KR20220005352A - Dnm1 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

Dnm1 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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KR20220005352A
KR20220005352A KR1020200083105A KR20200083105A KR20220005352A KR 20220005352 A KR20220005352 A KR 20220005352A KR 1020200083105 A KR1020200083105 A KR 1020200083105A KR 20200083105 A KR20200083105 A KR 20200083105A KR 20220005352 A KR20220005352 A KR 20220005352A
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서울대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 DNM1의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 다낭신(PKD)의 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신 진단용 키트 및 DNM1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 다낭신 마커 DNM1을 이용함으로써 환자의 소변 등 비침습적 방법으로 수득한 시료로부터 초기에 다낭신을 진단하고 발현 여부를 예측할 수 있다.

Description

DNM1 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용 {Composition for diagnosing polycystic kidney disease comprising agent for detecting DNM1 and use thereof}
본 발명은 DNM1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 다낭신(PKD)의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 키트 및 DNM1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 발현을 검출하는 제제를 이용한 다낭신의 예방 또는 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
다낭신 또는 다낭포성 신장 질환은 액체로 채워진 여러 개의 낭종으로 인해 신장이 벌집 모양으로 변형되는 유전 질환으로, 상염색체 우성 다낭신 (ADPKD), 상염색체 열성 다낭신(ARPKD) 등으로 분류된다.
상염색체 우성 다낭신(ADPKD, 이하 "다낭신"이라 한다)은 신장에서 가장 흔한 유전성 신장질환으로, 1000명당 1명 꼴의 발병률을 보인다. 다낭신 환자는 양쪽 콩팥에 다수의 낭종이 발생하고, 낭종의 크기와 수가 증가하여 결국에는 50-60대에 신장 기능이 정지하여 죽음에 이르게 된다. 낭종의 진행은 낭종 표피 세포의 증식이 일어난 후 낭종 안으로 낭종액이 차게 되면서 낭종의 크기가 커지게 되며 진행된다.
다낭신은 국내 투석 환자의 원인 중 약 2%를 차지하여, 당뇨, 고혈압, 사구체 신염 다음으로 흔하게 나타난다. 다낭신은 양쪽 콩팥의 구조적, 기능적 결함을 가져올 뿐만 아니라, 각종 신장의 합병증을 동반할 수 있기 때문에 비교적 질환의 초기 단계에서부터 관리가 필요하다.
다낭신의 원인 유전자는 PKD1과 PKD2 유전자로, 각각 polycystin-1과 polycystin-2라는 단백질을 코딩한다. 다낭신 진단 환자의 85%는 PKD1 유전자의 결함, 나머지 15%는 PKD2 유전자의 결함이 원인인 것으로 알려져 있다.
현재 다낭신의 완치 방법은 알려져 있지 않으며, 최근 치료 방향은 합병증에 의한 질병 이환 및 사망을 감소 시키는 방향으로 연구가 진행되고 있으며, 이를 위해 비침습적인 방법으로 초기에 다낭신을 진단할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 디나민-1 (Dynamin-1, DNM1)을 검출하는 제제를 포함하는 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 키트 또는 진단 및/또는 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNM1의 양을 측정하는 단계를 포함하는 다낭신의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 다낭신 환자의 낭종 표피 세포 및 배양액에서 DNM1을 암호화하는 유전자의 전사량 및/또는 DNM1 단백질의 발현량이 증가함을 확인하여, 다낭신에 대한 바이오마커로서의 기능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 디나민-1 (Dynamin-1, DNM1)을 검출하는 제제를 포함하는, 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측용 키트, 및 DNM1 유전자의 전사량 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신 진단 및/또는 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포에 후보 물질을 처리하여 DNM1 유전자의 전사량 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 조사하는 단계를 포함하는, 다낭신의 경감 또는 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 다낭신 돌연변이 유전자의 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "다낭신"은 다낭포성 신장질환 또는 다낭성 신장 질환을 의미하며, 예를 들어 상염색체 우성 다낭성 신장질환 또는 상염색체 열성 다낭성 신장질환일 수 있으며, 일 구현예에서, 상염색체 우성 다낭성 신장질환일 수 있다.
본 발명에서, 용어 “유전자”는 DNA, RNA 등을 포함하는 유전물질을 총칭하는 것으로, 엑손과 인트론을 포함하는 유전물질, cDNA, 및/또는 mRNA 등을 의미할 수 있다.
