KR20210146969A - 폐렴 구균 표층 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 중성 부근의 pH 에 있어서도 탈아미노화를 받지 않고, 분자로서의 안정성을 유지하는 D39 유래 PspA 변이체를 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질이다.
(a) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질,
(b) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질
구체적으로는, 본 발명은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질이다.
(a) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질,
(b) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질
Description
본 발명은 폐렴 구균 표층 단백질 A (PspA) 및 PspA 를 포함하는 백신에 관한 것이다.
폐렴 구균은, 인플루엔자 바이러스와 나란히 임상상 중요한 상기도 감염 병원체이며, 중이염으로부터 폐렴, 균혈증 및 수막염 등을 병발하고, 사망을 포함한 위중한 질병을 소아, 성인에서 발증시킨다.
이와 같은 폐렴 구균에 의한 감염을 방어하는 수단으로서, 최근, 성인 전용의 7가-, 10가-, 및 13가- 다당 결합형 폐렴 구균 백신 (PCV (pneumococcal conjugate vaccine) 7, PCV10 및 PCV13) 이 개발되어, 근육내 주사에 의해 투여되고 있다. 그러나, 이 다당체 베이스의 백신은, T 세포 비의존적인 다당의 면역원성이 약하기 때문에, 소아에 대한 면역 응답을 거의 유도하지 않고, 또, 협막혈청형의 폐렴 구균 밖에 감염 방어 효과를 나타내지 않는다. 또한, 백신의 근육내 주사는, 주로, 전신성 항IgG 항체를 유도하기 때문에, 이들 백신은 폐렴 구균에 대해서, 점막 면역의 응답을 유도할 수 없는 등의 문제점을 갖고 있다.
폐렴 구균의 표층에 존재하는 폐렴 구균 표층 단백질 A (pneumococcal surface protein A : PspA) 는, 높은 면역원성을 갖는 단백질로서 알려져 있으며, 백신의 후보로서 유망한 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). PspA 는, 거의 모든 종류의 폐렴 구균 상에 존재하고 있고, PspA 베이스의 백신은, 마우스 및 인간에게 있어서, 교차 반응을 야기하는 항체를 유도한다 (비특허문헌 3 ∼ 비특허문헌 5). 또한, PspA 특이적인 점막성 및 전신성의 항체가, 새끼 마우스 (모체를 통해서) 및 성체 마우스에 유도되고, 이 항체의 유도는, CD4+ T 세포에 의한 Th1 및 Th2 형 사이토카인의 응답에 의해 메디에이트 되고 있다. 이상의 지견으로부터, PspA 는, 성인 뿐만 아니라, 소아에게 있어서도 유효한 폐렴 구균 백신 후보인 것이 시사되고 있다.
PspA 는 3 개의 패밀리 (패밀리 1 ∼ 3) 로 분류되며, 또한, 6 개의 클레드 (클레드 1 ∼ 6) 라고 불리는 아군 (亞群) 으로 분류된다. 그 중에서도, 패밀리 1 로 분류되는 PspA 를 갖는 폐렴 구균주는, 지금까지 확인되어 있는 균주의 약 95 ％ 를 차지하고 있으며, 패밀리 1 로 분류되는 PspA 는, 백신 후보로서 특히 중요하다.
폐렴 구균의 유니버설 항원으로서 알려져 있는 D39 주 유래의 PspA 는, 패밀리 1, 클레드 2 로 분류되는 대표적인 백신 항원이며, 높은 항원성과 폐렴 구균 중화 항체 유도능을 갖는다. 그러나, D39 주 유래의 PspA 는 중성 부근의 pH 로 탈아미노화 되기 쉬워, 안정성에 문제가 있었다.
