KR20210152191A - 규조류 유래 후코잔틴을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후코잔틴을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제주 용암 해수와 함께 취수되는 부착성 규조류로부터 후코잔틴을 분리정제하여 이를 주름개선용 화장료 조성물로 이용하는 발명에 관한 것이다. 우리나라 제주 용암해수에서 취수되는 부착성 규조류로부터 최적의 방법으로 분리정제한 고순도의 후코잔틴은 피부주름 개선효과를 가지는 점에서, 후코잔틴을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.

Description

규조류 유래 후코잔틴을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for wrinkle improvement including fucoxanthin derived from diatoms}

본 발명은 후코잔틴을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제주 용암 해수와 함께 취수되는 부착성 규조류로부터 후코잔틴을 분리정제하여 이를 주름개선용 화장료 조성물로 이용하는 발명에 관한 것이다.

용암해수란 제주도의 현무암층을 뚫고 육지 지하로 흘러 들어온 바닷물이다. 용암해수는 제주도의 서부 일부지역과 동부지역을 중심으로 발견되며 고농도의 미네랄을 함유하고 있다. 또한 일반해수는 생활하수, 산업폐수, 항만오염 등의 불안정한 환경에 노출되어 산업화 소재 가공에 많은 비용이 소요되는 반면, 용암해수는 화산암반층에 의한 자연정화와 여과를 거쳐 중금속 흡착 및 유해물질을 차단하기 때문에 안전성과 안정성, 경제성을 확보하고 있고, 깊은 바다에서 취수하는 해양심층수에 비해서 비교할 수 없을 정도로 취수비용이 저렴하다.

본 출원의 발명자는 제주 용암해수를 이용하여 양식을 하는 과정에서 용암해수와 함께 부착성 규조류가 취수되는 것을 확인하고, 이들 부착성 규조류를 우점시켜 대량 배양하는 방법을 확립하였다. 부착성 규조류는 양식 산업의 사료 대체 에너지원으로서 또는 의학, 환경, 생명산업 등 여러 산업분야의 기초재로서 가치가 높은 자원으로 활용가능하다.

한편, 카로티노이드 시장은 합성 카로티노이드와 천연물 유래 카로티노이드로 분류되며, 꾸준한 성장세를 이루고 있다. 전 세계 카로티노이드 시장은 2014년 15억 달러를 기록하고, 2019년에는 약 18억 달러로 증가할 것으로 예상된다. 특히 루테인, 칸타잔틴, 아스타잔틴 등의 크산토필계 카로티노이드의 가치가 높아지고 있으며, 주로 천연색소, 항산화제, 비타민A 전구체, 양식 사료 첨가제 등으로 사용되고 있다.

후코잔틴은 주로 미역, 다시마, 모자반, 톳 등의 갈조류(brown algae)에 존재하는 일종의 카로티노이드계(Carotenoid) 색소를 의미한다. 갈조류가 갈색을 나타내는 것은 후코잔틴이라는 고유한 광합성 색소가 엽록소에 비해 상대적으로 많기 때문이다. 빛에너지를 포착해 약 80%를 엽록소에 전달함으로써 광합성을 보조한다. 포착된 빛에너지는 스펙트럼 상의 450~540nm 파장의 빛을 흡수하며, 510~525nm 파장의 빛을 가장 많이 흡수하며, 항비만, 항염증 등 다양한 효능이 있는 것으로 알려졌다.

한편, 노화에 따른 피부의 생리적 변화로는 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고, 피부장벽의 기능을 맡고 있는 지질층(lipid barrier)의 지질 조성과 함량이 변화되면서 그 기능이 급격하게 저하되어 피부의 수분함량이 떨어지고, 피부가 건조해지며, 기미, 주근깨 및 색소침착이 나타나는 등 다양한 변화가 있다. 최근에는 이와 같은 노화 과정 중에서도 특히 피부의 주름 및 탄력과 깊은 관계가 있는 세포 밖 매트릭스(ECM, extracellular matrix)성분 및 ECM의 주요 성분인 콜라겐의 변화에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 콜라겐은 ECM 성분의 70-80%를 차지하고 있는데, 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되면서 주름생성의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 아울러, 콜라겐 이외에 피부결합조직을 이루고 있는 엘라스틴, 프로테오글리칸(proteoglycan), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌, 피브로넥틴 등의 산화에 따른 기능 저하가 피부탄력 저하 및 주름형성의 주원인으로 알려져 연구되고 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있는데, 후코잔틴을 피부탄력 저하 및 주름형성 방지용 화장료 조성물로 사용된 예는 없다.

우리나라 제주 용암해수에서 취수되는 부착성 규조류로부터 분리된 후코잔틴을 포함하는 피부탄력 및 주름개선용 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명은 후코잔틴(Fucoxanthin)을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 후코잔틴은 규조류로부터 분리정제되는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 규조류는 제주 용암 해수와 함께 취수되는 부착성 규조류일 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 부착성 규조류는 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 또는 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 이상일 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 규조류는 바닥규조 배양물에서 수거되는 규조류일 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 후코잔틴은 전체 화장료 조성물 대비 2 중량% 포함될 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 화장료 조성물은 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 또는 향료를 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 화장료 조성물의 제형이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린싱, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스파운데이션, 또는 스프레이인 것일 수 있다.

또한 본 발명은 주름개선용 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 화장품은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 발모 영양제, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 세럼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.