본 발명에서, “대조군”은 건강군 (또는 정상군) 및/또는 다낭신 환자가 아닌 개체군을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "DNM1 유전자"는 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자를 의미하며, "DNM1 발현"은 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 및/또는 발현, 및 DNM1 단백질의 발현을 모두 포함한다.
본 발명이 제공하는 다낭신 진단용 조성물은, DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질을 검출하는 제제를 포함한다.
상기 유전자를 검출하는 제제는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 것이면 당업자가 자유롭게 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, DNM1 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 DNM1 단백질을 검출하는 제제는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제라면 제한 없이 선택하여 이용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 DNM1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 압타머 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 단백질의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하기 위한 목적 범위 내에서의 모든 종류의 항체를 의미하고, 예를 들어, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 제제는 생물학적 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질을 검출하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 사용가능하며, 상기 생물학적 상기 시료는 환자의 조직, 혈액, 세포, 혈장, 혈청, 뇨, 낭종액, 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 상기 생물학적 시료는 비침습적 방법으로 환자로부터 분리된 시료일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자로부터 분리된 신장 표피세포에서 전체 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 통해 cDNA를 제작하고, 해당 cDNA를 주형으로 하여 다시 PCR을 수행하여 대조군과 환자군의 DNM1 유전자의 mRNA 발현량을 비교하였다. PCR 후 각 시료를 전기영동하여 밴드 세기를 비교한 결과, 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 낭종 표피 세포들에게서 DNM1의 mRNA 발현량이 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 높게 나타났다. 따라서 DNM1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 DNM1 단백질은 다낭신, 예를 들어, 상염색체 우성 다낭신 진단용 바이오마커로서 활용될 수 있다 (실시예 2 참고).
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자로부터 분리된 신장 표피세포 내의 DNM1 단백질의 발현 양상을 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, 대조군 세포에 비해 DNM1 단백질 밴드가 현저히 선명하게 나타나, DNM1 유전자의 mRNA뿐만 아니라 DNM1 단백질의 발현량 또한 환자군에서 증가함을 확인하였다 (도 1b). 따라서 DNM1 단백질은 다낭신, 예를 들어, 상염색체 우성 다낭신 진단용 바이오마커로서 활용될 수 있다 (실시예 3 참고).
본 발명의 일 실시예에서, 대조군의 신장 조직과 상염색체 우성 다낭신 (ADPKD) 환자의 신장 조직에 면역조직화학염색 (immunohistochemistry: IHC) 방법을 이용하여 신장 조직 내 DNM1 단백질의 염색 여부을 조사하였다. 그 결과, DNM1 단백질이 대조군의 신장 조직에서는 확인되지 않았으며, 다낭신 환자의 낭종 (Cyst) 표피 세포에서 염색된 것을 확인하여, DNM1을 이용해 다낭신, 예를 들어 상염색체 우성 다낭신의 발현 여부 신뢰도 있게 예측할 수 있음을 확인하였다 (실시예 4 참고). 본 발명의 또 다른 일 예는 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 다낭신 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 진단용 키트는 상기 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질을 검출하기 위한 제제로서, 예를 들어 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 및 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 및/또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일 예로서, 본 발명에서 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 구성을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는, DNM1 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에, 테스트튜브 또는 다른 적절한 컨테이너(container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소(Taq-polymerase), 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 일 예에서, 본 발명의 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 구성을 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광 표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일 예로서, 본 발명에서 DNM1 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리 비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트 폴리스티렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및/또는 유리로 된 슬라이스 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색 기질은 ABTS(2,2'-아지노-비스(4-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
상기 키트의 구성에서 예시된 각 물질은 예시를 위한 것일 뿐, 통상의 기술자가 필요에 따라 적절히 구성을 변경할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신 진단 및/또는 다낭신의 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 시료는 환자 및/또는 대조군의 조직, 혈액, 세포, 혈장, 혈청, 뇨, 낭종액, 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 방법은, 환자로부터 분리된 시료로부터 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도를 대조군 시료 내 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 DNM1 유전자 발현 정도를 측정하는 방법은, 예를 들어 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응, 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR), RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것일 수 있다.