Berry 등, Infect Immun 57 : 2037-2042 1989
McDaniel 등, J Exp Med 165 : 381-394 1987
Briles 등, Infect Immun 68 : 796-800 2000
Nguyen 등, Vaccine 29 : 5731-5739 2011
McCool 등, J Exp Med 195 : 359-365 2002
상기 사정을 감안하여, 본 발명은, 중성 부근의 pH 에 있어서도 탈아미노화를 받지 않고, 분자로서의 안정성을 유지하는 D39 유래 PspA 변이체의 제공을 해결 과제로 한다.
본 발명자들, 탈아미노화 된 D39 유래 PspA 의 아미노산 서열을 MS/MS 법으로 해석한 바, 야생형 D39 유래 PspA 의 1 아미노산에 변이가 발생하고 있는 것을 알아내었다.
이 아미노산의 위치는, 서열 번호 1 로 나타내는 야생형 D39 유래 성숙 PspA 의 전체 아미노산 서열 중, 254 위치의 아스파라긴 (Asn) 만이 특이적으로 아스파르트산 (Asp) 으로 변해 있는 것이 분명해졌다. D39 유래 성숙 PspA 의 254 위치가 아스파르트산으로 변화한 PspA (N254D) 는, 매우 안정적인 PspA 로서, 항원성, 중화 항체 유도능에도 변화가 없다. 그리고, 이와 같은 아미노산의 변화는, 예를 들어, 패밀리 2, 클레드 3 의 EF3296 폐렴 구균주의 PspA 나, 패밀리 2, 클레드 4 의 EF5668 폐렴 구균주의 PspA 에는 보이지 않았다.
이상의 지견에 기초하여 본 발명은 완성되었다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) ∼ (5) 이다.
(1) 이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질.
(a) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질,
(b) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질
(2) 상기 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부가 α-헬릭스 영역인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질.
(3) 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 상기 (2) 에 기재된 단백질.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 코드하는 DNA.
(5) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 항원 또는 항원의 일부로서 포함하는 폐렴 구균 백신.
본 발명에 의해, 분자로서 안정적인 폐렴 구균 백신 항원이 제공된다. 구체적으로는, 종래의 D39 폐렴 구균 유래의 PspA 의 의약품 그레이드의 제조에 있어서의 이온 교환 크로마토그래피 등에 의한 정제 과정에 있어서는, 용출 피크가 2 개로 갈라지는 경우가 있고, 후의 피크는 탈아미노체였다. 본 발명에 의해 제공되는 항원은, 정제 과정, 및 그 후의 보존 상태에서도 매우 안정적인 제제의 조제가 가능한 것을 나타낼 수 있다.
도 1 은, PspA 단백질의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2 는, 소정의 pH (pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0 및 pH 8.5) 하에 있어서의 PspA 1-3 의 시간 경과적인 분자 변화를, Native-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸다. A : 마커 (500 mg) B : pH 7.0 (0 일의 컨트롤) C : pH 6.5 D : pH 7.0 E : pH 7.5 F : pH 8.0 G : pH 8.5
도 3 은, PspA 1-3 및 PspA 1-3LB 의 펩티드 맵에 의한 분석 결과를 나타낸다. 화살표는, PspA 1-3LB 에 특이적으로 발생한 피크이다.
도 4 는, PspA 1-3LB 의 나노겔 경비 백신 효과를 다른 PspA 항원을 사용한 나노겔 경비 백신의 효과와 비교한 결과를 나타낸다.
도 2 는, 소정의 pH (pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0 및 pH 8.5) 하에 있어서의 PspA 1-3 의 시간 경과적인 분자 변화를, Native-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸다. A : 마커 (500 mg) B : pH 7.0 (0 일의 컨트롤) C : pH 6.5 D : pH 7.0 E : pH 7.5 F : pH 8.0 G : pH 8.5
도 3 은, PspA 1-3 및 PspA 1-3LB 의 펩티드 맵에 의한 분석 결과를 나타낸다. 화살표는, PspA 1-3LB 에 특이적으로 발생한 피크이다.
도 4 는, PspA 1-3LB 의 나노겔 경비 백신 효과를 다른 PspA 항원을 사용한 나노겔 경비 백신의 효과와 비교한 결과를 나타낸다.
