KR20120083218A - 신규한 펩티드, 신규한 펩티드의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
신규한 펩티드, 신규한 펩티드의 준비 방법 및 용도
본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 펩티드, 이들의 염, 에스테르(ester) 또는 약학적으로 수용 가능한 프로드럭(prodrug)에 관한 것이다:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y,M,W,I,V,A이고,
X2은 R,K이고,
X3은 Y,F,I,M,L,E,D,H이고,
X4은 V,I,H이고,
X5은 I,V,Y,F,W임.
게다가 본 발명은 조제약 및 이들을 포함하는 키트, 및 이들을 사용하면서 분류 및 분리하는 방법, 및 조제약의 생산에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 펩티드, 이들의 염, 에스테르(ester) 또는 약학적으로 수용 가능한 프로드럭(prodrug)에 관한 것이다:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y,M,W,I,V,A이고,
X2은 R,K이고,
X3은 Y,F,I,M,L,E,D,H이고,
X4은 V,I,H이고,
X5은 I,V,Y,F,W임.
게다가 본 발명은 조제약 및 이들을 포함하는 키트, 및 이들을 사용하면서 분류 및 분리하는 방법, 및 조제약의 생산에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 펩티드, 특별히 올리고펩티드(oligopeptides)에 관한 것이며, 또한 이러한 펩티드를 생산하는 방법 및 약제를 생산하는데 있어서 이러한 펩티드의 용도에 관한 것이다.
보체계는 인간 및 동물의 선천적인 면역체계 중에서 가장 중요한 구성요소 중 하나이다. 일반적인 면역체계인 상기 보체계는 침입하는 병원균 및 변경된 숙주 구조물들(예, 노화된 세포)을 인식, 표지 및 제거할 수 있다. 선천적인 면역체계의 한 부분으로서 상기 보체계는 병원성 미생물에 대한 개체의 첫 방어선 중 하나를 형성하지만, 선천성 및 후천성 면역체계 사이에 소위 말하는 브리지(bridge)를 형성하면서, 여러 지점에서 적응(후천성의) 면역 체계로 연결된다(Walport 2001a; Walport 2001b; 및 Morgan 2005). 상기 보체계는 약 30개의 단백질 구성요소로 이루어진 네트워크로, 상기 구성요소는 수용성 형태, 및 세포의 표면에 부착된 수용체 및 조절자(즉, 억제자)의 형태로 혈장 내에서 발견될 수 있다. 상기 보체계의 중요한 구성요소는 엄격하게 결정된 순서로 케스케이드(cascade)같은 방식으로 서로를 활성할 수 있는 세린(serine) 단백질 분해 효소 지모겐(zymogen)이다. 상기 활성화된 단백질 분해효소의 특정 기질은 티오에스테르(thioester) 결합(보체계내의 구성요소 C4 및 C3). 이러한 기질이 상기 활성된 단백질 분해효소에 의해 잘리게 되면, 상기 반응성의 티오에스테르기는 분자 표면에 노출되며, 이러한 방식으로, 공격당한 세포의 표면에 상기 잘린 분자를 부착할 수 있다. 이 결과, 이러한 세포는 상기 면역체계에 의해 인식될 수 있도록 표지된다.
상기 보체계의 생물학적 기능은 매우 다양하며 복잡하고, 현재까지 이들의 모든 세부사항이 밝혀지진 않았다. 가장 중요한 기능 중에 하나는 상기 보체계의 말단 구성요소에서 형성된 세포막 공격 복합체(MAC)에 의해 유발된 직접적인 세포독성 활성이다. 상기 MAP는 외래의 것으로 인식된 세포의 막을 천공하고, 이 결과 세포는 용해되어 파괴된다.
상기 보체계의 또 다른 중요한 기능은 세포의 표면상에 정착하고 있는 활성된 보체 구성요소(즉, C1q, MBL, C4b, C3b)가 백혈구(즉, 대식세포)에 의한 식세포작용를 촉진하는 식작용이다. 이러한 백혈구는 세포를 파괴하기 위하여 세포를 삼킨다.
게다가, 상기 보체계의 염증 시작 역할 또한 매우 중요하다. 보체 활성 동안에 방출되는 상기 잘려진 산물은 백혈구 상에서 이들의 화학주성(化學走性)의 자극 효과에 의하여 염증 과정을 시작한다(Mollnes 2002).
상기 보체계의 보체는 상기 보체 케스케이드가 적절한 신호(즉, 외래 세포, 병원균의 침입)에 의해 유발될 때까지 비활성의(효소원의) 형태로 혈장 내에 존재한다. 상기 보체계의 정상적인 활동은 면역 항상성 유지 측면에서 중요하다. 이것의 비정상적인 저 활동 및 이것의 통제되지 않은 고 활동은 심각한 질병의 발생 또는 기존의 질병의 악화로 이어질 수 있다(Szebeni 2004).
상기 보체계는 3개의 다른 경로로 활성될 수 있다: 전형적인 경로, 렉틴(lectin) 경로 및 대체 경로. 전형적인 경로의 첫 단계로, 상기 C1 복합체는 외래의 것으로 인식되는 생물학적 구조물인 활성제의 표면에 결합한다. 상기 C1 복합체는 인식 단백질 분자(C1q) 및 이것에 결합하는 세린 단백질 분해 효소(C1r, C1s)로 이루어진 초분자의 복합체이다(Arlaud 2002). 첫 번째로, 모든 C1q분자는 면역 복합체, 노화된 세포, C-반응 단백질 및 다른 활성제 구조물에 결합한다. 상기 C1q분자가 상기 활성제에 결합한 후 그 결과, 상기 C1복합체 내에 존재하는 세린 단백질 분해 효소 지모겐은 점차적으로 활성된다. 4분자체 C1s-C1r-C1r-C1내에서, 첫 번째로 C1r 지모겐은 자동 활성하고, 그런 후 상기 활성된 C1r분자는 잘려지고 C1s분자를 활성한다. 상기 활성된 C1s는 상기 보체계의 C4 및 C2 구성요소를 자르고, 이 잘린 산물은 C3-전환효소 복합체(C4bC2a)의 전구체이다. 상기 C3-전환효소는 C3 구성요소를 자르고 C5-전환효소(C4bC2aC3b)로 전환된다. 상기 C5-전환효소가 C5를 자른 후에, 상기 보체계의 활성은 세 개의 경로(MAC 형성) 모두에서 특징인 말단 단계에서의 절정에 이른다.
상기 보체계, 렉틴 경로의 다른 경로의 활성은 전형적인 경로의 활성과 매우 유사하다(Fujita 2004). 그러나, 이 경우에, 몇몇 다른 형태의 인식 분자가 관여한다: MBL("마노스(manose)-결합 렉틴" 및 피코린(ficolin, H, L 및 M 형태). 이러한 분자는 미생물 표면상의 탄수화물 구조물에 결합한다. 상기 인식 분자의 결합은 MASP-2("MBL-관련된 세린 단백질 분해 효소"-2) 지모겐의 자동 활성으로 이어진다. 상기 활성된 MASP-2는 C4 및 C2 구성효소를 자르고, 상기 전형적인 경로에서 이미 설명된 것처럼, C3-전환효소 복합체의 형성으로 귀결되고, 이러한 관점에서, 상기에 기재된 것처럼 상기 과정이 진행된다.
상기 대체 경로는 C3 구성요소 및 외래의 것으로 인식된 생물학적 구조물에 부착하고 있는 상기 구성요소를 자르는 것으로 시작한다(Harboe 2008). 잘리는 동안 형성된 C3b 구성요소는 미생물의 세포막에 결합한 후, 동시에 잘려짐으로써 활성된 형태로 혈액내에 존재하는 펙터(factor) D에 의해 활성되는 펙터 B(C3bB)라 명명되는 세린 단백질 분해 효소의 효소원의 형태로 결합한다. 이러한 방식으로 형성된 상기 C3bBb 복합체는 대체 경로의 C3-전환효소로, C3b 분자와 더 완벽하게 완성된 후에, C5 전환효소로 전환한다. 또한 상기 대체 경로는 상기 C3 구성요소(C3w)의 느린 가수분해에 의해 독립적, 자발적으로 유발되지만, 상기 전형적인 또는 렉틴 경로가 C3 절단 시점에 도달하면, 상기 대체 경로의 효과는 상당히 증폭된다.
상기 경로 중에서, 최근에 발견되었으며 특성이 잘 밝혀지지 않았으나 본 발명의 측면에서는 가장 중요한 렉틴 경로의 세부사항을 자세하게 기재한다. 단백질 분해 효소 및 비-촉매 단백질의 여러 가지 종류는 여러 가지 다른 형태로 존재하는 인식 분자에 결합한다(다른 정도의 중합의 MBL 및 피콜린). 심지어 MASP-2는 자체적으로 보체 케그케이드를 시작할 수 있으나(Ambrus 2003; Gal 2005), 이 후자의 효소는 MASP-1보다 더 적은 양(0.5/ml)으로 존재한다. 좀 더 많은 양(7/ml)으로 존재하는 상기 MASP-1 단백질 분해의 생리학적인 기능은 현재까지 완전히 밝혀지지 않았다.
MASP-1은 자체적으로 보체 케스케이드를 시작할 수 없지만(이것은 단지 C2를 자를 수 있고, C4는 자르지 못한다.), MASP-1의 활성은 여러 시점에서 MASP-2의 활성을 보충할 수 있으므로, 활성된 MASP-1은 상기 렉틴 경로의 영향을 증폭하고 완성하기 위해 필요할 수 있다. 여러 징후는 MASP-1가 핼액 내의 두 주요한 단백질 가수 분해 케스케이드 체계-보체계 및 혈액 응고 체계-사이에 교상 결합을 형성하는, 어느 정도까지는 트롬빈(thrombine)과 유사한 단백질 분해 효소인 것을 나타낸다(Hajela 2002; Krarup 2008).
두 개의 단백질 MASP-1 및 MASP-2 의 유전자는 얼터너티드 스프라이싱(alternative splicing)의 산물이다. MAp19(sMAP) 단백질은 MASP-2(CUB1-EGF)의 처음 두 도메인(Domain)을 포함하고 있는 MASP-2 유전자에서 생산된다. MASP-3 mRNA는 상기 MASP-1 유전자에서 전사된다. MASP-3의 첫 5개의 도메인은 MASP-1의 도메인과 동일하지만, 이들의 세린 단백질 분해 효소 도메인은 상이하다. MASP-3은 합성 기질 상에 낮은 단백질 가수 분해 활성을 가지며, 이것의 자연계 기질은 알려지지 않았다. 다른 초기의 단백질 분해 효소와는 다르게, 이것은 C1-억제자 분자와 복합체를 형성하지 않는다. MAp19 및 MASP-3 두 단백질의 존재는 아마도 상기 렉틴 경로의 활성에 대해 반응할 것이다. 이러한 단백질 가수분해로 비 활성된 단백질은 상기 인식 분자 상의 결합 장소에 대하여 상기 활성된 MASP-2 및 MASP-1 효소와 경쟁한다.
상기에 언급된 것처럼, 인간 및 동물 보체계의 비정상적인 작동은 질병을 야기할 수 있다. 보체계의 조절되지 않은 활성은 자가-조직 손상, 및 염증 또는 자가 면역 병태를 야기할 수 있다(Beinrohr 2008). 이러한 상태 중 하나는 허혈-재관류(하기에서는 IR로 언급됨)손상이다. 조직으로의 산소 공급이 일시적으로 제한되거나 어떤 이유(즉, 혈관 폐색)로 방해(국소 빈혈)받게 되고 혈액 순환의 회복(재관류) 후에, 세포의 파괴가 시작한다. 재관류 동안에, 상기 보체계는 허혈성의 세포를 변환된 자신의 세포로 인식하여 이들을 제거하기 위해 염증 반응을 시작한다. 부분적으로, 이 현상은 심장 경색 및 뇌졸중 후에 발생하는 조직 손상의 원인이 되며, 또한 관상 동맥 우회 수술 및 장기 이식 동안에 발생하는 합병증의 원인일 수 있다(Markiewski 2007). 상기 렉틴 경로는 아마도 IR 손상의 발달에 역할을 한다. 이러한 이유로, 상기 렉틴 경로의 고의적인 억제는 IR 손상의 범위 및 결과를 줄일 수 있다. 또한, MBL이 RA동안에 관절에 축척되는 변경된 글리코실화를 가지는 항체 형태인 IgG-G0에 결합함으로써, 상기 렉틴 경로는 류마티스 관절염의 경우에 활성화 될 수 있다(하기에서는 RA로 명명됨). 또한, 상기 보체계의 조절되지 않은 활성은 다른 신경성퇴행질환(즉, 알츠하이머, 헌팅턴 및 피킨슨 병, 다발성 경화증)의 발달 및 유지에 역할을 하며, 이것은 노인황반변성(AMD)의 병인에 있어서 중요한 요소 중의 하나이다(Bora 2008). 후자의 임상 사진은 개발된 산업 국가에서 연령과 관련된 시력 손실에 관한 모든 경우에서 이것의 절반과 관련이 있다. 또한, 상기 보체계는 자가 면역 신장염(사구 체신염) 및 또 다른 자가 면역 질병인 SLE(전신 홍반 루푸스(lupus)) 중 하나와 관련이 있을 수 있다.
상기 보체계가 첫 단계 동안에 억제된다면, 특정 활성 경로의 효율적이고 선택적인 억제는 일반적인 면역억제를 야기하지 않고 가능할 수 있다. MASP-1 및 MASP-2 효소의 억제에 의하여, 상기 렉틴 경로는 선택적으로 차단될 수 있으며, 이것에 의하여 면역복합체의 제거의 원인이 되는 상기 전형적인 경로는 온전히 남겨져서 기능한다.
C1r, C1s, MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 효소는 동일한 도메인 구조를 가지는 효소군을 형성한다((Gal 2007). 단백질 가수 분해의 활성의 원인이 되는 트립신과(trypsin) 유사한 세린 단백질 분해효소(SP) 도메인은 5개의 비-촉매 도메인의 앞에 있다. 상기 분자(CUB=C1r/C1s, 성게 Uegf 및 뼈 형태 형성 단백질(bone morphogenetic protein-1; EGF=표피성장인자)의 N-말단을 형성하는 CUB1-EGF-CUB2 3개의 도메인은 상기 분자(MASP-1 및 MASP-2 두 경우에서)의 이합체화 및 상기 분자(즉, 상기 인식 분자에 결합하기 위해)와의 상호 작용의 원인이 된다.
상기 분자의 C-말단 CCP1-CCP2-SO 조각(CCP=보체 조절 단백질)은 촉매 특징과 관련하여 상기 분자 전체에 해당된다. 보체 단백질 분해 효소의 특징 중 하나는 이들이 매우 좁은 기질 특이성이 있고, 단지 몇 개의 단백질 기질의 정교하게 정의된 펩티드 결합을 자를 수 있다. 상기 CCP 모듈(module) 및 SP 도메인은 이러한 정교하게 조정된 특이성에 기여한다.
상기 SP 도메인은 세린 단백질 분해효소, 기질 결합 포켓(pocket) 및 산소음이온 구멍의 특징인 활성된 중심(centre)을 포함한다. 다른 단백질 분해효소에서 상당히 다른 구조인 8개의 표면 루프(loop) 지역은 하위 위치의 특이성을 결정하는데 결정적인 역할을 한다.
하나의 부분 상에서 상기 CCP 모듈은 촉매 영역의 구조를 안정화하고, 다른 부분에서 이들은 큰 단백질 기질에 대한 결합 위치를 가지고 있다. 트립신과 유사한 세린 단백질 분해 효소(즉, 벤자미딘(benzamidine), NPGB, FUT-175)를 억제하기 위해 상용되는 작은 분자의 화합물은 보체 단백질 분해 효소의 활성 또한 억제하지만(Schwertz 2008), 이 억제는 충분히 선택적이지 않고, 이것은 혈장내의 다른 세린 단백질 분해 효소(즉, 혈액 응고 효소인 칼리크레인(kallikrein))의 비활성화로 확장한다.
또한, 보체계의 유일하게 알려진 자연계의 억제자인, 혈액 내에서 순환하고 세르핀군(serpin family)에 속하는 C1 억제자 단백질은 비교적 넓은 특이성으로 특징지어진다.
당 분야의 상황에 따르면, 렉틴 경로를 효율적으로 그리고 선택적으로 억제할 수 있는 화합물 또는 자연계의 억제자 단백질은 알려지지 않았다.
[발명의 요약]
렉틴 경로를 포함하는 상기 보체계의 억제는 보체계의 비정상적인 활성의 결과로서 발생하는 인간 및 동물의 질병을 치료하는 효과적인 방법일 수 있다. 그러나, 현재까지 이러한 질병을 방지하기 위하여 원하는 범위에서 억제될 수 있는 상기 보체계에, 주로 상기 렉틴 경로에 사용될 수 있는 이용 가능한 화합물이 없다. 상기에 상세하게 설명된 것처럼, 렉틴 경로는 MASP-1 및 MASP-2를 억제함으로써 억제될 수 있다.
이러한 이유로, 우리의 목적은 상기 MASP-1 및/또는 MASP-2를 억제함으로써 보체계의 렉틴 경로를 선택적으로 억제할 수 있는 화합물을 개발하는 것이다.
놀랍게도 우리는 일반식()에 있어서, 하기 펩티드는 상기 목적에 적합하다는 것을 발견했다:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD ()에 있어서,
X1은 Y,M,W,I,V,A이고,
X2은 R,K이고,
X3은 Y,F,I,M,L,E,D,H이고,
X4은 V,I,H이고,
X5은 I,V,Y,F,W이다.
상기에 따라서, 본 발명은 일반식()의 펩티드, 이들의 염, 에스테르 및 약학적으로 수용 가능한 프로드럭에 관한 것이다.
특별히 바람직하게, 본 발명은 하기의 서열의 펩티드에 관한 것이다:
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2),
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
GVCSRSLPPICWPD (SEQ ID NO 4),
GMCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 5),
GYCSRSIPPVCIPD (SEQ ID NO 6),
GWCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 7), 및
상기 서열의 펩티드의 고리형인,
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
및 이들의 염 또는 에스테르.
가장 바람직하게는 본 발명은 서열 GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2) 및 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)의 펩티드, 이들의 염 및 에스테르에 관한 것이다.
게다가 본 발명은 일반식()에 있어서, 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 조제품, 이것의 염, 에스테르 또는 프로드럭 및 적어도 하나의 부가되는 첨가물에 관한 것이다. 이 첨가제는 조절된 활성제 방출을 안전하게 하기 위한 매트릭스(matrix)인 것이 바람직하다.
본 발명은 특별히 하기 서열의 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 조제약에 관한 것이다:
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2),
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
GVCSRSLPPICWPD (SEQ ID NO 4),
GMCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 5),
GYCSRSIPPVCIPD (SEQ ID NO 6),
GWCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 7),
상기 서열의 펩티드의 고리형인,
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
및/또는 이들의 약학적으로 수용 가능한 염 및 에스테르.
특별히 바람직하게는, 본 발명에 있어서, 상기 조제약은 GYCSRSYPPVCIPD 및 GICSRSLPPICIPD 서열의 펩티드 및/또는 이들의 약학적으로 수용 가능한 염 및/또는 에스테르를 포함한다.
또한, 본 발명은 MASP 효소를 잠재적으로 억제하는 화합물의 분리 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라서, 분리 방법은, 표지된 펩티드는 MASP를 포함하고 있는 용액으로 첨가된 후, 테스트하기 위하여 하나 이상의 화합물을 포함하고 있는 용액이 이것으로 첨가되고, 방출되는 표지된 펩티드의 분량을 측정하는 순서로 이루어진다. 이 점에 있어서, 상기 MASP 효소는 MASP-1 또는 MASP-2 효소가 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 보체계를 억제함으로써 치료될 수 있는 질병을 치료하는데 적절한 조제약을 생산하는데 있어서, 일반식()의 펩티드 및 이들의 약학적으로 수용 가능한 염 또는 에스테르의 용도에 관한 것이다. 이와 일치하여, 상기 질병은 다음의 군에서 선택되는 것이 바람직하다: 염증 및 자가 면역 질환, 특히 바람직하게는 허혈재관류 상해, 류마티스 관절염, 신경성퇴행질환, 노인황반변성, 및 사구체신염, 및 전신성홍반성루푸스 및 보체 활성과 관련된 가짜-알러지.
또한, 본 발명은 MASP 효소를 분리하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 일반식()에 있어서, 하나 이상의 고정된 펩티드를 가진 캐리어(carrier)는 MASP 효소를 포함하고 있는 용액으로 접촉되고 상기 조제약은 헹궈지는 순서로 이루어진다. 이 점에 있어서, 상기 MASP 효소는 MASP-1 또는 MASP-2가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 펩티드 중 몇 개는 MASP-1 및 MASP-2 두 효소를 억제하고, 나머지는 단지 MASP-2 효소를 억제하고, MASP-1 효소는 억제하지 않는다. 그러나, 본 발명에 있어서 이러한 펩티드는 단지 매우 높은 농도에서만 MASP 효소에 가깝게 관련된 트롬빈(thrombin)을 억제하고, 일반적으로는 단지 트립신을 약간 억제한다.
도면에 있어서,
도1은 파지(phage) 디스플레이(display) 방법의 도식 표현을 보여준다;
도2는 아가로스 겔 상(1번째 줄은 절단된 pMal-p2x lacq 유전자에 관한 것이며, 2번째 줄은 절단된 pBlueKS_Nhe_Nsi 벡터에 관한 것이다)에서 실시되고, 실시예 1.1.3.2.에서 기재된 절단의 결과에 대한 확인을 보여 준다;
도3은 실시예 1.1.4.3에서 기재된 것처럼 라이게이션(ligation) 및 형질전환에 사용된 벡터 및 인서트(insert)의 농도를 확인하기 위한 실험 결과를 보여 준다;
도4는 실시예 2.2.2.에 기재된 것처럼 라이게이션 실험과 관련하여 준비된 겔의 그림을 보여준다;
도5는 획득된 서열의 로고(logo) 그림을 보여주며, 여기에서
도5.a는 MASP-2에서 선택되고 한정된 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다;
도5.b는 MASP-2에서 선택되지만, MASP-1도 인식하는 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다; 및 .
도5.c는 MASP-1에서 선택되지만, MASP-2도 인식하는 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다.
도6은 본 발명에 따라서, 혈액 응고 상에서의 상기 펩티드의 효과를 분량과 관련하여 실험 결과를 보여주며, 여기에서
도6.a는 혈장 응고(섬유소 형성)가 혈장에 트롬빈을 첨가함으로써 야기되는 과정에서, 트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다;
도6.b는 혈장 응고(섬유소 형성)가 혈장에 조직 요소를 첨가함으로써 야기되는 과정에서 프로트롬빈(prothrombin)의 시간을 측정하는 실험을 도시한다; 및
도6.c는 혈액 응고의 소위 "활성된 접촉" 또는 "고유의" 경로를 시작하는 활성된 트롬보플라스틴(thromboplastin) 시간을 측정하는 실험을 도시한다;
도7은 본 발명에 있어서, 상기 3개의 보체 활성 경로 상에서의 상기 펩티드의 영향을 보여주며, 여기에서
도7.a는 선택적인 "S" 펩티드의 효과를 보여주고, 반면에,
도7.b는 비-선택적인 "NS" 펩티드의 효과를 보여준다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 MASP-1 및 MASP-2(또는 단지 MASP-2만) 효소를 선택적으로 억제하는 펩티드 및 펩티드 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열에 연속하여 유사한 아미노산 서열 및 상기에 기재된 서열과 비교하여 유사한 생물학적 활성에 관한 것이다. 당 분야의 기술인은 어떤 측면의 변경 또는 아미노산 교체는 논의가 되고 있는 상기 펩티드의 생물학적 기능을 변경하지 않고도 수행될 수 있다는 것을 분명히 인지하고 있다. 이러한 변경은 아미노산 곁사슬의 상대적 유사성, 예를 들어 크기, 전하, 소수성, 친수성 등에 따라 있을 수 있다. 이러한 변경의 목적은 효소 분해에 대한 펩티드의 안정성을 증가시키거나 약동학적 파라미터(parameter)를 개선하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 보호 범위는 검출능을 강화하기 위한 요소(즉, 형광군, 방사성 원자 등)가 통합된 펩티드를 포함한다.
게다가, 부가적인 아미노산이 상기 최초의 서열의 생물학적 활성에 중대한 영향을 끼치지 않는다면, 본 발명의 보호 범위는 상기 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 두 개의 말단에 약간의 아미노산을 더 포함하는 펩티드도 포함한다. 상기 말단으로 배치된 이러한 첨가된 아미노산의 목적은 고정을 촉진하고, 다른 시약으로 연결할 수 있는 가능성을 보장하고, 용해도, 흡수 및 다른 특성에 영향을 끼치는 것일 수 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명은 또한 상기 일반식()의 펩티드의 약학적으로 수용 가능한 염에 관한 것이다. 지금까지, 우리는 인간 또는 동물의 조직과 접촉하는 동안 독성, 염증, 알레르기 증상 또는 유사한 현상의 불필요한 상태로 귀결되지 않는 염을 의미한다. 첨가되는 산성의 염의 한정되지 않은 예는 다음과 같다: 아세테이트(acetate), 구연산(citrate), 아스파르트산염(aspartate), 벤조산(benzoate), 벤젠 술포네이트(benzene sulphonate), 부티르산(butyrate), 디글루코네이트(digluconate), 헤미설페이트(hemisulphate), 푸마르산염(fumarate), 염산염(hydrochloride), 브롬화수소산염(hydrobromide), 수화요오드(hydroiodide), 유산염(lactate), 말레인산염(maleate), 메탄 술폰산염(methane sulphonate), 옥살산염(oxalate), 프로피온산(propionate), 호박산(succinate), 주석산(tartrate), 인산(phosphate), 글루타민산(glutamate). 추가되는 염기의 염의 한정되지 않은 예로는, 다음과 같은 염이 언급된다: 알칼리 금속 및 알칼리 토류금속(리튬(lithium), 칼륨(potassium), 나트륨(sodium), 칼슘(calcium), 마그네슘(magnesium), 알루미늄(aluminium)), 제4기 암모늄(ammonium) 염, 아민 양이온(amine cation, 메틸아민(methylamine), 에틸아민(ethylamine), 디에틸아민(diethylamine) 등).