상기 역전사효소 중합효소 연쇄반응은, 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 DNM1 유전자 발현 여부 및 발현 정도를 확인 가능하고, 이를 대조군과 비교함으로써 다낭신의 발병 또는 진행 정도를 진단할 수 있다. 구체적으로, DNM1 유전자 발현량이 대조군보다 높게 나타나는 경우, 다낭신이 발병한 것으로 진단할 수 있다. 상기 DNM1 단백질의 발현량 또는 발현을 측정하는 방법은, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 면역조직화학염색 (immunohistochemistry, IHC), 방사선면역분석법, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로, 상기 단백질 발현 측정은 면역조직화학염색법을 이용하는 것이다. 면역조직화학염색은 조직 및 세포검사에 면역학적 방법을 사용하여, 확인하고자 하는 조직이나 세포의 특정 항원에 항체를 결합시키고 이 항체에 결합된 효소와 이 효소에 반응하는 발색제의 상호 작용으로 색깔을 띄게 만들어 발색 여부로 조직이나 세포에 특정 항원이 존재하는지의 여부를 확인한다. 이러한 면역병리는 종양성 질환에서 암세포의 종류와 기원을 분류하고 환자의 예후 판정과 치료 방침을 결정하는데 유용하다.
또한, 면역형광법은 면역병리의 한 방법으로 이는 발색제 대신에 형광물질을 사용하여 형광현미경 시야에서 관찰합니다. 이 방법은 신장과 피부 질환에서 많이 사용합니다. 조직염색의 경우 외과적으로 조직 일부를 추출하여 고정시킨 다음 염색을 하여 병의 진단에 사용합니다
본 발명이 제공하는 다낭신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 상기 환자 시료에서의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 대조군의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계 이후 환자 시료에서의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현량이 대조군보다 높은 경우 다낭신 환자로 결정하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
일 예에서, DNM1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 량이 정상군에 비해 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상 인 경우, 상기 시료가 얻어진 환자를 상염색체 우성 다낭신 환자로 결정할 수 있다.
상기 검출 방법을 통하여 다낭신의 발병 여부, 다낭신 환자의 낭종 형성 및 발현 여부를 예측할 수 있다. 즉, 환자의 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도를 대조군에서의 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질 발현 정도와 비교함으로써 환자의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질 발현 정도가 대조군에서보다 더 높게 나타나면, 다낭신이 발병 또는 진행된 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자의 낭종 표피 세포 내 DNM1 유전자의 mRNA양을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과, 대조군에서는 밴드가 희미하게 나타난 반면, 환자군에서는 선명한 밴드가 나타났다 (실시예 2 참고). 본 발명이 제공하는 다낭신의 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 환자로부터 분리된 시료 내 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명이 제공하는 다낭신의 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 상기 다낭신의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 수행하여, 또는 상기 방법 외의 다낭신 진단 방법을 이용해 다낭신 환자로 결정된 환자에 대해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 다낭신 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계 및 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현량 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 다낭신 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 다낭신 치료제란 다낭신의 진행을 완화하거나 중단시키는 물질을 포함한다.
구체적으로, 다낭신 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 증감을 비교하는 방법으로 다낭신 치료제를 스크리닝하는 데 유용하게 사용할 수 있다. DNM1 유전자의 mRNA 또는 DNM1 단백질 농도를 직간접적으로 감소시키는 물질은 다낭신의 치료제로 선택될 수 있다. 즉, 다낭신 치료제 후보 물질의 존재 하에 본 발명의 마커 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, 다낭신 치료제 후보 물질이 존재할 때의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도가 다낭신 후보 물질의 부재 하에서의 DNM1 유전자 및/또는 DNM1 단백질의 발현 정도보다 감소시키는 물질을 다낭신의 치료제로 결정할 수 있다.
본 발명이 제공하는 DNM1 유전자의 전사량 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 진단용 조성물은, 저비용으로 다낭신의 조기 진단 및 이에 따른 병증의 관리에 유용하게 이용될 수 있다. 특히 향후 환자의 신장 낭종 크기 증식을 억제할 수 있는 치료제 개발을 위한 타겟으로 적용 가능하다.
본 발명이 제공하는 DNM1 유전자의 전사량 및/또는 DNM1 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 이용하여 다낭신 환자의 낭종의 증식 발현 여부를 예측할 수 있으며, 이를 추적 관찰함으로써 향후 환자의 낭종 증식에 따른 발병 진행 정도를 예측할 수 있는 바이오마커로 활용 가능하고, 이를 통해 환자 개인 맞춤형 치료를 제공할 수 있다.
도 1a는 다낭신 환자의 낭종 표피 세포(Cyst#1 및 Cyst#2)와 대조군 세포(RPTEC)에서의 DNM1 유전자 발현량을 실시간 중합효소연쇄반응을 이용해 확인한 결과이다.
도 1b는 다낭신 환자의 낭종 표피 세포와 대조군 세포에서의 DNM1 단백질의 발현량을 Western blot을 이용하여 확인한 결과 사진이다.