본 발명은, 야생형 D39 유래 PspA 단백질과 동등한 항원성 및 중화 항체 유도능을 유지하고, 분자로서의 안정성 (예를 들어, 아미노산 변이가 잘 발생하지 않는 등) 에 있어서는, 야생형 D39 유래 PspA 보다 우수한 단백질 (이하 「본 발명의 PspA 단백질」 이라고 한다) 을 제공한다.
즉, 본 발명의 제 1 실시형태는, 본 발명의 PspA 단백질로서, 이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질이다.
(a) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질,
(b) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질
PspA 단백질은, 그 N 말단측으로부터, 시그널 서열 (Signal sequence) (예를 들어, GenBank accession no. : ABJ54172 (D39 주 유래) 의 아미노산 위치 1 ∼ 31), α-헬릭스 (α-Helix) 영역 (예를 들어, GenBank accession no. : ABJ54172 의 아미노산 위치 32 ∼ 319), 프롤린 리치 (Proline-rich) 영역 (예를 들어, GenBank accession no. : ABJ54172 의 아미노산 위치 320 ∼ 402), 콜린 결합 (Choline binding) 영역 및 C 말단 테일 (C-terminal tail) 영역으로 구성된다 (도 1 을 참조할 것). 시그널 서열은 절단되어 성숙 PspA (α-헬릭스 영역, 프롤린 리치 영역, 콜린 결합 영역 및 C 말단 테일 영역으로 구성된다) 가 된다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 「폐렴 구균 백신 항원 활성」 이란, 폐렴 구균에 의한 공격으로부터 생체를 방어하기 위한 면역 (액성 면역 및/또는 세포성 면역) 을 유도하는 활성을 말한다. 어느 단백질이 「폐렴 구균 백신 항원 활성」 을 갖는지 여부는, 당업자이면 용이하게 확인할 수 있다 (예를 들어, 실시예의 「4. 마우스 경비 (徑鼻) 면역」 의 기재된 방법 등에서 확인할 수 있다).
상기 (a) 에 있어서의 「당해 단백질」 이란, 「서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질」 을 말하며, 상기 (b) 에 있어서의 「당해 단백질」 이란, 「서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질」 이다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 「당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질」 이란, 「당해 단백질」 의 아미노산의 서열 중, 1 또는 몇 개 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개) 의 아미노산이 결실 (254 위치의 아스파르트산은 제외한다), 치환 (254 위치의 아스파르트산은 제외한다), 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 당해 단백질이 폐렴 구균 백신 항원으로서의 활성을 갖는 단백질이다.
혹은, 본 발명의 실시형태에 있어서, 「당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질」 이란, 254 위치의 아미노산은 아스파르트산으로서, 「당해 단백질」 의 아미노산의 서열과 약 60 ％ 이상, 바람직하게는 약 70 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 80 ％, 81 ％, 82 ％, 83 ％, 84 ％, 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％, 94 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 가장 바람직하게는 약 99 ％ 의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 당해 단백질이 폐렴 구균 백신 항원으로서의 활성을 갖는 단백질이다.
상기 (b) 에 있어서의, 「서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부」 란, 예를 들어, α-헬릭스 영역 (단, 254 위치의 아스파르트산을 포함한다) 의 일부 혹은 전부와 프롤린 리치 영역의 일부 혹은 전부를 포함하는 영역이 바람직하며, 예를 들어, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산으로 이루어지는 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 제 2 실시형태는, 「본 발명의 PspA 단백질」 을 코드하는 핵산 (DNA 등) 이다. 본 발명의 PspA 단백질은, 이것을 코드하는 핵산을 cDNA 라이브러리 등으로부터 취득하고, 적당한 발현용 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터에 의해 적당한 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질 이입하고, 이것을 적당한 배지 중에서 배양하고, 본 발명의 PspA 단백질을 발현시키고, 정제함으로써 조제할 수 있다.