본 발명에 따라서, 본 발명에 관한 프로드럭은 생체 내에서 펩티드로 변환하는 화합물이다. 예를 들어, 변환은 효소 가수 분해 동안 혈액 내에서 야기될 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 하나 이상의 첨가제가 적절한 생물학적 효과를 달성하기 위해 요구되는 조제약에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조제약은 당 분야의 기술인에 의해 광범위하게 알려진 조절된 활성제 방출을 안전하게 하는 매트릭스(matrix)와 결합된 조제약일 수 있다. 조절된 활성제 방출을 안전하게 하는 매트릭스는 일반적인 중합체로, 예를 들어, 효소 또는 산-염기 가수분해(즉, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리코라이드(polyglycolide))의 과정에서 적절한 조직(즉, 혈장)으로 들어갈 때, 분해된다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약에 당 분야에서 알려진 희석제, 충전제, pH 조절제, 용해를 촉진하는 기질, 색상 첨가제, 산화 억제제, 방부제, 등장화제 등과 같은 다른 첨가제 또한 사용될 수 있다. 이러한 첨가제는 당 분야에서 알려져 있다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약이 비경구적(정맥 내로, 근육 내로, 피하로 등)인 투약으로 개체에 투약될 가능성이 있다. 이것의 투약을 고려하는데 있어서, 바람직한 조제 구성은 수성 또는 비-수성, 분산, 현탁액, 유탁액 또는 고체(즉, 분말) 조제품일 수 있고, 사용 전에 직접 상기 액체 중 하나로 변형될 수 있다. 이러한 액체내의 적절한 매체, 캐리어, 희석제 또는 용매는 예를 들어, 물, 에탄올, 다른 폴리올(즉, 글리세린(glycerine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols) 및 유사한 기질), 카르복시메틸(carboxymethyl) 섬유소, 다른(야채) 오일, 유기 에스테르, 및 이러한 모든 기질의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약의 바람직한 제제는 다른 정제, 분말, 과립, 좌약주사, 시럽 등에 포함된다.
투약량은 상기 질병의 종류, 환자의 성, 나이, 무게 및 질병의 정도에 따라 다르다. 구강 투약의 경우에서, 바람직한 매일 복용량은 예를 들어, 0.01mg 내지 1g 범위에서 다양화될 수 있고, 비경 투약(즉, 정맥 투약)의 경우에서 바람직한 매일 복용량은 예를 들어, 활성제에 대하여 0.,001mg 내지 100mg 범위에서 다양화 될 수 있다.
게다가, 상기 조제약은 당 분야에서 알려진 것처럼 리포좀(liposome) 또는 미소캡슐(microcapsule)에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 유전자 치료의 최첨단 수단으로 대상 개체에 투여될 수 있다.
원하는 의학적 효과를 달성하기 위하여, MASP-1 또는 MASP-2를 선택적으로 억제하는 활성제가 필요한 경우, 본 발명에 따라서, 일반식()의 펩티드 유래의 선택적으로 억제하는 펩티드가 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 따라서, 상기 MASP-2를 선택적으로 억제하는 펩티드는 서열 GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2)을 가진 펩티드일 수 있으며, 반면, 본 발명에 따라서, 상기 MASP-1 효소를 선택적으로 억제하는 펩티드는 서열 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)를 가진 펩티드일 수 있다. 특정 치료 목적을 달성하기 위하여, MASP-1 및 MASP-2 두 개를 억제하는 펩티드로 서열 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)를 가진 고리형 펩티드와 같은 펩티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 서로 다른 MASP 효소(어떤 MASP 효소에 특정한 방식으로, 또는 MASP-1 및 MASP-2 두 개의 효소에 동시에 특정한 방식으로)를 측정하고 배치하기 위해 사용될 수 있는 서로 다른 키트에서 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 용도는 경쟁시험 및 비-경쟁시험, 방사선 면역 측정법, 생물 발광의 및 화학 발광의 시험, 형광 시험, 효소-연결된 분석(즉, ELISA), 면역 세포 화학적 분석 등으로 확장될 수 있다.
본 발명에 따라서, 키트는 MASP 효소의 잠재적인 억제자를 시험, 즉, 즉, 경쟁적인 바인딩 어세이를 하기에 적당한 것이 바람직하다. 이러한 키드를 사용하여, 본 발명에 따라서, MASP 효소 유래의 펩티드를 치환하는 잠재적인 억제자의 능력이 어느 정도인지를 측정할 수 있다. 이것을 감지하기 위해서는, 본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 어떤 방법으로 표지되어야 한다(즉, 형광 그룹 또는 방사선 원자를 포함하는 것).
본 발명에 따라서, 일반식()의 화합물(펩티드) 또한 MASP 효소를 잠재적으로 억제하는 화합물을 분류하는데 사용할 수 있다. 이러한 분류 절차 과정으로, 일반식()의 펩티드는 이후 시점에서 검출능을 강화하기 위하여 표지된 형태(형광성의, 방사성의 등)로 사용된다. 이러한 펩티드를 포함하는 조제품은 상기 펩티드가 상기 MASP 효소에 결합하는 과정으로, 상기 MASP 효소를 포함하는 용액에 첨가된다. 적절한 잠복기 후에, 상기 화합물/시험되는 화합물을 포함하고 있는 용액은 상기 조제품으로 첨가된 후, 또 다른 잠복기가 있다. 상기 MASP 효소에 결합하는 화합물은(만약, 상기 시험된 화합물이 상기 펩티드와 동일한 위치, 또는 그 밖의 위치에서 부분적으로 또는 완전히 상기 효소의 표면에 결합하면, 상기 펩티드를 결합하는 능력을 잃게 되는 방식으로, MASP 효소의 구조를 바꾸는) MASP 분자 유래의 표지된 펩티드를 이들의 억제 능력의 범위로 치환한다. 상기 치환된 펩티드의 농도는 펩티드 분자 상에 사용된 표지(형광성의 또는 방사성의)를 검출하는데 적절한 어떤 방법을 사용하면서 결정될 수 있다. 인큐베이션(incubation) 시간, 세척 조건, 검출 방법 및 기타 파라미터는 당 분야의 기술자들이 인지하고 있는 방식에서 최적화될 수 있다. 본 발명에 따라서, 상기 분류 방법은 고속대량스크리닝(high-throughput screening, HTS) 방법에서도 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 상기 보체계 작동의 억제가 바람직한 효과를 가지는 경우에 우선적으로 발명의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 이러한 질병을 치료하기 위한 약제의 생산에서 상기 펩티드를 사용하는 것에 관한 것이다. 상기에서 상세하게 설명된 것처럼, 이러한 질병은 우선적으로 특정 염증 및 자가 면역 질환이고, 특히 다음의 질병들이다: 허혈재관류 상해, 류마티스 관절염, 신경성퇴행질환(예, 알츠하이머, 헝팅턴 및 파키슨병, 다발성 경화증), 노인황반변성, 및 사구체신염, 및 전신성홍반성루푸스.
본 발명에 따라서, 상기 화합물은 펩티드를 고정하고 MASP 효소를 포함하고 있는 것으로 추측되는 용액으로 만들어진 조제품을 접촉함으로써, MASP 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용액이 실제로 MASP 효소를 포함하고 있다면, 이것은 고정된 펩티드에 의해 고정될 것이다. 이 방법은 분석 및 준비 목적에 적합할 수 있다. 상기 MASP 효소 상에 주어진 펩티드의 결합 형상이 알려지지 않았다면, 이 방법 동안에, 여러 방향 또는 여러 펩티드에 고정된 펩티드의 적절한 링크(link)를 확실시 하기위해 사용될 수 있다. 상기 MASP 효소를 포함하고 있는 상기 용액은 순수한 단백질 용액, 다른 범위로 추출된 추출물, 조직 표본 등일 수 있다.
파지 디스플레이( Phage display )
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 파지 디스플레이 방법을 사용하면서 개발되었다.
상기 파지 디스플레이는 유도된 체외 에볼루션(evolution)을 취득하는데 적절하며, 최첨단 기술을 이용한 방법(Smith 1985)의 주요 단계는 도1에서 도시되었다. 이 과정에서, 에볼루션에 관련된 상기 단백질의 유전자는 박테리오파지(bacteriophage) 외피 단백질 유전자로 링크된다. 이 방법으로, 상기 박테리오파지가 만들어 질 때, 융합 단백질이 생산되고, 파지의 표면으로 융합된다. 상기 파지 입자는 외래 단백질 유전자를 내부로 수용하는 반면, 이것의 표면상에, 외래 단백질을 전시한다. 상기 단백질 및 이것의 유전자는 파지에 의해 물리적으로 연결된다. 유도된 단백질 에볼루션을 위하여, 우리는 신중하게 결정하여 이것을 코딩(coding)하는 유전자의 코돈(codon)을 변경했다. 수많은 코돈은 합성된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 혼합물을 기반으로 한 조합된 돌연변이 생성을 사용하면서 동시에 변경될 수 있다. 상기 돌연변이의 위치 및 위치의 다양성은 동시에 결정된다.
수십억의 다양한 cDNA를 포함하고 있는 cDNA 라이브러리(library)를 제작하고 박테리아로 삽입한 후에, 상기 파지 단백질 라이브러리가 제작된다. 각각의 파지는 다양한 단백질 중에서 단지 하나의 형태만을 전시하고 이 단백질의 유전자만을 수용한다. 각각의 다양한 단백질은 연구자에 의해 선택된 주어진 타겟(target) 분자에 결합하는(및 일반적으로 상기 표면에 링크되는) 이들의 능력을 기반으로 하여, 단순한 단백질 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 유사한 방법을 사용하면서 분리될 수 있다. 동시에, 단순한 단백질 친화성 크로마토그래피에 상반되는 것으로써, 이러한 방식으로 선택된 다양한 파지 단백질은 두 가지의 중요한 특징을 가진다. 한 가지 특징은 이들이 증식할 수 있다는 것이며, 다른 특징은 이들의 상기 파지 입자에 싸여진 상기 코딩 유전자를 수용한다는 것이다.
에볼루션 동안에, 각각의 돌연변이를 시험하는 대신에, 사실상 수십억 개의 실험이 동시에 수행된다. 결합하는 다양한 단백질은 증폭되고, 선별-증식의 여러 사이클 후에, 기능이 다양한 개체군이 획득된다. 이러한 개체군 유래의 각각의 클론은 기능 시험이 수행되는 반면, 상기 단백질은 여전히 파지의 표면에 전시된다. 이 시험동안 적당한 것으로 보이는 다양한 파지 단백질은 물리적으로 연결된 유전자의 서열을 분석함으로써 확인된다. 상기 개별적인 분석 외에, 기능이 선택된 다수의 클론에 대한 서열 분석 또는 상기 기능을 수행할 수 있는 아미노산 서열을 밝힌다. 이러한 방법으로, 실제 실험을 기반으로 한 데이터베이스가 준비되며, 서열-기능 알고리듬(algorithm)을 고안하는 것이 가능하다. 상기를 기반으로 하여 최적으로 밝혀진 단백질들은 독립적인 단백질로 생산될 수 있으며, 이들은 좀 더 정교한 시험으로 진행될 수 있다.
라이브러리 제작
상기 SFTI(해바라기 트립신 억제자) 분자는 트립신 억제 활성이 있고, GRCTKSIPPICFPD (SEQ ID NO 1) 서열을 가진 14개의 아미노산 펩티드이다. 자연계에서, 상기 펩티드는 해바라기 내에 있고, 고리 형태이며, 본 발명에서 N-말단으로 표기된 글리신(glycoine) 및 C-말단으로 표기된 아스파라긴(asparagine)산은 펩티드(peptide) 결합으로 연결되어져 있다. 두 개의 시스테인(cystein)은 서로 이황화결합을 한다. 체외시험은 상기 이황화결합이 그대로 있다면, 상기 선형의 형태 또한 강력한 트립신 억제자인 것을 보여주었다(Korsinczky, 2001). 상기 SFTI의 또 다른 특징은, 효소와 상호 작용하는 상당히 큰 보우만 빌크(Bowman-Birk) 억제자들의 분자 일부분과 구조적으로 사실상 동일하다는 것이다(Luckett 1999; Korsinczky, 2001; Mulvenna 2005). 보우만 빌크 억제자에서 보존되고 상기 SFTI 분자와 동일한 부분은 밑줄을 그었다: GRCTKSIPPICFPD. 4번째 위치의 트레오닌(threonine)을 제외하고, 밑줄 친 모든 부분은 상기 라이브러리를 제작하는 동안 유지되었다.
상기 라이브러리를 디자인할 때, 다음의 무작위 추출이 사용되었다:GOCO(R/K)OOPPOCOPD. 구조적인 이유로 다양화되지 못한 위치는 밑줄로 표시되었다. "O" 위치에서, 모두 20개의 자연계의 아미노산이 허용된 반면, P1 위치에서는 도식(R/K)으로 표시된 단지 두 개의 기본 아미노산만을 허용하였다. 우리의 첫 예에 근거하여, 우리는 상기 기울림꼴 부분이 단백질 분해효소와 접촉하지 않는다고 추정했기 때문에 이들을 다양화되지 않았다.
파지 디스플레이 동안에 높은-어피니티(affinity) 바인딩 분자를 분리하기 위하여, 디스플레이된 바인딩 분자는 각 파지 당 낮은 복제 수, 이상적으로는 하나의 복제(1가의 파지 디스플레이)에서 제공되어야 한다. 이러한 외견상의 높은-어피니티 바인딩(친화력)에 의해, 여러 개의 고정된 타겟 분자에 대해 동시에 바인딩하는 것을 피할 수 있다. 이를 위하여, 상기에 설명된 SFTI 라이브러리는 파지 단백질 p8에 연결되어 발현될 때 파지 당 하나의 복제로 나타나는, 키로트립신(chymotrypsin) 억제 분자에 융합되어 발현되는 것이 증명되었다(Szenthe 2007). 이것은 스키스토셀카 그레가리아 키모트립신(Schistocerca Gregaria Chymotrypsin Inhibitor (SGCI)) 억제자 (Malik, 1999)로, 우리의 예비 실험에서 상기 억제자는 MASP 효소를 억제하지 않으며, 이 효소에 바인딩조차 하지 않는다는 것을 설명했다.
또한, 상기 SFTI 라이브러리의 주어진 요소 및 SGCI 분자 사이에, 우리는 단클론 항체에 의해 인식될 수 있는 선형의 항원효소 택(tag)을 도입하였으며, 여기에서 상기 택과 상기 라이브러리의 주어진 요소 사이에 적절한 거리를 유지하는 펩티드 링크를 사용하였다. 두 가지 목적을 제공하는 이것은 소위 "플레그-택(flag-tag)"이다. 이 중 하나의 목적은 상기 파지 표면상에 상기 라이브러리의 전시를 용이하게 보여줄 수 있다는 것이었다. 나머지 목적은 택에 대한 항체를 사용하면서 대조군 선별의 결과로 획득된 클론을 시컨싱(sequencing)한 후에, 특정 타겟 효소, 즉 MASP1 및 MASP 2가 부족한 상태에서 획득된 서열의 클론을 발견하는 것이다. 이러한 방법으로, 상기 효소에서 수행된 선별 결과를 상기 항체로 선별된 그룹에 비교할 때, 실제로 효소의 바인딩에 기인할 수 있고 다른 영향의 결과(예, 보다 효율적인 생산)가 아닌, 전형적인 위치-의존적인 아미노산 선호가 밝혀질 수 있다.
[실시예]
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
하기 실시예는 파지플라스미드 시스템의 가능한 제조방법 (실시예 1), 라이브러리의 준비 (실시예 2), 파지 선별 (실시예 3) 및 그 결과 (실시예 4)를 나타낸다. 실시예 5에서는 펩티드 합성 및 이와 관련된 분석 테스트가 서술되어져 있다.
실시예 1: 파지플라스미드 시스템의 제조
1.1 파지플라스미드 벡터의 제조
첫 단계로, 상업적인 유통으로 이용할 수 있는 벡터로부터 출발하여 직접 파지플라스미드 벡터를 제조하였다. 이를 위하여 쿤켈 돌연변이(Kunkel, 1991)를 이용한 새로운 제한효소 절단위치를 만들어야만 한다.
1.1.1. 우라실(uracil)을 함유한 외가닥 쿤켈-주형의 준비
1.1.1.1. 형질전환
0.5 ㎕의 pBluescript II KS(-) 파지플라스미드 (Stratagene, cat#212208-51.1 ㎍/㎕, 2961 bp)
8 ㎕ KCM 용액 [0.5 M KCl; 0.15 M CaCl2 0.25 M MgCl]
31.5 ㎕ USP 증류수
40 ㎕ CJ236 K12 대장균 컴피턴트(competent) 세포
상기 형질전환체는 20 분 동안 얼음에서 배양된 후 10 분 동안 상온에서 배양된다. 형질전환체 부피의 10배인 800 ㎕의 LB 배지를 추가한 후, 37 ℃에서 30 분 동안 200 rpm으로 섞는다. 그 후, LB-암피실린 플레이트 상에서 37 ℃로 밤새 100 ㎕를 배양한다.
1.1.1.2. 감염
다음날 콜로니는 2 ml의 배지[LB; 100 ㎍/ml 암피실린(ampicillin), 30 ㎍/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)]에 접종되고, 37 ℃에서 밤새 200 rpm으로 섞인다. 그 후, 밤새 배양된 2 ㎕의 배양액은 상기 조성물의 배지 2 ml에 접종되고, 37 ℃에서 6 시간 동안 200 rpm으로 섞인다. 30 ㎕ M13KO7 헬퍼(helper) 파지 (NEB, cat#N0315S)에 감염된 후, 37 ℃에서 40 분 동안 200 rpm으로 섞인다. 발단 배양액 전부는 30 ml의 배지[2YT, 100 ㎍/ml 암피실린, 30 ㎍/ml 클로람페니콜]로 옮겨진다. 파지들은 배양액에서 37 ℃로 밤새 16-18 시간 동안 200 rpm 조건에서 배양되어 생산된다. 다음날 아침 상기 배양액은 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리된다. 상기 상등액은 깨끗한 튜브로 옮겨지고, 1/5 부피인 6 ml의 용액[2.5 M NaCl; 20% PEG-8000]을 첨가하고, 상온에서 20 분 동안 배양한 후, 상기 파지들은 용액에서부터 침전된다. 상기 침전물은 4 ℃에서 20 분 동안 10,000 rpm으로 원심분리되고, 상기 상등액은 제거된다. 상기 침전물은 800 ㎕의 PBS 버퍼에서 용해된다.
상기 외가닥 플라스미드는 Qiaprep Spin M13 키트 (Qiagen, cat#27704)를 사용한 상기 파지들로부터 얻어진다. 상기 키트에 첨부된 설명서에 따라 100 ㎕의 10배 희석된 EB 버퍼와 상기 컬럼으로부터 녹아서 분리된다. 상기 외가닥 플라스미드의 농도는 260nm에서 35배 희석도로 확인된다 (ssDNS OD260 nm = 1= 33 ng/㎕). 상기 절차에 의하여 얻어진 외가닥 우라실을 함유한 pKS-파지플라스미드 벡터의 농도는 407 ㎍/ml이다.
1.1.2. 쿤켈 돌연변이를 이용한 Nsi 및 NheI의 절단위치의 소개
1.1.2.1. 올리고스의 인산화반응
변이 프라이머:
Blue_NheI_in_779 (36mer, SEQ ID NO 8):
5'-cgcaattaaccctcagctagcggaacaaaagctggg-3'
Blue_NsiI_in_1089 (36mer, SEQ ID NO 9):
5'-ccgcctttgagtgagatgcatccgctcgccgcagcc-3'
?2 ㎕의 10 배 농축된 TM 버퍼 [0.5 M Tris-HCl; 0.1 M MgCl2 pH 7.5]
?2 ㎕의 10 mM ATP
?1 ㎕의 100 mM DTT
?1 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드인산화효소 (Fermentas, 10u/㎕)
?36 ng Blue_NheI 프라이머 (4 ㎕)/36 ng Blue_Nsi 프라이머 (3.5 ㎕)
?10 ㎕ USP 증류수/10.5 ㎕ USP 증류수
상기 각각의 두 개의 프라이머와 일어나는 두 가지 인산화 반응은 20 ㎕의 부피로 함께 합쳐지고, 37 ℃에서 45 분 동안 배양된다.
1.1.2.2. 올리고뉴클레오티드의 혼성화
상기 주형: 상기 프라이머들의 비율은 25 ㎕의 부피에서 1:3의 모랄 비율로 맞춘다.
?2.5 ㎕의 외가닥 쿤켈 주형 (1 ㎍)
?2 ㎕의 인산화된 Blue_NheI 프라이머
?2 ㎕ 인산화된 Blue_Nsi_프라이머
?2.5 ㎕의 10 배 농축된 TM 버퍼
?16 ㎕의 USP 증류수
상기 반응 혼합물은 90 ℃의 수조에서 1 분 동안 덥혀지고, 즉시 50 ℃의 서모스탯(thermostat)으로 3 분 동안 옮겨진다. 그 후, 짧은 시간 동안 원심분리되고, 얼음에 놓여진다.
1.1.2.3. 2중 가닥 생성물의 준비, 정제, 절단
올리고뉴클레오티드의 혼성화 이후, 제2 DNA 합성에 의하여 2중-가닥 생성물은 체외에서 생성된다. 그 중 하나의 가닥은 우라실을 함유하고 쿤켈 주형인 반면, 나머지 다른 가닥은 돌연변이를 함유하고, 프라이머의 연장에 의하여 제조되며, 우라실을 함유하지 않는다.
? 1 ㎕의 10 mM ATP
?1 ㎕의 25 mM dNTP
?1.5 ㎕의 100 mM DTT
?0.6 ㎕의 T4 리가아제 (NEB, 400 u/㎕)
?0.3 ㎕ T7 중합효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
상기 반응 혼합물은 14 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 혼합물 전체는 1%의 아가로오스 겔 상에서 진행되고, 설명서에 따라 Qiaquick Gel Extraction 키트 (Qiagen, cat#28704)에 의해 분리 및 정제된다. 상기 생성물은 30 ㎕의 EB 버퍼에서 녹아서 분리되고, 상기 언급된 설명서에 따라 대장균 XL1 Blue 컴피턴트 세포로 형질전환된다. 이러한 세포들은 우라실을 함유하는 상기 가닥으로 분해하고, 박테리아가 배양된 3 ml의 배양액에 주로 클론들이 존재하고, 상기 벡터는 우라실을 함유하지 않은 변이 서열의 복제를 통해 증식된다. 상기 2중-가닥 벡터는 50 ㎕ 의 EB 버퍼에서 Mini Plus Plasmid DNA Extraction system (Viogen, cat#GF2001) 키트를 이용하여 분리된다.
유전자 처리의 다음 단계에서, 상기 생성물은 25 ㎕의 새로 생성된 절단위치에서 절단된다.
? 20 ㎕의 벡터 미니 프렙 (miniprep)
? 2.5 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼 (Fermentas)
? 1.25 ㎕의 USP 증류수
? 0.50 ㎕의 NheI (Fermentas, 10 u/ml)
? 0.75 ㎕의 Nsi (Promega, 10 u/ml)
절단은 37 ℃에서 밤새 일어난다. 상기 생성물은 2%의 아가로오스 겔 상에서 전기영동을 이용하여 확인되고, 상기 절단된 플라스미드를 상기 언급한 방법을 이용하여 겔로부터 분리한 후, 키트에 의해 정제된다. 이러한 방법으로 얻어진 벡터의 이름은 pBlueKS_NheI_Nsi이다.
1.1.3. lacIq 유전자의 추가
1.1.3.1 PCR
상기 lacIq 유전자 및 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 시그널 배열은 PCR을 이용하여 상기 pMal-p2X 벡터 (NEB, cat# N8077S, 200 ㎍/ml)로부터 분리된다.
프라이머:
pMal_lac_forward (SEQ ID NO 10): 5'-gtcagtatgcatccgacaccatcgaatggtg-3'
pMal_NheI_rev (SEQ ID NO 11): 5'-gtcagtgctagcgccgaggcggaaaacatcatcg-3'
?5 ㎕의 10배 농축된 Pfu 버퍼
?0.4 ㎕의 25 mM dNTPs
?10 ㎕의 25 mM MgSO4
?0.5 ㎕의 pMal-p2X 주형
?0.5 ㎕의 5 μM pMal_lac_forward 프라이머
?0.5 ㎕의 5 μM pMal_NheI_rev 프라이머
?1 ㎕의 Pfu 중합효소 (Fermentas, 2,5 Wu/㎕)
?36.5 ㎕ USP 증류수
PCR 동안에 사용되는 프로그램:
95 ℃ 180s
95 ℃ 45s
65 ℃ 45s
72 ℃ 240s
72 ℃ 480s
2-4단계는 20번 반복된다.
