클레이브를 아르곤으로 플러싱하고, 무수 DMF (450 mL)를 첨가하여 시약을 용해시켰다. 건조 DMF (930 mL) 중 벤질 N-[(벤질옥시)카르보닐]-3-브로모-L-페닐알라니네이트 (실시예 98A, 45.0 g, 96.1 mmol)의 용액을 오토클레이브에 첨가하고, 이어서 물 (18 mL)을 첨가하였다. 오토클레이브를 밀봉하고, 질소로 반복적으로 퍼징하고, 잠시 교반되도록 하였다. 오토클레이브를 일산화탄소 (3 bar)로 가압한 다음, 80℃ 및 3 bar로 960분 동안 가열하였다. 반응이 완결된 후, 오토클레이브를 퍼징하고, 개방한 다음, 내용물을 물 (13 L) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (7 L)로 3회 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 정상 크로마토그래피 (10 kg 실리카 겔)에 의해 DCM/MeOH (95/5)를 사용하여 정제한 다음, 정제용 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배, 바이오타지 이솔레라)에 의해 추가로 정제하여 표제 화합물 10.7 g (92% 순도)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.92분; MS (ESI neg): m/z = 432.14 [M-H]-
실시예 100A
벤질 N-[(벤질옥시)카르보닐]-3-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트
3-[(2S)-3-(벤질옥시)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-3-옥소프로필]벤조산 (실시예 99A, 18.0 g, 41.5 mmol)에 디클로로메탄 (280 mL, 4.4 mol)을 첨가하였다. 시클로헥산 (140 mL, 1.3 mol), tert-부틸 2,2,2-트리클로로에탄이미데이트 (36.3 g, 166 mmol) 및 (디에틸 에테르)(트리플루오로)보론 (1.6 mL, 12 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 추가의 (디에틸 에테르)(트리플루오로)보론 (1.6 mL, 12 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. (디에틸 에테르)(트리플루오로)보론 (1 mL, 7.5 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 추가의 tert-부틸 2,2,2-트리클로로에탄이미데이트 (9.0 g, 40.5 mmol) 및 추가의 (디에틸 에테르)(트리플루오로)보론 (1 mL, 7.5 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 침전물을 DCM:시클로헥산 (2:1)으로 세척하였다. 용액을 진한 수성 탄산수소나트륨 용액으로 희석하였다. 합한 수층을 DCM으로 2회 추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켰다. 생성된 흑색 오일을 시클로헥산 및 에틸 아세테이트 (2%)와 함께 교반하고, 침전물을 여과하고, 여과물을 증발시켰다. 생성된 흑색 오일을 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산-에틸 아세테이트 (9:1))에 의해 정제하여 표제 화합물 12.1 g (100% 순도, 60% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.34분; MS (ESI pos): m/z = [M+H]+490
실시예 101A
3-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닌
벤질 N-[(벤질옥시)카르보닐]-3-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트 (실시예 100A, 13.0 g, 26.6 mmol)를 메탄올 (250 mL) 중에 용해시켰다. 목탄 상 10% 팔라듐 (1.54 g)을 첨가하고, 혼합물을 주위 압력에서 4시간 동안 실온에서 수소화시켰다. 침전물이 형성되었다. 현탁액을 메탄올 중에 용해시키고, 환류 하에 교반하였다. 따뜻한 용액을 규조토 층 상에서 여과하고, 필터 케이크를 메탄올 (약 1 L)로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시키고, 건조시켜 표제 화합물 6.10 g (94% 순도, 81% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.59분; MS (ESI neg): m/z = 264 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.525 (5.74), 1.546 (16.00), 2.326 (0.50), 2.366 (0.48), 2.670 (0.50), 2.709 (0.48), 3.169 (0.57), 7.400 (0.89), 7.419 (0.66), 7.501 (0.76), 7.739 (0.84), 7.759 (0.85), 7.796 (1.02).
실시예 102A
3-(tert-부톡시카르보닐)-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-페닐알라닌
3-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닌 (실시예 101A, 6.10 g, 23.0 mmol)을 물 (100 mL) 및 아세톤 (100 mL) 중에 용해시켰다. 탄산수소나트륨 (19.3 g, 230 mmol)을 첨가하였다. 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (8.14 g, 24.1 mmol)의 용액을 아세톤 (100 mL) 중에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 1 부분의 MTBE로 추출하였다. 수성 층을 1 M 염산을 사용하여 산성화시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 8.90 g (100% 순도, 79% 수율)을 수득하였다. 생성물은 또한 유기 층에 존재하였다. 유기 층을 농축시켰다. DCM 및 1 M 염산을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 잔류물을 여과하고, 물 및 DCM으로 세척하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 DCM:메탄올 (0-10%))에 의해 정제하였다. 잔류물을 아세토니트릴에 녹이고, 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 (10:90); 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 (95:5); 19.48-19.66분 10:90으로의 구배; 19.66-20.72분 (10:90))에 의해 정제하였다. 총 1.58 g (100% 순도, 14% 수율)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.27분; MS (ESI neg): m/z = 486 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.106 (1.34), 1.144 (4.63), 1.519 (16.00), 1.544 (0.64), 2.086 (1.34), 2.119 (1.97), 2.483 (1.16), 2.595 (0.68), 3.077 (0.43), 3.319 (1.89), 4.158 (0.42), 4.169 (0.81), 4.181 (2.03), 4.195 (0.76), 4.203 (0.48), 4.541 (0.43), 7.259 (0.80), 7.277 (0.76), 7.293 (0.68), 7.312 (0.44), 7.378 (0.62), 7.384 (0.86), 7.397 (1.11), 7.403 (1.62), 7.415 (0.62), 7.422 (0.90), 7.521 (0.63), 7.540 (0.45), 7.583 (0.68), 7.605 (0.86), 7.626 (0.62), 7.747 (0.59), 7.766 (0.57), 7.784 (0.68), 7.806 (0.63), 7.847 (1.02), 7.864 (1.58), 7.883 (1.42).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 103A
(2S,5R)-2-(2-에틸부틸)-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진
(2R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (CAS-RN: 109838-859, 2.9 mL, 16 mmol)을 무수 THF (60 mL, 740 mmol) 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (10 mL, 1.6 M, 16 mmol)을 -78℃에서 교반하면서 15분 기간에 걸쳐 천천히 적가하였다. 3-(브로모메틸)펜탄 (5.91 g, 35.8 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 밤새 실온이 되도록 하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 물로 천천히 켄칭하였다. 디에틸 에테르를 첨가하고, 수분 동안 교반한 후, 유기 층을 분리하였다. 수성 상을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 2%)에 의해 정제하여 표제 화합물 2.60 g (95% 순도, 57% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.90분; MS (ESI pos): m/z = 269 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (0.51), 0.008 (0.45), 0.608 (6.77), 0.624 (6.91), 0.771 (3.04), 0.790 (7.57), 0.796 (3.51), 0.808 (4.20), 0.815 (7.45), 0.833 (3.54), 0.999 (6.56), 1.016 (6.71), 1.179 (0.65), 1.197 (0.97), 1.215 (0.95), 1.223 (0.51), 1.232 (0.73), 1.240 (0.81), 1.257 (1.26), 1.275 (1.64), 1.294 (1.28), 1.310 (0.57), 1.343 (0.55), 1.356 (1.67), 1.364 (0.66), 1.369 (0.83), 1.376 (1.52), 1.388 (1.40), 1.398 (0.66), 1.403 (0.63), 1.409 (1.04), 1.422 (0.43), 1.459 (0.56), 1.474 (0.63), 1.489 (0.45), 1.637 (0.66), 1.647 (0.68), 1.656 (0.56), 1.667 (0.69), 1.670 (0.69), 1.681 (0.54), 1.690 (0.48), 1.700 (0.44), 2.191 (0.54), 2.199 (0.55), 2.208 (0.71), 2.216 (0.71), 2.225 (0.52), 2.233 (0.51), 3.597 (16.00), 3.616 (15.85), 3.916 (1.08), 3.925 (2.24), 3.933 (1.46), 3.959 (0.67), 3.969 (1.06), 3.980 (0.99), 3.990 (1.00), 4.000 (0.49).
실시예 104A
메틸 4-에틸-L-노르류시네이트
메탄올 (30 mL) 중 (2S,5R)-2-(2-에틸부틸)-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (실시예 103A, 2.60 g, 9.69 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고, 염산의 10% 수용액 (10 mL)을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 용액을 증발시키고, 잔류물을 DCM 및 탄산나트륨 용액 (100 mL, 2.0 M)으로 희석하였다. 분리된 수성 층을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 3.49 g (48% 순도, 100% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): Rt = 3.18분, m/z = 173 [M+]
실시예 105A
4-에틸-N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-노르류신
메틸 4-에틸-L-노르류시네이트 (실시예 104A, 3.97 g, 48% 순도, 11.0 mmol)에 메탄올 (100 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액 (24 mL, 1.0 M)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온으로 가온하고, 추가로 4시간 동안 교반하였다. 물 (80 mL), 탄산수소나트륨 (2.03 g, 24.2 mmol) 및 탄산나트륨 (4.00 g, 37.7 mmol)을 용액에 순차적으로 첨가하였다. 메탄올을 회전 증발에 의해 반응 혼합물로부터 제거하고, 수용액을 1,4-디옥산 (60 mL)으로 희석하였다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (CAS-RN: 28920-43-6, 8.54 g, 33.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 및 MTBE를 첨가하고, 잠시 교반한 다음, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 MTBE로 추출한 다음, 합한 유기 층을 5% 탄산나트륨 용액으로 세척하였다. 합한 수성 층을 황산수소칼륨을 사용하여 pH 1로 산성화시키고, 수현탁액을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 (10:90); 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 (95:5); 19.48-19.66분 10:90으로의 구배; 19.66-20.72분 (10:90))에 의해 정제하여 표제 화합물 1.57 g (100% 순도, 37% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 11): Rt = 1.49분; MS (ESI pos): m/z = 404 [M+Na]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (3.19), 0.008 (3.01), 0.774 (6.73), 0.792 (16.00), 0.809 (13.36), 0.826 (14.04), 0.844 (7.32), 1.181 (0.92), 1.197 (1.90), 1.216 (3.12), 1.234 (3.84), 1.253 (2.82), 1.273 (1.79), 1.293 (2.23), 1.308 (3.41), 1.331 (4.60), 1.339 (4.12), 1.505 (0.45), 1.557 (3.55), 1.575 (5.01), 1.590 (3.09), 3.950 (1.22), 3.970 (2.67), 3.989 (2.69), 4.009 (1.11), 4.204 (1.35), 4.220 (3.90), 4.238 (7.46), 4.263 (5.22), 4.279 (3.57), 4.286 (5.10), 4.304 (3.43), 4.310 (2.32), 4.328 (1.06), 7.299 (2.60), 7.306 (2.93), 7.317 (5.73), 7.322 (5.59), 7.336 (3.69), 7.341 (3.48), 7.400 (6.17), 7.419 (10.33), 7.437 (4.62), 7.626 (4.21), 7.647 (3.80), 7.711 (8.98), 7.729 (8.16), 7.884 (9.94), 7.903 (9.15), 12.540 (0.98).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 106A
N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-2,6-디플루오로-L-페닐알라닌
메틸 2,6-디플루오로-L-페닐알라니네이트 (CAS-RN: 1192057-28-5, 1.03 g, 4.79 mmol)에 메탄올 (18.5 mL)을 첨가하고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액 (4.8 mL, 1.0 M)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (17 mL), 탄산수소나트륨 (402 mg, 4.79 mmol) 및 탄산나트륨 (667 mg, 6.29 mmol)을 용액에 첨가하였다. 메탄올을 회전 증발에 의해 제거하고, 수성 층을 1,4-디옥산 (14 mL)으로 희석하였다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (CAS-RN: 28920-43-6, 1.86 g, 7.18 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, MTBE로 세척하였다. 수성 층을 1 M 염산을 사용하여 pH 1로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물 1.74 g (100% 순도, 86% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.00분; MS (ESI pos): m/z = 424 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.157 (0.74), 1.175 (1.50), 1.193 (0.76), 1.988 (2.79), 2.992 (0.74), 3.014 (0.87), 3.025 (1.22), 3.048 (1.17), 3.118 (1.24), 3.134 (1.32), 3.153 (0.81), 3.169 (0.76), 3.316 (16.00), 4.021 (0.71), 4.039 (0.70), 4.131 (0.95), 4.149 (1.39), 4.166 (2.72), 4.194 (4.15), 4.213 (2.65), 4.235 (0.72), 7.013 (1.71), 7.033 (3.28), 7.053 (2.07), 7.290 (1.33), 7.307 (3.44), 7.323 (4.18), 7.341 (2.36), 7.357 (0.48), 7.397 (2.41), 7.415 (4.00), 7.434 (1.83), 7.639 (2.22), 7.659 (3.87), 7.679 (1.99), 7.818 (1.97), 7.839 (1.95), 7.876 (4.80), 7.894 (4.40), 12.793 (0.81).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 107A
N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-2,5-디플루오로-L-페닐알라닌
메틸 2,5-디플루오로-L-페닐알라니네이트 (CAS-RN: 1213491-95-2) (2.27 g, 10.5 mmol)에 메탄올 (40 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액 (11 mL, 1.0 M)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 물 (35 mL), 탄산수소나트륨 (886 mg, 10.5 mmol) 및 탄산나트륨 (1.47 g, 13.9 mmol)을 용액에 첨가하였다. 메탄올을 회전 증발에 의해 제거하고, 수성 층을 1,4-디옥산 (30 mL)으로 희석하였다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (CAS-RN: 28920-43-6, 4.09 g, 15.8 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고, MTBE로 세척하였다. 수성 층을 1 M 염산 용액을 사용하여 pH 1로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 DCM:메탄올 0-5%)에 의해 정제한 다음, 잔류물을 아세토니트릴에 녹이고, 정제용 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 40 mm; 용매: 0.1% HCOOH를 함유하는 AcCN/H2O; 유량: 100 mL/분; 구배: 0-5.50분 (10:90); 3.00분에 샘플 주입; 5.50-17.65분 95:5로의 구배; 17.65-19.48분 (95:5); 19.48-19.66분 10:90으로; 19.66-20.72분 (10:90)에 의해 다시 정제하여 표제 화합물 1.82 g (100% 순도, 41% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 1.04분; MS (ESI pos): m/z = 424 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (2.88), 0.008 (2.75), 1.234 (0.68), 2.329 (0.47), 2.671 (0.46), 2.843 (2.48), 2.870 (3.13), 2.877 (3.47), 2.904 (3.10), 3.166 (3.44), 3.177 (3.74), 3.200 (2.97), 3.212 (2.73), 4.141 (1.90), 4.158 (5.16), 4.173 (9.08), 4.196 (12.08), 4.201 (12.22), 4.211 (8.55), 4.221 (7.38), 4.233 (3.76), 4.246 (2.97), 4.259 (2.15), 7.084 (0.87), 7.093 (1.61), 7.106 (2.33), 7.114 (3.81), 7.124 (3.21), 7.135 (2.97), 7.144 (2.17), 7.175 (3.13), 7.187 (4.77), 7.197 (6.58), 7.210 (7.69), 7.220 (4.45), 7.232 (3.61), 7.263 (4.47), 7.282 (9.79), 7.301 (7.22), 7.305 (7.95), 7.325 (4.82), 7.349 (0.45), 7.389 (6.78), 7.408 (11.73), 7.426 (5.46), 7.489 (0.48), 7.509 (0.67), 7.532 (0.46), 7.610 (7.40), 7.628 (12.92), 7.646 (6.48), 7.791 (6.23), 7.812 (6.10), 7.871 (16.00), 7.890 (14.50), 12.862 (3.43).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
이 아미노산을 또한 실시예 126A에서 제조된 메틸 2,5-디플루오로-L-페닐알라니네이트로부터 제조하였다. 아미노산은 또한 실시예 106A에 기재된 절차를 사용하여 2,5-디플루오로-L-페닐알라니네이트 (CAS RN: 31105-92-7)로부터 제조할 수 있다.