PspA 단백질 발현용의 숙주 세포로는, 예를 들어, 세균 세포 (예를 들어, Escherichia coli B strain, E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putida 등), 곰팡이 (예를 들어, Penicillium camembertii, Acremonium chrysogenum 등), 동물 세포, 식물 세포, 바큘로바이러스/곤충 세포 또는 효모 세포 (예를 들어, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris 등) 를 사용하여, 이들 세포 내에서 발현시킬 수 있다.
PspA 단백질을 발현시키기 위한 발현용 벡터는, 각종 숙주 세포에 적합한 벡터를 사용할 수 있다. 발현용 벡터로는, 예를 들어, pBR322, pBR325, pUC118, pET 등 (대장균 숙주), pEGF-C, pEGF-N 등 (동물 세포 숙주), pVL1392, pVL1393 등 (곤충 세포 숙주, 바큘로바이러스 벡터), pG-1, Yep13 또는 pPICZ 등 (효모 세포 숙주) 을 사용할 수 있다. 이들 발현 벡터는, 각각의 벡터에 적합한, 복제 개시점, 선택 마커 및 프로모터를 갖고 있으며, 필요에 따라, 인핸서, 전사 집결 서열 (터미네이터), 리보솜 결합 부위 및 폴리아데닐화 시그널 등을 갖고 있어도 된다. 또한, 발현 벡터에는, 발현한 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해서), FLAG 태그, His 태그, HA 태그 및 GST 태그 등을 융합시켜 발현시키기 위한 염기 서열이 삽입되어 있어도 된다.
발현용 벡터의 제조는, 당업자에게 공지된 수법에 의해 실시할 수 있으며, 적절히, 시판되는 키트 등을 사용하여 실시할 수도 있다.
발현시킨 PspA 단백질을 배양균체 또는 배양 세포로부터 추출할 때에는, 배양 후, 공지된 방법으로 균체 또는 배양 세포를 모으고, 이것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리소자임 및/또는 동결 융해 등에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심 분리나 여과에 의해, 가용성 추출액을 취득한다. 특히, 배양 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 배양 상청 중에 발현시킨 PspA 단백질을, 상청을 회수함으로써 취득하는 편이 바람직하다. 얻어진 추출액 또는 배양 상청으로부터, 공지된 분리·정제법을 적절히 조합하여 목적으로 하는 단백질을 취득할 수 있다. 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외 여과법, 겔 여과법, SDS-PAGE 등의 주로 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 전하의 차를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법 (예를 들어, GST 태그와 함께 폴리펩티드를 발현시킨 경우에는 글루타티온을 담체에 결합시킨 수지를, His 태그와 함께 폴리펩티드를 발현시킨 경우에는 Ni-NTA 수지나 Co 베이스의 수지를, HA 태그와 함께 폴리펩티드를 발현시킨 경우에는 항HA 항체 수지를, FLAG 태그와 함께 폴리펩티드를 발현시킨 경우에는, 항FLAG 항체 결합 수지 등을 사용하는 방법), 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법 또는 등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 사용된다.
본 발명의 제 3 실시형태는, 본 발명의 PspA 단백질을 항원으로서 포함하는, 폐렴 구균에 의한 감염을 억제하기 위한 백신 (이하 「본 발명의 폐렴 구균 백신」 이라고도 기재한다) 이다.
본 발명의 폐렴 구균 백신에 포함되는 본 발명의 PspA 단백질은, 단독으로 포함되어 있어도 되지만, 본 발명의 PspA 단백질과는 상이한 PspA 단백질 (상이한 패밀리 및/또는 클레드에 속하는 PspA 단백질을 포함한다) 의 전부 또는 일부와 융합된 형태로 포함되어 있어도 된다 (예를 들어, WO2018102774 등을 참조).