1.1.3.2 절단
상기 생성물은 상기 명세서에 따라 GenElute PCR Clean Up 키트 (Sigma, cat#NA1020)를 이용하여 정제되고, 라이게이션을 가능하게 만드는 점착성 말단을 생성하기 위해서 제한효소에 의해서 37 ℃에서 밤새 절단된다.
?20 ㎕의 PCR 생성물 (lacIq 유전자)
?2.5 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼 (Fermentas)
?1 ㎕의 Nsi 효소 (=AvaIII, Fermentas, 10 u/㎕)
?0.5 ㎕ NheI 효소
상기 절단된 PCR 생성물은 상기 키트에 의하여 정제되고, 1%의 아가로오스 겔에서 확인되기 전에 준비된 파지플라스미드에 의해 절단되고 정제된다. 상기 결과는 도 2에 나타나 있고, 제1열은 절단된 pMal-p2X lacIq 유전자에 상응하고, 제2열은 pBlueKS_NheI_Nsi 벡터에 상응한다.
1.1.3.3. 라이게이션
2 ㎕의 절단된 pBlueKS_NheI_Nsi 벡터
6 ㎕의 절단된 pMal-p2X lacIq 유전자
1 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas,1 Weiss u/㎕)
라이게이션은 상온에서 2 시간 동안 달성된다. 그 후 라이게이션된 생성물은 40 ㎕의 상기 언급된 대장균 XL1 Blue 세포들로 형질전환된다. 100 ㎕의 형질전환된 생성물 [LB; 100 ㎍/ml 암피실린]은 한천평판상으로 퍼뜨려지고, 37 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 발단된 콜로니로부터 미니 프렙 배양액이 접종되고, 상기 플라스미드는 Viogen 키트를 이용하여 분리된다. 상기 라이게이션은 37 ℃에서 1 시간 동안 제한 절단과 함께 확인된다. 상기 EcoRI 효소를 위하여, 절단위치는 단지 상기 추가된 lacIq 유전자 내부에 있다.
?3.5 ㎕의 미니 프렙 생성물
?1 ㎕의 10배 농축된 EcoRI 버퍼
?0.26 ㎕의 EcoRI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?5.24 ㎕의 USP 증류수
1% 아가로오스 겔에 상에서 절단이 이루어졌음을 확인할 수 있고, 라이게이션이 성공적임을 확인할 수 있다. 상기 새로운 파지플라스미드 벡터의 이름은 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq이다.
1.1.4. 에피톱(epitope) 택 및 SGCI 부분의 삽입
1.1.4.1. PCR
에피톱 택으로 사용되는 상기 프래그(flag)-택의 아미노산 배열은 DYKDDDDK (SEQ ID NO 12)이다. 상기 SGCI 부분은 단백질 p8을 감싸기 위해 융합되고, 상기 에피토프 테그는 SGCI의 N-말단에 융합된다. 상기에서 언급하였듯이, 상기 SGCI의 존재로 1가의 발현을 알 수 있으므로, 하나의 파지는 하나의 라이브러리 구성 펩티드의 최대값을 표면상에서 보일 것이다.
프라이머:
pGP8-Tag-NheI (SEQ ID NO 13): 5'-gtcagtgctagcatcggattataaagacgatgac-3'
P8-XbaI-rev (SEQ ID NO 14): 5'-gtcagttctagattattagcttgctttcgaggtg-3'
?5 ㎕의 10배 농축된 Pfu 버퍼
?8 ㎕의 25 mM MgSO4
?0.4 ㎕의 25 mM dNTPs
?2 ㎕의 주형: pGP8-Tag-SGCI 벡터 (earlier construction)
?0.5 ㎕의 5 μM pGP8-테그-NheI 프라이머
?0.5 ㎕의 5 μM P8-XbaI-rev 프라이머
?1 ㎕의 Pfu 중합효소 (Fermentas, 2,5 u/㎕)
?36.2 ㎕의 USP 증류수
PCR 동안에 사용되는 프로그램:
95 ℃ 180s
95 ℃ 45s
60 ℃ 45s
72 ℃ 60s
72 ℃ 480s
2-4 단계는 25번 반복된다.
상기 PCR 생성물은 설명서에 따라 Sigma GenElute PCR Clean Up를 이용하여 정제된다.
1.1.4.2. 제한효소 절단
상기 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터는 상기 프래그텍-SGCI 부분의 라이게이션을 가능하게 하기 위하여 37 ℃에서 2 시간 동안 제한 효소에 의하여 절단된다.
?2.5 ㎕의 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 미니 프렙
?3.5 ㎕의 10배 농축된 Tango 버퍼
?1.5 ㎕의 XbaI (Fermentas, 10 u/㎕)
?1.5 ㎕의 NheI (Fermentas, 10 u/㎕)
?3.5 ㎕의 USP 증류수
상기 생성물은 1%의 아가로오스 겔로부터 분리되고, Viogen Gel-M 키트에 의하여 정제되며, 45 ㎕의 물에 녹여서 분리한다. 그 후, 상기 생성물은 37 ℃에서 45 분 동안 알칼리성 인산가수분해효소에 의하여 처리된다.
?43 ㎕의 겔로부터 분리되고, 절단된 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터
?1 ㎕의 Shrimp 알칼리성 인산가수분해효소 (SAP, Fermentas, 1 u/㎕)
?5 ㎕의 10배 농축된 SAP 버퍼
상기 인산가수분해효소는 65 ℃에서 15 분 동안 가열 배양된다.
1.1.4.3. 라이게이션 및 형질전환
상기 반응 혼합물을 준비하기 전, 상기 벡터 및 상기 인서트(insert)는 농도를 확인하기 위하여 1.8%의 아가로오스 겔 상에서 진행된다. 상기 결과는 도 3에 나타나 있다.
도에서 상기 독립된 열은 하기를 의미한다:
1. 6 ㎕의 1 kb DNA 사다리 (Fermentas);
2. 프래그택-SGCI-p8 PCR 생성물; 및
3. 절단되고, 정제된 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터.
상기 라이게이션을 위하여 상기 반응 혼합물 및 상기 조절된 생성물은 상온에서 90 분 동안 배양된다.
?2 ㎕의 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터
?7 ㎕의 프래그테그-SGCI-p8 PCR 생성물
?1 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
?1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas, 1 Wu/㎕)
상기 라이게이션된 생성물은 상기에서 언급하였듯이, 대장균 XL1 Blue cells로 형질전환되고(transformed), 37 ℃에서 밤새 배양된다.
10개의 부분 표본 배지를 각각의 박테리아 콜로니와 함께 각각 3 ml 씩 접종한 후, 밤새 배양된 배양액은 준비되고, 2중-가닥 플라스미드가 분리된다. 상기 XbaI 및 NheI 효소에 의하여 발생된 상기 점착성(sticky) 말단은 서로 호환이 가능하므로, DNA 배열에 의하여 적절한 방향으로 인터그레이션(intergration)이 실현된 경우 상기 10개의 클론으로부터 분리되고, 상기 Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing 키트 (Applied Biosystems; cat#4336917) 시스템은 PCR-반응을 위하여 사용된다. 상기 배열은 BIOMI Kft. (Godollo)에 의해서 수행된다. 상기 10개의 샘플 중에서 2개의 샘플에서 우수한 인터그레이션이 발견되었다. 상기 새로운 벡터의 이름은 pKS-Tag-SGCI-p8이다.
1.1.5. Ser-Gly 어댑터(adapter)의 인터그레이션
1가의 발현을 위해서 library member-Ser/Gly/linker-Flagtag-SGCI-p8과 같은 기능적 단위의 배열이 제조된다. 이를 위해서, 상기 pKS-테그-SGCI-p8 벡터는 NheI 및 XhoI 효소에 의해서 잘리고, 이러한 단계의 결과 상기 원래의 프래그-택이 빠진다. 그 후, 상기 벡터는 Gly-Ser(GGSGGSGG, SEQ ID NO 15) 및 상기 플래그-택의 연결을 함유하는 어댑터와 라이게이션되고, 적절한 NheI 및 XhoI 점착성 말단과 함께 제공된다. 라이게이션을 확인하기 위하여, BamHI 절단위치는 상기 프래그-택의 내부에 만들어진다. 이러한 효소는 상기 적절한 라이게이션된 벡터의 2개의 위치로 잘리, 상기 제조된 생성물은 159 kb 길이이며, 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 측정할 수 있다.
?20 ㎕의 pKS-테그-SGCI-p8 벡터 미니 프랩
?3 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?2 ㎕의 XhoI (Fermentas, 10 u/㎕)
?5 ㎕의 USP 증류수
상기 벡터는 37 ℃에서 2 시간 동안 절단되고, 주어진 조건은 XhoI에게 이상적이지 않으므로, 상기 0.8%의 아가로오스 겔 상에서 절단이 완료되었는지 확인된다. 그 후, 1 ㎕ NheI 효소가 추가되고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양된다. 상기 생성물은 Viogen Gel-M 키트에 의하여 아가로오스 겔로부터 분리된다.
상기 연결자 및 프래그-택를 함유하는 어댑터들은 상기 절단된 벡터에 어닐레이트(anellate)된다.
어댑터:
Ser-Gly_forward (SEQ ID NO 16): 5'-ctagctggcgggtcgggtggatccggtggcgattataaagacgatgatgacaaac-3'
Ser-Gly_reverse (SEQ ID NO 17): 5'-tcgagtttgtcatcatcgtctttataatcgccaccggatccacccgacccgccag-3'
?15 ㎕의 절단된 pKS-테그-SGCI-p8 벡터
?2.8 ㎕의 1.3 ng/㎕ Ser-Gly_forward 프라이머
?1.7 ml의 2.2 ng/㎕ Ser-Gly_reverse 프라이머
상기 반응 혼합물은 90 ℃에서 1 분 동안 배양되고, 50 ℃에서 3 분 동안 배양되고, 짧은 시간 원심분리되며, 얼음에 놓인다. 라이게이션을 위하여 하기가 더해진다.
?2.2 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
?1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas, 1 Weiss u/㎕)
라이게이션은 16 ℃에서 밤새 수행된다. 대장균 XL1 Blue 세포는 상기에서 언급하였듯이 형질전환되고, 상기 형질전환된 생성물 [LB; 100 mg/ml]은 플레이트 상으로 퍼진다. 상기 콜로니 스타터(starter)는 밤새 접종되고, Viogen Mini-M 키트에 의하여 미니 프랩 플라스미드는 상기 지시에 따라 정제된다. 상기 얻어진 샘플들은 Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing 키트를 이용하여 DNA-배열에 의하여 확인되고, 상기 PCR 생성물은 BIOMI Kft. (Godollo, 헝가리)에 의해서 수행된다.
상기 라이브러리는 이러한 방법에 의하여 제조된 파지프라스미드를 기초로 제조되며, 그 이름은 pKS-SG-Tag-SGCI-p8이다.
실시예 2: 파지 라이브러리의 준비
시컨싱으로 확인된 상기 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터는 프라이머로, 디제너레이트(degenerate)된 라이브러리 올리고 및 벡터-특정 올리고로 PCR하여, 주형으로 사용되었다. 이러한 방법으로 생성된 상기 PCR 생성물은 상기 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터와 융합된다.
2.1. PCR
2.1.1. 라이브러리 올리고
상기에서 언급하였듯이, 라이브러리를 계획한 경우 GOCO(R/K)OOPPOCOPD와 같은 무작위 스킴(scheme)이 사용된다. 상기 SFTI-라이브러리는 상기 존재하는 모든 20개의 아미노산을 허용하는 6 개의 선택된 위치("O" 위치)로 준비되고, P 위치에서는 단지 아르기닌 및 리신이 허용된다("R/K" 위치). 발생되지 않은 올리고뉴클레오티드와 관련된 IUPAC 코드를 이용하여 상기 라이브러리의 상기 올리고뉴클레오티드 배열은 하기와 같다(SEQ ID NO 19):
5'-CC GCC GCC TCG GCG CTA GCA GGT NNK TGT NNK ARA NNK NNK CCT CCG NNK TGT NNK CCG GAT GGC GGG TCG GGT GGA TCC GGT GG-3'
상기 펩티드의 부분적인 코딩은 밑줄이 그어져 있는 반면, 무작위 코돈은 진하게 표시되어 있다.
2.1.2 DNA 라이브러리의 준비
상기 라이브러리는 PCR을 이용하여 준비되고, 하나의 올리고는 융합하기 위한 라이브러리 구성을 수용하며, 다른 올리고는 일반적인 외부의 프라이머이다. 상기 전체 반응 혼합물은 300 ㎕ 씩 6개의 PCR 튜브로 나뉜다.
?30 ㎕의 10배 농축된 Taq 버퍼
?36 ㎕의 25 mM MgCl2
?2.4 ㎕의 25 mM dNTP
?15 ㎕의 13 μM SFTI-라이브러리 올리고뉴클레오티드
?22 ㎕의 10 μM pVIII 3' 프라이머
?9 ㎕ (450 ng)의 pKS-SG-테그-SGCI-p8 주형
?180.6 ㎕의 USP 증류수
?5 ㎕의 Taq 중합효소 (Fermentas, 5 u/㎕)
상기 프로그램:
1. 95 ℃ 60s
2. 95 ℃ 30s
3. 50 ℃ 30s
4. 72 ℃ 60s
5. 72 ℃ 120s
상기 2-4 단계는 15번 반복한다.
상기 PCR 생성물은 1.5%의 아가로오스 겔 상에서 확인되고, 상기 프라이머를 제거하기 위하여 ExoI 효소에 의하여 절단된다. 37 ℃에서 45 분 동안 하나의 튜브당 1 ㎕의 ExoI 효소와 함께 배양되고, 80 ℃에서 비활성화된다. 호모듀플랙스(homoduplex)를 증가시키기 위하여 짧은 중합 사이클이 삽입되고, 상기 프라이머는 일반적으로 외부 프라이머로 사용된다.
pVIII 3' (SEQ ID NO 18): 5'-gctagttattgctcagcggtggcttgctttcgaggtgaatttc-3'
각각의 튜브에 하기가 더해진다:
?2.5 ㎕의 2,5 mM dNTP
?1 ㎕의 100 μM pVIII 3' 프라이머
?0.8 ㎕의 Taq 중합효소 (Fermentas, 5 u/㎕)
상기 프로그램은 상기 PCR의 경우와 동일하지만, 단지 2 사이클만 수행된다.
상기 생성물은 다시 1.5%의 아가로오스 겔 상에서 확인되고, ExoI 효소에 의해 절단되며, 상기 6개의 PCR 튜브의 성분은 설명서에 따라 3개의 칼럼 상에서 Sigma PCR Clean up 키트에 의해 정제된다. 용리는 52 ㎕/column의 부피에서, 10배 희석된 EB 버퍼에서 일어난다.
2.2 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 파지플라스미드 벡터에서 DNA 라이브러리의 인터그레이션
2.2.1 절단
상기 벡터 및 상기 DNA 라이브러리는 두 단계로 절단되는데, 첫 번째는 NheI 효소에 의해 절단된다. DNA 라이브러리의 절단 단계 중에 분리된 불필요한 부분은 상기 생성물과 완전히 동일한 크기이기 때문에 상기 반응 혼합물로부터 제거되지 못한다. 상기 벡터로 이러한 조각이 들어가는 것을 방지하기 위해서, 상기 첫 번째 절단 단계에서 SacI 효소 또한 추가된다. 상기 불필요한 부분의 말단 근처에서 정제에 의해서 제거될 수 있는 작은 조각이 분리되고, 남아있는 상기 큰 조각은 상기 SacI의 점착성 말단에 의해 라이게이션되지 못한다. 배양은 37 ℃에서 8 시간 동안 밤새 수행된다.
?93 ㎕의 pKS-SG-테그-SGCI-p8 벡터 (40 ㎍)
?15 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?4 ㎕의 NheI 효소(Fermentas, 10 u/㎕)
?38 ㎕의 USP 증류수
(V = 150 ㎕)
?35 ㎕의 DNA-라이브러리 PCR 생성물
?15 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?4 ㎕의 NheI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?4 ㎕의 SacI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?38 ㎕의 USP 증류수
(V = 150 ㎕)
하기에서, 다른 점착성 말단에서 생성된 두 배의 상기 Acc651 (=KpnI) 효소가 더해진다. 상기 Tango 버퍼의 농도 역시 두배이다.
상기 절단된 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터:
?8 ㎕의 Acc651 (Fermentas, 10 u/㎕)
?19.8 ㎕의 10배 농축된 Tango 버퍼
상기 절단된 DNA-라이브러리:
?8 ㎕의 Acc651 (Fermentas, 10 u/㎕)
?11 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
2.2.2 라이게이션
먼저 절단된 생성물 모두 겔로부터 분리된다. 상기 벡터는 0.8%의 아가로오스 겔로부터 분리되고, 6개의 튜브로 나뉘어, 6개의 컬럼에서 Viogen Gel-M 키트를 이용하여 정제된다. 상기 DNA-라이브러리는 1.8% 겔로부터 분리되고, 3개의 컬럼에서 정제된다 (도 4). 도에 나타난 상기 겔 영상의 열은 다음을 의미한다:
1. 1 ㎕의 100 bp DNA 래더(ladder)
2. 1 ㎕의 정제된 DNA-라이브러리
3. 1 ㎕의 정제된 벡터
4. 5 ㎕의 1 kb DNA 래더
모든 샘플들은 라이게이션을 위하여 사용되었으며, 6개의 튜브로 나뉘어져 16 ℃에서 18 시간 동안 배양되었다:
?210 ml의 정제된 pKS-SG-테그-SGCI-p8 벡터
?100 ml의 정제된 SFTI DNA-라이브러리
?2 ml의 T4 리가아제 (NEB, 400,000 ul/ml)
?35 ml의 USP 증류수
상기 생성물은 Qiagen Gel Elute 키트에 의해 정제되고, 컬럼 상에서 단지 정제된 겔로부터 분리되지 않는다. 용리는 2 x 60 ㎕의 USP 증류수에서 수행된다.
2.3 파지 라이브러리의 전기영동, 증식
상기 라이브러리는 전기영동을 경유하여 상기 슈퍼컴피턴트(supercompetent) 세포에 도입된다. 상기 플라스미드를 가능한 많은 세포에 도입하여 라이브러리는 108-109 조각들을 함유한다.
USP 증류수에 존재하고 염이 존재하지 않는 상기 DNA 라이브러리는 2 x 350 ml의 슈퍼수용성 세포에 더해진다. 상기 조작은 하기 프로토콜에 따라서 직경이 0.2 cm인 큐벳(cuvette)에 의해 수행된다: 2.5 kV, 200 ohm, 25 ㎌.
전기영동 후, 상기 세포들은 조심스럽게 2 x 25 ml SOC 배지로 옮겨지고, 37 ℃에서 30 분 동안 100 rpm으로 배양되어 샘플이 얻어진다. 배양은 희석되고, [LB], [LB; 100 ㎍/ml 암피실린] 및 [LB; 10 ㎍/ml 테트라사이클린] 플레이트로 떨어지며, 37 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 같은 절차는 비-전기 영동된 조절 생성물 및 물에 의해 전기 영동된 조절 생성물의 경우에도 적용된다. 샘플을 얻은 후, 상기 2 x 25 ml 배지액은 2 x 250 ㎕의 M13KO7 헬퍼 파지에 의해 감염되고, 37 ℃에서 30 분 동안 220 rpm으로 섞이며, 전체 생성물이 접종된다. 상기 2 x 250 ml [2YT; 100 ㎍/ml ampicillin; 30 ㎍/ml kanamycin] 배지액은 37 ℃에서 18 시간 동안 220 rpm으로 2개의 2-리터 플라스크에서 배양된다.
상기 적정에 기초하여 라이브러리 1.2 x 109개의 변종을 함유한다.
실시예 3: 파지 선택
하기의 본 실시예에서, 상기 실시예들에 따라 MASP-1 및 MASP-2 적중 효소에 구축된 라이브러리의 선택에 대하여 설명한다.
3.1 표적 효소
인간 MASP-표적들은 하나의 세린-프로테아제(SP) 영역 및 두개의 보체 조절 단백질 영역(CCP-1,-2) (Gal 2007)으로 이루어진다. 이것들은 전체 분자의 촉매 활동을 이끄는 재조합 파편 물질들이다. 상기 단백질은 생물학적 활동을 가진 형태가 복원에 의해 얻어지는 것으로부터 봉입체의 형태로 생산된다. 정제는 음이온 및 양이온 교환분리에 의하여 수행된다. 상기 단백질의 활동은 용액에서 ELISA 판에 연결된 형태로 평가된다. 생산은 다른 연구에서 자세하게 묘사된다. (Ambrus 2003)
선택하는 동안 사용된 표적들의 데이터:
MASP-1 CCP1-CCP2-SP: Mw = 45478 Da, cstock=0.58g/l(이하 MASP-1).
MASP-2 CCP1-CCP2-SP: Mw = 44017 Da, cstock=0.45g/l(이하 MASP-2)
안티-플래그택 항체 (Anti-Flagtag antibody): cstock=4g/l,(시그마, 입에서 생산되는 단일클론 안티-플래그 M2 항체, cat# F3165)
3.2 선택 단계들
3.2.1 파지의 분리
2.3 장에서 묘사된 조작의 끝에서, 파지는 18시간 동안 2 x 250 ml의 배양에서 생산된다. 선택의 제1단계에서 파지는 전시를 위한 라이브러리로 즉시 사용되기 위해 고립된다.
세포 배양은 4 ℃에서 10분 동안 8,000rpm으로 원심 분리되었다. 박테리오파지를 함유하는 상층액(supernatant)은 깨끗한 원심분리 관에 주입되고, 상층액 부피의 1/5의 침전제가 가해졌다[2.5 M NaCl; 20% PEG-8000]. 침전은 상온에서 20분 동안 발생한다. 그런 다음 4 ℃에서 15분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상기 상층액은 폐기되고, 다시 짧은 시간 동안 원심분리되었으며, 잔류액은 피펫으로 옮겨졌다. 흰색의 파지 침전물은 25ml의 [PBS; 5 mg/ml BSA; 0.05% Tween-20] 버퍼에 용해된다. 있을 수 있는 세포 파편들을 제거하기 위하여, 다시 원심분리되었고, 상층액이 깨끗한 관내로 이동하였다.
3.2.2 제1 선택 사이클
a) 고정: 표적 분자는 96-웰(well, Nunc Maxisorp) ELISA 판 (cat#442404)에 고정되었다. 고정되는 동안 MASP-1 및 MASP -2의 농도는 20 ㎍/ml이고, 안티-플래그택 항체의 농도는 2 ㎍/ml이다. 단백질은 고정 버퍼[200 mM Na2CO3;pH9.4]에 희석되고, 100 ㎕이 웰 내로 주입된다. 고정의 시간은 단백질마다 최적화된다. MASP-1는 60분 동안 실온에서 110 rev/min로 혼합되는 동안 배양되었고, 상기 항체는 30분 동안 배양되었으며, MASP-2는 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 본 제1 선택 사이클에서 표적마다 12개의 웰이 사용되었다. 모든 두 번째 열은 빈 채로 남겨두었다. 이 열은 나중에 표적 단백질로 덮이는 것과 같은 방식으로 처리된다.
b) 차단: 상기 고정 용액이 제거되고, 200 ㎕/well의 차단 버퍼[PBS; 5 mg/ml BSA]가 판 안으로 주입된다. 그것은 150 rev/min으로 혼합되는 동안, 실온에서 적어도 1시간 동안 배양되었다.
c) 세척: 상기 ELISA-판은 세척 버퍼[PBS; 0.05% Tween-20] 1 L로 4번 세척되었다.
d) 선택: 위에서 언급되어 있는 분리된 라이브러리의 파지는 피펫을 통해 각 웰마다 100 ㎕의 부피로 상기 판으로 옮겨진다. 그것은 150 rev/min으로 혼합되는 동안, 실온에서 적어도 2.5시간 동안 배양되었다.
e) E. coli XL1 블루 배양: 상기 선택시 XLI 블루 세포들이 접종 루프를 사용하여 미리 새롭게 선택된 판으로부터 2 x 30 ml [2YT; 10 ㎍/ml tetracycline] 의 배지 속으로 접종되었다. 이 세포들은 표적 단백질로부터 용출된 파지를 가지고 추후에 감염될 것이다. 감염 시점에 상기 세포들은 기하급수적 성장 상태에 있어야 한다. OD600nm가 0.3-0.5인 배양액이 필요하고, 상기 배양액은 37 ℃, 220 rpm에서 2-3 시간 동안 그것을 성장시킴으로써 얻어진다.
f) 세척: 상기 ELISA-판은 세척 버퍼 3 리터로 12번 세척되었다.
g) 용출: 용출은 100 mM HCl 용액, 100 ㎕/well로 수행되었다. 산이 가해지고, 5분 동안 흔든 다음 각 웰로부터 차례로 인출되었다. 각각의 표적 단백질로부터 용출된 상기 파지는 관에 채집되었으며, 상기 관에는 12 x 15 ㎕의 1 M 트리스-베이스 버퍼가 상기 파지를 함유하는 산성 용액을 빠르게 중화시키기 위하여 미리 가해져 있다. 상기 관은 즉시 혼합되고 얼음 위에 위치한다.
h) 감염: 기하급수적 성장 상태에서 4.5 ml의 XL1 블루 배양액이 평가 튜브 내로 주입되고, 그것은 표적 단백질로부터 용출된 파지 용액 500 ㎕에 의해 감염되었다. 총 4회의 감염이 MASP-1 및 MASP-2로부터, 상기 항체로부터, 그리고 음성 조절 물질로부터 용출된 파지를 가지고 수행되었다. 상기 배양액은 37 ℃, 220 rpm로 30분 동안 배양되었다.
i) 적정: 20 ㎕의 샘플이 각각의 감염된 배양액으로부터 추출되고, 샘플 부피의 10배의 2YT 배지로 희석되었으며, 염기서열이 10배의 추가 희석을 통해 준비되었다. 각 지점으로부터 10 ㎕ [LB; 100 ㎍/ml ampicillin]이 판 위에 떨어뜨려지고 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장하였다.
j) 헬퍼 파지에 의한 감염: 샘플 채취 직후, 50 ㎕ M13KO7 헬퍼 파지가 평가 튜브 내에서 각 배양액에 가해졌고, 추가 30분 동안 배양되었다.
k) 모든 감염된 배양액들은 3 x 200 ml의 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 30 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)] 배지 내로 이동되었고, 220 rpm으로 혼합하는 동안 37 ℃에서 18 시간 동안 배양되었다. 상기 조절 물질은 더 이상 취급되지 않고 적정에서만 필요하다.
l) 농축: 다음에 아침 적정이 이루어지고, 단지 하나의 선택 사이클 이후에 조절 물질과 비교하여 큰 차이점이 탐지될 수 있다. 상기 항체로부터 용출된 파지의 수는 백그라운드의 용출된 파지의 수보다 4만큼 높고, MASP의 경우에는 1-1.5 차이가 난다.