실시예 108A
벤질 테트라히드로-2H-피란-3-일아세테이트 (라세미체)
테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산 (1.00 g, 6.94 mmol)을 메탄올 (10 mL, 250 mmol) 중에 용해시켰다. 탄산세슘 (1.13 g, 3.47 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 기체의 발생이 중지될 때까지 실온에서 교반하였다. 이어서, 용액을 증발시켰다. 잔류물을 DMF (10 mL) 중에 용해시키고, (브로모메틸)벤젠 (1.3 mL, 11 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 추가의 (브로모메틸)벤젠 (325 μL, 2.75 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 물 및 에테르로 희석하였다. 수분 동안 교반한 후, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 (85/15))에 의해 정제하여 표제 화합물 1.50 g (100% 순도, 92% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.84분; MS (ESI pos): m/z = 235 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.161 (0.45), 1.170 (0.51), 1.183 (0.89), 1.187 (0.68), 1.191 (0.98), 1.196 (0.60), 1.204 (0.68), 1.208 (1.03), 1.212 (0.77), 1.217 (1.00), 1.229 (0.62), 1.238 (0.63), 1.428 (0.47), 1.447 (0.62), 1.449 (0.74), 1.455 (0.95), 1.463 (0.63), 1.468 (0.83), 1.476 (1.42), 1.484 (0.80), 1.489 (0.56), 1.498 (0.98), 1.501 (0.53), 1.506 (1.11), 1.509 (1.00), 1.516 (1.65), 1.523 (1.08), 1.532 (0.56), 1.543 (0.70), 1.550 (0.40), 1.747 (0.90), 1.751 (0.77), 1.755 (0.89), 1.764 (0.62), 1.773 (0.82), 1.777 (0.69), 1.781 (0.77), 1.887 (0.41), 1.894 (0.68), 1.901 (0.68), 1.908 (0.76), 1.914 (0.90), 1.921 (0.74), 1.927 (0.68), 1.934 (0.63), 2.194 (1.30), 2.208 (1.18), 2.225 (3.67), 2.239 (3.41), 2.255 (3.55), 2.270 (3.23), 2.286 (1.23), 2.301 (1.12), 3.018 (2.02), 3.038 (2.30), 3.041 (2.34), 3.059 (2.06), 3.246 (1.05), 3.252 (1.07), 3.267 (1.61), 3.273 (1.61), 3.289 (1.21), 3.295 (1.19), 3.685 (0.75), 3.692 (1.34), 3.705 (1.77), 3.708 (1.89), 3.713 (2.24), 3.716 (2.16), 3.726 (1.17), 3.730 (1.14), 3.734 (1.08), 3.738 (0.97), 5.089 (16.00), 7.310 (0.41), 7.315 (0.73), 7.320 (0.71), 7.327 (2.21), 7.334 (1.16), 7.339 (1.36), 7.342 (1.95), 7.345 (2.49), 7.348 (2.36), 7.351 (1.63), 7.360 (9.48), 7.364 (11.33), 7.371 (1.08), 7.376 (3.55), 7.378 (3.74), 7.382 (1.62), 7.390 (0.55), 7.393 (1.20), 7.395 (0.74).
실시예 109A
벤질 테트라히드로-2H-피란-3-일 아세테이트
부분입체이성질체 혼합물 (실시예 108A, 1.5 g)을 메탄올/아세토니트릴 (30 mL) 중에 용해시키고, 키랄팩 AZ-H (SFC) 5 μm, 250 x 30 mm 칼럼을 사용하는 THAR 초임계 유체 크로마토그래피 정제용 200 기기를 사용하여 분리하였다; 용리액: CO2/에탄올 (90:10); 압력: 135 bar; 용리액 온도: 35℃; 유량: 100 g/분; 검출: UV 210 nm; 주입 부피 0.4 mL/주입; 일반적 작업 조건 하에 CO2 1 g/분은 1 mL/분과 대략 동등함.
순서 설정: 주기 시간 = 11.2분
분획 1을 1.48분에 수집하였다 (거울상이성질체 1)
분획 2를 1.89분 사이에 수집하였다 (거울상이성질체 2)
생성물-함유 분획을 합하고, 농축시켰다.
분획을 분석용 SFC-MS (애질런트, 칼럼: 다이셀 AZ-3 3 μm 100 x 4.6 mm, 용리액: CO2/에탄올 (90:10); BPR 압력: 130 bar; BPR 온도: 60℃; 칼럼 온도: 40℃; 유량: 3 mL/분; UV 210 nm)를 사용하여 분석하였다.
2종의 거울상이성질체의 입체화학은 할당하지 않았다.
벤질 테트라히드로-2H-피란-3-일아세테이트 (거울상이성질체 1)를 99.5% ee (641 mg, 100% 순도)로 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.98분; MS (ESI pos): m/z = 235 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.161 (0.45), 1.170 (0.51), 1.183 (0.89), 1.187 (0.67), 1.191 (0.98), 1.196 (0.61), 1.204 (0.67), 1.209 (1.03), 1.213 (0.77), 1.217 (1.00), 1.230 (0.61), 1.238 (0.62), 1.428 (0.48), 1.447 (0.61), 1.449 (0.75), 1.455 (0.95), 1.463 (0.64), 1.468 (0.82), 1.476 (1.41), 1.484 (0.79), 1.489 (0.56), 1.498 (0.98), 1.501 (0.52), 1.507 (1.05), 1.510 (1.00), 1.516 (1.65), 1.523 (1.07), 1.532 (0.55), 1.543 (0.70), 1.747 (0.90), 1.751 (0.78), 1.755 (0.89), 1.764 (0.63), 1.773 (0.81), 1.777 (0.69), 1.781 (0.78), 1.887 (0.40), 1.894 (0.69), 1.901 (0.68), 1.908 (0.76), 1.914 (0.91), 1.921 (0.74), 1.927 (0.67), 1.934 (0.64), 2.194 (1.30), 2.208 (1.18), 2.225 (3.69), 2.239 (3.42), 2.255 (3.56), 2.270 (3.24), 2.286 (1.23), 2.301 (1.12), 3.019 (2.02), 3.038 (2.29), 3.041 (2.36), 3.060 (2.07), 3.246 (1.05), 3.252 (1.08), 3.268 (1.63), 3.273 (1.63), 3.289 (1.24), 3.295 (1.23), 3.686 (0.75), 3.692 (1.34), 3.705 (1.73), 3.708 (1.90), 3.713 (2.19), 3.715 (2.20), 3.726 (1.19), 3.730 (1.13), 3.734 (1.08), 3.738 (0.97), 5.089 (16.00), 7.310 (0.40), 7.315 (0.74), 7.321 (0.69), 7.328 (2.23), 7.334 (1.13), 7.339 (1.36), 7.342 (1.99), 7.345 (2.52), 7.347 (2.34), 7.350 (1.66), 7.360 (9.33), 7.364 (11.16), 7.371 (1.09), 7.376 (3.58), 7.378 (3.72), 7.382 (1.63), 7.390 (0.54), 7.393 (1.20), 7.396 (0.75).
벤질 테트라히드로-2H-피란-3-일아세테이트 (거울상이성질체 2)를 또한 99.5% ee (611 mg, 100% 순도)로 수득하였다.
실시예 110A
테트라히드로-2H-피란-3-일아세트산 (거울상이성질체 1)
목탄 상 10% 팔라듐 (84.0 mg)을 아르곤 하에 메탄올로 가습하였다. 벤질 테트라히드로-2H-피란-3-일아세테이트 (실시예 109A, 641 mg, 2.74 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 주위 압력에서 2시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 규조토의 층 상에서 여과에 의해 제거하고, 필터 케이크를 메탄올로 세척하고, 용매를 회전 증류에 의해 제거하여 표제 화합물 364 mg (100% 순도, 92% 수율)을 수득하였다.
GC-MS (GC-MS 방법 1): Rt = 3.57분, m/z = 144 [M+]
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.145 (1.98), 1.154 (2.21), 1.166 (4.03), 1.171 (3.11), 1.175 (4.45), 1.180 (2.85), 1.188 (3.11), 1.192 (4.69), 1.196 (3.55), 1.201 (4.57), 1.213 (2.68), 1.222 (2.75), 1.428 (1.03), 1.436 (1.93), 1.445 (1.35), 1.449 (1.65), 1.455 (2.72), 1.458 (3.25), 1.463 (4.18), 1.471 (2.92), 1.476 (3.82), 1.484 (6.50), 1.493 (3.67), 1.498 (2.58), 1.506 (5.73), 1.514 (6.62), 1.521 (7.99), 1.528 (5.13), 1.537 (2.67), 1.548 (3.18), 1.554 (1.80), 1.563 (0.64), 1.759 (1.78), 1.767 (4.22), 1.771 (3.85), 1.775 (4.26), 1.784 (2.89), 1.793 (3.85), 1.797 (3.49), 1.801 (3.85), 1.809 (1.56), 1.824 (0.81), 1.832 (1.31), 1.839 (1.87), 1.846 (3.17), 1.853 (3.16), 1.859 (3.72), 1.866 (4.34), 1.873 (3.58), 1.879 (3.34), 1.886 (3.00), 1.893 (1.65), 1.900 (1.44), 1.908 (0.69), 2.023 (6.18), 2.036 (5.11), 2.054 (16.00), 2.068 (14.33), 2.087 (15.54), 2.101 (13.64), 2.118 (5.69), 2.133 (5.09), 2.999 (9.23), 3.018 (10.90), 3.021 (11.02), 3.040 (9.47), 3.134 (0.64), 3.247 (6.14), 3.253 (6.29), 3.269 (9.57), 3.275 (9.49), 3.291 (7.06), 3.297 (6.90), 3.586 (0.59), 3.696 (3.77), 3.703 (6.42), 3.709 (4.14), 3.717 (8.63), 3.725 (11.12), 3.739 (5.37), 3.743 (5.40), 3.747 (5.21), 3.750 (4.68).
이 물질을 SPPS에 사용하였다.
실시예 111A
(3S)-3-[(2S,5R)-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진-2-일]시클로헥산-1-온
(2R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (4.61 g, 25.0 mmol)을 THF (20 mL) 중에 용해시키고, -78℃로 냉각시켰다. 부틸리튬 (16 mL, 1.6 M, 25 mmol)을 교반하면서 적가하였다. 교반을 -78℃에서 15분 동안 계속하였다. 리튬 (아자니딜리덴메틸리덴)(티오펜-2-일)구리 (100 mL, 0.25 M, 25 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. THF (10 mL) 중 시클로헥스-2-엔-1-온 (2.4 mL, 25 mmol)으로부터의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 10분 동안 교반한 다음, 이것을 주위 온도에서 2시간 동안 추가로 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 탄산수소나트륨 용액 및 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 잔류물을 감압 하에 농축시켜 무색 오일 6.8 g을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산-에틸 아세테이트 85-15)에 의해 정제하여 표제 화합물 5.7 g (90% 순도, 64% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 3.14분; MS (ESI pos): m/z = 281.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.587 (0.94), 0.604 (1.17), 0.617 (6.04), 0.634 (6.04), 0.971 (0.51), 0.988 (5.87), 0.995 (1.32), 1.005 (5.67), 1.012 (0.98), 1.032 (0.88), 1.049 (0.91), 1.575 (0.55), 1.596 (0.42), 1.607 (0.61), 1.750 (0.61), 1.760 (0.78), 1.784 (1.05), 1.794 (1.28), 1.816 (0.50), 1.837 (0.50), 1.843 (0.57), 1.874 (0.43), 1.979 (0.82), 2.012 (1.26), 2.024 (0.52), 2.032 (0.55), 2.044 (0.95), 2.057 (0.40), 2.122 (0.46), 2.148 (0.80), 2.156 (1.00), 2.164 (1.00), 2.173 (0.67), 2.181 (0.70), 2.190 (0.69), 2.199 (0.54), 2.207 (0.59), 2.225 (0.71), 2.242 (0.64), 2.259 (0.74), 2.275 (0.64), 2.294 (0.45), 2.310 (0.65), 2.319 (0.47), 2.329 (0.48), 2.338 (0.58), 2.348 (0.54), 3.602 (0.89), 3.631 (16.00), 3.642 (4.12), 3.652 (14.26), 3.902 (1.14), 3.911 (2.10), 3.920 (1.33), 3.943 (0.45), 4.069 (1.14), 4.078 (1.82), 4.086 (0.98), 4.492 (0.55), 5.674 (0.91).