본 발명의 폐렴 구균 백신은, 1 또는 복수 종류의 아쥬반트, 예를 들어, 완전 프로인트 혹은 불완전 프로인트 아쥬반트, 콜레라 톡신, 이열성 대장균 독소, 수산화알루미늄, 칼륨 명반, 사포닌 혹은 그 유도체, 무라밀 디펩티드, 광물유 또는 식물유, 노바솜 또는 비이온성 블록 공중합체, DEAE 덱스트란 등을 포함할 수 있다. 또, 의약상 허용되는 담체를 포함하고 있어도 된다. 의약상 허용되는 담체는, 백신 접종되는 동물의 건강에 악영향을 미치지 않는 화합물인 것이 필요하다. 의약상 허용되는 담체는, 예를 들어, 무균수 또는 버퍼이다.
본 발명의 폐렴 구균 백신은, 통상적인 능동 면역법으로 투여할 수 있으며, 주사에 의해 투여해도 되고, 경구, 또는 경비 등의 경점막 방법으로 투여해도 된다. 또, 폐렴 구균 백신은, 폐렴 구균 감염의 예방 또는 치료에 대하여, 유효한 양 (폐렴 구균에 의한 공격에 대하여, 생체 내에 있어서 면역을 유도하기에 충분한 양) 으로, 제형에 적합한 방법에 의한 단회 또는 복수회 투여할 수 있다. 폐렴 구균 백신은, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 경구적으로, 또는, 점막 (비강내 또는 설하 등) 에 투여할 수 있다. 또, 본 발명의 폐렴 구균 백신은, 다른 항원 성분과 혼합하여 사용할 수도 있다.
폐렴 구균 백신의 투여량, 투여 횟수는 투여 대상에 따라 바뀔 수 있지만, 항원을 수 10 ㎍ 포함하는 백신을 1 주일 내지 수 주일에 한 번의 빈도로, 수 회 투여함으로써 방어 면역을 유도할 수 있다.
또, 본 발명의 폐렴 구균 백신에는, 경비 투여에 적합하도록 나노겔을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 나노겔이란, 친수성의 다당 (예를 들어, 풀루란) 에, 측사슬로서 소수성의 콜레스테롤이 부가된, 고분자 겔 나노 입자를 말한다. 나노겔은 공지된 방법, 예를 들어, WO2000012564 에 기재된 방법 등에 기초하여 제조할 수 있다.
구체적으로는, 먼저, 탄소수 12 ∼ 50 의 수산기 함유 탄화수소 또는 스테롤과, OCN-R1 NCO (식 중, R1 은 탄소수 1 ∼ 50 의 탄화수소기이다) 로 나타내는 디이소시아네이트 화합물을 반응시켜, 탄소수 12 ∼ 50 의 수산기 함유 탄화수소 또는 스테롤이 1 분자 반응한 이소시아네이트기 함유 소수성 화합물을 제조한다. 얻어진 이소시아네이트기 함유 소수성 화합물과 다당류를 반응시켜, 탄소수 12 ∼ 50 의 탄화수소기 또는 스테릴기를 함유하는 소수성기 함유 다당류를 제조한다. 다음으로, 얻어진 생성물을 케톤계의 용매로 정제함으로써, 순도가 높은 소수성기 함유 다당류를 제조할 수 있다.
여기서, 다당류로는, 풀루란, 아밀로펙틴, 아밀로오스, 덱스트란, 하이드록시에틸 덱스트란, 만난, 레반, 이눌린, 키틴, 키토산, 자일로글루칸 또는 수용성 셀룰로오스 등이 이용 가능하고, 특히, 풀루란이 바람직하다.