우리나라 제주 용암해수에서 취수되는 부착성 규조류로부터 최적의 방법으로 분리정제한 고순도의 후코잔틴은 피부주름 개선효과를 가지는 점에서, 후코잔틴을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 본 발명은 의료분야, 미용분야 등 다양한 산업분야에서 활용이 가능하다.

도 1은 규조료 원물을 주정에 교반 후 규조토로 사전코팅(precoat)된 여과베드(filter bed)에 loading하여 여과하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 분리정제된 후코잔틴을 메탄올에 녹인 표준용액 1에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 규조료 원물을 주정에 교반 후 규조토로 사전코팅(precoat)된 여과베드(filter bed)에 loading하여 여과하고, 이틀동안 -20℃에서 보관하여 재결정을 실시한 표준용액 2의 모액에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 규조료 원물을 주정에 교반 후 규조토로 사전코팅(precoat)된 여과베드(filter bed)에 loading하여 여과하고, 이틀동안 -20℃에서 보관하여 재결정을 실시한 표준용액 2의 결정에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 상기 표준용액 1과 동일하게 제조하되 탈염반응을 진행하지 아니한 표준용액 3에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 상기 표준용액 1과 동일하게 제조하되 탈염반응을 진행한 표준용액 3에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 상기 표준용액 1과 동일하게 제조하되 햇빛에 노출한 표준용액 4에 대한 HPLC 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 표 1의 Sample No 4에 대한 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 8은 표 1의 Sample No 5에 대한 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 9는 표 1의 Sample No 6에 대한 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 10은 후코잔틴 분리정제 공정의 개략도를 나타낸 것이다.
도 11은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)에 의한 후코잔틴 분리정제 공정을 나타낸 것이다.
도 12는 후코잔틴을 포함하는 분획물의 TLC(Thin Layer Chromatography) 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 후코잔틴의 농축과정을 나타낸 것이다.
도 14는 표준 후코잔틴(Sigma Aldrich에서 구입)을 이용한 표준검량선 작성을 나타낸 것이다.
도 15는 규조분말의 70% 주정 추출물로부터 분획/농축과정을 통하여 최종적으로 얻어진 순도 60% 후코잔틴의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 16은 규조토 사전코팅(precoat) 여과 및 재결정화 과정을 나타낸 것이다.
도 17은 여과과정 및 재결정의 현미경 관찰사진(×400)을 나타낸 것이다.
도 18은 재결정을 실시한 후코잔틴의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 19는 표 3의 Sample No 1의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 20은 표 3의 Sample No 3의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 21은 표 3의 Sample No 15의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 22는 표 3의 Sample No 16의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 23은 후코잔틴의 분말제형을 나타낸 것이다.
도 24는 표 3의 Sample No 8의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 25는 표 3의 Sample No 9의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 26은 표 3의 Sample No 10의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 27은 표 3의 Sample No 11의 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 28 내지 도 47은 표 6의 sample 1 내지 20에 대한 HPLC 정량분석을 나타낸 것이다.
도 48은 콜라게나제 활성 억제 시험에 제공된 후코잔틴 시료를 나타낸 것이다.
도 49는 후코잔틴의 투여농도에 따른 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 50은 후코잔틴의 세포 내 콜라게나제 활성 억제율을 나타낸 것이다.
도 51 및 도 52는 후코잔틴의 주름개선 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명에 의한 일 실시예에서, 후코잔틴(Fucoxanthin)을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 다른 실시예에서, 후코잔틴은 규조류로부터 분리정제되는 것일 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 규조류는 제주 용암 해수와 함께 취수되는 부착성 규조류일 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 부착성 규조류는 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 또는 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 이상일 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 규조류는 바닥규조 배양물에서 수거되는 규조류일 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 후코잔틴은 전체 화장료 조성물 대비 2 중량% 포함될 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 화장료 조성물은 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 또는 향료를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 또 다른 실시예에서, 화장료 조성물의 제형이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린싱, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스파운데이션, 또는 스프레이인 것일 수 있다.

또한 본 발명에 의한 일 실시예로서, 주름개선용 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명에 의한 다른 실시예에서, 화장품은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 발모 영양제, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 세럼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 후코잔틴 분리정제방법의 최적화

분리정제방법에 따른 후코잔틴의 함량변화를 측정하여 분리정제방법을 최적화하였다. 이를 위하여 먼저 wet 상태의 규조류를 50g씩 담아 진공건조기에서 48시간 건조를 하였고, 이후 다양한 공정에 의한 후코잔틴의 함량변화를 HPLC를 이용하여 측정하였다.

먼저, 표준용액 1은 규조류 원물을 70% 주정에 2시간 동안 교반 후 규조토로 사전코팅(precoat)된 여과베드(filter bed)에 loading하여 여과 후 감압농축을 실시하였다. 이에 따른 sample 1.2g을 전자저울로 칭량하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography, Φ 3.5 cm x 15 cm)를 실시하였고, 용출용매로는 N-Hexane : Acetone = 70 : 30 으로 흘려주었다. 분리정제된 후코잔틴을 methanol에 녹여서 농도 0.1% 인 표준용액 1을 제조하였다. 이 후, 표준용액 1을 투명용기에 분주하고 후코잔틴 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 색변화는 나타나지 않았으며 후코잔틴 함량은 peak area 값을 기준으로 산출하였다. 하기 표준용액 2와 비교하였을 때 후코잔틴 함량이 높은 것으로 나타났고, 다른 성분들은 제거되어 순도가 90%로 나타났다(도 1).