실시예 112A
(1R,3S)-3-[(2S,5R)-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진-2-일]시클로헥산-1-올 (2종의 입체이성질체가 존재함)
(3S)-3-[(2S,5R)-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진-2-일]시클로헥산-1-온 (실시예 111A, 5.70 g, 20.3 mmol)을 메탄올 (50 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 소듐 테트라히드로보레이트 (769 mg, 20.3 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 추가의 소듐 테트라히드로보레이트 (769 mg, 20.3 mmol)를 첨가하고, 교반을 실온에서 계속하였다. 이 단계를 0.5 당량의 소듐 테트라히드로보레이트로 2회 더 반복하였다. 메탄올을 증발시키고, 잔류물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석하였다. 수분 동안 교반한 후, 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물을 감압 하에 농축시켜 황색 오일 5.7 g을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (구배 시클로헥산-시클로헥산 에틸 아세테이트 5%-30%)에 의해 정제하여 표제 화합물 4.95 g (86% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.87분; MS (ESI pos): m/z = 283.2 [M+H]+; Rt = 1.91분; MS (ESI pos): m/z = 283.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.589 (1.83), 0.600 (6.10), 0.605 (2.52), 0.617 (6.02), 0.739 (0.91), 0.768 (0.96), 0.798 (0.42), 0.898 (0.47), 0.934 (0.50), 0.997 (6.80), 1.014 (7.00), 1.157 (0.53), 1.175 (0.92), 1.193 (0.73), 1.203 (0.72), 1.211 (0.59), 1.227 (0.47), 1.235 (0.72), 1.243 (0.51), 1.313 (0.52), 1.321 (0.63), 1.352 (0.99), 1.398 (2.43), 1.485 (0.59), 1.515 (0.56), 1.668 (0.44), 1.676 (0.56), 1.684 (0.44), 1.708 (0.51), 1.745 (0.57), 1.774 (0.54), 1.879 (0.58), 1.887 (0.56), 1.988 (1.39), 2.185 (0.54), 2.193 (0.57), 2.202 (0.73), 2.210 (0.75), 2.219 (0.55), 2.227 (0.55), 3.611 (7.06), 3.617 (3.03), 3.622 (16.00), 3.629 (14.28), 3.845 (0.55), 3.854 (0.50), 3.862 (1.17), 3.871 (2.39), 3.880 (1.79), 3.933 (1.11), 3.942 (1.74), 3.951 (0.86), 4.215 (0.59), 4.223 (0.57), 4.431 (2.16), 4.443 (2.10).
실시예 113A
메틸 (2S)-아미노 [(1S)-3-히드록시시클로헥실]아세테이트 (2종의 입체이성질체가 존재함)
(3S)-3-[(2S,5R)-5-이소프로필-3,6-디메톡시-2,5-디히드로피라진-2-일]시클로헥산올 (실시예 112A, 4.95 g, 17.5 mmol)을 메탄올 (45 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 10% 수성 염산 용액 (15 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 잠시 동안 교반한 다음, 이것을 실온에서 3시간 동안 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 DCM으로 희석한 다음, 수성 탄산나트륨 용액 (150 mL, 2.0 M, 300 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 교반한 다음, 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (DCM:메탄올 95+5)로 정제하여 표제 화합물 1.92 g (58% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (1.04), 0.008 (0.93), 0.760 (0.69), 0.777 (0.71), 0.834 (0.61), 0.867 (1.92), 0.875 (1.16), 0.885 (1.54), 0.892 (1.18), 0.910 (0.45), 0.922 (0.61), 0.942 (1.05), 0.951 (0.95), 0.973 (1.17), 0.981 (1.06), 1.003 (0.54), 1.012 (0.50), 1.157 (0.67), 1.165 (0.41), 1.190 (0.65), 1.198 (0.44), 1.223 (0.42), 1.375 (0.69), 1.407 (0.79), 1.498 (0.52), 1.513 (0.89), 1.519 (0.95), 1.527 (0.74), 1.549 (0.69), 1.633 (2.72), 1.671 (0.69), 1.680 (0.78), 1.753 (1.26), 1.783 (1.67), 1.959 (0.49), 2.086 (0.85), 3.096 (0.46), 3.110 (0.48), 3.138 (1.12), 3.151 (1.10), 3.162 (1.07), 3.175 (1.02), 3.276 (0.43), 3.288 (0.55), 3.593 (0.71), 3.603 (4.85), 3.612 (16.00), 3.626 (1.87), 3.633 (0.96), 3.637 (1.57), 4.232 (0.60), 4.240 (0.55), 4.481 (1.83), 4.492 (1.73), 5.754 (0.68).
실시예 114A
(2S)-2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-2-[(1S)-3-히드록시시클로헥실]아세트산 (2종의 입체이성질체가 존재함)
메틸 (2S)-아미노[(1S)-3-히드록시시클로헥실]아세테이트 (실시예 113A, 1.92 g, 10.3 mmol)를 메탄올 (40 mL)에 첨가하고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액 (10 mL, 1.0 M, 10 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (37 mL), 탄산수소나트륨 (861 mg, 10.3 mmol), 및 탄산나트륨 (1.43 g, 13.5 mmol)을 용액에 첨가하였다. 메탄올을 증발시키고, 수성 층을 1,4-디옥산 (30 mL)으로 희석하였다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, (9H-플루오렌-9-일)메틸 카르보노클로리데이트 (CAS-RN: 28920-43-6, 3.98 g, 15.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 및 MTBE를 첨가하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 산성화시키고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피 (DCM:메탄올/HOAc 95+5+1)로 정제하여 표제 화합물 2.22 g (55% 수율)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.62분; MS (ESI pos): m/z = 396.18 [M+H]+; Rt = 1.67분; MS (ESI pos): m/z = 396.18 [M+H]+
실시예 115A
(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-2-[(1S,3R)-3-히드록시시클로헥실]아세트산 (부분입체이성질체 1)
부분입체이성질체 1
(2S)-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}[(1S)-3-히드록시시클로헥실]아세트산 (실시예 114A, 2.22 g)을 실시예 96A에 기재된 방법을 사용하여 키랄 크로마토그래피에 의해 정제하여 부분입체이성질체 1 890 mg (100% 순도, 40% 수율, 99% ee)을 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.62분; MS (ESI pos): m/z = 396.2 [M+H]+
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.878 (0.88), 0.909 (1.80), 0.940 (2.23), 0.962 (1.87), 0.986 (2.99), 1.025 (4.63), 1.053 (3.69), 1.083 (1.14), 1.151 (1.18), 1.184 (2.16), 1.217 (1.71), 1.249 (0.53), 1.492 (2.55), 1.523 (2.32), 1.668 (2.86), 1.701 (2.42), 1.779 (6.54), 1.802 (4.90), 2.073 (4.22), 3.875 (0.46), 3.900 (3.08), 3.916 (3.51), 3.921 (3.52), 3.936 (2.67), 4.197 (1.31), 4.211 (3.35), 4.223 (9.23), 4.238 (12.01), 4.242 (10.59), 4.253 (6.34), 4.270 (3.91), 4.296 (0.72), 4.563 (2.04), 7.312 (6.21), 7.331 (14.61), 7.349 (9.50), 7.402 (9.30), 7.420 (15.31), 7.439 (6.83), 7.603 (4.81), 7.624 (4.95), 7.752 (11.74), 7.770 (10.65), 7.884 (16.00), 7.903 (14.82), 8.155 (0.69).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 116A
(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-2-[(1S,3S)-3-히드록시시클로헥실]아세트산 (부분입체이성질체 2)
또한, (2S)-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)[(1S,3S)-3-히드록시시클로헥실]아세트산의 부분입체이성질체 혼합물 (실시예 114A)의 키랄 크로마토그래피 동안 부분입체이성질체 2 280 mg (95% 순도, 12% 수율)을 단리하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.67분; MS (ESI pos): m/z = 396.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.862 (0.81), 0.879 (0.71), 1.024 (0.76), 1.055 (1.68), 1.084 (1.84), 1.113 (1.00), 1.274 (1.39), 1.308 (2.53), 1.339 (1.79), 1.404 (4.60), 1.430 (3.90), 1.498 (3.23), 1.531 (6.31), 1.566 (4.20), 1.609 (2.04), 1.640 (1.55), 2.179 (1.80), 2.328 (0.51), 2.670 (0.47), 3.820 (0.62), 3.839 (0.86), 3.858 (0.76), 3.904 (4.71), 3.920 (3.46), 3.925 (3.34), 3.941 (2.46), 4.195 (1.38), 4.210 (3.69), 4.223 (9.20), 4.238 (10.72), 4.244 (8.66), 4.254 (7.18), 4.272 (6.16), 7.309 (5.80), 7.328 (13.47), 7.346 (8.67), 7.400 (9.17), 7.419 (15.07), 7.437 (6.77), 7.487 (3.68), 7.508 (3.60), 7.546 (0.67), 7.637 (0.61), 7.748 (11.33), 7.767 (10.18), 7.883 (16.00), 7.901 (14.74).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 117A
3-({[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}메틸)시클로헥산카르복실산 (라세미체)
3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}시클로헥산카르복실산 (라세미체) (CAS RN: 145149-55-9, 1.00 g, 3.89 mmol)을 디클로로메탄 (20 mL, 310 mmol) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (20 mL, 260 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용액을 증발시키고, 잔류물을 아세톤 (15 mL) 중에 용해시켰다. 물 (10 mL), 탄산수소나트륨 (6.53 g, 77.7 mmol) 및 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (CAS-RN: 82911-69-11.38 g, 4.08 mmol)을 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 탄산수소나트륨 (6.53 g, 77.7 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 현탁액을 물로 희석하고, MTBE로 추출하였다. 수성 층을 수성 염산 (1 M)을 사용하여 산성화시킨 다음, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시키고, 증발시켜 3종의 생성물-함유 분획을 수득하였다: 130 mg (96% 순도, 8% 수율), 127 mg (96% 순도, 8% 수율), 51.0 mg (3% 수율).
LC-MS (방법 9): Rt = 1.01분; MS (ESI pos): m/z = 380 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.736 (0.49), 0.759 (1.44), 0.790 (1.73), 0.821 (0.80), 0.851 (0.96), 0.882 (2.75), 0.913 (2.99), 0.944 (1.23), 1.083 (0.45), 1.120 (0.52), 1.153 (1.38), 1.182 (3.81), 1.206 (3.18), 1.235 (1.28), 1.418 (1.48), 1.598 (1.97), 1.630 (2.23), 1.717 (2.24), 1.739 (1.48), 1.747 (1.53), 1.835 (1.93), 1.862 (3.95), 1.897 (2.04), 2.074 (2.00), 2.123 (1.19), 2.130 (1.10), 2.152 (2.02), 2.174 (0.85), 2.181 (0.95), 2.524 (1.06), 2.785 (0.60), 2.801 (1.06), 2.818 (2.22), 2.835 (3.08), 2.849 (2.89), 2.862 (3.29), 2.878 (2.21), 2.895 (1.16), 2.911 (0.57), 4.188 (1.46), 4.206 (3.84), 4.223 (3.22), 4.238 (0.88), 4.253 (0.91), 4.287 (11.07), 4.304 (6.87), 4.333 (0.64), 4.351 (0.40), 4.451 (0.68), 7.306 (6.09), 7.324 (16.00), 7.341 (10.19), 7.392 (6.85), 7.410 (10.96), 7.429 (4.86), 7.459 (0.43), 7.626 (0.73), 7.643 (0.75), 7.683 (9.67), 7.702 (8.66), 7.875 (11.34), 7.894 (10.10), 12.028 (1.95).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
실시예 118A
벤질 (2S)-2-(모르폴린-4-일)프로파노에이트
L-알라닌 (589 mg, 6.61 mmol), 1-브로모-2-(2-브로모에톡시)에탄 (910 μL, 7.3 mmol) 및 탄산나트륨을 에탄올 중에 용해시키고, 용액을 2일 동안 환류하였다. 현탁액을 실온이 되도록 하고, 현탁액을 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 에탄올 (30 mL) 중에 현탁시키고, 3 M 염산을 첨가하여 pH를 (pH= 3으로) 조정하였다. 현탁액을 여과하고, 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 DMF (20 mL) 중에 용해시켰다. 탄산세슘 (1.08 g, 3.30 mmol) 및 (브로모메틸)벤젠 (1.6 mL, 13 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 이어서, 물을 첨가한 다음, 용액을 역상 HPLC (칼럼: 레프로실; C18; 10 μm; 125 x 30 mm; 용리액 0.1% HCOOH 개질제를 함유하는 ACN/H2O; 유량: 75 mL/분; 구배: 0-5.50분 10/90; 3.00분까지 샘플 주입; 5.50-17.65분 95/5로의 구배; 17.65-19.48분 95/5; 19.48-19.66분 10/90으로의 구배; 19.66-20.72분 10/90)에 의해 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 동결건조시켜 표제 화합물 800 mg (98% 순도, 48% 수율)을 무색 오일; ee ＞99%로서 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.51분; MS (ESI pos): m/z = 250 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.191 (10.46), 1.205 (10.52), 2.462 (0.66), 2.469 (0.77), 2.473 (0.76), 2.485 (1.55), 2.521 (1.43), 2.562 (0.63), 3.330 (0.93), 3.344 (2.66), 3.358 (2.62), 3.372 (0.86), 3.499 (0.46), 3.506 (0.63), 3.511 (0.45), 3.521 (2.34), 3.530 (3.52), 3.532 (3.50), 3.538 (3.54), 3.549 (2.18), 3.564 (0.56), 5.101 (0.60), 5.126 (5.99), 5.131 (5.75), 5.156 (0.57), 7.323 (0.69), 7.327 (0.52), 7.332 (1.27), 7.341 (1.23), 7.343 (0.94), 7.350 (1.14), 7.358 (0.50), 7.369 (1.15), 7.377 (16.00), 7.386 (6.48), 7.392 (0.46).