본 발명의 제 3 실시형태에서 사용되는 나노겔로는, 카티온성 콜레스테롤 치환 풀루란 (cationic cholesteryl-group-bearing pullulan : cCHP 라고 칭한다) 및 그 유도체를 들 수 있다. cCHP 는, 분자량 3 만 내지 20 만, 예를 들어 분자량 100,000 의 풀루란에 100 단당 (單糖) 당 콜레스테롤이 1 ∼ 10 개, 바람직하게는 1 ∼ 몇 개 치환된 구조를 갖는다. 또한, 본 발명에서 사용되는 cCHP 는, 항원의 사이즈나 소수성의 정도에 따라, 콜레스테롤 치환량을 적절히 변경해도 된다. 또, CHP 의 소수성의 정도를 변경하기 위해서, 알킬기 (탄소수 10 ∼ 30, 바람직하게는, 탄소수 12 ∼ 20 정도) 를 부가시켜도 된다. 본 발명에서 사용되는 나노겔은, 입경 10 ∼ 40 ㎚, 바람직하게는 20 ∼ 30 ㎚ 이다. 나노겔은 이미 널리 시판되고 있으며, 이들 시판품을 사용해도 된다.
본 발명의 실시형태에서 사용되는 나노겔은, 백신이 부 (負) 로 대전하는 코 점막 표면에 침입할 수 있도록, 정전하를 갖는 관능기, 예를 들어 아미노기를 도입한 나노겔이다. 아미노기의 나노겔로의 도입 방법으로는, 아미노기를 부가한 콜레스테롤 풀루란 (CHPNH2) 을 사용하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 감압 건조시킨 CHP 를 디메틸술폭시드 (DMSO) 에 용해하고, 이것에 1-1'카르보닐디이미다졸을 질소 기류하에 첨가하고 몇 시간 실온에서 반응시킨다. 그 반응 용액에 에틸렌디아민을 서서히 첨가하고, 수 시간 내지 수 십 시간 정도 교반한다. 얻어진 반응 용액을 증류수에 대하여, 몇 일간 투석한다. 투석 후의 반응 용액을 동결 건조시키고, 유백색 고체를 얻는다. 에틸렌디아민의 치환도는 원소 분석이나 H-NMR 등을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 폐렴 구균 백신은, 약학적으로 허용할 수 있는 공지된 안정제, 방부제, 산화 방지제 등을 포함시켜도 된다. 안정제로는, 젤라틴, 덱스트란, 소르비톨 등을 들 수 있다. 방부제로는, 티메로살, β-프로피오락톤 등을 들 수 있다. 산화 방지제로는 α토코페롤 등을 들 수 있다.
본 발명의 제 4 실시형태는, 본 발명의 폐렴 구균 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 폐렴 구균에 의한 감염증의 예방 방법이다.
여기서, 「예방」 이란, 폐렴 구균에 감염될 우려가 있는 환자에게 있어서, 그 감염을 미리 저지하는 것을 의미하며, 이에 따라 폐렴 구균 감염증의 발증을 미리 저지하는 것을 목적으로 하는 처치를 말한다.
본 명세서에 있어서 인용된 모든 문헌의 개시 내용은, 참조에 의해, 그 전체가 본 명세서의 일부로서 받아들여진다. 또, 본 명세서가 영문으로 번역되었을 경우로, 단수형의 「a」, 「an」 및 「the」 의 단어가 포함되는 경우, 문맥으로부터 분명하게 그렇지 않은 것이 개시되어 있지 않은 한, 단수 뿐만 아니라 복수의 것을 포함하는 것으로 한다.
이하에 실시예를 나타내어 더욱 본 발명의 설명을 실시하는데, 실시예는, 어디까지나 본 발명의 실시형태의 예시에 지나지 않고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
1. Native PAGE
각종 PspA 단백질, PspA 1-1 (서열 번호 5), PspA 1-2 (서열 번호 6), PspA 1-3 (서열 번호 4) 및 PspA 1-3LB (서열 번호 3) 를 대장균 발현계 등 발현시켰다 (상세한 내용은, WO2018102774 를 참조할 것). 발현한 PspA 단백질을 정법에 의해 비변성법으로 추출하고 이온 교환 크로마토그래피, 부틸 세파로오스 등을 사용하여, LDS (Lithium Dodecyl Sulfate) - PAGE 로 균일하게 될 때까지 정제하였다.