다음으로, 표준용액 2는 재결정 공정을 통하여 제조하였다. 온도가 높은 용매에 용질을 녹이면 낮은 온도에서보다 더 많은 양의 용질을 용해시킬 수 있다. 이렇게 용해되어 있는 상태에서, 온도를 다시 천천히 내리면 용해도가 작아지기 때문에 용질은 다시 석출되면서 결정을 이루게 되는데, 이를 재결정이라 한다. 본 발명에서는 70% 주정에 규조류 원물 5g을 2시간 동안 교반하여 여과한 후, 재결정 실험을 위해 여과된 sample을 이틀동안 -20℃보관하여 표준용액 2를 제조하였다. 이 후 표준용액 2를 투명용기에 분주하고 후코잔틴 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 색변화는 나타나지 않았으며 후코잔틴 함량은 peak area 값을 기준으로 산출하였다. 표준용액 1과 비교하여, Chlorophyll 성분이 제거되지 아니하여 결정 sample 은 순도가 75%, 모액 sample은 순도가 61%로 나타났다(도 2, 도 3).

표준용액 3은 규조류 원물에 대한 탈염공정을 추가한 것 이외에는 표준용액 1과 동일하게 진행하여 탈염공정의 효과를 검증하였다. 표준용액 3을 투명용기에 분주하고 후코잔틴 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 색변화는 나타나지 않았으며 후코잔틴 함량은 peak area 값을 기준으로 산출하였다. 관찰된 후코잔틴 함량은 탈염을 진행한 경우 표준용액 1과 비교하여 21% 수준으로 낮아졌고, 탈염을 진행하지 않은 경우 17% 수준으로 낮아졌다(도 4, 도 5).

다음 표준용액 4는 후코잔틴이 햇빛에 노출된 경우의 함량변화를 통하여 후코잔틴의 안정성을 검증하였다. 표준용액 4를 투명용기에 분주하고 후코잔틴 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 색변화는 나타나지 않았으며 후코잔틴 함량은 peak area 값을 기준으로 산출하였다. 일주일 동안 햇빛에 방치 후 후코잔틴의 함량과 순도를 관찰한 결과 함량은 약 82% 감소하였고, 순도는 90%에서 55%로 감소하였다(도 6).

결론적으로 후코잔틴 조제물을 0.1% 농도로 메탄올에 용해한 것을 HPLC 분석한 결과 표준용액 1이 함량과 순도면에서 우수한 것으로 나타났으며, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하지 않았을 때에는 분리정제가 제대로 되지 아니하여 후코잔틴의 함량 및 순도가 낮아지는 것으로 나타났다. 또한 탈염공정은 후코잔틴 함량과 순도에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 또한 재결정 공정도 표준용액 1과 비교하여 후코잔틴의 순도 및 함량이 다소 낮아지는 결과를 확인할 수 있었다. 나아가 후코잔틴은 햇빛 노출에 민감하게 작용하는 것을 표준용액 4에서 확인할 수 있었다.

실시예 2. 후코잔틴 추출에 있어서 적정용매의 결정

후코잔틴의 분리에 있어서 동종의 미세조류 분말의 용매추출은 주정을 사용하였을 경우 가장 추출수율이 높았다는 결과와, 용매를 주정로 하였을 경우 기타 추출방법(Sohxlet법, 초음파추출법, 아임계 추출법 등)을 사용한 것과 크게 다르지 않았다는 결과 및 식품에 활용할 수 있다는 점 등을 고려하여, 70% 주정을 추출용매로 하였다.

다만, 추출용매의 사용량은 향후 산업화 과정에서 생산단가 결정에 중요한 요소가 되므로 우선 규조류 원물 대비 적정 용매비율을 실험하였다. 규조류 분말 100g(sample No 1, 2, 3)에 10배의 70% 주정을 교반하고, 50g(No. 4, 5, 6)에 각각 10배, 20배, 30배의 70% 주정을 교반하여 추출효율을 비교하여 나타내었다(표 1, 도 7 내지 도 9)

시료명	성분함량 (㎍/mL(ppm))	s.d [standard deviation]	비고 (총함량)
Sample No 1	240.40	2.27	여액 900mL x 240 = 216mg
Sample No 2	335.00	3.54	여액 900mL x 335 = 301mg
Sample No 3	366.30	3.89	여액 900mL x 366 = 329mg
Sample No 4	418.53	4.54	여액 600mL x 418 = 250mg
Sample No 5	289.48	2.36	여액 950mL x 289 = 274mg
Sample No 6	186.64	0.29	여액 1400mLx 186 = 260mg
Positive control STD	158.71	0.46

(※ No.1-3; 70% 주정 10x 여액, No.4; 70% 주정 10x 여액, No.5; 70% 주정 20x 여액, No. 6; 70% 주정 30x 여액)

10배 용량의 주정로 추출한 구간에서는 총 250mg, 20배 용량에서는 274mg, 30배 용량에서는 260mg의 후코잔틴이 추출되어 주정 양이 늘어남에 따라 추출효율이 소폭 증가하였지만 그 차이는 10% 내외이므로 적정 추출 용매량은 10배의 70% 주정을 기준으로 진행하였다. 다만, 더욱 정확한 용매조건을 결정하기 위하여 추가실험을 진행하였고, 그 결과는 하기 실시예 9에 나타내었다.