3.2.3. 제2 선택 사이클
이 사이클에서, 제1 선택 사이클의 경우와 마찬가지의 동일 단계들이 반복된다. 그러나 차단 및 세척 버퍼에서 2 mg/ml의 카세인(casein) (피어스, cat#37528)이 BSA 대신 사용되었다. 이러한 수정에 의하여 BSA에 결합하는 파지의 증식을 피할 수 있다. 이 단계에서, 각각의 표적 단백질은 고유의 조절 물질 (12개의 웰)을 가지고, 이전 사이클에서 용출되고 증식된 파지는 각각의 표적 단백질에 위치한다.
18시간 동안 생산된 상기 파지는 위에서 언급한 바와 같이 분리되나, 마지막에 10 ml의 살균 PBS 버퍼에 용해되었다. 상기 파지 용액의 농도는 268 nm에서 측정된 다음, [PBS; 2 mg/ml casein; 0.05% Tween-20] 버퍼에 희석되어 각각이 균일한 OD 268값 0.5를 가지게 되며, 이는 그것들이 어떻게 도입 단계에서 사용되는지에 관한 것이다. 상기 제2 선택 사이클 후에 2.7 ml의 새롭게 기하급수적으로 증가하는 XL1 블루 세포들이 300 ㎕의 용출 파지에 의해 감염되었다. 적정은 총 6번(표적 단백질 3번 + 조절 물질 3번) 수행되었고, 헬퍼 파지에 의해 또한 감염된 상기 배양액은 30 ml의 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 30 ㎍/ml 카나마이신] 배지 속으로 투입되었다.
상기 제2 선택 사이클 이후에 상기 안티-플래그택 항체에 있어서 104배, MASP-1는 10배, MASP-2는 20배의 농축을 달성하였다.
3.2.4 제3 선택 사이클
모든 단계가 제2 사이클의 경우와 동일한 방식으로 수행되고, 카세인이 마찬가지로 버퍼 내에 유지된다. 분리 후에 파지는 2.8 ml의 살균 PBS에 용해되고, 전시를 위해 OD268~0.5로 희석되었다.
본 제3 선택 사이클 이후에, 상기 조절 물질과 비교하여 막대한 농축 값이 얻어졌다. 안티-플래그택 항체에서는 105배, MASP-s 모두에서는 104배 차이가 발생하였다.
3.3. 파지 ELISA 분석을 이용한 각각의 클론 테스트
이 테스트에서, 백그라운드에서는 신호를 나타내지는 못하지만, 선택된 각각의 클론들의 어떠한 부분이 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는지 시험하였다.
a) 감염: MASP-1 및 MASP-2의 경우에, 선택 사이클 2 및 3으로부터 용출된 파지 10 ㎕가 기하급수적 상태의 XL1 블루 배양액 90 ㎕에 가해졌다. 220 rpm에서 혼합되는 동안 37 ℃에서 30분 동안 배양되었고, 그 다음 20 ㎕ 양이 추출되고 180 ㎕의 2YT 배지가 가해졌다. 이러한 10배 희석과정은 2번 이상 반복되었다. 각각의 희석 시컨스로부터 [LB; 100 ㎍/ml ampicillin] 판들에 100 ㎕를 바르고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 파지는 상기 제1 선택 사이클로부터 용출된 상기 안티-플래그택 항체가 처음으로 희석되었고, 그 직후에 감염된 세포가 되었다. 이것의 이유는 상기 항체가 상기 ELISA 판의 표면에 훨씬 잘 고정되어 훨씬 많은 파지가 용출될 수 있기 때문이다. 높은 파지 농도에 의하여, 몇 개의 파지에 의해 하나의 세포가 감염되는 위험이 있고, 이는 엇갈리고 이해할 수 없는 시컨스를 초래한다.
b) 주입: 이른바 "싱글 루스(single loose)" 튜브 내로, 500 ㎕의 배지 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 50 ㎕ M13KO7 헬퍼 파지] 내로, 각각의 군락들이 접종되었다. 이러한 튜브들은 96-웰 ELISA-판 배열과 유사하게 배열되고, 300 rev/min로 혼합하는 동안 37 ℃에서 개별적으로 판 인큐베이터 내에서 움직이고, 소-부피 배양액 생산에 적합하다.
c) 고정: MASP-1 및 MASP-2 단백질은, 상기 안티-플래그태그 항체가 1 ㎍/ml의 농도일 때, 0.01 ㎍/㎕의 농도, 100 ㎕/well 의 부피로, 선택과 관련하여 위에서 설명한 바와 같이, 눈크(Nunc) ELISA 막시솔프(Maxisorp) 판에 고정되었다. 각각의 클론은 고유의 표적 단백질, 백그라운드 및 안티-플래그태그 항체에서 테스트되었다.
d) 18시간 뒤에 상기 튜브들은 2,500 rpm, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리기 내에서 원심분리되고, 상층액이 피펫을 통해 깨끗한 튜브 내로 옮겨졌다. ELISA 분석 후에 잔류 상층액은 65 ℃에서 2시간 동안 가열되었고, 그 후 -20 ℃에 저장될 수 있고, 시컨싱에 사용될 수 있다.
e) 차단: 상기 용액은 고정 샘플로부터 제거되었고, 200 ㎕/웰의 [PBS; 2 mg/ml 카세인] 차단 버퍼가 각각의 웰에 주입되었다. 배양은 150 rev/min로 혼합하는 동안 실온에서 적어도 1시간 동안 일어났다.
f) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1 리터로 4번 세척되었다.
g) 파지 적용: 위에서 설명한 바와 같이 생산되고 분리된 상기 파지들은 [PBS; 2 mg/ml 카세인; 0.05% Tween-20] 버퍼를 사용하여 2배로 희석되었고, 100 ㎕가 웰에 주입되었다. 동일 클론으로부터 샘플들이 피펫을 통하여 총 3개의 웰 내로 주입되었다. 배양은 110 rev/분으로 혼합하는 동안 실온에서 1시간 동안 일어났다.
h) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1.5 리터로 6번 세척되었다.
i) 안티-M13 항체: [PBS; 2 mg/ml 카세인; 0,05% Tween-20] 버퍼 내에 10,000 배로 희석된, 단일항체 안티-M13 HRP 공액 항체(Amersham, cat#27-9421-01) 100 ㎕가 웰로 주입되었고, 그 다음 110 rev/분으로 혼합하는 동안 실온에서 30분 동안 배양되었다.
j) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1.5 리터로 6번 세척된 다음 PBS로 2번 세척되었다.
k) 발달: USP 로 2배로 희석된 1-단계 울트라 TMB-ELISA 기질 (Pierce, cat#34028) 100 ㎕가 각각의 웰에 주입되었고, 잠시 흔들어 준 다음 각 웰에 1 M HCl 50 ㎕를 가함으로써 반응이 중지되었다.
l) 판독: 바이오트랙 II (Amersham) 플레이트 판독 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도가 측정되었다.
백그라운드의 강도가 낮고, 자신의 표적 단백질에 적어도 3배 이상의 강력한 신호를 표시하는 파지 상층액으로부터 샘플을 채취하였고, 상기 샘플들을 DNA 시컨싱을 위하여 준비하였다. 2 ㎕의 상층액을 사용하였고, PCR 반응을 위하여 빅 다이 터미네이터 3.1 버전 사이클 시컨싱 키트(Applied Biosystems; cat#4336917) 시스템을 사용하였다. 그것은 BIOMI Kft. (Godollo)에 의하여 작동된다.
서열 해석 후, MASP들의 경우에 제3 사이클에서 단지 몇몇의 개개의 서열들이 발견되었고, 단지 몇 개의 유형만이 농축되었으므로 제2 선택 사이클로부터 보다 많은 클론들이 선택되고 테스트되어야 하는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 목적은 표적 단백질의 아미노산 선호에 대한 패턴을 구축할 수 있도록 가능한 한 다양하게 수많은 서열을 수집하는 것이다.
실시예 4: 결과
본 실시예에서는 실시예 1-3에서 언급된 테스트 결과를 설명하며, 서열이 얻어진다.
MASP-1에서 용출된 파지로부터, ELISA를 사용하여 32개의 클론들을 테스트하였고, 결국 9개의 각각의 서열들을 발견하였다. MASP-2의 경우에는 80개의 ELISA 지점으로부터 21개의 각각의 서열들을 얻었으며, 안티-플래그택 항체의 경우에는 72개의 테스트된 클론으로부터 57개의 해석 가능한 서열을 얻었다.
결과를 해석할 때, 표시-오차 효과를 고려해야 했다. DNA 라이브러리 구축에 사용되는 NNK 코돈이 각각의 아미노산를 위한 동일한 빈도를 보장하지 않기 때문에 이를 위한 하나의 방법으로 코돈 표준화를 사용한다. 보다 이상적인 다른 접근법은 항체로부터 선택된 서열 데이터로부터 표준화하는 것이다. 이론적으로 가능한 서열 유형들 중 일부는 실현 가능한 구축을 가져오지 않거나, 파지에 너무나 큰 부담을 주게 되므로, 모든 이론적으로 가능한 서열 유형들이 상기 파지 표면에 표시되는 것은 아니다. 그러나, 상기 항체로부터 실제로 발생한 서열들을 얻게 되고, 상기 서열들은 표적 단백질에 수행된 선택의 초기 단계에서 나타나고, MASP들에 특정 양식은 이로부터 얻어진다.
데이터 표준화 후에, 본 발명자들은 인터넷 사이트 (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi; Crooks 2004 and Schneider 1990)에서 접속 가능한 웹로고의 도움으로 상기 서열들에 대한 서열 로고 다이어그램을 만들었다. 본 발명자들은 각각의 위치에서 원하는 아미노산 및 그것들이 MASP-1 또는 MASP-2로부터 유래되었는지에 여부에 따라 서로 어떻게 분화되는지에 대하여 시험하였다. 본 발명자들은 또한 우리의 데이터를 프레임으로 제공되고, 소의 트립신의 보조나노분자 억제제인 야생-타입 SFTI의 서열과 비교하였다.
각각의 클론들은 위에서 언급한 ELISA 시스템 내에서, 백그라운드로서 사용된 BSA에서, 그들의 표적으로 사용되는 고유의 단백질에서 검사되었고, 또한 가능한 교차 반응을 알아보기 위하여 다른 MASP 분자에서 검사되었다. 상기 결과에 근거하여 서열들은 3개의 그룹으로 분류될 수 있다.
a) MASP-2로부터 선택되고, MASP-2에 특유한 서열들
b) MASP-2로부터 선택되고, MASP-1도 인지하는 서열들
c) MASP-1으로부터 선택되고, MASP-2도 인지하는 서열들
본 발명자들은 특별히 MASP-1만 인지하는 그룹을 발견하지 못하였다. 상기 비-선택 그룹들(b 및 c)은 매우 유사한 경향을 나타내었고, MASP 표적에 관계없이 선택되었다. 상기 서열 로고 다이어그램의 수평축에서 각각의 위치의 수를 볼 수 있으며, 위치 5에 대응하는 P1 사이트를 볼 수 있다. 상기 서열 로고 다이어그램은 도 5에 도시되며, 도면의 숫자(5.a; 5.b 및 5.c)는 같은 순서로 a), b) 및 c)로 표시된 그룹들의 서열 로고 다이어그램에 관한 것이다. 각각의 위치에서 상기 로고의 컬럼 높이는 요소(우리의 경우 20가지의 다른 아미노산 유형) 발생빈도를 나타낸다. 이러한 발생이 적을수록 컬럼은 높아진다. 완전히 균등한 경우(모든 20개의 아미노산이 5%의 비율로 발생) 높이는 0이다. 최대 값은 오직 한 유형의 요소(아미노산)가 발생할 때의 경우에 속한다. 상기 컬럼 내에 각각의 아미노산들은 발생빈도에 근거하여 배열되고, 가장 빈번한 것이 상단에 위치한다. 아미노산을 나타내는 글자의 높이는 주어진 위치에서의 상대적인 발생빈도에 비례한다.(예를 들어, 50%의 발생빈도의 경우, 컬럼의 높이는 절반임) 컬러 다이어그램의 경우, 일반적으로 유사한 화학적 성질을 가지는 아미노산들은 동일 또는 유사한 색깔로 나타내어지고, 본 특허 명세서에 속하는 도면들에서는 다른 회색그림자를 사용하였다.
상기 로고 다이어그램의 도움으로 선택 및 비-선택적인 그룹들의 일치 서열을 결정하였고, 선택에서 유래된 클론 이름에 근거하여 M2-6E 및 M2-4G 펩티드로 명명하였으며, 그것들의 활동을 반영하는 그것들의 이름은 "S" 펩티드(선택적의 S) 또는 "NS" 펩티드 (비선택적의 NS)이다.(하기 참조)
MASP-2 선택적 M2-6E 클론 (SEQ ID NO 2):
"S" 펩티드 GYCSRSYPPVCIPD
비선택적 M2-4G 클론 (SEQ ID NO 3):
"NS" 펩티드 GICSRSLPPICIPD
상기 펩티드, 및 그들의 점 돌연변이와 순환변종은 고상 펩티드 합성을 통해 생산되었다. 상기 합성 및 펩티드 분석 테스트는 실시예 5에서 설명된다.
실시예 5: 펩티드 합성 및 분석
5.1 펩티드 제조, 복원 및 품질검사
펩티드들은 표준 Fmoc (N-(9-플루오레닐(fluorenyl)) 메톡시 카보닐(methoxy carbonyl)) 절차(Atherton 1989)를 사용하는 고상 펩티드 합성을 통해 생산되었다. 운반체로부터의 분리 및 보호기의 동시 제거는 라디칼-추적제로서 1.2-에탄싸이올(ethanedithiol), 싸이오에니솔(thioanisole), 물 및 페놀의 존재 하에서 TFA (trifluoroacetic acid(트리플루오로아세트산)) 방법을 사용하여 수행되었다. 거의 다 건조될 때까지 용액을 증발시킨 후에, 생성물은 차가운 다이에틸 에테르를 사용하여 침전되었다. 물속에서 상기 침전물의 용해 후에, 휘발성 물질들은 냉동건조(lyophilisation)에 의해 제거되었다. 복원을 위해, 펩티드의 2개의 시스테이닐(cysteinyl) 측면 사슬 사이에서 이황화 결합을 만들어내고, 냉동 건조된 물질이 0.1 mg/ml의 농도에서 수용액에서 용해되었다. 산화는 연속적인 환기 외에 용액을 혼합함으로써 수행되었고, pH 값이 N,N-다이이소프로필(diisopropyl)-에틸아민(ethylamine)을 가함으로써 알칼리 값(8-9 사이)으로 유지되었다. 산화의 완전한 실현은 역-상(reversed-phase) HPLC 및 질량분석기를 사용하여 측정되었다. 95% 이상의 균일 형태로 산화된 물질의 분리 역시 역-상 HPLC 법으로 수행되었다.
M2-4G 펩티드의 경우, 상기 고리 형태가 또한 생산되고, 펩티드 결합이 선형 형태의 N말단 및 C말단 사이에서 형성된다. 고리화가 하기와 같이 수행되었다. 펩티드 합성은 펩티드가 1% TFA를 함유하는 DCM (dichloromethane) 용액을 사용하여 분리되는 곳으로부터, 2-ClTrt (2-chlorotrityl) 수지 위에서 이루어졌다. 그러한 조건하에서 측쇄 보호기는 펩티드에 남게 된다. 역-상 HPLC 절차를 사용하여, 분리된 펩티드를 정제한 후에, 선형 펩티드는 상기 펩티드의 최종 농도가 0.1 mM인 경우에 상당한 양의 DMF (dimethylformamide)를 사용하여 용해되었다. 그런 다음, 1.1 당량의 HATU((1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridine-3- oxid hexafluorophosphate) 및 3.0 당량의 DIPEA (diisopropylethylamine)이 가해졌다. 실온에서 30분 동안 용액을 혼합한 후에, 고리화 효율이 역-상 HPLC 절차 및 질량분석기를 사용하여 측정되었다. 고리화가 완료된 후에, 샘플은 증발되었고, 펩티드는 예비의 역-상 HPLC 절차를 사용하여 정제되었다.
각각의 분리된 펩티드에서 품질 검사가 질량분석 절차를 사용하여 수행되었다. 질량분석은 HP1100 타입 HPLC-ESI-MS 시스템, 유동-주입(flow-injection) 법으로 10 mM 암모늄-포르미에이트(ammonium-formiate), pH 3.5용액을 사용하여 이루어졌다. 상기 장치는 아래의 파라미터들로 설정되었다. 건조 기체 및 분무 기체는 질소이고, 건조 기체의 유속은 10 l/분이며, 온도는 300 ℃이었다. 분무 기체의 압력은 210 kPa이었고, 모세관 전압은 3500V이었다.
총 이온 전류(TIC) 크로마토그램은 300-2000 mass/전하의 범위로 양이온 설정에서 만들어졌다. 질량 데이터는 Agilent ChemStation 소프트웨어으로 측정되었다. 각각의 생성된 억제제의 이름, 서열 및 질량 데이터는 하기 표 1에 도시된다.
[표 1]
표 1: 화학적 합성에 따라 제조된, 본 발명에 따른 여러 펩티드 억제제의 이론상 및 측정된 분자 중량
표 1에 도시된 서열에서, 라이브러리 구축 중의 무작위로 뽑힌 위치는 밑줄로 표시되고, 와이드-타입(wild-type) SFTI 의 아미노산과 다른 아미노산이 있는 위치들은 굵은 글씨체로 표시되었다.
5.2. 합성 펩티드 기질로 Ki상수 결정
펩티드의 억제능력은 먼저 MASP 효소 및 트립신에서 측정되었다. MASP 효소 에서 가장 유망한 억제 데이터를 보여주고 있는 단지 두 개의 펩티드(추후 언급)의 억제능력은 트롬빈에서 또한 측정되었다.
5.2.1. MASP 효소로 측정
측정에 사용된 합성 기질은 10mM의 원액으로부터 준비되는 Z-L-Lys-SBzl 수산화나트륨(시그마, C3647)이다. 반응은 [20 mM HEPES; 145 mM NaCl; 5 mM CaCl2;0.05%Triton-X100]으로 구성되는 버퍼에서, 실온에서 1ml의 부피로 수행되었다. 상기 효소에 의해 갈라진 상기 기질은 2x 초과 용액에 존재하는 다이싸이오다이피리딘(ithiodipyridine) 예비 기질(알드리싸이올 -4, 시그마, cat#143057)과 함께 반응 내로 투입되었다. 이 방법에서 만들어진 색소포(chromophore) 그룹의 방출은 324nm에서 분광광도계로 관찰되었다. 희석 서열은 합성 펩티드로부터 준비되었고, 상기 효소가 이것에 가해졌으며, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 기질의 농도 및 측정시간의 길이는 효소가 10% 미만의 기질을 소비하는 조건으로 선택되었다. 측정 과정에서, 강력히 결합된 억제제의 특성으로 발달된 측정 방법이 사용되었다. (Empie, 1982) 반응의 초기 단계에서 그려진 직선의 경사는 억제되지 않은 효소 반응의 경우에서 얻어진 경사로 표준화되고, 상기 효소 양으로 곱해졌다. 이 결과로부터, 본 발명자들은 상기 억제제 농도의 함수로 표시되고, 하기식 1에 따라 그려진 자유 효소 농도를 얻었다:
[식 1]
E = y = E0-(E0+x+Ki-(((E0+x+Ki)^2)-4*E0*x)^(1/2))/2,
E는 자유(비억제) 효소 농도이고, E0는 초기 효소 농도이다. MASP-1 및 MASP-2 농도는 C1 억제제에 의한 적정으로 결정되었다. 상기 결과는 평행 측정의 평균으로 계산되었다. 상기 결과는 하기 5.3의 표 2에 요약되었다.
5.3. 트립신 및 트롬빈에서의 측정
2개의 일치 펩티드들, 즉 M2-6E and M2-4G는 가장 유망한 MASP-2 및 MASP-1 억제제로 판명되었고, 본 발명자들은 그들의 트립신 및 트롬빈 억제 능력의 관점에서 초기 SFTI 분자에 그것들을 비교함으로써 그것들을 특성 짓는 것을 계속하였다. 트립신 억제를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 위에서 언급된 측정 조건을 사용하였고, 트립신의 활동이 억제제 펩티드 농도의 함수로 Z-L-Lys-SBzl 수산화나트륨 기질에서 측정되었다. 평가는 위에서 언급한 바와 같이 이루어졌다. MASP 효소는 혈액에서 생리학적 업무를 수행하고, 펩티드들을 사용하는 가능성은 혈청에 있는 다른 프로테아제의 활동의 효과에 따라 결정된다. 본 발명자들은 유사한 조건에서 혈액 응고의 중심 효소인 트롬빈을 Z-Gly-Pro-Arg-pNa 기질과 함께 시험하였다. P-니트로아닐라이드(nitroanilide)는 예비 기질을 필요로 하지 않고, 생성물의 제조는 분광광도계로 405nm에서 직접 관찰되었다. 좁은 큐벳에서 측정되는 부피는 350 ㎕이고, 상기 기질의 농도는 505 μM이었다. 트롬빈은 다른 억제제 농도로 실온에서 20분 동안 배양되었다. 트롬빈의 양은 활성-지점(active-site) 적정법을 사용하여 결정되었다. 평가는 위에서 언급한 바와 같이 이루어졌다. 그 결과는 하기 표 2에 요약되었다.
[표 2]
표 2: 각각의 억제제들의 효소 억제 요약표. 밑줄이 쳐지고 굵은 글씨로 보여지는 서열은 표 1과 동일한 의미를 가진다.
별도로 표시되지 않는 한, 상기 억제제는 열린 사슬을 가진다. 기호 "NG"는 억제가 가장 높은 억제제 농도를 사용한 경우에도 불구하고 측정되지 않은 것을 의미한다. 기호 "-"는 주어진 효소/억제제 쌍의 관점에서 측정이 수행되지 않음을 의미한다.
상기 데이터에 기초하여, 선택 펩티드(M2-6E, SEQ ID NO 2)는 MASP-2를 보다 더 억제하고, MASP-1에는 비활성이며, 트립신에서의 활동이 4등급 낮으며, 또한 트롬빈 억제제로서 매우 좋지 못하다. 이와는 반대로, 비선택 펩티드(M2-4G, cyclic SEQ ID NO 3)는 보다 일반적인 억제제의 특징을 나타낸다. 그것은 모든 4개의 단백질분해효소를 억제하고, 야생타입 SFTI-1보다 트립신에서 훨씬 약하다. 그것은 좋지 못한 트롬빈 억제제이나, 야생타입과 비교할 때 그것의 밀접성은 향상되었다.
5.4. 혈액 응고에서 펩티드의 효과
본 발명자들은 건강한 사람들로부터 채집된 혈액 혈장을 사용하여 혈액 응고 측정을 수행하였다. 정맥 천자(venipuncture)를 통해 얻어지고 소듐 구연산염(sodium citrate)으로 처리된 혈액으로부터 상기 혈장은 원심분리에 의해 분리된다.(2000 g, 15 분, Jouan CR412 원심분리기)
혈액 응고의 외부 경로를 테스트하는 프로트롬빈 시간(PT)은 Innovin 시약(Dale Behring, Marburg, 독일)을 사용하는 Sysmex CA-500 (Sysmex, 일본) 자동 시스템으로 측정되었다. 혈액 응고의 내부 경로를 테스트하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 및 트롬빈 조작을 직접 테스트하는 트롬빈 시간(TT)은 트리니크랏(TriniClot) 시약(Trinity Biotech, Wichlow, 아일랜드) 및 리아날(Reanal) 시약 (Reanal Finechemical, 헝가리)를 사용하는 Coag-A-Mate MAX (BioMerieux, 프랑스) 분석기로 측정되었다.
혈액 응고에서 펩티드의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 투여량 의존성(dose dependency)을 측정하였고, 그 결과는 도 6의 그래프에 도시된다. 각 도면에서, 꺽인 선들 사이의 영역은 정해진 측정과 관련하여 정상 범위를 나타낸다. 세로 좌표에서 시간은 초로 측정되고, 횡축에서 억제제 농도의 로그값이 μM 단위로 도시된다.