실시예 119A
(2S)-2-(모르폴린-4-일)프로판산
팔라듐 (활성탄 상 10%) (100 mg)을 아르곤 하에 메탄올로 습윤화시켰다. 그 후, 벤질 (2S)-2-(모르폴린-4-일)프로파노에이트 (실시예 118A, 800 mg, 3.21 mmol)를 메탄올 (100 mL) 중에 용해시키고, 습윤화된 활성탄 상 팔라듐을 아르곤 하에 용액에 첨가하였다. 이어서, 현탁액을 수소 분위기 하에 주위 압력에서 2시간 동안 수소화시켰다. 용기에서 수소를 아르곤으로 퍼징하고, 현탁액을 셀라이트 상에서 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 MeCN/H2O 중에 용해시키고, 동결건조시켜 표제 화합물 501 mg (＞99% 순도, 98% 수율)을 담갈색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 9): Rt = 0.16분; MS (ESI pos): m/z = 160 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, 산화중수소) δ [ppm]: 1.519 (16.00), 1.534 (15.96), 3.695 (1.39), 3.709 (4.02), 3.724 (3.89), 3.738 (1.30).
실시예 120A
1-(Tert-부톡시카르보닐)-4-에틸리덴-L-프롤린
메틸(트리페닐)포스포늄 브로마이드 (34.7 g, 97.1 mmol)를 400 mL THF 중에 현탁시켰다. 톨루엔 중 KHMDS 용액의 용액 (146.6 mL, 15% w/v, 97.1 mmol)을 실온에서 적가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 0℃로 냉각시키고, 1-(tert-부톡시카르보닐)-4-옥소-L-프롤린 (11.1 g, 48.6 mmol)을 여러 부분으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 10% 시트르산 용액을 사용하여 약간 산성으로 만들고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 층을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 농후한 오렌지색 수지를 수득하였다. 조 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 121A
1-tert-부틸 2-메틸 (2S)-4-메틸리덴피롤리딘-1,2-디카르복실레이트
조 1-(tert-부톡시카르보닐)-4-에틸리덴-L-프롤린 (실시예 120A) (11.0 g, 48.6 mmol)을 DMF (60 mL) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨 (10.1 g, 72.9 mmol)을 첨가한 다음, 아이오도메탄 (4.5 ml, 73 mmol)을 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 회전 증발기로 제거하고, 에틸 아세테이트를 첨가한 다음, 혼합물을 물로 1회 세척하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 1회 재추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 진공 하에 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 DCM 중에 용해시키고, 바이오타지 이솔레라 플래쉬 크로마토그래피 시스템을 사용하는 정상 크로마토그래피에 의해 시클로헥산-에틸 아세테이트 (85/15)의 용리액을 사용하여 정제하여 표제 화합물 10.2 g (80%)을 황색 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 1.77분; MS (ESI pos): m/z = 186 M-C4H8+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.339 (16.00), 1.405 (10.53), 3.313 (10.02), 3.627 (3.90), 3.938 (2.21), 3.967 (0.60), 4.331 (0.51), 4.337 (0.54), 4.350 (0.57), 4.356 (0.59), 4.363 (0.47), 4.367 (0.42), 4.992 (1.33), 5.019 (1.17).
실시예 122A
5-tert-부틸 6-메틸 (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복실레이트
아르곤 하에, 디에틸아연 (22 mL, 헥산 중 1.0 M, 22 mmol)을 무수 DCM (27 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 5℃로 냉각시킨 다음, DCM (17 mL) 중 TFA (1.7 ml, 22 mmol)의 용액을 1시간 기간에 걸쳐 적가하였다. 용액을 5℃에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 무수 DCM (5 mL) 중 디아이오도메탄 (1.8 mL, 22 mmol)의 용액을 신속하게 적가하고, 생성된 용액을 5℃에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 그 후, 무수 DCM (5 mL) 중 1-tert-부틸 2-메틸 (2S)-4-메틸리덴피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (실시예 121A) (2.70 g, 11.2 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 해동 빙조에서 90시간 동안 교반한 다음, 포화 수성 염화암모늄 용액으로 켄칭하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 DCM으로 1회 재추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 증발시켜 조 생성물 1.57 g을 황색 오일로서 수득하였다. 오일을 에틸 아세테이트 (54 mL) 중에 용해시키고, 디-tert-부틸디카르보네이트 (2.6 mL, 11 mmol) 및 트리에틸아민 (3.1 mL, 22 mmol)을 순차적으로 첨가한 다음, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 10/1; 닌히드린으로 착색됨)를 사용하여 제어하였다. 조 생성물을 석유 에테르-에틸 아세테이트 (EA) (2%에서 18% EA)의 용리액 구배를 사용하는 바이오타지 이솔레라 플래쉬 크로마토그래피 시스템 (100 g 바이오타지 카트리지 울트라)을 사용하여 정상 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 1.02 g을 무색 오일로서 수득하였다.
실시예 123A
(6S)-5-(tert-부톡시카르보닐)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산
5-tert-부틸 6-메틸 (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복실레이트 (실시예 122A) (2.50 g, 9.79 mmol)를 50% THF/물 (40 mL) 중에 용해시켰다. 수산화리튬 (703 mg, 29.4 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. THF를 회전 증발기를 사용하여 제거하고, 수용액을 추가의 물 (20 mL)로 희석하고, MTBE로 1회 세척하였다. 분리된 수성 상을 1 M 염산 (30 mL)을 사용하여 산성화시킨 다음, DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 표제 화합물 2.4 g을 무색 오일로서 수득하였다.
실시예 124A
(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산
(6S)-5-(tert-부톡시카르보닐)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (실시예 123A) (2.36 g, 9.79 mmol)을 DCM (50 mL) 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (10 mL, 250 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC (DCM/MeOH 9/1)를 사용하여 반응 제어를 수행하였다. 용액을 증발시키고, 조 생성물을 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 갈색 잔류물로서 수득하였다. 이를 후속 단계에 직접 사용하였다 (Fmoc 보호, 실시예 82A 참조).
실시예 15A
(2S,5R)-2-[(2,5-디플루오로페닐)메틸]-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진
반응을 아르곤 하에 수행하였다. (2R)-3,6-디메톡시-2-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (CAS-RN: 109838-85-9) (2.9 ml, 16 mmol)을 무수 THF (40 mL) 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, n-부틸 리튬 용액 (10 mL, 헥산 중 1.6 M, 16 mmol)을 천천히 적가하고, 생성된 용액을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 무수 THF (15 mL) 중 2-(브로모메틸)-1,4-디플루오로벤젠 (4.05 g, 19.5 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물이 실온이 될 때까지 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 HPLC에 의해 반응 진행을 모니터링하면서 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 염화나트륨 용액으로 1회 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 농축시켜 조 황색 오일 5.46 g을 수득하였다. 오일을 시클로헥산-에틸 아세테이트 (EA) (95/5)의 용리액을 사용하는 바이오타지 이솔레라 플래쉬 크로마토그래피 시스템 (100 g 바이오타지 카트리지 울트라)을 사용하여 정상 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 4.16 g (82%)을 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 10): Rt = 2.44분; MS (ESI pos): m/z = 311 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 0.563 (6.79), 0.580 (6.97), 0.933 (6.65), 0.951 (6.88), 2.103 (0.58), 2.111 (0.61), 2.120 (0.78), 2.129 (0.79), 2.137 (0.59), 2.145 (0.57), 2.864 (0.79), 2.882 (0.83), 2.898 (1.08), 2.915 (1.09), 3.089 (1.06), 3.101 (1.10), 3.123 (0.82), 3.134 (0.81), 3.313 (7.20), 3.518 (1.28), 3.527 (2.46), 3.535 (1.37), 3.566 (16.00), 4.293 (0.58), 4.304 (1.07), 4.313 (1.08), 4.321 (1.01), 4.330 (0.58), 6.992 (0.47), 7.000 (0.66), 7.005 (0.63), 7.015 (1.06), 7.023 (0.71), 7.028 (0.64), 7.037 (0.63), 7.075 (0.63), 7.084 (0.91), 7.095 (0.74), 7.105 (0.66), 7.131 (0.68), 7.143 (0.73), 7.154 (1.05), 7.166 (1.04), 7.177 (0.45), 7.189 (0.40).
실시예 126A
메틸 2,5-디플루오로-L-페닐알라니네이트
(2S,5R)-2-[(2,5-디플루오로페닐)메틸]-3,6-디메톡시-5-(프로판-2-일)-2,5-디히드로피라진 (실시예 125A) (4.15 g, 13.4 mmol)을 메탄올 (35 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수성 10% 염산의 용액 (12 mL)을 첨가하고, 용액을 0℃에서 몇 분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 실온이 되도록 한 다음, 이 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 메탄올을 증발시켰다. 잔류물을 DCM으로 희석하고, 2 M 수성 탄산나트륨 용액 (120 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 수분 동안 격렬히 교반하였다. 층을 분리하고, 수성 상을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켜 무색 액체 3.97 g을 수득하였다. 조 액체를 시클로헥산-에틸 아세테이트 (EA) (10%에서 75% EA)의 구배 용리액을 사용하는 바이오타지 이솔레라 플래쉬 크로마토그래피 시스템 (100 g 바이오타지 카트리지 울트라)을 사용하여 정상 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 2.27 g (79%)을 무색 액체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 1.20분; MS (ESI pos): m/z = 216 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.833 (16.00), 2.733 (3.07), 2.753 (3.26), 2.767 (4.81), 2.787 (5.01), 2.889 (4.71), 2.904 (4.91), 2.923 (3.10), 2.938 (3.19), 3.315 (15.20), 3.401 (0.42), 3.553 (5.22), 3.568 (6.29), 3.572 (6.60), 3.768 (0.41), 7.060 (0.89), 7.069 (1.71), 7.081 (2.21), 7.090 (4.07), 7.101 (3.20), 7.111 (2.84), 7.120 (1.89), 7.151 (5.97), 7.163 (5.82), 7.174 (9.84), 7.186 (7.52), 7.196 (4.42), 7.208 (2.10).
실시예 127A
tert-부틸 (2R)-2-아미노-3-[[(2R)-2-아미노-3-tert-부톡시-3-옥소-프로필]디술파닐]프로파노에이트
tert-부틸 아세테이트 (63.22 g, 544.24 mmol, 73 mL) 중 L-시스틴 (CAS RN: 56-89-3) (10.00 g, 41.61 mmol)의 현탁액에 HClO4 (18.26 g, 127.23 mmol, 11 mL, 70% 순도) (H2O 중 70%)를 0℃에서 0.5시간에 걸쳐 적가한 다음, 용액을 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. 얼음을 첨가하고, 용액을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다 (이론치 14.67 g).
실시예 128A
tert-부틸 (2R)-3-[[(2R)-3-tert-부톡시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-옥소-프로필]디술파닐]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노에이트
물 (200 mL) 및 EA (200 mL) 중 tert-부틸 (2R)-2-아미노-3-[[(2R)-2-아미노-3-tert-부톡시-3-옥소-프로필]디술파닐]프로파노에이트 (이론치 14.67 g, 실시예 127A로부터임)의 혼합물에 0℃에서 Na2CO3 (30.00 g, 283.08 mmol) 및 Boc2O (27.25 g, 124.85 mmol)를 첨가하고, 혼합물 (pH는 8-9였음)을 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EA (100 mL) 및 물 (200 mL)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EA (200 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (200 mL)로 세척하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (PE/EA=1/0에서 1/1)에 의해 정제하여 표제 화합물의 2개의 배치를 수득하였다: 담갈색 오일로서 조 물질 8.5 g 및 담갈색 오일로서 6.5 g.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.51, 1.61, 1.62. 1.64, 3.11, 3.12, 3.14, 3.16, 3.19, 3.203, 3.23, 3.24, 4.44, 4.46, 4.48, 4.49, 5.35, 5.37.
실시예 129A
tert-부틸 (2R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-술파닐-프로파노에이트
THF (150 mL) 및 물 (15 mL) 중 tert-부틸 (2R)-3-[[(2R)-3-tert-부톡시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-옥소-프로필]디술파닐]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노에이트 (8.5 g, 조 물질, 실시예 128A로부터임)의 용액에 트리부틸포스판 (3.77 g, 4.6 mL)을 0℃에서 0.5시간에 걸쳐 첨가한 다음, 용액을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 6.5 g의 희귀 물질 (실시예 128A로부터임)로부터 제조된 또 다른 배치로 후처리하였다. 두 반응 혼합물 모두를 물 (300 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트 (150 mL x 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (300 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (PE/EA = 40/1에서 10/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 12.5 g을 무색 오일로서 수득하였으며, 이를 순수한 것으로 사용하였다. 잔류 트리부틸포스핀을 함유하는 불순한 배치 6.5 g을 또한 수득하였으나 폐기하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.45, 2.94, 2.95, 2.96, 2.97, 4.46, 4.47, 4.48, 4.49, 5.39, 5.41
실시예 130A
tert-부틸 (2R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(트리플루오로메틸술파닐)프로파노에이트
MeOH (150 mL) 중 3,3-디메틸-1-(트리플루오로메틸)-1,2-벤즈아이오독솔 (18 g, 54.53 mmol)의 용액에 MeOH (20 mL) 중 tert-부틸 (2R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-술파닐-프로파노에이트 (14 g, 50.47 mmol, 실시예 129A로부터임)의 용액을 -78℃에서 N2 하에 30분에 걸쳐 첨가하고, 반응물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였으며, 이때 이것은 무색 용액이 되었다. 반응 혼합물을 20℃로 가온하고, 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (PE/EA=1/0에서 40/1)에 의해 2회 정제하여 표제 화합물 13.2 g을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.47, 3.26, 3.28, 3.30, 3.31, 3.45, 3.46, 3.48, 3.50, 4.47, 4.48, 5.34, 5.35.