실시예 3. 후코잔틴 분리정제

후코잔틴 등의 기능성 물질의 분리정제에는 실리카 겔 크로마토그래피(silica gel chromatography)가 이용되고 있는데, 여러 가지 화합물들의 물리 화학적 특성에 의한 silica gel 컬럼 내에서의 이동도의 차이에 따라 분리되는 성질을 이용한 것이다. 본 발명에서는 목표물질인 후코잔틴을 효율적으로 분리정제하기 위하여 다양한 조건에서의 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하였다.

전체과정은 도 10에 따라 규조류 분말에 10배 용량의 70% 주정을 넣고 2시간 교반 후 여과하여 각각의 추출물을 얻고 분획과정, 농축과정을 거친 후 실리카 겔 크로마토그래피로 분리하였다.

구체적으로, 먼저 규조류 분말 100g에서 10배 용량의 70% 주정으로 추출한 추출액을 5um 여과지로 필터링하여 얻은 1차 주정 추출물을 n-Hexane : 70% 주정(1:1)로 분리하여 아래층의 70% 주정 분획물을 얻었다. 상기 분획물에서 후코잔틴을 분리하기 위하여, 컬럼에 silica를 충진하여 샘플을 loading하고, gradient (Hexane:Acetone=7:3→6:4→5:5→Acetone) 분리과정을 수행하여 최종 분획물들을 얻었다. 이 후, 후코잔틴을 포함하고 있다고 예상되어지는 분획물(진한 주황색층)을 확보하여 TLC(Thin Layer Chromatography)를 수행하였고(도 11, 12), 그 결과 Fraction No.1에서 No.9까지의 분획물에서 후코잔틴이 분리되었음을 확인하고 고압진공농축기를 이용하여 농축과정을 진행하였다(도 13).

실시예 4. HPLC를 이용한 후코잔틴 정량분석

먼저, 표준물질 후코잔틴(Sigma Aldrich로 부터 구입)을 이용하여 농도별로 희석하여 HPLC 표준검량선을 작성하였다(도 14). HPLC 분석은, Waters 2695 HPLC 장비를 사용하였고, 사용칼럼은 Kromasil 100-5-C18 (4.6x250mm, 5um), 검출파장은 450nm, 용매는 Acetonitrile / water를 사용하였다(표 2).

Control Factor		Conditions
Injection volume		10uL
Column		Kromasil 100-5-C18 (4.6×250mm, 5um)
Mobile phase		A: 0.1% FA in ACN, B: 0.1% FA in H2O
Flow rate		0.7mL/min
Column Temperature		35℃
Wavelength		450nm
Detector		Waters 2998 PDA (Waters, USA)
Separation Module		Waters 2695 (Waters, USA)
Time(min)	Flow(mL/min)		A (0.1% FA in ACN)	B (0.1% FA in H2O)
0	0.7		10	90
10	0.7		60	40
17	0.7		100	0
30	0.7		100	0
35	0.7		10	90
40	0.7		10	90

HPLC 정량분석결과, 100g의 규조분말의 70% 주정 추출물로부터 분획/농축과정을 통하여 최종적으로 순도 60%의 후코잔틴 8.7g을 얻었으며 결과적으로 5.22%의 수율을 나타내었다(도 15).

실시예 5. 재결정화 방법의 유용성 실험

후코잔틴의 정제도 및 수율을 향상시키기 위하여 농축물의 재결정화의 유용성을 검토하였다. 구체적으로, 규조 분말 100g에 10배 용량의 70% 주정로 2시간 교반하여 얻은 1차추출물을, 50g의 규조토로 코팅한 여과베드에 loading하여 추출물 여액을 얻었다. 최종적으로 얻은 농축물을 acetone으로 용해시켜 실리카 겔 크로마토그래피로 후코잔틴 분획물을 샘플링하고, TLC(Thin Layer Chromatography)로 체크하여 후코잔틴이 분리되었음을 확인하였다(도 16).

상기 후코잔틴 분획물로부터 재결정화를 시도하였는데, 재결정화 과정은 다음과 같다. 시료에 동량의 50℃의 물을 섞고 40℃에서 2시간 교반한 후, -20℃에서 overnight 보관하고, 여과를 통해 재결정화를 진행하였다. 후코잔틴의 결정은 현미경 관찰(400배율)을 통해 확인하였으며(도 17), 상기 조건으로 HPLC 정량분석을 수행하였다(도 18). 그 결과, 재결정화를 통해 후코잔틴 농축이 가능하게 되었지만, 목적하는 고순도의 후코잔틴을 분리하는데는 유용성이 크지 않다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 다양한 배양/환경 조건에서의 후코잔틴 함량비교

규조 배양환경, 해수염 제거유무, 건조형태, 건조온도 등에 따른 규조에서의 후코잔틴 함량변화를 비교분석 하였다(도 19 내지 22, 표 3).