먼저, PspA 1-3 분자는, 정제 후 곧바로 2 ㎎/㎖ PBS 에 현탁하고, 0.5 M NaH2PO4 또는 0.5 M Na2HP4 로 pH 를 소정의 pH (pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0 및 pH 8.5) 로 조정하고, 25 ℃ 에서 소정 시간 (1 일, 2 일 및 5 일) 보존하였다. 각 샘플, 10 ㎕ (1.0 ㎍/lane) 사용하여 Native PAGE 로, 200 V, 60 분 전기 영동을 실시하고, Coomassie Blue (BioRad) 염색을 실시하였다. 또한, 사용한 겔은, 7.5 ％ Mini-Protein TGX Gel 12 well (BioRad), 처리액은 Native Sample Buffer for Protein Gels (BIoRad), 영동 완충액은 10 x Premixed electrophoresis buffer (BioRad) 를 사용하였다.
이 조건의 처리로, LDS-PAGE 에서는 모든 검체에서 단일 밴드를 나타내어 외관의 분자량에는 변화가 없었지만 (데이터는 나타내지 않는다), Native-PAGE 에서는, 처리 5 일에 pH 에 상관없이, 이동도가 큰 밴드가 생겼다 (도 2 의 화살표). 이 밴드에 대응하는 단백질을 PspA 1-3LB 로 하였다. 데이터는 나타내지 않지만, 이 현상은 정제 직후의 PspA 1-1 및 PspA 1-2 에 있어서도 동일하게 관찰되었지만, PspA 2 (EF3296 주 유래) 및 PspA 3 (EF5668 주 유래) 에서는 관찰되지 않고, 폐렴 구균 D39 주 유래의 PspA 에 특이적으로 일어나는 현상인 것으로 생각되었다.
2. 펩티드 맵
PspA 1-3 으로부터 PspA 1-3LB 로의 분자 변화를 특정하기 위해서, 정제 직후의 PspA 1-3 및 PspA 1-3LB, 각각, 0.5 ㎎/㎖ 에 대하여, 10 ㎍ 의 트립신 (sigma, Sequence grade) 을 첨가하고, 37 ℃, 24 시간, pH 8.5 로 소화 처리를 실시하고, 처리한 샘플의 50 ㎕ 를 역상 HPLC (Waters C18 1.7 ㎛ 2.1 x 100 ㎜) 에 도입하고, 분리 온도 50 ℃, 0.1 ％ TFA (100 ％), 0.1 ％ TFA - 40 ％ acetonitrile (55 ％) 의 110 분 Linear-Gradient 용출, 0.2 ㎖/분, 220 ㎚ (Detection) 로 분석하였다.
그 결과, 용출 시간이 상이한 피크가 검출되었다 (도 3). 그래서, 본 피크를 분취하여 PPSQ-21A Protein sequencer (Shimadzu) 에 의해 N-말단 분석을 실시한 바, AAEENDNVE (서열 번호 7) 라고 하는 서열이 PspA 1-3LB 에 관측되었다. 이 결과로부터, PspA 1-3LB 아미노산 서열에 있어서, 특이적인 탈아미노화가 일어나고 있을 가능성이 시사되었다.
3. PspA 1-3LB 의 아미노산 서열의 결정
다음으로, PspA 1-3LB 의 전체 아미노산 서열 분석을 실시하기 위해서, 상기 2. 와 동일하게 trypsin 소화를 실시하고, LC-MS/MS (HPLC acquity UPLC (Waters : C4 - 1.7 ㎛, 2.1 x 100 ㎜) - MS : Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo) MS1 : Orbitrap, MS2 : Ion Trap 을 사용하여 서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 302 아미노산 잔기 중, 208 잔기 (69 ％) 의 아미노산의 서열을 동정 (同定) 하고, 또한 whole - MS 분석도 실시하여 (Intact 체 33569.03 및 1 탈아미노체 33569.93), 각 이론값과 일치하였으므로 N254D 이외에 탈아미노화가 일어나고 있을 가능성은 매우 낮은 것으로 결론지었다.