실시예 131A
tert-부틸 (2R)-2-아미노-3-(트리플루오로메틸술파닐)프로파노에이트 히드로클로라이드
DCM (10 mL) 중 tert-부틸 (2R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(트리플루오로메틸술파닐)-프로파노에이트 (12.20 g, 35.32 mmol, 실시예 130A로부터임)의 용액에 HCl/디옥산의 용액 (4 M, 50 mL)을 첨가하고, 반응물을 10℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 백색 유리질 고체를 수득하였으며, 이를 후속 단계에 직접 사용하였다.
실시예 132A
tert-부틸 (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-(트리플루오로메틸술파닐)-프로파노에이트
디옥산 (80 mL) 중 tert-부틸 (2R)-2-아미노-3-(트리플루오로메틸술파닐)프로파노에이트 히드로클로라이드 (실시예 131A로부터의 조 물질)의 혼합물에 포화 NaHCO3 (80 mL), 및 Fmoc-OSu (19 g, 56.33 mmol)를 첨가하고, 반응물 (pH ~7-8)을 10℃에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 (100 mL)로 희석한 다음, EA (100 mL x 2)로 추출하였다. 유기 층을 염수 (100 mL)로 세척하고, 농축시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피 (PE/EA=40/1~10/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 13 g을 무색 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 1.028분; MS (ESI pos): m/z = 490.2 [M+Na]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.45, 3.32, 3.47, 3.36, 3,49, 3.50, 4.16, 4.22, 4.24, 4.26, 4.37, 4.44, 4.46, 4.58, 5.62, 5.64, 7.33, 7.35, 7.40, 7.42, 7.44, 7.56, 7.61, 7.77, 7.79.
19F NMR: (376 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -40.85.
실시예 133A
2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-(트리플루오로메틸술파닐)프로판산
DCM (15 mL) 중 tert-부틸 (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-(트리플루오로메틸술파닐)-프로파노에이트 (13 g, 27.81 mmol)의 용액에 TFA (30 mL) 및 티오아니솔 (15.75 g, 126.81 mmol, 15 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 10℃에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)으로 희석한 다음, EA (50 mL x 2)로 추출하였다. 유기 층을 1 M HCl (50 mL)로 세척하고, 농축시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피 (PE/EA=10/1에 이어서 DCM/MeOH=40/1에서 5/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 10 g을 백색 유리질 고체 순도: 98.8%로서 수득하였다. 1H NMR은 생성물이 에틸 아세테이트를 함유함을 나타냈으므로, 고체를 DCM (80 mL) 중에 재용해시키고, 농축시킨 다음, 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물 9.67 g (23.22 mmol, 83.5% 수율, 98.8% 순도)을 백색 유리질 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 0.895분; MS (ESI pos): m/z = 434.1 [M+Na]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 3.25, 3.26, 3.32, 3.33, 3.93, 3.95, 4.22, 4.24, 4.26, 4.28, 4.30, 4.31, 6.95, 6.98, 7.31, 7.32, 7.33, 7.34, 7.39, 7,41, 7.42, 7.68, 7.70, 7.87, 7.89.
19F NMR: (376 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -40.89
키랄 SFC: Rt = 2.49분, 99% ee
키랄 SFC 조건: AD-3_5CM_IPA (DEA)_10_20_3ML_T35 칼럼: 키랄팩 AD-3 50 x 4.6 mm I.D., 3 μm 이동상: 10%에서 20%의 CO2 중 이소-프로판올 (0.05% DEA) 유량: 3 mL/분 파장: 220 nm.
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다. 이 아미노산은 또한 상업적으로 입수가능하다 (CAS-RN: 1994331-25-7).
실시예 134A
디-tert-부틸 (2S)-5-옥소피롤리딘-1,2-디카르복실레이트
CH3CN (2.00 L) 중 화합물 tert-부틸 (2S)-5-옥소피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (CAS-RN: 35418-16-7) (290 g, 1.57 mol, 1.00 당량) 및 DMAP (1.91 g, 15.66 mmol, 0.01 당량)의 용액에 5℃에서 Boc2O (341 g, 1.57 mol, 359 mL, 1.00 당량)를 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물에서 출발 물질이 완전히 소모되었음을 나타냈고, 2개의 새로운 스팟 (TLC)이 형성되었다 (PE/EA = 3/1, Rf = 0.43, Rf = 0.9). 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 CH3CN을 제거하고, 잔류물을 DCM (1000 mL)과 물 (1000 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 (300 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EA = 100/1에서 10/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 (260.00 g, 874.75 mmol, 55.72% 수율, 96% 순도)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 0.873분; MS (ESI pos): m/z = 308.0 [M+Na]+, 331 [M+2Na]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.44-1.42 (d, J=8.4, 8H), 1.97-1.92 (m, 1H), 2.22-2.19 (m, 1H), 2.43-2.40 (m, 1H), 2.58-2.49 (m, 1H), 4.42-4.39 (m, 1H).
실시예 135A
디-tert-부틸 (2S)-4,4-디알릴-5-옥소-피롤리딘-1,2-디카르복실레이트
THF (40.0 mL) 중 디-tert-부틸 (2S)-5-옥소피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (61.9 g, 208 mmol, 1.00 당량, 실시예 134A로부터임)의 용액에 LiHMDS (1 M, 437 mL, 2.10 당량)를 -73℃에서 적가한 다음, -73℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물에 화합물 알릴 브로마이드 (50.4 g, 416 mmol, 2.00 당량)를 적가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 완전히 소모되었음을 나타내고, 4개의 새로운 스팟이 형성되었다 (PE/EA = 3/1, Rf = 0.9, Rf = 0.8, Rf = 0.7, Rf = 0.1). 반응 혼합물을 포화 수성 염화암모늄 (1000 mL)으로 켄칭하고, DCM (500 mL x3)으로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EA = 100/1에서 30/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 (100 g, 38% 수율, 86% 순도)을 무색 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 1.044분; MS (ESI pos): m/z = 411.4 [M+2Na]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.49-1.43 (d, J=8.4, 8H), 1.87-1.82 (m, 1H), 2.22-2.18 (m,3H),
실시예 136A
디-tert-부틸 (2S)-4,4-디알릴피롤리딘-1,2-디카르복실레이트
THF (300 mL) 중 디-tert-부틸 (2S)-4,4-디알릴-5-옥소-피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (80.0 g, 188 mmol, 1.00 당량, 실시예 135A로부터임)의 용액에 -78℃에서 LiBHEt3 (1 M, 225 mL, 1.20 당량)을 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 -78℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 목적 MS가 검출되었음을 나타냈다. TLC는 2개의 새로운 스팟이 형성되었음을 나타냈다 (PE/EA = 3/1, Rf = 0.65, Rf = 0.8). 반응 혼합물을 0℃에서 포화 수성 탄산나트륨 (50 mL)으로 켄칭한 다음, 30% H2O2 (1 mL)를 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켜 THF를 제거한 다음, 잔류물을 물 (1000 mL) 및 DCM (1000 mL)으로 희석하였다. 수상을 DCM (300 mL x 3)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EA = 80/1에서 30/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 (56.0 g, 69% 수율, 85% 순도)을 무색 오일로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 1.192분; MS (ESI pos): m/z = 390.3 [M+K]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.53-1.47 (m, 18H), 2.13-1.98 (m, 2H), 2.22-2.15 (m,3H), 2.39-2.24 (m, 1H), 2.92-2.91 (m, 1H), 4.22-4.08 (m, 1H), 5.18-5.06 (m, 5H), 5.85-5.77 (m, 2H).
실시예 137A
디-tert-부틸 (3S)-2-아자스피로[4.4]논-7-엔-2,3-디카르복실레이트
DCM (400.00 mL) 중 그럽스 제1 세대 촉매 (CAS RN: 172222-30-9) (2.85 g, 3.47 mmol, 0.05 당량)의 용액에 디-tert-부틸 (2S)-4,4-디알릴피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 (25.0 g, 69.4 mmol, 1.00 당량, 실시예 136A로부터임)를 34℃에서 적가하였다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 N2 하에 34℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 2개의 새로운 스팟이 형성되었음을 나타냈다 (PE/EA = 5/1, Rf = 0.6, Rf = 0.7). 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EA = 1/0에서 80/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 (12.0 g)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 1.46-1.43 (m, 18H), 1.92-1.87 (m, 1H), 2.45-2.22 (m, 5H), 3.49-3.29 (m, 2H), 4.21-4.19 (m, 1H), 5.64 (s, 2H).
실시예 138A
디-tert-부틸 (3S)-2-아자스피로[4.4]노난-2,3-디카르복실레이트
EtOH (100 mL) 중 디-tert-부틸 (3S)-2-아자스피로[4.4]논-7-엔-2,3-디카르복실레이트 (12.0 g, 37.1 mmol, 1.0 당량, 실시예 137A로부터임)의 용액에 N2 분위기 하에 Pd/C (10%, 0.1 g)를 첨가하였다. 현탁액을 탈기하고, H2 기체로 3회 퍼징하였다. 혼합물을 25℃에서 H2 (15 Psi) 하에 16시간 동안 교반하였다. 현탁액의 일부를 여과하고, 여과물을 농축시키고, 양성자 NMR을 취하였으며, 이는 목적 생성물이 형성되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물 10.0 g (조 물질)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 4.12-4.02 (m, 1H), 3.65-3.60 (m, 2H), 3.12-3.38 (m, 5H), 2.11-2.06 (m, 1H), 1.80-1.77 (m, 1H), 1.57-1.56 (m, 6H), 1.40-1.36 (m, 18H).
실시예 139A
(3S)-2-아자스피로[4.4]노난-3-카르복실산
화합물 디-tert-부틸 (3S)-2-아자스피로[4.4]노난-2,3-디카르복실레이트 (12 g, 36.8 mmol, 1 당량, 실시예 138A로부터임)를 HCl/EtOAc의 용액 (150 mL)에 첨가한 다음, 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS 분석은 출발 물질이 소모되었음을 나타냈고, 목적 표적 질량이 발견되었다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켜 용매를 제거하여 조 표제 화합물 7.5 g (36.4 mmol, 99% 수율)을 백색 고체로서 히드로클로라이드 염으로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ [ppm]: 10.07 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 4.38-4.27 (m, 1H), 3.16-3.02 (m, 2H), 2.22-2.21 (m, 1H), 1.96-1.90 (m, 1H), 1.63-1.56 (m, 8H).
실시예 140A
(3S)-2-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-2-아자스피로[4.4]노난-3-카르복실산
THF (70 mL) 및 H2O (70 mL) 중 (3S)-2-아자스피로[4.4]노난-3-카르복실산 (5.1 g, 24.8 mmol, 실시예 139A로부터임) 및 Fmoc-OSu (10.0 g, 29.7 mmol, 1.2 당량)의 용액에 NaHCO3 (8.5 g, 101 mmol, 3.94, 4.08 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS 분석은 출발 물질이 소모되었음을 나타냈고, 목적 표적 질량을 수득하였다. 물 (200 ml)을 첨가한 다음, 혼합물을 DCM (200 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 생성물을 역상 MPLC (EA)에 대해 정제하여 표제 화합물 6.9 g (17.5 mmol, 70% 수율, 99% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 2.501분; MS (ESI pos): m/z = 392.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.80-7.79 (d, J= 7.2, 2H), 7.59-7.54 (m, 2H), 7.44-7.42 (m, 2H), 7.36-7.35 (m, 2H), 4.55-4.52 (m, 2H), 4.42-4.38 (m, 1H), 4.31-4.20 (m, 1H), 3.34-3.17 (m,2H), 2.33-2.28 (m, 1H), 2.13-2.08 (m, 1H), 1.73-1.50 (m, 8H).
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다. 이 아미노산은 또한 상업적으로 입수가능하다 (CAS-RN: 394734-78-2).
실시예 141A
(2S,4R)-4-(트리플루오로메틸)피롤리딘-2-카르복실산
DCM (70 mL) 중 (2S,4R)-1-tert-부톡시카르보닐-4-(트리플루오로메틸)피롤리딘-2-카르복실산 (7 g, 24.7 mmol, 1 당량)의 용액에 TFA (8.00 mL, 108 mmol, 4.37 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS 분석은 출발 물질이 소모되고 목적 표적 질량이 발견되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 조 생성물을 직접 후속 단계에 사용하였다. 표제 화합물 (7.34 g, 24.7 mmol, 100% 수율, TFA 염)을 백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 0.18분; MS (ESI pos): m/z = 184.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 4.51-4.48 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.57-3.55 (m, 1H), 2.65-2.62 (m, 2H), 2.53-2.49 (m, 1H).
실시예 142A
(2S,4R)-1-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)-4-(트리플루오로메틸)피롤리딘-2-카르복실산
H2O (70 mL) 및 아세톤 (70 mL) 중 조 (2S,4R)-4-(트리플루오로메틸)피롤리딘-2-카르복실산 (2 g, 6.73 mmol, 1 당량, TFA 염, 실시예 141A로부터임)의 용액에 Na2CO3 (2.85 g, 26.9 mmol, 4 당량) 및 Fmoc-OSu (2.72 g, 8.08 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS 분석은 단지 1개의 피크를 나타냈고, 목적 질량이 발견되었다. TLC 분석 (DCM/MeOH = 10/1)은 출발 물질이 소모되었고, 주요 스팟 (Rf = 0.4)이 나타났음을 나타냈다. HCl 용액 (1 M, 30 mL)을 pH = 2까지 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 DCM (70 mL x 2)으로 추출하고, 합한 유기 층을 염수 (70 ml)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EA = 10/1에서 5/1)에 의해 정제하여 표제 화합물 1.7 g (61%, 97% 순도)을 황색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 15): Rt = 2.425분; MS (ESI pos): m/z = 406.2 [M+H]+, 406.2 [M+Na]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ [ppm]: 7.92-7.89 (m, 2H), 7.66-7.64 (m, 2H), 7.42-7.41 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 2H), 4.16-4.19 (m, 4H), 3.72-3.50 (m, 3H), 2.38-2.30 (m, 2H), 2.18 (s, 1H).