시료명	성분함량 (㎍/mL(ppm))	s.d [standard deviation]	비고
Sample No 1	51.03	2.13	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 2	20.52	1.12	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 3	26.65	1.28	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 4	27.44	1.27	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 5	56.38	2.03	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 6	67.58	2.42	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 7	49.66	1.86	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 8	316.99	8.91	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 9	61.22	2.16	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 10	48.69	1.83	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 11	43.68	1.73	50mg/mL로 녹여 분석
Sample No 12	43.92	1.81	여액 900mL x 43 = 38mg
Sample No 13	61.36	2.24	여액 600mL x 61 = 36mg
Sample No 14	47.43	1.94	여액 900mL x 47 = 42mg
Sample No 15	272.26	7.96	여액 700mL x 272 = 190mg
Sample No 16	242.30	7.12	여액 900mL x 242 = 217mg

(※ No.1; 바닥규조/탈염X/자연건조, No.2; 바닥규조/탈염/60℃건조, No.3; 부상규조/탈염X/냉해동/자연건조, No.4; 부상규조/탈염/60℃건조, No.5; 바닥규조/탈염2/자연건조, No.7 부상규조/40℃열풍건조, No.8-11; 베타사이클로덱스트린 제형분말, No.12-14; 건조분말/1,3BG추출/10x,7x,10x, No.15; Fresh Diatom/1,3BG추출 10x, No. 16; Fresh Diatom/주정추출 10x)

HPLC분석은 상기 실시예와 동일한 조건으로 분석하였으며, 규조류 건조분말(No.1 내지 No.11)은 50mg/mL의 농도로 methanol에 용해, 30분간 초음파 처리, filtering후 분석에 이용하였으며, 분석은 3회 반복 수행하였다. 그 결과, 규조 생육환경에 있어서, 바닥규조가 부상규조보다 후코잔틴 함량이 높은 것으로 나타났으며 (표 3, No.1 & No.3), 탈염의 유무는 함량변화에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

한편, 건조온도에 따른 후코잔틴 함량변화를 분석한 결과, 자연건조에 비해 건조온도가 50℃ 이상의 조건에서는 후코잔틴 함량이 크게 감소하는 것으로 나타났다 (표 3, No.1 내지 No.5). 이 결과는 후코잔틴이 열 안정성이 낮다는 기존 연구결과들과 일치하며, 후코잔틴을 산업적으로 생산할 경우 50℃이하의 환경 및 추출조건을 설정하는 것이 중요하다는 것을 시사한다.

분석한 시료 중 후코잔틴 함량이 가장 높은 것은 건조시키지 않은 규조원물 시료로써, 이 결과는 규조배양물을 수거, 건조(자연건조 또는 열풍건조)과정에서 규조내의 후코잔틴이 일부 분해되었다는 것을 나타낸다 (No. 15, 16). 결론적으로, 후코잔틴의 대량 추출공정 확립에 있어서 최초단계인 규조의 수확/가공단계는, 건조공정을 거치지 않고 규조 원물 자체를 그대로 수확하여 곧바로 추출공정으로 진입하는 것이 가장 효율적인 공정이다.

실시예 7. 후코잔틴의 제형화

1차 주정 추출물을 제조하여 여과 후 농축과정을 거쳐 얻어진 농축물에, 베타사이클로 덱스트린을 동량 및 30%씩 증가시킨 양을 첨가하여 반죽을 만든 후 72시간 동결건조를 진행하였다. 동결건조된 시료를 분쇄하여 분말제형을 제조하고, 각 시료에서의 후코잔틴 함량을 분석하였다 (도 23 내지 27, 표 3 No.8 내지 11). 분석결과, 덱스트린 첨가량의 변화에 따른 후코잔틴 함량에는 큰 차이를 보이지 않았으며, 타 시료보다 5배 농축한 농축액에 동량의 덱스트린을 첨가한 시료(No.8)에서는 가장 높은 316ppm (0.6%)을 나타내었지만 다른 시료에 비해 색상 및 향에 있어서 문제점을 나타냈다. 결론적으로, 식품으로의 제형은 부형제인 베타사이클로 덱스트린을 최소로 첨가하는 조건 즉, 추출물 농축액과 동량(1:1)의 덱스트린을 첨가하여 제조하는 것이 가장 효율적인 방법임을 확인할 수 있다.

실시예 8. 플라즈마 처리에 따른 후코잔틴 추출효율 분석

생물 규조(Fresh Diatom)에서 후코잔틴을 추출하는데 있어서, 플라즈마 처리 유무에 따른 후코잔틴의 추출효율을 비교 분석함으로써 최적의 추출조건을 결정하였다.

먼저, 생물규조에 플라즈마를 처리한 것과 처리하지 않은 시료로 부터 추출물을 조제하여 후코잔틴 추출수율을 비교하였다. 생물규조 5g에 20mL의 70%주정을 첨가하여 25분간 plasma를 처리한 후 40℃에서 3일간 추출하고, 추출액을 3500rpm에서 10분간 원심분리 하여 추출잔사를 제거, 상층의 추출액을 이용하여 HPLC 분석을 수행하였고, 대조군으로써, 상기와 동일한 추출조건에서, 플라즈마 처리를 하지 않은 시료를 대조군으로 설정하였다. 추출액이 소량인 관계로 여과과정을 거치지 않고 원심분리를 이용하여 잔사를제거 한 후 추출액을 얻었고(표 4), 플라즈마 처리에 따른 후코잔틴 추출효율을 HPLC 분석을 통하여 검토하였다(표 5).

No.	시료명	최초량(mL)	여액량(mL)	비고 (잔사제거)
19	NP(No Pla)	20	15	3500rpm, 10min
20	Pla-25min	20	17	3500rpm, 10min

* NP:플라즈마 무처리, Pla:플라즈마 처리

No.	시료명	Fx함량
19	NP(No Pla)	1.08
20	Pla-25min	1.22

상기 표에 따르면, 플라즈마를 처리하지 않은 시료에서는 1.08mg이 추출된 반면, 플라즈마를 처리한 시료에서는 1.22mg이 추출되어, 플라즈마 처리에 의해 약 13%의 추출효율이 증가되었음을 확인하였다. 이는 시료에 플라즈마 처리를 함으로써 규조 세포벽 성분의 물성변화를 초래하여 세포내 구성성분이 용이하게 용출 되었음을 시사한다.