도 6.a는 혈장 응고(피브린 형성)가 상기 혈장에 트롬빈을 가함으로써 시작되는 과정에서 트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다. 외부적으로 가해진 트롬빈의 효과는 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다. 도 6.b는 혈장 응고(피브린 형성)가 상기 혈장에 조직 요인을 가함으로써 시작되는 과정에서 프로트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다. 그 결과 요인 VII의 활성화를 통하여 프로트롬비나아제 복합체 활성 트롬빈이 몇 단계에서 만들어진다. 이 실험에서, 외상(혈관 손상)의 결과로 활성화된 혈액 응고의 외부 경로가 모방된다. 조직 요인에 의해 개시된 단백질분해효소 캐스케이드의 일원은 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다. 도 6.c는 혈액 응고의 소위 "활성화 또는 본질적인 접촉" 경로를 모방하는 활성화된 트롬보플라스틴 시간을 측정하는 실험으로, 상기 혈액 응고는 혈액에서 콜라겐의 발생에 의하여 예를 들어 생리학적으로 발생한다. 본 실험에서는 콜라겐 대신에 예를 들어 카올린 파우더와 같은 큰 표면적의 물질을 가함으로써 실현된다. 이 결과, 요인 XII를 활성화시켜 단백질분해효소 캐스케이드가 다시 개시되고, 그 결과 프로트롬비나아제 복합체 활성화 트롬빈이 만들어진다. 이 단백질분해효소 캐스케이드의 일원은 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다.
세 가지 모든 측정에서, 상기 농도가 200 μM인 경우에도 선택적인 "S" 펩티드는 정상범위 근처에 남아 있으므로, 상기 MASP-억제 양상으로부터 적절한 농도에서 응고를 억제하지 않는다. 200 μM인 경우 상기 비선택적 "NS" 펩티드가 극단적인 측정값에 도달하는 즉, 혈액 응고를 상당히 억제하는 것을 의미하는 것과 상반적이다. 이전 챕터에서 서술한 상기 데이터는 "NS" 펩티드가 Ki 값 10 μM에서 트롬빈을 억제한다는 것을 증명하고, 상기 실험에서 나타난 효과를 설명한다. 혈액 응고의 마지막 단계에서, 트롬빈은 피브린계 응고물에 의해 생성되는 피브리노겐을 분해하는 효소이다. 그래서 상기 트롬빈 자신의 억제는 혈액 응고의 억제에 충분히 효과적이다. 이러한 이유로, 상기 혈액 응고 실험에 기초하여, 상대적으로 바람직하게 트롬빈을 억제하는 상기 "NS" 펩티드 역시 상기 혈액 응고 케스케이드에서 기능적 양상으로부터 트롬빈을 선행하는 혈액 응고 요인(예를 들면, VIIA, IXa, Xa, XIa, XIIa)을 억제한다. 동시에, 세 가지 모든 실험에서 상기 선택적인 "S" 펩티드의 혈액 응고 상에서의 약한 효과는 이러한 펩티드는 상기 케스케이드의 초기 요소의 강한 억제자가 될 수 없음을 입증한다.
5.5 세 가지 보체활성 경로에 있어서 본원발명에 따른 펩티드의 효과
상기에서 자세히 서술하였듯이, 상기 보체계는 세 가지 경로를 통해 활성화 될 수 있으며, 동일한 단일 말단을 야기한다. 세 가지 활성 경로는 전형적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로를 포함한다. MASP-s는 렉틴 경로의 초기 단계의 효소이므로, 상기 렉틴 경로, 상기 다른 두 가지의 활성화 경로 및 상기 세 가지 경로가 만나는 단계에서 본원발명에 따른 상기 MASP 억제제의 효과를 아는 것이 중요하다.
측정을 위하여, 상기 보체 경로의 선별적인 측정을 위해 개발된 WIELISA 키트 (Euro-Diagnostica AB, COMPL300)를 상기 키트에 첨부된 사용 설명서에 기초하여 사용하였다. 측정의 원리는 상기 세 가지 활성 경로에 따라 현재 시험된 보체 활성 경로는 작동할 수 있는 반면 나머지 두 가지 경로에서는 불활성화되는 세 가지 측정 환경에서 사용한다. 동시에, 측정 동안에 탐지되는 상기 생성물은 경로-선택적 요소가 아니고, 상기 활성 경로의 공동 부분의 마지막 요소인 상기 C5-9 복합체이다.
측정을 위하여, 상기 혈액 샘플은 상온에서 1 시간 동안 배양되고, 원심분리되며, 상기 혈청은 -80 ℃의 작은 배치에 저장된다. 상기 혈청은 주어진 보체 경로에 속하는 상기 버퍼와 함께 처방전에 따라 희석되고, 상온에서 20 분 동안 배양되고, 펩티드로부터 준비된 상기 희석된 배열이 첨가되고, 상온에서 20분 동안 배양되며, 특정한 ELISA 플레이트의 알맞은 웰에 떨어뜨려진다. 그 다음, 세척, 배양 및 항체 첨가가 사용을 위한 지시에 따라 수행된다. 상기 기질과 함께 20분 동안 배양되며, 상기 데이터는 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 얻어진다. 각각의 측정 지점에 속하는 유사한 100% 활성은 억제자가 없는 혈청에 의하여 나타난다. 상기 측정은 하나의 단일하게 녹인 혈청 샘플로부터 동일한 플레이트에서 동시에 수행된다.
상기 측정은 "S" 펩티드 및 "NS" 펩티드 모두 효율적이고 특정한 상기 보체계의 렉틴 경로의 억제자라는 매우 중요한 결과를 야기한다. 이러한 결과는 앞서 입증한 양 펩티드는 상기 MASP-2 효소를 매우 효율적으로 억제하고, 본 발명에 따른 효소는 상기 렉틴 경로를 억제한다는 결과에 따른 것이다.
수많은 세린 단백질분해효소들은 상기 보체계에서 작동하고, 이들 중 일부는 상기 MASP 효소와 매우 유사하다. "S" 펩티드 또는 "NS" 펩티드가 아님에도 불구하고 상기 전형적 경로 또는 교대적 경로를 억제한다.
상기 전형적 경로 및 교대적 경로의 측정 과정으로서, 본원 발명에 따른 펩티드의 존재는 상기 말단인 C5-9 복합체의 생성을 억제하지 않고, 본원 발명에 따른 상기 펩티드는 상기 보체계의 공동 부분의 단백질분해효소를 억제하지 않으므로, 상기 렉틴 경로의 억제는 MASP 효소 단계인 렉틴 경로의 초기에 일어난다. 상기 WIELISA 측정 과정에서 얻어진 상기 IC50 데이터는 합성 기질에 기초한 MASP-2 억제 측정 과정에서 얻어진 Ki값보다 30 배, 60 배 더 높다. 이러한 결과에 대한 가능한 설명은 다음과 같다: 억제자 펩티드는 MASP-2 효소와 기질 결합 위치에 직접 결합되고, 이러한 결합은 동일한 효소 표면에 의한 작은 합성 기질의 상대적으로 약한 상호작용과 잘 경쟁한다. 그러나 상기 기질 결합 위치가 단백질분해효소 부위에 위치할 뿐만 아니라, 생리학적 기질은 다른 표면(엑소사이트)을 거쳐 결합을 생성할 수 있고, 작은 합성 기질에 비해 높은 친화도로 상기 효소와 결합한다. 상기 효소-기질 복합체로부터 효소-억제자 복합체로 옮겨진 균형을 맞추기 위하여 억제자 펩티드가 고농도로 사용되어야만 하기 때문에 이러한 높은 친화도가 나타난다.
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도1은 파지(phage) 디스플레이(display) 방법의 도식 표현을 보여준다;
도2는 아가로스 겔 상(1번째 줄은 절단된 pMal-p2x lacq 유전자에 관한 것이며, 2번째 줄은 절단된 pBlueKS_Nhe_Nsi 벡터에 관한 것이다)에서 실시되고, 실시예 1.1.3.2.에서 기재된 절단의 결과에 대한 확인을 보여 준다;
도3은 실시예 1.1.4.3에서 기재된 것처럼 라이게이션(ligation) 및 형질전환에 사용된 벡터 및 인서트(insert)의 농도를 확인하기 위한 실험 결과를 보여 준다;
도4는 실시예 2.2.2.에 기재된 것처럼 라이게이션 실험과 관련하여 준비된 겔의 그림을 보여준다;
도5는 획득된 서열의 로고(logo) 그림을 보여주며, 여기에서
도5.a는 MASP-2에서 선택되고 한정된 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다;
도5.b는 MASP-2에서 선택되지만, MASP-1도 인식하는 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다; 및 .
도5.c는 MASP-1에서 선택되지만, MASP-2도 인식하는 서열에 관계된 서열 그림을 보여준다.
도6은 본 발명에 따라서, 혈액 응고 상에서의 상기 펩티드의 효과를 분량과 관련하여 실험 결과를 보여주며, 여기에서
도6.a는 혈장 응고(섬유소 형성)가 혈장에 트롬빈을 첨가함으로써 야기되는 과정에서, 트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다;
도6.b는 혈장 응고(섬유소 형성)가 혈장에 조직 요소를 첨가함으로써 야기되는 과정에서 프로트롬빈(prothrombin)의 시간을 측정하는 실험을 도시한다; 및
도6.c는 혈액 응고의 소위 "활성된 접촉" 또는 "고유의" 경로를 시작하는 활성된 트롬보플라스틴(thromboplastin) 시간을 측정하는 실험을 도시한다;
도7은 본 발명에 있어서, 상기 3개의 보체 활성 경로 상에서의 상기 펩티드의 영향을 보여주며, 여기에서
도7.a는 선택적인 "S" 펩티드의 효과를 보여주고, 반면에,
도7.b는 비-선택적인 "NS" 펩티드의 효과를 보여준다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 MASP-1 및 MASP-2(또는 단지 MASP-2만) 효소를 선택적으로 억제하는 펩티드 및 펩티드 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열에 연속하여 유사한 아미노산 서열 및 상기에 기재된 서열과 비교하여 유사한 생물학적 활성에 관한 것이다. 당 분야의 기술인은 어떤 측면의 변경 또는 아미노산 교체는 논의가 되고 있는 상기 펩티드의 생물학적 기능을 변경하지 않고도 수행될 수 있다는 것을 분명히 인지하고 있다. 이러한 변경은 아미노산 곁사슬의 상대적 유사성, 예를 들어 크기, 전하, 소수성, 친수성 등에 따라 있을 수 있다. 이러한 변경의 목적은 효소 분해에 대한 펩티드의 안정성을 증가시키거나 약동학적 파라미터(parameter)를 개선하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 보호 범위는 검출능을 강화하기 위한 요소(즉, 형광군, 방사성 원자 등)가 통합된 펩티드를 포함한다.
게다가, 부가적인 아미노산이 상기 최초의 서열의 생물학적 활성에 중대한 영향을 끼치지 않는다면, 본 발명의 보호 범위는 상기 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 두 개의 말단에 약간의 아미노산을 더 포함하는 펩티드도 포함한다. 상기 말단으로 배치된 이러한 첨가된 아미노산의 목적은 고정을 촉진하고, 다른 시약으로 연결할 수 있는 가능성을 보장하고, 용해도, 흡수 및 다른 특성에 영향을 끼치는 것일 수 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명은 또한 상기 일반식()의 펩티드의 약학적으로 수용 가능한 염에 관한 것이다. 지금까지, 우리는 인간 또는 동물의 조직과 접촉하는 동안 독성, 염증, 알레르기 증상 또는 유사한 현상의 불필요한 상태로 귀결되지 않는 염을 의미한다. 첨가되는 산성의 염의 한정되지 않은 예는 다음과 같다: 아세테이트(acetate), 구연산(citrate), 아스파르트산염(aspartate), 벤조산(benzoate), 벤젠 술포네이트(benzene sulphonate), 부티르산(butyrate), 디글루코네이트(digluconate), 헤미설페이트(hemisulphate), 푸마르산염(fumarate), 염산염(hydrochloride), 브롬화수소산염(hydrobromide), 수화요오드(hydroiodide), 유산염(lactate), 말레인산염(maleate), 메탄 술폰산염(methane sulphonate), 옥살산염(oxalate), 프로피온산(propionate), 호박산(succinate), 주석산(tartrate), 인산(phosphate), 글루타민산(glutamate). 추가되는 염기의 염의 한정되지 않은 예로는, 다음과 같은 염이 언급된다: 알칼리 금속 및 알칼리 토류금속(리튬(lithium), 칼륨(potassium), 나트륨(sodium), 칼슘(calcium), 마그네슘(magnesium), 알루미늄(aluminium)), 제4기 암모늄(ammonium) 염, 아민 양이온(amine cation, 메틸아민(methylamine), 에틸아민(ethylamine), 디에틸아민(diethylamine) 등).
본 발명에 따라서, 본 발명에 관한 프로드럭은 생체 내에서 펩티드로 변환하는 화합물이다. 예를 들어, 변환은 효소 가수 분해 동안 혈액 내에서 야기될 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 하나 이상의 첨가제가 적절한 생물학적 효과를 달성하기 위해 요구되는 조제약에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조제약은 당 분야의 기술인에 의해 광범위하게 알려진 조절된 활성제 방출을 안전하게 하는 매트릭스(matrix)와 결합된 조제약일 수 있다. 조절된 활성제 방출을 안전하게 하는 매트릭스는 일반적인 중합체로, 예를 들어, 효소 또는 산-염기 가수분해(즉, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리코라이드(polyglycolide))의 과정에서 적절한 조직(즉, 혈장)으로 들어갈 때, 분해된다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약에 당 분야에서 알려진 희석제, 충전제, pH 조절제, 용해를 촉진하는 기질, 색상 첨가제, 산화 억제제, 방부제, 등장화제 등과 같은 다른 첨가제 또한 사용될 수 있다. 이러한 첨가제는 당 분야에서 알려져 있다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약이 비경구적(정맥 내로, 근육 내로, 피하로 등)인 투약으로 개체에 투약될 가능성이 있다. 이것의 투약을 고려하는데 있어서, 바람직한 조제 구성은 수성 또는 비-수성, 분산, 현탁액, 유탁액 또는 고체(즉, 분말) 조제품일 수 있고, 사용 전에 직접 상기 액체 중 하나로 변형될 수 있다. 이러한 액체내의 적절한 매체, 캐리어, 희석제 또는 용매는 예를 들어, 물, 에탄올, 다른 폴리올(즉, 글리세린(glycerine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols) 및 유사한 기질), 카르복시메틸(carboxymethyl) 섬유소, 다른(야채) 오일, 유기 에스테르, 및 이러한 모든 기질의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 조제약의 바람직한 제제는 다른 정제, 분말, 과립, 좌약주사, 시럽 등에 포함된다.
투약량은 상기 질병의 종류, 환자의 성, 나이, 무게 및 질병의 정도에 따라 다르다. 구강 투약의 경우에서, 바람직한 매일 복용량은 예를 들어, 0.01mg 내지 1g 범위에서 다양화될 수 있고, 비경 투약(즉, 정맥 투약)의 경우에서 바람직한 매일 복용량은 예를 들어, 활성제에 대하여 0.,001mg 내지 100mg 범위에서 다양화 될 수 있다.
게다가, 상기 조제약은 당 분야에서 알려진 것처럼 리포좀(liposome) 또는 미소캡슐(microcapsule)에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 유전자 치료의 최첨단 수단으로 대상 개체에 투여될 수 있다.
원하는 의학적 효과를 달성하기 위하여, MASP-1 또는 MASP-2를 선택적으로 억제하는 활성제가 필요한 경우, 본 발명에 따라서, 일반식()의 펩티드 유래의 선택적으로 억제하는 펩티드가 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 따라서, 상기 MASP-2를 선택적으로 억제하는 펩티드는 서열 GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2)을 가진 펩티드일 수 있으며, 반면, 본 발명에 따라서, 상기 MASP-1 효소를 선택적으로 억제하는 펩티드는 서열 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)를 가진 펩티드일 수 있다. 특정 치료 목적을 달성하기 위하여, MASP-1 및 MASP-2 두 개를 억제하는 펩티드로 서열 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)를 가진 고리형 펩티드와 같은 펩티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 서로 다른 MASP 효소(어떤 MASP 효소에 특정한 방식으로, 또는 MASP-1 및 MASP-2 두 개의 효소에 동시에 특정한 방식으로)를 측정하고 배치하기 위해 사용될 수 있는 서로 다른 키트에서 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 용도는 경쟁시험 및 비-경쟁시험, 방사선 면역 측정법, 생물 발광의 및 화학 발광의 시험, 형광 시험, 효소-연결된 분석(즉, ELISA), 면역 세포 화학적 분석 등으로 확장될 수 있다.
본 발명에 따라서, 키트는 MASP 효소의 잠재적인 억제자를 시험, 즉, 즉, 경쟁적인 바인딩 어세이를 하기에 적당한 것이 바람직하다. 이러한 키드를 사용하여, 본 발명에 따라서, MASP 효소 유래의 펩티드를 치환하는 잠재적인 억제자의 능력이 어느 정도인지를 측정할 수 있다. 이것을 감지하기 위해서는, 본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 어떤 방법으로 표지되어야 한다(즉, 형광 그룹 또는 방사선 원자를 포함하는 것).
본 발명에 따라서, 일반식()의 화합물(펩티드) 또한 MASP 효소를 잠재적으로 억제하는 화합물을 분류하는데 사용할 수 있다. 이러한 분류 절차 과정으로, 일반식()의 펩티드는 이후 시점에서 검출능을 강화하기 위하여 표지된 형태(형광성의, 방사성의 등)로 사용된다. 이러한 펩티드를 포함하는 조제품은 상기 펩티드가 상기 MASP 효소에 결합하는 과정으로, 상기 MASP 효소를 포함하는 용액에 첨가된다. 적절한 잠복기 후에, 상기 화합물/시험되는 화합물을 포함하고 있는 용액은 상기 조제품으로 첨가된 후, 또 다른 잠복기가 있다. 상기 MASP 효소에 결합하는 화합물은(만약, 상기 시험된 화합물이 상기 펩티드와 동일한 위치, 또는 그 밖의 위치에서 부분적으로 또는 완전히 상기 효소의 표면에 결합하면, 상기 펩티드를 결합하는 능력을 잃게 되는 방식으로, MASP 효소의 구조를 바꾸는) MASP 분자 유래의 표지된 펩티드를 이들의 억제 능력의 범위로 치환한다. 상기 치환된 펩티드의 농도는 펩티드 분자 상에 사용된 표지(형광성의 또는 방사성의)를 검출하는데 적절한 어떤 방법을 사용하면서 결정될 수 있다. 인큐베이션(incubation) 시간, 세척 조건, 검출 방법 및 기타 파라미터는 당 분야의 기술자들이 인지하고 있는 방식에서 최적화될 수 있다. 본 발명에 따라서, 상기 분류 방법은 고속대량스크리닝(high-throughput screening, HTS) 방법에서도 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 상기 보체계 작동의 억제가 바람직한 효과를 가지는 경우에 우선적으로 발명의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 이러한 질병을 치료하기 위한 약제의 생산에서 상기 펩티드를 사용하는 것에 관한 것이다. 상기에서 상세하게 설명된 것처럼, 이러한 질병은 우선적으로 특정 염증 및 자가 면역 질환이고, 특히 다음의 질병들이다: 허혈재관류 상해, 류마티스 관절염, 신경성퇴행질환(예, 알츠하이머, 헝팅턴 및 파키슨병, 다발성 경화증), 노인황반변성, 및 사구체신염, 및 전신성홍반성루푸스.
본 발명에 따라서, 상기 화합물은 펩티드를 고정하고 MASP 효소를 포함하고 있는 것으로 추측되는 용액으로 만들어진 조제품을 접촉함으로써, MASP 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용액이 실제로 MASP 효소를 포함하고 있다면, 이것은 고정된 펩티드에 의해 고정될 것이다. 이 방법은 분석 및 준비 목적에 적합할 수 있다. 상기 MASP 효소 상에 주어진 펩티드의 결합 형상이 알려지지 않았다면, 이 방법 동안에, 여러 방향 또는 여러 펩티드에 고정된 펩티드의 적절한 링크(link)를 확실시 하기위해 사용될 수 있다. 상기 MASP 효소를 포함하고 있는 상기 용액은 순수한 단백질 용액, 다른 범위로 추출된 추출물, 조직 표본 등일 수 있다.
파지 디스플레이( Phage display )
본 발명에 따라서, 상기 펩티드는 파지 디스플레이 방법을 사용하면서 개발되었다.
상기 파지 디스플레이는 유도된 체외 에볼루션(evolution)을 취득하는데 적절하며, 최첨단 기술을 이용한 방법(Smith 1985)의 주요 단계는 도1에서 도시되었다. 이 과정에서, 에볼루션에 관련된 상기 단백질의 유전자는 박테리오파지(bacteriophage) 외피 단백질 유전자로 링크된다. 이 방법으로, 상기 박테리오파지가 만들어 질 때, 융합 단백질이 생산되고, 파지의 표면으로 융합된다. 상기 파지 입자는 외래 단백질 유전자를 내부로 수용하는 반면, 이것의 표면상에, 외래 단백질을 전시한다. 상기 단백질 및 이것의 유전자는 파지에 의해 물리적으로 연결된다. 유도된 단백질 에볼루션을 위하여, 우리는 신중하게 결정하여 이것을 코딩(coding)하는 유전자의 코돈(codon)을 변경했다. 수많은 코돈은 합성된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 혼합물을 기반으로 한 조합된 돌연변이 생성을 사용하면서 동시에 변경될 수 있다. 상기 돌연변이의 위치 및 위치의 다양성은 동시에 결정된다.
수십억의 다양한 cDNA를 포함하고 있는 cDNA 라이브러리(library)를 제작하고 박테리아로 삽입한 후에, 상기 파지 단백질 라이브러리가 제작된다. 각각의 파지는 다양한 단백질 중에서 단지 하나의 형태만을 전시하고 이 단백질의 유전자만을 수용한다. 각각의 다양한 단백질은 연구자에 의해 선택된 주어진 타겟(target) 분자에 결합하는(및 일반적으로 상기 표면에 링크되는) 이들의 능력을 기반으로 하여, 단순한 단백질 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 유사한 방법을 사용하면서 분리될 수 있다. 동시에, 단순한 단백질 친화성 크로마토그래피에 상반되는 것으로써, 이러한 방식으로 선택된 다양한 파지 단백질은 두 가지의 중요한 특징을 가진다. 한 가지 특징은 이들이 증식할 수 있다는 것이며, 다른 특징은 이들의 상기 파지 입자에 싸여진 상기 코딩 유전자를 수용한다는 것이다.
에볼루션 동안에, 각각의 돌연변이를 시험하는 대신에, 사실상 수십억 개의 실험이 동시에 수행된다. 결합하는 다양한 단백질은 증폭되고, 선별-증식의 여러 사이클 후에, 기능이 다양한 개체군이 획득된다. 이러한 개체군 유래의 각각의 클론은 기능 시험이 수행되는 반면, 상기 단백질은 여전히 파지의 표면에 전시된다. 이 시험동안 적당한 것으로 보이는 다양한 파지 단백질은 물리적으로 연결된 유전자의 서열을 분석함으로써 확인된다. 상기 개별적인 분석 외에, 기능이 선택된 다수의 클론에 대한 서열 분석 또는 상기 기능을 수행할 수 있는 아미노산 서열을 밝힌다. 이러한 방법으로, 실제 실험을 기반으로 한 데이터베이스가 준비되며, 서열-기능 알고리듬(algorithm)을 고안하는 것이 가능하다. 상기를 기반으로 하여 최적으로 밝혀진 단백질들은 독립적인 단백질로 생산될 수 있으며, 이들은 좀 더 정교한 시험으로 진행될 수 있다.
라이브러리 제작
상기 SFTI(해바라기 트립신 억제자) 분자는 트립신 억제 활성이 있고, GRCTKSIPPICFPD (SEQ ID NO 1) 서열을 가진 14개의 아미노산 펩티드이다. 자연계에서, 상기 펩티드는 해바라기 내에 있고, 고리 형태이며, 본 발명에서 N-말단으로 표기된 글리신(glycoine) 및 C-말단으로 표기된 아스파라긴(asparagine)산은 펩티드(peptide) 결합으로 연결되어져 있다. 두 개의 시스테인(cystein)은 서로 이황화결합을 한다. 체외시험은 상기 이황화결합이 그대로 있다면, 상기 선형의 형태 또한 강력한 트립신 억제자인 것을 보여주었다(Korsinczky, 2001). 상기 SFTI의 또 다른 특징은, 효소와 상호 작용하는 상당히 큰 보우만 빌크(Bowman-Birk) 억제자들의 분자 일부분과 구조적으로 사실상 동일하다는 것이다(Luckett 1999; Korsinczky, 2001; Mulvenna 2005). 보우만 빌크 억제자에서 보존되고 상기 SFTI 분자와 동일한 부분은 밑줄을 그었다: GRCTKSIPPICFPD. 4번째 위치의 트레오닌(threonine)을 제외하고, 밑줄 친 모든 부분은 상기 라이브러리를 제작하는 동안 유지되었다.