19F NMR (400 MHz, DMSO) δ [ppm]: -70.128, -70.275.
키랄 SFC: Rt = 2.33분, 99% ee
키랄 SFC 조건: AD-3_5CM_IPA (DEA)_10_20_3ML_T35 칼럼: 키랄팩 AD-3 50 x 4.6 mm I.D., 3 μm 이동상: 10%에서 20%의 CO2 중 이소-프로판올 (0.05% DEA) 유량: 3 mL/분 파장: 220 nm.
이 아미노산을 SPPS에 사용하였다.
표 13: 참조 펩티드
표 14: 본 발명에 따른 펩티드
표 15: 참조 펩티드에 대한 분석 데이터
표 16: 본 발명에 따라 제조된 펩티드에 대한 분석 데이터
표 17: 선택된 펩티드에 대한 Maldi 질량 스펙트럼 데이터
하기에서, 실시예 29, 44, 45, 67, 75, 109, 166, 185, 347, 443, 466 및 499는 그의 화학 구조에 의해 예시된다. 본 발명은 이들 실시예의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 포함한다. 화학 구조는 염 유리 형태로서 표시된다.
실시예 29, 서열: AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH (HCl 염)
실시예 44, 서열: ((N-Me)G)-IC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IP-(PEG9(31개 원자))-NH2
실시예 45, 서열: AI-C+SRS-((tBu)A)-P-((6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산)-I-(Pen)+IPD-NH2
실시예 67, 서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2 (HCl 염)
실시예 75, 서열: AIC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-NH2
실시예 109, 서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IP-NH2
실시예 166, 서열: (3-아미노-2,2-디메틸프로피온산)-IC+SRS-((tBu)A)-PPI-(Pen)+IPD-NH2
실시예 185, 서열: AIC+SRSLP-(Oic)-I-((N-Me)C)+IPD-NH2
실시예 347, 서열: IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH
실시예 443, 서열: ((N-Me)A)-IC+SRS-((tBu)A)-P-((3R,6R)-1,1-디플루오로-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실산 (거울상이성질체 1))-I-(Pen)+IP-NH2
실시예 466, 서열: ((N-Me)G)-IC+SRSLP-(Oic)-I-(Pen)+IPDD-OH
실시예 499, 서열: AIC+S-(Arg (13C6,15N4))-SLP-(Oic)-I-(Pen)+IPD-OH
생물학적 시험관내 시험
1. 시험 화합물의 세린 프로테아제 프로파일링
시험 화합물을 칼리크레인, 플라스민, FXIa, 트롬빈, 인자 Xa, tPA 및 트립신을 포함한 상이한 인간 세린 프로테아제로 이루어진 프로테아제 패널에서 시험하였다.
시험 설명
시험 화합물의 억제 효력 및/또는 선택성을 결정하였다. 검정은 프로테아제 촉매된 절단 시에 형광원성 펩티드성 프로테아제 기질로부터 방출되는 아미노메틸쿠마린 (AMC)의 형광 검출에 기초한다. 전형적으로 인간 혈장으로부터 또는 인간 췌장으로부터의 트립신에 대해 정제된 활성 프로테아제 또는 지모겐, 및 상응하는 기질은 상업적으로 입수가능하다.
세린 프로테아제 검정은 하기 효소 및 기질로 구성된다. 모든 효소 및 기질을 검정 완충제 (50 mM 트리스/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% BSA) 중에 희석하였다. 최종 검정 농도가 하기 제공된다:
· 칼리크레인 (코르디아(Kordia); 0.2 nM), H-Pro-Phe-Arg-AMC (바켐 I-1295; 5 μM)
· 플라스민 (코르디아; 0.1 μg/mL, 1.2 nM), MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC (바켐 I-1275; 50 μM)
· 인자 XIa (코르디아; 0.15 nM), Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC (바켐 I-1575; 5 μM)
· 트롬빈 (코르디아; 0.02 nM), Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-AMC (바켐 I-1560; 5 μM)
· 인자 Xa (코르디아; 1.3 nM), Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC (바켐 I-1100; 5 μM)
· 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA, 록소; 2 nM), CH3SO2-D-Phe-Gly-Arg-AMC (펜타팜 091-06; 5 μM)
· 트립신 (시그마; 0.042 U/mL), 기질 Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC (바켐 I-1100; 5 μM)
시험 화합물 효력의 결정을 위해, 효소 및 상응하는 기질 희석물을 사용하여 프로테아제 검정을 수행하였다:
시험 또는 참조 화합물의 연속 희석물 1 μL/웰을 함유하는 384 웰 마이크로타이터 플레이트 (백색, 그라이너(Greiner))에 20 μL 검정 완충제, 20 μl 효소 희석물 및 20 μl 기질을 첨가하였다. 대조군 반응은 시험 화합물을 함유하지 않았다 (DMSO 단독). 실온에서 전형적으로 30분 동안 인큐베이션한 후 (선형 반응 동역학), 형광 (ex 360 nm, em 465 nm)을 마이크로타이터 플레이트 형광 판독기 (예를 들어 테칸 사파이어 II(Tecan Safire II))에서 측정한다. 백분율 프로테아제 활성에 대해 로그 시험 화합물 농도를 플롯팅함으로써 IC50 값을 결정하였다.
2. 생화학적 인간 MASP-1 및 MASP-2 검정
2.1 재조합 인간 MASP1 및 MASP2 활성 프로테아제의 재조합 발현 및 단백질 생산.
C-말단 His 태그 및 N-말단 Ig-카파 분비 신호를 갖는 아미노산 297-699에 상응하는 단편을 코딩하는 인간 MASP1의 말단절단된 cDNA 서열 (서열식별번호(SEQ ID No): 2)을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (인비트로젠(Invitrogen)) 내로 서브클로닝하였다.
C-말단 His 태그 및 N-말단 Ig-카파 분비 신호를 갖는 아미노산 297-686에 상응하는 단편을 코딩하는 인간 MASP1의 말단절단된 cDNA 서열 (서열식별번호: 3)을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (인비트로젠) 내로 서브클로닝하였다.
MASP1 또는 MASP2 발현 벡터를 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 리포펙타민 LTX® 시약 (써모-피셔)을 사용하여 HEK293 (ATCC 번호 CRL-1573) 세포주 내로 형질감염시켰다. 성숙 형태의 재조합 인간 MASP1 및 MASP2 프로테아제가 배양 배지 내로 분비되었다. MASP1 및 MASP2 단백질을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 Ni-NTA 슈퍼플로우 수지 (퀴아젠(Qiagen)) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 조건화 배지로부터 정제하였다.
2.2 생화학적 인간 MASP1 검정
HEK 293 세포에서 생산된 재조합 인간 MASP1 효소를 반응 완충제 (50 mM HEPES pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.01% CHAPS; 0.5 mM 글루타티온) 중에 20 nM의 농도로 희석하고, 25 μl를 384-웰 백색 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오 원 781075)의 각각의 단일 웰로 옮겼다. 억제제 화합물 용액 (상응하는 농도로 DMSO 중에 용해됨) 또는 대조군으로서의 순수한 DMSO 1 μl를 동일한 웰에 첨가하였다. 효소적 반응을 반응 완충제 중 FRET 기질 ABZ-MYGGARRL-Lys (Dnp)-NH2; (ABZ - 2-아미노벤조일; DNP - 2,4-디니트로페닐; 제리니 펩티드 테크놀로지스(Jerini Peptide Technologies) (베를린)에 의한 맞춤 합성)의 20 μM 용액 25 μl의 첨가에 의해 개시하였다. 마이크로타이터 플레이트를 32℃의 온도에서 60-120분 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도의 증가를 320 nm의 여기 파장 및 420 nm의 방출 파장을 사용하여 적절한 형광 플레이트 판독기 (예를 들어 테칸 울트라(TECAN Ultra))에서 측정하였다. 인간 MASP1 활성의 억제 백분율로부터 시험 화합물 농도의 함수로서 IC50 값을 계산하였다.
2.3 생화학적 인간 MASP2 검정
HEK 293 세포에서 생산된 재조합 인간 MASP2 효소를 반응 완충제 (50 mM HEPES pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.01% CHAPS; 0.5 mM 글루타티온) 중에 20 nM의 농도로 희석하고, 25 μl를 384-웰 백색 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오 원 781075)의 각각의 단일 웰로 옮겼다. 억제제 화합물 용액 (상응하는 농도로 DMSO 중에 용해됨) 또는 대조군으로서의 순수한 DMSO 1 μl를 동일한 웰에 첨가하였다. 효소적 반응을 반응 완충제 중 FRET 기질 답실-KISPQGYGRR-Glu(EDANS)-NH2; (답실 - 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산; 에단스 - 5-[(2-아미노에틸)아미노]나프탈렌-1-술포닐; 제리니 펩티드 테크놀로지스 (베를린)에 의한 맞춤 합성)의 60 μM 용액 25 μl의 첨가에 의해 개시하였다. 마이크로타이터 플레이트를 32℃의 온도에서 60-120분 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도의 증가를 340 nm의 여기 파장 및 490 nm의 방출 파장을 사용하여 적절한 형광 플레이트 판독기 (예를 들어 테칸 울트라)에서 측정하였다. 인간 MASP2 활성의 억제 백분율로부터 시험 화합물 농도의 함수로서 IC50 값을 계산하였다.
3. C3 침착 검정 (인간, 래트, 마우스, 개, 미니-돼지)
C3 침착 검정을 본질적으로 (참조)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 멀티웰 플레이트 (그라이너-눈크(Greiner-Nunc) 384 맥시 소르프(Maxi Sorp) #464718)를 4℃에서 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 만난(Mannan) (시그마 M7504, 0.05 M 카르보네이트-비카르보네이트 완충제, pH 9.6 중 10 μg/mL)으로 밤새 코팅하였다. 웰을 TBS로 3회 세척하고, 후속적으로 비-특이적 결합을 차단하기 위해 37℃에서 트리스-완충 염수 (TBS) 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA) 50 μL과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 단계 및 각각의 하기 인큐베이션 단계 후에, 웰을 C3 세척 완충제 (TBS; 0.05% 트윈 20; 5 mM CaCl2)로 3회 세척하였다. 이어서, 웰을 베로날 완충제 (론자 12624E) 중 희석된 혈청과 시험 화합물의 혼합물 50 μL와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혈청을, 예비-시험에서 코팅되지 않은 플레이트에 대해 검출가능한 C3 침착을 나타내지 않는 농도로 사용하였다. 적절한 희석은 각각 인간, 래트, 마우스 및 개 혈청에 대해 1:100 - 1:200 및 미니 돼지 혈청에 대해 1:20 - 1:100 범위인 것으로 밝혀졌다. 전형적인 실험에서, 화합물을 1x10-9 내지 5x10-5 mol/L의 농도 범위로 시험하였다. 세척 후에 C3 침착을 1시간 동안 폴리클로날 토끼 항-인간 C3 항체 (다코(Dako) (바이오졸(Biozol)) A0062)와 함께 인큐베이션한 다음, 세척하고, 37℃에서 30분 동안 퍼옥시다제 접합된 항 토끼 IgG (시그마 A1949)와 함께 인큐베이션하고, 후속적으로 세척하고, 암실에서 TMB 기질 용액과 함께 인큐베이션함으로써 검출하였다. 적절하게 발색되었을 때, 정지 용액 (시그마 S5814) 25 μL를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, 450 nm의 파장에서의 흡수를 측정함으로써 광도계 상에서 정량화하였다. 항체를 0.5% BSA가 보충된 C3 세척 완충제 중에 희석하였다.
4. 생화학적 래트 MASP-1 및 MASP-2 검정
4.1 재조합 인간 및 래트 MASP1 및 MASP2 활성 프로테아제의 재조합 발현 및 단백질 생산.
C-말단 His 태그 및 N-말단 Ig-카파 분비 신호를 갖는 아미노산 302-704에 상응하는 단편을 코딩하는 래트 MASP1의 말단절단된 cDNA 서열 (서열식별번호: 4)을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (인비트로젠) 내로 서브클로닝하였다.
C-말단 His 태그 및 N-말단 Ig-카파 분비 신호를 갖는 아미노산 296-685에 상응하는 단편을 코딩하는 래트 MASP2의 말단절단된 cDNA 서열 (서열식별번호: 5)을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (인비트로젠) 내로 서브클로닝하였다.
MASP1 또는 MASP2 발현 벡터를 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 리포펙타민 LTX® 시약 (써모-피셔)을 사용하여 HEK293 (ATCC 번호 CRL-1573) 세포주 내로 형질감염시켰다. 성숙 형태의 재조합 래트 MASP1 및 MASP2 프로테아제가 배양 배지 내로 분비되었다. MASP1 및 MASP2 단백질을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 Ni-NTA 슈퍼플로우 수지 (퀴아젠) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 조건화 배지로부터 정제하였다.
4.2 생화학적 래트 MASP1 검정.