실시예 9. 후코잔틴 추출효율의 최적화

생물 규조(Fresh Diatom)에서 후코잔틴을 추출하는데 있어서, 사용하는 용매의 종류, 용매량 및 추출시간에 따른 추출효율을 비교 분석함으로써 최적의 추출조건을 결정하였다.

먼저, 추출 용매의 양, 시간에 따른 조건을 결정하기 위하여, 시료량은 생물규조 50g(No.1∼18), 추출용매는 70%주정 또는 1,3BG(Butylene Glycol)를 사용하고 40℃조건에서, 시료량 (v/v)의 3배, 5배, 7배의 용매량을 각각 설정하여 추출 (시료명= 주정용매: A3, A5, A7. BG용매: B3, B5, B7)로 하였고, 여기에 추출시간을 각각 1일, 3일, 5일로 설정하여 추출(시료명= 1일: 1d, 3일: 3d, 5일: 5d)하였다.

여과 및 원심분리 과정은 다음과 같다. 각각의 추출시료는, 여과지 (Hyundai No.21: 8∼12um, 90mm)와 진공펌프로 여과하여 잔사를 걸러낸 후 분석에 사용하였다(표 6, 도 28 내지 47). 다만, BG 추출물은 점도가 매우 높아 여과에 24시간 이상 걸리게 되어 추출시간 조건에 변동이 발생하게 되므로, 3일과 5일간 추출한 시료는 3500rpm으로 10분간 원심분리한 후 추출액을 얻었다 (No.10∼12, No.16∼18).

No.	시료명	최초량(mL)	여액량(mL)	비고
1	A3-1d	150	125
2	A5-1d	250	225
3	A7-1d	350	350
4	B3-1d	150	100
5	B5-1d	250	170
6	B7-1d	350	270	여과시간 지연으로 2d가 됨
7	A3-3d	150	120
8	A5-3d	250	225
9	A7-3d	350	320
10	B3-3d	150	120	3500rpm, 10min
11	B5-3d	250	210	3500rpm, 10min
12	B7-3d	350	300	3500rpm, 10min
13	A3-5d	150	130
14	A5-5d	250	220
15	A7-5d	350	310
16	B3-5d	150	130	3500rpm, 10min
17	B5-5d	250	210	3500rpm, 10min
18	B7-5d	350	290	3500rpm, 10min
19	NP(No Pla)	20	15	3500rpm, 10min
20	Pla-25min	20	17	3500rpm, 10min

(* A: 70%주정, B: 1,3BG, 3/5/7: 3x,5x,7x, d: day, NP:플라즈마 무처리, Pla:플라즈마 처리)

용매량	추출시간
	1d	3d	5d
A 3	13	9	8
A 5	29	23	19
A 7	43	30	22

(단위 : mg)

먼저, 70% 주정을 용매로 추출시간에 따른 Fx 추출효율을 분석한 결과, 70% 주정 3배량(150mL) 추출시 1일 13mg, 3일 9mg, 5일 8mg, 5배량(250mL) 추출시 1일 29mg, 3일 23mg, 5일 19mg, 7배량(350mL) 추출시 1일 13mg, 3일 9mg, 5일 8mg으로 시간이 경과함에 따라 Fx추출효율이 낮아지는 것으로 나타났다(표 7). 이로 부터 70% 주정 추출조건에서는 원물 대비 7배(v/v)의 주정량으로 1일간 추출하는 것이 가장 효과적이라는 것임을 알 수 있다.

용매량	추출시간
	1d	3d	5d
B 3	18	24	28
B 5	32	38	38
B 7	43	45	45

(단위 : mg)

다음, 1,3BG를 용매로 추출시간에 따른 Fx 추출효율을 분석한 결과, 1,3BG 3배량(150mL) 추출시 1일 18mg, 3일 24mg, 5일 28mg, 5배량(250mL) 추출시 1일 32mg, 3일 38mg, 5일 38mg, 7배량(350mL) 추출시 1일 43mg, 3일 45mg, 5일 45mg으로 시간이 경과함에 따라 Fx추출효율이 높아지거나 동등한 것으로 나타났다(표 8). 이 결과로 부터 1,3BG 추출조건에서는 원물 대비 7배(v/v)의 1,3BG량으로 3일 또는 5일간 추출하는 것이 효과적이라는 것임을 알 수 있다. 그러나, 7배량에서 1일과 3일, 5일간의 차이가 43mg과 45mg으로 크지 않으므로 시간적 효율을 고려할 때 원물대비 7배(v/v)의 1,3BG량에서 1일간 추출하는 것이 효율적이라고 할 수 있다.

실시예 10. 후코잔틴의 콜라게나제(Collagenase) 활성 억제

상기 방법에 의하여 추출된 후코잔틴 시료를 이용하여 콜라게나제 활성 억제 시험을 하였다(도 48). 먼저 시료에 대한 순도 환산 후 배양액으로 해당 농도로 희석하여 사용하였으며, 세포주로 사용된 인간 섬유아세포주(Human fibroblast)인 CCD986SK는 ATCC(수탁번호; CRL-1947)에서 구입하여 사용하였다. 다음으로, 세포배양액의 배지 조성은 하기 표 9, 10에 나타내었으며, 배양조건은 온도 (37 ± 1)℃, CO₂농도 5%, 습도는 가습조건, 배양기는 CO₂ 세포배양기를 사용하였다.