상기 라이브러리를 디자인할 때, 다음의 무작위 추출이 사용되었다:GOCO(R/K)OOPPOCOPD. 구조적인 이유로 다양화되지 못한 위치는 밑줄로 표시되었다. "O" 위치에서, 모두 20개의 자연계의 아미노산이 허용된 반면, P1 위치에서는 도식(R/K)으로 표시된 단지 두 개의 기본 아미노산만을 허용하였다. 우리의 첫 예에 근거하여, 우리는 상기 기울림꼴 부분이 단백질 분해효소와 접촉하지 않는다고 추정했기 때문에 이들을 다양화되지 않았다.
파지 디스플레이 동안에 높은-어피니티(affinity) 바인딩 분자를 분리하기 위하여, 디스플레이된 바인딩 분자는 각 파지 당 낮은 복제 수, 이상적으로는 하나의 복제(1가의 파지 디스플레이)에서 제공되어야 한다. 이러한 외견상의 높은-어피니티 바인딩(친화력)에 의해, 여러 개의 고정된 타겟 분자에 대해 동시에 바인딩하는 것을 피할 수 있다. 이를 위하여, 상기에 설명된 SFTI 라이브러리는 파지 단백질 p8에 연결되어 발현될 때 파지 당 하나의 복제로 나타나는, 키로트립신(chymotrypsin) 억제 분자에 융합되어 발현되는 것이 증명되었다(Szenthe 2007). 이것은 스키스토셀카 그레가리아 키모트립신(Schistocerca Gregaria Chymotrypsin Inhibitor (SGCI)) 억제자 (Malik, 1999)로, 우리의 예비 실험에서 상기 억제자는 MASP 효소를 억제하지 않으며, 이 효소에 바인딩조차 하지 않는다는 것을 설명했다.
또한, 상기 SFTI 라이브러리의 주어진 요소 및 SGCI 분자 사이에, 우리는 단클론 항체에 의해 인식될 수 있는 선형의 항원효소 택(tag)을 도입하였으며, 여기에서 상기 택과 상기 라이브러리의 주어진 요소 사이에 적절한 거리를 유지하는 펩티드 링크를 사용하였다. 두 가지 목적을 제공하는 이것은 소위 "플레그-택(flag-tag)"이다. 이 중 하나의 목적은 상기 파지 표면상에 상기 라이브러리의 전시를 용이하게 보여줄 수 있다는 것이었다. 나머지 목적은 택에 대한 항체를 사용하면서 대조군 선별의 결과로 획득된 클론을 시컨싱(sequencing)한 후에, 특정 타겟 효소, 즉 MASP1 및 MASP 2가 부족한 상태에서 획득된 서열의 클론을 발견하는 것이다. 이러한 방법으로, 상기 효소에서 수행된 선별 결과를 상기 항체로 선별된 그룹에 비교할 때, 실제로 효소의 바인딩에 기인할 수 있고 다른 영향의 결과(예, 보다 효율적인 생산)가 아닌, 전형적인 위치-의존적인 아미노산 선호가 밝혀질 수 있다.
[실시예]
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
하기 실시예는 파지플라스미드 시스템의 가능한 제조방법 (실시예 1), 라이브러리의 준비 (실시예 2), 파지 선별 (실시예 3) 및 그 결과 (실시예 4)를 나타낸다. 실시예 5에서는 펩티드 합성 및 이와 관련된 분석 테스트가 서술되어져 있다.
실시예 1: 파지플라스미드 시스템의 제조
1.1 파지플라스미드 벡터의 제조
첫 단계로, 상업적인 유통으로 이용할 수 있는 벡터로부터 출발하여 직접 파지플라스미드 벡터를 제조하였다. 이를 위하여 쿤켈 돌연변이(Kunkel, 1991)를 이용한 새로운 제한효소 절단위치를 만들어야만 한다.
1.1.1. 우라실(uracil)을 함유한 외가닥 쿤켈-주형의 준비
1.1.1.1. 형질전환
0.5 ㎕의 pBluescript II KS(-) 파지플라스미드 (Stratagene, cat#212208-51.1 ㎍/㎕, 2961 bp)
8 ㎕ KCM 용액 [0.5 M KCl; 0.15 M CaCl2 0.25 M MgCl]
31.5 ㎕ USP 증류수
40 ㎕ CJ236 K12 대장균 컴피턴트(competent) 세포
상기 형질전환체는 20 분 동안 얼음에서 배양된 후 10 분 동안 상온에서 배양된다. 형질전환체 부피의 10배인 800 ㎕의 LB 배지를 추가한 후, 37 ℃에서 30 분 동안 200 rpm으로 섞는다. 그 후, LB-암피실린 플레이트 상에서 37 ℃로 밤새 100 ㎕를 배양한다.
1.1.1.2. 감염
다음날 콜로니는 2 ml의 배지[LB; 100 ㎍/ml 암피실린(ampicillin), 30 ㎍/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)]에 접종되고, 37 ℃에서 밤새 200 rpm으로 섞인다. 그 후, 밤새 배양된 2 ㎕의 배양액은 상기 조성물의 배지 2 ml에 접종되고, 37 ℃에서 6 시간 동안 200 rpm으로 섞인다. 30 ㎕ M13KO7 헬퍼(helper) 파지 (NEB, cat#N0315S)에 감염된 후, 37 ℃에서 40 분 동안 200 rpm으로 섞인다. 발단 배양액 전부는 30 ml의 배지[2YT, 100 ㎍/ml 암피실린, 30 ㎍/ml 클로람페니콜]로 옮겨진다. 파지들은 배양액에서 37 ℃로 밤새 16-18 시간 동안 200 rpm 조건에서 배양되어 생산된다. 다음날 아침 상기 배양액은 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리된다. 상기 상등액은 깨끗한 튜브로 옮겨지고, 1/5 부피인 6 ml의 용액[2.5 M NaCl; 20% PEG-8000]을 첨가하고, 상온에서 20 분 동안 배양한 후, 상기 파지들은 용액에서부터 침전된다. 상기 침전물은 4 ℃에서 20 분 동안 10,000 rpm으로 원심분리되고, 상기 상등액은 제거된다. 상기 침전물은 800 ㎕의 PBS 버퍼에서 용해된다.
상기 외가닥 플라스미드는 Qiaprep Spin M13 키트 (Qiagen, cat#27704)를 사용한 상기 파지들로부터 얻어진다. 상기 키트에 첨부된 설명서에 따라 100 ㎕의 10배 희석된 EB 버퍼와 상기 컬럼으로부터 녹아서 분리된다. 상기 외가닥 플라스미드의 농도는 260nm에서 35배 희석도로 확인된다 (ssDNS OD260 nm = 1= 33 ng/㎕). 상기 절차에 의하여 얻어진 외가닥 우라실을 함유한 pKS-파지플라스미드 벡터의 농도는 407 ㎍/ml이다.
1.1.2. 쿤켈 돌연변이를 이용한 Nsi 및 NheI의 절단위치의 소개
1.1.2.1. 올리고스의 인산화반응
변이 프라이머:
Blue_NheI_in_779 (36mer, SEQ ID NO 8):
5'-cgcaattaaccctcagctagcggaacaaaagctggg-3'
Blue_NsiI_in_1089 (36mer, SEQ ID NO 9):
5'-ccgcctttgagtgagatgcatccgctcgccgcagcc-3'
?2 ㎕의 10 배 농축된 TM 버퍼 [0.5 M Tris-HCl; 0.1 M MgCl2 pH 7.5]
?2 ㎕의 10 mM ATP
?1 ㎕의 100 mM DTT
?1 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드인산화효소 (Fermentas, 10u/㎕)
?36 ng Blue_NheI 프라이머 (4 ㎕)/36 ng Blue_Nsi 프라이머 (3.5 ㎕)
?10 ㎕ USP 증류수/10.5 ㎕ USP 증류수
상기 각각의 두 개의 프라이머와 일어나는 두 가지 인산화 반응은 20 ㎕의 부피로 함께 합쳐지고, 37 ℃에서 45 분 동안 배양된다.
1.1.2.2. 올리고뉴클레오티드의 혼성화
상기 주형: 상기 프라이머들의 비율은 25 ㎕의 부피에서 1:3의 모랄 비율로 맞춘다.
?2.5 ㎕의 외가닥 쿤켈 주형 (1 ㎍)
?2 ㎕의 인산화된 Blue_NheI 프라이머
?2 ㎕ 인산화된 Blue_Nsi_프라이머
?2.5 ㎕의 10 배 농축된 TM 버퍼
?16 ㎕의 USP 증류수
상기 반응 혼합물은 90 ℃의 수조에서 1 분 동안 덥혀지고, 즉시 50 ℃의 서모스탯(thermostat)으로 3 분 동안 옮겨진다. 그 후, 짧은 시간 동안 원심분리되고, 얼음에 놓여진다.
1.1.2.3. 2중 가닥 생성물의 준비, 정제, 절단
올리고뉴클레오티드의 혼성화 이후, 제2 DNA 합성에 의하여 2중-가닥 생성물은 체외에서 생성된다. 그 중 하나의 가닥은 우라실을 함유하고 쿤켈 주형인 반면, 나머지 다른 가닥은 돌연변이를 함유하고, 프라이머의 연장에 의하여 제조되며, 우라실을 함유하지 않는다.
? 1 ㎕의 10 mM ATP
?1 ㎕의 25 mM dNTP
?1.5 ㎕의 100 mM DTT
?0.6 ㎕의 T4 리가아제 (NEB, 400 u/㎕)
?0.3 ㎕ T7 중합효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
상기 반응 혼합물은 14 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 혼합물 전체는 1%의 아가로오스 겔 상에서 진행되고, 설명서에 따라 Qiaquick Gel Extraction 키트 (Qiagen, cat#28704)에 의해 분리 및 정제된다. 상기 생성물은 30 ㎕의 EB 버퍼에서 녹아서 분리되고, 상기 언급된 설명서에 따라 대장균 XL1 Blue 컴피턴트 세포로 형질전환된다. 이러한 세포들은 우라실을 함유하는 상기 가닥으로 분해하고, 박테리아가 배양된 3 ml의 배양액에 주로 클론들이 존재하고, 상기 벡터는 우라실을 함유하지 않은 변이 서열의 복제를 통해 증식된다. 상기 2중-가닥 벡터는 50 ㎕ 의 EB 버퍼에서 Mini Plus Plasmid DNA Extraction system (Viogen, cat#GF2001) 키트를 이용하여 분리된다.
유전자 처리의 다음 단계에서, 상기 생성물은 25 ㎕의 새로 생성된 절단위치에서 절단된다.
? 20 ㎕의 벡터 미니 프렙 (miniprep)
? 2.5 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼 (Fermentas)
? 1.25 ㎕의 USP 증류수
? 0.50 ㎕의 NheI (Fermentas, 10 u/ml)
? 0.75 ㎕의 Nsi (Promega, 10 u/ml)
절단은 37 ℃에서 밤새 일어난다. 상기 생성물은 2%의 아가로오스 겔 상에서 전기영동을 이용하여 확인되고, 상기 절단된 플라스미드를 상기 언급한 방법을 이용하여 겔로부터 분리한 후, 키트에 의해 정제된다. 이러한 방법으로 얻어진 벡터의 이름은 pBlueKS_NheI_Nsi이다.
1.1.3. lacIq 유전자의 추가
1.1.3.1 PCR
상기 lacIq 유전자 및 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 시그널 배열은 PCR을 이용하여 상기 pMal-p2X 벡터 (NEB, cat# N8077S, 200 ㎍/ml)로부터 분리된다.
프라이머:
pMal_lac_forward (SEQ ID NO 10): 5'-gtcagtatgcatccgacaccatcgaatggtg-3'
pMal_NheI_rev (SEQ ID NO 11): 5'-gtcagtgctagcgccgaggcggaaaacatcatcg-3'
?5 ㎕의 10배 농축된 Pfu 버퍼
?0.4 ㎕의 25 mM dNTPs
?10 ㎕의 25 mM MgSO4
?0.5 ㎕의 pMal-p2X 주형
?0.5 ㎕의 5 μM pMal_lac_forward 프라이머
?0.5 ㎕의 5 μM pMal_NheI_rev 프라이머
?1 ㎕의 Pfu 중합효소 (Fermentas, 2,5 Wu/㎕)
?36.5 ㎕ USP 증류수
PCR 동안에 사용되는 프로그램:
95 ℃ 180s
95 ℃ 45s
65 ℃ 45s
72 ℃ 240s
72 ℃ 480s
2-4단계는 20번 반복된다.
1.1.3.2 절단
상기 생성물은 상기 명세서에 따라 GenElute PCR Clean Up 키트 (Sigma, cat#NA1020)를 이용하여 정제되고, 라이게이션을 가능하게 만드는 점착성 말단을 생성하기 위해서 제한효소에 의해서 37 ℃에서 밤새 절단된다.
?20 ㎕의 PCR 생성물 (lacIq 유전자)
?2.5 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼 (Fermentas)
?1 ㎕의 Nsi 효소 (=AvaIII, Fermentas, 10 u/㎕)
?0.5 ㎕ NheI 효소
상기 절단된 PCR 생성물은 상기 키트에 의하여 정제되고, 1%의 아가로오스 겔에서 확인되기 전에 준비된 파지플라스미드에 의해 절단되고 정제된다. 상기 결과는 도 2에 나타나 있고, 제1열은 절단된 pMal-p2X lacIq 유전자에 상응하고, 제2열은 pBlueKS_NheI_Nsi 벡터에 상응한다.
1.1.3.3. 라이게이션
2 ㎕의 절단된 pBlueKS_NheI_Nsi 벡터
6 ㎕의 절단된 pMal-p2X lacIq 유전자
1 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas,1 Weiss u/㎕)
라이게이션은 상온에서 2 시간 동안 달성된다. 그 후 라이게이션된 생성물은 40 ㎕의 상기 언급된 대장균 XL1 Blue 세포들로 형질전환된다. 100 ㎕의 형질전환된 생성물 [LB; 100 ㎍/ml 암피실린]은 한천평판상으로 퍼뜨려지고, 37 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 발단된 콜로니로부터 미니 프렙 배양액이 접종되고, 상기 플라스미드는 Viogen 키트를 이용하여 분리된다. 상기 라이게이션은 37 ℃에서 1 시간 동안 제한 절단과 함께 확인된다. 상기 EcoRI 효소를 위하여, 절단위치는 단지 상기 추가된 lacIq 유전자 내부에 있다.
?3.5 ㎕의 미니 프렙 생성물
?1 ㎕의 10배 농축된 EcoRI 버퍼
?0.26 ㎕의 EcoRI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?5.24 ㎕의 USP 증류수
1% 아가로오스 겔에 상에서 절단이 이루어졌음을 확인할 수 있고, 라이게이션이 성공적임을 확인할 수 있다. 상기 새로운 파지플라스미드 벡터의 이름은 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq이다.
1.1.4. 에피톱(epitope) 택 및 SGCI 부분의 삽입
1.1.4.1. PCR
에피톱 택으로 사용되는 상기 프래그(flag)-택의 아미노산 배열은 DYKDDDDK (SEQ ID NO 12)이다. 상기 SGCI 부분은 단백질 p8을 감싸기 위해 융합되고, 상기 에피토프 테그는 SGCI의 N-말단에 융합된다. 상기에서 언급하였듯이, 상기 SGCI의 존재로 1가의 발현을 알 수 있으므로, 하나의 파지는 하나의 라이브러리 구성 펩티드의 최대값을 표면상에서 보일 것이다.
프라이머:
pGP8-Tag-NheI (SEQ ID NO 13): 5'-gtcagtgctagcatcggattataaagacgatgac-3'
P8-XbaI-rev (SEQ ID NO 14): 5'-gtcagttctagattattagcttgctttcgaggtg-3'
?5 ㎕의 10배 농축된 Pfu 버퍼
?8 ㎕의 25 mM MgSO4
?0.4 ㎕의 25 mM dNTPs
?2 ㎕의 주형: pGP8-Tag-SGCI 벡터 (earlier construction)
?0.5 ㎕의 5 μM pGP8-테그-NheI 프라이머
?0.5 ㎕의 5 μM P8-XbaI-rev 프라이머
?1 ㎕의 Pfu 중합효소 (Fermentas, 2,5 u/㎕)
?36.2 ㎕의 USP 증류수
PCR 동안에 사용되는 프로그램:
95 ℃ 180s
95 ℃ 45s
60 ℃ 45s
72 ℃ 60s
72 ℃ 480s
2-4 단계는 25번 반복된다.
상기 PCR 생성물은 설명서에 따라 Sigma GenElute PCR Clean Up를 이용하여 정제된다.
1.1.4.2. 제한효소 절단
상기 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터는 상기 프래그텍-SGCI 부분의 라이게이션을 가능하게 하기 위하여 37 ℃에서 2 시간 동안 제한 효소에 의하여 절단된다.
?2.5 ㎕의 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 미니 프렙
?3.5 ㎕의 10배 농축된 Tango 버퍼
?1.5 ㎕의 XbaI (Fermentas, 10 u/㎕)
?1.5 ㎕의 NheI (Fermentas, 10 u/㎕)
?3.5 ㎕의 USP 증류수
상기 생성물은 1%의 아가로오스 겔로부터 분리되고, Viogen Gel-M 키트에 의하여 정제되며, 45 ㎕의 물에 녹여서 분리한다. 그 후, 상기 생성물은 37 ℃에서 45 분 동안 알칼리성 인산가수분해효소에 의하여 처리된다.
?43 ㎕의 겔로부터 분리되고, 절단된 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터
?1 ㎕의 Shrimp 알칼리성 인산가수분해효소 (SAP, Fermentas, 1 u/㎕)
?5 ㎕의 10배 농축된 SAP 버퍼
상기 인산가수분해효소는 65 ℃에서 15 분 동안 가열 배양된다.
1.1.4.3. 라이게이션 및 형질전환
상기 반응 혼합물을 준비하기 전, 상기 벡터 및 상기 인서트(insert)는 농도를 확인하기 위하여 1.8%의 아가로오스 겔 상에서 진행된다. 상기 결과는 도 3에 나타나 있다.
도에서 상기 독립된 열은 하기를 의미한다:
1. 6 ㎕의 1 kb DNA 사다리 (Fermentas);
2. 프래그택-SGCI-p8 PCR 생성물; 및
3. 절단되고, 정제된 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터.
상기 라이게이션을 위하여 상기 반응 혼합물 및 상기 조절된 생성물은 상온에서 90 분 동안 배양된다.
?2 ㎕의 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 벡터
?7 ㎕의 프래그테그-SGCI-p8 PCR 생성물
?1 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
?1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas, 1 Wu/㎕)
상기 라이게이션된 생성물은 상기에서 언급하였듯이, 대장균 XL1 Blue cells로 형질전환되고(transformed), 37 ℃에서 밤새 배양된다.
10개의 부분 표본 배지를 각각의 박테리아 콜로니와 함께 각각 3 ml 씩 접종한 후, 밤새 배양된 배양액은 준비되고, 2중-가닥 플라스미드가 분리된다. 상기 XbaI 및 NheI 효소에 의하여 발생된 상기 점착성(sticky) 말단은 서로 호환이 가능하므로, DNA 배열에 의하여 적절한 방향으로 인터그레이션(intergration)이 실현된 경우 상기 10개의 클론으로부터 분리되고, 상기 Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing 키트 (Applied Biosystems; cat#4336917) 시스템은 PCR-반응을 위하여 사용된다. 상기 배열은 BIOMI Kft. (Godollo)에 의해서 수행된다. 상기 10개의 샘플 중에서 2개의 샘플에서 우수한 인터그레이션이 발견되었다. 상기 새로운 벡터의 이름은 pKS-Tag-SGCI-p8이다.
1.1.5. Ser-Gly 어댑터(adapter)의 인터그레이션
1가의 발현을 위해서 library member-Ser/Gly/linker-Flagtag-SGCI-p8과 같은 기능적 단위의 배열이 제조된다. 이를 위해서, 상기 pKS-테그-SGCI-p8 벡터는 NheI 및 XhoI 효소에 의해서 잘리고, 이러한 단계의 결과 상기 원래의 프래그-택이 빠진다. 그 후, 상기 벡터는 Gly-Ser(GGSGGSGG, SEQ ID NO 15) 및 상기 플래그-택의 연결을 함유하는 어댑터와 라이게이션되고, 적절한 NheI 및 XhoI 점착성 말단과 함께 제공된다. 라이게이션을 확인하기 위하여, BamHI 절단위치는 상기 프래그-택의 내부에 만들어진다. 이러한 효소는 상기 적절한 라이게이션된 벡터의 2개의 위치로 잘리, 상기 제조된 생성물은 159 kb 길이이며, 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 측정할 수 있다.
?20 ㎕의 pKS-테그-SGCI-p8 벡터 미니 프랩
?3 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?2 ㎕의 XhoI (Fermentas, 10 u/㎕)
?5 ㎕의 USP 증류수
상기 벡터는 37 ℃에서 2 시간 동안 절단되고, 주어진 조건은 XhoI에게 이상적이지 않으므로, 상기 0.8%의 아가로오스 겔 상에서 절단이 완료되었는지 확인된다. 그 후, 1 ㎕ NheI 효소가 추가되고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양된다. 상기 생성물은 Viogen Gel-M 키트에 의하여 아가로오스 겔로부터 분리된다.
상기 연결자 및 프래그-택를 함유하는 어댑터들은 상기 절단된 벡터에 어닐레이트(anellate)된다.
어댑터:
Ser-Gly_forward (SEQ ID NO 16): 5'-ctagctggcgggtcgggtggatccggtggcgattataaagacgatgatgacaaac-3'
Ser-Gly_reverse (SEQ ID NO 17): 5'-tcgagtttgtcatcatcgtctttataatcgccaccggatccacccgacccgccag-3'
?15 ㎕의 절단된 pKS-테그-SGCI-p8 벡터
?2.8 ㎕의 1.3 ng/㎕ Ser-Gly_forward 프라이머
?1.7 ml의 2.2 ng/㎕ Ser-Gly_reverse 프라이머
상기 반응 혼합물은 90 ℃에서 1 분 동안 배양되고, 50 ℃에서 3 분 동안 배양되고, 짧은 시간 원심분리되며, 얼음에 놓인다. 라이게이션을 위하여 하기가 더해진다.
?2.2 ㎕의 10배 농축된 T4 리가아제 버퍼
?1 ㎕의 T4 리가아제 (Fermentas, 1 Weiss u/㎕)
라이게이션은 16 ℃에서 밤새 수행된다. 대장균 XL1 Blue 세포는 상기에서 언급하였듯이 형질전환되고, 상기 형질전환된 생성물 [LB; 100 mg/ml]은 플레이트 상으로 퍼진다. 상기 콜로니 스타터(starter)는 밤새 접종되고, Viogen Mini-M 키트에 의하여 미니 프랩 플라스미드는 상기 지시에 따라 정제된다. 상기 얻어진 샘플들은 Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing 키트를 이용하여 DNA-배열에 의하여 확인되고, 상기 PCR 생성물은 BIOMI Kft. (Godollo, 헝가리)에 의해서 수행된다.
상기 라이브러리는 이러한 방법에 의하여 제조된 파지프라스미드를 기초로 제조되며, 그 이름은 pKS-SG-Tag-SGCI-p8이다.
실시예 2: 파지 라이브러리의 준비
시컨싱으로 확인된 상기 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터는 프라이머로, 디제너레이트(degenerate)된 라이브러리 올리고 및 벡터-특정 올리고로 PCR하여, 주형으로 사용되었다. 이러한 방법으로 생성된 상기 PCR 생성물은 상기 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터와 융합된다.
2.1. PCR
2.1.1. 라이브러리 올리고
상기에서 언급하였듯이, 라이브러리를 계획한 경우 GOCO(R/K)OOPPOCOPD와 같은 무작위 스킴(scheme)이 사용된다. 상기 SFTI-라이브러리는 상기 존재하는 모든 20개의 아미노산을 허용하는 6 개의 선택된 위치("O" 위치)로 준비되고, P 위치에서는 단지 아르기닌 및 리신이 허용된다("R/K" 위치). 발생되지 않은 올리고뉴클레오티드와 관련된 IUPAC 코드를 이용하여 상기 라이브러리의 상기 올리고뉴클레오티드 배열은 하기와 같다(SEQ ID NO 19):
5'-CC GCC GCC TCG GCG CTA GCA GGT NNK TGT NNK ARA NNK NNK CCT CCG NNK TGT NNK CCG GAT GGC GGG TCG GGT GGA TCC GGT GG-3'
상기 펩티드의 부분적인 코딩은 밑줄이 그어져 있는 반면, 무작위 코돈은 진하게 표시되어 있다.
2.1.2 DNA 라이브러리의 준비
상기 라이브러리는 PCR을 이용하여 준비되고, 하나의 올리고는 융합하기 위한 라이브러리 구성을 수용하며, 다른 올리고는 일반적인 외부의 프라이머이다. 상기 전체 반응 혼합물은 300 ㎕ 씩 6개의 PCR 튜브로 나뉜다.
?30 ㎕의 10배 농축된 Taq 버퍼
?36 ㎕의 25 mM MgCl2
?2.4 ㎕의 25 mM dNTP
?15 ㎕의 13 μM SFTI-라이브러리 올리고뉴클레오티드
?22 ㎕의 10 μM pVIII 3' 프라이머
?9 ㎕ (450 ng)의 pKS-SG-테그-SGCI-p8 주형
?180.6 ㎕의 USP 증류수
?5 ㎕의 Taq 중합효소 (Fermentas, 5 u/㎕)
상기 프로그램:
1. 95 ℃ 60s
2. 95 ℃ 30s
3. 50 ℃ 30s
4. 72 ℃ 60s
5. 72 ℃ 120s
상기 2-4 단계는 15번 반복한다.