HEK 293 세포에서 생성된 재조합 래트 MASP1 효소를 반응 완충제 (50 mM HEPES pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.01% CHAPS; 0.5 mM 글루타티온) 중에 4 nM의 농도로 희석하고, 25 μl를 384-웰 백색 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오 원 781075)의 각각의 단일 웰로 옮겼다. 억제제 화합물 용액 (상응하는 농도로 DMSO 중에 용해됨) 또는 대조군으로서의 순수한 DMSO 1 μl를 동일한 웰에 첨가하였다. 효소적 반응을 반응 완충제 중 FRET 기질 답실-MYGGARRL-Glu(에단스)-NH2; (답실 - 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산; 에단스 - 5-[(2-아미노에틸)아미노]나프탈렌-1-술포닐; 제리니 펩티드 테크놀로지스 (베를린)에 의한 맞춤 합성)의 40 μM 용액 25 μl의 첨가에 의해 개시하였다. 마이크로타이터 플레이트를 32℃의 온도에서 60-120분 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도의 증가를 340 nm의 여기 파장 및 490 nm의 방출 파장을 사용하여 적절한 형광 플레이트 판독기 (예를 들어 테칸 울트라)에서 측정하였다. 래트 MASP2 활성의 억제 백분율로부터 시험 화합물 농도의 함수로서 IC50 값을 계산하였다.
4.3 생화학적 래트 MASP2 검정.
HEK 293 세포에서 생성된 재조합 래트 MASP2 효소를 반응 완충제 (50 mM HEPES pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.01% CHAPS; 0.5 mM 글루타티온) 중에 20 nM의 농도로 희석하고, 25 μl를 384-웰 백색 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오 원 781075)의 각각의 단일 웰로 옮겼다. 억제제 화합물 용액 (상응하는 농도로 DMSO 중에 용해됨) 또는 대조군으로서의 순수한 DMSO 1 μl를 동일한 웰에 첨가하였다. 효소적 반응을 반응 완충제 중 FRET 기질 Abz-IEGRTSED-(Lys)Dnp-NH2; (ABZ - 2-아미노벤조일; DNP - 2,4-디니트로페닐; 제리니 펩티드 테크놀로지스 (베를린)에 의한 맞춤 합성)의 30 μM 용액 25 μl의 첨가에 의해 개시하였다. 마이크로타이터 플레이트를 32℃의 온도에서 60-120분 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도의 증가를 320 nm의 여기 파장 및 420 nm의 방출 파장을 사용하여 적절한 형광 플레이트 판독기 (예를 들어 테칸 울트라(TECAN Ultra))에서 측정하였다. 래트 MASP2 활성의 억제 백분율로부터 시험 화합물 농도의 함수로서 IC50 값을 계산하였다.
표 18: 참조 펩티드의 평균 IC50
표 19: 본 발명의 펩티드의 평균 IC50
표 20: 참조 펩티드의 평균 IC50
표 21: 본 발명의 펩티드의 평균 IC50
4. 일측성 신절제술 후 래트에서의 신장 허혈 재관류 손상 (IRI)
모든 절차는 과학 목적의 동물 사용에 대한 국가 법령 (dt. Tierschutzgesetz) 및 EU 지침에 따르며, 바이엘 아게(Bayer AG)의 동물 실험 윤리 위원회 및 관할 지역 관리소 (라누프 레클링하우젠(LANUV Recklinghausen))에 의해 승인받았다. 표준 실험실 사료 및 수돗물은 자유롭게 이용가능하였다. 전형적인 실험에서, 사용된 동물의 수는 n = 6 내지 12였다. 동물을 실험군에 무작위로 배정하였다. 신장 허혈 재관류 손상 (IRI)을 250 내지 350 g 범위의 바람직한 체중의 수컷 일측 신절제된 위스타(Wistar) 래트에서 수행하였다. 일측성 신절제술을 위해, 래트에게 공기 중 2% 이소플루란의 흡입 하에 마취 상태를 유지시켰다. 0.9 NaCl 중 25% 케타벳(Ketavet) 및 8% 롬푼(Rompun)의 혼합물 400 μl/kg의 피하 주사로서 무통각을 제공하였다. 일측성 신절제술은 배측부 복벽의 작은 절개를 통해 우측 신장을 돌출시키고 그의 경부를 결찰시킨 후에 수행하였다. 일측성 신절제술 후, 외과용 봉합사로 복부 절개를 겹쳐서 봉합하고, 동물을 IRI 전 7 내지 8일 동안 회복시켰다. IRI를 상기 기재된 바와 같이 마취 및 무통각 하에 수행하였다. 잔존 좌측 신장을 복벽의 작은 절개를 통해 돌출시키고, 신장 경부의 혈관을 무외상 미세혈관 클램프로 45분 동안 전형적인 설정에서 클램핑하였다. 이 시간 동안, 계내 클램프를 장착한 신장을 복강 내로 재위치시켜 온허혈을 보장하였다. 45분 후, 클램프를 개방하고, 제거하고, 절개를 상기 기재된 바와 같이 봉합사에 의해 봉합했다. 시험 화합물 또는 비히클을 수술 전에 배치된 폴리에틸렌 카테터를 통해 경정맥 내로 정맥내 투여하였다.
화합물을 적절한 비히클 중에 용해시키고, IRI 전에 예방적으로 또는 IRI의 완료 후에 치료적으로 투여하였다. 적용된 전형적인 용량 범위는 0.1 - 30 mg/kg i.v.였다. 화합물이 없는 비히클을 대조군으로서의 역할을 하는 동물에게 투여하였다. 모의 대조군 동물에게 허혈의 유도를 위한 클램프의 폐쇄 없이 상기 기재된 전체 절차를 적용하였다.
IRI 후 제1일 및 제8일에 마취 하에 혈액 샘플을 채취하였다. 전형적인 설정에서, 동물을 IRI 8일 후에 희생시키고, 신장을 샘플링하고, 액체 질소에서 동결시켰다. 또 다른 전형적인 설정에서 동물을 IRI 1일 후에 희생시켰다.
신장 기능을 평가하기 위해 혈장 샘플에서 측정된 전형적인 실험실 파라미터는 크레아티닌 및 우레아였다. 크레아티닌 클리어런스를 결정하기 위해, 동물을 대사 케이지에서 유지하고, 소변을 적어도 16시간 동안 수집하였다. 소변 부피 유량 (VU)의 결정 및 소변 및 혈장 크레아티닌 농도 (각각 [Crea]U 및 [Crea]Pl)의 결정 후, 크레아티닌 클리어런스 (ClCrea)를 표준 식: ClCrea = VU * [Crea]U / [Crea]Pl에 따라 계산하였다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응: 총 RNA를 트리졸 방법에 의해 조직 샘플로부터 추출하였다. 수득된 RNA의 무결성을 바이오애널라이저(Bioanalyzer) (애질런트) 상에서 체크하였다. 역전사를 위해, 1 μg의 총 RNA를 먼저 RNase-무함유 DNase I (깁코(Gibco))을 사용하여 실온에서 15분 동안 소화시킨 다음, 키트 공급업체의 표준 프로토콜에 따라 40 μl의 총 반응 부피로 프로미스크립트(Promiscript) (프로메가(Promega))를 사용하여 역전사시켰다. 65℃로 15분 동안 가열함으로써 효소를 불활성화시킨 후, 수득된 cDNA를 2차 증류수로 150 μl의 최종 부피로 희석하고, PCR 반응당 4 μl를 선택하였다. 하우스키핑 유전자로서의 시토졸 베타-액틴에 대한 미가공 데이터의 정규화를 포함하는 실시간 PCR을 기재된 바와 같이 수행하였다 (Ellinghaus et al., 2005). 생성된 발현은 임의의 단위로 주어진다. 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 서열이 표 1에서 제공된다.
5. 대동맥 풍선 폐쇄 후 돼지에서의 신장 허혈 재관류 손상 (IRI)
모든 절차는 과학 목적의 동물 사용에 대한 국가 법령 (dt. Tierschutzgesetz) 및 EU 지침에 따르며, 바이엘 아게의 동물 실험 윤리 위원회 및 관할 지역 관리소 (라누프 레클링하우젠)에 의해 승인받았다. 바람직하게는 12 내지 16kg 범위의 체중의 암컷 괴팅겐(Goettingen) 미니 돼지 (덴마크 엘레가르트)를 실험에 사용하였다. 동물을 무작위로 실험군에 배정하였다.
하기 기재된 바와 같이 변형된 최소 침습법을 적용하였다 (Simon et al., Effects of intravenous sulfide during porcine aortic occlusion-induced kidney ischemia/reperfusion injury. Shock. 2011;35:156-163; Matejkova et al., Carbamylated erythropoietin-FC fusion protein and recombinant human erythropoietin during porcine kidney ischemia/reperfusion injury. Intensive Care Med. 2011;39:497-510). 간략하게: 돼지에게 케타베트® / 스트레스닐(Stresnil)®의 근육내 주사에 의한 예비투약 후에 케타베트®, 도르미쿰(Dormicum)® 및 판쿠로늄(Pancuronium)®의 연속 i.v.-주입에 의해 마취상태를 유지시켰다. 기관내 삽관 후, 소아 호흡기 (아반스(Avance) CS2, 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 산소 공기 혼합물로, 6 내지 8 mL/kg의 1회 호흡량으로 3-4 cm H2O의 일정한 호기말 양압 (PEEP) 및 13 내지 20분-1의 빈도로 동물을 인공적으로 환기시켰다. 환기를 조정하여 동맥 PaCO2를 기준선에서 약 40 mmHg로 유지하였다. 카테터를 약물 및 유체 투여를 위해 우측 경정맥에 배치하였다. 링거-락테이트 용액을 10 mL/kg/h의 일정한 속도로 정맥내로 주입하였다. 동물에게 50 i.E./kg 헤파린을 i.v. 제공하였다. 상용적으로 하기 심혈관 및 호흡 파라미터를 적절한 압력 변환기 및 기록 장비에 핏팅된 필수 프로브 및 카테터의 배치 후에 측정하였다: 중심 정맥압 (좌측 경정맥을 통함), 동맥 혈압 및 심박수 (BP 및 HR; 좌측 경동맥을 통함) 및 우측 경동맥에 배치된 펄션(Pulsion) 4F 열희석-카테터 (PV2014L08 N)에 연결된 피코(PiCCO)® 시스템 (펄션, 독일)의 사용에 의한 심장 박출량 (CO) 및 전신 혈관 저항 (SVR). CVP, BP 및 HR의 측정을 위한 카테터를 콤비트란스(Combitrans) 트랜스듀서 (브라운(Braun), REF 5203660)를 통해 포네마(Ponemah) 기록 시스템에 피팅하였다. 포가티(Fogarty) 폐쇄 카테터 (8F/14F, 에드워즈 라이프사이언시스(Edwards Lifesiences), REF 6208014F)를 좌측 대퇴 동맥을 통해 복부 대동맥 내로 삽입하여, 팽창가능한 풍선이 장착된 팁을 신장 동맥의 상류에 위치시켰다. 카테터를 작은 복부 절개를 통해 방광 내로 도입시키고, 소변을 연속적으로 수집하였다. 동맥 혈액 샘플을 규칙적 간격으로 수집하고, 샘플 중 크레아티닌, 우레아, 간 효소, 혈액 세포 및 화합물 농도를 결정하였다. 동맥 pO2, pCO2 및 pH를 동맥 혈액 샘플에서 규칙적 간격으로 스타트 프로파일(Stat Profile)® 프라임(PRIME)® (노바 바이오메디칼(Nova Biomedical)) 혈액 기체 분석기 상에서 결정하였다. 2.0 내지 5.0 MHz 광범위-스펙트럼 콘벡스 트랜스듀서 (C1-5-RS, REF 5384874)가 장착된 LOGIQ e 수의학적 초음파 장치 (제너럴 일렉트릭스(General Electrics))를 사용하여 도플러 초음파 저항 지수 결정에 의해 규칙적 간격으로 신장 관류를 평가하였다. 신장 저항 지수 (RRI)는 환자에서 급성 신장 손상의 중증도를 평가하는데 적합한 파라미터이다 (Darmon et al., Diagnostic accuracy of Doppler renal resistive index for reversibility of acute kidney injury in critically ill patients. Intensive Care Med. 2011;37(1):68-76)
심혈관 파라미터가 안정한 기준선을 나타냈을 때 (대개의 경우 수술 60분 후임), 기록을 시작하고, 기준선 파라미터에 대한 샘플을 수집하였다. HR 및 MABP를 연속적으로 측정하고, 기록을 위해 2분 간격에 걸쳐 평균내었다. 실험 종료시, 돼지를 방혈에 의해 희생시켰다.
포가티 풍선 카테터의 풍선을 염수로 팽창시켜, 신장 및 복부 기관으로의 혈류를 즉시 방해하고 풍선 상류의 대동맥 혈압의 급격한 증가를 유발함으로써 신장 손상을 유발하였다. 혈류의 정지는 신장 혈관의 도플러 초음파 검사에 의해 추가로 확인하였다. 전형적인 실험에서, 대동맥은 풍선을 수축시킴으로써 재관류될 때까지 90 내지 120분 동안 폐쇄된 채 유지된다. 재관류 후, 링거-락테이트(Ringer-lactate) 주입 속도를 20 mL/kg/h로 배가하여 혈압을 안정화시키고 이뇨를 가능하게 하였다. 모든 파라미터를 재관류 후 최대 6시간 동안 모니터링하였다.
화합물을 적절한 비히클 중에 용해시키고, IRI 전에 예방적으로 또는 IRI의 완료 후에 치료적으로 투여하였다. 적용된 전형적인 용량 범위는 0.1 - 10 mg/kg i.v.였다. 전형적인 실험에서, 용량 군당 최대 6마리의 동물에서 최대 3회 용량을 시험하였다. 화합물이 없는 비히클을 대조군으로서의 역할을 하는 동물에게 투여하였다. 모의 대조군 동물은 허혈의 유도 없이 상기 기재된 전체 절차를 적용하였다.
재관류 후의 신장 기능에 대한 척도로서, 바람직하게는 이뇨, 혈청 크레아티닌, 혈청 칼륨, 혈청 비카르보네이트 및 도플러 초음파 검사에 의해 결정된 저항 지수의 변화가 사용되었으나 이에 제한되지는 않는다.