명칭	조성(mL)
Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM)	445
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	50
Penicillin-Streptomycin	5
Total volume	500

(완전배지 조성)

명칭	조성(mL)
Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM)	99
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	1
Total volume	100

(무혈청배지 조성)

실시예 10-1. 후코잔틴의 세포독성시험

하기 표 11에 나타낸 바와 같이, 시료를 5개 농도로 희석하여 세포독성시험을 실시하였다.

시험군		물질명	투여농도(ppm)
G1	음성대조군	-	-
G2	시험물질군	후코잔틴	6.25
G3			12.5
G4			25
G5			50
G6			100

먼저, 96 well plate에 세포를 3×10⁴ (200 ㎕/well)개로 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후, 시료가 농도별로 포함된 무혈청배지로 교체하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 다시 배양하였다. 이 후 세포생존율을 측정하는 MTT assay을 위하여 MTT용액을 200 ㎕/well 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 3 시간 배양 후, 배지를 제거하고 DMSO용액을 200 ㎕/well 넣어 plate shaker에서 20 분간 추출한 다음 570 nm 파장에서 ELISA 측정하였다.

결과는 Microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 생존율은 하기 계산식 1에 따라 산출하였고, 그 결과는 표 12 및 도 49에 나타내었다.

[계산식 1]

Group	Substance	Dose(ppm)		OD Value (570nm)	% of control
G1	Control	-	Mean	0.851	100.00
			S.D.	0.034	4.00
			N	9	9
G2	후코잔틴	6.25	Mean	0.907	106.65
			S.D.	0.053	6.23
			N	9	9
G3		12.5	Mean	0.924	108.59
			S.D.	0.053	6.25
			N	9	9
G4		25	Mean	0.346	40.69
			S.D.	0.067	7.87
			N	9	9
G5		50	Mean	0.088	10.36
			S.D.	0.002	0.22
			N	9	9
G6		100	Mean	0.089	10.42
			S.D.	0.003	0.35
			N	9	9

N: Number of well, S.D.: Standard deviation

상기 표 12 및 도 49에 따르면, 후코잔틴을 6.25 ppm, 12.5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm 의 농도로 처리한 결과, 각각의 농도에서 106.65 ± 6.23 %, 108.59 ± 6.25 %, 40.69 ± 7.87 %, 10.36 ± 0.22 %, 10.42 ± 0.35 % 의 세포 생존율이 관찰되었고, 후코잔틴을 6.25 ppm, 12.5 ppm 농도 처리시 세포 생존율이 가장 높은 것을 확인하였다. 이 결과 후코잔틴은 12.5 ppm 이하 농도에서 70 % 이상의 세포 생존율이 관찰되었으며, CCD-986SK 세포를 이용한 세포 내 콜라게나제 활성 억제 시험에서 사용되는 시료의 최고 농도는 12.5 ppm으로 선택하였다.

실시예 10-2. 후코잔틴의 세포 내 콜라게나제 활성 억제 시험

하기 표 13에 나타낸 바와 같이, 시료를 3개 농도로 희석하여 시험을 실시하였다.

시험군		물질명	투여농도
G1	음성대조군	-	-
G2	양성대조군	TGF-b1	60 ng/mL
G3	시험물질군	후코잔틴	3.13 ppm
G4			6.25 ppm
G5			12.5 ppm

먼저, 48 well plate에 세포를 5×10⁴ (1 mL/well)개로 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후, 시험물질 및 양성대조물질이 첨가된 배지로 교체하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 48시간 다시 배양하였다. 이 후 단백질 정량을 위하여 세포용해물을 회수하여 BSA protein assay reagent kit(Thermo scientific PIERCE, USA)에 따라 수행한 후 BSA 표준곡선에 따라 단백질함량을 측정하였고, 콜라게나제 정량을 위하여 세포용해물을 회수하여 Human MMP-1 ELISA Kit(SIGMA)에 따라 수행한 후 콜라게나제 표준곡선에 따라 콜라게나제 함량을 측정하였다.

세포 내 콜라게나제 활성 억제율은 단백질함량에 대한 콜라게나제 함량으로 환산하였으며, 하기 계산식 2에 따라 산출하였고, 그 결과는 표 14 및 도 50에 나타내었다.

[계산식 2]

Group	Substance	Dose		Human MMP-1 Conc.(pg/mL)	Protein Conc. (μg/mL)	Human MMP-1 /Protein(%)
G1	-	-	Mean	1167.981	93.464	100.00
			S.D.	40.042	9.385	8.14
			N	3	3	3
G2	TGF-β1	60 ng/mL	Mean	797.919	95.013	66.79
			S.D.	66.044	5.318	2.05
			N	3	3	3
G3	후코잔틴	3.13 ppm	Mean	1542.041	97.795	125.93
			S.D.	24.274	6.212	9.64
			N	3	3	3
G4		6.25 ppm	Mean	1379.241	100.296	109.63
			S.D.	40.817	5.212	5.34
			N	3	3	3
G5		12.5 ppm	Mean	964.579	102.092	75.36
			S.D.	53.024	4.655	6.28
			N	3	3	3