상기 PCR 생성물은 1.5%의 아가로오스 겔 상에서 확인되고, 상기 프라이머를 제거하기 위하여 ExoI 효소에 의하여 절단된다. 37 ℃에서 45 분 동안 하나의 튜브당 1 ㎕의 ExoI 효소와 함께 배양되고, 80 ℃에서 비활성화된다. 호모듀플랙스(homoduplex)를 증가시키기 위하여 짧은 중합 사이클이 삽입되고, 상기 프라이머는 일반적으로 외부 프라이머로 사용된다.
pVIII 3' (SEQ ID NO 18): 5'-gctagttattgctcagcggtggcttgctttcgaggtgaatttc-3'
각각의 튜브에 하기가 더해진다:
?2.5 ㎕의 2,5 mM dNTP
?1 ㎕의 100 μM pVIII 3' 프라이머
?0.8 ㎕의 Taq 중합효소 (Fermentas, 5 u/㎕)
상기 프로그램은 상기 PCR의 경우와 동일하지만, 단지 2 사이클만 수행된다.
상기 생성물은 다시 1.5%의 아가로오스 겔 상에서 확인되고, ExoI 효소에 의해 절단되며, 상기 6개의 PCR 튜브의 성분은 설명서에 따라 3개의 칼럼 상에서 Sigma PCR Clean up 키트에 의해 정제된다. 용리는 52 ㎕/column의 부피에서, 10배 희석된 EB 버퍼에서 일어난다.
2.2 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 파지플라스미드 벡터에서 DNA 라이브러리의 인터그레이션
2.2.1 절단
상기 벡터 및 상기 DNA 라이브러리는 두 단계로 절단되는데, 첫 번째는 NheI 효소에 의해 절단된다. DNA 라이브러리의 절단 단계 중에 분리된 불필요한 부분은 상기 생성물과 완전히 동일한 크기이기 때문에 상기 반응 혼합물로부터 제거되지 못한다. 상기 벡터로 이러한 조각이 들어가는 것을 방지하기 위해서, 상기 첫 번째 절단 단계에서 SacI 효소 또한 추가된다. 상기 불필요한 부분의 말단 근처에서 정제에 의해서 제거될 수 있는 작은 조각이 분리되고, 남아있는 상기 큰 조각은 상기 SacI의 점착성 말단에 의해 라이게이션되지 못한다. 배양은 37 ℃에서 8 시간 동안 밤새 수행된다.
?93 ㎕의 pKS-SG-테그-SGCI-p8 벡터 (40 ㎍)
?15 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?4 ㎕의 NheI 효소(Fermentas, 10 u/㎕)
?38 ㎕의 USP 증류수
(V = 150 ㎕)
?35 ㎕의 DNA-라이브러리 PCR 생성물
?15 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
?4 ㎕의 NheI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?4 ㎕의 SacI 효소 (Fermentas, 10 u/㎕)
?38 ㎕의 USP 증류수
(V = 150 ㎕)
하기에서, 다른 점착성 말단에서 생성된 두 배의 상기 Acc651 (=KpnI) 효소가 더해진다. 상기 Tango 버퍼의 농도 역시 두배이다.
상기 절단된 pKS-SG-Tag-SGCI-p8 벡터:
?8 ㎕의 Acc651 (Fermentas, 10 u/㎕)
?19.8 ㎕의 10배 농축된 Tango 버퍼
상기 절단된 DNA-라이브러리:
?8 ㎕의 Acc651 (Fermentas, 10 u/㎕)
?11 ㎕의 10배 농축된 Y Tango 버퍼
2.2.2 라이게이션
먼저 절단된 생성물 모두 겔로부터 분리된다. 상기 벡터는 0.8%의 아가로오스 겔로부터 분리되고, 6개의 튜브로 나뉘어, 6개의 컬럼에서 Viogen Gel-M 키트를 이용하여 정제된다. 상기 DNA-라이브러리는 1.8% 겔로부터 분리되고, 3개의 컬럼에서 정제된다 (도 4). 도에 나타난 상기 겔 영상의 열은 다음을 의미한다:
1. 1 ㎕의 100 bp DNA 래더(ladder)
2. 1 ㎕의 정제된 DNA-라이브러리
3. 1 ㎕의 정제된 벡터
4. 5 ㎕의 1 kb DNA 래더
모든 샘플들은 라이게이션을 위하여 사용되었으며, 6개의 튜브로 나뉘어져 16 ℃에서 18 시간 동안 배양되었다:
?210 ml의 정제된 pKS-SG-테그-SGCI-p8 벡터
?100 ml의 정제된 SFTI DNA-라이브러리
?2 ml의 T4 리가아제 (NEB, 400,000 ul/ml)
?35 ml의 USP 증류수
상기 생성물은 Qiagen Gel Elute 키트에 의해 정제되고, 컬럼 상에서 단지 정제된 겔로부터 분리되지 않는다. 용리는 2 x 60 ㎕의 USP 증류수에서 수행된다.
2.3 파지 라이브러리의 전기영동, 증식
상기 라이브러리는 전기영동을 경유하여 상기 슈퍼컴피턴트(supercompetent) 세포에 도입된다. 상기 플라스미드를 가능한 많은 세포에 도입하여 라이브러리는 108-109 조각들을 함유한다.
USP 증류수에 존재하고 염이 존재하지 않는 상기 DNA 라이브러리는 2 x 350 ml의 슈퍼수용성 세포에 더해진다. 상기 조작은 하기 프로토콜에 따라서 직경이 0.2 cm인 큐벳(cuvette)에 의해 수행된다: 2.5 kV, 200 ohm, 25 ㎌.
전기영동 후, 상기 세포들은 조심스럽게 2 x 25 ml SOC 배지로 옮겨지고, 37 ℃에서 30 분 동안 100 rpm으로 배양되어 샘플이 얻어진다. 배양은 희석되고, [LB], [LB; 100 ㎍/ml 암피실린] 및 [LB; 10 ㎍/ml 테트라사이클린] 플레이트로 떨어지며, 37 ℃에서 밤새 배양된다. 상기 같은 절차는 비-전기 영동된 조절 생성물 및 물에 의해 전기 영동된 조절 생성물의 경우에도 적용된다. 샘플을 얻은 후, 상기 2 x 25 ml 배지액은 2 x 250 ㎕의 M13KO7 헬퍼 파지에 의해 감염되고, 37 ℃에서 30 분 동안 220 rpm으로 섞이며, 전체 생성물이 접종된다. 상기 2 x 250 ml [2YT; 100 ㎍/ml ampicillin; 30 ㎍/ml kanamycin] 배지액은 37 ℃에서 18 시간 동안 220 rpm으로 2개의 2-리터 플라스크에서 배양된다.
상기 적정에 기초하여 라이브러리 1.2 x 109개의 변종을 함유한다.
실시예 3: 파지 선택
하기의 본 실시예에서, 상기 실시예들에 따라 MASP-1 및 MASP-2 적중 효소에 구축된 라이브러리의 선택에 대하여 설명한다.
3.1 표적 효소
인간 MASP-표적들은 하나의 세린-프로테아제(SP) 영역 및 두개의 보체 조절 단백질 영역(CCP-1,-2) (Gal 2007)으로 이루어진다. 이것들은 전체 분자의 촉매 활동을 이끄는 재조합 파편 물질들이다. 상기 단백질은 생물학적 활동을 가진 형태가 복원에 의해 얻어지는 것으로부터 봉입체의 형태로 생산된다. 정제는 음이온 및 양이온 교환분리에 의하여 수행된다. 상기 단백질의 활동은 용액에서 ELISA 판에 연결된 형태로 평가된다. 생산은 다른 연구에서 자세하게 묘사된다. (Ambrus 2003)
선택하는 동안 사용된 표적들의 데이터:
MASP-1 CCP1-CCP2-SP: Mw = 45478 Da, cstock=0.58g/l(이하 MASP-1).
MASP-2 CCP1-CCP2-SP: Mw = 44017 Da, cstock=0.45g/l(이하 MASP-2)
안티-플래그택 항체 (Anti-Flagtag antibody): cstock=4g/l,(시그마, 입에서 생산되는 단일클론 안티-플래그 M2 항체, cat# F3165)
3.2 선택 단계들
3.2.1 파지의 분리
2.3 장에서 묘사된 조작의 끝에서, 파지는 18시간 동안 2 x 250 ml의 배양에서 생산된다. 선택의 제1단계에서 파지는 전시를 위한 라이브러리로 즉시 사용되기 위해 고립된다.
세포 배양은 4 ℃에서 10분 동안 8,000rpm으로 원심 분리되었다. 박테리오파지를 함유하는 상층액(supernatant)은 깨끗한 원심분리 관에 주입되고, 상층액 부피의 1/5의 침전제가 가해졌다[2.5 M NaCl; 20% PEG-8000]. 침전은 상온에서 20분 동안 발생한다. 그런 다음 4 ℃에서 15분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상기 상층액은 폐기되고, 다시 짧은 시간 동안 원심분리되었으며, 잔류액은 피펫으로 옮겨졌다. 흰색의 파지 침전물은 25ml의 [PBS; 5 mg/ml BSA; 0.05% Tween-20] 버퍼에 용해된다. 있을 수 있는 세포 파편들을 제거하기 위하여, 다시 원심분리되었고, 상층액이 깨끗한 관내로 이동하였다.
3.2.2 제1 선택 사이클
a) 고정: 표적 분자는 96-웰(well, Nunc Maxisorp) ELISA 판 (cat#442404)에 고정되었다. 고정되는 동안 MASP-1 및 MASP -2의 농도는 20 ㎍/ml이고, 안티-플래그택 항체의 농도는 2 ㎍/ml이다. 단백질은 고정 버퍼[200 mM Na2CO3;pH9.4]에 희석되고, 100 ㎕이 웰 내로 주입된다. 고정의 시간은 단백질마다 최적화된다. MASP-1는 60분 동안 실온에서 110 rev/min로 혼합되는 동안 배양되었고, 상기 항체는 30분 동안 배양되었으며, MASP-2는 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 본 제1 선택 사이클에서 표적마다 12개의 웰이 사용되었다. 모든 두 번째 열은 빈 채로 남겨두었다. 이 열은 나중에 표적 단백질로 덮이는 것과 같은 방식으로 처리된다.
b) 차단: 상기 고정 용액이 제거되고, 200 ㎕/well의 차단 버퍼[PBS; 5 mg/ml BSA]가 판 안으로 주입된다. 그것은 150 rev/min으로 혼합되는 동안, 실온에서 적어도 1시간 동안 배양되었다.
c) 세척: 상기 ELISA-판은 세척 버퍼[PBS; 0.05% Tween-20] 1 L로 4번 세척되었다.
d) 선택: 위에서 언급되어 있는 분리된 라이브러리의 파지는 피펫을 통해 각 웰마다 100 ㎕의 부피로 상기 판으로 옮겨진다. 그것은 150 rev/min으로 혼합되는 동안, 실온에서 적어도 2.5시간 동안 배양되었다.
e) E. coli XL1 블루 배양: 상기 선택시 XLI 블루 세포들이 접종 루프를 사용하여 미리 새롭게 선택된 판으로부터 2 x 30 ml [2YT; 10 ㎍/ml tetracycline] 의 배지 속으로 접종되었다. 이 세포들은 표적 단백질로부터 용출된 파지를 가지고 추후에 감염될 것이다. 감염 시점에 상기 세포들은 기하급수적 성장 상태에 있어야 한다. OD600nm가 0.3-0.5인 배양액이 필요하고, 상기 배양액은 37 ℃, 220 rpm에서 2-3 시간 동안 그것을 성장시킴으로써 얻어진다.
f) 세척: 상기 ELISA-판은 세척 버퍼 3 리터로 12번 세척되었다.
g) 용출: 용출은 100 mM HCl 용액, 100 ㎕/well로 수행되었다. 산이 가해지고, 5분 동안 흔든 다음 각 웰로부터 차례로 인출되었다. 각각의 표적 단백질로부터 용출된 상기 파지는 관에 채집되었으며, 상기 관에는 12 x 15 ㎕의 1 M 트리스-베이스 버퍼가 상기 파지를 함유하는 산성 용액을 빠르게 중화시키기 위하여 미리 가해져 있다. 상기 관은 즉시 혼합되고 얼음 위에 위치한다.
h) 감염: 기하급수적 성장 상태에서 4.5 ml의 XL1 블루 배양액이 평가 튜브 내로 주입되고, 그것은 표적 단백질로부터 용출된 파지 용액 500 ㎕에 의해 감염되었다. 총 4회의 감염이 MASP-1 및 MASP-2로부터, 상기 항체로부터, 그리고 음성 조절 물질로부터 용출된 파지를 가지고 수행되었다. 상기 배양액은 37 ℃, 220 rpm로 30분 동안 배양되었다.
i) 적정: 20 ㎕의 샘플이 각각의 감염된 배양액으로부터 추출되고, 샘플 부피의 10배의 2YT 배지로 희석되었으며, 염기서열이 10배의 추가 희석을 통해 준비되었다. 각 지점으로부터 10 ㎕ [LB; 100 ㎍/ml ampicillin]이 판 위에 떨어뜨려지고 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장하였다.
j) 헬퍼 파지에 의한 감염: 샘플 채취 직후, 50 ㎕ M13KO7 헬퍼 파지가 평가 튜브 내에서 각 배양액에 가해졌고, 추가 30분 동안 배양되었다.
k) 모든 감염된 배양액들은 3 x 200 ml의 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 30 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)] 배지 내로 이동되었고, 220 rpm으로 혼합하는 동안 37 ℃에서 18 시간 동안 배양되었다. 상기 조절 물질은 더 이상 취급되지 않고 적정에서만 필요하다.
l) 농축: 다음에 아침 적정이 이루어지고, 단지 하나의 선택 사이클 이후에 조절 물질과 비교하여 큰 차이점이 탐지될 수 있다. 상기 항체로부터 용출된 파지의 수는 백그라운드의 용출된 파지의 수보다 4만큼 높고, MASP의 경우에는 1-1.5 차이가 난다.
3.2.3. 제2 선택 사이클
이 사이클에서, 제1 선택 사이클의 경우와 마찬가지의 동일 단계들이 반복된다. 그러나 차단 및 세척 버퍼에서 2 mg/ml의 카세인(casein) (피어스, cat#37528)이 BSA 대신 사용되었다. 이러한 수정에 의하여 BSA에 결합하는 파지의 증식을 피할 수 있다. 이 단계에서, 각각의 표적 단백질은 고유의 조절 물질 (12개의 웰)을 가지고, 이전 사이클에서 용출되고 증식된 파지는 각각의 표적 단백질에 위치한다.
18시간 동안 생산된 상기 파지는 위에서 언급한 바와 같이 분리되나, 마지막에 10 ml의 살균 PBS 버퍼에 용해되었다. 상기 파지 용액의 농도는 268 nm에서 측정된 다음, [PBS; 2 mg/ml casein; 0.05% Tween-20] 버퍼에 희석되어 각각이 균일한 OD 268값 0.5를 가지게 되며, 이는 그것들이 어떻게 도입 단계에서 사용되는지에 관한 것이다. 상기 제2 선택 사이클 후에 2.7 ml의 새롭게 기하급수적으로 증가하는 XL1 블루 세포들이 300 ㎕의 용출 파지에 의해 감염되었다. 적정은 총 6번(표적 단백질 3번 + 조절 물질 3번) 수행되었고, 헬퍼 파지에 의해 또한 감염된 상기 배양액은 30 ml의 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 30 ㎍/ml 카나마이신] 배지 속으로 투입되었다.
상기 제2 선택 사이클 이후에 상기 안티-플래그택 항체에 있어서 104배, MASP-1는 10배, MASP-2는 20배의 농축을 달성하였다.
3.2.4 제3 선택 사이클
모든 단계가 제2 사이클의 경우와 동일한 방식으로 수행되고, 카세인이 마찬가지로 버퍼 내에 유지된다. 분리 후에 파지는 2.8 ml의 살균 PBS에 용해되고, 전시를 위해 OD268~0.5로 희석되었다.
본 제3 선택 사이클 이후에, 상기 조절 물질과 비교하여 막대한 농축 값이 얻어졌다. 안티-플래그택 항체에서는 105배, MASP-s 모두에서는 104배 차이가 발생하였다.
3.3. 파지 ELISA 분석을 이용한 각각의 클론 테스트
이 테스트에서, 백그라운드에서는 신호를 나타내지는 못하지만, 선택된 각각의 클론들의 어떠한 부분이 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는지 시험하였다.
a) 감염: MASP-1 및 MASP-2의 경우에, 선택 사이클 2 및 3으로부터 용출된 파지 10 ㎕가 기하급수적 상태의 XL1 블루 배양액 90 ㎕에 가해졌다. 220 rpm에서 혼합되는 동안 37 ℃에서 30분 동안 배양되었고, 그 다음 20 ㎕ 양이 추출되고 180 ㎕의 2YT 배지가 가해졌다. 이러한 10배 희석과정은 2번 이상 반복되었다. 각각의 희석 시컨스로부터 [LB; 100 ㎍/ml ampicillin] 판들에 100 ㎕를 바르고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 파지는 상기 제1 선택 사이클로부터 용출된 상기 안티-플래그택 항체가 처음으로 희석되었고, 그 직후에 감염된 세포가 되었다. 이것의 이유는 상기 항체가 상기 ELISA 판의 표면에 훨씬 잘 고정되어 훨씬 많은 파지가 용출될 수 있기 때문이다. 높은 파지 농도에 의하여, 몇 개의 파지에 의해 하나의 세포가 감염되는 위험이 있고, 이는 엇갈리고 이해할 수 없는 시컨스를 초래한다.
b) 주입: 이른바 "싱글 루스(single loose)" 튜브 내로, 500 ㎕의 배지 [2YT; 100 ㎍/ml 암피실린; 50 ㎕ M13KO7 헬퍼 파지] 내로, 각각의 군락들이 접종되었다. 이러한 튜브들은 96-웰 ELISA-판 배열과 유사하게 배열되고, 300 rev/min로 혼합하는 동안 37 ℃에서 개별적으로 판 인큐베이터 내에서 움직이고, 소-부피 배양액 생산에 적합하다.
c) 고정: MASP-1 및 MASP-2 단백질은, 상기 안티-플래그태그 항체가 1 ㎍/ml의 농도일 때, 0.01 ㎍/㎕의 농도, 100 ㎕/well 의 부피로, 선택과 관련하여 위에서 설명한 바와 같이, 눈크(Nunc) ELISA 막시솔프(Maxisorp) 판에 고정되었다. 각각의 클론은 고유의 표적 단백질, 백그라운드 및 안티-플래그태그 항체에서 테스트되었다.
d) 18시간 뒤에 상기 튜브들은 2,500 rpm, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리기 내에서 원심분리되고, 상층액이 피펫을 통해 깨끗한 튜브 내로 옮겨졌다. ELISA 분석 후에 잔류 상층액은 65 ℃에서 2시간 동안 가열되었고, 그 후 -20 ℃에 저장될 수 있고, 시컨싱에 사용될 수 있다.
e) 차단: 상기 용액은 고정 샘플로부터 제거되었고, 200 ㎕/웰의 [PBS; 2 mg/ml 카세인] 차단 버퍼가 각각의 웰에 주입되었다. 배양은 150 rev/min로 혼합하는 동안 실온에서 적어도 1시간 동안 일어났다.
f) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1 리터로 4번 세척되었다.
g) 파지 적용: 위에서 설명한 바와 같이 생산되고 분리된 상기 파지들은 [PBS; 2 mg/ml 카세인; 0.05% Tween-20] 버퍼를 사용하여 2배로 희석되었고, 100 ㎕가 웰에 주입되었다. 동일 클론으로부터 샘플들이 피펫을 통하여 총 3개의 웰 내로 주입되었다. 배양은 110 rev/분으로 혼합하는 동안 실온에서 1시간 동안 일어났다.
h) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1.5 리터로 6번 세척되었다.
i) 안티-M13 항체: [PBS; 2 mg/ml 카세인; 0,05% Tween-20] 버퍼 내에 10,000 배로 희석된, 단일항체 안티-M13 HRP 공액 항체(Amersham, cat#27-9421-01) 100 ㎕가 웰로 주입되었고, 그 다음 110 rev/분으로 혼합하는 동안 실온에서 30분 동안 배양되었다.
j) 세척: 상기 판은 세척 버퍼 1.5 리터로 6번 세척된 다음 PBS로 2번 세척되었다.
k) 발달: USP 로 2배로 희석된 1-단계 울트라 TMB-ELISA 기질 (Pierce, cat#34028) 100 ㎕가 각각의 웰에 주입되었고, 잠시 흔들어 준 다음 각 웰에 1 M HCl 50 ㎕를 가함으로써 반응이 중지되었다.
l) 판독: 바이오트랙 II (Amersham) 플레이트 판독 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도가 측정되었다.
백그라운드의 강도가 낮고, 자신의 표적 단백질에 적어도 3배 이상의 강력한 신호를 표시하는 파지 상층액으로부터 샘플을 채취하였고, 상기 샘플들을 DNA 시컨싱을 위하여 준비하였다. 2 ㎕의 상층액을 사용하였고, PCR 반응을 위하여 빅 다이 터미네이터 3.1 버전 사이클 시컨싱 키트(Applied Biosystems; cat#4336917) 시스템을 사용하였다. 그것은 BIOMI Kft. (Godollo)에 의하여 작동된다.
서열 해석 후, MASP들의 경우에 제3 사이클에서 단지 몇몇의 개개의 서열들이 발견되었고, 단지 몇 개의 유형만이 농축되었으므로 제2 선택 사이클로부터 보다 많은 클론들이 선택되고 테스트되어야 하는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 목적은 표적 단백질의 아미노산 선호에 대한 패턴을 구축할 수 있도록 가능한 한 다양하게 수많은 서열을 수집하는 것이다.
실시예 4: 결과
본 실시예에서는 실시예 1-3에서 언급된 테스트 결과를 설명하며, 서열이 얻어진다.
MASP-1에서 용출된 파지로부터, ELISA를 사용하여 32개의 클론들을 테스트하였고, 결국 9개의 각각의 서열들을 발견하였다. MASP-2의 경우에는 80개의 ELISA 지점으로부터 21개의 각각의 서열들을 얻었으며, 안티-플래그택 항체의 경우에는 72개의 테스트된 클론으로부터 57개의 해석 가능한 서열을 얻었다.
결과를 해석할 때, 표시-오차 효과를 고려해야 했다. DNA 라이브러리 구축에 사용되는 NNK 코돈이 각각의 아미노산를 위한 동일한 빈도를 보장하지 않기 때문에 이를 위한 하나의 방법으로 코돈 표준화를 사용한다. 보다 이상적인 다른 접근법은 항체로부터 선택된 서열 데이터로부터 표준화하는 것이다. 이론적으로 가능한 서열 유형들 중 일부는 실현 가능한 구축을 가져오지 않거나, 파지에 너무나 큰 부담을 주게 되므로, 모든 이론적으로 가능한 서열 유형들이 상기 파지 표면에 표시되는 것은 아니다. 그러나, 상기 항체로부터 실제로 발생한 서열들을 얻게 되고, 상기 서열들은 표적 단백질에 수행된 선택의 초기 단계에서 나타나고, MASP들에 특정 양식은 이로부터 얻어진다.
데이터 표준화 후에, 본 발명자들은 인터넷 사이트 (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi; Crooks 2004 and Schneider 1990)에서 접속 가능한 웹로고의 도움으로 상기 서열들에 대한 서열 로고 다이어그램을 만들었다. 본 발명자들은 각각의 위치에서 원하는 아미노산 및 그것들이 MASP-1 또는 MASP-2로부터 유래되었는지에 여부에 따라 서로 어떻게 분화되는지에 대하여 시험하였다. 본 발명자들은 또한 우리의 데이터를 프레임으로 제공되고, 소의 트립신의 보조나노분자 억제제인 야생-타입 SFTI의 서열과 비교하였다.
각각의 클론들은 위에서 언급한 ELISA 시스템 내에서, 백그라운드로서 사용된 BSA에서, 그들의 표적으로 사용되는 고유의 단백질에서 검사되었고, 또한 가능한 교차 반응을 알아보기 위하여 다른 MASP 분자에서 검사되었다. 상기 결과에 근거하여 서열들은 3개의 그룹으로 분류될 수 있다.
a) MASP-2로부터 선택되고, MASP-2에 특유한 서열들
b) MASP-2로부터 선택되고, MASP-1도 인지하는 서열들
c) MASP-1으로부터 선택되고, MASP-2도 인지하는 서열들
본 발명자들은 특별히 MASP-1만 인지하는 그룹을 발견하지 못하였다. 상기 비-선택 그룹들(b 및 c)은 매우 유사한 경향을 나타내었고, MASP 표적에 관계없이 선택되었다. 상기 서열 로고 다이어그램의 수평축에서 각각의 위치의 수를 볼 수 있으며, 위치 5에 대응하는 P1 사이트를 볼 수 있다. 상기 서열 로고 다이어그램은 도 5에 도시되며, 도면의 숫자(5.a; 5.b 및 5.c)는 같은 순서로 a), b) 및 c)로 표시된 그룹들의 서열 로고 다이어그램에 관한 것이다. 각각의 위치에서 상기 로고의 컬럼 높이는 요소(우리의 경우 20가지의 다른 아미노산 유형) 발생빈도를 나타낸다. 이러한 발생이 적을수록 컬럼은 높아진다. 완전히 균등한 경우(모든 20개의 아미노산이 5%의 비율로 발생) 높이는 0이다. 최대 값은 오직 한 유형의 요소(아미노산)가 발생할 때의 경우에 속한다. 상기 컬럼 내에 각각의 아미노산들은 발생빈도에 근거하여 배열되고, 가장 빈번한 것이 상단에 위치한다. 아미노산을 나타내는 글자의 높이는 주어진 위치에서의 상대적인 발생빈도에 비례한다.(예를 들어, 50%의 발생빈도의 경우, 컬럼의 높이는 절반임) 컬러 다이어그램의 경우, 일반적으로 유사한 화학적 성질을 가지는 아미노산들은 동일 또는 유사한 색깔로 나타내어지고, 본 특허 명세서에 속하는 도면들에서는 다른 회색그림자를 사용하였다.