표 22: 서열 목록
참고문헌
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SEQUENCE LISTING
<110> Bayer AG
Bayer Pharma AG
<120> MASP inhibitory compounds and uses thereof
<130> BHC171044WO
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SFMI-1
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(11)
<223> disulfide bond;
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(11)
<223> disulfide bond
<400> 1
Gly Ile Cys Ser Arg Ser Leu Pro Pro Ile Cys Ile Pro Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 430
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASP-1_Human_Sequence fragment_C-terminal His Tag and N-terminal
Ig-kappa secretion signal
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Gly Asn Glu Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro
20 25 30
Val His Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Lys Tyr Phe Phe Lys Asp
35 40 45
Gln Val Leu Val Ser Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Val Leu Lys Asp Asn
50 55 60
Val Glu Met Asp Thr Phe Gln Ile Glu Cys Leu Lys Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys Lys Ile Val Asp Cys Arg Ala Pro Gly
85 90 95
Glu Leu Glu His Gly Leu Ile Thr Phe Ser Thr Arg Asn Asn Leu Thr
100 105 110
Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Lys Tyr Ser Cys Gln Glu Pro Tyr Tyr Lys
115 120 125
Met Leu Asn Asn Asn Thr Gly Ile Tyr Thr Cys Ser Ala Gln Gly Val
130 135 140
Trp Met Asn Lys Val Leu Gly Arg Ser Leu Pro Thr Cys Leu Pro Val
145 150 155 160
Cys Gly Leu Pro Lys Phe Ser Arg Lys Leu Met Ala Arg Ile Phe Asn
165 170 175
Gly Arg Pro Ala Gln Lys Gly Thr Thr Pro Trp Ile Ala Met Leu Ser
180 185 190
His Leu Asn Gly Gln Pro Phe Cys Gly Gly Ser Leu Leu Gly Ser Ser
195 200 205
Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Leu His Gln Ser Leu Asp Pro Glu
210 215 220
Asp Pro Thr Leu Arg Asp Ser Asp Leu Leu Ser Pro Ser Asp Phe Lys
225 230 235 240
Ile Ile Leu Gly Lys His Trp Arg Leu Arg Ser Asp Glu Asn Glu Gln
245 250 255
His Leu Gly Val Lys His Thr Thr Leu His Pro Gln Tyr Asp Pro Asn
260 265 270
Thr Phe Glu Asn Asp Val Ala Leu Val Glu Leu Leu Glu Ser Pro Val
275 280 285
Leu Asn Ala Phe Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Glu Gly Pro Gln Gln
290 295 300
Glu Gly Ala Met Val Ile Val Ser Gly Trp Gly Lys Gln Phe Leu Gln
305 310 315 320
Arg Phe Pro Glu Thr Leu Met Glu Ile Glu Ile Pro Ile Val Asp His
325 330 335
Ser Thr Cys Gln Lys Ala Tyr Ala Pro Leu Lys Lys Lys Val Thr Arg
340 345 350
Asp Met Ile Cys Ala Gly Glu Lys Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Ala
355 360 365
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Thr Leu Asn Arg Glu Arg Gly Gln
370 375 380
Trp Tyr Leu Val Gly Thr Val Ser Trp Gly Asp Asp Cys Gly Lys Lys
385 390 395 400
Asp Arg Tyr Gly Val Tyr Ser Tyr Ile His His Asn Lys Asp Trp Ile
405 410 415
Gln Arg Val Thr Gly Val Arg Asn His His His His His His
420 425 430
<210> 3
<211> 417
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASP-2_Human_Sequence fragment_C-terminal His Tag and N-terminal
Ig-kappa secretion signal
<400> 3
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro
20 25 30
Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser
35 40 45
Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu
50 55 60
Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp
65 70 75 80
Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp
85 90 95
Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr
100 105 110
Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met
115 120 125
Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr
130 135 140
Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly
145 150 155 160
Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala
165 170 175
Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr
180 185 190
Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His
195 200 205
Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met
210 215 220
Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu
225 230 235 240
Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn
245 250 255
Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn
260 265 270
Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly
290 295 300
Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His
305 310 315 320
Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser
325 330 335
Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp
340 345 350
Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu
355 360 365
Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn
370 375 380
Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr
385 390 395 400
Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe His His His His His
405 410 415
His
<210> 4
<211> 430
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASP-1_Rat_Sequence fragment_C-terminal His Tag and N-terminal
Ig-kappa secretion signal
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Gly Asn Glu Cys Pro Lys Leu Gln Pro Pro
20 25 30
Val Tyr Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Val Tyr Ser Phe Lys Asp
35 40 45
Gln Val Leu Ile Ser Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Val Leu Lys Asp Asn
50 55 60
Glu Val Met Asp Thr Phe Gln Ile Glu Cys Leu Lys Asp Gly Ala Trp
65 70 75 80
Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys Lys Ile Val Asp Cys Gly Val Pro Ala
85 90 95
Val Leu Lys His Gly Leu Val Thr Phe Ser Thr Arg Asn Asn Leu Thr
100 105 110
Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Arg Tyr Ser Cys Gln Gln Pro Tyr Tyr Lys
115 120 125
Met Leu His Asn Thr Thr Gly Val Tyr Thr Cys Ser Ala His Gly Thr
130 135 140
Trp Thr Asn Glu Val Leu Lys Arg Ser Leu Pro Thr Cys Leu Pro Val
145 150 155 160
Cys Gly Leu Pro Lys Phe Ser Arg Lys His Ile Ser Arg Ile Phe Asn
165 170 175
Gly Arg Pro Ala Gln Lys Gly Thr Thr Pro Trp Ile Ala Met Leu Ser
180 185 190
Gln Leu Asn Gly Gln Pro Phe Cys Gly Gly Ser Leu Leu Gly Ser Asn
195 200 205
Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu His His Pro Leu Asp Pro Glu
210 215 220
Glu Pro Ile Leu His Asn Ser His Leu Leu Ser Pro Ser Asp Phe Lys
225 230 235 240
Ile Ile Met Gly Lys His Trp Arg Arg Arg Ser Asp Glu Asp Glu Gln
245 250 255
His Leu His Val Lys His Ile Met Leu His Pro Leu Tyr Asn Pro Ser
260 265 270
Thr Phe Glu Asn Asp Leu Gly Leu Val Glu Leu Ser Glu Ser Pro Arg
275 280 285
Leu Asn Asp Phe Val Met Pro Val Cys Leu Pro Glu His Pro Ser Thr
290 295 300
Glu Gly Thr Met Val Ile Val Ser Gly Trp Gly Lys Gln Phe Leu Gln
305 310 315 320
Arg Leu Pro Glu Asn Leu Met Glu Ile Glu Ile Pro Ile Val Asn Tyr
325 330 335
His Thr Cys Gln Glu Ala Tyr Thr Pro Leu Gly Lys Lys Val Thr Gln
340 345 350
Asp Met Ile Cys Ala Gly Glu Lys Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Ala
355 360 365
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Thr Lys Asp Ala Glu Arg Asp Gln
370 375 380
Trp Tyr Leu Val Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Asp Cys Gly Lys Lys
385 390 395 400
Asp Arg Tyr Gly Val Tyr Ser Tyr Ile Tyr Pro Asn Lys Asp Trp Ile
405 410 415
Gln Arg Val Thr Gly Val Arg Asn His His His His His His
420 425 430
<210> 5
<211> 417
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASP-2_Rat_Sequence fragment_C-terminal His Tag and N-terminal
Ig-kappa secretion signal
<400> 5
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro
20 25 30
Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp
35 40 45
Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser
50 55 60
Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp
65 70 75 80
Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp
85 90 95
Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu Val Thr
100 105 110
Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr
115 120 125
Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr
130 135 140
Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro Val Cys Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln Pro Ala
165 170 175
Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Glu Thr Thr
180 185 190
Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr Ala Ala His
195 200 205
Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp Ile Arg Met
210 215 220
Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp Pro Glu
225 230 235 240
Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe Asp Asn
245 250 255
Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn Arg Asn
260 265 270
Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu Met Lys
275 280 285
Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln Lys Gly
290 295 300
Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His
305 310 315 320
Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly Ala Lys
325 330 335
Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly Lys Asp
340 345 350
Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Asn Glu
355 360 365
Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ile Asn
370 375 380
Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
385 390 395 400
Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe His His His His His
405 410 415
His
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fluorescence Resonance Energy Transfer substrate
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is 2-aminobenzoyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> AMIDATION
<220>
<221> Xaa
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is a non peptidic capping group (2,4-dinitrophenyl; bound to
lysine amino group on position 6)
<400> 6
Xaa Met Tyr Gly Gly Ala Arg Arg Leu Lys Xaa
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fluorescence resonance energy transfer substrate
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is 4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> AMIDATION
<220>
<221> Xaa
<222> (13)..(13)
<223> Xaa is 5-[(2-Aminoethyl) amino]naphthalene-1-sulfonyl (bound to
Glutamic acid caboxylic acid group on position 5)
<400> 7
Xaa Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Xaa
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fluorescence resonance energy transfer substrate
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is 4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> AMIDATION
<220>
<221> Xaa
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is 5-[(2-Aminoethyl) amino]naphthalene-1-sulfonyl (bound to
Glutamic acid caboxylic acid group on position 5)
<400> 8
Xaa Met Tyr Gly Gly Ala Arg Arg Leu Glu Xaa
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fluorescence resonance energy transfer substrate
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is 2-aminobenzoyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> AMIDATION
<220>
<221> Xaa
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is a non peptidic capping group (2,4-dinitrophenyl; bound to
lysine amino group on position 6)
<400> 9
Xaa Ile Glu Gly Arg Thr Ser Glu Asp Lys Xaa
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala-1 SFMI-1
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(11)
<223> disulfide bond
<400> 10
Ala Ile Cys Ser Arg Ser Leu Pro Pro Ile Cys Ile Pro Asp
1 5 10
Claims (15)
- 하기 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물:
(X1)q(X2)rX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(X13)s(X14)t (II)
여기서
X1은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다. - 하기 화학식 (II)의 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물:
(X1)q(X2)rX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(X13)s(X14)t (II)
여기서
X1은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 나타내고,
q는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X2는 천연 아미노산 I를 나타내고,
r은 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X3은 천연 아미노산 C 또는 비천연 아미노산 L-페니실라민 (Pen)을 나타내고,
X4는 천연 아미노산 S를 나타내고,
X5는 천연 아미노산 R 또는 비천연 아미노산 N(5)-메틸-L-아르기닌 ((Me)R)을 나타내고,
X6은 천연 아미노산 S를 나타내고,
X7은 천연 아미노산 L 또는 비천연 아미노산 L-tert-부틸알라닌 ((tBu)A)을 나타내고,
X8은 천연 아미노산 P 또는 비천연 아미노산 L-프롤린 (3,4-2H)을 나타내고,
X9는 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내고,
X10은 천연 아미노산 I를 나타내고,
X11은 천연 아미노산 C 또는 L-N-메틸시스테인 ((N-Me)C) 및 L-페니실라민 (Pen)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내고,
X12는 천연 아미노산 I를 나타내고,
X13은 천연 아미노산 P를 나타내고,
s는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
X14는 D, Q 및 E로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산을 나타내고,
t는 0 또는 1의 정수를 나타내고,
여기서 펩티드의 N-말단은 비치환되거나, 아세틸화되거나 또는 C1-C20-알킬로 일치환 또는 이치환되고,
여기서 펩티드의 C-말단은 비치환되거나 또는 아미드화되고,
여기서 펩티드는 X3과 X11을 연결하는 연결을 통해 고리화된다. - 제1항에 있어서,
X9가 비천연 아미노산 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로인돌-2-카르복실산 (Oic)을 나타내는 것인
펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
X1이 A 및 G로 이루어진 목록으로부터 선택된 천연 아미노산 또는 N-메틸-L-알라닌 ((N-Me)A), N-메틸-글리신 ((N-Me)G), L-노르류신 (Nle), L-노르발린 (Nva) 및 L-오르니틴 (Orn)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 비천연 아미노산을 나타내는 것인
펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드의 N-말단 및 C-말단이 비치환된 것인, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 X3과 X11을 연결하는 디술피드 결합을 통해 고리화된 것인, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 적어도 1개의 PEG 기로 치환된 것인, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, MASP-1 및/또는 MASP-2 억제제로서 작용하고/거나 C3 침착을 억제하는, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 고체 상 펩티드 합성을 사용하여 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병의 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 펩티드를 함유하는 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을, 1종 이상의 불활성 비독성 제약상 적합한 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 함유하는 적어도 1종의 화합물 또는 유도체, 전구약물, 유사체, 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 상기 염의 용매화물을, 포스포디에스테라제의 억제제, 구아닐레이트 시클라제의 자극제 또는 활성화제, IP 수용체 효능제, 미네랄로코르티코이드-수용체 길항제, 이뇨제, PPAR-감마 효능제, PPAR-델타 효능제, 코르티코스테로이드, 산화성 스트레스 하의 기관에 대한 손상을 감소시키는 활성 성분, 세포 사멸의 유도 및 아폽토시스 경로를 억제하는 화합물, 염증 반응 및 T 세포 증식을 억제하는 화합물, 항혈전제, 혈소판 응집 억제제, 트롬빈 억제제, GPIIb/IIIa 길항제, 인자 Xa 억제제, 헤파린 또는 저분자량 (LMW) 헤파린 유도체 및 응고 인자 XI의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 활성 성분과 조합하여 포함하는 제약 조성물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병의 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물.
- 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 따른 제약 조성물의 투여에 의해, 인간 및 동물에서 심혈관 및 심폐 장애, 쇼크, 염증성 장애, 심혈관, 폐, 뇌 및 신장의 패혈증 후유증, 허혈 및/또는 재관류-관련 손상, 급성 신장 손상, 이식편 방어 및 이식편 기능 지연, 혈액 및 혈액-형성 기관 및 면역계의 질환, 당뇨병의 후유증, 신경계의 염증성 질환, 눈의 질환, 피부의 질환, 호흡기계, 소화기계 또는 비뇨생식기계의 질환, 및 화상 및 손상의 후유증을 치료 및/또는 예방하는 방법.
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