N: Number of well, S.D.: Standard deviation, Conc.: Concentration

후코잔틴을 3.13 ppm, 6.25 ppm, 12.5ppm 농도로 처리한 결과, 12.5 ppm 의 농도에서 콜라게나제 활성 억제가 측정되었다. 구체적으로, 후코잔틴을 3.13 ppm, 6.25 ppm, 12.5 ppm 농도로 처리한 결과, 각각의 농도에서 125.96 ± 9.64 %, 109.63 ± 5.34 %, 75.36 ± 6.28 % 로 측정되었으며, 12.5 ppm의 농도에서 콜라게나제 활성 억제가 측정되었다. 한편 양성대조물질인 TGF-β1을 60 ng/mL 처리하였더니 대조군에 비해서 66.79 ± 2.05 % 로 세포 내 콜라게나제 활성이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 11. 후코잔틴의 주름개선 효과에 대한 인체적용시험

실시예 11-1. 시험대상

본 인체적용시험은 한국화학융합시험연구원에 의뢰하여 일반인 22명을 대상으로 실시하였으며 성별은 모두 여성으로, 평균나이는 42.7세, 표준편자 6.6이고, 시험대상의 연령대는 30대가 8명(36.4%), 40대가 10명(45.5%), 50대가 4명(18.2%) 이었으며, 참여한 시험대상자의 일반적 피부상태 및 특성은 하기 표 15에 나타내었다.

피부타입	평균	백분율(%)
건성	7	31.8
지성	0	0
중성	3	13.6
복합성(중지성)	4	18.2
복합성(중건성)	8	36.4

실시예 11-2. 시험방법(Methods)

먼저, 후코잔틴의 주름개선 효과를 입증하기 위하여 사용된 시료의 조성비를 하기 표 16에 나타내었다.

원료명	조성비
정제수	57.4
글리세린	3
징크옥사이드	10
티타늄디옥사이드	6.6
에칠헥실메톡시신나메이트	7.5
하이드록시에틸아크릴레이트/소듐아크릴로일다이메틸타우레이트코폴리머	3
카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드	3
1,2-헥산다이올	2
푸코잔틴	2
다이메티콘	2
사이클로메티콘	2
바이오실리카	1
향료	0.5
총합	100

일정온도(20.2 - 22.2 ℃)와 습도(44.0 - 57.0 % R.H.)가 유지되는 항온 항습조건에서 시험을 실시하였다. 시험대상자의 안면부를 측정부위로 하였으며, 방문 시 센터의 동일한 세정제로 시험부위를 세정한 후 항온항습조건에서 30분간 안정을 취하도록 하였다. 객관적 측정을 위하여 매 측정시 동일한 시험자가 측정하였다.

순응도 평가는 시험기간 동안 시험대상자에게 제품과 순응일지를 배포함으로서 시험대상자가 직접 사용여부를 기입하였고, 하기 계산식 3에 따라 평가하였다.

[계산식 3]

하기 표 17에 나타낸 바와 같이, 시험을 종료한 모든 시험대상자가 시험제품을 사용한 순응도가 80% 이상으로, 모든 데이터를 결과로 분석하였다.

총 사용횟수	28.00회
평균 사용횟수	27.59회
평균 순응도	98.54%

실시예 11-3. 시험결과

피부주름 측정장비는 Antera 3D CS (Miravex, Ireland)를 사용하였으며, 시험부위 촬영 후 피부주름을 나타내는 Wrinkles medium 값을 분석하였고, 단위는 임의단위인 A.U.로 나타내었다. 결과 값이 감소할수록 개선됨을 의미한다.

Antera를 이용한 제품 사용 전, 사용 2주 및 4주 후 눈가주름을 측정한 결과를 표 18 및 도 51, 도 52에 나타내었다.

	사용 전	사용 2주 후	사용 4주 후
평균	13.98	13.00	12.74
표준편차	3.03	2.38	2.37
개선율(%)		7.01	8.87
유의확률		사용 2주 후	사용 4주 후
군내비교		0.222	0.037*

Repeated measures ANOVA (*: P ＜0.05)

정규성 검정에 따라 모수적 방법인 Repeated measures ANOVA로 검정한 결과, 눈가주름은 사용 전과 비교하여 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 감소하였다. 구체적으로, 피부주름을 확인한 결과, 눈가 주름 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 7.01 % 및 8.87 % 의 개선율을 보였으며, 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 감소 (P＜0.05)하였음을 확인할 수 있었다.

나아가, 안전성 평가결과, 시험대상자들에게 시험제품을 사용한 후 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)이나 자극성 접촉 피부염(irritant contact dermatitis)에 대한 이상반응은 관찰되지 않았고, 시험제품 사용 후 피부 이상반응과 관련된 특별한 증상 발생은 보고되지 않았다.

Claims (10)

1. 후코잔틴(Fucoxanthin)을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 후코잔틴은 규조류로부터 분리정제되는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 규조류는 제주 용암 해수와 함께 취수되는 부착성 규조류인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 부착성 규조류는 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 또는 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 이상인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 규조류는 바닥규조 배양물에서 수거되는 규조류인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 후코잔틴은 전체 화장료 조성물 대비 2 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 또는 향료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
8. 제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린싱, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스파운데이션, 또는 스프레이인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
9. 제1항 내지 제6항의 주름개선용 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 화장품은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 발모 영양제, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 세럼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 화장품.
    

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