상기 로고 다이어그램의 도움으로 선택 및 비-선택적인 그룹들의 일치 서열을 결정하였고, 선택에서 유래된 클론 이름에 근거하여 M2-6E 및 M2-4G 펩티드로 명명하였으며, 그것들의 활동을 반영하는 그것들의 이름은 "S" 펩티드(선택적의 S) 또는 "NS" 펩티드 (비선택적의 NS)이다.(하기 참조)
MASP-2 선택적 M2-6E 클론 (SEQ ID NO 2):
"S" 펩티드 GYCSRSYPPVCIPD
비선택적 M2-4G 클론 (SEQ ID NO 3):
"NS" 펩티드 GICSRSLPPICIPD
상기 펩티드, 및 그들의 점 돌연변이와 순환변종은 고상 펩티드 합성을 통해 생산되었다. 상기 합성 및 펩티드 분석 테스트는 실시예 5에서 설명된다.
실시예 5: 펩티드 합성 및 분석
5.1 펩티드 제조, 복원 및 품질검사
펩티드들은 표준 Fmoc (N-(9-플루오레닐(fluorenyl)) 메톡시 카보닐(methoxy carbonyl)) 절차(Atherton 1989)를 사용하는 고상 펩티드 합성을 통해 생산되었다. 운반체로부터의 분리 및 보호기의 동시 제거는 라디칼-추적제로서 1.2-에탄싸이올(ethanedithiol), 싸이오에니솔(thioanisole), 물 및 페놀의 존재 하에서 TFA (trifluoroacetic acid(트리플루오로아세트산)) 방법을 사용하여 수행되었다. 거의 다 건조될 때까지 용액을 증발시킨 후에, 생성물은 차가운 다이에틸 에테르를 사용하여 침전되었다. 물속에서 상기 침전물의 용해 후에, 휘발성 물질들은 냉동건조(lyophilisation)에 의해 제거되었다. 복원을 위해, 펩티드의 2개의 시스테이닐(cysteinyl) 측면 사슬 사이에서 이황화 결합을 만들어내고, 냉동 건조된 물질이 0.1 mg/ml의 농도에서 수용액에서 용해되었다. 산화는 연속적인 환기 외에 용액을 혼합함으로써 수행되었고, pH 값이 N,N-다이이소프로필(diisopropyl)-에틸아민(ethylamine)을 가함으로써 알칼리 값(8-9 사이)으로 유지되었다. 산화의 완전한 실현은 역-상(reversed-phase) HPLC 및 질량분석기를 사용하여 측정되었다. 95% 이상의 균일 형태로 산화된 물질의 분리 역시 역-상 HPLC 법으로 수행되었다.
M2-4G 펩티드의 경우, 상기 고리 형태가 또한 생산되고, 펩티드 결합이 선형 형태의 N말단 및 C말단 사이에서 형성된다. 고리화가 하기와 같이 수행되었다. 펩티드 합성은 펩티드가 1% TFA를 함유하는 DCM (dichloromethane) 용액을 사용하여 분리되는 곳으로부터, 2-ClTrt (2-chlorotrityl) 수지 위에서 이루어졌다. 그러한 조건하에서 측쇄 보호기는 펩티드에 남게 된다. 역-상 HPLC 절차를 사용하여, 분리된 펩티드를 정제한 후에, 선형 펩티드는 상기 펩티드의 최종 농도가 0.1 mM인 경우에 상당한 양의 DMF (dimethylformamide)를 사용하여 용해되었다. 그런 다음, 1.1 당량의 HATU((1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridine-3- oxid hexafluorophosphate) 및 3.0 당량의 DIPEA (diisopropylethylamine)이 가해졌다. 실온에서 30분 동안 용액을 혼합한 후에, 고리화 효율이 역-상 HPLC 절차 및 질량분석기를 사용하여 측정되었다. 고리화가 완료된 후에, 샘플은 증발되었고, 펩티드는 예비의 역-상 HPLC 절차를 사용하여 정제되었다.
각각의 분리된 펩티드에서 품질 검사가 질량분석 절차를 사용하여 수행되었다. 질량분석은 HP1100 타입 HPLC-ESI-MS 시스템, 유동-주입(flow-injection) 법으로 10 mM 암모늄-포르미에이트(ammonium-formiate), pH 3.5용액을 사용하여 이루어졌다. 상기 장치는 아래의 파라미터들로 설정되었다. 건조 기체 및 분무 기체는 질소이고, 건조 기체의 유속은 10 l/분이며, 온도는 300 ℃이었다. 분무 기체의 압력은 210 kPa이었고, 모세관 전압은 3500V이었다.
총 이온 전류(TIC) 크로마토그램은 300-2000 mass/전하의 범위로 양이온 설정에서 만들어졌다. 질량 데이터는 Agilent ChemStation 소프트웨어으로 측정되었다. 각각의 생성된 억제제의 이름, 서열 및 질량 데이터는 하기 표 1에 도시된다.
[표 1]
표 1: 화학적 합성에 따라 제조된, 본 발명에 따른 여러 펩티드 억제제의 이론상 및 측정된 분자 중량
표 1에 도시된 서열에서, 라이브러리 구축 중의 무작위로 뽑힌 위치는 밑줄로 표시되고, 와이드-타입(wild-type) SFTI 의 아미노산과 다른 아미노산이 있는 위치들은 굵은 글씨체로 표시되었다.
5.2. 합성 펩티드 기질로 Ki상수 결정
펩티드의 억제능력은 먼저 MASP 효소 및 트립신에서 측정되었다. MASP 효소 에서 가장 유망한 억제 데이터를 보여주고 있는 단지 두 개의 펩티드(추후 언급)의 억제능력은 트롬빈에서 또한 측정되었다.
5.2.1. MASP 효소로 측정
측정에 사용된 합성 기질은 10mM의 원액으로부터 준비되는 Z-L-Lys-SBzl 수산화나트륨(시그마, C3647)이다. 반응은 [20 mM HEPES; 145 mM NaCl; 5 mM CaCl2;0.05%Triton-X100]으로 구성되는 버퍼에서, 실온에서 1ml의 부피로 수행되었다. 상기 효소에 의해 갈라진 상기 기질은 2x 초과 용액에 존재하는 다이싸이오다이피리딘(ithiodipyridine) 예비 기질(알드리싸이올 -4, 시그마, cat#143057)과 함께 반응 내로 투입되었다. 이 방법에서 만들어진 색소포(chromophore) 그룹의 방출은 324nm에서 분광광도계로 관찰되었다. 희석 서열은 합성 펩티드로부터 준비되었고, 상기 효소가 이것에 가해졌으며, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 기질의 농도 및 측정시간의 길이는 효소가 10% 미만의 기질을 소비하는 조건으로 선택되었다. 측정 과정에서, 강력히 결합된 억제제의 특성으로 발달된 측정 방법이 사용되었다. (Empie, 1982) 반응의 초기 단계에서 그려진 직선의 경사는 억제되지 않은 효소 반응의 경우에서 얻어진 경사로 표준화되고, 상기 효소 양으로 곱해졌다. 이 결과로부터, 본 발명자들은 상기 억제제 농도의 함수로 표시되고, 하기식 1에 따라 그려진 자유 효소 농도를 얻었다:
[식 1]
E = y = E0-(E0+x+Ki-(((E0+x+Ki)^2)-4*E0*x)^(1/2))/2,
E는 자유(비억제) 효소 농도이고, E0는 초기 효소 농도이다. MASP-1 및 MASP-2 농도는 C1 억제제에 의한 적정으로 결정되었다. 상기 결과는 평행 측정의 평균으로 계산되었다. 상기 결과는 하기 5.3의 표 2에 요약되었다.
5.3. 트립신 및 트롬빈에서의 측정
2개의 일치 펩티드들, 즉 M2-6E and M2-4G는 가장 유망한 MASP-2 및 MASP-1 억제제로 판명되었고, 본 발명자들은 그들의 트립신 및 트롬빈 억제 능력의 관점에서 초기 SFTI 분자에 그것들을 비교함으로써 그것들을 특성 짓는 것을 계속하였다. 트립신 억제를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 위에서 언급된 측정 조건을 사용하였고, 트립신의 활동이 억제제 펩티드 농도의 함수로 Z-L-Lys-SBzl 수산화나트륨 기질에서 측정되었다. 평가는 위에서 언급한 바와 같이 이루어졌다. MASP 효소는 혈액에서 생리학적 업무를 수행하고, 펩티드들을 사용하는 가능성은 혈청에 있는 다른 프로테아제의 활동의 효과에 따라 결정된다. 본 발명자들은 유사한 조건에서 혈액 응고의 중심 효소인 트롬빈을 Z-Gly-Pro-Arg-pNa 기질과 함께 시험하였다. P-니트로아닐라이드(nitroanilide)는 예비 기질을 필요로 하지 않고, 생성물의 제조는 분광광도계로 405nm에서 직접 관찰되었다. 좁은 큐벳에서 측정되는 부피는 350 ㎕이고, 상기 기질의 농도는 505 μM이었다. 트롬빈은 다른 억제제 농도로 실온에서 20분 동안 배양되었다. 트롬빈의 양은 활성-지점(active-site) 적정법을 사용하여 결정되었다. 평가는 위에서 언급한 바와 같이 이루어졌다. 그 결과는 하기 표 2에 요약되었다.
[표 2]
표 2: 각각의 억제제들의 효소 억제 요약표. 밑줄이 쳐지고 굵은 글씨로 보여지는 서열은 표 1과 동일한 의미를 가진다.
별도로 표시되지 않는 한, 상기 억제제는 열린 사슬을 가진다. 기호 "NG"는 억제가 가장 높은 억제제 농도를 사용한 경우에도 불구하고 측정되지 않은 것을 의미한다. 기호 "-"는 주어진 효소/억제제 쌍의 관점에서 측정이 수행되지 않음을 의미한다.
상기 데이터에 기초하여, 선택 펩티드(M2-6E, SEQ ID NO 2)는 MASP-2를 보다 더 억제하고, MASP-1에는 비활성이며, 트립신에서의 활동이 4등급 낮으며, 또한 트롬빈 억제제로서 매우 좋지 못하다. 이와는 반대로, 비선택 펩티드(M2-4G, cyclic SEQ ID NO 3)는 보다 일반적인 억제제의 특징을 나타낸다. 그것은 모든 4개의 단백질분해효소를 억제하고, 야생타입 SFTI-1보다 트립신에서 훨씬 약하다. 그것은 좋지 못한 트롬빈 억제제이나, 야생타입과 비교할 때 그것의 밀접성은 향상되었다.
5.4. 혈액 응고에서 펩티드의 효과
본 발명자들은 건강한 사람들로부터 채집된 혈액 혈장을 사용하여 혈액 응고 측정을 수행하였다. 정맥 천자(venipuncture)를 통해 얻어지고 소듐 구연산염(sodium citrate)으로 처리된 혈액으로부터 상기 혈장은 원심분리에 의해 분리된다.(2000 g, 15 분, Jouan CR412 원심분리기)
혈액 응고의 외부 경로를 테스트하는 프로트롬빈 시간(PT)은 Innovin 시약(Dale Behring, Marburg, 독일)을 사용하는 Sysmex CA-500 (Sysmex, 일본) 자동 시스템으로 측정되었다. 혈액 응고의 내부 경로를 테스트하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 및 트롬빈 조작을 직접 테스트하는 트롬빈 시간(TT)은 트리니크랏(TriniClot) 시약(Trinity Biotech, Wichlow, 아일랜드) 및 리아날(Reanal) 시약 (Reanal Finechemical, 헝가리)를 사용하는 Coag-A-Mate MAX (BioMerieux, 프랑스) 분석기로 측정되었다.
혈액 응고에서 펩티드의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 투여량 의존성(dose dependency)을 측정하였고, 그 결과는 도 6의 그래프에 도시된다. 각 도면에서, 꺽인 선들 사이의 영역은 정해진 측정과 관련하여 정상 범위를 나타낸다. 세로 좌표에서 시간은 초로 측정되고, 횡축에서 억제제 농도의 로그값이 μM 단위로 도시된다.
도 6.a는 혈장 응고(피브린 형성)가 상기 혈장에 트롬빈을 가함으로써 시작되는 과정에서 트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다. 외부적으로 가해진 트롬빈의 효과는 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다. 도 6.b는 혈장 응고(피브린 형성)가 상기 혈장에 조직 요인을 가함으로써 시작되는 과정에서 프로트롬빈 시간을 측정하는 실험을 도시한다. 그 결과 요인 VII의 활성화를 통하여 프로트롬비나아제 복합체 활성 트롬빈이 몇 단계에서 만들어진다. 이 실험에서, 외상(혈관 손상)의 결과로 활성화된 혈액 응고의 외부 경로가 모방된다. 조직 요인에 의해 개시된 단백질분해효소 캐스케이드의 일원은 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다. 도 6.c는 혈액 응고의 소위 "활성화 또는 본질적인 접촉" 경로를 모방하는 활성화된 트롬보플라스틴 시간을 측정하는 실험으로, 상기 혈액 응고는 혈액에서 콜라겐의 발생에 의하여 예를 들어 생리학적으로 발생한다. 본 실험에서는 콜라겐 대신에 예를 들어 카올린 파우더와 같은 큰 표면적의 물질을 가함으로써 실현된다. 이 결과, 요인 XII를 활성화시켜 단백질분해효소 캐스케이드가 다시 개시되고, 그 결과 프로트롬비나아제 복합체 활성화 트롬빈이 만들어진다. 이 단백질분해효소 캐스케이드의 일원은 증가하는 농도(횡축)에서 사용된 펩티드와 억제되고, 응고에 필요한 시간(종축)이 측정된다.
세 가지 모든 측정에서, 상기 농도가 200 μM인 경우에도 선택적인 "S" 펩티드는 정상범위 근처에 남아 있으므로, 상기 MASP-억제 양상으로부터 적절한 농도에서 응고를 억제하지 않는다. 200 μM인 경우 상기 비선택적 "NS" 펩티드가 극단적인 측정값에 도달하는 즉, 혈액 응고를 상당히 억제하는 것을 의미하는 것과 상반적이다. 이전 챕터에서 서술한 상기 데이터는 "NS" 펩티드가 Ki 값 10 μM에서 트롬빈을 억제한다는 것을 증명하고, 상기 실험에서 나타난 효과를 설명한다. 혈액 응고의 마지막 단계에서, 트롬빈은 피브린계 응고물에 의해 생성되는 피브리노겐을 분해하는 효소이다. 그래서 상기 트롬빈 자신의 억제는 혈액 응고의 억제에 충분히 효과적이다. 이러한 이유로, 상기 혈액 응고 실험에 기초하여, 상대적으로 바람직하게 트롬빈을 억제하는 상기 "NS" 펩티드 역시 상기 혈액 응고 케스케이드에서 기능적 양상으로부터 트롬빈을 선행하는 혈액 응고 요인(예를 들면, VIIA, IXa, Xa, XIa, XIIa)을 억제한다. 동시에, 세 가지 모든 실험에서 상기 선택적인 "S" 펩티드의 혈액 응고 상에서의 약한 효과는 이러한 펩티드는 상기 케스케이드의 초기 요소의 강한 억제자가 될 수 없음을 입증한다.
5.5 세 가지 보체활성 경로에 있어서 본원발명에 따른 펩티드의 효과
상기에서 자세히 서술하였듯이, 상기 보체계는 세 가지 경로를 통해 활성화 될 수 있으며, 동일한 단일 말단을 야기한다. 세 가지 활성 경로는 전형적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로를 포함한다. MASP-s는 렉틴 경로의 초기 단계의 효소이므로, 상기 렉틴 경로, 상기 다른 두 가지의 활성화 경로 및 상기 세 가지 경로가 만나는 단계에서 본원발명에 따른 상기 MASP 억제제의 효과를 아는 것이 중요하다.
측정을 위하여, 상기 보체 경로의 선별적인 측정을 위해 개발된 WIELISA 키트 (Euro-Diagnostica AB, COMPL300)를 상기 키트에 첨부된 사용 설명서에 기초하여 사용하였다. 측정의 원리는 상기 세 가지 활성 경로에 따라 현재 시험된 보체 활성 경로는 작동할 수 있는 반면 나머지 두 가지 경로에서는 불활성화되는 세 가지 측정 환경에서 사용한다. 동시에, 측정 동안에 탐지되는 상기 생성물은 경로-선택적 요소가 아니고, 상기 활성 경로의 공동 부분의 마지막 요소인 상기 C5-9 복합체이다.
측정을 위하여, 상기 혈액 샘플은 상온에서 1 시간 동안 배양되고, 원심분리되며, 상기 혈청은 -80 ℃의 작은 배치에 저장된다. 상기 혈청은 주어진 보체 경로에 속하는 상기 버퍼와 함께 처방전에 따라 희석되고, 상온에서 20 분 동안 배양되고, 펩티드로부터 준비된 상기 희석된 배열이 첨가되고, 상온에서 20분 동안 배양되며, 특정한 ELISA 플레이트의 알맞은 웰에 떨어뜨려진다. 그 다음, 세척, 배양 및 항체 첨가가 사용을 위한 지시에 따라 수행된다. 상기 기질과 함께 20분 동안 배양되며, 상기 데이터는 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 얻어진다. 각각의 측정 지점에 속하는 유사한 100% 활성은 억제자가 없는 혈청에 의하여 나타난다. 상기 측정은 하나의 단일하게 녹인 혈청 샘플로부터 동일한 플레이트에서 동시에 수행된다.
상기 측정은 "S" 펩티드 및 "NS" 펩티드 모두 효율적이고 특정한 상기 보체계의 렉틴 경로의 억제자라는 매우 중요한 결과를 야기한다. 이러한 결과는 앞서 입증한 양 펩티드는 상기 MASP-2 효소를 매우 효율적으로 억제하고, 본 발명에 따른 효소는 상기 렉틴 경로를 억제한다는 결과에 따른 것이다.
수많은 세린 단백질분해효소들은 상기 보체계에서 작동하고, 이들 중 일부는 상기 MASP 효소와 매우 유사하다. "S" 펩티드 또는 "NS" 펩티드가 아님에도 불구하고 상기 전형적 경로 또는 교대적 경로를 억제한다.
상기 전형적 경로 및 교대적 경로의 측정 과정으로서, 본원 발명에 따른 펩티드의 존재는 상기 말단인 C5-9 복합체의 생성을 억제하지 않고, 본원 발명에 따른 상기 펩티드는 상기 보체계의 공동 부분의 단백질분해효소를 억제하지 않으므로, 상기 렉틴 경로의 억제는 MASP 효소 단계인 렉틴 경로의 초기에 일어난다. 상기 WIELISA 측정 과정에서 얻어진 상기 IC50 데이터는 합성 기질에 기초한 MASP-2 억제 측정 과정에서 얻어진 Ki값보다 30 배, 60 배 더 높다. 이러한 결과에 대한 가능한 설명은 다음과 같다: 억제자 펩티드는 MASP-2 효소와 기질 결합 위치에 직접 결합되고, 이러한 결합은 동일한 효소 표면에 의한 작은 합성 기질의 상대적으로 약한 상호작용과 잘 경쟁한다. 그러나 상기 기질 결합 위치가 단백질분해효소 부위에 위치할 뿐만 아니라, 생리학적 기질은 다른 표면(엑소사이트)을 거쳐 결합을 생성할 수 있고, 작은 합성 기질에 비해 높은 친화도로 상기 효소와 결합한다. 상기 효소-기질 복합체로부터 효소-억제자 복합체로 옮겨진 균형을 맞추기 위하여 억제자 펩티드가 고농도로 사용되어야만 하기 때문에 이러한 높은 친화도가 나타난다.
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<212> PRT
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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Gly Tyr Cys Ser Arg Ser Ile Pro Pro Val Cys Ile Pro Asp
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Adapter
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Adapter
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide library
<400> 19
ccgccgcctc ggcgctagca ggtnnktgtn nkarannknn kcctccgnnk tgtnnkccgg 60
atggcgggtc gggtggatcc ggtgg 85
Claims (16)
- 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 펩티드, 이들의 염, 에스테르(ester) 또는 약학적으로 수용 가능한 프로드럭(prodrug):
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 M, W, I, V, A이고,
X2은 R, K이고,
X3은 Y, F, I, M, L, E, D, H이고,
X4은 V, I, H이고,
X5은 I, V, Y, F, W임.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 서열을 갖는 펩티드, 이들의 염, 또는 에스테르(ester):
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2),
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
GVCSRSLPPICWPD (SEQ ID NO 4),
GMCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 5),
GYCSRSIPPVCIPD (SEQ ID NO 6),
GWCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 7), 및
상기 서열의 고리형 펩티드인 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3).
- 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드, 이들의 염, 또는 에스테르(ester):
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2), 및
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3).
- 하기 일반식(Ⅰ)에 따른 적어도 하나의 펩티드; 또는 하기 일반식(Ⅰ)에 따른 하나의 펩티드의 약학적으로 수용 가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭; 또는 적어도 하나의 부가되는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조제약:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y, M, W, I, V, A이고,
X2은 R, K이고,
X3은 Y, F, I, M, L, E, D, H이고,
X4은 V, I, H이고,
X5은 I, V, Y, F, W임.
- 제4항에 있어서, 상기 첨가제 중에서 적어도 하나는 조절된 활성제 방출을 안전하게 하기 위한 매트릭스(matrix)인 것을 특징으로 하는 조제약.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 펩티드는 하기 서열을 가진 펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조제약 또는 이들의 약학적으로 수용 가능한 염 또는 에스테르:
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2),
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3),
GVCSRSLPPICWPD (SEQ ID NO 4),
GMCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 5),
GYCSRSIPPVCIPD (SEQ ID NO 6),
GWCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 7), 및
서열 GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)를 가진 고리형 펩티드.
- 제6항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 서열을 가진 펩티드인 것을 특징으로 하는 조제약, 또는 이들의 약학적으로 수용 가능한 염 또는 에스테르:
GYCSRSYPPVCIPD (SEQ ID NO 2), 및
GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3).
- 하기 일반식(Ⅰ)에 따른 하나 이상의 펩티드, 이들의 염 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y, M, W, I, V, A이고
X2은 R, K이고
X3은 Y, F, I, M, L, E, D, H이고
X4은 V, I, H이고
X5은 I, V, Y, F, W임.
- ⅰ) 하기 일반식(Ⅰ)에 따른 펩티드, 또는 이것의 염 또는 에스테르를 상기 펩티드가 표지된 MASP를 포함하는 용액에 첨가하고;
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y, M, W, I, V, A이고,
X2은 R, K이고,
X3은 Y, F, I, M, L, E, D, H이고,
X4은 V, I, H이고,
X5은 I, V, Y, F, W이고,
ⅱ) 테스트를 위하여 하나 이상의 화합물을 포함하는 용액을 상기 ⅰ)의 용액에 첨가하고; 그리고
ⅲ) 상기 표지된 펩티드의 방출량을 측정하는;
단계로 MASP 효소를 강력하게 억제하는 화합물을 분류하기 위한 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 MASP 효소는 MASP-1 또는 MASP-2 효소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 보체계를 억제함으로써 치료될 수 있는 질병을 치료하는데 적절한 조제약을 생산하기 위한 하기 일반식(Ⅰ)의 펩티드, 이들의 약학적으로 수용 가능한 염, 또는 에스테르의 용도:
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y, M, W, I, V, A이고,
X2은 R, K이고,
X3은 Y, F, I, M, L, E, D, H이고,
X4은 V, I, H이고,
X5은 I, V, Y, F, W임.
- 제11항에 있어서, 상기 보체계를 억제함으로써 치료될 수 있는 질병은 염증 및 자가 면역 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제11항에 있어서, 상기 보체계를 억제함으로써 치료될 수 있는 상기 질병은 허혈재관류 상해, 류마티스 관절염, 신경성퇴행질환, 노인황반변성, 및 사구체신염, 및 전신성홍반성루푸스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제11항에 있어서, 상기 보체계를 억제함으로써 치료될 수 있는 상기 질병은 보체 활성과 관련된 가짜-알러지인 것을 특징으로 하는 용도.
- ⅰ) 하기 일반식(Ⅰ)에 따른 하나의 펩티드, 이것의 염, 또는 이것의 에스테르를 하나의 캐리어(carrier) 상에 고정시키고;
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (Ⅰ)
상기 식에서 X1은 Y, M, W, I, V, A이고,
X2은 R, K이고,
X3은 Y, F ,I, M, L, E, D, H이고,
X4은 V, I, H이고,
X5은 I, V, Y, F, W이고;
ⅱ) 상기에서 고정된 상기 펩티드는 MASP 효소를 포함하고 있는 용액과 접촉하고; 그리고
ⅲ) 상기 조제약을 세척하는;
단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 MASP 효소를 분리하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 MASP 효소는 MASP-1 또는 MASP-2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| WITN | Withdrawal due to no request for examination |