도 2는 대조군인 정상인의 신장조직 및 상염색체 우성 다낭신 (ADPKD) 환자의 신장 조직에 면역조직화학염색 (immunohistochemistry: IHC) 방법을 이용하여 DNM1 단백질 발현을 확인한 결과 사진이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 시료의 준비
다낭신 환자의 신장 조직 샘플은 서울대학교병원으로부터 공급받았다. 상염색체 우성 다낭신 환자로부터 추출된 신장에서 낭종의 일부를 추출하여 세포 배양을 진행하였다. 세포 배양은 DMEM/10%(v/v) FBS 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 진행되었다. 대조군 시료로는 ATCC에서 구매한 RPTEC/TERT1 (CRL-4031) (이하, "RPTEC"라 한다)이라는 정상(비환자) 신장 표피 세포를 사용하였다.
실시예 2. 다낭신 환자의 낭종 표피 세포에서 DMN1 발현량의 mRNA 수준 확인
2-1. RNA 시료 준비
실시예 1에서 배양된 세포로부터 Qiagen사의 RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 세포 내 전체 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 먼저 세포를 1X10^7 개로 수득하여 RLT lysis buffer를 사용하여 cell lysis를 진행하였다. Lysate를 gDNA Eliminator spin column에 옮긴 후 10,000rpm에 30초간 원심분리 후, Flow-through에 동일량의 70% EtOH를 넣어 섞은 후 RNeasy spin column에 옮겨 10,000rpm에 15초간 원심분리하였다. RW1 buffer 700ul를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리 후 RPE buffer 500ul를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리를 수행한 후, Air dry 후 50ul RNase-free water를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리하여 전체 RNA를 추출하였다
2-2. RT-PCR
상기 추출된 전체 RNA를 주형으로, TAKARA사의 PrimeScript RT-PCR Kit를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)을 통해 cDNA를 제작하였다. Reaction Mixture, Reagent Mixture 및 Thermal condition 정보는 하기와 같다.
(1) Reaction mixture;
Template (RNA) 2ug
Oligo dT primer (2.5uM) 1ul
dNTP (10mM each) 1ul
RNase Free dH2O up to 10ul
Denaturation at 65℃ for 5 min
(2) Reagent mixture;
Reaction mixture 10ul
5X PrimeScript Buffer 4ul
RNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ul
PriemScript RTase 0.5ul
RNase Free dH2O 5ul
(3) Thermal condition;
30℃ 10 min
42℃ 30 min
95℃ 5min
4℃ 보관
2-3. 건강군과 환자군의 DNM1 발현량 비교
실시예 2-2에서 제작된 cDNA 시료를 주형으로 하여, 하기 표 2에 기재된 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 DNM1을 암호화하는 유전자의 발현량을 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용해 증폭하여 건강군 건강군 (RPTEC; 실시예 1 참고) 과 환자군 (실시예 1 참고)의 DNM1 발현량을 비교하였다. 대조군으로는 GAPDH 유전자를 사용하였다. GAPDH 유전자의 증폭 및 DNM1 cDNA의 증폭에 사용된 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 프라이머 서열 (5'->3')
1 DNM1_forward AGGGCCCAGCCTCACCTACG
2 DNM1_reverse CTCACACGGCACCCAGGCAG
3 GAPDH_forward TTGCCATCAATGACCCCTTCA
4 GAPDH_reverse CGCCCCACTTGATTTTGGA
PCR 후 각 시료를 아가로스 젤에서 전기영동하여 각 PCR 산물의 밴드 세기를 통해 mRNA 발현량을 비교하였다. 도 1a에 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 낭종 표피 세포들에게서 DNM1 유전자의 mRNA 발현량을 조사한 결과의 사진을 나타내었다. 대조군인 GAPDH의 밴드 세기는 대조군 세포(control, RPTEC)와 상염색체 우성 다낭신 환자 세포들 사이에서 큰 변화를 보이지 않았으나, DNM1의 경우, 대조군 세포에서의 밴드의 세기(intensity)보다 약한 밴드가 나타난 반면, 상염색체 우성 다낭신 환자군에서는 밴드가 대조군 세포에서의 밴드 세기와 유사한 강도로 나타나, 환자군에서 DNM1의 mRNA 발현량이 공통적으로 증가하였음이 확인되었다.