4. 마우스 경비 면역
4-1. 방법
4-1-1. 항원의 나노겔화 (백신 준비)
cCHP 나노겔과 각 PspA 단백질 (PspA 1-1, PspA 1-2, PspA 1-3 및 PspA 1-3LB) 을 분자비 1 : 1 로 혼합하고, 40 ℃ 의 히트 블록으로 1 시간 인큐베이션 하였다.
4-1-2. 마우스에 대한 경비 면역
각 cCHP-PspA 용액을, Balb/c 마우스의 7 주령 암컷에게 각각 경비 투여하였다. 투여 항원량은, 1 마리, 1 회당 각 PspA 단백량으로서 10 ㎍ 을 투여하였다. 경비 면역은 1 주 간격으로 합계 3 회 실시하였다.
4-1-3. 면역 마우스로부터의 혈청 샘플 조제
최종 투여로부터 1 주일 동안 상승해 오는 혈청 중의 PspA 특이적 IgG 를 측정하기 위해서, 면역 마우스의 안와 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채취한 혈액 샘플을 4 ℃, 7,000 rpm 으로 원심 후, 상청을 회수하여 혈청 샘플로 하였다.
4-1-4. 항원 특이적 IgG 의 측정
ELISA 플레이트에 각 항원을 종농도 1 ㎍/㎖ 로 코팅하고, 하룻밤 반응 후, 웰을 세정하였다. 비특이적 반응을 피하기 위해서, 1 ％ BSA 함유 PBS 로 25 ℃, 1 시간 웰을 블로킹 하고, 추가로 세정 후, 28 부터 단계 희석한 혈청 샘플을 제조하고, 각각 웰에 첨가하여, 25 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 웰을 세정 후, HRP 표지의 항마우스 IgG 를 첨가하여 25 ℃ 에서 1 시간 반 반응시켰다. 추가로 세정 후, HRP 의 기질인 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액을 첨가하여 발색시켰다. 2N 황산으로 반응 정지 후, 즉시 마이크로 플레이트 리더로 흡광도 (450 ㎚) 를 측정하고, 엔드 포인트법으로 항체가를 산출하였다.
4-1. 결과
cCHP-PspA 1-1, cCHP-PspA 1-2, cCHP-PspA 1-3 또는 cCHP-PspA 1-3LB 의 경비 투여에 의해, 마우스 혈청 중에 있어서, 각각의 항원에 특이적 IgG 가 유도되어 오는 것을 알 수 있었다. 또, 각 PspA 항원간에서의 항체가에 큰 차이는 없었다 (도 4).
산업상 이용가능성
본 발명의 폐렴 구균 표층 단백질 및 그 일부는, 폐렴 구균 백신의 항원으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 감염증의 예방 의학의 분야에 있어서, 이용되는 것이 기대된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
HanaVax Inc.
<120> Pneumococcal surface protein A
<130> TPC0312UVT
<150> JP2019- 65362
<151> 2019-03-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
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Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr
115 120 125
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala
145 150 155 160
Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala
165 170 175
Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu
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Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe
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Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser
210 215 220
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile
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Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
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Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
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Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys
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<210> 6
<211> 356
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<213> Streptococcus pneumoniae
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1 5 10 15
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355
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 7
Ala Ala Glu Glu Asn Asp Asn Val Glu
1 5
Claims (5)
- 이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질.
(a) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질,
(b) 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로서, 당해 일부에는 254 위치의 아스파르트산이 포함되어 있고, 폐렴 구균 백신 항원 활성을 갖는 단백질, 및 당해 단백질과 실질적으로 동일한 단백질 - 제 1 항에 있어서,
상기 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 일부가 α-헬릭스 영역인 것을 특징으로 하는 단백질. - 제 2 항에 있어서,
서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 단백질. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 코드하는 DNA.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 항원 또는 항원의 일부로서 포함하는 폐렴 구균 백신.
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