도 1a에 상염색체 우성 다낭신 환자들의 전기영동 결과 나타난 band 사진과 실시간 중합효소연쇄반응(Real time-PCR, RT-PCR) 결과 그래프를 나타내었다. 대조군인 RPTEC에서의 fold change를 1로 두었을 때, 환자 2인의 fold change는 각각 9.3 및 13.3으로 측정되어 건강군에 비해 다낭신 환자에서 DNM1의 발현량이 현저히 높게 나타나는 것을 정량적으로 확인하였다.
실시예 3. 다낭신 환자의 낭종 표피 세포에서 DNM1의 단백질 수준 확인 (Western blot)
추가로, Western blot을 이용해 상기 대조군 세포와 다낭신 환자의 신장 낭종 표피 세포 (실시예 1 참고)에서의 DNM1 발현량을 확인하였다. 단백질 발현량을 살필 대조군으로는 b-actin 단백질을 선정하였으며, DNM1에 대해서는 Abcam 사의 항-DNM1 (ab52611) 항체를, b-actin에 대해서는 Sigma 사의 monoclonal anti-b-actin (A5316) 항체를 각각 1:1000 희석 농도로 이용하였다.
도 1b에 Western blot 결과를 나타내었다. Western blot도 RT-PCR에서와 마찬가지로, 낭종 표피 세포(Cyst #1 및 Cyst #2로 표시)에서의 DNM1 단백질이 대조군 세포에 비해 증가함을 확인하였다.
실시예 4. 다낭신 환자의 신장 조직에서 DNM1의 단백질 발현 여부 예측
비침습적 방법을 이용하여 DNM1을 이용한 상염색체 우성 다낭신의 진단 및/또는 발현 여부 예측 가능성을 확인하기 위해, 대조군인 정상인의 신장 조직과 환자군의 신장 조직을 이용해 면역조직화학염색 (immunohistochemistry: IHC)를 이용해 DNM1 단백질 발현을 조사하였다.
구체적으로, 신장 조직을 절취한 다음 포르말린에 24시간 정도 고정하고 나서, 파라핀 블록 제작을 위하여 탈수, 투명, 침투, 포매 과정 후에 절편을 하여 슬라이드를 제작한다. 이후 절편된 신장 조직 슬라이드를 탈파라핀하고 나서 항원성 부활하여 항체가 결합할 수 있게 한 다음 1차 항체인 DNM1 항체를 결합시킨 다음 2차 항체로 염색을 진행한다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. IHC 결과, DNM1 단백질이 대조군인 정상인의 신장 조직에서는 보이지 않고 다낭신 환자의 낭종 (Cyst) 표피 세포에서 증가함을 나타내므로, 이를 이용하여 발현을 예측할 수 있는 바이오마커로서 활용할 수 있음을 확인하였다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for diagnosing polycystic kidney disease comprising agent for detecting DNM1 and use thereof <130> DPP20201840KR <160> 4 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNM1_forward <400> 1 agggcccagc ctcacctacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNM1_reverse <400> 2 ctcacacggc acccaggcag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward <400> 3 ttgccatcaa tgaccccttc a 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse <400> 4 cgccccactt gattttgga 19

Claims (10)

  1. 디나민-1 (Dynamin-1, DNM1) 단백질을 검출하는 제제, 및 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA를 검출하는 제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는, 다낭신의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 다낭신의 진단용 키트.
  3. 디나민-1 (Dynamin-1, DNM1) 단백질을 검출하는 제제, 및 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA를 검출하는 제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는, 다낭신의 발현 여부 예측용 조성물.
  4. 제3항에 따른 조성물을 포함하는, 다낭신의 발현 여부 예측용 키트.
  5. 환자로부터 분리된 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자, 및 DNM1 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 시료는 환자의 조직, 혈액, 세포, 혈장, 혈청, 뇨, 낭종액, 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 다낭신 환자가 아닌 대조군으로부터 분리된 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자, 및 DNM1 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계;
    환자와 대조군의 발현량을 비교하는 단계; 및
    상기 환자 시료에서의 발현량이 대조군에 비해 낮은 경우, 상기 환자를 다낭신 환자로 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 환자로부터 분리된 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자, 및 DNM1 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신의 발현 여부 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시료는 환자의 조직, 혈액, 세포, 혈장, 혈청, 뇨, 낭종액, 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 다낭신 환자가 아닌 대조군으로부터 분리된 시료로부터 DNM1 단백질을 암호화하는 유전자 및 DNM1 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계;
    환자와 대조군의 발현량을 비교하는 단계; 및
    상기 환자 시료에서의 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 상기 환자를 다낭신이 발현된 환자로 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
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